СИМОНОВА ИРИНА АЛЕКСАНДРОВНА
РАЗРАБОТКА АЛГОРИТМА СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТОВ В УСЛОВИЯХ СТАЦИОНАРА.
03.00.07 — «Микробиология» / 4 14.00.36 — «Аллергология и иммунология»
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Диссертация выполнена в Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова.
Научные руководители: доктор медицинских наук
Е.В.ВОЛЧКОВА кандидат медицинских наук
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор
Ю.В. НЕСВИЖСКИЙ доктор биологических наук, профессор К.И.САВИЦКАЯ
Ведущее учреждение: НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН
Защита диссертации состоится на заседании диссертационного совет^Д 074.O5.iO при ММА. им. И.М. Сеченова по адресу: 119381, г.Москва, Б. Пироговская ул., 2-6
С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ММА им. И.М. Сеченова, по адресу: г. Москва, Зубовская пл., д.1
Автореферат разослан «¿¿¿_ £ 1999г.
Ученый секретарь диссертационного
совета, к.м.н., доцент Миронов А.Ю.
В последние годы в структуре вирусных гепатитов существенно возросло значение гепатитов с парентеральным механизмом передачи возбудителей и сочетанных форм ВГ. Этот рост связан с вовлечением в эпидемический процесс лиц молодого возраста, употребляющих наркотические вещества внутривенно (Шахгильдян И.В.,1999; Онищенко Г.Г.1999).
Сходство по клинической картине всех вирусных гепатитов на начальных этапах диагностики делают проблему верификации по этиологическому признаку данного поражения печени чрезвычайно актуальной (Апросина З.Г.,1996; Учайкин В.Ф.,1996; Alter H.J.,1992). На сегодняшний день в решении этой проблемы все большее значение приобретает лабораторная диагностика, т.к. она занимает центральное место в системе подтверждения диагноза вирусного гепатита (Михайлов М.И.,1999; Соринсон С.Н.,1998; Sherlock Sh.,1999).
В большинстве лечебных учреждений и в службе переливания крови г. Москвы лабораторная диагностика вирусных гепатитов осуществляется в соответствии с приказами Министерства Здравоохранения СССР №408 «О мерах по снижению заболеваемости вирусными гепатитами в стране» от 12.07.89, Департамента Здравоохранения и Центра Госсанэпиднадзора г. Москвы №493/96 «О совершенствовании системы эпиднадзора за вирусными гепатитами В и С» от 29.09.94 и ограничивается определением HBsAg и anti-HCVIgG. Этого явно недостаточно для подтверждения вирусной этиологии поражения печени, учитывая разнообразие существующих гепатотропных вирусов.
К настоящему моменту идентифицировано 8 различных гепатотропных вирусов: из них общепризнанными являются HAV, HBV, HCV, HDV, HEV (Михайлов М.И.,1998; Соринсон С.Н.,1998; Львов Д.К.,1997; Alter H.J.,1995; Sherlock Sh.,1999); роль HFV, HGV, TTV в развитии заболевания печени изучается (Балаян М.С.,1995; Михайлов М.И.,1997; Кузин С.Н.,1999; Мохонов В.В.,1999; Соринсон С.Н.,1997; Bonacini М.,1998; Charlton М.,1998; Hohne М.,1998; Naomov N.V.,1998; Okamoto Н.,1998; Simmonds P.,1998; Tanaka H.,1998).
У описанных вирусов существует значительное количество специфических маркеров, выявление которых имеет разное диагностическое значение в
зависимости от периода заболевания (Bocsan I S.,1995; Buffet С.,1995; Long G.S., 1996).
Для определения специфических маркеров вирусных гепатитов разработано множество тест-систем, выпускаемых различными отечественными и зарубежными фирмами.
Большинство исследователей считают, что для достоверной диагностики различных форм вирусных гепатитов и установления фазы инфекционного процесса крайне важно определение всего известного спектра маркеров (Михайлов М.И.,1999; Широнина Н.Л.,1999; Ющук Н.Д.,1992; Alexander M.,1998; Bocsan I.S.,1995; Buffet С.,1995; Long G.S., 1996).
Однако, реализация этой задачи в условиях стационара занимает много времени и требует значительных материально-технических затрат, что явилось решающим фактором для оптимизации схемы диагностики вирусных гепатитов, т.е. выбора наиболее информативного комплекса маркеров для подтверждения диагноза и определения характера течения заболевания на каждом этапе диагностики.
Цель работы — разработать алгоритм серологической диагностики острых вирусных гепатитов в условиях стационара, следуя которому можно оптимизировать подтверждение вирусной этиологии гепатитов при минимальных расходах диагностических средств за короткий промежуток времени с момента поступления больного в стационар.
В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:
1. Осуществить первичный скрининг сывороток крови больных, поступающих в стационар с подозрением на вирусный гепатит и выбрать оптимальный комплекс серологических маркеров для проведения исследований крови на первом этапе диагностики.
2. Проанализировать группу больных, поступивших в стационар с подозрением на гепатит, у которых отсутствуют маркеры первичного скрининга.
3. Определить основные показания для проведения последующих этапов диагностики.
4. Предложить оптимальный алгоритм серологической диагностики вирусных гепатитов в стационаре.
5. Изучить особенности выявления антител к антигенам HCV и HDV.
Впервые предложен оптимальный алгоритм серологической диагностики острых вирусных гепатитов в условиях стационара с учетом новых диагностических возможностей, ранее не описанный в литературе.
Впервые на основе комплексного использования различных методов идентификации маркеров вирусных гепатитов установлен характер соответствия серологических маркеров репликации вирусов в различные периоды заболевания и определено их диагностическое значение.
Показано, что выявление антител к антигенам вируса гепатита О не совпадает с циклом репликации вируса.
Впервые описана дискретность выявления антител классов и ¡ёСт к антигенам вируса гепатита С на ранних этапах развили инфекционного процесса и показано, что диагностика ВГС в некоторых случаях требует серологического мониторинга в течении нескольких месяцев с учетом индивидуальных особенностей течения заболевания.
Впервые оценена диагностическая роль агЦ|-НСУ1£>М в серодиагностике острой НСУ-инфекции. Показано, что выявление апи-НСУ^М характеризует фазу активной репликации вируса гепатита С и позволяет увеличить показатель подтверждения вирусной этиологии гепатитов на 18,6% среди серонегативных проб первого этапа диагностики.
В результате проведенных исследований разработан оптимальный алгоритм серологической диагностики острых вирусных гепатитов в условиях стационара, который позволяет максимально быстро получать достоверное подтверждение вирусной этиологии поражения печени при минимальных расходах диагностических наборов.
Экономический эффект разработанного алгоритма’, предложенный алгоритм позволил сократить количество проводимых исследований одной сыворотки почти в 2 раза с 7,9±1,2 (1996г.) до 4,1±0,7 (1998г.), при этом показатель подтверждения диагноза практически не изменился 86,7±2,7 (1996г.) и 89,4±1,1 (1998г.) ( при р М и апй-HCVIgG соответственно — рассчитывали согласно инструкциям, прилагаемым к тест — системам.
при R1,R2>1 сыворотку расценивали как положительную, т.е. в сыворотке содержался определяемый маркер.
Дополнительно для полуколнчественной оценки соотношения anti-HCVIgM и anti-HCVIgG в определенные периоды заболевания определяли коэффициент К = R2/R1, предложенный Афанасьевым А.Ю, 1996г.
Помимо метода ИФА для выявления антител класса IgG к антигенам HCV использовали метод рекомбинантного иммуноблотинга (RIBA HCV 2.0 SIA), заложенный в основу тест-системы «Desiscan HCV Р1и5″(таблица1). Данный метод позволял охарактеризовать антитела, направленные против различных участков генома вируса гепатита С (Рис. 1)
1 — 2 CI С2 NS3 NS4 Пластиковая
РИС. 1 Расположение контролей и антигенов на стрипе для проведения
1 — Античеловеческий IgG контроль обеспечивает:
• контроль внесения образца;
• контроль реагентов ( коньюгата и субстрата);
• считывание результатов, с учетом интенсивности
В процессе синтеза рекомбинантных белков, гены кодирующие белки NS3 и NS4 встраивают в ген, кодирующий глугатионтрансферазу S (GST).
Контроль на GST выявляет присутствие анти — GST антител в образце, которые могут привести к ложноположительной реакции.
Процедура проведения иммуноблота соответствует стандартной методике непрямого твердофазного ИФА (Егоров А.М.,1991; Нго Г.Г.,1988; Фримель Г.,1987).
Проводили статистическую обработку полученных результатов, при этом определяли среднюю ошибку полученных показателей и доверительные интервалы (Федорова С.Ф., 1977г.), результаты считали достоверными, при р М, ant¡-HDVIgM, апй-НОУ^О. Для окончательного подтверждения диагноза и сопоставления результатов диагностики, полученных в ИФА, был использован метод ПЦР.
Проведение повторных исследований спустя 5-8 дней с момента первичного скрининга показало, что у всех 975 больных с подтвержденной вирусной этиологией поражения печени повторно выявляются маркеры первичного скрининга (Рис.2)
В группе из 96 больных с маркерами ВГА после первичного скрининга не обнаружили маркеров других форм вирусных гепатитов ни методом ИФА, ни методом ПЦР.
Дополнительное определение маркеров ВГВ и ВП) при проведении повторных исследований позволило нам разграничить фазы развития НВУ-инфекцин и выявить присоединение НОУ-инфекции у 100 больных (15,3%) -из них — у 66 больных с маркерами ВГВ после первичного скрининга, у 32 больных — с маркерами ВГВ+ВГС, у 2 больных- с маркерами ВГВ+ВГА.
При этом у 73% больных наблюдалось тяжелое течение НОУ-коинфекции (58% — с маркерами ВГВ после первичного скрининга, 15% — с маркерами ВГВ+ВГС), а у 3% — тяжелое течение ШУУ-суперинфекции на фоне ВГВ, что подтвердило господствующее в литературе мнение о том, что заражение НЮУ (ках при коинфекции, так и суперинфекции) приводит к развитию острого заболевания, при этом в сообщениях часто подчеркивалась связь между наличием дельта-инфекции и тяжестью заболевания (Балаян М.С.,1999; Логинов А.С.,1993; Шарапов Н.Б.,1996; Вегпиап 1,1991; ШггеНо М.,1991).
Среднетяжелое течение ГШУ-коинфекции наблюдали у 24% больных: из них — у 5% с маркерами ВГВ; у 17% — с маркерами ВГБ+ВГС; у 2% — с маркерами ВГВ+ВГА после проведения первичного скрининга.
Между тем, у 5 больных с тяжелым течением НВУ-инфекции не обнаружили маркеров ВГХ), но выявили маркер ВГС (апй-ЖЛП^М) при повторных исследованиях, который являлся единственным серологическим маркером, позволяющим подтвердить НСУ-инфекцию.
РИС.2 Результаты проведения повторных исследований крови.
Следовательно, проведение повторных исследований в группе больных с маркерами НВУ-инфекции позволило нам установить, что в стационаре для серодиагностики ВГВ и ВГТ) необходимо проведение двух этапов (таблица 3):
• на первом этапе подтверждаем развитие НВУ-инфекции, определяя НВ$А0 и ant¡-HBcorIgM в сыворотке крови;
• в случае положительного результата на НВбАз и на anti-HBcoгIgM -диагноз ОВГВ подтвержден уже на первом этапе диагностики, дополнительных маркеров ВГВ таким больным на втором этапе определять не следует. В случае тяжелого течения заболевания необходимо исключить присоединение инфекций, вызванных другими гепатотропными вирусами, в частности НОУ- и НСУ-, определяя апй-НЕ)У1$М и ап1′-НСУ1$М в сыворотках крови больных.
• в случаях НВ$А^+, аМьНВсогО^- и HBsAg-, anti-HBcorIgM+ необходимо проведение второго этапа диагностики для уточнения фазы ВГВ и исключения НОУ-инфекции, при этом следует определять маркеры, представленные в таблице 3.
Существуют противоречивые данные о сроках появления серологических маркеров HDV-инфекции (Liaw J.,1992; Negro F.,1995; Bocsan I.S.,1995; Carredda F.,1989), поэтому мы решили провести комплексную диагностику В ГО и оценить характер соответствия результатов, полученных различными методами (ИФА и ПЦР). Наши данные свидетельствовали, что выявление антител к антигенам HDV (anti-HDVlgM, anti-HDVIgG) не совпадает с циклом репликации вируса, поэтому при отсутствии серологических маркеров HDV-инфекции необходимо проводить исследования методом ПЦР. Таблица 3. Показания для проведения второго этапа серологической диагностики в стационаре больным с маркерами
HBV-инфекцни после первичного скрининга.
Профиль J6 (из табл.2) Результаты Задачи проведения второго этапа Определение следующих серологических маркеров
2 HBsAg-t-anti-HBcorlgM-f Диагноз определен-ОВГВ. В случае тяжелого течения — исключить присоединение инфекций, вызванных другими ге-патотропнымн вирусами. anti- HDVIgM anti-HCVIgM
3 HBsAg+ anti-HBcorlgM- Установить фазу ВГВ, исключить наличие НОУ — инфекции. HBeAg anti-HBe anti-HBcorlgG anti -HBs anti-HDVlgM anti-HDVIgG
В результате повторных исследований крови в группе из 193 больных (апй-НСУ^О+ после первичного скрининга) у 183 больных (94,8%) выявили anti-HCVIgM в сыворотке крови и НСУРНК в плазме.
Определение коэффициента К показало, что у 113 больных (61,7%) значение К находилось в пределах от 1 — 4, при этом 88-ми из 113 больных (77,8%) с учетом клинико-эпидемиологических данных был поставлен диагноз — ОВГС,
а 25-ти из 113 (22,2%) — обострение ХВГС. Среди 70 больных с К>4: 55 (78,5%) поставлен — ОВГС; а 15 (21,5%) — обострение ХВГС.
Таким образом, выявление anti-HCVIgM у больных ВГС отражает фазу активной репликации HCV, как при ОВГС, так и при обострении ХВГС.
В то же время, в результате повторных исследований крови среди 193 больных (anti-HCVIgG + после первичного скрининга) у 10 не выявили anti -HCVlgM в сыворотке крови и HCVPHK в плазме, но обнаружили HGVPHK в плазме крови, что свидетельствовало о развитии HGV — суперинфекцин. Возможно, обострение инфекционного Процесса у больных было связано с активизацией HGV в организме (Alter H.J.,1997; Chen H.L.,1998, Fattovich G.,1998; Hwang J.,1998; Tanaka T.,1998).
Особое диагностическое значение anti-HCVIgM нам удалось установить при повторных исследованиях в группе из 188 больных, серонегативных по результатам первичного скрининга (Рис.3).
• Обнаружено, что у 35 больных (18,6%) этот серологический маркер являлся единственным подтверждением развития HCV-инфекции. Полученные результаты подтверждены в ПЦР. Интересно отметить, что возможность определения anti-HCVIgM в стационаре появилась лишь с 1996г., когда были разработаны отечественные тест-системы. До этого момента большинство подобных больных выписывалось из стационара с диагнозом — гепатит не установленной этиологии. Выявление anti-HCVIgM позволило увеличить показатель подтверждения вирусной этиологии гепатита до 8б,9%±1,2% (при р М, ап1|-НС\^0.
3. Больным с выявленным маркером ВГА — ал(!-НАУ1$>М+ после первичного скрининга достаточно проведения первого этапа диагностики для подтверждения диагноза.
4. Больным с маркерами НВУ-инфекции после первичного скрининга необходимо проведение второго этапа серологической диагностики для определения фазы развития инфекционного процесса и исключения присоединения НОУ- и НСУ- инфекций, при этом следует определять маркеры, представленные в таблице 3.
5. При проведении второго этапа диагностики в стационаре не следует повторно определять маркеры первичного скрининга.
6. Больным с положительным результатом на ап11-НСУ1£0, а также больным с отрицательным результатом на апй-НСУ^О после первичного скрининга, но с подозрением на ВГС по клинико-эпидемиологическим данным необходимо проведение второго этапа серологической диагностики путем определения атьНСУ!^ в сыворотке крови (Рис.4).
7. Больным с выявленными маркерами микст-инфекций после первичного скрининга необходимо проведение второго этапа серологической диагностики для установления фазы развития инфекционного процесса и исключения присоединения инфекций, вызванных другими гешгтотропными вирусами, при этом необходимо придерживаться той же тактики диагностического поиска, •по и при диагностике НВУ- и НСУ- моноинфекцнй (таблица 3, Рис.4).
8. Больным, у которых отсутствуют серологические маркеры первичного скрининга, но имеются клинические признаки вирусного гепатита необходимо назначать проведение исследований методом ПЦР, определяя НСУРНК, ¡-ЮУРНК в плазме крови.
РИС. 5 Алгоритм лабораторной диагностики вирусных гепатитов в стационаре.
1. Разработан алгоритм серологической диагностики острых вирусных гепатитов в условиях стационара, оптимизирующий подтверждение вирусной этиологии поражения печени, а также сокращающий расходы диагностических средств и время проведения исследований.
3. Для диагностики ВГА достаточно проведения первичного скрининга, т.к в 100% случаев этот диагноз был подтвержден на первом этапе диагностики.
4. Для окончательной диагностики ВГВ и ВГС необходим учет серологических маркеров второго этапа (НВеА§, апи-НВе, апй-НВсог^О, апП-НЕЬ, апп-НСУГкМ, ап1ьШ)У1(5М) для суждения о длительности заболевания и возможности дополнительного инфицирования.
6. Установлено, что выявление антител к антигенам НОУ не совпадает с циклом репликации вируса, поэтому диагностика ВГТ> должна быть комплексной, т.е. включать различные методы исследований — при отрицательных результатах ИФА (апй-НОУ1]$М-, апй-НОУ^О-), но при наличии клинических признаков НОУ-инфекции необходимо назначать определение ШЭУРНК методом ПЦР.
7. При вирусном гепатите С выявлена дискретность обнаружения антител классов и в ИФА и иммуноблоте на ранних этапах развития НСУ-инфекции, а также результатов ПЦР, что в некоторых случаях требует серологического мониторинга больных в течение нескольких месяцев ( от 1 до 3 месяцев).
8. Установлено, что выявление НСУРНК, НОУРНК среди серонегативных проб первичного скрининга позволяет увеличить показатель подтверждения вирусной этиологии поражения печени до 90,1%±1,8%(при р Симонова, Ирина Александровна
источник
Тленкопачев Руслан Сафарбиевич
ВИРУСНЫЕ ГЕПАТИТЫ В И С И ОСОБЕННОСТИ ИХ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ
14.00.30 – ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
03.00.06 — ВИРУСОЛОГИЯ
Автореферат диссертации на соискание
Ученой степени кандидата медицинских наук
Работа выполнена в ГУ НИИ вирусных препаратов имени О.Г.Анджапаридзе РАМН
доктор медицинских наук С.Н.Кузин
доктор медицинских наук В.Ф.Лавров
доктор медицинских наук, профессор Г.В.Ющенко
доктор медицинских наук В.М.Глиненко
Ведущая организация: Московский НИИ эпидемиологии и иммунологии им. Г.Р.Габричевского Минздрава России.
Защита диссертации состоится 17 декабря 2004 года в часов на заседании диссертационного совета Д 001.007.02 в ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи (г.Москва, 123098, ул. Гамалеи, д.18).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.
Автореферат разослан 16 ноября 2004 года.
доктор медицинских наук, профессор Е.В.Русакова
В последние 10 лет эпидемиологическая ситуация в отношении вирусных гепатитов В и С (ГВ и ГС) в России претерпела существенные изменения. Так, в период с 1995 по 2000 год был зафиксирован существенный рост заболеваемости острыми вирусными гепатитами В и С (ОВГВ и ОВГС), который характеризовался активным вовлечением в эпидемический процесс лиц в возрасте 15-19 и 20-29 лет и ведущей ролью пути передачи вирусов гепатитов В и С (ВГВ и ВГС), ассоциированного с внутривенным введением наркотиков (И.В.Шахгильдян с соавт., 2003; М.И.Михайлов с соавт., 1999; Г.Г.Онищенко 2002). В то же время с 2001 года отмечено существенное снижение заболеваемости этими гепатитами. По мнению И.В.Шахгильдяна с соавт., 2003; Л.Д.Кирилловой с соавт., 2000; И.В.Фельдблюм с соавт., 2000 в числе причин, обусловивших снижение заболеваемости ГВ и ГС, отмечено отчетливое уменьшение числа потребителей инъекционных наркотиков. Вместе с тем, несмотря на рекордно низкие показатели заболеваемости ОВГВ и ОВГС в России они весьма значительно превышают западноевропейские, где регистрируют лишь единичные случаи гепатитов В и С.
Важно отметить, что заболеваемость ГВ и ГС в отдельных Федеральных округах (ФО) существенно различается. Так, если в Южном ФО отмечены наименьшие показатели заболеваемости ГВ и ГС, то максимальные – в Уральском и Северо-Западном ФО. При этом, закономерности распространения гепатитов В и С в Уральском и Северо-Западном ФО в настоящее время изучены достаточно подробно (И.О.Кузнецова, 1999; В.В.Романенко, 2000; Е.А.Савин, 1992; С.Л.Мукомолов, 1993; О.Н.Ершова, 2000; И.Л.Кириллова, 2003 и др.). Вместе с тем, эпидемиологических исследований в Южном ФО, включающем: республики северного Кавказа, Ростовскую, Астраханскую, Волгоградскую области; Краснодарский и Ставропольский край, до настоящего времени не проводили. Отдельные работы по проблеме вирусных гепатитов (А.М.Цуканова с соавт., 2002) не дают представления об интенсивности эпидемического процесса в этом регионе. Дефицит такой информации делает актуальными эпидемиологические исследования по проблеме вирусных гепатитов в Южном ФО. Субъекты Российской Федерации, относящиеся к Южному ФО – территории с разнообразным этническим составом населения и преимущественным его проживанием в сельскохозяйственной зоне и горных районах. Кабардино-Балкарская Республика (КБР), один из субъектов Федерации, относящийся к Южному ФО. Комплексных исследований по изучению закономерностей распространения вирусов гепатитов В и С среди «здорового» населения и отдельных групп риска на территории КБР не выполняли.
В основе диагностики вирусных гепатитов В и С лежит использование иммуноферментных тест-систем (ИФТС) для определения маркеров этих инфекций. Современные ИФТС позволяют выявлять HBsAg в концентрациях до 0,1 нг/мл и с их помощью возможна детекция анти-ВГС в подавляющем большинстве случаев – до 99,8% (C.Janot et al., 1994). Однако достижение высокой чувствительности современных ИФТС сопряжено с некоторыми проблемами в обеспечении специфичности, что может приводить к появлению ложноположительных результатов, а также расхождений в результатах исследований при использовании других ИФТС в качестве подтверждающих. Кроме того, генетическая вариабельность ВГВ и ВГС также может приводить к различиям в детекции этих маркеров. В этой связи представляется актуальным изучить, с одной стороны, структуру субтипов HBsAg, циркулирующих на территории Кабардино-Балкарии, с
другой, диагностические возможности некоторых иммуноферментных тест-систем для детекции HbsAg и анти-ВГС, сертифицированных в России.
Возможности получения ложноположительных результатов при детекции анти-ВГС обусловливают необходимость использования подтверждающих тестов, что регламентировано соответствующими нормативными документами Минздрава РФ (приказ №322 от 21.10.2002 «О применении в практике здравоохранения иммуноферментных тест-систем для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) и антител к вирусу гепатита С (анти-ВГС) в сыворотке крови человека»). В качестве основного подтверждающего теста используется иммуноблотинг. Однако, как было показано еще в 1995 году J.L.Brown et al., чувствительность иммуноблотинга несколько ниже, чем ИФА третьего поколения. Это может несколько ограничивать возможности использования иммуноблотинга в качестве подтверждающего теста, так как в тех случаях, когда значения положительного сигнала в ИФА оказываются на пределе чувствительности (величина R в интервале 1,0-1,3) в иммуноблотинге этот образец с большой долей вероятности будет отрицательным. При этом необходимо отметить, что в службе крови любой риск, связанный с неполным выявлением инфицированной крови, недопустим. Таким образом, актуальной задачей является оценка целесообразности применения иммуноблотинга в качестве подтверждающего теста при детекции анти-ВГС в службе крови.
Цель работы: характеристика распространения вирусов гепатитов В и С среди населения Кабардино-Балкарской Республики и оценка диагностических возможностей современных методов серологической диагностики гепатитов В и С.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
1. Дать анализ заболеваемости острыми и хроническими вирусными гепатитами в Кабардино-Балкарии в период с 1992 по 2003, охарактеризовать динамику изменения возрастного состава больных острыми вирусными гепатитами В и С, а также структуру путей передачи вирусов гепатитов В и С.
2. Провести сравнительное изучение частоты обнаружения маркеров гепатитов В и С среди индикаторных групп «здорового» населения и отдельных контингентов повышенного риска инфицирования, а также
определить иммуноструктуру населения Кабардино-Балкарии к вирусам гепатита В и С.
3. Определить структуру субтипов HBsAg, циркулирующих на территории Кабардино-Балкарии.
4. Установить частоту расхождений в результатах исследований на наличие анти-ВГС с помощью различных иммуноферментных тест-систем и целесообразность использования иммуноблотинга в качестве подтверждающего теста для службы крови.
Научная новизна.
В результате проведенных исследований получены новые данные о широте распространения вирусов гепатитов В и С среди населения Кабардино-Балкарской Республики.
Показано, что основными путями передачи вирусов гепатитов В и С у больных острыми формами этих заболеваний являются артифициальные, чей удельный вес составил соответственно 45,5% и 46,8%, из которых преобладает инфицирование при проведении лечебно-диагностических парентеральных манипуляций в условиях амбулатории – соответственно 32,9% и 30,4%.
Установлено, что среди заболевших острыми вирусными гепатитами В и С в Кабардино-Балкарии преобладают лица в возрасте 20-29 лет, удельный вес которых составляет 20,3%-45,5% и 26,8%-48,0% соответственно. Отмечено незначительное вовлечение детей до 14 лет, чья доля в отдельные годы не превышала 3,4%, в эпидемический процесс гепатита С.
Выявлено значительное превышение показателей заболеваемости хроническим вирусным гепатитом В детей до 14 лет, в отдельные годы в 5-6 раз превосходящие среднероссийские.
Показано преобладание вирусного гепатита В в этиологической структуре взрослых больных острыми (44,9%-55,1%) и хроническими (72,2%-78,4%) вирусными гепатитами. У детей с хронической патологией печени доля хронического гепатита В составила 91,5%.
Получены новые данные о распространении вирусов гепатитов В и С среди населения Кабардино-Балкарии. Отмечено постепенное нарастание частоты обнаружения HBsAg и анти-HBs с увеличением возраста с достижением максимальных показателей в возрасте 40-49 лет (HBsAg обнаружен у 5,4% лиц и анти-HBs – у 40,1%). Антитела к вирусу гепатита С с наибольшей частотой тестированы в возрастной группе 30-39 лет – 6,6%, у детей до 6 лет анти-ВГС не обнаружены.
Впервые в России, на европейской части территории, определена структура субтипов HBsAg в которой преобладал субтип ayw2, обнаруженный в 59% случаев. Обращает на себя внимание факт выявления субтипа HBsAg adrq+, встречающегося, преимущественно, в странах Юго-Восточной Азии.
Практическая значимость.
Установление ведущих путей передачи вирусов гепатитов В и С, а также основных возрастных групп вовлеченных в эпидемический процесс, позволили разработать адекватные профилактические мероприятия и усовершенствовать систему эпидемиологического надзора за вирусными гепатитами в Кабардино-Балкарской Республике.
Полученные результаты позволили максимально обеспечить качество серологической диагностики в системе эпидемиологического надзора за гепатитами В и С.
Внедрение полученных результатов в практику.
Полученные результаты были использованы при подготовке приказов ЦГСЭН в Республике Кабардино-Балкария №32-Р от 16.07.1994 «О совершенствовании эпидемиологического надзора за вирусными гепатитами в Кабардино-Балкарской Республике» и приказа №43-Р от 28.08.1995.
Научные положения, выводы и практические рекомендации, вытекающие из результатов диссертационной работы, используются при чтении лекций и проведении семинарских занятий на кафедре эпидемиологии Российской медицинской Академии последипломного образования Министерства здравоохранения РФ.
Апробация работы.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на II съезде гигиенистов, эпидемиологов, микробиологов и инфекционистов Республики Кыргызстан, Бишкек, 1991; IV Российской научно-практической конференции с международным участием «Вирусные гепатиты В, С и D – проблемы диагностики, лечения и профилактики», Москва, 2001; V Российской научно-практическая конференции «Гепатит В, С и D – проблемы диагностики, лечения и профилактики», 2003, Москва; на научной конференции, посвященной 40-летию открытия HBsAg, 2004, Москва; ХII международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии», Украина, Крым, Гурзуф, 2004 год. Апробация работы состоялась 13 мая 2004 года на заседании Ученого совета ГУ НИИ вирусных препаратов им. О.Г.Анджапаридзе РАМН.
По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.
Структура и объем диссертации.
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, выводов и указателя литературы, состоящего из 187 работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация изложена на 151 странице машинописного текста, включает 28 таблиц и 9 рисунков.
Собственные исследования.
1. Материалы и методы.
Работу выполняли на территории Республики Кабардино-Балкария в период с 1989 по 2003 год. Для изучения заболеваемости острыми и хроническими вирусными гепатитами В и С использованы данные официальной статистики, годовые отчеты республиканского центра госсанэпиднадзора, годовые отчеты центра госсанэпиднадзора в г.Нальчике, а также сводные данные Федерального центра госсанэпиднадзора, любезно предоставленные Г.С.Коршуновой. Проанализированы результаты эпидемиологического обследования (форма 357/у) больных острыми вирусными гепатитами В, дельта и С. Расчет показателей, отражающих интенсивность эпидемического процесса проводили с использованием официальных данных о численности населения Республики Кабардино-Балкария, отдельных ее районов, а также г.Нальчика.
С целью изучения этиологической структуры острых и хронических вирусных гепатитов проведено исследование сывороток крови больных, находившихся на лечении в отделении вирусных гепатитов Республиканской инфекционной больницы г.Нальчик. Всего обследовано в 1989-1990 гг. 205 больных ОВГ, в том числе 87 детей до 14 лет и 118 взрослых пациентов и в 2000-2002 гг. обследован 561 пациент, в том числе 162 ребенка и 399 взрослых. Все пациенты были обследованы на наличие маркеров вирусных гепатитов с использованием коммерческих иммуноферментных тест-систем. У больных с острыми вирусными гепатитами определяли анти-HAV класса IgM, HBsAg, анти-НВс класса IgM, анти-ВГС, анти-дельта (суммарные и IgM) и анти-ВГЕ. У лиц с хроническими гепатитами тестировали HbsAg, анти-дельта (суммарные и IgM), анти-ВГС.
Для изучения широты распространения маркеров гепатитов В и С среди «здорового» населения различных возрастных групп Республики Кабардино-Балкарии были обследованы на наличие HbsAg, анти-HBs и анти-ВГС 1330 человек, в том числе детей в возрасте 0-2 года – 98, 3-6 лет – 108, 7-9 лет – 172 и 10-14 лет – 125, а также взрослых 15-19 лет – 157 человек, 20-29 лет – 272, 30-39 лет – 181, 40-49 лет – 112 и в возрасте старше 50 лет – 105 человек. Для детекции HbsAg, и анти-ВГС использовали тест-системы «Гепаскан HbsAg» и «Гепаскрин» производства ЗАО БТК «Биосервис», г.Москва, а также иммуноферментная тест-система для определения анти-HBs производства СП «ДИАплюс».
Для определения широты распространения маркеров вирусов гепатитов В и С среди «здорового» населения обследованы 110 безвозмездных доноров крови, 315 беременных женщин и 382 ученика средних школ г.Нальчика. Из групп повышенного риска инфицирования обследованы 88 медицинских работников и дети дома ребенка г.Нальчика (главный врач Л.А.Калибатова), в общей сложности в период с 1990 по 1994 год обследовано 173 ребенка.
Субтиповую HBsAg принадлежность определяли в 22 образцах сывороток крови доноров, содержащих HBsAg с помощью методики описанной Swenson et al., 1991. Субтипирование было выполнено к.б.н. И.Г.Нетесовой (ЗАО «ВекторБест», г.Новосибирск).
С целью обнаружения сывороток крови, содержащих серологические варианты HbsAg, которые плохо выявляются иммуноферментными тест-системами, проведена раститровка 132 образцов с наличием HbsAg, полученных после предварительного скрининга со станций переливания крови гг.Нальчика и Москвы. Разведение образцов для титрования осуществляли с помощью буфера, содержащего сывороточные белки, соли и детергенты. Раститровку выполняли с использованием пяти моноклональных антител, конъюгированных пероксидазой хрена – 5С3-ПХ, NE2-ПХ, NF5-ПХ, G11-ПХ, 11F3-ПХ. Моноклональные антитела 11F3,G11 и 5С3 получены в ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи РАМН. Конъюгаты моноклональных антител NE2 и NF5 любезно предосталены доктором А.В.Храмцовым (РЦ иммунологии МЗ РФ). Все моноклональные антитела реагировали в твердофазном ИФА с рекомбинантным HbsAg (вакцинный препарат, Комбиотех, Россиия) до концентрации не менее 1 нг/мл. Исследования выполнены на базе лаборатории эффекторов и медиаторов иммунитета ГУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН (руководитель – д.м.н. А.П.Суслов).
источник
ВИНОГРАДОВА Елена Николаевна
Вирусные гепатиты В и С (проблемы диагностики и терапии)
14.00.10 — инфекционные болезни
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук
Работа выполнена в Специализированной клинике вирусных инфекций
А. А. Яковлев доктор медицинских наук, профессор,
О. И. Киселев доктор биологических наук. Официальные оппоненты:
Академик МАН ЭБ, член-корр. РАЕН, доктор медицинских наук, профессор Ю. В. Лобзин,
Академик МАН ЭБ, заслуженный деятель науки , доктор медицинских наук, профессор Н. М. Грачева,
член-корр. РАМН, заслуженный деятель науки, доктор
медицинских наук, профессор
Ведущая организация — Российский государственный медицинский Университет.
Защита состоится » _ 1997 г. в часов на
заседании диссертационного совета Д 074. 16.05 по защите докторских диссертаций при Санкт-Петербургской Медицинской Академии последипломного образования (193015, Санкт-Петербург, ул. Салтыкова-Щедрина, 41).
С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Академии.
Автореферат разослан «_» _ 1997 г.
Ученый секретарь Диссертационного Совета, к.м.н., доцент
Вирусные гепатиты В и С, занимая лидирующее место в группе заболеваний вирусной этиологии, имеют повсеместное распространение, вызывая в некоторых случаях пожизненное хроническое течение болезни. На современном этапе установлена не только высокая заболеваемость вирусными гепатитами, представляющими угрозу развитию общества, но и их четкая связь с онкологическими заболеваниями, с гепатоцеллюлярной карциномой (Покровский В.И., 1996; Шувалова Е.П., 1996).
В последние годы спектр вирусов, вызывающих гепатит, увеличился благодаря открытию вирусов гепатита G и F, а также других вирусов, ожидающих своего изучения (Соринсон С.Н., 1996; Deka N. et al., 1994; Kirn J. et a. 1995; Simmonds J. ei al., 1995).
Во многих странах, в том числе развивающихся, по-прежнему регистрируется на высоком уровне вирусный гепатит А, а с учетом накопления нсиммун-ных лиц среди населения развитых стран гепатит А и для них представляет серьезную проблему как «экзотическая», в основном импортируемая инфекция, с возможными эпидемическими вспышками в условиях «открытых» границ и широкой миграции населения (Балаян М.С., Каретный Ю.В., 1987; Балаян М.С., 1995; Лобзин Ю.В., 1996). Возможное развитие тяжелых и затяжных форм гепатита А требует изучения с учетом новых сведений об этиологии вирусных гепатитов и увеличения возможности их диагностики. Еще более серьезную проблему представляют гепатиты В, С, D, повсеместное распространение которых не способна приостановить даже вакцинация против гепатита В, введенная в календарь профилактических прививок многих стран мира (Шахгильдян И.В., 1994; Лучшее В.И., 1994, Шляхтенко Л.И., 1994; Ивашкин В.Т. и соавт., 1995). По данным ВОЗ, в мире насчитывается более 300 млн. носителей HBV, широко распространена HCV инфекция.
Большую актуальность в последние годы приобрели вирусные гепатиты микст, вызываемые двумя или тремя гепатотропными вирусами, регистрирующиеся нередко у лиц с насыщенным парентеральным анамнезом, в том числе у инъекционных наркоманов, а также у лиц, злоупотребляющих алкоголем, оказывающим повреждающее действие на печень (Дунаевский О.А. и соавт., 1995; Логинов А.С., 1995; Рахманова А.Г. и соавт., 1995, 1996).
Накопившиеся новые данные в связи с внедрением молекулярнобиологи-ческих методов диагностики позволили выделить HBeAg негативный мутант HBV, что затрудш ло подтверждение гепатита вирусной В этиологии и выделение репликативных форм болезни (Михайлов М.И., 1990; Zanetti et al., 1988; Liang Т. etal., 1991).
Большие сложности вызывает диагностика гепатита С, ибо в широкой клинической практике используется преимущественно определение суммарных антител к HCV, позднее появление которых, а также возможность их наличия у реконвалесцентов заболевания не позволяет осуществлять выявление больных в начальных стадиях болезни и решать вопросы важной этиологической
значимости (Мукомолов C.J1. и соавт., 1994; Сологуб Т.В. и соавт., 1995; Stevens S. et al., 1990).
Возникают большие затруднения в лечении больных с затяжными и хроническими формами вирусных гепатитов. Традиционно используемые стандартные средства патогенетической терапии недостаточно эффективны при прогрессирующих тяжелых и хронических формах болезни (Змызгова А.В. и соавт., 1990, 1996; Грачева Н.М. и соавт., 1993; Корочкина О.В., 1993; Hoofnagle J., 1989, 1993). Новейшими исследованиями установлено значение выявления РНК HCV и ДНК HBV в сыворотке крови для диагностики и назначения средств этиотропной терапии, а также оценки их результативности (Bogard М. et al., 1997; Fearon М. et al., 1997).
Вышеизложенное определяет актуальность дальнейших исследований по проблеме диагностики и терапии вирусных гепатитов.
На основе молекулярнобиологических методов исследования определить критерии диагностики моно- и микст вирусных гепатитов В и С и усовершенствовать тактику их комплексной терапии.
1. Определить клинико-диагностическое значение выявления ДНК и РНК вирусов гепатитов В и С в сыворотке крови методом полимеразной цепной реакции.
2. Определить генотипы вируса гепатита С, циркулирующие в Санкт-Петербурге, при различных формах заболевания.
3. Уточнить значение вирусов гепатитов В и С в развитии затяжных и тяжелых форм болезни у больных с вирусным гепатитом А.
4. Сопоставить при прогрессирующих тяжелых и хронических формах вирусных гепатитов клинико-морфологические данные с результатами серологического и вирусологического обследования больных.
5. Охарактеризовать механизмы реагирования иммунной системы больных вирусными гепатитами В и С с учетом наличия репликативной активности вирусов и применения противовирусных препаратов в комплексной терапии заболеваний.
Положения, выносимые на защиту
При вирусных гепатитах В и С установлено клинико-патогенетическое значение репликативной активности вирусов. Комплексными клинико-серо-логическими и молекулнрно-билогичсскими методами исследования показано значение детекции геномов HBV. HCV, HDV в полимеразной цепной реакции (ПЦР) Д-1Я диагностики вирусных гепатитов и оценки эффективности спосо-
бов терапии заболевания. Результаты ПЦР позволяли подтверждать вирусную этиологию гепатитов у больных с отсутствием антигенов и антител в И ФА с использованием высокочувствительных тест-систем.
Определение генотипов НСУ в Санкт-Петербурге выявило преобладание генотипов вируса 1Ь и 2а (56,1% и 17,1% соответственно), реже выявлялись генотипы 1а, За (14,6 и 7,4%), — в 4,8% выявлены одновременно два генотипа 1Ь и За. Высказывается положение о зависимости наличия в регионе преимущественно среднетяжелых форм гепатита С во взаимосвязи с генотипами НСУ.
Показана возможность и значение одновременной репликации ИВУ, НСУ и НЭУ и установлено ее значение в развитии прогрессирующих тяжелых и/или хронических форм болезни. Сопоставление клинико-лабораторных данных с результатами аутопсий и гистоморфологических исследовании печени позволяет обсуждать положение о значении микст-репликации НВУ, НСУ и НОУ как основной причины смертельных исходов у больных хроническими гепатитами, в том числе в циррогической стадии.
Обосновывается положение о взаимосвязи репликации НВУ НСУ с характером клинического течения вирусного гепатита А и хронических вирусных гепатитов В и С. Тяжелые формы гепатита А развиваются у больных с хроническими репликативнымн формами гепатитов В и С и микст-гепатитами В, С и При субклинических формах вирусных гепатитов В и С НАУ может способствовать репликации НВУ и НСУ, вызывая манифестацию хронических форм болезни разной степени тяжести. Серологическими исследопа-ниями установлено, что затяжное течение гепатита А и обострение болезни у реконвалесцентов может быть обусловлено герпес-вирусами, выявление которых определяет адекватность терапевтической тактики.
На основании изучения комплекса показателей иммунной защиты организма, клеточного и гуморального иммунитета обосновывается положение о зависимости степени их изменений от микст-репликации НВУ, НСУ. У больных с микст-репликацией НВУ и НСУ была достоверно снижена поглотительная и метаболическая активность лейкоцитов и уровень циркулирующих иммунных комплексов. Недостаточное формирование иммунных комплексов, изменения в макрофагальном звене иммунитета, низкий уровень Т-хелперов и, в особенности, В-лимфоцитов отражали наиболее существенные нарушения в иммунном статусе у больных с микст репликацией.
Обосновывается положение о терапевтической эффективности при гепатитах В и С противовирусных и иммуномодулиругощих препаратов (ази-дотимидина, рекомбинантного интерферона) преимущественно при затяжных прогредиентных формах болезни и, в меньшей степени, при хронических гепатитах.
По клинико-лабораторным данным в работе показано, что применение с лечебной целью коммерческой рекомбинантной вакцины против гепатита В при хроническом моногепатите В со слабо выраженной активностью не сопровождается побочными эффектами, а у 2/3 больных способствует исчезновению репликации НВУ, на основании чего выдвигается положение о том,
что вакцина является препаратом выоора в комплексном лечении больных хроническим вирусным гепатитом В.
Установлены патогенетические закономерности развития тяжелых, прогрессирующих затяжных и хронических форм вирусных гепатитов В и С. Внедрение молекулярнобиологических методов диагностики привело к появлению нового патогенетического критерия — репликативной активности вирусов, которая является основой для суждения о прогрессии болезни и оценки эффективности методов терапии.
Впервые установлены факты, характеризующие тяжесть современного течения вирусных гепатитов. Показано значение сочетанной репликации HBV, HCV и HDV в развитии прогрессирующих хронических форм болезни. Установлено, что репликативные формы гепатитов В и С, моно- и микст-, при суперинфекции HAV приобретают тяжелое течение болезни.
Охарактеризованы особенности клинического течения острых и хронических вирусных гепатитов моно- и микст, впервые выделены циркулирующие в Санкт-Петербурге генотипы вирусов гепатита С и показана их взаимосвязь с тяжестью заболевания. Впервые определено значение репликативной активности IIDV, выявляемой в ПЦР для прогрессирующего течения хронического гепатита С. Новыми являются данные о высокой частоте неманифестных форм моногепатита В у лиц с насыщенным парентеральным анамнезом, завершающиеся выработкой протективных антител.
Показано, что изменения иммунологической реактивности отражают характер течения вирусных гепатитов, а возникающие иммунорегуляторные нарушения являются важным звеном патогенеза репликативных форм вирусных гепатитов. Дисбаланс, выявляемый в интерфероновом статусе организма, снижение функциональной и метаболической активности, сокращение численности популяций CD4 Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, повышение уровня естественных киллеров и HLA DR клеток (при микст-инфекции) выражаются прогрессирующим течением гепатита и свидетельствуют о нарушении гомеос-тагической функции иммунной системы.
Впервые по клинико-иммунологическим данным показана терапевтическая эффективность азидотимидина при остром гепатите С. Установлено, что у большинства больных после завершения курса лечения прекращается репликация HCV, что подтверждено результатами отдаленных наблюдений рекон-валесцентов.
В дополнение и развитие данных литературы по результатам определения комплекса клинико-вирусологических показателей и интерферонового статуса организма уточнены показания к назначению рекомбинантных интерферо-нов при вирусных гепатитах и коммерческой рекомбинантной вакцины против гепатита В.
Внедрение молекулярно-биологических методов диагностики привело к существенному улучшению этиологической расшифровки вирусных гепатитов.
Выявленное значение моно- и микст инфекции в развитии различных форм тяжести острого и хронического гепатита позволяет более обоснованно сузить о степени выраженности и характере иммунопатологических состоянии у больных вирусными гепатитами с индивидуализацией показаний к их комп-нексной терапии.
Данные о распределении генотипов IICV, циркулирующих в Санкт-Петербурге, должны быть учтены для изучения клинических форм болезни, создания банка данных типирования вирусов и назначения комплексной противовирусной терапии.
Установлена терапевтическая эффективность азидотимидина и рекомбп-нантного интерферона при затяжных гепатитах В и С, определены схемы лечения с конкретизацией доз препаратов и длительности курса терапии.
Установлена зависимость терапевтической эффективности интерферона у больных гепатитом В от интерферонового статуса и чувствительности имму-нокомпетентных клеток к препарату, что указывает на необходимость их определения в клинической практике. Установлена терапевтическая эффективность комплексной терапии, включающей одновременное назначение интерферона и азидотимидина при хронических репликативных моно- и микст-гепатитах В и С. Впервые показана эффективность использования вакцинотерапии при хроническом вирусном гепатите В.
Апробация и внедрение результатов работы
Материалы диссертации обсуждались на проблемной комиссии «Инфекционные болезни» Медицинской академии последипломного образования (1995, 1996).
Фрагменты работы доложены: на XVII Всемирной конференции терапевтических обществ «»Санкт-Петербург, сентябрь 1996), на Международном симпозиуме «Клиническая медицина» (Калининград, май 1996.), на сателлитном симпозиуме «Противовирусная терапия» (октябрь 1996), на Юбилейной Всероссийской конференции, посвященной 100-летию первой кафедры инфекционных болезней Военно-Медицинской академии (октябрь 1996 г.), на обществе терапевтов им. С.П.Боткина (Санкт-Петербург, февраль 1997).
Результаты работы представлены в виде стендовых докладов на Международной коференции «Прогресс в клинической вирусологии» (Стокгольм, 1994), на IV Международной конференции по ведущим тенденциям в диагностике и лечении хронических вирусных гепатитов (Перуджа, Италия, 1995), на Международной конференции «Прогресс в клинической вирусологии» (Прага, 1995), на IX Международном симпозиуме по вирусным гепатитам и заболеваниям печени (Рим, 1996), на VII Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиоло-
гов и паразитологов (Москва, январ1» 1997 г.), на конференции инфекционис тов Германии (Берлин, март 1997), на Российском национальном конгресс« «Человек и лекарства» (Москва, апрель 1997).
По материалам диссертации опубликовано 59 печатных работ, в том числе главы в «Руководстве для врачей общей практики».
Результаты диссертационной работы внедрены в практическую работ> городской клинической больницы г. Якутска Республики Саха, госпитале в/ч 63784, городской клинической больнице №1 г. Калининграда, городской инфекционной больницы № 30 им. С.П. Боткина (Санкт-Петербург).
Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедрах инфекционных болезней Медицинской академии последипломного образования, Санкт-Петербургской Медицинской академии им. Мечникова, Калининградского университета, Якутского Медицинского института, Университета Республики Саха.
По материалам диссертации составлены «Информационное письмо по диагностике вирусного гепатита С», рекомендации для врачей «Хронический вирусный гепатит».
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 315 стр. машинописи, включает введение, заключение и 5 глав. Обзор литературы составлен на основании анализа 154 источников на русском языке и 298 на иностранных. Таблиц в диссертации 76, рисунков 21.
Материалы и методы исследований
Работа выполнена в специализированной клинике вирусных инфекций НИИ гриппа РАМН (директор д.б.н. О.И. Киселев). Необходимые данные официальной статистики были получены в Центре Госсанэпиднадзора (зав. эпидотделом О.В. Парков, ведущий городской эпидемиолог по проблеме вирусных гепатитов Л.Н. Крыга). В работе использованы также данные больных инфекционной больницы № 30 им. С.П. Боткина (главный врач д.м.н., проф. A.A. Яковлев).
Клиническое течение вирусных гепатитов было изучено у 4570 больных, из них с острыми вирусными гепатитами 3312: гепатит А (ГА) — 1887, гепатит В (ГВ) — 824, гепатитом С (ГС) — 183, гепатитами микст этиологии — 401, невери-фицированной этиологии — 7 больных.
С хроническими вирусными гепатитами наблюдалось 1258 больных в том числе: с хроническим гепатитрм В (ХГВ) — 251, хроническим гепатитом С (ХГС) — 270, хроническим гепатитом микст этиологии (ХВГ) — 713 и ^верифицированной этиологии — 18 больных.
С целью выявления субклинических форм гепатитов В и С обследовано 1248 лип с насыщенным парентеральным анамнезом для решения вопросов последующей их иакцннации против гепатит;! В.
Наблюдения за больными включали кроме клинического обследования, оценку гемограмм, результатов определения уровня билирубина, активности аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ), гаммаг-лютаминтранспептидазы (ГГТП), 5-нуклеотидазы (5-НУК), щелочной фосфо-тазы (ЩФ), вычислялся альбумино-гаммаглобулиновый коэффициент, определялись при необходимости и другие общепринятые биохимические показатели. При острых гепатитах оценка тяжести заболевания проводилась согласно приказу МЗ СССР №408 от 12 июля 1989 г., при хронических гепатитах -по международной классификации 1994 года.
Лабораторная верификация вирусных гепатитов А, В, С, D, Е проводилась путем определения в ИФА специфических серологических маркеров анти-HAV IgM, определения HBsAg и его концентрации и анти-HBs, а также HBeAg и анти НВе, анти HBcIgG и анти HBcIgM, анти HCV IgG, ainи IICV IgM, анти HDV IgG, анти HDV IgM, анти HEV, анти CMV IgM и IgG.
Использовались отечественные (НПО «Аквапаст» и АО «Вектор») и импортные («Ордженикс», «Лабсистемс») тест-системы. Наряду с серологическими проводились молекулярно-биологические исследования в лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии (зав. лаб. М. П. Грудинин), для выявления в образцах крови специфических участков вирусного генома с использованием полимеразной цепной реакции. Обследовано 1491 больной (всего 2500 исследований).
Генотипирование гепатита С проводили с использованием коммерческого набора «INNO — LIPA HCV П»( Innogenetics N.V., Belgium) и метода, разработанного в лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии НИИ гриппа РАМН, основанного на полиморфизме длин рестринированных фрагментов (restricton length fragments poliphmorphysm — RLFP) амплифицирован-ных последовательностей HCV.
Результаты ПЦР и серологических исследований оценивали полуколичественно, в зависимости от степени выраженности.
Иммунологические исследования были проведены у 178 больного в динамике (всего 2030 исследований) и включали определение показателей иммунной защиты организма: функциональной активности фагоцитов крови по их поглотительной и метаболической активности (по спонтанному и нагрузочному НСТ тесту с использованием частиц латекса), определялось процентное содержание фагоцитирующих клеток, реакция торможения миграции лимфоцитов (РТМЛ), спонтанная и индуцированная конконвалином, ЦИК. В цитотоксическом тесте с использованием моноклональных антител определялись В-лимфоциты, Т-лим-фоциты и их субпопуляции CD2, CD3, CD4, CD8, их низкодифференцирован-ные предшественники клетки с «двойными знаками» CD4+CD8- и CD4-CD8+, клетки с маркерами CD 16 — естественные киллеры и один из показателей главного комплекса гистосовместимости — IILA DR. Эти исследования проведены в лаборатории иммунологии клиники (зав. лаб. к.м.н. З.Н. Кннго).
Интерфероновый статус организма оценивался по содержанию общего сывороточного интерферона (ИФ) в циркулирующей крови и способности лейко-
цитов продуцировать при индукции к л вирусом Ныо-Кастла или фитогемаглю-тинином ИФ a/ß и ИФ у по модифицированной методике Г.А. Кондратьева и соавт. (1988). Эти исследования проведены совместно сР.Ю. Ариненко.
Чувствительность иммунокомпетентных клеток к ИФ определяли по от-ношению.миграции лейкоцитов после инкубации их с ИФ в сравнении со стандартным митогеном конконвалином в РТМЛ. Определение в динамике содержания в сыворотке крови антиинтерфероновых антител проводилось в РИГА.
Терапевтическую эффективность противовирусных препаратов, синтетических аналогов нуклеозидов (азидотимидин) и рекомбинантного интерферона оценивали с учетом правил и направлений GCP с использованием протоколов клинических исследований «слепым» открытым методом. Статистическую обработку результатов проводили на персональном компьютере IBM/PC АТ’486 с использованием программ Microsoft Exel и Stat Graph.
Результаты собственных исследований
Изучение официальных материалов регистрации вирусных гепатитов за последние 4 года позволили установить, что заболеваемость вирусными гепатитами в Санкт-Петербурге по мере введения в практику выявления специфических маркеров для диагностики всех регистрируемых случаев гепатита А и гепатита С стала изменяться в своих соотношениях. Так, при суммарной заболеваемости вирусными гепатитами на 100 000 населения 232,7 в 1994, 189,8 в 1995 и 139,7 в 1996 году удельный вес гепатитов В и С составлял 48,7, 38,7,32,4 и 10,5, 14,5 и 16,3 соответственно. Снижение общей заболеваемости было обусловлено преимущественно гепатитом А (со 178 до 89,2 на 100.000 населения города). Следует отметить, что выявляемость гепатита С ежегодно, несмотря на снижение общей заболеваемости вирусными гепатитами, возрастала: с ?0,5 на 100.000 населения в 1994 году до 16,3 в 1996 году, что в определенной мере отражает увеличение диагностических возможностей. Аналогичная ситуация была выявлена в наших наблюдениях.
При обследовании более чем 800 сывороток крови больных с диагнозом направления вирусный гепатит А в эпидемический сезон заболевания (август — ноябрь) выявлен лишь один больной с гепатитом Е по результатам ИФА с анти HEV. Больной прибыл из Средней Азии, заболевание протекало в сред-нетяжелой форме с благоприятным отдаленным исходом. Эти данные г.озво-ляют считать, что гепатит Е не характерен для нашего региона.
Изучение совокупности серологических маркеров у больных с вирусным гепатитом А, подтвержденным эпидемиологически и выявлением IgM анти HAV позволило установить, что вирусный гепатит А выявлялся из 2000 — 2200 больных, ежегодно лечившихся в клинике, у 50 — 65% больных.
Целенаправленное изучение клиники и исходов гепатита А у 733 больных позволило выявить у 521 больного характерное циклическое течение болезни: у 54% больных заболевание протекало в легкой, а у 46% — в форме’ средней тяжести.
Затяжное течение гепатита А наблюдалось у 212 из 733 целенаправленно >бследованных больных (28,9%). Из них у 47 больных установлена коинфек-;ия с гепатитами В и С, у 143 — суперинфекция HAV при хронических гепатитах В и С, а у 22 больных с затяжным течением гепатита А выявлена цнтоме-«аловирусная инфекция. Клинико-биохпмические, серологические данные, а гакже данные ПЦР, а при необходимости биопсии печени позволили выде-ипъ у 47 больных коинфекцию ГА+ГВ — 15 больных, ГА+ГС — 20 больных, ГА+ГВ+ГС — 12 больных. Из этих 47 больных 28 были инъекционными наркоманами, остальным проводились парентеральные вмешательства за 2-3 месяца до настоящего заболевания. Клинически у этих больных отмечалось двух-золновое течение заболевания с повторным повышением уровня билирубина и активности AJIT, что обуславливало затяжное течение болезни с последующим развитием хронического гепатита у 8 из 15 с ГВ, у 5 из 8 обследованных с ГС и у 6 из 12 больных с тройной коинфекцией (ГА+ГВ+ГС).
Среднетяжелые формы ГА при коинфекции с ГВ и ГС отмечены у 27 из 47 больных (57,4%), в то время как при моно ГА — у 46% больных. Хронические формы заболевания развились у 19 больных из 35 обследованных (54,2%). Исключить хронический гепатит В и С в дебюте заболевания было сложно, однако по клиническим и эпидемиологическим данным, а также по результатам серологических данных с использованием ПЦР следовало предполагать наличие микст острого гепатита В, С и гепатита А.
Вирусный гепатит А при хроническом гепатите В наблюдался у 80 больных, хроническом гепатите С у 36 больных, хроническом гепатите В+С у 27 больных. При этом отмечено, что среднетяжелые формы суммарно наблюдались у 47 больных (32,8%), а тяжелые формы у 27 больных (18,8%). Наиболее часто тяжелые формы регистрировались у больных с гепатитом А и хроническим гепатитом микст В и С (29,6%) и у больных с гепатитом А и хроническим гепатитом В (18,7%).
У 22 больных причиной затяжного течения ГА можно считать развитие цитомегаловирусной (ЦМВ) инфекции, у которых в период затяжной рекон-валесценции были выявлены специфические антитела класса IgM. Течение заболевания имело бтагоприятный характер, вероятно, в следствие назначения фамвира (0,750-1,0 г в сутки), спустя 3 месяца от начала заболевания отмечена нормализация клинико-биохимнческих показателей и сероконверсня анти IgM ЦМВ на анти IgG ЦМВ.
Результаты изучения циркуляции HBV и HCV у населения Санкт-Петербурга было проведено с целью выявления их у медицинских работников отделений гемодиализа, хирургии, лабораторий и сотрудников инфекционного стационара. Нами обследовано 1248 человек, в том числе 774 -сотрудники отделений гемодиализа и хирургии, 342 — отделения по пересадке костного мозга, 75 лаборантов, 37 санитарок и 20 административных работников. У них определялись анти-HBs, HBsAg, анти НВс суммарные и содержание общих анти HCV в целях последующей иммунизации против гепатита В.
При этом наиболее высокий уровень субклинических форм вирусных гепатитов преимущественно HBV этиологии выявлен у персонала отделений хирургии и гемодиализа — 58,7±1,6 и отделений по пересадке костного мозга -84,6±1,9.
Анализ распределения лиц с маркерами HBV в зависимости от стажа работы и возраста обследуемых выявил следующие закономерности. У лиц молодого возраста, 19-20 лет, со стажем работы 1-2 года HBsAg выявлен у лаборантов в 7,3%, у врачей — в 3,8%, в то время как у лиц в возрасте 31-49 лет HBsAg выявлен в 1,3%, а анти HBs и анти НВс — в 40,2 и 71,9% соответственно.
Определение содержания анти HBs выявило наличие их в защитной дозе (10-15 ME/мл) у 26,8% врачей отделений гемодиализа и хирургии и в 31,3% — у медсестер.
Результаты определения общих анти HCV у медицинских работников показало их наличие у сотрудников хирургических отделений в 5 раз реже, чем HBV, у 12-20% из 1820 обследуемых. Вместе с тем РНК HCV по данным ПЦР обнаружена у 7 из 10 лиц с общими анти-HCV при отсутствии каких-либо кли-нико-биохимических проявлений болезни. Эти данные позволяют считать, что в отличии от гепатита В, при котором возможно благоприятное течение субклинических форм болезни с формированием у 1/3 больных протективного иммунитета, гепатит С является более агрессивным заболеванием. Наличие виремии у практически здоровых лиц с анти-HCV свидетельствует о необходимости диспансеризации с тщательным обследованием «носителей» антител к HCV. Это важно в особенности-с учетом данных литературы о преимущественно иеманифестном и медленно прогрессирующим течением этого «коварного» заболевания с выявлением его лишь в цирротической стадии, нередко при суперинфекции другими гепатотропными вирусами (Linnen J. et al., 1996).
Результаты наших исследований о высокой частоте инфицирования HBV медицинских работников подтверждают данные литературы (Ивашкин В.Т. и соавт., 1993; Шахгильдян И.В. и соавт., 1994; Нечаев В.В. и соавт., 1995; Огарков И.И., 1996). В дополнении к ним нами установлена частота выявления анти-HBs в защитной дозе при клинически не регистрируемых формах заболевания. Показана также частота обнаружения анти-HCV у лиц с высоким риском парентерального инфицирования.
Для определения значения в комплексной клинико-лабораторной диагностики вирусных гепатитов были использованы результаты детекции ДНК HBV и РНК HCV полуколичественным методом ПЦР в сопоставлении с серологическими маркерами, выявленными в ИФА. Обследовано 1491 больной с использованием ПЦР в динамике заболевания. При этом мы выделили 487 больных с моно и микст репликативными формами гепатита В и С.
Из 195 больных ¡05 больных были с монорепликативным вирусным гепатитом В, а у 90 больных с рсшшкативным гепатитом В были одновременно обнаружены антитела к HCV.
Оценка значения серологических маркеров в диагностике HBV-инфекции проводилась путем сопоставления клипико-биохпмпческих, анамнестических
и эпидемиологических данных с результатами количественного определения HBsAg, HBeAg, анти-НВе, анти-НВс IgM и IgG, с наличием ДНК HBV, определяемой в ГЩР.
источник