Меню Рубрики

Специфические методы диагностики вирусного гепатита с

Сайт предоставляет справочную информацию исключительно для ознакомления. Диагностику и лечение заболеваний нужно проходить под наблюдением специалиста. У всех препаратов имеются противопоказания. Консультация специалиста обязательна!

Вирус гепатита С, это РНК содержащий вирус покрытый липидной оболочкой со встроенными белковыми молекулами (обеспечивают индивидуальные свойства вируса). Данный вирус был открыт в 1989 г. , до этого момента данную инфекцию определяли как «гепатит ни А, ни В».

Главная особенность этого вируса заключается в его генетической изменчивости, (выражается в постоянной мутации). На настоящий момент известно о 6 основных генотипах (совокупность генетической информации) вируса гепатита С. Но, благодаря постоянной мутации вируса, в организме одного человека могут присутствовать до четырех десятков подтипов HCV одного генотипа. Эта изменчивость вируса позволяет ему быть неуязвимым для иммунной сиcтемы и в высоком проценте случаев приводит к развитию хронических форм гепатита С.

Иммунная система человека не успевает вырабатывать в достаточном количестве антитела и уничтожить вирус – постоянно появляются обновленные подвиды вируса. В следствие постоянной мутации вируса антитела активно синтезирующиеся к одному виду вируса не воздействуют на очередное поколение модернизированных потомков с отличными антигенными детерминантами.

Статистически распространенность гепатита С в мире достигает 2%. Число инфицированных гепатитом С в России может достигает 5 млн. Официальная регистрация данного заболевания во многом затруднена из-за слабой выявляемости данного вида гепатита.

Ежегодно в разных странах заболеваемость гепатитом С возрастает. Во многом данное явление связывают с ростом наркомании (38-40% зараженных гепатитом С, принимают внутривенно наркотики).

Повреждение ткани печени может происходит за счет деятельности самих вирусов и вследствие иммунной реакции организма, уничтожающего инфицированные клетки печени ,содержащие чужеродный генетический материал.

  • При нанесении татуировок и пирсинга в условиях несоблюдения стерилизации инструментов– в соответствующих салонах.
  • Употребление инъекционных наркотиков .
  • В местах лишения свободы высока вероятность заражения.
  • В больнице, клинике — медперсонал может заразиться вследствие травмы при работе с инфицированной кровью.
  • Гемотрансфузии (переливание крови) редко являются причиной инфицирования (не более 4%)
  • Стоматологические кабинеты — при несоблюдении стерилизации инструментов и грубо нарушаются санитарные нормы.

Часто при гепатите С точно установить источник инфицирования не представляется возможным.

Заражение половым путем гепатитом С маловероятно. Вероятность инфицирования при незащищенном половом контакте составляет 3-5%.
Однако при беспорядочных половых связях — при наличии большого количества половых партнеров, риск значительно возрастает.
Вероятность передачи вируса при оральном сексе не изучена.
При половых контактах с инфицированными или больными гепатитом С рекомендуется использование презерватива.

В этом случае инфицированное лицо должно соблюдать все медицинские и гигиенические предписания врача :

  • Запрещается быть донором крови или органов
  • Запрещается пользование общими бытовыми предметами, потенциально опасными в передаче вируса (бритвы, эпиляторы, зубная щетка, маникюрные наборы)
  • При порезах и ссадинах производить перевязку для избегания крови на предметы обихода (перевязки больному производятся в медицинских перчатках)

Вирус гепатита С выживает во внешней среде сохраняет жизнеспособность 16 ч., иногда и до 4-х дней.

Загрязненные кровью места, должны быть обработаны хлорсодержащими моющими средствами, или хлорной известью в разведении 1:100. Стирка одежды при 60 градусах вирус инактивируется за 30 минут, при кипячении – за 2 минуты.

Скрининг анализ – это серология крови , обнаружение антител к вирусу гепатита С (анти-HCV). Данное исследование доступно во всех медицинских учреждениях. Данный анализ устанавливает факт контакта с инфекцией (инфицирования). Данный метод допускает ложно-положительный (при отсутствии инфекции,анализ положителен) и ложно-отрицательный результат (при наличии инфекции анализ отрицателен. Потому стандартный тест анти-HCV ( ИФА, иммуноферментный анализ ) подтверждают методом рекомбинантного иммуноблотинга (РИБА).Обнаружение РНК вируса методом полимеразной цепной реакции( ПЦР ).
Редко анализ на РНК вируса дает ложно-отрицательный результат, потому его повторяют.

В настоящий момент ПЦР диагностика является наиболее информативной и достоверной. Она выявляет не только факт инфицирования пациента, но и активность инфекционного процесса( активности размножения и распространения вируса). Посредством количественной полимеразной цепной реакции можно определить количество вирусных единиц в крови (вирусная нагрузка) – что позволяет отслеживать активность и скорость размножения вируса. Высокая вирусная нагрузка – неблагоприятный фактор, ухудшающий прогноз на выздоровление. Низкая вирусная нагрузка позволяет ( при условии адекватного лечения) добиться излечения .

Естественно – при высоком содержании вируса в крови выше вероятность заразиться при контакте с кровью больного или при половом контакте.
Генотипирование генатита: при ПЦР анализе есть возможность генотипирования вируса. У различных генотипов вируса имеются различия в устойчивости к проводимой антивирусной терапии – потому длительность и состав лечения определяется в том числе и согласно генотипу вируса.
Иногда есть показания к УЗИ печени и пункционной биопсии. Для изучения анатомической и гистологической структуры поражения печени.

Хронический гепатит С требует лечения у опытного специалиста — гепатолога или инфекциониста.
Заболевание а хронической фазе может быть потенциально причиной цирроза и печеночной недостаточности – потому отнеситесь со всей ответственностью к своевременности обращения к специалисту и к выбору лечащего врача.
Многие врачи широкого профиля занимаются лечением данного заболевания ,но не многие обладают соответствующими знаниями и часто не имеют клинического опыта лечения данного заболевания современными препаратами.


Итак, любое заболевание всегда проще предотвратить, чем его лечить – потому представляем вам информацию о том, что делать для того, чтобы избежать заражения вирусом гепатита С.

  • Применение наркотических средств неприемлемо!
  • Если Вы все же используете инъекционные наркотики, то Вам следует рассмотреть возможность сделать прививку от гепатита А и В – что снизит риск тяжелого течения гепатита при заражении гепатитом С
  • Пользуйтесь только личными предметами ухода и не позволяйте никому пользоваться ими : бритвенные станки, зубные щетки, депиляторы и любые предметы, где может быть кровь
  • Медицинскому работнику следует соблюдать технику безопасности при работе с любыми острыми предметами. Рекомендуется вакцинация от гепатита В.
  • В медицинских учреждениях или стоматологических кабинетах, следите, чтобы все опасные манипуляции проводились только одноразовыми инструментами.
  • Еще раз подумайте так ли уж Вам необходима татуировка или пирсинг.Если избежать этого нет возможности, то смотрите – куда и к кому Вы обращаетесь. Мастер перед процедурой должен мыть тщательно руки и работать в медицинских перчатках, инструментарий должен быть продезинфицирован.

Автор: Ткач И.С. врач, хирург офтальмолог

источник

О возбудителе HCV-инфекции стало известно сравнительно недавно. До начала 1990-х годов точное выявление заболевания представляло собой серьезную проблему. Это обусловило широкое распространение вируса при гемотрансфузионных процедурах и трансплантации органов, длительное течение инфекции без адекватной терапии. Но сейчас диагностика гепатита С точна, анализы помогают прогнозировать эффективность терапии, а срок выполнения специфических исследований не превышает 3–5 дней.

Так почему масштабы распространения HCV некоторые специалисты сравнивают с эпидемией? В современном российском законодательстве предусмотрена регулярная проверка на гепатит С методом ИФА как у людей из группы риска, так и у работников, способных инфицировать других. Тем не менее, многие не проходят регулярной диспансеризации и не сдают даже стандартные клинические анализы, не говоря о специфических исследованиях.

Но HCV далеко не всегда сопровождается какими-либо клиническими проявлениями, более того, характерные симптомы заболевания отмечают только у четверти пациентов. Вирусная инфекция обычно протекает медленно, но репликация возбудителя патологии происходит постоянно. В результате наступает необратимая гибель гепатоцитов. На месте клеток, утративших свои функции, появляются участки соединительной ткани – своего рода шрамы.

Таким образом развивается фиброз, который, если не предпринять лечебных мер, перерастает в цирроз печени – тяжелое заболевание, сопровождающееся нарушением работы всех внутренних органов. При диагностике на этой стадии можно избавиться от вируса. Однако изменения печеночной паренхимы остаются необратимыми. В некоторых случаях больным требуется срочная трансплантация печени, а лечение начинают после проведения операции.

Поэтому чем раньше поставлен точный диагноз, тем скорее доктор начинает терапию. Таким образом репликацию вируса останавливают еще до развития тяжелых осложнений. Однако обычных клинических исследований недостаточно для выявления инфекции. Необходимо сдать более специфичные анализы, отличающиеся как по технике выполнения, так и по особенностям расшифровки результатов.

Сделать ряд диагностических тестов можно самостоятельно, но интерпретировать полученные данные (особенно если они положительны либо сомнительны) должен только врач.

Заподозрить наличие инфекции можно по некоторым клиническим признакам. К их числу относят:

  • постоянное чувство слабости;
  • астенический синдром;
  • непереносимость физических нагрузок (ранее привычных);
  • сонливость;
  • эмоциональная раздражительность;
  • расстройства пищеварения различной интенсивности (могут отсутствовать, иногда проявляются в виде отсутствия аппетита, тошноты).

Но подобные симптомы не могут достоверно выявить HCV, так как данные признаки не специфичны и указывают на множество других патологий или обычное переутомление.

Как определить гепатит С у взрослых и у детей:

  • по анализу крови на содержание определенных иммуноглобулинов (ИФА);
  • по результатам исследования, проведенного методом полимеразной цепной реакции;
  • по биохимическому анализу на содержание печеночных проб, билирубина.

Недавно на фармацевтическом рынке появились диагностические наборы, позволяющие провести анализ на наличие гепатита С в домашних условиях. Подобные тест-системы менее чувствительны, чем исследования, проводимые в лаборатории. Но в целом, это быстрый и достаточно точный способ самодиагностики.

Интерпретация результатов, особенно сомнительных, должна проводиться врачом. Положительный тест служит показанием для консультации доктора.

Дополнительно необходима проверка показателей общеклинического теста крови и мочи. Перед началом лечения доктор оценивает состояние печени по данным неинвазивных исследований (УЗИ, эластометрия). При подозрении на тяжелые поражения ткани выполняют биопсию органа.

Учитывая длительное бессимптомное течение, результаты обычного анализа крови и мочи могут быть без каких-либо отклонений. Поэтому для выявления вируса гепатита Ц используют серологические (ИФА) и молекулярные (ПЦР) методы лабораторной диагностики. Для этого сдают кровь из вены в частной лаборатории либо поликлинике по месту жительства. Срок получения результатов – до 5 дней.

Основные методы диагностики патологии можно разделить на две группы. Молекулярные исследования направлены на обнаружение частиц вируса. Помимо наличия РНК возбудителя гепатита С, такой анализ показывает его количественное содержание и точный генотип. Серологическое исследование (ИФА) «реагирует» на выработку иммуноглобулинов, синтезируемых при попадании вируса в кровь человека.

Уровень РНК, достаточный для лабораторного определения, достигается через 10–16 дней после инфицирования (если проводить диагностику современными высокочувствительными технологиями). Количественно вирусную РНК можно определить позже, через 4–6 недель после заражения. Тогда же целесообразно проводить и генотипирование. Синтез антител начинается сразу же, при первом контакте вируса с кровью человека. Но лабораторным путем при помощи анализа ИФА их можно обнаружить только через 3–4 недели.

Возможность выявления вируса на ранних стадиях зависит от индивидуальных особенностей больного – сроков выработки антител и активности процессов репликации вируса.

Какие анализы сдают при подозрении на гепатит С:

  • биохимия крови, печеночные пробы (отклонения от нормы могут лишь косвенно указывать на наличие гепатита С);
  • ИФА;
  • ПЦР.

Грамотное поэтапное полное обследование способствует исключению неопределенных результатов, дает максимально точную картину здоровья пациента в целом и позволяет врачу назначить правильное лечение.

Исследование методом ПЦР – самый точный анализ для обнаружения гепатита С в организме. Сам принцип постановки полимеразной цепной реакции достаточно сложен. Для проведения необходим обработанный и соответствующим образом подготовленный образец биологического материала. К нему добавляют фермент, провоцирующий деление заданного участка РНК (при его наличии) в геометрической прогрессии. Впоследствии определение частиц вируса проводят при помощи различных физико-химических методов.

Основные отличия ПЦР-диагностики гепатита C от исследования путем иммуноферментного анализа приведены в таблице:

Молекулярный тест, проведенный по методике ПЦР Иммуноферментный анализ
Мишени для исследования
РНК вируса в крови Антитела к гепатиту С (класса G и М)
Разновидности анализа и изучаемые критерии
Качественный анализ позволяет ответить на главный вопрос, здоров человек или болен Anti HCV Total определяет в крови общий титр всех антител к возбудителю гепатита С вне зависимости от класса
Количественное исследование оценивает вирусную нагрузку Определение иммуноглобулинов по классам: обнаруженные маркеры IgG свидетельствует о хронической инфекции, IgM – об острой
Генотипирование служит для выявления разновидности патологии Антитела с белку core и неструктурным протеинам HCV – это развернутый анализ, назначается нечасто, служит для дифференциальной диагностики инфекции с другими заболеваниями, прогнозирования особенностей течения и исхода
Сроки диагностики
до 3 дней 3–5 дней
Сроки обнаружения (с момента инфицирования)
10–14 дней Через 3–4 недели
Вероятность получения ложных результатов и ошибочной расшифровки
Минимальна, ошибки могут быть связаны с неправильной подготовкой образцов либо нарушением правил постановки реакции Неправильные результаты (ложноотрицательные или ложноположительные) могут быть следствием определенных заболеваний и состояний (например, беременности, аутоиммунных патологий, ВИЧ, системных инфекций и т.д.)

Качественный анализ, предназначенный для выявления патогенной РНК строго специфичен, поэтому используется для дифференциальной диагностики хронического вирусного гепатита С и для первичного определения наличия заболевания. Современные наборы реактивов, используемые для проведения исследования, характеризуются высокой чувствительностью. Достоверная диагностика возможна уже через 1,5–2 недели после инфицирования.

Расшифровка анализа не отличается сложностью. Если частицы вируса обнаружены, человек болен либо произошла реконвалесценция болезни. Отрицательный результат свидетельствует в пользу отсутствия патологии или о диагностическом окне, когда человек заражен, но уровень РНК патогена слишком низок для лабораторного обнаружения.

При помощи качественного анализа методом ПЦР возможна ранняя диагностика вирусной инфекции.

Исследование проводится после подтверждения диагноза гепатита С по качественной ПЦР. По анализу определяют показатель вирусной нагрузки. Этот параметр определяет активность патологического процесса. В зависимости от результата количественного анализа выделяют несколько уровней вирусной нагрузки (представлено в таблице).

Уровень вирусной нагрузки (измеряется в МЕ/мл) Расшифровка
Ниже 3ˑ104 Низкая виремия
3ˑ104–8ˑ105 Средняя виремия
Сверх 8ˑ105 Высокий уровень виремии

Чем выше параметр вирусной нагрузки (ВН), тем активнее происходит репликация вируса, хуже прогноз и выше вероятность необратимых изменений структуры тканей печени. Как правило, высокая виремия сопровождается достаточно характерными клиническими проявлениями инфекции. Обнаружение низкой ВН, особенно на фоне острой фазы заболевания является предиктором самостоятельного выздоровления. В таком случае начало терапии откладывают на 7–14 дней, после чего исследование повторяют.

Данный анализ проводят только в том случае, если в крови обнаружена вирусная РНК и установлено ее количественное содержание. Генотипирование – единственное исследование, которое определит разновидность возбудителя гепатита С. Только так можно правильно назначить курс терапии и установить продолжительность их применения.

В настоящее время диагностика вирусной инфекции возможна дома, при этом человеку не нужны какие-либо специальные медицинские навыки. Экспресс-тест на гепатит С «работает» по принципу иммуноферментного анализа, то есть набор позволяет определить наличие антител к HCV в образце биологического материала. Большинство тест-систем предназначены для проверки крови. Но появились наборы, позволяющие выяснить, есть ли иммуноглобулины к гепатиту С в слюне.

Относительно достоверности экспресс-тестов было проведено несколько клинических исследований. Установлено, что подобные наборы – не самый точный способ диагностики инфекции, многое зависит от правильности забора биологического материала, соблюдения других правил выполнения анализа. Однако проведение такого теста дает возможность самостоятельно определить инфицирование, не посещая доктора и лабораторию.

Цена одной тест-системы, позволяющей проверить наличие вируса, колеблется в пределах 800–2000 рублей в зависимости от производителя и способа выполнения анализа. Исследование выполняют следующим образом. На тест-полосу наносят образец биологического материала (слюна либо кровь) и ждут отведенное время. Появление одной контрольной полоски свидетельствует об отрицательном результате, две линии – о возможном инфицировании.

При подготовке к проведению обследования необходимо соблюдать такие правила:

  • исключить токсическое влияние алкоголя на печень (отказаться от употребления спиртного за 5–7 дней до сдачи анализов);
  • соблюдать диету с ограничением жирных, жареных, копченых блюд (стол №5) за неделю до проведения обследования;
  • сдавать кровь строго натощак (прием пищи запрещен за 12–14 часов до забора крови);
  • не курить за 8 часов до исследования.

Существует несколько способов проведения диагностики. Можно сдать кровь в частной лаборатории, где не требуется направлений от врача. Необходимые тесты выполняют по полису страхования, но перед этим придется получить направления у участкового терапевта или инфекциониста.

Нередко пациенты интересуются, покажет ли общий анализ крови гепатит С, ведь общеклинические исследования сдаются регулярно при вирусных заболеваниях и других, более распространенных инфекциях. Но изменения картины крови возникают далеко не всегда. Кроме того, подобные нарушения неспецифичны и не позволяют провести точную диагностику заболевания.

Приблизительно в 20–30% случаев возникают следующие изменения:

  • снижение общего уровня лейкоцитов за счет лимфоцитов;
  • уменьшение содержания гемоглобина;
  • изменение уровня тромбоцитов за счет нарушений свертывающей системы крови;
  • повышение параметров скорости оседания эритроцитов.

Еще одним способом, как обнаружить вирусное поражение печени, служат показатели биохимического исследования крови.

О возможном инфицировании свидетельствует повышение концентрации:

Нарушения функциональной активности печени проходят по мере приема противовирусных препаратов.

Диагноз гепатита С не ставят на основании результатов печеночных проб и стандартного клинического исследования крови.

Для получения полной картины состояния пациента необходимо проведение дополнительных инструментальных исследований. Это связано с длительным бессимптомным течением патологии. Нередко о наличии болезни пациент узнает на стадии фиброза, а при неблагоприятном прогнозе – на этапе цирроза либо злокачественной малигнизации гепатоцитов.

От состояния печени во многом зависит тактика терапии. При декомпенсированных формах цирроза прием таргетных противовирусных препаратов дополняется рибавирином, либо продолжительность лечения увеличивают до 24 недель.

Процедура проводится для определения стадии и степени цирроза, а также подтверждения злокачественного перерождения клеток (предварительно опухоль обнаруживают при помощи ультразвукового исследования). Пункцию выполняют в условиях стационара под местной анестезией.

Под контролем УЗИ специалист делает прокол и вводит в паренхиму печени специальную иглу с системой захвата, позволяющей взять образец биологического материала. Кусочек ткани помещают в специальную среду, при необходимости добавляют краситель и исследуют под микроскопом.

Противопоказанием к проведению процедуры служит паразитарное поражение печени и тяжелые нарушения системы свертывания. Кроме того, возможность выполнения манипуляции напрямую зависит от согласия самого пациента. Для принятия взвешенного решения врач должен подробно объяснить, для чего необходимы результаты биопсии, каковы риски при проведении процедуры.

Ультразвуковое исследование сочетает в себе высокую информативность, безболезненность и безопасность. В течение 15–20 минут доктор может получить подробные данные о размерах и структуре печени и других органов брюшной полости.

Как правило, УЗИ, проведенное на фоне гепатита С, демонстрирует:

  • нарушения кровоснабжения органа;
  • изменения, связанные с оттоком и секрецией желчи;
  • наличие уплотнений, очагов воспаления, некроза, в тяжелых случаях возможно обнаружение новообразований;
  • увеличение размеров печени.

По итогам УЗИ доктор поймет масштабы поражения печени, однако точная диагностика гепатита С возможна только по результатам анализа крови.

Сама техника выполнения обследования напоминает ультразвуковую диагностику. Эластометрия – неинвазивное безболезненное исследование, предназначенное для оценки плотности паренхимы печени. Таким образом доктор может определить стадию и тяжесть фиброза, при котором нормальная ткань органа замещается соединительной. Без соответствующей терапии и таргетного противовирусного лечения развивается цирроз печени.

Подобные методики информативны при диагностике цирроза и наличия злокачественных новообразований. Томограмма имеет ряд противопоказаний. Но подобное исследование гораздо информативнее УЗИ и эластометрии, позволяет в полной мере оценить состояние печени.

Самостоятельная диагностика вируса без проведения должных исследований и их грамотной расшифровки невозможна. Человек может предположить наличие инфекции по ряду симптомов, например, повышенной утомляемости, постоянной слабости, сочетающихся с расстройствами пищеварения. К группе риска относят людей, часто подвергающихся инвазивным медицинским или эстетическим процедурам, пренебрегающими барьерными методами защиты при случайных половых контактах.

Наиболее простой способ самостоятельной диагностики – проведение экспресс-теста либо сдача анализов в платной лаборатории. Однако при наличии характерной для вирусного поражения печени лучше пройти комплексное обследование под контролем врача.

Обследование на гепатит С при беременности является обязательным и выполняется дважды: при первой консультации у гинеколога и постановке на учет, а затем в середине последнего триместра. Доктор назначает анализы, выполняемые по методики ИФА. Но основная проблема заключается в получении ложноположительных результатов. После зачатия в организме женщины начинается выработка протеинов, близких по структуре к антителам к гепатиту С.

Поэтому позитивный ИФА при беременности не всегда является признаком инфицирования и требует подтверждения методом ПЦР. Также в период вынашивания ребенка возможно обследование органов брюшной полости при помощи УЗИ, иногда проводится эластометрия. Но при подтверждении диагноза лечение может навредить плоду. Поэтому назначают поддерживающие здоровье женщины медикаменты, а основную терапию начинают после родов.

Читайте также:  Национальный проект по вирусному гепатиту

Лечение гепатита С вполне реально как на острой, так и на хронической фазе. Но одно из условий успешной терапии – своевременная диагностика, когда еще возможно восстановление функциональной активности печени. Поэтому специалисты рекомендуют самостоятельно либо по направлению от врача сдавать соответствующие тесты, а при позитивном результате незамедлительно обращаться за медицинской помощью.

источник

Своевременная диагностика гепатита С минимизирует риски развития тяжелых последствий болезни. Вирус, размножаясь в организме, приводит к уничтожению гепатоцитов и развитию стойкого аутоиммунного воспаления. Основные методы диагностики помогают выявить вирус на ранних стадиях инфицирования. Если заболевание обнаружено, необходимо более полное обследование. Для этого проводятся инструментальные виды проверки течения болезни.

Если болезнь протекает в безжелтушной смазанной форме, то практически невозможно понять, что у тебя гепатит С. В 80% случаев заболевание остается незамеченным, а возбудитель вируса постепенно разрушает печеночные клетки и весь организм.

Для верификации диагноза и осложнений заболевания у взрослых и у детей обязательно используют аппаратные и лабораторные методы диагностики. Аппаратные процедуры позволяют визуализировать страдающий орган, определить степень разрушения гепатоцитов, отсутствие или наличие тяжелых осложнений (опухоли, фиброза, жирового гепатоза и т. д). Лабораторные анализы – часть дифференциальной диагностики. По анализу крови можно выявить самого возбудителя или наличие антител к нему.

Как определить гепатит С в домашних условиях? Для этого существуют новейшие экспресс-тесты (подробнее о них можно почитать в данной статье). Они помогают с высокой точностью обнаружить заболевание после самостоятельно проведенного анализа дома. Для проверки необходима капля крови или слюны. Однако окончательный диагноз ставится только после проведения лабораторных исследований в медицинском учреждении.

В настоящее время лабораторная диагностика HCV позволяет не только с точностью определить наличие вируса в организме человека, но и установить, сколько приблизительно времени прошло с момента заражения, насколько активно происходит развитие заболевания.

Первичные диагностические исследования проходят в несколько этапов и позволяют получить ответы на ряд вопросов, необходимых для определения дальнейшей тактики терапии:

  • насколько эффективно иммунная система отреагировала на контакт с вирусом;
  • как давно HCV находится в организме человека;
  • какова фаза инфекции (острая или хроническая в стадии обострения);
  • насколько тяжело протекает заболевание (чем выше вирусная нагрузка, тем активнее патологический процесс);
  • генотип и подтип вируса (имеет решающее значение для назначения конкретных препаратов).

Но перечисленные исследования целесообразно проводить только после окончательного подтверждения диагноза. Для этого сдают несколько лабораторных анализов.

После попадания в организм начинается активная репликация вируса. Однако до достижения определенного уровня, HCV в крови не обнаруживается. Самые современные высокочувствительные тест-системы ПЦР способны выявить болезнь спустя 3–4 недели. Но при подозрении на возможность заражения и отрицательном результате исследования рекомендуют провести повторный тест.

Анализ на гепатит Ц путем проведения иммуноферментного исследования (ИФА) информативен на сроке 10–16 недель после заражения. За это время антитела к вирусу вырабатываются в достаточном для определения количестве.

Но при этом необходимо учитывать возможность как ложноотрицательных, так и ложноположительных результатов ИФА. Такая вероятность существует при:

  • беременности (вне зависимости от срока);
  • иммунодефицитных состояниях;
  • аутоиммунных заболеваниях;
  • онкологии, затрагивающей систему кроветворения.

Кроме того нельзя исключать и человеческий фактор, то есть лабораторную ошибку, допущенную при выполнении анализа. Поэтому при положительном результате доктора рекомендуют сделать исследование повторно. Аналогичной тактики придерживаются и в том случае, если специфические симптомы прогрессируют на фоне отрицательных ИФА и/или ПЦР.

Диагностическое обследование пациента с возможной HCV-инфекцией регламентировано международными медицинскими протоколами.

В соответствии с рекомендациями ВОЗ, анализы проводят в таком порядке:

  • печеночные пробы (на начальной стадии заболевания или латентном течении гепатита С показатели могут укладываться в физиологические границы нормы);
  • ИФА (на первом этапе рекомендуют сделать суммарный ИФА, определяющий совокупность иммуноглобулинов типа G и M, при положительном результате выполняют отдельно анализы на IgG и IgM к HCV);
  • полимеразная цепная реакция (ПЦР), делится на качественный (определяет только наличие патогенной РНК в крови), количественный (оценивает уровень РНК) и генотипирование (выявляет точную разновидность HCV – генотип и подтип).

В дополнение врач назначает и стандартный перечень анализов. Он включает исследование на ВИЧ и другие виды вирусного и инфекционного гепатита, ОАК и ОАМ, оценку липидного и белкового профиля крови, иммунограмму и др. При подозрении на наличие фиброза, цирроза или гепатоцеллюлярной карциномы показана биопсия печени.

Исследования, проводимые методом ПЦР, считаются наиболее достоверными способами диагностики гепатита C. Проведение полимеразной цепной реакции позволяет выявить специфические вирусные РНК в крови человека, оценить их количество и структуру нуклеотидной цепи.

ПЦР диагностика может проводиться несколькими методами (каждый отличается по технологии проведения и стоимости для пациента):

Разновидность ПЦР Описание анализа
Качественный Направлен только на выявление РНК вируса гепатита C
Количественный Проводится для оценки вирусной нагрузки (расшифровку проводит только врач)
Генотипирование Необходимо для определения разновидности инфекции

ПЦР рекомендуют проводить после исследования анти HCV методом ИФА, который позволяет определить специфические антитела к гепатиту С. Наличие IgM свидетельствует об остром течении инфекции, IgG – о хроническом или латентном. По титру антител можно предположить активность патологического процесса, однако точную вирусную нагрузку определяют только методом ПЦР.

Качественный анализ является своего рода проверкой, есть ли РНК HCV в крови человека. В отличие от результатов ИФА, которые зависят от определенных факторов (например, наличия беременности или состояния иммунной системы) данные ПЦР однозначны. Но при помощи этого исследования можно выявить, есть ли РНК гепатита С или нет.

Для полной клинической картины необходимы другие тесты. Поэтому в бланке лаборатории указано только наименование анализа и полученный результат. Средняя стоимость качественного ПЦР в частных клинических кабинетах составляет порядка 1000 рублей.

Проводится для определения уровня вирусной нагрузки, то есть количество копий вируса гепатита С в определенном объеме плазмы крови. Единицы измерения МЕ/мл. Высокие показатели указывают на острое течение заболевания и часто свидетельствуют о риске серьезных поражений печени.

Данные для расшифровки результатов анализа приведены в таблице, но интерпретировать исследования и ставить окончательный диагноз должен только инфекционист-гепатолог.

Полученный результат Расшифровка
Отрицательный Человек не заражен HCV или количество РНК в крови слишком низко для определения при помощи лабораторных тест-систем (возможно в течение 1–4 недель после инфицирования)
1,5 МЕ/мл Низкая вирусная нагрузка, прогноз благоприятен
4ˑ106 –2ˑ108МЕ/мл Средняя вирусная нагрузка, служит показанием к немедленному началу терапии
Выше 2ˑ108МЕ/мл Высокая вирусная нагрузка, прогноз неблагоприятен. Необходима противовирусная терапия после всесторонней оценки состояния печени

В лабораториях могут отличаться марки тест-систем и, соответственно, используемые единицы измерения и нормы. Поэтому при расшифровке рекомендуют ориентироваться на референсные значения.

Стоимость исследования в платной лаборатории достигает 2500 рублей.

Генотипирование один из основных анализов на этапе подготовки пациента к началу курса противовирусной терапии. Исследование основано на отличиях в структуре известных 6 разновидностей (и около 100 подтипов) HCV. В бланке с результатами указывают выявленный генотип и субтип, например, 1b или 3a и т.д. Полученные данные позволяют врачу определить перечень назначаемых препаратов и продолжительность лечения, объяснить пациенту возможные исходы терапии.

Цена проведения генотипирования в частной клинике колеблется в пределах 1000 рублей.

Экспресс-тест на вирусный гепатит С рассчитан на выявление антител, которые вырабатывает иммунная система после попадания вируса в организм.

Тест-полоски бывают:

  1. Для диагностики по крови. В коробке содержится набор всех необходимых инструментов, сразу после вскрытия система готова к работе. Прилагается инструкция, описывающая пошаговый алгоритм действия, начиная с забора крови, заканчивая оценкой полученного результата.
  2. Диагностика по слюне. Специальным одноразовым аппаратом собирают небольшое количество слюны или десневой жидкости. Результат оценивают через 20 минут.

Cito-тесты можно купить в аптеке без рецепта. Их достоверность выше 96%. Все зависит от правильности забора биоматериала, соблюдения правил проведения тестирования, фирмы-изготовителя, способа хранения и т. д. Цены на изделия разнятся от 300 до 1600 рублей.

Для выработки антител в организме требуется как минимум 2–3 недели. В некоторых случаях это процесс удлиняется до полугода.

Общий анализ крови сдают в любое время, по истечении часа от приема пищи. Анализ крови на биохимические показатели строго натощак утром, с 9 до 11 часов. Причина в биологическом ритме организма. Ночной голод должен быть не менее 10 часов.

При использовании тест-полосок дома, важно чтобы гематокрит (текучесть крови) был в пределах нормы. Густая кровь искажает полученные результаты.

Вирусологический анализ на гепатит (определение антигенов и антител) делают из венозной крови, она обладает большей диагностической ценностью. Между забором биоматериала и последним приемом пищи должно пройти 4–6 часов. Накануне лучше отказаться от слишком жирной пищи, алкоголя, переедания.

Если недавно проходили Rg-графию, ректальный осмотр прямой кишки, физиопроцедуры, присутствовал прием сильнодействующих препаратов и антибиотиков, то необходимо сказать об этом своему доктору или лаборанту.

Покажет ли общий анализ крови гепатит С? Нет, в нем отсутствуют показатели для дифференциальной диагностики вируса. Но опытного врача-гепатолога должен насторожить лейкоцитоз и резкое увеличение показателей СОЭ (скорость оседания эритроцитов). Развернутый анализ на биохимию, выявит характерные для болезни изменения в работе печение, появление грозных осложнений хронического и острого гепатита С.

Приведем типичные лабораторные тесты и их диагностическую ценность:

>нормы при циррозах и вирусных гепатитах

Аппаратные исследования имеют высокую диагностическую ценность, особенно для выявления хронического гепатита С. Это важно для скорейшего начала терапии и в борьбе с недопущением печеночной недостаточности.

Исследование предусматривает забор биоптата для дальнейшего гистологического анализа полученной печеночной ткани. Биопсия печени – один из самых точных анализов дифференциальной диагностики хронического вирусного гепатита С, позволяющих проверить наличие вируса в тканях, возможные злокачественные процессы, степень фиброза и т. д.

Чаще всего прибегают к трем видам биопсии:

  1. Чрескожная. Прокалывают переднюю брюшную полость, далее под контролем УЗИ или вслепую достигают печени, где и производят забор биоптата. Манипуляция не требует общего обезболивания, малотравматичная с минимальным периодом нахождения в стационаре.
  2. Лапароскопическая. Выполняют под общим наркозом, посредством лапароскопа – аппарата с видеотехникой. Операция инвазивная, но доктор будет видеть состояние органа на экране, а биоптат возьмут из самых пораженных участков печеночной ткани.
  3. Трансъюгулярная. Подходит для пациентов с повышенным риском кровотечения. Прокол делают в области крупных кровеносных сосудов, исследование проводят под ЭКГ-контролем.

Противопоказания:

  • тяжелые нарушения в системе свертывания крови;
  • наличие единичных или множественных эхинококковых кист;
  • сосудистые опухоли печеночной ткани;
  • присутствие гноя или гнойное расплавление желчевыводящих путей;
  • эмпиема плевры справа, поддиафрагмальный абсцесс;
  • синдром хилаидити;
  • запущенная форма эмфиземы легких;
  • желтуха, как результат формирования участка обструкции в области дренирования желчного протока;
  • нежелание пациента давать письменное разрешение на проведение процедуры.

Большинство осложнений возникают в первые 24 часа после биопсии. Поэтому пациента оставляют в клинике до следующего утра. Ведется мониторинг артериального давления и частоты сердечных сокращений.

Это поможет своевременно диагностировать кровотечение из пункционного канала. Рекомендуют постельный режим 6–8 часов. О подготовке к биопсии подробно расскажет доктор, все его рекомендации следует строго выполнять.

УЗИ – распространенная доступная по цене аппаратная диагностическая процедура для исследования органов брюшной полости. Ультразвук, дополненный портальной системой Doppler, и с контрастным усилением являются основными методами оценки состояния паренхимы печени, портальной венозной гипертензии и других изменений, характерных для течения гепатита С.

Подготовка к УЗИ несложная, но требующая тщательного выполнения всех рекомендаций. На исследование приходят строго натощак, с периодом голода не меньше 10 часов. За несколько дней отказываются от всех продуктов, вызывающих метеоризм.

Если кишечник остается вздутым, показано ветрогонное средство. Накануне разрешено сделать высокую очистительную клизму.

Фибросканирование – неинвазивная диагностическая процедура для обнаружения участков ремоделирования соединительной ткани печени. Измерение проводится с помощью специального датчика, размещенного на уровне печени между двумя ребрами. Во время измерения пациент ощущает только легкие, безвредные, безболезненные вибрации на коже.

Под аппаратом больной находится всего несколько минут, манипуляцию повторяют при первой необходимости. Приблизительно за 2–3 часа до осмотра пациенту запрещают принимать пищу. Эластометрия противопоказана при тяжелых формах ожирения, асцита и дыхательной недостаточности.

Если УЗИ дало неопределенный результат, то назначают КТ (компьютерную томографию) или МРТ (магнитно-резонансная томография) печени.

Эти исследования имеют общие предосторожности и противопоказания:

  • масса тела >150 кг;
  • металлические украшения, молнии, пуговицы снимают;
  • обязательно скажите своему врачу о случаях аллергии, длительно применяемых медикаментах, фобиях закрытого пространства;
  • психические расстройства, неадекватное поведение пациента;
  • некоторые заболевания, такие как миелома и почечная недостаточность, требуют коррекции плана Rg-облучения;
  • ношение брекет-систем.

КТ не назначают при беременности, если в кишечнике имеется бариевая смесь или последний прием пищи был раньше, чем за 4 часа до процедуры. МРТ не делают, если на место исследования наложен гипс, имеется металлический протез или водитель сердечного ритма.

Компьютерную томографию делают, используя Rg-лучи, МРТ – магнитные волны. Полученные послойные снимки помогают визуализировать структурные изменение (фиброз, цирроз, жировой гепатоз) и размер органа. Если используют контрастное вещество, то на снимках становятся видны очаговые изменения, диаметром >1 см.

Ранняя диагностика болезни особенно полезна при беременности. Гепатит С способен серьезно осложнять течение беременности, увеличивает риск развития внутриутробных патологий, может привести к нарушениям функций печени. Золотым стандартом является обследование за полгода до планирования малыша. Если присутствие инфекции будет обнаружено, то нужно пройти курс терапии до беременности.

Если беременная не была обследована до зачатия, то от специфических анализов нельзя отказываться ни в коем случае. Первый раз исследование на гепатит С проводят в женской консультации при постановке на учет, второй раз – во втором триместре, третий – в третьем. При наличии жалоб, позволяющих заподозрить заболевание, назначают внеплановое лабораторное тестирование.

Как показывает практика, у врачей в арсенале есть все необходимые диагностические возможности для своевременного обнаружения инфекции. Потому, как только человек заподозрит или поймет, что он инфицирован, следует незамедлительно отправляться на прием к инфекционисту, терапевту или гепатологу.

Только своевременное начало правильно подобранной схемы терапии приведет к полному излечению или длительной ремиссии.

источник

Диагностика острых и хронических гепатитов обязательно должна носить комплексный характер.

Прежде всего она направлена на определение возбудителя данного заболевания. Также врач обязательно должен оценить степень нарушения работы печени и выявить сопутствующие осложнения. Начальной стадией диагностики является изучения анамнеза и осмотр пациента. После этого специалист назначает другие методы диагностики вирусных гепатитов – лабораторные и инструментальные.

В процессе ПЦР-диагностики заболевания определяют маркеры острых и хронических гепатитов. К ним относят следующее:

  1. Маркеры гепатита А. Анти-НАV IgM появляются в крови к окончанию инкубационного периода. В этот момент у человека возникают первые симптомы гепатита. Антитела присутствуют в сыворотке около полугода. Благодаря выявлению данных веществ методом ПЦР можно говорить о текущей или недавно возникшей инфекции.
    Анти-НАV-total возникают в сыворотке позже. Они говорят о присутствии HAV-инфекции и последующем формировании иммунитета. Данный показатель, полученный в процессе исследований методом ПЦР, может использоваться для определения эффективности профилактики с помощью вакцин.
  2. Маркеры гепатита В. В эту категорию входит НВsAg, который является поверхностным антигеном гепатита В и появляется в завершающей стадии инкубационного периода. Его не удается выявить в 10 % острых случаев заболевания и большинстве хронических.
    Антитела анти-НВs возникают спустя 3-12 месяцев после начала развития патологии. Они присутствуют в организме примерно 5 лет. Ангиген НbcorA не удается определить в сыворотке крови. Его удается выявить лишь в гепатоцитах.
    Анти-Нвcor IgM представляет собой антитела к ядерному антигену, которые характерны для завершения инкубационного периода и начала развития болезни. Определение данных веществ является значимым критерием при проведении ПЦР-диагностики.
    Анти-Нвcor IgG характерны для парентеральных гепатитов во время развернутой клинической картины. Они сохраняются на всю жизнь и свидетельствуют о том, что человек перенес инфекцию. В завершение инкубационного периода можно обнаружить НвeAg. Он сохраняется в течение 10-12 недель и говорит о репликации парентеральных вирусов.
    Анти-Нве представляют собой антитела к HbeAg и возникают во время развернутых проявлений. Данные вещества сохраняются на 5 лет после заболевания. При хронических парентеральных гепатитах их выявляют и по истечении указанного времени.

Помимо ПЦР-диагностики, очень важно оценить количество ферментов печени. Поражение тканей органа сопровождается попаданием в кровь ферментов, что влечет их увеличение в составе плазмы. В нормальном состоянии количество АСАТ составляет 5-35 Ед./л, а АЛАТ – 5-40 Ед./л.
Лабораторная диагностика вирусных гепатитов должна включать определение плазматической активности щелочной фосфатазы. В случае развития гепатита она увеличивается. В норме данный показатель составляет 30-115 Ед./л.
Немаловажное значение имеет оценка фракций билирубина – свободного и связанного. Его повышение обусловлено неспособностью клеток печени выводить из организма данный пигмент. В норме концентрация связанного билирубина составляет 0,1-0,3 мг/дл, а свободного – 0,2-0,7 мг/дл.

Наши постоянная читательница

Наша постоянная читательница справилась с ГЕПАТИТОМ С действенными медикаментами — Софосбувир и Даклатасвир. По отзывам пациентов — результат 97% — полное избавление от вируса. Мы решили посоветовать ДЕЙСТВЕННУЮ терапию Вам. Результат почти 100%. ДЕЙСТВЕННЫЙ МЕТОД.

Чтобы обследовать органы брюшной полости, обычно применяют ультразвуковое исследование. Это достаточно простой метод, который помогает визуализировать увеличение печени и других органов, а также оценить происходящие в них изменения. Также с помощью УЗИ оценивается состояние сосудов. Если же врач планирует сделать пункционную биопсию, данный метод поможет выбрать оптимальное место для прокола.
С помощью данного аппарата удается увидеть на мониторе определенные сечения внутренних органов. В результате можно визуализировать локальные изменения в них – камни, опухолевые образования и т.д.
Неправильные результаты можно получить исключительно в том случае, если работа органа нарушается на клеточном уровне. Вследствие этого весь орган поражен. К примеру, при изменении клеток печени удастся обнаружить нарушение оттенка тканей. Однако информацию относительно характера и тяжести болезни получить не удастся.
В такой ситуации проводится пункционная биопсия. Это наиболее точная методика, которая позволяет получить максимальное количество информации. С помощью данного способа оценивается структура тканей печени, что позволяет наиболее точно диагностировать гепатит.

Гепатит у беременных – очень опасная патология, поскольку она практически всегда провоцирует нарушения в развитии плода. При поражении вирусом типа В практически всегда заражается и ребенок. Наличие гепатита С у беременных провоцирует несколько иную картину. Тем не менее, нельзя сказать, развитие данного заболевания у беременных спровоцирует инфицирование малыша.
Чтобы провести правильную диагностику, прежде всего нужно сдать анализ крови и провести ПЦР-диагностику. При гепатите В у беременных имеет значение наличие HBsAg и НВеАg. Если они присутствуют, риск заражения ребенка повышается. В такой ситуации также уменьшается эффективность вакцины для беременных.
Если же будущая мама заболевает гепатитом С, инфицирование ребенка происходишь лишь в 5 % случаев. При этом данный вид заболевания передается от беременных к плоду лишь при условии активного протекания недуга. В большинстве случае ребенок заражается от матери при родах.
При выявлении вирусного гепатита у беременных обязательно требуется стационарная терапия. Если у женщин развивается цирроз печени, нужно принимать все меры, чтобы беременность и вовсе не наступила. Дополнительные нагрузки на организм, которые возникают у беременных, спровоцируют сильное обострение болезни.
При хронизации процесса беременность не оказывает влияния на клиническую картину патологии. Иногда у беременных женщин воспаления в печени и вовсе прекращаются. Однако нужно быть готовой к тому, что после родов гепатит резко обострится. Потому так важно держать данный процесс под контролем.

Дифференциальная диагностика проводится для того, чтобы отличить вирусный гепатит от острых поражений печени, связанных с воздействием химических веществ. Особенно важно провести диф диагностику алкогольной формы заболевания. На начальном этапе развития этого недуга часто ставят ошибочный диагноз, принимая его за вирусный гепатит. Это происходит в 50 % случаев.
Чтобы провести диф диагностику этих процессов, нужно учитывать, что алкогольный гепатит развивается исключительно на фоне постоянного употребления большого количества спиртного. Важными критериями диф диагностики в данном случае является следующее:

источник

М.И.Михайлов, Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН, Москва

При постановке диагноза «гепатит С» необходимо учитывать следующие наиболее важные факторы:

  • показатели активности «печеночных» ферментов;
  • наличие или отсутствие маркеров инфицирования вирусом гепатита С (ВГС) и другими гепатотропными вирусами;
  • данные эпидемиологического анамнеза;
  • результаты клинического осмотра пациента. Только комплексный учет данных факторов позволяет с высокой степенью надежности диагностировать это заболевание. Лабораторный работник должен предоставить объективную информацию о выявленном спектре вирусных антигенов и антител, а также РНК ВГС, позволяющую клиницисту, сотруднику службы переливания крови и врачу-эпидемиологу решать стоящие перед ними задачи. Чаще всего это:
  • выявление лиц с наличием ВГС для снижения уровня посттрансфузионного гепатита С;
  • постановка диагноза и разграничение острого и хронического гепатита С;
  • прогноз заболевания;
  • назначение, оценка и прогноз эффективности проводимой терапии;
  • изучение широты распространения ВГС в популяции и различных группах населения.
    При этом основными направлениями работ, выполняемых лабораторными сотрудниками, являются:
  • разработка и выбор наиболее информативных методов выявления маркеров инфицирования ВГС;
  • определение критериев объективной оценки полученных результатов;
  • разработка оптимальных алгоритмов проведения лабораторных исследований;
  • внедрение системы повышения качества выявления маркеров инфицирования ВГС.

    Основой лабораторной диагностики гепатита С служат знания о ВГС, его репликации, информация о динамике появления и исчезновения маркеров инфицирования, а также современные иммунохимические и молекулярно-биологические методы детекции антигенов, антител и нуклеиновых кислот.

    ВИРУС ГЕПАТИТА С. ВГС впервые был идентифицирован в 1988 году, когда группа исследователей во главе с М. Houghton и Choo Q.L, применив новые молекулярнобиологические методы исследования, клонировала и секвинировала геном вируса [I]. Частица вируса гепатита С имеет сферическую форму со средним диаметром около 50 нм [2,3]. Попытки визуального обнаружения и изучения строения вируса гепатита С предпринимались с момента открытия вируса, однако до сих пор отсутствуют хорошо документированные результаты этих исследований, что, возможно, связано с трудностями накопления вирусных частиц в необходимых количествах.

    ВГСединственный член рода Hepacivirus в семействе Flaviviridae, в которое входят такие вирусы, как вирус диареи быков и лихорадки свиней (род Pestivirus) и вирус желтой лихорадки, вирус дэнге и GB-вирусы: GBV-A, GBV-B и GBV-C/HGV (род Flavivi-rus). Схема строения вируса гепатита С может быть представлена следующим образом (схема № 1). Нуклеокапсид содержит РНК вируса гепатита С. Сверху нуклеокапсид покрыт липидной оболочкой с утопленными в ней оболочечными белками, кодированными РНК ВГС. Геном вируса представлен однонитевой линейной молекулой РНК положительной полярности, протяженностью около 9600 нуклеотидов. Организация генома ВГС подобна другим флавивирусам. В нем выделяют две зоны, кодирующие структурные и неструктурные (функциональные) белки. Гены, кодирующие структурные белки, расположены у 5′ области генома вируса, а неструктурные у 3′ области. Ген ВГС имеет одну открытую рамку считывания (ОРС), единый полипептид (приблизительно в 3000 аминокислот), который под действием вирусных и клеточных протеаз нарезается на структурные и неструктурные белки.

    Рис. 1. Структурные элементы HCV

    К структурным белкам относят белки, кодированные Core, El и Е2 зонами РНК ВГС. Выявлено три формы С-белка ВГС: полноразмерная (р21) с молекулярной массой — 21 kD, усеченная (р19) и форма (р16), обнаруженная в ядрышках инфицированных гепатоцитов. На своей поверхности С-белок несет различные высококонсервативные В-клеточные эпитопы, существование которых чрезвычайно важно для выявления антител к ВГС в процессе лабораторной диагностики гепатита С.

    Зоны РНК ВГС — Е1 и Е2 кодируют белки с молекулярной массой 31 и 70 kD . Эти белки имеют несколько участков N-гликозилирования; в Е1 белке определено до 6 таких участков, а в Е2 — 11. В участке Е2 заключена информация о небольшом белке — р7, который в структуре вируса не обнаружен.

    Обозначение регионов, расположенных ближе к 3′- концу РНК ВГС — как зон, несущих информацию о неструктурных белках вируса, указывает на то, что эти белки не являются структурными компонентами вирусной частицы. В неструктурной зоне РНК ВГС выделяют участки, обозначенные как: NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B. Большинство из белков, кодированных неструктурными зонами РНК ВГС, необходимы для репликации вируса.

    Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей РНК изолятов ВГС, полученных в различных регионах мира и даже в процессе заболевания от одного и того же пациента, выявил основную особенность этого вируса — высокую гетерогенность РНК. Положение о значительной генетической вариабельности РНК ВГС легло в основу теорий, объясняющих: длительное (иногда пожизненное) носительство вируса, частое развитие хронического заболевания, трудности в терапии и создании эффективных вакцинных препаратов. Наиболее значительные отличия последовательностей РНК ВГС сосредоточены в N-концевой части региона Е2, которую обозначают — «гипервариабельный регион» (HVR) [4].

    В настоящее время определено 6 основных генотипов и свыше 100 субтипов ВГС. Генотипы 1а, 1в, 2а, 2в, 2с и За составляют более 90% HCV-изолятов, полученных в Северной и Южной Америке, Европе, России, Китае, Японии и Австралии/Новой Зеландии [5]. Генотипы 4, 5а и 6 соответственно регистрируются в Центральной и Южной Африке, Юго-Восточной Азии. В России и странах СНГ зарегистрировано преобладание генотипа 16 (не менее 68,9%) [6,7]. Считается, что пациенты, инфицированные генотипом 1 (особенно 1в), отвечают хуже на лечение по сравнению с пациентами, инфицированными другими генотипами вируса.

    У больного ВГС циркулирует как популяция частиц вируса, у которых геномы отличаются друг от друга на 1-2% (квазиспецифичности) в результате мутаций, накапливающихся во время инфекции и/или попавших в организм пациента при заражении. Эти мутантные формы могут способствовать более активной репликации или могут помогать вирусу уклоняться от иммунного ответа организма и потенциально влиять на исход острой инфекции, различия в течении заболевания и ответе на интерферонотерапию [8].

    ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИ-ВГС. После открытия вируса ВГС и определения его роли в развитии посттрансфузионного гепатита — «ни А, ни В» перед исследователями стояла задача разработать методы, способные выявлять лиц с ВГС и пригодные для диагностики острого и хронического гепатита С. Было установлено, что антигены ВГС циркулируют в чрезвычайно низких концентрациях, и очевидно, что методический уровень конца 80-х годов XX века, применяемый для детекции вирусных антигенов, был явно недостаточен.

    В 1989 году группа исследователей фирмы «Chiron Corporation» под руководством Q-L.Choo осуществила клонирование РНК ВГС и получила иммунореактивные олигопептиды, вступающие в реакцию с антителами, циркулирующими в крови больных хроническим гепатитом «ни А, ни В». Эти олигопептиды стали основой диагностических препаратов для выявления антител к ВГС. Это определило быстрый прогресс в разработке и промышленном выпуске диагностических препаратов. Основным методом, применяемым для детекции анти-ВГС, стал твердофазный иммуноферментный анализ, как метод, отвечающий требованиям практического здравоохранения -т.е. обладающий высокой чувствительностью, специфичностью и простотой проведения.

    Учитывая, что ВГС персистирует в крови больных острым и хроническим гепатитом С одновременно с анти-ВГС, внимание разработчиков диагностических препаратов концентрировалось на создании тест-систем для детекции антител, обеспечивающих максимально полное выявление носителей вируса и максимально ранние сроки диагностики острой инфекции. Многообразие антигенов и антигенных детерминант, кодированных структурной и неструктурной зоной РНК ВГС, определило направление в конструировании диагностических препаратов выбором и аранжировкой олигопептидов, применяемых для их создания. За время, прошедшее с момента открытия ВГС, созданы диагностические системы трех поколений ( таблица 1).

    Таблица 1
    Диагностические препараты для выявления анти-ВГС [9]

    Применяемые пептиды,
    зоны РНК ВГС, в которых
    они кодированы

    Время первого
    выявления
    анти-ВГС от
    начала желтухи

    С22-3 Core
    С200 NS3 и NS4
    СЗЗс NS3
    С 100-3 NS4

    С22-3 Core
    С200 NS3 и NS4
    СЗЗс NS3
    Пептид NS5

    Введение дополнительных пептидов, прежде всего с22-3 (Core), в диагностические препараты 2-го и 3-го поколения позволило решить главную задачу, то есть увеличить чувствительность, специфичность и, самое главное, выявляемость анти-ВГС . Благодаря диагностикумам 3-го поколения удается выявлять до 97% носителей ВГС. Вместе с тем, определенную дискуссию вызвало решение о введении в диагностикум пептида, кодированного NS5 регионом РНК ВГС. По мнению некоторых исследователей, присутствие этого пептида не имеет принципиального значения для улучшения качества диагностического препарата. [10,11]. Однако антитела к NS5 могут быть выявлены в более ранние сроки инфекции, что улучшает качество лабораторной диагностики острого гепатита С. [12].

    В настоящее время во всем мире, в том числе и в России, применяются диагностические препараты 3-го поколения. Пептиды, применяемые в диагностических препаратах, получены при помощи рекомбинантной технологии (например, диагностикумы фирм: «Диагностические препараты», г. Нижний Новгород; «Вектор» г. Новосибирск; «Roche»; «Abbott» и др.), или синтетической (000 МЦ «Авиценна» г. Санкт-Петербург; «Organon» и др.). Диагностикумы, в которых одновременно использованы оба вида пептидов, получили обозначения, как препараты 4-го поколения. По своим характеристикам эти препараты не обладают значимыми различиями. Сравнительные испытания, регулярно проводимые МЗ России, продемонстрировали сопоставимую чувствительность диагностических препаратов отечественных и зарубежных производителей.

    Установлено, что применение диагностикумов 3-го поколения для выявления анти-ВГС среди иммунокомпетентного населения (например, доноров крови) оценивается в 98,8-100%. В то же время среди иммунокомпрометированных лиц, например, таких как пациенты после трансплантации почки, костного мозга или лица, инфицированные ВИЧ, этот показатель значительно ниже — 50 — 95% [12]. S.George с соавт. [13] продемонстрировали, что у 8,4% больных ВИЧ-инфекцией регистрируются ложно-негативные результаты выявления анти-ВГС. Причем у таких пациентов в процессе наблюдения может регистрироваться серореверсионный эффект, т.е. регистрация позитивного результата после серонегативного анти-ВГС периода [14].

    Одна из наиболее важных проблем при проведении исследований на наличие анти-ВГС — ложнопозитивные результаты. Их появление может быть связано с неспецифическим взаимодействием компонентов реакции, возможными перекрестными реакциями с другими вирусными антигенами и многими другими факторами. Уровень ложно-позитивных результатов при выявлении анти-ВГС с различными диагностическими препаратами может достигать 10-20% [15,16]. Повышенный уровень таких результатов отмечен среди больных онкологическими и аутоиммунными заболеваниями, лиц с иммунодефицитными состояниями и больных сифилисом [16,17]. Существование ложнопозитивных результатов ставит перед лабораторным работником задачу их разграничения с истинным выявлением анти-ВГС. Для решения этой задачи служит обнаружение в образце сыворотки крови РНК ВГС. Однако отрицательный результат обнаружения РНК ВГС не позволяет говорить о наличии ложнопозитивного выявления анти-ВГС. Необходимо учитывать, что анти-ВГС могут изолированно циркулировать в крови пациента, который выздоровел после острого гепатита С (10-15%) или у которого произошла элиминация РНК ВГС в результате проводимой терапии.

    КОНФИРМАЦИОННЫЕ (SUPPLEMENTAL) ТЕСТЫ. Для разграничения ложнопозитивных образцов и образцов, действительно содержащих антитела к ВГС, разработаны дополнительные (Supplemental) тесты. Наиболее часто в этих тестах используется принцип иммуноблота [например — тест RIBA («Ortho-Clinical Diagnostics»); «LiaTek HCV» (Organon Teknika)], когда на нитроцеллюлозной мембране адсорбируются в виде отдельных полос антигены, кодированные различными зонами РНК ВГС. Анти-ВГС взаимодействуют с адсорбированными антигенами с помощью меченных ферментом антител против Ig G человека с последующей их детекцией при помощи субстратного комплекса. Помимо иммуноблота в качестве дополнительных тестов также используют диагностические препараты для выявления анти-ВГС против конкретных антигенов, кодированных различными зонами РНК ВГС [«Спектр 4» («Имбио», г. Нижний Новгород; РекомбиБест АНТИ-ВГС-СПЕКТР» — ЗАО «Вектор Бест», г. Новосибирск; ИФА- Анти-НСУ-Спектр, НПО «Диагностические системы», г. Нижний Новгород].

    Разработка и внедрение этих тестов идет параллельно с внедрением скрининговых тестов для выявления анти-ВГС, повторяя принцип расширяющегося спектра использованных пептидов в каждом последующем поколении диагностических препаратов. Так, диагностикум RIBA-III отличается от предыдущего поколения добавлением пептида, кодированного зоной NS5. Принципы, позволяющие подтвердить позитивный результат выявления анти-ВГС, прежде всего включают: возможность (в некоторых случаях) получения более четких результатов ферментативной реакции при взаимодействии с отдельными пептидами, а также применение в диагностикуме расширенного спектра пептидов, которые не используются в скрининговых тестах. Только введение новых пептидов позволяет повысить диагностическую ценность подтверждающих тестов.

    Трактовка полученных результатов, например в таком тесте, как RIBA-III, включает три возможных ответа : позитивный, негативный и неопределенный результат. Последний из них выдается в случае отсутствия четких показаний (согласно инструкции, прилагаемой к диагностическому набору), позволяющих определенно судить о наличии или отсутствии анти-ВГС в исследуемом образце. Соотношение спектра регистрируемых ответов при проведении подтверждающих тестов колеблется в зависимости от характеристик групп пациентов, у которых первично выявлены анти-ВГС [18]. По данным J.M. Pawlotsky с соавт. [19], в половине случаев результатов, трактуемых как «неопределенные», удается обнаружить РНК ВГС. На наш взгляд, правомочность ответа — «неопределенный результат выявления анти-ВГС», выдаваемого лабораторным работником клиницисту, очевидна не только при проведении подтверждающего теста, но и рутинном исследовании на наличие анти-ВГС. Необходимость такой трактовки полученных результатов является отражением современного состояния лабораторной диагностики гепатита С.

    ОПРЕДЕЛЕНИЕ IgM АНТИ- ВГС. В настоящее время созданы и промышленно выпускаются диагностические наборы для выявления IgM анти-ВГС фирмами: «Вектор Бест»; «Диагностические системы»; «Имбио», «Abbott» и др. На этапе конструирования диагностических наборов были созданы наборы для ИФА, основой которых являлись пептиды, кодированные различными регионами РНК ВГС [20] . Выбор был остановлен на пептиде, кодированном Core регионом РНК ВГС и выявлении антител к нему класса IgM. Так же как и при использовании тестов для выявления анти-ВГС (IgG), при исследовании IgM анти-ВГС могут быть зарегистрированы ложнопозитивные результаты. По данным Stevensona D.L. с соавт. [21], до 70% больных с хроническим гепатитам С с наличием IgM анти-ВГС одновременно имели повышенный уровень ревматоидного фактора, который способствует появлению ложнопозитивных результатов. Вместе с тем, по мнению Pawlotsky J.M., наличие ревматоидного фактора не влияет на качество выявления IgM анти-ВГС [22].

    ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИГЕНОВ ВГС. Возможность определения антигенов ВГС привлекала внимание исследователей сразу же после открытия вируса. Принципиальная возможность их тестирования была продемонстрирована К. Krawczynski с соавторами [23], которые иммуногистохимически обнаружили в печеночной ткани антигены ВГС, доказав специфичность иммунофлюоресцентного свечения. Применение поли- и моноклональных антител к различным антигенам ВГС установило наличие ВГС core Ag, антигенов, кодированных NS3 и NS4 зонами РНК ВГС, в ядре и цитоплазме гепатоцитов, у 60-90% больных хроническим ГС [24].Однако дальнейшие исследования продемонстрировали, что антигены ВГС удается обнаружить менее чем в 5% печеночных клеток.

    Первые диагностические тест-системы («Ortho Antibody to Core Antigen (Murine Monoclonal) EL1SA Test System» и «Imucheck F-HCV Ag Core Kokusai») для выявления антигена ВГС появились на рынке иммунобиологических препаратов в 1999 году. В качестве цели детекции был избран Core антиген ВГС, который определяют при помощи твердофазного варианта ИФА, сконструированного на основе моноклональных антител. Первые исследования по применению этих тестов определили их высокую чувствительность, специфичность, и перспективность применения, прежде всего, в службе переливания крови [25,26]. Установлены:

  • возможность определения Core Ag ВГС в сыворотке или плазме крови;
  • специфичность выявления Core Ag ВГС;
  • наличие лиц с циркулирующим антигеном в крови серонегативных по анти-ВГС;
  • частое (90,3%) обнаружение Core Ag ВГС в сыворотках крови с наличием анти-ВГС и РНК ВГС [25];
  • прямая корреляция между концентрацией РНК ВГС и выявлением Core Ag ВГС [25];
  • сокращения фазы «окна» — от момента инфицирования до первого позитивного результата выявления анти-ВГС . Определено, что Core Ag ВГС удается выявлять в 83% случаев (n=24) на следующий день после первого обнаружения РНК ВГС [26] и задолго (в среднем 26 дней) до появления анти-ВГС [27].

    МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ РНК ВГС. Современный этап лабораторной диагностики гепатита С можно охарактеризовать как этап начала широкого применения молекулярно — биологических методов выявления РНК ВГС. Подавляющее большинство методов выявления нуклеиновых кислот было апробировано для выявления РНК ВГС. Принципам конструирования диагностических препаратов и их применению для детекции вирусных ДНК или РНК посвящено значительное количество литературных обзоров, опубликованных как в отечественных [28], так и зарубежных изданиях [29]. Все эти методы можно разделить на две группы, в основе которых лежит применение принципов гибридизации без амплификации избранного участка нуклеиновой кислоты или с их амплификацией, что позволяет значительно повысить разрешающую способность метода.

    Метод гибридизации основан на соединении меченных гибридизационных зондов (генноинженерные или синтетические молекулярные структуры, содержащие в себе нуклеотидные последовательности, комплементарные избранным участкам РНК). Учет результатов осуществляют по интенсивности сигнала, поступающего от метки в составе образовавшегося комплекса.

    При гепатите С этот метод выявления РНК ВГС прежде всего нашел применение для ее идентификации непосредственно в гепатоцитах, в тестах обозначаемых — in situ hibidization [30]. Возможность непосредственной детекции РНК ВГС в ткани позволила обнаружить ее в мононуклеарных клетках крови, клетках слюнных желез и других тканях организма больного гепатитом С [31,32].

    Метод гибридизации, применяемый для детекции РНК ВГС, позволяет продемонстрировать наличие негативных (репликативных) цепей РНК ВГС, что свидетельствует об активной репликации вируса [33].

    Метод полимеразнной цепной реакции — в настоящее время наиболее широко применяемый методический прием, лежащий в основе практически всех молекулярно-биологических методов детекции РНК ВГС. Причем определение РНК ВГС возможно как в качественном, так и количественном варианте, что особенно важно для назначения, мониторинга и оценки эффективности применяемой терапии.

    В качестве основных вариантов метода можно выделить:

  • полимеразную цепную реакцию (ПЦР);
  • лигазную цепную реакцию;
  • NASBA;
  • ТМА (Реакция транскрипционно опосредованной амплификации, Transcrip-tion-mediated amplification).

    Полимеразная цепная реакция — широко применяемый как в России, так и за рубежом метод детекции РНК ВГС. В его основе лежит многоцикловой процесс, напоминающий естественную репликацию нуклеиновой кислоты, причем каждый цикл состоит из последовательных этапов.

    Из исследуемого материала (сыворотка или плазма крови, печеночный биоптат) выделяется РНК ВГС. Учитывая, что нуклеиновая кислота ВГС представлена РНК, а для амплификации необходима молекула кДНК, при помощи фермента — обратной транскриптазы, происходит образование однонитевых молекул кДНК ВГС. На следующем этапе к определенному участку каждой из цепей кДНК ВГС присоединяются т.н. праймеры — короткие олигонуклеотиды, комплементарные известным нуклеотидным последовательностям. Сравнение первичной структуры 5’UTR области генома различных изолятов ВГС выявило их незначительную изменчивость (между генотипами, гомология нуклеотидов — 92-98%, а внутри генотипа 98-99%). Это сделало предпочтительным выбор праймеров из этой зоны РНК ВГС и их применение в диагностических тест-системах, выпускаемых у нас в стране и за рубежом.

    Далее, при помощи фермента ДНК- зависимой ДНК полимеразы происходит синтез новых участков ДНК. В настоящее время в качестве источника этого фермента чаще всего используют бактерии Thermophilus termus (Tth-полимераза) или Thermophilus aquaticus (Taq-полимераза). Обладая термостабильностью в присутствии ионов марганца и магния, этот фермент может быть одновременно использован для синтеза комплементарных одноцепочечных молекул кДНК ВГС и амплификации избранных участков кДНК. На завершающем этапе одного цикла реакции, при помощи ДНК полимеразы происходит синтез новых цепей комплементарных кДНК ВГС. Многократное повторение циклов реакции приводит к накоплению фрагментов кДНК ВГС, которые возможно зарегистрировать при помощи электрофореза в полиакриламидном геле с последующей визуальной детекцией или же с применением гибридизации с олигонуклеотидными зондами, что увеличивает чувствительность и специфичность применяемых диагностических препаратов. Применение праймеров, меченных ферментами, позволяет проводить учет результатов ПЦР при помощи иммуноферментного анализа.

    Постоянная цель, стоящая перед исследователями, конструирующими диагностические системы для выявления РНК ВГС, — повышение чувствительности и специфичности. Этой цели служит вариант ПЦР, обозначенный — «гнездовой ПЦР» (nested PCR) [34]. Отличительной особенностью этого метода от «классического» является одновременное использование двух пар праймеров, одна из которых комплементарно связывается с внутренним участком ампликона, полученного после первого раунда амплификации. Вместе с тем считается, что при этом варианте ПЦР более высок риск контаминации образцов, что может привести к ложноположительным результатам [35] .

    Острая потребность в определении РНК ВГС и сложности, связанные с крупномасштабным производством высокочувствительных и специфичных диагностических наборов для ПЦР диагностики, определили широкое применение препаратов, изготовленных в научных лабораториях. Сравнение этих тест-систем, так называемых — «домашних» тестов («in house tests»), продемонстрировало их высокую вариабельность по чувствительности и специфичности, а также отсутствие воспроизводимости результатов между лабораториями и сериями диагностических препаратов. Так, при проведении первого Европейского цикла «внешнего» контроля качества оценки выявления РНК ВГС (1996 г.) из 136 лабораторий только 22 (16%) смогли абсолютно правильно определить наличие или отсутствие вирусной РНК в предоставленных контрольных образцах [36]. Подобный результат отмечен и в нашей стране, во время проведения аналогичной работы в рамках Федеральной системы внешнего контроля качества (2001 г.), когда из 14 участвующих лабораторий лишь 3 (21,4%) смогли правильно решить поставленную задачу [37].

    Причины появления ложнонегативных и ложнопозитивных результатов выявления РНК ВГС разнообразны. При ложноотрицательных результатах:
    — потеря или разрушение РНК ВГС в ходе подготовки к реакции клинического материала;
    — наличие в образце ингибиторов, влияющих на различные компоненты ПЦР. Эти ингибиторы представлены различными химическими или белковыми субстанциями. Например: наличие в спермальной жидкости ингибиторов обратной транскриптазы не позволяло обнаружить РНК ВГС и говорить о возможности реализации полового пути передачи гепатита С [38]; наличие гепаприна [39]; высокий уровень криоглобулинов в сыворотке крови [40];
    — несоблюдение теплового режима хранения и транспортировки клинического материала. При ложнопозитивных результатах:
    — контаминация между пробами (при обработке образцов и/или работе с реакционной смесью), в том числе и контаминацией позитивным контрольным образцом;
    — контаминация продуктами предшествующий амплификации (ампликонами), которые могут загрязнять исследуемые образцы и растворы через аэрозоли или лабораторное оборудование.

    Массовое внедрение ПЦР диагностики по определению РНК ВГС поставило перед органами практического здравоохранения задачи перехода на новый уровень проведения лабораторных исследований. Выделение изолированных зон для осуществления основных этапов ПЦР (для подготовки проб; проведения амплификации; для учета полученных результатов); отдельный комплект для каждого этапа реакции лабораторной одежды, автоматических пипеток; существование стандартных диагностических наборов и самое главное — наличие высококвалифицированных лабораторных сотрудников позволяет снизить уровень появления ложных результатов.

    Первый стандартизированный набор для определения РНК ВГС («AmplicorTM HCV», «Roche Diagnostic Systems») изготовлен в 1993 году. За прошедшие годы наборы для выявления РНК ВГС прошли эволюцию, основной целью которой стало повышение их чувствительности и специфичности. При конструировании «Amplicor TM HCV» использовано несколько оригинальных методических приемов, позволяющих выявлять 100 и выше копий РНК ВГС в мл., а также бороться с возможными случаями контаминации образцов и растворов, применяемых в наборе. Использование фермента — амперазы и дезиксиуридинтрифосфата (dUTP) позволяет разрушать в первом цикле амплификации предшествующие апликоны, которыми могла произойти контаминация. Разрушение амперазы в конце первого цикла амплификации (при +55 С) не позволяет ферменту разрушать ампликоны, избранные в качестве мишени. Принципиальным новшеством стало введение внутреннего контроля. Смысл этого новшества заключается во введении в каждый исследуемый образец последовательности, подобной амплифицируемому участку РНК ВГС, которая в дальнейшем выявляется с помощью соответствующих праймеров в реакции амплификации в аналогичном режиме. Отсутствие позитивной реакции при выявлении внутреннего контроля свидетельствует о наличии ложнонегативного результата реакции на наличие РНК ВГС в исследуемом образце. Диагностикумом следующего поколения стал препарат, обозначенный — «HCV Amplicor 2,0», при использовании обладающий пределом чувствительностью 50 молекул РНК ВГС.

    Систему выявления РНК ВГС при помощи наборов фирмы «Roche» нельзя рассматривать в отрыве от их приборного обеспечения, определяющего высокое качество тестирования. Разработчики метода стремились к полной автоматизации всех этапов реакции. Воплощением этой идеи стала система «COBASAmpliPrepTM», позволяющая полностью автоматизировать процесс выделения РНК ВГС, амплификации и детекции, тем самым уменьшить риск получения ложнопозитивных и ложнонегативных результатов, сохранив при этом высокую чувствительность и специфичность [41].

    Лигазная цепная реакция выявления РНК BГC.(LCR). Метод основан на способности фермента «ДНК- зависимой ДНК-лигазы» сшивать (лигировать) разрывы фосфодиэфирной связи в ДНК в присутствии АТФ и ионов Mg 2+. Так же как и при проведении «классической» ПЦР для выявления РНК ВГС, первый этап LCR — обратная транскрипция с получением кДНК ВГС. Далее ДНК-лигаза осуществляет связывание двух пар праймеров (комплементарных 5′ некодированной зоне РНК ВГС), которые в дальнейшем амплифицируются. Детекция продуктов амплификации LCR осуществляется при помощи учета реакции антиген-антитело. Каждый из двух прайеров метится различным гаптеном. Первый из них захватывается антителами, адсорбированными на микрочастицах. После процедуры промывания при помощи второй пары антител, меченных флуоресцентной меткой, происходит их избирательное взаимодействие с гаптеном в амплификационном продукте с последующим проведением субстратной реакции и учетом на флюориметре.

    Чувствительность этого метода составляет около 200 копий РНК ВГС в мл, что позволяет его использовать для решения различных клинико-диагностических задач [42]. В настоящее время диагностические наборы выявления РНК ВГС, основанные на LCR, изготовлены фирмой «Abbott».

    Nucleic Acids Seaquencence Amplification — NASBA —метод детекции РНК ВГС основан на одновременном действии трех ферментов: обратной транскриптазы вируса миелобластомы птиц, РНК-азы Н и РНК-полимеразы Т7 [43.]. В отличие от RT PCR на первом этапе не проводится обратная транскрипция РНК ВГС. При помощи использованных ферментов удается получить более 10(9) копий участка кДНК ВГС в течение 90 минут [44]. Возможность проведения реакции при небольших температурах (+41 С) значительно упрощает работу и позволяет отказаться от оборудования, обеспечивающего циклические изменения высоких температур. Учет результатов реакции осуществляется при помощи электрохемилюминесценции. Несмотря на то, что по своей чувствительности NASBA близка к RT PCR, метод широко не используется для выявления РНК ВГС. В настоящее время проводится разработка варианта метода, сочетающего принципы проведения NASBA и «Real-time RT PCR».

    Метод транскрипционно опосредованной амплификации (Transcription-mediated amplification — ТМА) отличается от ПЦР и LCR прежде всего тем, что непосредственно амплифицируются фрагменты РНК ВГС , а не кДНК ВГС. На начальном этапе реакции к РНК ВГС присоединяется праймер (№1) и с помощью фермента (обратной транскриптазы) синтезируется копия молекулы мишени — кДНК. Обратная транскриптаза, обладая также активностью РНКазы-Н, разрушает вирусную РНК в гибриде РНК-кДНК. Далее к молекуле кДНК присоединяется второй праймер с последующей достройкой двухцепочечной ДНК при помощи обратной транскриптазы. При помощи другого фермента -РНК-полимеразы происходит транскрипция РНК с кДНК, что приводит к образованию от 100 до 1000 копий ампликона РНК ВГС в одном цикле реакции. К этим РНК-апликонам присоединяется праймер № 2 с дальнейшим синтезом кДНК-копий и разрушением молекулы РНК. Присоединение праймера №1 на кДНК с последующей достройкой двухцепочечной ДНК запускает следующий цикл амплификации. Учет результатов реакции осуществляют на люменометре, так как образовавшиеся РНК-ампликоны специфически взаимодействуют с ДНК-зондами, меченными хемилюминафорами.

    В качестве преимуществ ТМА-метода при выявление РНК ВГС отмечают:

  • проведение реакции при более низких температурах по сравнению с ПЦР;
  • образование большего числа ампликонов в одном цикле реакции, что уменьшает время, необходимое для получения конечного результата (30-40 минут), и повышает чувствительность реакции (50 копий /мл.) [45].
  • снижение риска контаминации, так как РНК менее устойчива, чем ДНК.

    Сравнительные исследования по детекции РНК ВГС при помощи ТМА и другими методами продемонстрировали высокий уровень совпадений результатов [45].

    Сочетание принципов гибридизации и амплификации лежит в основе метода выявления РНК ВГС, обозначенного как «Метод гибридизации с использованием разветвленных зондов или Branched DNA assay (bDNA) [46]. В отличие от ПЦР в данном тесте осуществляется амплификация не молекул кДНК ВГС, а сигнала. Реакция проводится в 96 луночных планшетах, на которых адсорбированы фрагменты РНК ВГС из 5′ нетранслируемой зоны и core-гена РНК ВГС. За счет последующего связывания с синтетической молекулой разветвленной ДНК и гибридизацией с пробой, меченной щелочной фосфотазой с усилителем и последующей ферментативной реакцией достигается резкое увеличение полученного сигнала. В настоящее время на диагностическом рынке появились диагностикумы третьего поколения (Вауег 3.0 Hepati-tis С Virus RNA Quantitation by bRNА), обладающие чувствительностью, позволяющей выявлять 520 IU/ml (2500 копий РНК ВГС).

    КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ РНК ВГС. Для оценки концентрации РНК ВГС применяют количественный вариант ПЦР. Первоначально концентрацию РНК ВГС пытались охарактеризовать порядковыми величинами, например»+»,»++» и т.д., визуально отражающими интенсивность полос, полученных при электрофорезе продуктов амплификации, или же методом конечных разведений, т.е по наличию позитивного результата в конечной точке титрования. Трудности стандартизации всех этапов ПЦР не позволяют объективно оценить концентрацию РНК ВГС, что приводит к существенным ошибкам трактовки полученных результатов.

    В настоящее время результаты исследования выражают в количественных единицах: количество копий РНК ВГС, содержащихся в 1 мл., в абсолютном или логарифметическом выражении (log 10). Исходя из того, что концентрация обнаруженной РНК ВГС отражает количество вирусных частиц, данный показатель обозначают как «вирусный эквивалент (eq)», с добавлением приставки k (килограмм, тысяча) или М (миллион). Еще одним способом выражения количества вирусных частиц являются их весовые эквиваленты. Например, в граммах или пикограммах (1 pg соответствует приблизительно 1 миллиону eq). Разнообразие применяемых величин создает трудности трактовки результатов, полученных в различных лабораториях. Поэтому комитет экспертов ВОЗ по биологической стандартизации изготовил «международный стандартный образец», содержащий РНК ВГС (лиофильновысушенная сыворотка крови, содержащая РНК ВГС 1-го генотипа), концентрация которой выражена в международных единицах (IU/mL) [47]. Специальные коэффициенты позволяют пересчитывать полученные показатели концентрации в международные единицы.

    Для определения концентрации РНК ВГС применяют практически все варианты ПЦР. При этом к диагностическим препаратам предъявляется ряд специфических требований, важнейшим из которых является строгая линейность результатов, т.е. увеличение сигнала регистрируемой реакции при увеличении концентрации РНК ВГС в исследуемом образце. Применение внутренних стандартов с различным содержанием РНК ВГС позволяет избежать многих методических ошибок, которые могут отразиться на конечном результате реакции [28]. Чувствительность применяемых диагностикумов (Amplicor HCV Monitor v2.0; LCx HCV RNA Quantitative Assay) позволяет выявлять РНК ВГС, начиная с 50 копий в мл [48,49], что особенно важно для прогнозирования эффективности избранной противовирусной терапии.

    ПЦР в реальном времени («Real-time RT PCR») —один из наиболее перспективных вариантов количественного метода выявления РНК ВГС. Метод и его аппаратное обеспечение совместно разработаны специалистами фирм «Roche» и «Percin Elmer». Принцип метода заключается в способности гидролизовать последовательности кДНК в направлении 5′—- 3′. В реакции применяется специальный зонд, меченный двумя флюоресцентными красителями, имеющими близкие максимумы поглощения и флюоресценции. При наличии продуктов амплификации Tag-полимераза расщепляет зонд, что приводит к предотвращению переноса энергии от одной молекулы красителя к другой, и тем самым предотвращает выход кванта света. Специальный прибор осуществляет учет реакции и математическое моделирование кинетики флюоресценции на каждом этапе реакции, что позволяет получить информацию об исходной концентрации РНК ВГС.

    Отличительной особенностью «ПЦР в реальном времени» считают возможность получать информацию о наличии РНК ВГС непосредственно в процессе реакции, что позволяет уменьшить время анализа в сочетании с высокой чувствительностью и линейностью получаемых результатов [50]. По данным Татьяны Яшиной с соавторами, данный метод позволяет выявлять от 200 копий РНК ВГС в мл. [51].

    МЕТОДЫ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ РНК ВГС. Определение принадлежности ВГС к определенному генотипу и субтипу нашло свое применение для решения не только чисто научных, но и практических вопросов. Например: поиск источника инфекции во время вспышек гепатита С или прогнозирование эффективности применяемой терапии.

    «Золотой стандарт» генотипирования ВГС — непосредственное определение первичной структуры РНК ВГС с его последующим филогенетическим анализом [52], что позволяет четко охарактеризовать данный изолят вируса. Получить эту информацию возможно при использовании следующих вариантов секвенирования:

  • прямого;
  • на основе стандартного клонирования;
  • секвенирования продуктов ПЦР реакции (Limited-sequencing).
    Несмотря на точность получаемого результата, метод непосредственного секвенирования не используется в практическом здравоохранении из-за технических сложностей проведения исследования и высокой стоимости работ. Вместе с тем наличие информации о первичной структуре РНК ВГС является референтным методом генотипирования, а наличие приборов для автоматического секвинирования упрощает получение результата.

    В настоящее время в большинстве случаев для генотипирования РНК ВГС применяются методы, основанные на использовании ПЦР с типоспецифическими праймерами. Впервые генотипирование РНК ВГС проведено Н. Okamoto с соавторами в 1992 году при помощи RT-ПЦР [53], включающего два этапа амплификации. Первый из них проводился с универсальными, для всех генотипов ВГС, праймерами, второй со смесью типоспецифических праймеров с получением специфических продуктов амплификации различной длины. О наличии того или иного генотипа судили по размеру амплифицированного продукта. В качестве праймеров используются типоспецифические зонды, информация о которых расположена в 5’UTR, Core или NS5 — областях РНКВГС[54].

    Гибридизация амплифицированных продуктов с адсорбированными геноспецифическими зондами (из 5′-нетранслируемой зоны РНК ВГС), адсорбированными на нитроцеллюлозной мембране, лежит в основе теста — обозначенного «INNO-LiPA HCV, INNO-GENETICS» [55]. Первоначально с помощью этого теста удавалось типировать генотипы: la; lb; 2a; 2b;3a; 3Ь; 4 и 5а. В дальнейшем тест-системы 2-го поколения «INNO-LiPA HCV II , INNOGENETICS» позволяют различать все 6 генотипов и дополнительно 2с; 2d; 2i; 3с; 4a-h; 6а и 10а. [56]

    Методический арсенал определения генотипов ВГС не ограничивается вышеперечисленными способами и включает в себя разнообразные методы:

  • генотипирование на основе анализа профилей рестрикции амплифицированных продуктов (RFLP). Продукты амплификации фрагментов РНК ВГС (5’UTR — область или NS5 область РНК ВГС) расщепляются рестриктазами. Образовавшиеся фрагменты различаются по длине в зависимости от имеющихся внутри них сайтов рестрикции, по которым идет расщепление. Результаты электрофореза и их сравнение позволяют идентифицировать генотип ВГС в исследуемом образце [57]. Сравнение результатов генотипирования методом ПЦР- RFLP с данными секвинирования продемонстрировало высокий уровень совпадения результатов — 95% [58].
  • генотипирование на основе метода SSCP (оценки конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК). В качестве объекта исследования выбран 5′-нетранслируемый регион РНК ВГС, который обладает минимальным набором нуклеотидных вариаций, отличающих генотипы друг от друга. Этот факт определяет возможность применить общие праймеры при генотипировании [59].

    СЕРОТИПИРОВАНИЕ Анти-ВГС стало возможным благодаря исследованиям P.Simmonds с соавторами, установившим наличие антител, направленных к генотипспецифичным эпитопам, информация о которых кодирована NS4 зоной РНК ВГС [60]. При помощи диагностикума для ИФА, сконструированного на основе синтетических пептидов, удалось разграничить случаи гепатита С, вызванные вирусами 1, 2 и 3 генотипа (89% совпадения с результатами генотипирования). Разработка тестсистем с использованием синтетических и рекомбинантных антигенов, кодированных NS4 и Core зонами РНК ВГС, позволила расширить перечень типируемых вариантов вируса, а также судить о наличии подтипов (1а, lb, 2a, 2Ь, За, и 4а) [61,62]. В настоящее время осуществляется коммерческий выпуск диагностических препаратов для проведения серотипирования как в плашечном варианте проведения ИФА — «Мurех НС 1-6 Serotyping Assay, Murex Diagnostics», так и в варианте «иммуноблот» — RIBA HCV Serotyping Assay, Chiron Diagnostics. Сравнительные данные результатов серотипирования и генотипирования РНК ВГС продемонстрировали высокий уровень совпадения результатов, достигая 95% [62].

    Серотипирование анти- ВГС по сравнению с генотипированием РНК ВГС обладает такими преимуществами, как простота проведения реакции и более низкая стоимость. Вместе с тем, этот метод ни в коем случае не может заменить генотипирование. Результаты серотипирования анти-ВГС свидетельствуют о типовой принадлежности анти-ВГС при текущей или ранее перенесенной инфекции. В некоторых случаях (наиболее часто у больных гемофилией) регистрируется одновременное выявление анти-ВГС различных подтипов, что может свидетельствовать о множественном инфицировании различными субтипами и генотипами ВГС [63]. Кроме того, у пациентов с гепатитом С на фоне выраженного иммунодефицитного состояния РНК могут быть единственным маркером, что делает невозможным проведение серотипирования.

    ВЫЯВЛЕНИЕ и ТРАКТОВКА РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕСТИРОВАНИЯ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ВГС-ИНФЕКЦИИ. Наличие широкого спектра серологических маркеров текущей или предшествующей ВГС инфекции, а также современная методологическая база позволяют решить многие задачи лабораторной диагностики и профилактики гепатита С. В таблице № 2 представлены серологические маркеры ВГС инфекции и наиболее важные направления их тестирования.

    Таблица 2
    Диагностическая значимость маркеров текущей или предшествующей ВГС инфекции

    Подтвер-
    ждение
    результата
    + анти-ВГС

    Одной из главных задач лабораторной диагностики гепатита С является постановка диагноза и разграничение острого от хронического гепатита С при помощи выявления серологических маркеров инфицирования. Так же как и при других острых вирусных гепатитах, серологические маркеры инфицирования ВГС последовательно появляются и исчезают по ходу инфекции и процесса выздоровления (Рисунок 2).

    РНК ВГС удается обнаружить на 7 — 21-й день после инфицирования ВГС, а анти-ВГС на 20 — 150-й день (в среднем 50-й день) [64]. Спектр анти-ВГС может различаться в зависимости от периода острого гепатита. Считается, что первыми удается определить антитела, кодированные Core и NS5 зоной РНК ВГС. Анти-ВГС к белкам, кодированным NS4 зоной, в острую фазу гепатита С отсутствуют [65]. Сравнительное изучение уровня концентраций анти-ВГС, спектра анти-ВГС и РНК ВГС у больных острым и хроническим гепатитом продемонстрировало некоторые различия [66]. На наш взгляд, эти различия могут быть связаны с индивидуальными особенностями инфекционного процесса, что снижает их диагностическую ценность.

    Рис. 2. Острый гепатит С

    По аналогии с лабораторной диагностикой гепатита А и В ожидали, что определение антител к ВГС класса IgM будут иметь столь же большое диагностическое значение как IgM анти-ВГА и IgM анти-НВс. Однако данные тестирования сывороток крови больных острым и хроническим гепатитом С на наличие IgM анти-ВГС указывают на частое их выявление среди этих больных — 50-93% и 50-70% соответственно [67,68], эти результаты свидетельствуют, что обнаружение IgM анти-ВГС не может быть использовано как маркер острой ВГС инфекции.

    Отсутствие маркера, претендующего на роль «золотого» стандарта острого гепатита С, определяет необходимость комплексной оценки полученных результатов, основанных на динамическом наблюдении за пациентом.

    Не менее важное направление использования высокочувствительных методов тестирования РНК ВГС — снижение риска развития посттрансфузионного гепатита С. Необходимость таких работ определяется наличием фазы «окна», т.е. временем между первым обнаружением РНК ВГС и появлением анти-ВГС , а также существованием доноров крови (больных хроническим гепатитом С), у которых имеются РНК ВГС при отсутствии анти-ВГС. Современная система контроля донорской крови на наличие ВГС включает только тестирование анти-ВГС, риск заражения гепатитом С сохраняется. Исходя из этого правомерна постановка вопроса о тестировании крови на наличие РНК ВГС современными методами (методы NAT — «nucleic acid amplification test»). Фактор, ограничивающий эту работу, — высокая цена исследований. Для сокращения затрат рекомендуется тестирование пулов сывороток крови (от 8 до 96 образцов) с последующим поиском позитивного образца в случае выявления РНК ВГС в пуле сывороток. Учитывая фактор разведения искомой РНК ВГС при пулировании сывороток крови, принципиальным становится вопрос о применении наиболее чувствительных методов детекции. Считается, что использование диагностических наборов для NAT — с чувствительностью 50-100 IU/mL позволяет значительно уменьшить риск посттрансфузионного гепатита С.

    Несомненно, перечень вопросов, которые можно решить при тестировании всего спектра маркеров ВГС-инфекции, не исчерпывается этими двумя направлениями. Наличие современных методов тестирования в совокупности со знанием их возможностей открывает широкие перспективы научных и прикладных работ по гепатиту С.

    источник

    • Исследуемый показатель Диагностическая ценность
    Аспартатаминотрансфераза (АсАт) Если фермента больше нормы, то говорят о гибели гепатоцитов или миоцитов. Исключение – беременные женщины, где допускается незначительное превышение нормы
    Аланинаминотрансфераза (АлАт) При гепатитах норма фермента превышена в несколько раз
    Щелочная фосфатаза (ЩФ) >нормы при костных патологиях, туб- или онкопроцессах в печени, циррозе, любых гепатитах вирусного генеза
    Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) > нормы при разрушении печеночной ткани
    Глутаматдегидрогеназа (ГДГ) Отклонения от нормы наблюдают при тяжелых расстройствах работы печени, желчевыводящих путей, острых токсических воздействий
    Сорбитолдегидрогеназа (СДГ) В норме практически отсутствует. Появление фермента укажет на вирусный или невирусный гепатит, цирроз
    Гамма-глутамилтрансфераза (ГГТ) >нормы при гепатитах на фоне систематических алкогольных интоксикациях
    Фруктозо-монофосфат-альдолаза (ФМФА) В норме содержится только в следовых количествах. Активное присутствие фермента наблюдают при острых формах гепатитов, особенно сопряженных с профессиональной вредностью
    Общий белок >нормы при неправильной работе печеночной ткани
    Альбумин нормы при серьезных погрешностях питания, циррозе, но особенно на фоне алкоголизма
    Триглицериды

    Популярные записи

    Вирусный гепатит с среди медработников
    Вирусный гепатит а основные признаки
    Вирусный гепатит при цмв
    Источник возбудителя вирусного гепатита
    Приказы вирусного гепатита казахстан
    Хронический вирусный гепатит постановка диагноза
    Внепеченочные поражения при вирусном гепатите с
    Вирусная нагрузка может уменьшиться при гепатите с