Возбудитель относится к роду Carinobakterium, виду C. difteria.
Это тонкие палочки, прямые или слегка изогнутые, грамположительные. Для них характерен выраженный полиморфизм. На концах булавовидные утолщения. В мазках бактерии располагаются под углом в виде V или X.
Спор и капсул не образуют. Неподвижны. Имеют фимбрии. Являются факультативными анаэробами или аэробами.
Выделяясь во внешнюю среду со слюной, пленками, дифтерийные палочки способны сохранять жизнеспособность на предметах в течение нескольких дней. Хорошо переносят высушивание.
Каринобактерии требовательны к питательным средам, для их культивирования применяются сывороточные среды или среды с добавлением крови. Используется среда Ру (свернутая сыворотка). Для выделения используются элективные питательные среды с добавлением толурита калия. Каринобактерии подразделяются на три биовара: gravis, mitisintermedius.
1) ворсинки, фимбрии или пили;
2) колонизация и инвазия (за счет ферментов);
3) корд-фактор (нарушает фосфорилирование процессов дыхания клеток макроорганизма);
4) ведущий фактор – экзотоксин.
Пути передачи – воздушно-капельный, контактно-бытовой.
Возбудитель проникает через слизистые оболочки ротоглотки, реже – глаз, половых органов, кожу, раневую поверхность.
Сам возбудитель остается на месте входных ворот инфекции, а патогенез и клиническая картина определены действием экзотоксина, который оказывает общее и местное действие.
Патоморфологическим проявлением взаимодействия макро– и микроорганизма при дифтерии является фибринозное воспаление. В выходящем из сосудов экссудате обнаруживается фибриноген, при свертывании которого на поверхности слизистой оболочки образуются серовато-белого цвета пленчатые налеты, плотно спаянные с окружающей тканью. Они тяжело снимаются, при их отрыве обнажается эрозийная поверхность. Разрастание этих пленок приводят к развитию истинного крупа.
Затем в воспалительный процесс вовлекаются:
1) регионарные лимфатические узлы (лимфадениты);
3) сердце (параличу сердечной мышцы);
6) периферическая нервная система – полиневриты, парезы;
7) иммунная система (на 5—7-й дни антитела отсутствуют).
Сила токсина измеряется в DLM. 1 DLM – это минимальное количество токсина, которое при подкожном введении морской свинке весом 250 г вызывает ее гибель на 4—5-е сутки при характерной патолого-анатомической картине.
Диагностика. Профилактика. Лечение дифтерии
Микробиологическая диагностика
1. Основной метод – бактериологическое исследование.
2. Определение токсигенности видовой культуры (реакция преципитации Вагая).
Способы определения токсигенности:
3) использование ДНК-зондов;
4) реакция преципитации Вагая.
1) лица с подозрением на дифтерию;
2) больные с различными заболеваниями лор-органов.
Особенности бактериологического исследования при дифтерии:
1) посев материала на элективные питательные среды;
2) слизистые оболочки носа, зева, половых органов, кожа в составе нормальной микрофлоры содержат различных представителей рода Carinobakterium. Они условно-патогенны, объединены понятием дифтероиды. У ослабленных больных, с вторичным иммунодефицитом, у онкологических больных могут вызывать различные гнойно-воспалительные процессы. В ходе бактериологического исследования надо дифференцировать каринобактерии дифтерии от дифтероидов.
Отличия дифтероидов от возбудителей дифтерии:
1) различия по морфологическим свойствам. Дифтероиды в мазках располагаются беспорядочно или в виде палисада. В цитоплазме зерна волютина отсутствуют;
2) различия в биохимической активности;
3) для выявления различий в антигенных свойствах используют реакцию агглютинации по идентификации с видовой дифференцированной сывороткой;
4) чувствительность к бактериофагу.
Культуральные свойства не отличаются.
Этиотропная терапия: антитоксическая противодифтерийная сыворотка; вводится в дозе 10 000—50 000 АЕ (в зависимости от возраста и тяжести заболевания).
1 АЕ – это такое минимальное количество сыворотки, которое нейтрализует 100 DLF дифтерийного токсина.
Серотерапия эффективна в ранний период болезни, пока токсин не фиксирован клетками организма и ткани существенно не повреждены.
Профилактика:
1) активная. Используются вакцины: АД (дифтерийный анатоксин), АДС, АДСМ, АКДС. Вакцинация АКДС проводится трехкратно детям в возрасте 3 месяцев. Ревакцинация проводится под контролем определения содержания (титра) антитоксинов сыворотки с помощью реакции РПГА с дифтерийным анатоксическим эритроцитарным диагностикумом;
2) пассивная. Проводится в очагах заболевания антитоксической сывороткой, доза которой определяется формой и тяжестью заболевания.
Возбудитель относится к роду Mycobakterium, вид M. tuberculesis.
Это тонкие палочки, слегка изогнутые, спор и капсул не образуют.
Туберкулезная палочка имеет особенности – в клеточной стенке содержится большое количество липидов (до 60 %). Большинство из них – миколовые кислоты, которые входят в каркас клеточной стенки, где находятся в виде свободных гликопептидов, входящих в состав корд-факторов. Корд-факторы обуславливают характер роста в виде жгутов.
Микобактерии туберкулеза окрашиваются по Цилю—Нильсену. Этот метод основан на кислотоустойчивости микобактерий.
В результате лечения противотуберкулезными препаратами возбудитель может утратить кислотоустойчивость.
Для микобактерий туберкулеза характерен выраженный полиморфизм. В их цитоплазматической мембране обнаруживаются характерные включения – зерна Муха. Микобактерии в организме человека могут переходить в L-формы.
Микобактерии требовательны к питательным средам. Факторы роста – глицерин, аминокислоты. Растут на картофельно-глицериновых, яично-глицериновых и синтетических средах.
На плотных питательных средах образуются характерные колонии: морщинистые, сухие, с неровными краями.
Возбудитель туберкулеза проникает в организм в составе мелкодисперсных аэрозолей. Возбудитель должен попасть в альвеолы, где они поглощаются резидентными макрофагами.
В результате взаимодействия микобактерий и макрофагов под влиянием факторов вирулентности развивается воспаление гранулематозного типа.
Из легких туберкулезная палочка попадает в регионарные лимфатические узлы, далее – в кровоток.
Путь заражения воздушно-капельный. Источник – больной человек, который в острый период выделяет с мокротой туберкулезные палочки.
Наиболее часто встречается туберкулез легких, но могут поражаться и кишечник, и опорно-двигательный аппарат, и мочеполовая система, и др. Выделяют два патогенетических варианта туберкулеза.
1. Первичный туберкулез. Возникает у лиц, ранее не имевших контакта с возбудителем. Инфицирование происходит в детском возрасте или подростковом периоде.
Через 2–3 недели формируется первичный туберкулезный комплекс(первичный аффект, лимфаденит, лимфангит).
Наиболее часто он самоизлечивается, подвергается фиброзу и кальцификации (очаг Гона). В других случаях развивается острый туберкулез.
2. Вторичный туберкулез. Протекает хронически. Возникает при реактивации первичного очага (через 5 лет и более).
Развитию вторичного туберкулеза способствуют неблагоприятные условия жизни, хронические заболевания, алкоголизм, и др.
источник
Возбудитель дифтерии характеризуется полиморфизмом: тонкие, слегка изогнутые палочки (наиб. распространенные) встречаются кокковидные и ветвящиеся формы. Бактерии нередко располагаются под углом друг к другу. Они не образуют спор, не имеют жгутиков, у многих штаммов выявляют микрокапсулу. Характерная особенность — наличие на концах палочки зерен волютина (обусловливает булавовидную форму). Возбудитель дифтерии по Граму окрашивается положительно.
Факультативный анаэроб, оптим. температура. Микроб растет на специальных питательных средах, например на среде Клауберга (кровяно-теллуритовый агар), на которой дифтерийная палочка даёт колонии 3 типов: а) крупные, серые, с неровными краями, радиальной исчерченностью, напоминающие маргаритки; б) мелкие, черные, выпуклые, с ровными краями; в) похожие на первые и вторые.
В зависимости от культуральных и ферментативных свойств различают 3 биологических варианта C.diphtheriae:gravis,mitisи промежуточныйintermedius.
Экзотоксин, нарушающий синтез белка и поражающий в связи с этим клетки миокарда, надпочечников, почек, нервных ганглиев. Способность вырабатывать экзотоксин обусловлена наличием в клетке профага, несущегоtох-ген, ответственный за образование токсина. Ферменты агрессии — гиалуронидазу, нейраминидазу. К факторам патогенности относится также микрокапсула.
Выделяют два основных биовара возбудителя (gravis и mitts), а также ряд промежуточных (intermedius, minimus и др.)
Материал для исследования,методика забора,этапы бактериологического метода исследования дифтерии
С помощью тампона у больного берут пленку и слизь из зева и носа
Материал для исследования из ротоглотки, носа или других пораженных мест засевают раздельно на поверхность одной из рекомендуемых плотных питательных сред, разлитых в чашки Петри. При посеве материал втирают в среду со всех сторон тампона на участке площадью 2 x 1 кв. см — формирование такой «площадки» является обязательным. Затем этим же тампоном засевают оставшуюся поверхность 1/2 чашки. Посев производят частыми неперекрывающимися штрихами, не отрывая тампон от поверхности питательной среды и не изменяя положения тампона.
Исследуют под микроскопом колонии,выросшие за 24 ч, Чашки с колониями, похожими на дифтерийные, отбирают для дальнейшей идентификации культуры по всем тестам. В случае роста «подозрительных» однотипных колоний, необходимо сразу же приступить к изучению их токсигенных свойств.
Через 24 часа, при появлении специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности, положительной пробе на цистиназу, изучаемую культуру идентифицируют как коринебактерий дифтерии токсигенные и выдают документированный ответ.
При отсутствии специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности, чашки инкубируют еще 24 часа.
Определяют токсигенность,бх свойства. При отсутствии специфических линий преципитации через 48 часов после постановки пробы на токсигенность, но при положительных результатах проб на цистиназу, глюкозу, отрицательных результатах проб на уреазу и сахарозу, культуру идентифицируют как коринебактерии дифтерии нетоксигенные, с указанием биохимического варианта.
Идентификация чистой культуры.Отличия возбудителей дифтерии от других коринебактерий(ложнодифтерийные палочки и дифтероидов)
Внутривидовая идентификация заключается в определении био- и серовара. Для ускоренного обнаружения дифтерийного токсина применяют: РНГА с антительным эритроцитарным диагностикумом, реакцию нейтрализации антител (о наличии токсина судят по эффекту предотвращения гемаггютинации); РИА и ИФА
Дифтерийная палочка не гидролизует мочевину и не образует индол. Отсутствие способности ферментировать палочку сахарозу и разлагать мочевину – дифференцирующий признак, отличающий дифтерийную палочку от других коринебактерий. Другой дифференцирующий признак – способность разлагать цистин.
Окраска по Найссеру позволяет выделить характерные зерна Бабеша-Эрнста и отличить дифтерийную палочку от ложнодифтерийной палочки. C .pseudodiphtheriticum
Отличия от дифтероидов: дифтероиды имеют большее количество волютиновых зерен, расположенных не полярно, а по всему телу; в мазках дифтероиды располагаются не под углом, а параллельными рядами — «частоколом».
Дифтерийный токсин,его свойства,действие на лабораторных животных и человека. Методы отпределения токсигенности дифтерийной палочки
Экзотоксин синтезируется лизогенными культурами в виде неактивного предшественника. Активация происходит под действием собственной протеазы, которая разрезает его на 2 пептида А и В. Пептид В выполняет акцепторную функцию, пепдит А реализует биологическую активность токсина.
ЖИВОТНЫЕ:Антитоксический и антимикробный. Напряженность антитоксического иммунитета ранее определялась в реакции Шика (внутрикожное введением дифтерийного токсина — 1/40 Dlm для морской свинки). При наличии иммунитета проба Шика отрицательная, при отсутствии — местная воспалительная реакция. В настоящее время для определения титра антитоксических антител используются РНГА и ИФА. Специфическая профилактика
ЧЕЛОВЕК:Активная иммунизация проводится вакциной АКДС или АДС (АДС-М) . Дифтерийный компонент — анатоксин. Вакцинация плановая в 3, 4 и 5 месяцев. Ревакцинации в 18 месяцев, в 6, 11 и 16 лет, а в последующем каждые 10 лет до 66 лет.
Определение токсигенности дифтерийной палочки in vitro. Способность к образованию токсина можно определять заражением куриных эмбрионов или культур клеток с регистрацией последующего цитопатнческого эффекта. Можно использовать твердофазный ИФА с использованием антитоксинов, меченных пероксидазой. Также предложены ПЦР и ДНК-зонды для обнаружения гена tox в бактериальной хромосоме.
Таксономическое положение микобактерий.Виды микобактерий:комплекс туберкулезных и нетуберкулезных палочек.Основные представители
источник
1. Краткая характеристика инфекций, основные системы.
2. Характеристика возбудителя:
2.1. Морфологические и тинкториальные свойства;
2.2. Культуральные свойства;
2.3. Биохимические свойства;
2.4. Токсические свойства;
2.5. Антигенные свойства;
2.6. Резистентность;
2.7. Патогенность для животных;
3. Патогенез и эпидемиология.
4. Иммунитет.
5. Лабораторная диагностика.
6. Специфическая профилактика и терапия.
1. Краткая характеристика инфекций, основные системы.
Дифтерия – острое инфекционное заболевание, вызываемое Corynebacterium diphtheriae и ее токсином. Бактерии вызывают воспаление воздухоносных путей, реже кожных покровов. Токсин приводит к дегенерации периферических нервов, сердечной мышцы и других тканей. Заболевание известно очень давно; еще сирийский врач историограф Аретей Каппадокийский (1 век до н.э.) охарактеризовал его как «злокачественные язвы на миндалинах, ведущие к удушению». Последнее настолько характерно, что в Испании дифтерию называли «гаратилью», то есть маленькая гаррота (устройство, применяемое для удушения преступников). Возбудитель – Corynebacterium diphtheriae; впервые его выделил Э.Клебс (1883), а чистую культуру возбудителя получил Ф.Лёффлер (1884).
2. Характеристика возбудителя.
2.1. Морфологические и тинкториальные свойства.
Дифтерийная палочка (палочка Клебса – Леффлера) представлена тонкими, слегка изогнутыми или прямыми палочками размером 1 – 12 × 0,3 – 0,8 мкм. Часто они утолщены на концах и напоминают булаву. Для дифтерийной палочки характерен выраженный полиморфизм. Наряду с типичными формами, можно обнаружить карликовые, кокковидные, толстые с колбовидным утолщением на концах, гигантские, клиновидные, нитевидные, ветвящиеся и другие формы. На поверхности бактерий имеются фимбрии, облегчающие адгезию к эпителию слизистой оболочки. У С . Diphtheriae выделяют три биовара – gravis, mitis и intermedius.
· Бактерии биовара gravis – короткие неправильной формы, с небольшим количеством метахроматических гранул.
· Биовар mitis образуют длинные изогнутые полиморфные палочки, содержащие много волютиновых зерен (тельца Бабеша-Эрнста).
· Бактерии биовара intermedius наиболее крупные, с бочковидными очертаниями; для них характерны поперечные перегородки, разделяющие клетку на несколько сегментов. В настоящее время биовар intermedius относят в группу gravis.
С. diphtheriae хорошо окрашивается основными анилиновыми красителями, грамположительна (окрашивание не всегда равномерно). Для окраски мазков обычно применяют щелочной метиленовый синий по Леффлеру либо окрашивают их по Найссеру. Бактерии способны образовывать L- и фильтрующиеся формы. В мазках С. diphtheriae располагаются в виде «растопыренных пальцев», «иероглифов», «паркета», латинских букв V, Y, L и т.д.
Рост на средах с теллуритом
Рост на бульоне
Гемолиз на кровяных средах
2.2. Культуральные свойства.
Дифтерийная палочка хорошо растет при 36-37ºС; оптимум рН 7,4-8,0. Питательные среды должны содержать аминокислоты, витамины, ионы металлов (Са2+ , Mg2+ , Fe2+ и др.), играющие роль ростовых факторов. На сывороточных средах (например, среде Леффлера) дают рост уже через 10-12 ч; за это время контаминирующая микрофлора обычно успевает развиться. Наибольшее распространение получили среды с теллуритом, так как возбудитель резистентен к высоким концентрациям теллурита калия или натрия, ингибирующим рост сопутствующей микрофлоры. На таких средах возбудитель образует серовато-черные колонии в результате восстановления теллурита до металлического теллура, аккумулирующегося внутри бактерий. В жидких средах образуют помутнение и осадок; их образование и характер варьируют у различных биоваров.
2.3. Биохимические свойства.
С. diphtheriae сбраживает с образованием кислоты глюкозу, мальтозу, галактозу, декстрин; не разлагает сахарозу, лактозу, манит. Способность разлагать крахмал и гликоген варьирует у различных штаммов, что используют для внутривидовой дифференцировки. Дифтерийная палочка не гидролизует мочевину и не образует индол. Отсутствие способности ферментировать палочку сахарозу и разлагать мочевину – дифференцирующий признак, отличающий дифтерийную палочку от других коринебактерий. Другой дифференцирующий признак – способность разлагать цистин. С. diphtheriae продуцирует каталозу, гиалуронидазу, нейромидазу, ДНК-азу и др. Дифтерийная палочка лизирует эритроциты морской свинки и кролика. Биовары возбудителя дифтерии существенно различаются по культуральным и биохимическим свойствам. Среди дифференциально-диагностических биохимических тестов наиболее часто учитывают различия в способности разлагать углеводы и мочевину.
Бактериоцины. Дифтерийная палочка образует бактериоцины (корицины), образующие узким спектром действия. Гены, кодирующие синтез бактериоцинов, передаются плазмидами. Бактериоцины образуют как токсические, так и нетоксические штаммы.
С. diphtheriae продуцирует мощный экзотоксин – основной фактор патогенности. Нетоксигенные штаммы не вызывают развития заболевания . В чистом виде токсин впервые получили Э.Ру и А.Иерсен (1888), что явилось решающим моментом для установления этиологической роли микроорганизма. Токсин проявляет все свойства экзотоксина (термолабильный, высокотоксичный, иммуногенный белок, нейтрализуемый антитоксической сывороткой). Нативный токсин – полипептид с Мr около 72000; его образуют фрагменты А (проявляет ферментативную активность) и В (взаимодействует с клеточными рецепторами, облегчая проникновения фрагмента А). клетки всех чувствительных организмов способны рецептировать В – фрагмент и поглощать молекулу посредством эндоцитоза. В кислой среде эндосом (фаголизосом) дисульфидные связи, объединяющие оба компонента, разрушаются фрагмент В взаимодействует с мембраной эндосомы, облегчая проникновение фрагмента А в цитоплазму. Последний устойчив к денатурации и длительно сохраняется в цитозоле. Механизм цитотоксического действия связан с модификацией белков через АТФ-рибозилирование. Подобным свойством обладают многие токсины, но лишь дифтерийный токсин и токсин А Pseudomonas aeruginosa имеют специфическую мишень – фактор элонгации 2 – трансферазу, ответственную за наращивание (элонгацию) полипептидной цепи на рибосоме.
Дифтерийный токсин катализирует перенос АТФ-рибозы от цитоплазматического никотинамиддинуклеотида (НАД) к фактору элонгации 2, приводя к АТФ-рибозилированию гистидиновых остатков в молекуле фактора с необратимым блокированием элонгации полипептидной цепи (то есть любого белкового синтеза). Немодифицированный фактор элонгации 2 образует комплекс с ГТФ и тРНК, связывающийся с мРНК в эукариотических клетках, после чего ингибирует белковый синтез, в том числе и в миокарде, приводя к структурным и функциональным нарушениям, способным вызвать смерть больного. Результат действия токсина на нервную ткань – демиелинизация нервных волокон, часто приводящая к параличам и парезам.
Способность к токсинообразованию проявляют лишь лизогенные штаммы Corynebacterium diphtheriae , инфицированные бактериофагом (β-фаг), несущим ген tox , кодирующий структуру токсина. Образование последнего наиболее выражено при вступлении бактериальной популяции в стадию отмирания. Переход умеренного фага в литическую форму мало влияет на синтез токсина.
Активность токсина. 1 ЕД Dlm дифтерийного токсина равна наименьшей концентрации, убивающей морскую свинку массой 250 г на 4-5-е сутки (около 0,25-0,1 мкл). Для получения анатоксина используют штамм PW-8 либо его варианты – «Массачусетс», «Торонто» и др.
У С. diphtheriae выделяют О- и К-Аг. Липидные и полисахаридные термолабильные фракции О-АГ коринебактерий преимущественно представлены межвидовыми Аг. Поверхностные термолабильные К-Аг (нуклеопротеиды, белки) обеспечивают видовую специфичность и проявляют выраженную иммуногенность. С помощью анти-К-сывороток дифтерийные бактерии разделяют на серологические варианты. Биовар mitis включает 40 сероваров, gravis – 14, intermedius – 4. в отечественной практике используют диагностические агглютинирующие, неадсорбированные сыворотки; в том числе полигрупповые и к сероварам для РА на стекле и в пробирках.
источник
Возбудитель дифтерии. Таксономия. Характеристика. Микробиологическая диагностика. Выявление антитоксического иммунитета. Специфическая профилактика и лечение
Дифтерия — острая инфекционная болезнь, характеризующаяся фибринозным воспалением в зеве, гортани, реже в других органах и явлениями интоксикации. Возбудителем ее является Corynebacterium diphtheriae.
Таксономия. Corynebacterium относится к отделу Firmicutes, роду Corynebacterium.
Морфологические и тинкториальные свойства. Возбудитель дифтерии характеризуется полиморфизмом: тонкие, слегка изогнутые палочки (наиб. распространенные) встречаются кокковидные и ветвящиеся формы. Бактерии нередко располагаются под углом друг к другу. Они не образуют спор, не имеют жгутиков, у многих штаммов выявляют микрокапсулу. Характерная особенность — наличие на концах палочки зерен волютина (обусловливает булавовидную форму). Возбудитель дифтерии по Граму окрашивается положительно.
Культуральные свойства. Факультативный анаэроб, оптим. температура. Микроб растет на специальных питательных средах, например на среде Клауберга (кровяно-теллуритовый агар), на которой дифтерийная палочка даёт колонии 3 типов: а) крупные, серые, с неровными краями, радиальной исчерченностью, напоминающие маргаритки; б) мелкие, черные, выпуклые, с ровными краями; в) похожие на первые и вторые.
В зависимости от культуральных и ферментативных свойств различают 3 биологических варианта C.diphtheriae: gravis, mitis и промежуточный intermedius.
Ферментативная активность. Высокая. Ферментируют глк и мальтозу в образованием кислоты, не разлагают сахарозу, лактозу и маннит. Не продуцируют уреазу и не образуют индол. Продуцирует фермент цистиназу, рпсщепляющую цистеин до H2S. Образует каталазу, сукцинатдегидрогеназу.
Антигенные свойства. О-антигены – термостабильные полисахаридные, расположены в глубине клеточной стенки. К-антигены – поверхностные, термолабильные, сероватоспецифические. С помошью сывороток к К-антигену С.diph. разделяют на серовары(58).
Факторы патогенности. Экзотоксин, нарушающий синтез белка и поражающий в связи с этим клетки миокарда, надпочечников, почек, нервных ганглиев. Способность вырабатывать экзотоксин обусловлена наличием в клетке профага, несущего tох-ген, ответственный за образование токсина. Ферменты агрессии — гиалуронидазу, нейраминидазу. К факторам патогенности относится также микрокапсула.
Резистентность. Устойчив к высушиванию, действию низких температур, поэтому в течение нескольких дней может сохраняться на предметах, в воде.
Эпидемиология. Источник дифтерии — больные люди Заражение происходит чаще через дыхательные пути. Основной путь передачи воздушно-капельный, возможен и контактный путь — через белье, посуду.
Патогенез. Входные ворота инфекции — слизистые оболочки зева, носа, дыхательных путей, глаз, половых органов, раневая поверхность. На месте входных ворот наблюдается фибринозное воспаление, образуется характерная пленка, которая с трудом отделяется от подлежащих тканей. Бактерии выделяют экзотоксин, попадающий в кровь, — развивается токсинемия. Токсин поражает миокард, почки, надпочечники, нервную систему.
Клиника. Существуют различные по локализации формы дифтерии: дифтерия зева, которая наблюдается в 85—90 % случаев, дифтерия носа, гортани, глаз, наружных половых органов, кожи, ран. Инкубационный период составляет от 2 до 10 дней. Заболевание начинается с повышения температуры тела, боли при глотании, появления пленки на миндалинах, увеличения лимфатических узлов. Отека гортани, развивается дифтерийный круп, который может привести к асфиксии и смерти. Другими тяжелыми осложнениями, которые также могут явиться причиной смерти, являются токсический миокардит, паралич дыхательных мышц.
Иммунитет. После заболевания — стойкий, напряженный антитоксичный иммунитет. Особое значение – образование АТ к фрагменту В. Они нейтрализуют дифтерийный гистотоксин, предупреждая прикрепление последнего к клетке. Антибактериальный иммунитет – ненажняженный, сероватоспецифичен
Микробиологическая диагностика. С помощью тампона у больного берут пленку и слизь из зева и носа. Для постановки предварительного диагноза возможно применение бактериоскопического метода. Основной метод диагностики — бактериологический: посев на среду Клаубера II (кровяно-теллуритовый агар), на плотную сывороточную среду для выявления продукции цистиназы, на среды Гисса, на среду для определения токсигенности возбудителя. Внутривидовая идентификация заключается в определении био- и серовара. Для ускоренного обнаружения дифтерийного токсина применяют: РНГА (реакция непрямой геммаглютинации) с антительным эритроцитарным диагностикумом, реакцию нейтрализации антител (о наличии токсина судят по эффекту предотвращения гемаггютинации); РИА (радиоиммунный) и ИФА(имунноферментный анализ).
Лечение. Основной метод терапии — немедленное введение специфической антитоксической противодифтерийной лошадиной жидкой сыворотки. Иммуноглобулин человека противодифтерийный для в/в введения.
Ассоциированные вакцины: АКДС (абсорбированная коклюшно – столбнячная вакцина), АДС (абсорбированный дифтерийно — столбнячный анатоксин).
Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:
источник
Наиболее характерные колонии на среде Клауберга II с добавлением теллурита калия или натрия (элективная среда для выращивания С. diphtheriae). Они вырастают в виде почти черных колоний, выделяющихся на красном фоне среды. Цвет колоний обусловлен способностью С. diphtheriae в процессе роста восстанавливать теллуристый калий до элементарного теллура.
Микробы дифтерии не являются однородными по своим культурально — биохимическим свойствам и подразделяются на биовары gravis, mitis и intermedius. На среде Клауберга II через 48 часов бактерии биовара gravis вырастают в виде круглых (d 1,5- 2 мм) колоний с неровными краями, часто имеют приподнятый центр и радиальную исчерченность. Колонии серовато-черного цвета, напоминают маргаритки. Вариант mitis дает круглые выпуклые колонии черного цвета (d 1- 1,5 мм) с ровными краями. Вариант intermedius занимает промежуточное положение. Дает черные выпуклые с блестящей поверхностью колонии.
К работе № 3
Дифференциация коринебактерий
С. Diphtheria дифференцируют от дифтероидов по морфологическим свойствам, ферментации углеводов, способности продуцировать цистиназу и уреазу, токсигенности и антигенным признакам.
Способность бактерий продуцировать токсин устанавливают в реакции преципитации в агаре. Для этого в чашку Петри с питательным агаром, содержащим 15-20% лошадиной сыворотки, 0,3% мальтозы и 0,03% цистина, помещают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой. Исследуемые культуры подсевают в виде перпендикулярных к бумажке штрихов на расстоянии 0,6-0,8 см. Посевы инкубируют при 37 0 С 24 часа. Если культуры токсигенны, то в месте соединения токсина с антитоксином в агаре образуется преципитат в виде белых линий.
Для определения цистиназы (проба Пизу) в столбик агара с цистином и ацетатом свинца уколом засевают исследуемую культуру. Посевы инкубируют при 37 0 С 24 часа. Истинные дифтерийные палочки вызывают почернение по ходу укола, вокруг которого появляется зона коричневого цвета. В результате расщепления цистина ферментом цистиназой выделяется свободная сера, которая вступает в реакцию с ацетатом свинца, образуя сульфид свинца черного цвета.
Для определения уреазы (проба Закса) используют среду с мочевиной и индикатором – феноловым красным. Исследуемую культуру петлей растирают по стенке пробирки со средой, инкубируют 20-30 мин при 37 0 С. Истинные дифтерийные палочки не имеют фермента уреазы, поэтому цвет среды не изменится. Другие коринебактерии выделяют уреазу, которая расщепляет мочевину, рН среды меняется, и среда приобретает красный цвет.
Проводится реакция агглютинации с агглютинирующей дифтерийной сывороткой.
К работе № 4
Серодиагностика дифтерии
Антитела к С. diphtheriae определяют в крови больных, начиная с первых дней болезни и повторно через 10-14 дней. Обязательным условием является определение специфических антител в динамике болезни в парных сыворотках. Диагностическое значение имеют результаты серологических исследований при нарастании титра антител не менее чем в 3-4 раза.
Для определения уровня дифтерийного антитоксина в сыворотке человека применяют несколько реакций:
РПГА — двухкомпонентная реакция, предполагающая взаимодействие диагностикума эритроцитарного дифтерийного антигенного (представляет собой эритроциты с адсорбированным на них дифтерийным анатоксином) и антитоксических противодифтерийных антител, находящихся в сыворотке крови обследуемых. При наличии в исследуемой сыворотке антитоксина образуется специфический комплекс: антитоксин + сенсибилизированные анатоксином эритроциты.В результате формируется осадок в виде агглютината эритроцитов.
В нашей странеРПГА рекомендована в качестве основного метода для определения напряженности антитоксического иммунитета к С. diphtheriae, а также для оценки вакцинального иммунитета.
Оценка состоянияколлективного иммунитета требует более детальной характеристики, чем только установление процента серонегативных людей. Для этого следует давать развернутыепо каждому титру данные в РНГА т.е. с учетом степени напряженности. Отсутствие антител является безусловным показателем незащищенности; титры 1:10 и 1:20 можно считать индикатором пограничного иммунитета, не обеспечивающего безусловной защиты; однако заболевание при этом, как правило, протекает в легкой форме без летального исхода. Титры 1:80 и выше являются показателем защищенности группы.
Таким образом, процентное распределение показателей титров в каждом разведении дает качественную характеристику состояния иммунитета к дифтерии в обследованной группе. Например, выявление у 50% обследованных показателей пограничного иммунитета (титры 1:10, 1:20) свидетельствует о слабой защищенности группы, в которой с годами будет увеличиваться число лиц, не защищенных от дифтерии.
В настоящее время приняты следующие количественные критерии, характеризующие степень восприимчивости к дифтерии в зависимости от уровней антитоксических антител.
| Содержание антитоксических антител | Интерпретация результатов |
| 1,0 МЕ/мл | уровень антитоксина, обеспечивающий стойкуюдлительную невосприимчивость к дифтерии |
ИФА предназначен дляколичественного определения антибактериальных и антитоксических иммуноглобулинов М, G человека в сыворотке крови больных дифтерией, бактерионосителей издоровых людей. Принцип ИФА основан на образовании специфического комплекса антиген-антитело, выявляемого с помощью второго антитела, меченного пероксидазой хрена. При последующем добавлении субстратной смеси развивается ферментативная реакция, регистрируемая по появлениюокрашенного продукта. Интенсивность реакции учитывается с помощью иммуноферментного анализатора или визуально.
3.Определение титра антител к дифтерийному токсину в сыворотке крови человека в реакции нейтрализации (РН) на культуре клеток.
Метод основан на том, что метаболическая активность и рост клеток культуры ингибируется дифтерийным токсином, который, в свою очередь, может быть нейтрализован антитоксином, содержащимся в сыворотке крови. Последовательное разведение сыворотки крови человека добавляют в лунки микропланшета, в которые затем вносят дифтерийный токсин в рабочей дозе и культуру клеток. Обнаружение по окончании инкубации (t 37 о С 5-6 суток) живых клеток культуры в лунках, содержащих определенные разведения сывороток, будет указывать на соответствующий титр антител к дифтерийному токсину в тестируемых сыворотках + проба на токсигенность.
К работе № 5
Опора деревянной одностоечной и способы укрепление угловых опор: Опоры ВЛ — конструкции, предназначенные для поддерживания проводов на необходимой высоте над землей, водой.
Папиллярные узоры пальцев рук — маркер спортивных способностей: дерматоглифические признаки формируются на 3-5 месяце беременности, не изменяются в течение жизни.
Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰).
Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим.
источник
ГБОУ ВПО “Уральский государственный медицинский университет” Министерства здравоохранения Российской Федерации Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии
Методические указания к практическим занятиям для студентов
ООП специальности 060301.65 Фармация Дисциплина С2.Б.11 Микробиология
1. Тема: Возбудитель дифтерии.
2. Цели занятия : Изучить со студентами свойства возбудителя дифтерии, факторы патогенности возбудителя и патогенез дифтерии, методы диагностики, профилактики и лечения дифтерии.
3.1. Изучение свойств возбудителя дифтерии.
3.2. Изучение патогенеза дифтерии.
3.3. Изучение методов диагностики, профилактики и лечения дифтерии.
3.4. Выполнение самостоятельной работы.
4. Продолжительность занятия в академических часах : 3 часа.
5. Контрольные вопросы по теме:
5.1. Морфологические, тинкториальные, культуральные и биохимические свойства возбудителя дифтерии.
5.2. Факторы патогенности возбудителя дифтерии и патогенез вызываемого заболевания.
5.3. Методы диагностики, профилактики и лечения дифтерии.
6. Задания и методические указания к их выполнению.
На занятии студенту необходимо:
6.1. Ответить на вопросы преподавателя.
6.2. Принять участие в обсуждении изучаемых вопросов.
6.3. Выполнить самостоятельную работу.
Теоретическая справка Дифтерия – острое инфекционное заболевание, характеризующееся общей
интоксикацией организма и образованием пленчатых налетов в месте внедрения возбудителя. Дифтерия относится к антропонозным инфекциям.
Возбудитель дифтерии – Corynebacterium diphtheriae — обнаружен впервые в 1883 г. Э. Клебсом в срезах пленок, взятых из зева больных. Получен в чистой культуре в 1884 г. Ф. Лёффлером.
В 1888 г. Э. Ру и А. Иерсен обнаружили способность дифтерийного микроба продуцировать экзотоксин.
В 1892 г. Э. Беринг получил антитоксическую противодифтерийную сыворотку. В последующем он совместно с Ш. Китазато использовал эту сыворотку для лечения больных дифтерией. Лечение с помощью сыворотки называется серотерапией. За внедрение в практику серотерапии при дифтерии Э. Беринг и Э. Ру
в 1901 г. были удостоены Нобелевской премии.
В 1923 г. Г. Рамон разработал метод получения дифтерийного анатоксина (токсоида). Анатоксин представляет собой препарат токсина, утратившего токсические свойства, но сохранившего иммуногенность. Анатоксин получают путем добавления к токсину 0,3-0,4% формалина и инкубирования смеси в течение месяца при 37-40ºС. В настоящее время анатоксин используется для вакцинации людей против дифтерии и для иммунизации животных при получении противодифтерийной сыворотки.
Классификация . Возбудитель дифтерии относится к отделу Firmicutes ,
семейству Corynebacteriaceae , роду Corynebacterium , виду C. diphtheriae . Название микроба происходит от греч. coryne — булава, bacteria — палочка, diphtheria — пленка.
Морфология . С. diphtheriae (палочка Клебса-Лёффлера) — прямые или слегка изогнутые неподвижные грамположительные палочки. Спор и капсул не образуют. Палочки утолщены на концах и напоминают булаву. В мазках бактерии располагаются под углом друг к другу, в виде “растопыренных пальцев”, “иероглифов”, “паркета”, латинских букв V, Y, L и др. На поверхности бактерий имеются фимбрии, облегчающие адгезию к эпителию слизистой оболочки.
При окраске препаратов метиленовым синим или по методу Нейссера на полюсах клеток обнаруживаются гранулы — зерна волютина (зерна Бабеша-Эрнста). По химической природе волютин представляет собой полифосфаты, он является запасом питательных веществ и энергии. При окраске по Граму зерна волютина не
выявляются. При окраске по методу Нейссера палочки окрашиваются в соломенножелтый цвет, а зерна волютина — в темно-коричневый цвет.
Культуральные свойства . Дифтерийная палочка является аэробом или факультативным анаэробом, температурный оптимум для роста 35-37°С, оптимальная рН 7,6-7,8. Лучше растет на средах, содержащих кровь или сыворотку крови животных, хорошо растет на средах с теллуритом калия. В бульоне наблюдается равномерное помутнение или нежная пленка.
Элективные среды для выращивания C. diphtheriae :
— свернутая кровяная сыворотка (среда Ру);
— сыворотка с добавлением сахарного бульона (среда Ру-Лёффлера);
— кровяной теллуритовый агар (среда Клауберга II);
— цистин-теллурит-сывороточная среда Тинсдаля-Садыковой. Биохимическая активность . Возбудитель дифтерии разлагает глюкозу,
мальтозу, галактозу с образованием кислоты без газа, но не ферментирует сахарозу. Возбудитель продуцирует цистиназу (положительная проба Пизу – почернение столбика сывороточного агара или образование коричневого облачка вокруг линии укола в результате образования сернистого свинца при взаимодействии с уксуснокислым свинцом сероводорода, образующегося при расщеплении цистина или цистеина цистиназой). Не образует уреазу (отрицательная проба Закса – цвет бульона с мочевиной и феноловым красным не изменяется). Не образует индола.
Биовары возбудителя . По культуральным и биохимическим свойствам возбудитель дифтерии подразделяется на биовары:
Биовары различаются между собой по форме колоний на средах с теллуритом, по характеру роста в жидких средах, по гемолитической активности, по ферментации углеводов и морфологии клеток.
Биовар gravis на плотных средах образует сухие серовато-черные плоские радиально исчерченные колонии размером 2-3 мм (R-форма, вид “маргаритки”). В жидких средах растет в виде пленки на поверхности и зернистого осадка, жидкость остается прозрачной. Не вызывает гемолиза. Ферментирует глюкозу, мальтозу, крахмал, гликоген. Палочки короткие, с небольшим количеством гранул.
Биовар mitis образует мелкие (1-2 мм) гладкие блестящие черные колонии с ровными краями (S-форма), в бульоне вызывает равномерное помутнение и порошкообразный осадок. Обладает гемолитической активностью, разлагает глюкозу и мальтозу. Палочки длинные, изогнутые, содержат много зерен волютина.
Биовар intermedius образует круглые гладкие блестящие (S-форма) или шероховатые колонии с изрезанными краями (RS-форма) диаметром менее 1 мм. Клетки самые крупные, с бочковидными очертаниями и внутриклеточными перегородками. Ферментируют глюкозу, мальтозу, гликоген.
Антигенная структура . C. diphtheriae содержит соматический термостабильный О-антиген липидно-полисахаридной природы (родовая специфичность) и поверхностный термолабильный К-антиген белковой природы
(обладает типовой специфичностью). По особенностям К-антигена выделяют 58 сероваров, в том числе у биовара gravis 14 сероваров, у биовара mitis – 40 сероваров, у биовара intermedius – 4 серовара.
Факторы патогенности возбудителя дифтерии:
1. Поверхностные структуры способствуют адгезии микроорганизмов в месте входных ворот инфекции и препятствуют фагоцитозу:
— корд-фактор липидной природы; — микрокапсула, содержащая миколовые кислоты.
2. Ферменты агрессии и инвазии :
— нейраминидаза – расщепляет нейраминовую кислоту слизи;
— гиалуронидазу — разрушает гиалуроновую кислоту. 3. Токсины :
— гемолизин – разрушает эритроциты крови;
— дермонекротоксин – вызывает некроз клеток в месте локализации возбудителя;
— дифтерийный экзотоксин (гистотоксин) – основной фактор патогенности дифтерийного микроба. Он является одним из наиболее сильных биологических ядов. Представляет собой термолабильный полипептид — разрушается при 56-60ºС в течение 1-2 часов, при 80ºС — в течение нескольких минут. Инактивация токсина происходит под влиянием прямого солнечного света, УФ лучей (в течение 1-2 часов), кислорода воздуха.
Токсин состоит из двух фрагментов — А и В. Фрагмент В обеспечивает адсорбцию и проникновение фрагмента А в клетку. Дифтерию вызывают только токсигенные штаммы, которые несут в своем геноме гены умеренного бактериофага. Таким образом, способность к образованию токсина проявляется только у лизогенных штаммов, то есть у клеток, содержащих в своем геноме умеренный профаг (бета-фаг), несущий tox-гены. Утрата клеткой профага делает клетку мало токсигенной. Напротив, лизогенизация нетоксигенных С. diphtheriae конвертирующим фагом превращает их в токсигенные бактерии. Конверсия нетоксигенного штамма в токсигенный может происходить как in vivo, так и in vitro.
Резистентность . В пыли возбудитель сохраняет жизнеспособность и вирулентность в течение 5 недель, на различных предметах – до 5,5 месяцев, на посуде и игрушках – до 15 дней, в воде и молоке – в течение 6-20 дней. При 60ºС погибает в течение 10 минут, при кипячении — через 1 минуту. Чувствительный к дезинфицирующим веществам.
Возбудитель дифтерии хорошо переносит высушивание и долго сохраняется
в высохшей слизи, слюне, в частичках пыли. В высушенных пленках выдерживает температуру 98°С в течение 1 часа, а при комнатной температуре может сохраняться до 7 месяцев.
Для обнаружения токсигенных дифтерийных бактерий используют метод преципитации в геле (метод иммунодиффузии Илека) . Полоску стерильной фильтровальной бумаги смачивают антитоксической противодифтерийной сывороткой и наносят на поверхность плотной питательной среды в чашке Петри. Чашку подсушивают в термостате 15-20 минут. Испытуемые культуры засевают бляшками по обе стороны от полоски фильтровальной бумаги. Чашки с посевами инкубируют при 37°С, результаты учитывают через 24-48 часов. Результатом
взаимодействия токсина и антитоксина является образование в геле четкой линии преципитации.
Эпидемиология . В естественных условиях восприимчив к дифтерии только человек. Источник инфекции – больной человек или бактерионоситель. Больные заразны с появления первых признаков болезни до периода реконвалесценции. Особенно опасны больные стертыми, атипичными формами и бактерионосители. Пик заболеваемости приходит на осенне-зимний период . Заражение происходит
воздушно-капельным , воздушно-пылевым путем , контактно-бытовой (через различные предметы, бывшие в употреблении у больных или бактерионосителей: посуда, книги, белье, игрушки и т. п.). В случае инфицирования пищевых продуктов (в основном, молочные продукты) возможно заражение алиментарным путем . Чаще болеют дети младшего возраста. Однако заболевание встречается у подростков и взрослых.
Патогенез . Входные ворота — слизистые оболочки верхних дыхательных путей (миндалины, зев, носоглотка, гортань, трахея), реже – конъюнктива глаз, кожа, слизистая половых органов. В месте входных ворот происходит адгезия
возбудителя, его размножение и продуцирование дифтерийного токсина . В
результате этого наблюдается некроз эпителия , выход фибриногена из сосудистого русла, превращение фибриногена в фибрин и образование фибринозной пленки . Пленка представляет собой скопление нитей фибрина, некротизированных клеток эпителия, эритроцитов, лейкоцитов, бактерий. В полости рта, зеве, глотке, где слизистая выстлана многослойным эпителием, образуется дифтеритическая пленка , плотно соединенная с подлежащей тканью. На слизистой дыхательных путей, покрытых однослойным эпителием, возникает крупозная пленка , рыхло связанная с подлежащей тканью.
Экзотоксин оказывает не только местное, но и общее действие. Развивается токсинемия . При этом поражаются различные органы, но в наибольшей степени страдают сердечная мышца, нервная ткань, надпочечники и почки (в этих тканях происходит дегенерация паренхимы, жировая инфильтрация, некроз, иногда возникают обширные кровоизлияния).
Клиника. Инкубационный период — 2-10 дней (в среднем 5-7 дней).
Различают следующие периоды болезни :
— период манифестных проявлений и ранних токсических осложнений (5-10
— период поздних токсических осложнений (до 6 недель);
— период реконвалесценции (2-3 месяца).
— распространенные токсические формы;
В зависимости от локализации входных ворот различают дифтерию зева, носа, гортани, трахеи, глаза, уха, половых органов, кожи. При локализации процесса в зеве увеличиваются региональные (шейные) лимфатические узлы, в области шеи развивается выраженный отек (“бычья шея”).
Иммунитет . После переболевания формируется пожизненный напряженный антибактериальный и антитоксический иммунитет. Повторное заболевание возможно в 5-6% случаев.
Материал для исследования — слизь из зева и носа, пленка с входных ворот инфекции.
1. Бактериоскопия при окраске по Граму и по Нейссеру (используется
2. Бактериологический метод :
— посев на элективные среды;
— выделение чистой культуры на скошенном сывороточном агаре.
— укороченный пестрый ряд (глюкоза, мальтоза, сахароза, мочевина);
— способность к росту в анаэробных условиях в столбике 0,5% сахарного агара (растет только дифтерийный микроб).
4. Проверка культуры на токсигенность (реакция иммунодиффузии).
5. Серологические методы при дифтерии являются методами ретроспективной диагностики, поэтому они имеют вспомогательное значение. В настоящее время для оценки напряженности антитоксического иммунитета используют РНГА .
Окончательный ответ по токсигенным бактериям выдается через 48-72 часа. Окончательный ответ по биохимическим свойствам нетоксигенных бактерий выдается через 79-96 часов.
Лечение проводится в стационаре. Специфическим средством лечения дифтерии является внутримышечное введение противодифтерийной
антитоксической лошадиной сыворотки (антитоксина) , применение
антибиотиков (пенициллины, тетрациклины, эритромицин и др.) и сульфаниламидных препаратов. Проводят также детоксикационную терапию.
Сыворотку следует вводить как можно раньше. Введение сыворотки после третьего дня считается поздним. Сыворотку вводят дробно по методу Безредки для профилактики анафилактического шока.
Специфическая профилактика . Для специфической профилактики дифтерии используют препараты, содержащие дифтерийный анатоксин:
— адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина (АКДС-
— адсорбированный дифтерийно-столбнячный анатоксин (АДС-анатоксин);
— адсорбированный дифтерийно-столбнячный анатоксин с уменьшенным содержанием антигенов (АДС-М-анатоксин):
— адсорбированный дифтерийный анатоксин с уменьшенным содержанием антигена (АД-М-анатоксин).
Компоненты адсорбированы на гидроокиси алюминия.
Первая вакцинация проводится в 3 месяца, вторая в 4,5 месяца, третья – в 6 месяцев, ревакцинация – в 18 месяцев, 6 и 14 лет.
После обсуждения теоретических вопросов преподаватель объясняет порядок проведения самостоятельной работы.
1. Приготовить два препарата из чистых культур дифтероидов, окрасить один из них щелочным метиленовым синим по Леффлеру в течение 3-5 минут, а второй – по Граму. Препараты промикроскопировать, результаты зарисовать в рабочей тетради.
2. Зарисовать в рабочей тетради схему лабораторной диагностики дифтерии.
7. Оценивание знаний, умений, навыков по теме занятия:
Ответы на вопросы и активность на занятии оцениваются по 5-балльной системе.
8. Литература для подготовки темы:
1. Галынкин В., Заикина Н., Кочеровец В. Основы фармацевтической микробиологии. 2008.
2. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник для студентов медицинских вузов. Под ред. А.А. Воробьева. Учебники и учеб. пособия для высшей школы. Издательство: Медицинское информационное агентство, 2012. – 702 с.
3. Микробиология: учеб. для студентов учреждений высш. проф. образования, обучающихся по специальности 060301.65 “Фармация” / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. – 608 с.: ил.
4. Одегова Т.Ф., Олешко Г.И., Новикова В.В. Микробиология. Учебник для фармацевтических вузов и факультетов. — Пермь, 2009. — 378 с.
1. Коротяев А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: Учебник для студентов мед. вузов / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. — 5-е изд., испр. и
доп. – СПб.: СпецЛит, 2012. – 759 с.: ил.
2. Медицинская микробиология: учебник. 4-е изд. Поздеев О.К. / Под ред. В.И. Покровского. – 2010. – 768 с.
3. Руководство по медицинской микробиологии. Общая и санитарная микробиология. Книга 1 / Колл. авторов // Под редакцией Лабинской А.С., Волиной Е.Г. – М.: Издательство БИНОМ, 2008. – 1080 с.: ил.
Методические указания переработаны и дополнены профессором Литусовым Н.В.
Обсуждены на заседании кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии.
источник
В микробиологии при изучении возбудителя дифтерии рассматриваются тинкториальные, морфологические, культуральные, биохимические и антигенные свойства токсигенных штаммов.
Чаще всего развитие патологии наблюдается у людей с отсутствием антитоксического иммунитета. К сожалению, полная ликвидация инфекции невозможна, так как заразиться можно не только от тех, кто уже заболел, но и от носителей бактерии.
Дифтерия — это острое инфекционное заболевание, вызываемое токсигенными штаммами Corynebacterium diphtheriae.
Путь передачи возбудителя инфекции – воздушно-капельный. Болезнь характеризуется местным фибринозным воспалением преимущественно рото- и носоглотки, а также явлениями общей интоксикации и поражением сердечно-сосудистой, нервной и выделительной систем.
Возбудителем дифтерии является Corynebacterium diphtheriae, который впервые был описан Klebs в 1883 г. Позднее, в 1884 г., Loeffler выделил чистую культуру коринебактерий дифтерии.
Род Corynebacterium (класс Actinobacteria, порядок Actinomycetales) — гетерогенная группа коринеформных бактерий, включающая в себя 67 видов коринебактерий. Содержание G + С пар в ДНК коринебактерий — от 40 до 67 ммоль%.
Клеточная стенка коринебактерий содержит мезодиаминопимелиновую кислоту, короткоцепочечные миколовые кислоты с 22-36 атомами углерода, арабинозу, галактозу, жирные кислоты, основными из которых являются пальмитиновая, стеариновая и олеиновая.
Значительное количество видов коринебактерий, преимущественно обитающих на слизистых оболочках или кожных покровах млекопитающих, часто встречается и во внешней среде. Некоторые виды продуцируют экзотоксин и являются патогенными для человека и животных.
Типовым является вид Corynebacterium diphtheriae, который неоднороден по своим морфологическим, культуральным, биохимическим и антигенным свойствам и в соответствии с этим разделен на биотипы (gravis, mitis, intermedium, mitis, var. belfanti).
Штаммы С. diphtheriae, независимо от их принадлежности к тому или иному биотипу, могут быть токсигенными, т. е. способными продуцировать дифтерийный экзотоксин, или нетоксигенными.
Возбудителем дифтерии являются только токсигенные штаммы С. diphtheriae. В микробиологии достаточно хорошо изучены все их свойства – тинкториальные, морфологические, культуральные, биохимические и антигенные.
Тинкториальные свойства бактерий – это свойства, характеризующие их способность вступать в реакцию с красителями и окрашиваться определенным образом.
С. diphtheriae — прямые или слегка изогнутые тонкие грамположительные неподвижные, неспорообразующие, полиморфные палочки с заостренными или булавовидными концами, размером 0,3-0,8 х 1,5-8,0 мкм.
Внутри клеток расположены зерна волютина, представляющие собой метахроматиновые гранулы полиметафосфата. Зерна волютина у С. diphtheriae располагаются в булавовидных утолщениях на одном или обоих концах, реже — в середине.
Другие виды коринебактерий также могут содержать зерна волютина с разнообразным расположением. Частота обнаружения волютиновых гранул зависит от культурального варианта, физиологического состояния клетки и содержания фосфатов в среде.
Зерна выявляют путем окрашивания препаратов щелочным метиленовым синим по Леффлеру. Гранулы полиметафосфата воспринимают краситель более интенсивно, чем цитоплазма клетки, обусловливая метахромазию, присущую коринебактериям дифтерии.
Зерна волютина обнаруживают также при использовании окраски по Нейссеру и люминесцентной микроскопии.
В мазках коринебактерии дифтерии располагаются под углом, напоминая латинские буквы L, X, V, Y или растопыренные пальцы рук. В мазках, приготовленных из материала, взятого из зева, носа, отделяемого ран, С. diphtheriae могут иметь войлокообразный характер.
Полиморфизм дифтерийных бактерий обусловлен прежде всего несбалансированным синтезом муреина, формирующего клеточную стенку, при культивировании на питательных средах с большим количеством сывороточных белков. В среде с оптимальным содержанием ингредиентов, отвечающим физиолого-химическим потребностям, они имеют однородную форму.
На морфологические свойства дифтерийных палочек влияет возраст культуры, содержание в среде фосфатов, глицерина, железа. В результате действия этих факторов прекращается деление клеток, могут появляться «гигантские» клетки.
Такое расположение более характерно для дифтерийных палочек, тогда как другие виды коринебактерий, являющиеся представителями нормальной микрофлоры, чаще располагаются в микропрепаратах в виде «частокола» из нескольких параллельно лежащих клеток.
К такому угловому и полисадному расположению клеток приводит «щелкающее» (snapping) деление. При окраске по Граму клетки С. diphtheriae окрашиваются положительно, но иногда и отрицательно, что связывают с их чрезмерным обесцвечением спиртом.
Возбудитель дифтерии и другие представители рода Corynebacterium относятся к аэробам, факультативным и облигатным анаэробам. Они являются хемогетеротрофами, каталазоположительны, углеводный метаболизм смешанный — дыхательный и бродильный.
С. diphtheriae требовательны к условиям культивирования, хорошо растут при + 37 °С (pH 7,4-8,0) на питательных средах, обогащенных аминокислотами, пуриновыми и пиримидиновыми основаниями, с добавлением лошадиной (или бычьей) сыворотки или гемолизированной крови.
Для культивирования дифтерийных бактерий используют кровяной (5-10%) агар, сывороточный (10-15%) агар, свернутую сыворотку Леффлера или Ру, селективные среды с добавлением теллурита калия (кровяно-теллуритовый агар — КТА), среды Клауберга II и Тинсдейла—Садыковой), коринебакагар, допускается использование хинозольной среды Бучина.
На плотных питательных средах коринебактерии дифтерии образуют различные типы колоний: С. diphtheriae gravis растет преимущественно в R-форме, образуя колонии диаметром 1,5-2,0 мм, через 48 ч — с радиальной исчерченностью и неровными краями, напоминающие цветок маргаритки.
Для С. diphtheriae mitis более характерна S-форма колоний (диаметр 0,5-1,0 мм, с ровными краями, выпуклой гладкой, поверхностью). С. diphtheriae intermedius образуют мелкие, слегка конусообразные, округлые колонии диаметром 0,5-1,0 мм. Культуральные свойства вида С. diphtheriae mitis var. belfanti, как и С. diphtheriae intermedius, сходны с биоваром mitis.
При выделении С. diphtheriae из клинического материала для ингибирования роста сопутствующей микрофлоры в основном используют среды, содержащие теллурит калия.
Подавляющее большинство штаммов возбудителя дифтерии резистентно к относительно высоким концентрациям теллурита калия, способно за счет продукции теллуритредуктазы восстанавливать теллурит калия до металлического теллура и накапливать его внутри клеток, что придает дифтерийным колониям серо-черную или черную окраску.
Наиболее четко все биотипы С. diphtheriae выявляются на среде КТА и коринебакагаре.
На жидких питательных средах R-формы коринебактерий дифтерии (биотип gravis) растут, образуя пленку на поверхности или крошкообразный осадок, S-формы (биотип mitis)дают равномерное помутнение и мелкозернистый осадок.
Коринебактерии дифтерии обладают невысокой ферментативной активностью.
Важнейшим дифференциальным биохимическим свойством С. diphtheriae является наличие фермента цистиназы, который выявляют на питательной среде Пизу (сывороточный агар, содержащий цистин и уксуснокислый свинец).
Положительная цистиназная активность проявляется потемнением среды в виде «облачка» по ходу укола.
С. diphtheriae не обладают уреазной активностью, что позволяет дифференцировать их от других коринебактерий, имеющих цистиназу. Все биотипы С. diphtheriae ферментируют глюкозу и мальтозу и не разлагают сахарозу.
Способность разлагать крахмал присуща только биотипу gravis. Тест на редукцию нитратов положителен для всех биотипов С. diphtheriae, за исключением С. diphtheriae mitis var. belfanti.
С. diphtheriae неоднородны по антигенной структуре: у них выделяют О- и К-антигены. О-антигены расположены в глубине клеточной стенки и представлены межвидовыми и видовыми термостабильными липидными и полисахаридными фракциями.
К-антигены термолабильны, имеют белковую природу, расположены на поверхности бактерий и обусловливают типоспецифические свойства коринебактерий. Термостабильные компоненты обладают групповой (межвидовой) специфичностью.
За групповую специфичность ответственны, в частности, полисахариды и поверхностные липиды. Термолабильные антигены содержат белковую и небелковую фракции, характеризуются узкой внутривидовой (типовой) специфичностью.
Токсигенные штаммы С. diphtheriae более однородны в антигенном отношении и содержат больший набор антигенов, чем нетоксигенные. Для нетоксигенных штаммов характерна значительная вариабельность антигенных детерминант и менее выраженная иммуногенность.
Обнаружение поверхностных антигенов коринебактерий для их серотипирования проводят в реакции агглютинации. Недостатком серотипирования является способность многих штаммов, особенно нетоксигенных, к спонтанной агглютинации или полиагглютинабельности.
Антибактериальной активностью в отношении С. diphtheriae обладают различные препараты: рифампицин, эритромицин, пенициллин, кларитромицин, азитромицин, тетрациклины.
В последнее время наблюдается выраженная тенденция к увеличению показателей минимальной подавляющей концентрации (МПК) к большинству этих препаратов.
Устойчивость к рифампицину, пенициллину и эритромицину более выражена среди штаммов С. diphtheriae mitis, чем С. diphtheriae gravis.
Формирование устойчивости к антибактериальным препаратам у возбудителя дифтерии детерминировано плазмидами, транспозонами и, возможно, мутациями хромосомных генов.
Коринебактерии дифтерии характеризуются широким спектром факторов патогенности. На поверхности С. diphtheriae имеется микрокапсула, которая прочно связана с остальными слоями клеточной стенки и выявляется не только у неповрежденных, но и у частично лизированных клеток.
Клеточная стенка коринебактерий дифтерии многослойна (до 9 слоев), толщина ее намного превышает таковую как у грамположительных, так и у грамотрицательных микроорганизмов.
Дифтерийные бактерии содержат на своей поверхности термолабильные типоспецифические протеины и термостабильные антигены, представляющие собой полисахариды или полисахаридные комплексы.
Е.Н. Holdsworth впервые выделил изолированные клеточные стенки С. diphtheriae (штамм PW-8), провел их химический анализ и установил, что клеточные стенки содержат вещество пептидополисахаридной природы, в состав которого входят галактоза, манноза, арабиноза.
L. BarKsdale предложил разделить основные химические компоненты, выделенные из клеточных стенок С. diphtheriae, на следующие группы: пептидополисахариды, полисахариды (ПС), белки и пептиды.
Специфические антигены, ответственные за серотиповые индикаторные реакции, расположены на поверхности клетки вместе с трегалозомиколатами. Антигены, общие для вида С. diphtheriae, микобактерий и нокардий, ответственные за перекрестные реакции в РА, находятся в глубинных слоях клеточной стенки и представлены пептидогликаном, ПС, белками и липидами.
Поверхностные структуры дифтерийных бактерий, играющие роль возможных факторов колонизации, имеют внутривидовые отличия. Штаммы биотипов gravis и mitis имеют различные по специфичности поверхностные антигены, а в пределах этих биотипов, в свою очередь, выделяют ряд серотипов.
Формированием колонизационной резистентности у населения к одной антигенной разновидности и отсутствием иммунитета к другому сероварианту можно объяснить смену био- и серотипов в течение эпидемического процесса.
Каждому новому подъему заболеваемости предшествует подъем носительства, связанный с появлением нового антигенного варианта, к которому у населения нет колонизационной резистентности.
Основным фактором вирулентности дифтерийного микроба является дифтерийный токсин (ДТ).
По мнению V. Johnson, клеточные рецепторы организма к ДТ имеют лишь относительную специфичность и могут связывать также и лектины, адениннуклеотиды, аденозинфосфаты и др.
При связывании подобных веществ с клеточными рецепторами возникает феномен конкурентного блокирования, в результате чего клеточные рецепторы утрачивают способность связывать ДТ, а клетки приобретают резистентность к цитотоксическому действию яда.
Рецепторы к ДТ имеются на клетках человека, обезьян, кроликов, морских свинок.
По результатам исследований, основная масса ДТ фиксируется клетками, имеющими соответствующие рецепторы. Динамика процессов связывания дифтерийного токсина с рецепторами клеток протекает в две стадии.
- Первая, обратимая стадия, длительностью около 30 мин, состоит в создании непрочной связи дифтерийного токсина с рецепторами клеток. При этом клетка полностью сохраняет жизнеспособность, а токсин, фиксированный на поверхности цитоплазматической мембраны, легко нейтрализуется антитоксическими антителами.
- Вторая стадия — необратимая — завершается в течение последующих 30-60 мин. В этот период структура и функция клеток еще не претерпевают каких-либо изменений, но добавление антитоксической сыворотки уже не предохраняет клетки от цитопатогенного действия ДТ и последующей их гибели.
Основным механизмом трансмембранного транспорта ДТ в клетки является адсорбционный эндоцитоз. В-фрагмент взаимодействует с клеточными рецепторами, в результате чего формируются трансмембранные каналы, по которым A-фрагмент перемещается в цитозоль.
Цитопатогенное действие ДТ возникает при фиксации на цитолемме не менее 250 молекул ДТ. Проникновение ДТ в клетку влечет за собой нарушение белковых синтезов, приводящих к ее гибели.
В основе ингибиции синтеза лежит блокада A-фрагментом фактора элонгации EF-2, что вызывает нарушение процессов трансляции с мРНК в рибосомах.
Антитоксические антитела, секретируемые в ответ на введение ДТ, функционально неоднородны и могут быть направлены как против А-, так и против В-фрагмента ДТ.
Основным механизмом детоксикации является взаимодействие ДТ с антителами, направленными против детерминант В-фрагмента, особенно его С-конца, способными препятствовать присоединению ДТ к мембранам клеток.
Считают, что антитоксические антитела нейтрализуют ДТ не в крови или межтканевой жидкости, а на поверхности клеток, т. к. скорость нейтрализации антителами низкомолекулярных структур выше при фиксации антигена на структуре большей массы, каковой является клетка.
В крови ДТ циркулирует в свободном состоянии или в составе циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). При локализованной форме ДТ легко выходит в кровеносное русло, и его молекулы, подвергаясь быстрой инактивации, элиминируются из организма.
Инактивация ДТ происходит путем образования ЦИК малой величины, более доступных для инактивации и легко элиминируемых из организма.
При токсической форме дифтерии из-за лимфостаза ДТ концентрируется в лимфе, разносится ею и фиксируется в тканях и органах-мишенях, в кровь выходит небольшое количество ДТ.
Образующиеся при токсической форме ЦИК имеют достоверно большие размеры и плохо доступны для инактивации.
Механизм повреждающего действия дифтерийного токсина (ДТ) на органы-мишени осуществляется двояко. С одной стороны, он раздражает нервные чувствительные рецепторы слизистых оболочек и внутренних органов.
С другой, ДТ оказывает цитопатогенное действие, фиксируясь в тканях органов-мишеней — сердца, почек, надпочечников, нервной ткани, реже — легких, печени, пищевода, желудка, кишечника и поджелудочной железы.
Поражение сердечно-сосудистой системы во многом определяет тяжесть течения и исходы дифтерии. Частота выявления патологии миокарда при дифтерии, по данным разных авторов, колеблется от 3,2 до 65 %.
Большинство авторов связывают поражение сердца при тяжелых формах дифтерии с развитием миокардита. ДТ нарушает энергообеспечение мембранных механизмов переноса ионов (К, Na) и оказывает повреждающее действие на систему тканевого дыхания, нейтрализуя никотинамиддинуклеотид (НАД), в результате чего развивается тканевая гипоксия при угнетении синтетических и иммунных процессов.
Помимо этого, ДТ оказывает рефлекторное воздействие на тонус блуждающего нерва, что приводит к нарушению экстракардиальной нервной регуляции миокарда.
Поражение нервной системы, особенно ее периферического и вегетативного отделов, является причиной значительных расстройств, возникающих в организме больных дифтерией.
Эти изменения в основном представлены дегенерацией нервных волокон, миелиновых оболочек, фрагментацией осевых цилиндров. В основе развития дифтерийных полинейропатий лежат процессы демиелинизации, обусловленные как прямым воздействием ДТ на синтез миелина в олигодендроцитах, так и изменением под его влиянием нейроиммунных связей.
При развитии дифтерийных полинейропатий быстрее вовлекаются те нервы, которые анатомически находятся ближе к очагу инфекции или лимфатическим сосудам. Поражение центральной нервной системы (ЦНС) менее характерно для дифтерии.
Имеет место полнокровие оболочек, картина отека и набухания вещества головного мозга, парезы, свисание мягкого нёба, изредка наблюдаются очаговые кровоизлияния.
Тяжелые поражения надпочечников характерны прежде всего для случаев токсической дифтерии. Результат действия дифтерийного токсина проявляется в формировании кровоизлияний в ткань надпочечников, капсулу и прилегающую клетчатку.
Встречаются случаи массивных кровоизлияний в оба надпочечника с полным разрушением коркового и мозгового слоев, приводящие к смерти от острой надпочечниковой недостаточности.
Местный воспалительный дифтерийный процесс из места первичной локализации может распространяться по дыхательным путям вплоть до легких.
В легких при микроскопическом исследовании диагностируется фибринозно-геморрагическая пневмония, а при бактериологическом исследовании возможен высев токсигенной дифтерийной палочки из легочной ткани.
Однако такой характер процесс принимает редко. В подавляющем большинстве случаев развивается очаговая бронхопневмония и отек легких. Дифтерия гортани (круп) чаще возникает как следствие распространения дифтеритического воспаления со слизистой оболочки носа или глотки на гортань.
Поражение почек при дифтерии протекает по типу инфекционно-токсического нефроза, который возникает в остром периоде на высоте интоксикации и характеризуется появлением в моче белка, гиалиновых цилиндров, лейкоцитов, эритроцитов.
В возникновении поражений почек при дифтерии определенную роль играют ЦИК. У больных с высоким уровнем ЦИК поражения почек более выражены и сохраняются более длительно, чем у больных с низким содержанием ЦИК.
Под действием ДТ могут возникать и поражения печени, однако выраженность их незначительна. Преобладают дистрофические изменения гепатоцитов, иногда встречаются и немногочисленные очажки их некроза .
Другие органы пищеварения и отделы пищеварительного тракта (поджелудочная железа, пищевод, желудок, кишечник) поражаются не часто.
Помимо продукции ДТ, С. diphtheriae обладает факторами патогенности, обеспечивающими способность к колонизации. Основными из них являются: пили, ферменты (гиалуронидаза, нейраминидаза, амилаза, протеазы, ДНКаза), поверхностно расположенный гликолипид корд-фактор и др., патогенетическое значение которых пока недостаточно изучено.
На поверхности С. diphtheriae экспрессированы пили, представляющие собой длинные, тонкие, похожие на нити органоиды белковой природы. Эти структуры играют ведущую роль в начальной стадии развития инфекционного процесса — колонизации слизистых оболочек — и могут быть использованы как потенциальные компоненты вакцин.
ДНКаза возбудителя обнаружена у токсигенных и нетоксигенных штаммов коринебактерий, ее роль в патогенезе дифтерии пока неясна.
Корд-фактор содержит гликолипид, в состав которого входит коринемиколеновая оксикислота. Корд-фактор расположен на поверхности клеточных стенок вместе со специфическими белками наружней мембраны.
Он способствует устойчивости к фагоцитозу, т. к. препятствует слиянию фагосом, содержащих бактерии, с лизосомами, имеющими губительные для микроорганизмов протеолитические ферменты, и ингибирует образование каталазы и супероксиддисмутазы.
С. diphtheriae способны продуцировать бактериоцины (корицины), способствующие подавлению жизнедеятельности нормальной микрофлоры организма.
Немаловажное значение в повышении проницаемости клеточных барьеров имеет также внедрение в зону инокуляции возбудителя дифтерии кокков, продукты жизнедеятельности которых способствуют более массивной диффузии токсических веществ.
Взаимосвязанное действие всех факторов патогенности дифтерийного микроорганизма обусловливает развитие дифтерийной инфекции в организме.
Начальным этапом развития дифтерийной инфекции является адгезия возбудителя на эпителиальных клетках.
Процесс адгезии коринебактерий дифтерии проходит три стадии, обусловленные электростатической силой клеток, гидрофобной активностью клеточных мембран и лиганд-рецептор-опосредованной связью.
Только лиганд-рецепторное взаимодействие коринебактерий дифтерии с клетками хозяина является высокоспецифичным. Рецепторами адгезинов коринебактерий дифтерии считают соединения липидно-белковой природы, не содержащие маннозу.
Адгезия играет роль пускового Механизма в развитии колонизации возбудителем слизистых оболочек, продукции токсина и последующем его воздействии на органы и системы организма.
В процессе адгезии С. diphtheriae участвуют поверхностные структуры микробной клетки и, в частности, пили, роль которых до конца пока не изучена.
Колонизация С. diphtheriae слизистой оболочки — многофакторный процесс, включающий прежде всего осуществление конкурентных взаимоотношений возбудителя с представителями нормальной микрофлоры.
Подавление барьерной функции нормальной микрофлоры возбудителем дифтерии происходит за счет его способности синтезировать фермент каталазу, разлагающий перекиси, продуцируемые микроорганизмами, и бактериоцины (корицины), что создает селективные преимущества возбудителю дифтерии перед индигенной микрофлорой хозяина в месте внедрения.
Важную роль в процессе подавления местного иммунитета играет корд-фактор, ДТ, а также ферменты — протеазы и каталаза, разрушающие секреторный IgA и его изотип IgA, и угнетающие процессы фагоцитоза.
Разжижение слизи на эпителии верхних дыхательных путей (ВДП), нарушение функции реснитчатого эпителия происходит под воздействием ДТ, нейраминидазы и гиалуронидазы. По-видимому, в дальнейшем процесс колонизации сопровождается формированием биопленки возбудителем дифтерии.
Дальнейшее развитие инфекционного процесса может быть различным и зависит от ряда условий. Развитие классической клинической картины дифтерии чаще наблюдается у лиц с отсутствием антитоксического иммунитета.
К формированию бактерионосительства токсигенных С. diphtheriae предрасполагает наличие антитоксических антител. Высокой адгезивной активностью обладают штаммы С. diphtheriae, выделенные от носителей и больных токсической формой дифтерии.
У штаммов, обусловивших развитие локализованных форм заболевания, определяются низкие показатели адгезивной активности.
ДТ, продуцируемый возбудителем, поступает непосредственно в лимфатическую систему (лимфоглоточное кольцо, лимфатические сосуды, регионарные лимфатические узлы) и кровоток.
При наличии антитоксинов у инфицированных лиц, как правило, не возникает ни местных, ни общих проявлений действия токсина и инфекционный процесс ограничивается бессимтомной колонизацией, т. е. носительством.
Развитие манифестированных форм дифтерии обычно наблюдают у лиц, не имеющих противодифтерийных антител.
В месте внедрения возбудителя наблюдают его массивное размножение, сопровождающееся увеличением продукции токсина и развитием некроза слизистой оболочки, который обусловлен, помимо действия токсина, и ферментами (гиалуронидазой, нейраминидазой и, возможно, ДНКазой).
Поражение токсином определенных органов обусловлено динамикой циркуляции дифтерийного токсина. Состояние токсинемии является главным фактором, формирующим клиническую картину заболевания и определяющим его характер и исход.
По мере снижения регистрации заболеваемости дифтерией значение больных как источников инфекции уменьшается, и основная роль в распространении возбудителя уже будет принадлежать носителям. Именно поэтому полная ликвидация дифтерии невозможна, несмотря на проводимую вакцинопрофилактику.
Носительство дифтерийной палочки в коллективах охватывает 10-20 % детей, в очагах дифтерии бактерионосители составляют иногда более 70 % от числа обследованных.
Циркуляция токсигенных штаммов коринебактерий на фоне проводимой иммунизации и формирования антитоксического иммунитета определяет скрытое течение эпидемического процесса.
Для решения проблемы носительства важным является изучение роли антибактериального иммунитета и, в частности, его влияния на продолжительность вегетирования токсигенных коринебактерий дифтерии.
При дифтерийном бактерионосительстве может происходить формирование различных его форм: транзиторной и кратковременной, средней продолжительности и затяжной. Оценка иммунологических параметров у бактерионосителей свидетельствует о развитии у них иммуносупрессии, особенно при затяжном бактерионосительстве.
С. diphtheriae содержит сложный комплекс факторов патогенности, обусловливающих развитие эпидемического и инфекционного процессов, в связи, с чем особую актуальность приобретает разработка адекватных подходов к диагностике и специфической профилактике дифтерии.
источник