Методика бактериологических исследований на дифтерию

Диагностика дифтерии основана на клинических данных с последующим подтверждением диагноза бактериологическим исследованием. Лабораторная диагностика дифтерии включает в себя ряд исследований, основным из которых является микробиологическое.

Зачастую для постановки диагноза бывает достаточно тщательно собранного анамнеза заболевания и осмотра ротоглотки. Всякая задержка при установлении диагноза и назначения адекватного лечения увеличивает вероятность неблагоприятного исхода заболевания.
Выделение культуры возбудителей с последующим определением у выделенных возбудителей токсикогенности является основным и единственным методом микробиологической диагностики дифтерии. Предварительный результат получается через 24 часа, через 48 часов получается результат исследования дифтерийных палочек на токсикогенность, через 72 часа определяется биовар возбудителя.
Микроскопическое исследование при дифтерии нерационально.
Серологическая диагностика основана на определении роста титра антибактериальных антител. Результаты получаются на 2-й неделе заболевания.
При диагностике дифтерии применяется генетический метод (ПЦР), позволяющий определить ДНК бактерий.
Реакция латекс агглютинации относится к экспресс-методам. Результат получается уже через два часа.
Иммунофлуоресцентный анализ результативен. Однако его проведение должно осуществляться только высококвалифицированным персоналом.

Рис. 1. Пленка грязно-белого цвета и выраженный отек подкожной жировой клетчатки шеи — «бычья шея» — классические признаки дифтерии.

Микробиологическое исследование является основным методом лабораторной диагностики дифтерии.

Бактериологическое исследование проводится в следующих случаях:

с целью диагностики дифтерии зева, носа и глотки у взрослых и детей,
с целью выявления возможного бактерионосительства у лиц, которые поступают в детские дошкольные учреждения и специализированные учреждения для взрослых,
с целью выявления заболевания среди контактирующих лиц.

Материал для исследования (мазок на дифтерию) собирается натощак или спустя 2 часа после еды. Для исследования используются дифтерийные пленки или кусочки тканей, расположенных по соседству, отделяемое из мест поражения и носоглоточная слизь.

Забор материала (мазок на дифтерию) осуществляется ватным тампоном. Корень языка прижимается шпателем. Ватным тампоном необходимо коснуться слизистой оболочки миндалин на границе пленки, дужек и задней стенки глотки. Далее тампон опускается в стерильную пробирку, не касаясь ее стенок.

В течение первых 3-х часов должен быть отправлен в лабораторию. При невозможности произвести посев в ближайшие 3 — 4 часа, забор материала осуществляется стерильным ватным тампоном, который смачивают в 5% растворе глицерина в изотоническом растворе хлорида натрия или 2% растворе теллурита калия.

Забор материала (мазок на дифтерию) осуществляется двумя ватными тампонами, один из которых используется для посева, другой — для микроскопии.

При подозрении на дифтерию необходимо оповестить сотрудников лаборатории, чтобы собранный материал был посеян на соответствующие среды (кровяной агар, среда Леффлера или теллуритовая среда).

Посев осуществляется на питательные среды (кровяной агар, среда Леффлера или теллуритовая среда). Теллурит в большой концентрации подавляет рост сопутствующей микрофлоры.

Рис. 2. На фото рост колоний палочки дифтерии на разных средах — кровяном агаре и теллуритовой среде.

При росте бактерий на кровяном агаре колонии приобретают беловатую окраску, они непрозрачные, округлые, выпуклой формы, 1 — 2 мм в диаметре, чаще маслянистой консистенции.

При росте бактерий на теллуритовых средах колонии серого цвета, выпуклые, края ровные. Через двое суток колонии приобретают темно-серый или черный цвет, они имеют металлический блеск, ровные или фестончатые края, поверхность гладкая или радиально исчерчена.

Идентификации разновидностей штаммов возбудителей дифтерии основана на способности бактерий расщеплять гликоген и крахмал. Для этих целей используется методика «длинного» ряда углеводов.

Принимая во внимание ферментативные признаки возбудителей и структуру колоний при росте на теллуритовых средах, выделяют 4 биотипа коринебактерий дифтерии: Corynebacterium diphtheriae gravis, Corynebacterium diphtheriae mittis, Corynebacterium diphtheriae intermedius и Corynebacterium diphtheriae belfanti.

Рис. 3. На фото слева колонии коринебактерий дифтерии гравис (Corynebacterium diphtheriae gravis). Они имеют большой размер, выпуклые по центру, радиально исчерчены, с неровными краями. На фото справа Corynebacterium diphtheriae mittis. Они небольшого размера, темной окраски, гладкие и блестящие, с ровными краями.

Токсикогенность возбудителей дифтерии определяется после выделения культуры бактерий. Для этих целей используется методика диффузной преципитации в геле и методика определения токсикогенности бактерий в живом организме (на морских свинках).

Лабораторная диагностика с применением микроскопии является второстепенным по значимости. Ввиду того, что возбудители дифтерии плохо впитывают красители, окраска по Граму считается не специфичной, однако она позволяет косвенно определить непатогенные коринебактерии, которые в мазке располагаются параллельно друг другу.

При окраске по Нейссеру выявляются характерные для дифтерийных палочек зерна Бабеша-Эрнста, которые располагаются на полюсах клеток, придавая им вид булавы.

В мазках патогенные дифтерийные палочки располагаются под углом друг к другу.

Для выявления зерен Бабеша-Эрнста применяется методика люминесцентной микроскопии. При окрашивании мазков корифосфином в микроскопе можно увидеть желто-зеленые тела бактериальных клеток с оранжево красными зернами волютина.

Рис. 4. Дифтерийные палочки под микроскопом. Окраска по Граму.

Рис. 5. На фото слева ложнодифтерийные палочки Гоффмана. Они часто обнаруживаются в носоглотке. Они толстые, короткие, располагаются в мазках параллельно друг другу. На фото справа патогенные бактерии. В мазке располагаются под углом друг к другу.

Серологические исследования позволяют обнаружить антибактериальные и антитоксические антитела. Значимым является обнаружение антибактериальных антител, так как содержание антитоксина изменяется в связи с применением с первых дней антитоксической сыворотки. Наиболее распространенными в настоящее время является реакция пассивной гемагглютинации (РНГА и РПГА).

Иммуноглобулины G и M говорят об остроте инфекционного процесса.

Иммуноглобулины G говорят о недавно перенесенном заболевании.

Иммуноглобулины М говорят об остропротекающей дифтерии.

При дифтерии титр антител со временем повышается. Понижение концентрации антител свидетельствует о выздоровлении больного.

Противодифтерийные антитела образуются после вакцинации. В крови привитого человека они циркулируют многие годы.

Благодаря применению методики флуоресцирующих антител стало возможным проведение качественного и количественного анализа внутриклеточных и поверхностных антигенов в образцах клеточных суспензий. Антигены визуализируются с помощью специфических антител с флуоресцентными маркерами. Использование данной методики доверяется только высококвалифицированному персоналу.

Методика ПЦР применяется для раннего выявления дифтерийных палочек, подтверждения диагноза и в случаях атипичной ангины. Обнаружение гена токсикогенности методом ПЦР является наиболее быстрым и надежным методом лабораторной диагностики дифтерии.

Рис. 6. ПЦР является наиболее быстрым и надежным методом лабораторной диагностики дифтерии.

При токсическом поражении сердечной мышцы отмечаются изменения на электрокардиограмме, фонокардиограмме и УЗИ сердца. Исследуется активность целого ряда ферментов (лактатдегодрогиназа, креатинфосфокиназа, аспартатаминотрансфераза).
Поражение почек при дифтерии проявляется в виде токсического нефроза. При подозрении на это осложнение производится общий анализ крови и мочи, биохимические исследования (определение креатинина, мочевины, остаточного азота), производится УЗИ почек.
Токсическое поражение печени протекает с явлениями гипогликемии (снижение уровня глюкозы в крови) и глюкозурии (наличие глюкозы в моче).
Развитие анемии связано с гемолизом эритроцитов.

к содержанию ↑

Наличие или отсутствие противодифтерийного иммунитета устанавливается при помощи внутрикожной пробы Шика, которая проводится с дифтерийным токсином.

В случае отрицательной реакции говорят о невосприимчивости к дифтерии. Реакцию Шика сегодня используют только по эпидпоказаниям. На ее проведение уходит несколько дней. Однако несмотря на это она помогает определить степень восприимчивости к дифтерии лиц, находившихся в контакте с больным и уточнить их иммунный статус.

Рис. 7. Реакция Шика проводится с дифтерийным токсином. Стандартный дифтерийный токсин в дозе 0,2 мл вводится внутрикожно в среднюю треть предплечья туберкулиновым шприцом.

источник

Показания. Бактериологическому исследованию подлежат: 1) с диагностической целью больные с подозрением на дифтерию ежедневно в течение 3-х дней с момента обращения; больные с налетом на миндалинах, дужках, язычке, с подозрением на паратонзиллит, паратонзилярный абсцесс, инфекционный мононуклеоз, стенозирующий ларинготрахеит – однократно; 2) по эпидемическим показаниям все контактные – однократно; 3) с профилактической целью вновь поступающие в детские дома, школы-интернаты, специализированные учреждения для детей с поражением центральной нервной системы, санатории для детей с туберкулезной интоксикацией, психоневрологические санатории – однократно. Исследование направлено на выделение возбудителя и идентификацию его патогенных признаков, включая токсигеннность.

Аппаратура, инструментарий, медикаменты:

· исследуемый материал (слизь и пленки с миндалин, ротоглотки, носа, глаза, уха, раны, кожи, влагалища, пупочной ранки);

· стерильные ватные сухие тампоны или стерильные тампоны, смоченные 5 % раствором глицерина в физиологическом растворе с рН 7,6;

· среды обогащения, питательные среды;

· стерильные шпатели, проволочки, деревянные палочки, пробирки, предметные стекла;

· биксы, теплая грелка или сумка-«термос».

Техника выполнения

Для взятия материала используют стерильные сухие ватные тампоны, а при транспортировке в жаркое время – тампоны, смоченные 5 % раствором глицерина на физиологическом растворе. Материал с миндалин и носа берут отдельными тампонами, натощак или не ранее, чем через 2 ч после еды, при хорошем освещении с использованием шпателя, не касаясь тампоном языка, слизистой щек и зубов.

При наличии налетов материал берут с границы пораженной и здоровой ткани, слегка нажимая на них тампоном. Исследуют пленки с миндалин, гортани и других участков. При редких локализациях дифтерии – поражениях глаза, уха, раны и т.д. – берут материал из мест поражения, а также из зева и носа.

После забора материала на посев его необходимо немедленно доставить в лабораторию. Эффективность бактериологического метода зависит от длительности периода между забором материала и посевом. Положительные результаты высоки при посеве у постели больного и маловероятны при посеве через 2-3 ч после забора материала.

Собранный из мест поражения материал засевают на элективные среды (Леффлера, Клауберга) и помещают в термостат при 37 о С. Предварительный ответ об обнаружении бактерий, подозрительных на дифтерию, выдают через 24-48 ч, а окончательный – через 48 ч (культура токсигенная) или через 72 ч (культура нетоксигенная). Токсигенность коринебактерий дифтерии определяют на плотных питательных средах методом преципитации в геле по Оухтерлони.

Для предварительной ориентации можно проводить микроскопию мазков с целью получения немедленного ответа. Для приготовления мазка-отпечатка необходимо приготовить чистое, обезжиренное эфиром предметное стекло. Ватный тампон, укрепленный на деревянной палочке или металлической проволочке, увлажняют изотоническим раствором хлорида натрия и вводят в носовой ход (или со слизистой небных миндалин), делают несколько вращательных движений. После этого тампон помещают на предметное стекло и производят отпечатки. В мазках при микроскопии обнаруживают попарно под углом друг к другу расположенные палочки-возбудители заболевания.

Дата добавления: 2016-01-07 ; просмотров: 2891 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

источник

Справочные и теоретические материалы. Микробиологическая диагностика дифтерии складывается из бактериологического и серологического методов исследования

Микробиологическая диагностика дифтерии складывается из бактериологического и серологического методов исследования.

Бактериологическое исследование проводят с целью лабораторной диагностики дифтерийной инфекции, выявления источников инфекции, подтверждения эпидемиологических связей и наблюдения за распространением токсигенных коринебактерий дифтерии. Цель бактериологического исследования – выявление возбудителя дифтерии с помощью минимального количества диагностических тестов, необходимых, достаточных и специфичных для получения достоверного ответа в максимально сжатые сроки. Не менее трех суток – отрицательный ответ, трех-четырех суток – ответ о выделении токсигенных коринебактерий дифтерии (возбудителя дифтерии). Четырех-пяти суток – ответ о выделении нетоксигенных коринебактерий дифтерии или других представителей этого рода. Бактериологическое исследование проводится на основании МУК 4.2.3065-13. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции. Методические указания (Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор), Главным государственный санитарным врачом РФ Г.Г.Онищенко 14 июля 2013 года).

Эффективность проведения бактериологического исследования в значительной степени зависит от своевременного правильного взятия материала и соблюдения сроков доставки его в бактериологическую лабораторию.

Медицинским работникам лечебно-профилактических организаций (ЛПО), ответственным за взятие и транспортирование материала при обследовании на дифтерию, необходимо согласовывать методику взятия материала, условия транспортирования и возможности применения транспортной среды с врачами-бактериологами, проводящими эти исследования. Медицинским работникам ЛПО, допущенным к взятию и посеву материала, следует проходить инструктаж не реже 1 раза в год в баклаборатории, осуществляющей исследования на дифтерию. Для взятия материала используют коммерческие стерильные сухие ватные (или дакроновые) тампоны, также возможно их приготовление в лабораторных условиях с учетом требований нормативно-методической документации. Тампоны должны иметь форму «капли», а не «веретена».

Материал из ротоглотки и носа берут отдельными тампонами, натощак или не ранее чем через 2 ч после еды, а также до применения полоскания или других видов лечения. Взятие материала осуществляют при хорошем освещении, с использованием шпателя, не касаясь тампоном языка и внутренних поверхностей щек и зубов. Одним тампоном собирают материал с участков ротоглотки – миндалин, дужек мягкого неба, небного язычка, при необходимости – с задней стенки глотки. При наличии налетов патологический материал следует брать с границы пораженных и здоровых тканей, слегка нажимая на них тампоном. Для взятия материала из носа используют другой тампон, который вводят глубоко сначала в один, а потом в другой носовой ход, собирая материал со стенок и перегородки носа, при этом, не касаясь крыльев носа снаружи.

При дифтерии других локализаций (глаза, уши, кожа, раны, гениталии и пр.), помимо материала из пораженных участков, забирают материал из ротоглотки и носа. При показаниях к обследованию на дифтерию и одновременном наличии пораженных слизистых и кожи в углу рта («заеды») обследование этих участков проводят отдельным тампоном и параллельно берут материал из ротоглотки и носа.

При прямой ларингоскопии материал (слизь, пленка) собирают непосредственно из гортани. В случаях оперативного вмешательства для бактериологического исследования следует брать слизь из интубационной трахеотомической трубки.

При взятии материала с пораженного участка кожи необходимо протереть его поверхность промокательными движениями стерильной марлевой салфеткой или тампоном, смоченными стерильным физиологическим раствором, осторожно приподнять или отодвинуть струпы и корочки. После этого тампоном, предназначенным для взятия материала на дифтерию, взять секрет с пораженного участка. Одновременно забирают материал из ротоглотки и носа.

При постмортальном исследовании для выявления возбудителя дифтерии материал следует брать с миндалин, гортани и полости носа (слизь, пленки), при редких локализациях – со слизистой пищевода и желудка. Учитывая, что дифтерия является токсикоинфекцией, другие органы (сердце, печень и пр.) обследуют только для выявления токсических поражений.

Тампоны должны быть доставлены в лабораторию не позднее чем через 3 ч после взятия материала. В холодное время года для предотвращения замерзания исследуемый материал доставляют в бактериологическую лабораторию в сумках-термосах.

При невозможности доставки исследуемого материала в баклабораторию в установленные сроки (не позднее 3 ч) или проведения обследования в ЛПО во второй половине дня материал из ротоглотки (зева) и носа засевают «площадкой» с последующим рассевом на одну чашку Петри с питательной средой, разделенной пополам («чашечный метод»). После этого посевы помещают в термостат при 37 °C до утра следующего дня, после чего доставляют в сумках-термосах в баклабораторию (с указанием времени посева материала). При редких локализациях посев материала из каждого пораженного участка осуществляют на отдельную чашку Петри с питательной средой.

Медицинский персонал ЛПО должен проходить инструктаж в баклаборатории о правилах взятия и посева материала на питательные среды. При невозможности организовать посев материала «чашечным методом» допускается засевать материал в пробирки с транспортной средой для сохранения и подращивания возбудителя дифтерии, которая готовится в лабораторных условиях согласно существующим требованиям.

Не допускается использование коммерческих транспортных сред, предназначенных для исследования на микрофлору ротоглотки и носа, в связи с тем, что состав этих сред не удовлетворяет условиям культивирования возбудителя дифтерийной инфекции, что приводит к потере патологического материала.

В случае использования транспортной среды, приготовленной в лабораторных условиях, согласно нормативной документации, материал собирают сухим тампоном, опускают в пробирку со средой и следят за тем, чтобы пробка тампона не намокала. Следует учитывать, что применение транспортной среды увеличивает срок выдачи окончательного ответа на одни сутки, так как после подращивания в термостате при 37 °C на утро следующего дня материал доставляется в баклабораторию для последующего посева на чашки Петри с селективной питательной средой.

Незасеянные (чистые) чашки Петри с питательной средой и пробирки с транспортной средой доставляются в ЛПО из баклабораторий. Хранение питательных сред в ЛПО осуществляется в холодильнике при 4–6 °C: чашки со средой – не более трех дней; пробирки с транспортной средой – не более 10 дней. Перед взятием и посевом материала их необходимо достать из холодильника и согреть до комнатной температуры. При невозможности доставки материала в баклабораторию круглосуточно ЛПО оснащаются термостатами. В стационаре взятие патологического материала проводят круглосуточно, используя «чашечный метод».

Исследуемый материал из ротоглотки и носа, собранный сухими ватными тампонами и помещенный в пробирки (не менее двух пробирок от одного лица, при редких локализациях добавляются дополнительные пробирки). Материал, засеянный в пробирки с транспортной средой (также не менее двух пробирок от одного лица), или материал из ротоглотки и носа, а также из редких мест локализации, засеянный «чашечным методом», должен быть четко пронумерован и иметь сопроводительную документацию. Пробирки с материалом от одного лица скреплены вместе.

В сопроводительном документе указывают: фамилию, имя, отчество, возраст, адрес обследуемого лица, название учреждения, направляющего материал, локализацию взятия материала (нос, зев, кожа и др.). Дату и время взятия материала, цель обследования (диагностическая, с указанием диагноза, по эпидпоказаниям, с профилактической целью).

Первый день (посев материала)

Материал для исследования из ротоглотки (зева), носа или других пораженных мест засевают раздельно на поверхность одной из рекомендуемых плотных питательных сред — КТА или Клауберг II, разлитых в чашки Петри («чашечный метод посева»).

Лучшими питательными средами для первичного посева материала являются кровяные теллуритовые среды – КТА, Клауберг II. Питательные агары готовят по прописи на этикетке и ex tempore добавляют кровь или глицериновую смесь, теллурит калия. Кровяные теллуритовые среды являются также дифференциально-диагностическими, поскольку колонии коринебактерий на этих средах имеют серую или черную окраску (данные микроорганизмы способны восстанавливать теллурит калия до металлического теллура, вещества черного цвета, и накапливать его внутри клеток). Теллурит калия в определенной концентрации не препятствует росту представителей рода коринебактерий и практически полностью ингибирует рост посторонней микрофлоры. На питательных средах без крови значительно снижается высеваемость (в 2–3 раза), замедляется рост колоний (через 24 ч на чашках первичного посева колонии либо мелкие, либо отсутствуют, рост которых наблюдается только через 48 ч), изменяется морфология колоний, ингибирующая способность значительно ниже при замене теллурита калия на другие ингибиторы (например, хинозол). Для выделения коринебактерий дифтерии выпускается также коммерческая питательная среда Коринебакагар, в которую, согласно прописи по приготовлению, не нужно добавлять кровь. Однако данная среда уступает кровяным средам по ингибирующей активности и ростовым свойствам (образуются колонии меньшего размера на первые сутки или же они могут появляться только на вторые сутки роста).

Для определения токсигенных свойств коринебактерий дифтерии выпускается коммерческая сухая среда ОТДМ и Коринетоксагар. Коммерческие среды готовят по прописи на этикетке, добавляя ex tempore нужные ингредиенты.

В лабораторных условиях готовят транспортную среду для сохранения и накопления коринебактерий дифтерии, которую используют при транспортировании исследуемого материала. Коммерческого выпуска этой среды нет.

Питательные среды для первичного посева разливают по чашкам Петри слоем 3–4 мм. Они могут быть использованы в течение 3 суток при условии хранения при температуре 4–6 °C.

Посев от одного лица производят на одну чашку, используя при этом половину поверхности (1/2) чашки среды для посева материала из ротоглотки (зева), а вторую – для посева материала из носа. При посеве материала с кожи или других пораженных мест добавляют еще одну чашку (все чашки маркируются). Не допускается посев материала от нескольких лиц на одну чашку.

При посеве материал тщательно втирают в среду со всех сторон тампона на участке площадью 2×1 кв. см у края чашки, стараясь оставить весь патологический материал на поверхности формируемой «площадки». Формирование такой «площадки» является обязательным, что позволяет сохранить исследуемый материал, находящийся на тампоне. Дальнейший рассев исследуемого патологического материала осуществляют этим же тампоном, не отрывая тампон от поверхности питательной среды, засевая оставшуюся поверхность 1/2 чашки, что позволяет получить изолированные колонии (чистую культуру) для дальнейшей идентификации непосредственно с чашки первичного посева. Такой метод сохраняет весь патологический материал на поверхности питательной среды и позволяет работать с отдельными изолированными колониями, исключая этап накопления на агаровом косяке чистой культуры, что сокращает длительность проведения исследования на одни сутки.

Засеянные чашки с плотной питательной средой или пробирки с транспортной средой помещают в термостат для инкубации при 37 °C.

Высев из транспортной среды производят описанным выше способом на следующие сутки, используя дифференциально-диагностическую плотную питательную среду, тампоном, отжатым о стенки пробирки, или петлей, забирая материал из осадка.

Чашки со средой предварительно согревают при комнатной температуре или в термостате при 37 °C (15–20 мин.). Если на поверхности чашки со средой есть конденсат, то ее подсушивают на крышке, повернув чашку вверх дном. Нельзя использовать для посева материала «охлажденные» чашки с питательной средой.

1. Колонии, выросшие на чашках, просматривают через 24 ч после посева материала (если материал засевали во второй половине дня, то просмотр осуществляется ровно через 24 ч, т.е. во второй половине дня) визуально или с помощью микроскопа бинокулярного стереоскопического (МБС).

2. Чашки с колониями, «подозрительными» на дифтерийные, отбирают для дальнейшей идентификации культуры по всем тестам. «Подозрительные» колонии на кровяно-теллуритовых средах (КТА) через 24 ч роста – темно-серого или серо-черного цвета, выпуклые, округлой формы, непрозрачные, с ровными краями или с легкой изрезанностыо края или радиальной исчерченностью, мягкой, маслянистой консистенции. Через 48 ч окончательно формируется типичная морфология (архитектоника) колоний – серо-черного или черного цвета с металлическим оттенком («цвет мокрого асфальта»), непрозрачные, матовые, приподнятые с выпуклым центром или выпуклые, округлой формы, гладкие с ровными краями и мягкой консистенции (S-форма) или шероховатые, с радиальной исчерченностью (напоминающие форму «маргаритки»), с приподнятым центром (R-форма), иногда крошащиеся при прикосновении петлей.

3. Микроскопию препаратов-мазков из «подозрительных» колоний можно не проводить, так как все эти колонии подлежат обязательному изучению в пробе на токсигенность и в пробе Пизу.

4. Из «сомнительных» колоний готовят препараты-мазки. В препаратах-мазках, как «подозрительных», так и «сомнительных» колоний, клетки C. diphtheriae из культуры, выросшей на средах первичного посева с ингибиторами роста (теллурит калия), могут быть укорочены, утолщены, однако присущее им расположение и полиморфизм сохраняются. Оценка морфологических признаков не позволяет установить видовую принадлежность микроорганизмов, но дает возможность при обнаружении коринеформных микроорганизмов предположительно отнести их к роду Corynebacterium и подвергнуть дальнейшей идентификации по всем тестам. В случае обнаружения других форм микроорганизмов (кокков, дрожжей, споровых палочек) дальнейшее изучение этих колоний прекращается.

5. В случае роста «подозрительных» по морфологии колоний, похожих на колонии коринебактерий, необходимо сразу через 24 ч роста приступить к изучению их токсигенных свойств. Токсигенные свойства изучают не менее чем у 2 изолированных колоний путем посева одной половины каждой колонии на среду для определения токсигенности и «необожженной» петлей – на среду Пизу, а другой половины колонии – в пробирку со скошенным сывороточным агаром для сохранения и накопления чистой культуры.

6. При невозможности снять 1/2 колонии в первые 24 ч роста для посева на токсигенность и на среду Пизу используется материал целой колонии. Посев на скошенный агар исключается и в дальнейшем используется культура, выросшая через 24 ч в пробирке с пробой Пизу. Учитывая, что через 24 ч роста колонии имеют небольшие размеры и материала 1/2 или 1 колонии может быть недостаточно для накопления дифтерийного токсина в пробе на токсигенность, а также то, что в исследуемом материале могут находиться одновременно токсигенные и нетоксигенные разновидности C. diphtheriae, крайне важно изучить токсигенные свойства по возможности у максимального числа выросших колоний (20 и более), смешивая по 5–7 однотипных колоний в одну бляшку. При невозможности постановки пробы на токсигенность классическим способом из-за недостаточного количества и малого размера колоний, выросших через 24 ч, изучают, смешивая однотипные по морфологии и размеру колонии в нескольких бляшках, и, не прожигая петли, производят посев в среду Пизу. Чашки с пробами на токсигенность и Пизу помещают в термостат.

Определение токсигенных свойств коринебактерий дифтерии

Используют два способа постановки пробы на токсигенность:

1. Модифицированная проба Элека с бумажными полосками, утвержденная для бактериологической практики в нашей стране в 1961 г.

2. Проба Фельдмана Ю.Г. и соавторов с бумажными дисками, разработанная в нашей стране и утвержденная в 1988 г., получившая одобрение Международной рабочей группы ВОЗ по лабораторной диагностике дифтерийной инфекции к применению в зарубежных лабораториях. В основе методов определения токсигенности коринебактерий дифтерии лежит процесс встречной иммунодиффузии токсина и антитоксических антител в плотной питательной среде. В местах оптимального количественного соотношения между токсином, продуцируемым коринебактериями, и антитоксином, нанесенным на фильтровальную бумагу, происходит их взаимодействие с образованием преципитата в виде белой линии.

Токсигенность коринебактерий дифтерии определяют, как правило, в чистой культуре (отдельные колонии со среды первичного посева или культура со скошенного агара или с пробы Пизу). Смесь колоний или культуры, загрязненные посторонней микрофлорой, также могут быть испытаны на токсигенность. При отсутствии в этом случае преципитатов в агаровом геле опыт следует повторить с выделенными на скошенной сывороточно-агаровой среде или после рассева на КТА чистыми культурами.

Для постановки пробы на токсигенность необходимо иметь: стерильные чашки Петри с ровным дном (стеклянные или одноразовые пластиковые), питательную среду – сухую коммерческую питательную среду для определения токсигенности или агар Мартена, нормальную сыворотку крови крупного рогатого скота (СКРС), стерильные полоски из фильтровальной бумаги размером 0,7 см х 8,0 см или бумажные диски диаметром 0,6 см, очищенный ферментолизом и специфической сорбцией дифтерийный антитоксин (в дальнейшем именуется антитоксин), при отсутствии которого в исключительных случаях можно использовать противодифтерийную антитоксическую сыворотку лошадиную, лечебную (в дальнейшем именуется антитоксическая сыворотка). Лучше использовать коммерческие или приготовленные в лаборатории бумажные диски, пропитанные антитоксином. Обязательным является использование контрольного токсигенного штамма коринебактерий дифтерии биовара gravis 24– 48-часового роста.

Постановка пробы на токсигенность

На поверхность чашки Петри со средой для определения токсигенности дифтерийных микробов помещают четыре бумажных диска с дифтерийным антитоксином. Вокруг каждого диска с антитоксином формируют 5 «бляшек»: две «бляшки» – контрольного штамма и три – испытуемые (из одного анализа с подозрительными колониями формируют минимум две «бляшки» из изолированных колоний и одну – из смеси 3–6 однотипных колоний; материалом из этого же анализа можно занять места вокруг других дисков с антитоксином). Все пять «бляшек» располагают симметрично вокруг диска на расстоянии 0,7 см от его края. Диаметр каждой «бляшки» 0,6–0,7 см. На одной чашке Петри можно разместить до четырех дисков с антитоксином и, соответственно, до 20 «бляшек» с культурами (8 «бляшек» контрольных и 12 «бляшек» испытуемых). Бумажные диски расставляют на поверхности сывороточно-агаровой среды на максимально удаленном расстоянии между дисками, чтобы не произошло перекрестных реакций.

Чашки с посевами помещают в термостат при 37 °C.

Результат реакции учитывают через 18–24 ч, а также через 48 ч. Наличие линий преципитации между диском с антитоксином и испытуемой культурой свидетельствует о ее токсигенности. Исследуемая культура считается токсигенной, если линия преципитации данной культуры сливается под углом с линией преципитации контрольного штамма. Отсутствие линий преципитации у испытуемых культур через 48 ч, при наличии их у контрольных штаммов, указывает на отсутствие токсигенности у изучаемых культур. Линии преципитации у контрольных штаммов должны появляться через 18–24 ч. Более позднее появление линий преципитации требует проверки качества питательной среды, проверки чистоты контрольного штамма, или улучшения его фенотипических свойств при выращивании на кровяном агаре, или замены контрольного штамма.

1. Через 24 ч, при появлении специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности, положительной пробе на цистиназу, изучаемую культуру идентифицируют как коринебактерии дифтерии токсигенные и выдают документированный ответ о выделении C.diphtheriae токсигенных. При отсутствии специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности чашки инкубируют еще 24 ч.

2. Культуру, выросшую на скошенном сывороточном агаре или с пробы Пизу (после оценки ее чистоты), засевают на среды для определения биохимического варианта (глюкоза, сахароза, крахмал) и фермента уреазы (гидролиз мочевины).

Определение биохимических признаков

Определение цистиназной активности (проба Пизу).В отличие от C.pseudodiphtheriticum (ложнодифтерийной палочки Гофмана), C.pseudotuberculosis и многих других коринеформных бактерий C. diphtheriae и C.ulcerans обладают ферментом цистиназой.

Определение уреазной активности.C. pseudodiphtheriticum (ложнодифтерийная палочка Гофмана), C.ulcerans, C.pseudotuberculosis и некоторые другие микроорганизмы рода Corynebacterium обладают способностью продуцировать в процессе роста фермент уреазу и расщеплять мочевину. C.diphtheriae такой способностью не обладают.

Определение сахаролитической активности.Для идентификации C.diphtheriae используют также оценку сахаролитической активности выделенных культур на средах Гисса с углеводами – глюкозой, сахарозой, растворимым крахмалом.

Определение нитратредуктазной активности.Способность C.diphtheriae восстанавливать соли азотной кислоты (нитраты) в соли азотистой кислоты (нитриты) является дополнительным признаком, позволяющим отличать их от C.ulcerans и C.pseudotuberculosis, которые не обладают нитратредуктазой.

3. Чашки с первичным посевом исследуемого материала просматривают визуально или с помощью микроскопа бинокулярного стереоскопического (МБС) повторно через 36–48 ч инкубации в термостате. При наличии «подозрительных» колоний изучают их токсигенные свойства, цистиназную активность и выделяют чистую культуру на скошенном сывороточном агаре, если эти процедуры не были выполнены через 24 ч роста первичного материала.

4. Если вырастает только одна колония через 48 ч роста на чашках первичного посева, ее засевают на среду для определения токсигенности и, не обжигая петли, в столбик среды Пизу для определения цистиназы. Для дальнейшей идентификации можно использовать культуру из пробирки с пробой Пизу, или с бляшки через 48 ч роста в пробе на токсигенность, или через 24 ч роста в случае выявления токсигенных свойств идентифицируемой культуры.

5. При отсутствии колоний, подозрительных на коринебактерии дифтерии, выдают окончательный ответ, что коринебактерии дифтерии не выявлены.

6. При отсутствии роста микроорганизмов на «площадках» в чашках первичного посева через 48 ч инкубации в ряде случаев требуется повторное взятие и исследование материала. Отсутствие роста чаще всего свидетельствует о нарушении правил проведения бактериологического исследования (взятия, транспортирования, посева и культивирования исследуемого материала и качества питательных сред для первичного посева).

1. При появлении специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности (через 24 ч инкубации пробы на токсигенность 48-часового роста первичного посева) положительной пробе на цистиназу выдают документированный ответ о выделении токсигенных коринебактерий дифтерии.

2. Культуру, выросшую на скошенном сывороточном агаре или с пробы Пизу, после определения ее чистоты засевают на среды для изучения биохимических свойств (среды Гисса с сахарозой, глюкозой, крахмалом, проба Заксе или бульон с мочевиной), если эта процедура не была сделана ранее.

3. Повторно (через 48 ч) учитывают результаты пробы на токсигенность, поставленной во 2 день исследования. Одновременно производят учет сахаролитических свойств и уреазной активности в пробах, поставленных в 3 день исследования.

При отсутствии специфических линий преципитации через 48 ч после постановки пробы на токсигенность, но при положительных результатах проб на цистиназу, глюкозу, отрицательных результатах проб на уреазу и сахарозу, только на 4–5 сутки культуру идентифицируют как C.diphtheriae нетоксигенные, с указанием биохимического варианта.

4. При выделении токсигенных C.diphtheriae на 3–4 сутки от начала исследования дополнительно ответ о биохимических свойствах может быть выдан на 4–5 сутки (через 72 или 96 ч с момента первичного посева исследуемого материала).

Заключение осуществляется следующим образом.

1. Наличие специфических линий преципитации при определении токсигенных свойств, положительная проба на цистиназу, отрицательная проба на уреазу, характерные морфологические, культуральные и биохимические свойства (отсутствие ферментации сахарозы, ферментация глюкозы и крахмала или неферментация крахмала) позволяют заключить, что выделенная культура является C.diphtheriae, токсигенная, биохимического варианта гравис или митис.

2. Отсутствие специфических линий преципитации при определении токсигенных свойств, положительная проба на цистиназу, отрицательная проба на уреазу, характерные морфологические, культуральные и биохимические свойства (отсутствие ферментации сахарозы, ферментация глюкозы и крахмала или неферментация крахмала) позволяют заключить, что выделенная культура является C.diphtheriae, нетоксигенная, биохимического варианта гравис или митис.

3. При выделении C.pseudodiphtheriticum (ложнодифтерийной палочки Гофмана) или других дифтероидов бактериологический ответ считают отрицательным.

4. При наличии линий преципитации (чаще «размытых» в виде «облачка»), идентичных специфическим линиям контрольного штамма коринебактерий дифтерии, положительных проб на уреазу, цистиназу, ферментации глюкозы и крахмала, отсутствии ферментации сахарозы, отсутствии редукции нитратов в нитриты культуру относят к виду C. ulcerans, токсигенный вариант.

При отсутствии линий преципитации при определении токсигенных свойств и наличии всех других признаков, характерных для C. ulcerans, нетоксигенный вариант, бактериологический ответ считают отрицательным.

5. C.pseudotuberculosis идентифицируется по положительной реакции в пробе на уреазу. Тест восстановления нитратов в нитриты у этих микроорганизмов является вариабельным признаком, поэтому дифференциацию от C.ulcerans проводят по крахмалу (C.pseudotuberculosis не способны разлагать крахмал – отрицательный результат). Необязательный тест для практических бактериологов – для дифференциальной диагностики C.ulcerans и C.pseudotuberculosis вводят дополнительную пробу ферментации трегалозы и гидролиз желатина. Возможно выделение токсигенных C.pseudotuberculosis.

6. При выделении C. ulcerans и C. pseudotuberculosis необходимо подтверждение подобной идентификации в Референс-центре ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, чтобы исключить ошибки при возможном выделении C. diphtheriae.

7. Предварительный ответ при обследовании с диагностической целью и по эпидпоказаниям может быть выдан при наличии множественного роста однотипных «подозрительных» колоний на чашках первичного посева после 24 или 48 ч инкубации (на 2–3 сутки). Выявляют наличие фермента цистиназы и отсутствие фермента уреазы путем внесения в пробирки большого количества колоний. Предварительный ответ может быть изменен после окончания бактериологического исследования.

При нативной микроскопии (по просьбе инфекционистов) требуется дополнительный материал на тампонах из ротоглотки и носа. Однако чаще всего микроорганизмы в виде «палочек» не обнаруживают, что делает этот способ практически непригодным.

Серологическая диагностика.Для оценки состояния противодифтерийного иммунитета проводят определение антитоксических противодифтерийных антител в сыворотке крови человека методом постановки реакции пассивной гемагглютинации. Зарисовать схему постановки РНГА.

РПГА – двухкомпонентная реакция, предполагающая взаимодействие диагностикума эритроцитарного дифтерийного антигенного, который представляет собой эритроциты, сенсибилизированные дифтерийным анатоксином, и антитоксических противодифтерийных антител, находящихся в сыворотке крови обследуемых. При наличии в исследуемой сыворотке антитоксина образуется специфический комплекс: антитоксин + сенсибилизированные анатоксином эритроциты. В результате формируется осадок в виде агглютината эритроцитов.

РПГА рекомендуется ставить одновременно с двумя диагностикумами – дифтерийным и столбнячным. Несмотря на возможность использования коммерческих наборов, необходимо соблюдать основные требования, предъявляемые при постановке РПГА, чтобы устранить ошибки, некоторые неточности и даже ошибочные сведения, встречающиеся в Инструкциях по применению от производителей

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

Купить МУК 4.2.3065-13 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО «ЦНТИ Нормоконтроль».

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
Курьерская доставка (7 дней)
Самовывоз из московского офиса
Почта РФ

Методические указания предназначены для специалистов бактериологических лабораторий санитарно-эпидемиологической службы, лечебно-профилактических организаций независимо от их организационно-правовой формы и формы собственности и научно-исследовательских институтов, осуществляющих лабораторную диагностику дифтерийной инфекции.

2. Общие положения. Сущность метода

3. Характеристика возбудителя дифтерийной инфекции

4. Требования к взятию и транспортированию материала для бактериологической диагностики дифтерии

5. Организационно-методическая работа

6. Бактериологическое исследование

6.1. Порядок проведения бактериологического исследования

6.2. Бактериологическое заключение

6.3. Схема бактериологического исследования

7. Методики идентификации возбудителя дифтерийной инфекции

7.1. Определение токсигенных свойств коринебактерий дифтерии с помощью реакции преципитации в геле

7.2. Методики определения биохимических признаков

8.1. Методы приготовления питательных сред и реактивов

8.2. Среды для определения биохимических свойств

9. Хранение контрольных штаммов в лабораторных условиях

10. Методы контроля питательных сред

10.1. Метод бактериологического контроля питательных сред для первичного посева и сред для определения токсигенных и биохимических свойств

10.2. Метод количественного определения аминного азота

11. Методика постановки реакции пассивной гемагглютинации для выявления противодифтерийных антитоксических антител (РПГА)

12. Нормативные и методические ссылки

Приложение 1. Рецепты красок

Приложение 2. Материалы и оборудование

Приложение 3. Таблица и рисунки

Чтобы бесплатно скачать этот документ в формате PDF, поддержите наш сайт и нажмите кнопку:

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучии человека

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Методические указания МУК 4.2.3065—13

Л12 Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции: Ме

тодические указания.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2013.—63 с.

1. Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Е. Б. Ежлова, А. А. Мельникова, Н. А. Кошкина): ФБУЗ «Федеральный центр пилены и эпидемиоло-П1И» Роспотребнадзора (М. В. Зарочснпсв, И. В. Новокшонова); ФБУН «Московский научно-исслсловатсльский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского» Роспотребнадзора (И. К. Мазурова,

О. IO. Борисова, С. Ю. Комбарова, В. Г. Мельников. Н. М. Максимова,

Т. Н. Якимова); ФБУЗ «Центр гитены и эпидемиологии в г. Москве» Роспотребнадзора (И. Я. Салова, И. П. Трсбунскнх).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы но надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 года № I).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 14 июля 2013 г.

4. Разработаны взамен МУ 4.2.698—98 «Лабораторная диашостика дифтерийной инфекции».

энндемноло! ни Роспотребнадзора, 2013

На тсллуритовой среде без крови (коринебакагар) колонии С. diphtheriae через 24 ч роста мелкие (иногда 0,2—0,6 мм), через 48 ч роста размер колоний увеличивается до 1,0—1,2 мм, иногда наблюдаются «гигантские» колонии. Однако морфология колоний изменяется -исчезает исчерченность края, к 48 ч колонии меняют характерную для С. diphtheriae архитектонику — плоские, «расползающиеся» по поверхности агара, иногда меняется цвет колоний.

Помимо относительно условной оценки морфологии колоний на питательной среде первичного посева существует несколько других признаков, позволяющих различать биовары gravis, mitis, intermedins. Например, характерный рост на бульоне в пробирке: для биовара gravis — поверхностная пленка, бульон прозрачен, на дне пробирки через 24 ч организуегся осадок; для биовара mitis — диффузное помугнение среды с образованием осадка, для биовара intermedins — тонкое гранулярное по-мугнснис с последующим оседанием гранул на дно пробирки.

На кровяном агаре можно наблюдать гемолиз эритроцитов (кроличьих и крупного рогатого скота) при росте биовара mitis, гемолиз только кроличьих эритроцитов при росте биовара gravis и отсутствие гемолиза при росте биовара intermedins. Однако только бновар intermedins обладает липофильностью — способностью усиливать рост на среде с 0,3 % твина — 80.

Для С. diphtheriae характерен значительный полиморфизм — разнообразие размеров и формы клеток. Клетки имеют форму булавы, ракетки, палочки, овоида и т. п. Клетки С. uleerans и С. pseudotuberculosis чаще всего имеют овоидную форму. На средах КТА овоидную форму часто приобретают токсигенные С. diphtheriae. Взаиморасположение клеток напоминает римские цифры X, V, иногда — «китайские иероглифы». Подобную форму клетки приобретают при делении. Возможно параллельное расположение клеток, что особенно характерно для С. pseudodiphtlieriticum и С’, pseudotuberculosis.

При окраске часто обнаруживается выраженная внутриклеточная исчерченность, что объясняется наличием зерен волютина (метахрома-тические гранулы, тельца Бабсша-Эрнста). Описано сродство волютина к метиленовому синему (окраска по Лёффлеру), поэтому при обработке этим красителем гранулы или полоски (скопления гранул) прокрашиваются в синий цвет, а протоплазма в отдельных случаях может приобрести розовый оттенок. В бактериологической практике окраску по Граму не используют, поскольку клетки С. diphtheriae легко обесцвечиваются спиртом и могут выглядеть в мазке как грамотрицательные микроорга-

низмы. При окраске по Нсйсссру, которую также редко используют, клетки С. diphtheriae окрашиваются в желтый цвет с зернами вол юти на (на концах клетки) темно-коричневого цвета, иногда с синим оттенком.

Ферментат ив и а я акт ив ноет ь

Ферментативная активность коринебактерий изучается путем определения ферментов цистиназы, уреазы, способности расщеплять до кислоты глюкозу, сахарозу и крахмал (табл. 1). С. diphtheriae продуцируют фермент цистиназу, отсутствует продукция фермента уреазы, разлагают глюкозу, крахмал (биовар gravis), нс разлагают сахарозу. Биовар mil is не разлагает крахмал. С. diphtheriae способны восстанавливать соли азотной кислоты (нитраты) в соли азотистой кислоты (нитриты).

С. diphtheriae, вызывающие заболевание дифтерией, обладают ток-сигенными свойствами. Основными генами патогенности С. diphtheriae, отвечающими за токсинообразованис, являются ген дифтерийного токсина — tox и регуляторный ген — dtxR. 55—65 % токсигенных С. diphtheriae, циркулирующих в период спорадической заболеваемости дифтерией, имеют изменения (мутации) в этих генах, некоторые из них приводят к повышению уровня токсинообразования. Подобные изменения характеризовали большинство штаммов С. diphtheriae, распространенных в 90-е годы во время эпидемии дифтерии в России и вызвавшие тяжелые формы клинического течения заболевания.

Уровень токсинообразования штаммов С. diphtheriae биовара gravis в два-четыре раза превышал уровень токсинообразования биовара mil is, вызывая более тяжелое клиническое течение дифтерии в период последней эпидемии. Также, начиная с 90-х годов прошлого столетия, биовар gravis имеет доминирующее распространение среди токсигенных С. diphtheriae, в то время как среди нетоксигенных С diphtheriae доминирующее распространение имеет биовар mitis. От 2,0 до 20,0 % этой группы в различные периоды эпидпроцесса составляли штаммы, несущие «молчащий» ген дифтерийного токсина (fov-гсн), нс способный к экспрессии дифтерийного токсина, так называемые нетоксигенные ток-снесущие штаммы С. diphtheriae биовара mitis, эпидемиологическое значение которых до конца не изучено. Для циркуляции С. diphtheriae характерна периодическая смена доминирующего биовара, которая, как правило, совпадает с началом интенсификации эпидпроцесса.

В период спорадической заболеваемости сокращена циркуляция токсигенных С. diphtheriae, вместе с тем циркуляция нетоксигенных остаётся на высоком уровне.

Несвоевременное выявление носителей токсигенных С. diphthcriae бактериологическим методом приводит к «скрытому» распространению возбудителя дифтерии и возникновению новых очагов дифтерийной инфекции.

4. Требовании к взятию и транспортированию материала дли бактериологической диагностики дифтерии

Для взятия материала используют коммерческие стерильные сухие ватные (или дакроновые) тампоны, также возможно их приготовление в лабораторных условиях с учетом требований нормативно-методической документации. Тампоны должны иметь форму «капли», а не «веретена».

Материал из ротоглотки и носа берут отдельными тампонами, натощак или не ранее, чем через 2 ч после еды, а также до применения полоскания или других видов лечения. Взятие материала осуществляют при хорошем освещении, с использованием шпателя, нс касаясь тампоном языка и внутренних поверхностей щек и зубов. Одним тампоном собирают материал с участков ротоглотки — миндалин, дужек мягкого неба, небного язычка, при необходимости — с задней стенки глотки. При наличии налетов патологический материал следует брать с границы пораженных и здоровых тканей, слегка нажимая на них тампоном. Для взятия материала из носа используют другой тампон, который вводят глубоко сначала в один, а потом в другой носовой ход, собирая материал со стенок и перегородки носа, при этом не касаясь крыльев носа снаружи.

При дифтерии других локализаций (глаза, уши, кожа, раны, гениталии и пр.) помимо материала из пораженных участков забирают материал из ротоглотки и носа. При показаниях к обследованию на дифтерию и одновременном наличии пораженных слизистых и кожи в углу рта («за-еды») обследование этих участков проводят отдельным тампоном и параллельно беруг материал из ротоглотки и носа.

гическим раствором, осторожно приподнять или отодвинуть струпы и корочки. После этого тампоном, предназначенным для взятия материала на дифтерию, взять секрет с пораженного участка. Одновременно забирают материал из ротоглотки и носа.

При постмортальном исследовании для выявления возбудителя дифтерии материал следует брать с миндалин, гортани и полости носа (слизь, пленки), при редких локализациях — со слизистой пищевода и желудка. Учитывая, что дифтерия является токсикоинфекцией, другие органы (сердце, печень и пр.) обследуют только для выявления токсических поражений.

При невозможности доставки исследуемого материала в баклабора-торию в установленные сроки (не позднее 3 ч) или проведения обследования в Л ПО во второй половине дня материал из ротоглотки (зева) и носа засевают «площадкой» с последующим рассевом на одну чашку Петри с питательной средой, разделенной пополам («чашечный метод»). После этого посевы помещают в термостат при 37 °С до утра следующего дня, после чего доставляют в сумках-термосах в баклабораторию (с указанием времени посева материала). При редких локализациях посев материала из каждого пораженного участка осуществляют на отдельную чашку Петри с питательной средой.

Медицинский персонал ЛПО должен проходить инструктаж в ба-клаборатории о правилах взятия и посева материала на питательные среды.

При невозможности организовать посев материала «чашечным методом» допускается засевать материал в пробирки с транспортной средой для сохранения и подращивания возбудителя дифтерии, которая готовится в лабораторных условиях согласно нормативно-методической документации. Не допускается использование коммерческих транспортных сред, предназначенных для исследования на микрофлору ротоглотки и носа, в связи с тем, что состав этих сред не удовлетворяет условиям культивирования возбудителя дифтерийной инфекции, что приводит к потере патологического материала.

нение транспортной среды увеличивает срок выдачи окончательного ответа на одни сутки, так как после подращивания в термостате при 37 °С на утро следующего дня материал доставляется в баклабораторню для последующего посева на чашки Петри с селективной питательной средой.

Незасеянные (чистые) чашки Петри с питательной средой и пробирки с транспортной средой доставляются в ЛПО из баклабораторий. Хранение питательных сред в ЛПО осуществляется в холодильнике при 4—6 °С; чашки со средой — нс более трех дней; пробирки с транспортной средой — нс более 10 дней. Перед взятием и посевом материала их необходимо достать из холодильника и согреть до комнатной температуры. При невозможности доставки материала в баклабораторню круглосуточно ЛПО оснащаются термостатами. В стационаре взятие патологического материала проводят круглосуточно, используя «чашечный метод».

Исследуемый материал из ротоглотки и носа, собранный сухими ватными тампонами и помещенный в пробирки (не менее двух пробирок от одного лица, при редких локализациях добавляются дополнительные пробирки), или материал, засеянный в пробирки с транспортной средой (также не менее двух пробирок от одного лица), или материал из ротоглотки и носа, а также из редких мест локализации, засеянный «чашечным методом», должен быть четко пронумерован и иметь сопроводительную документацию. Пробирки с материалом от одного лица скреплены вместе.

В сопроводительном документе указывают: фамилию, имя, отчество, возраст, адрес обследуемого лица, название учреждения, направляющего материал, локализацию взятия материала (нос, зев, кожа и др.), дату и время взятия материала, цель обследования (диагностическая с указанием диагноза, по эпидпоказаниям, с профилактической целью).

5. Организационно-методическая работа

1. Медицинским работникам лечебно-профилактических организаций (ЛПО), ответственным за взятие и транспортирование материала при обследовании на дифтерию, необходимо согласовывать методику взятия материала, условия транспортирования и возможности применения транспортной среды с врачами-бактериологами. проводящими эти исследования.

2. Медицинским работникам ЛПО, допущенным к взятию и посеву материала, следует проходить инструктаж не реже 1 раза в год в бакла-боратории, проводящей исследования на дифтерию.

3. Врачам-бактериологам ЛПО и ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора в субъектах Российской Федерации следует повышать квалификацию на курсах тематического усовершенствования по лабораторной диагностике дифтерии нс реже 1 раза в три года.

4. Методическую помощь по вопросам взятия, транспортирования и лабораторной диагностики дифтерии осуществляют региональные центры по мониторингу за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней II—IV групп патогенности (на базе ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора в субъектах Российской Федерации — далее Региональные центры но мониторингу) и Референс-центр по мониторингу за дифтерией (на базе ФБУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора — далее Референс-центр).

5. Бактериологические лаборатории ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора в субъектах Российской Федерации направляют все выделенные токсигенные и выборочно нстоксигснныс штаммы С. diphtheriae, С. ulcerans, С. pseudotuberculosis, а также штаммы с атипичными свойствами в Референс-центр для реидентификации (верификации) по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

6. Бактериологические лаборатории Региональных центров по мониторингу и Референс-центр осуществляют внешний контроль качества лабораторных исследований на дифтерию, проводимых в бактериологических лабораториях субъектов Российской Федерации.

6. Бактериологическое исследование

6.1. Порядок проведения бактериологического исследования

Первый день. Посев материала

Посев от одного лица производят на одну чашку, используя при этом половину поверхности ( 1 Л) чашки среды для посева материала из ротоглотки (зева), а вторую — для посева материала из носа. При посеве материала с кожи или других пораженных мест добавляют еще одну чашку (все чашки маркируются). Не допускается посев материала от нескольких лиц на одну чашку.

При посеве материал тщательно втирают в среду со всех сторон тампона на участке площадью 2 х 1 см 2 у края чашки, стараясь оставить весь патологический материал на поверхности формируемой «площад-

2. Общие положения. Сущность метода. 4

3. Характеристика возбудителя дифтерийной инфекции. 9

4. Требования к взятию и транспортированию материала для

бактериологической диагностики дифтерии. 13

5. Организационно-методическая работа. 15

6. Бактериологическое исследование. 16

6.1. Порядок проведения бактериологического исследования. 16

6.2. Бактериологическое заключение. 20

6.3. Схема бактериологического исследования. 22

7. Методики идентификации возбудителя дифтерийной инфекции. 23

7.1. Определение токсигснных свойств коринсбактсрий дифтерии

с помощью реакции преципитации в геле. 23

7.2. Методики определения биохимических признаков. 30

8.1. Методы приготовления питательных сред и реактивов. 34

8.2. Среды для определения биохимических свойств. 39

9. Хранение контрольных штаммов в лабораторных условиях. 42

10. Методы контроля питательных сред.

10.1. Метод бактериологического контроля питательных сред для

первичного посева и сред для определения токсигенных и биохимических свойств.

10.2. Метод количественного определения аминного азота. ^

11. Методика постановки реакции пассивной гемагглютинации для

выявления противодифтерийных антитоксических антител (РПГА). 4^

12. Нормативные и методические ссылки. ^

Приложение I. Рецепты красок. 54

Приложение 2. Материалы и оборудование. ^

Приложение 3. Таблица и рисунки.

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Методические указания МУК 4.2.3065—13

Методические указания (далее — МУ) предназначены для специалистов бактериологических лабораторий санитарно-эпидемиологической службы, лечебно-профилактических организаций независимо от их организационно-правовой формы и формы собственности и научно-исследовательских институтов, осуществляющих лабораторную диагностику дифтерийной инфекции.

2. Общие положения. Сущность метода

Возбудитель дифтерии — коринебактерии дифтерии (Corvnebacte-пит diphtheriae), продуцирующие дифтерийный токсин (экзотоксин).

Источником инфекции является больной или бактерионоситель токси-генных С. diphtheriae.

Нетоксигенные С. diphtheriae не вызывают дифтерийную инфекцию. «Этиологическая» значимость этих микроорганизмов при фарингите, артрите, эндокардите и др. гнойно-септических заболеваниях требует специальных доказательств. При выделении нетоксигенных штаммов С.diphtheriae от больных с подозрением на дифтерийную инфекцию следует обратить внимание на правильность проведения бактериологического исследования и оценку токсигснных свойств.

Способность С. diphtheriae вырабатывать экзотоксин опосредован феноменом фаговой (или лизогенной) конверсии. Конверсию нстокси-генных штаммов С. diphtheriae в токсигенные и наоборот можно воспроизвести в особых экспериментальных (лабораторных) условиях. В тех случаях, когда при первичном посеве исследуемого материала от больных дифтерией или бактерионосителей выделяют токсигенные, а при повторных обследованиях после лечения антибиотиками — нетоксигенные коринебактерии дифтерии, можно предположить, что токсигенные и нетоксигенные С. diphtheriae колонизировали слизистые ротоглотки и носа одновременно. При лечении антибиотиками в первую очередь исчезают токсигенные штаммы, как более чувствительные к их действию, а нетоксигенные штаммы продолжают выделяться. Обнаружение только нетоксигенных штаммов у бактерионосителей при повторных обследованиях после лечения нельзя трактовать, как утрату способности токсигенных штаммов продуцировать экзотоксин.

Таксономически близкими к виду С. diphtheriae являются Corynebacterium ulcerans и Corynebacterium pseudotubercidosis — природные патогены крупного и мелкого рогатого скота, лошадей, домашних животных, способные вырабатывать дифтериеподобный экзотоксин, в редких случаях могут вызывать заболевания у человека.

Известны случаи выделения токсигенных С. ulcerans при клинической картине заболевания, сходной с дифтерией, а также токсигенных С pseudotubercidosis, вызывающих лимфадениты. Инфекции, вызванные этими микроорганизмами, у человека встречаются крайне редко, не имеют эпидемического распространения, а, следовательно, значение этих случаев в медицине невелико.

На слизистых оболочках ротоглотки и носа в норме часто встречается Corynebacterium pseudodiphtheriticum (ложнодифтерийная палочка Гофмана). Умение выделять и идентифицировать данные микроорганизмы, а также нетоксигенные С. diphtheriae служит критерием оценки

качества работы бактериологов, особенно в период снижения и спорадической заболеваемости дифтерией.

С. diphthereiae растут на питательных средах, сбалансированных по своему составу, и нс растут на простых питательных средах. Требуется кровь любого животного или человека (донора), как источник аминокислот, ростовых факторов, железа и пр. Нс всегда коммерческие среды удовлетворяют этим требованиям, поэтому контроль качества питательных сред и всех ингредиентов в лабораториях обязателен.

Кровяные теллуритовые среды (КТА, Клауберг II) остаются лучшими селективными дифференциально-диагностическими средами, обеспечивающими рост колоний через 24 ч, что на одни сутки сокращает сроки выдачи окончательного бактериологического ответа. КТА прост в приготовлении: основой этой среды являегся коммерческий сухой питательный агар (СПА), в качестве кровяных добавок используют кровь, однако не исключены любые гемолизированные кровяные добавки.

Трудоемкость бактериологического метода и стоимость анализа сокращается при использовании двух половин одной чашки с селективной дифференциально-диагностической питательной средой (далее плотная питательная среда) для посева материала из зева и носа от одного обследуемого. Использование Уа чашки для посева таких образцов на плотной питательной среде недопустимо, так как не позволяет, в большинстве случаев, получить рост изолированных колоний и провести исследование в установленные сроки.

Посев материала из зева и носа на кровяной агар производить нецелесообразно, так как очень сложно получить рост изолированных колоний C.diphtheriae на данной среде из-за обильного роста другой сопутствующей микрофлоры.

Колонии, морфология которых характерна для микроорганизмов рода Corynebacterium, в подавляющем большинстве нс подлежат микроскопии и должны быть изучены по всем необходимым идентификационным тестам. «Сомнительные» колонии с нехарактерными морфологическими свойствами подвергают микроскопии. Если в мазках обнаруживают коринеформные микроорганизмы, исследование следует продолжить по всем необходимым идентификационным тестам.

Окрашивание мазков осуществляют по Лёффлеру (щелочной метиленовый синий) или с использованием других синих красителей. Окраску по Граму не применяют, т. к. в процессе окраски клетки грамположи-тельных C.diphtheriae легко обесцвечиваются спиртом и могут выглядеть грамотрицательными (розовый оттенок). Чаще всего это явление наблюдают при окрашивании токсигенных С. diphtheriae (клеточная

стенка токсигснных С diphtheriae ближе но организации и структуре к грамотрицательным микроорганизмам).

В бактериологической практике опираться только на морфологические свойства микробной клетки или колоний при идентификации С. diphtheriae недостаточно. Описаны случаи бактериологической гипо-и гипердиагностики (в 55,0 и 14,5 % случаев соответственно), когда использовали учет только морфологических признаков.

При идентификации С. diphtheriae необходим комплекс идентификационных тестов. Основной специфический тест для выявления возбудителя дифтерии, правильная постановка кагорого является залогом успешной диагностики дифтерийной инфекции, — определение у выделенной культуры способности к продукции дифтерийного токсина. Определять продукцию токсина следует начинать уже в первый день появления роста изолированных колоний на чашках с плотной питательной средой, исключая этап накопления чистой культуры. Не соблюдение этого правила увеличивает сроки исследования на одни сутки.

Во избежание ошибок при определении токсигенных свойств кори-небактерий необходимо изучать данный признак у максимального числа выросших колоний (двадцать и более) с чашек первичного посева. При множественном росте подозрительных колоний нельзя ограничиться формированием только одной-двух бляшек. Кроме того, необходимо изучать токенгенные свойства отдельных изолированных колоний, чтобы не потерять нетоксигенные штаммы С diphtheriae, присутствие которых также возможно при наличии токсигенных С. diphtheriae в патологическом материале.

Используют два способа постановки пробы на токсигснность:

1) модифицированная проба Элека с бумажными полосками, утверждённая для бактериологической практики в нашей стране в 1961 г.;

2) проба Фельдмана Ю. Г. и соавторов с бумажными дисками, разработанная в нашей стране и утвержденная в 1988 г., получившая одобрение Международной рабочей группы ВОЗ по лабораторной диагностике дифтерийной инфекции к применению в зарубежных лабораториях.

В пробе на токсигснность следует использовать только антитоксин — противодифтерийные антитоксические антитела, очищенные методом специфической сорбции, что позволяет избежать появления неспецифических линий преципитации микробного происхождения. В исключительных случаях при отсутствии антитоксина допускается использование лечебной противодифтерийной антитоксической лошадиной сыворотки. В таком случае возможно появление неспецифических линий

преципитации микробного происхождения, которые необходимо отличить от специфических линий токсического происхождения.

Обязательными являются биохимические тесты — на цистиназу, уреазу, расщепление глюкозы, сахарозы и крахмала. Тест на нитраты проводят только при положительной уреазной реакции. Использование других тестов, применяемых в некоторых зарубежных странах, необоснованно увеличивает продолжительность, трудоемкость, стоимость исследования и не всегда приводит к точной идентификации «недифтерийных» микроорганизмов (других представителей рода Corynebacte-rium). При лабораторной диагностике дифтерии не является обязательным определение видовой принадлежности «недифтерийных» корине-бактерий рода Corynebacterium, тем более что их идентификация требует отдельных хемотаксономических и молекулярно-генетических моголов исследования.

С. diphtheriae подразделяют на культурально-биохимические варианты (биовары) gravis, mitis, intermedins, belfanti. В бактериологической практике определению подлежат биовар gravis и объединенная группа «митисных форм» — mitis, intermedius, belfanti, т. е. группа микроорганизмов С. diphtheriae, которая не обладает амилазной активностью (не разлагает крахмал). Биовар belfanti нс подлежит отдельному определению, так как этот микроорганизм не способен продуцировать экзотоксин. В бактериологической диагностике отдельного выделения биовара intermedius также не требуется, так как относительно условными дифференцирующими признаками от биовара mitis являются только размер колоний и наличие липофильности. Таким образом, в бактериологической диагностике определяются токсигснныс и биохимические свойства С. diphtheriae биовара gravis и группы микроорганизмов, у которых отсутствует амилазная активность, объединённые в группу С diphtheriae биовар mitis.

Молекулярно-генетические методы для лабораторного выявления С. diphtheriae находятся в стадии разработки. Имеющиеся тест-системы для метода ПЦР не могут различить ген дифтерийного токсина токси-генных штаммов от «молчащего» гена дифтерийного токсина нетокси-генных токснссущих штаммов С. diphtheriae, не способных продуцировать токсин из-за мутаций в этом гене. Это может привести к гипердиагностике. Поэтому их использование в лабораторной диагностике диф-герии может иметь только вспомогательное значение — поиск нетокси-генных токснесущих штаммов С diphtheriae среди нетоксигенных штаммов.

3. Характеристика возбудители дифтерийной инфекции

Род Corynebacterium гетерогенный, как и группа, условно объединившая его и другие роды грамположительных палочек, не образующих споры размером 0,3—0,8×1,5—8,0 мкм, неподвижных, обладающих различной степенью полиморфизма и плеоморфизма. C.diphtheriae имеют размер 0,2—0,6 х 1,0—7,0 мкм. Арабиногалактановый полимер клеточной стенки C.diphtheriae отличает этот вид от всех других видов рода Corynebacterium. Клеточная стенка С. diphtheriae имеет от 3—5 до 7—9 слоёв. Известно, что клеточная стенка токсигснных C.diphtheriae лучше дифференцирована и более тонкая по сравнению с клеточной стенкой нетоксигенных С. diphtheriae и других коринеформных микроорганизмов этого рода, что определяет их отношение к антибиотикам — токси-генные более чувствительны, чем нетоксигенные к пенициллину, эритромицину, тетрациклину и макролидам. Однако появляются штаммы С. diphtheriae устойчивые к некоторым антибиотикам, преимущественно выделенные от бактерионосителей.

Патогенные для животных Corymebacterium ulcerans и Corynebacterium pseudotuberculosis, некоторые комменсалы кожи со слизистых оболочек человека, например, Co/ynebacterium pseudodiphtheriticum (лож-нодифгерийная палочка Гофмана), Coiynebacterium xerosis, Corynebacterium striatum таксономически близки к виду С. diphtheriae.

Большинство видов лучше растет в аэробных условиях, в том числе и микроорганизмы вида С. diphtheriae. Вместе с тем, С. diphtheriae являются факультативными анаэробами (генерируют энергию, используя как молекулярный Оз, так и органические соединения), что крайне важно учитывать при изучении их ферментативной активности.

Вес коринсбактсрии, в т. ч. и С. diphtheriae, являются мезофнлами и растут при 36—37 °С.

Устойчивость к факторам внешней среды

С. diphtheriae устойчивы к низкой и чувствительны к высокой температуре (низкие температуры нс убивают дифтерийные палочки длительное время, под действием прямого солнечного света палочки дифтерии гибнут в течение нескольких дней); значительно устойчивы во внешней среде и длительно сохраняют жизнеспособность в дифтерийной пленке, в капельках слюны, на ручках дверей, детских игрушках до 15 дней; в пыли, на полу, на предметах в окружении больного до 18—40 дней; в сухой дифтерийной плёнке до 7 недель; в воде выживают в течение 6—20 дней. Корннебактерии дифтерии не устойчивы к действию физических и химических обеззараживающих средств и разрушаются под действием обычных дезинфектантов в обычных концентрациях (3—

5 %) при экспозиции 30 мин; погибают при нагревании до 60 °С в течение 10 мин, кипячение убивает их моментально.

Обычно колонии микроорганизмов из рода Corynebacterium на плотных питательных средах (например, на кровяном агаре) имеют серовато-белую или желтую окраску, непрозрачные или полупрозрачные, приподнятые, округлой формы, диаметром 1—3 мм. Чаще всего они бывают мягкой, маслянистой консистенции, хотя некоторые виды рода Coiynebacterium могут образовывать шероховатые R- кол он и и и крошиться при прикосновении. На питательных средах, сбалансированных по своему составу и удовлетворяющих требованиям культивирования С. diphtheriae через 24—48 ч роста вариант mitis образует колонии S-типа — приподнятые, гладкие, диаметром 1—2 мм; S-R-колонии варианта gravis обычно выпуклые, с приподнятым центром, диаметром 2— 3 мм; колонии варианта intermedius — S-типа, мелкие, плоские, гладкие, с ровным краем, диаметром 0,5—1 мм.

На селективных дифференциально-диагностических средах — кровяной теллуритовый агар (КТА) и Клауберг 11 через 24—48 ч роста колонии С. diphtheriae варианта gravis имеют серо-черную или черную окраску с металлическим оттенком («цвет мокрого асфальта»), непрозрачные, матовые, приподнятые с выпуклым центром, округлой формы, диаметром 1—3 мм, имеют радиальную исчерченность (форма «маргаритки») или выраженную краевую изрезанность, часто крошатся при прикосновении; колонии С. diphtheriae варианта mitis имеют серочерную или черную окраску («цвет мокрого асфальта»), непрозрачные, матовые, приподнятые с выпуклым центром, иногда плоские, округлой формы, диаметром 1—2 мм, чаще всего бывают мягкой, маслянистой консистенции или могут крошиться при прикосновении; колонии С. diphtheriae варианта intermedius имеют серо-черную окраску, мелкие, плоские, гладкие, с ровным краем, диаметром 0,5—1,0 мм, мягкой, маслянистой консистенции.

Морфология колоний С. ulcerans и С. pseudotuberculosis на КТА через 24—48 ч роста идентична морфологии колоний С. diphtheriae варианта gravis, серо-черной или черной окраски («цвет мокрого асфальта»), иног да с коричневым оттенком, колонии непрозрачные, матовые, приподнятые с выпуклым центром, округлой формы с радиальной ис-черченностью (или без неё), диаметром 1—2 мм. Колонии С. pseudo-diphtheriticum — серого цвета с характерным светлым ободком, непрозрачные, приподнятые, матовые, округлой формы, диаметром 1—2 мм.

источник