Возбудитель дифтерии относится к роду Corynebacterium (от лат. coryna — булава, diphthera — пленка). Бактерии имеют булавовидные утолщения на концах. К этому роду относятся патогенные для человека дифтерийные палочки и непатогенные виды — ложнодифтерийные палочки и дифтероиды, обнаруживаемые на слизистых оболочках и кожных покровах.
Возбудители дифтерии — Corynebacterium diphtheriae — были обнаружены Т. Клебсом (1883) и выделены в чистом виде Ф. Леффлером (1884).
Морфология. Возбудители дифтерии слегка изогнутые, тонкие палочки, размером 3-6 × 0,3-0,5 мкм, на концах которых имеются утолщения. В этих утолщениях имеются зерна волютина (зерна Бабеша — Эрнста). Бактерии дифтерии неподвижны, не имеют спор и капсул. Грамположительны. Они хорошо окрашиваются основными анилиновыми красителями, при этом волютиновые зерна окрашиваются интенсивнее. Для окраски обычно применяют щелочной метиленовый синий или кристаллический фиолетовый. Особенностью коринебактерий дифтерии является их полиморфность; в одной кулатуре встречаются различные по форме и размерам палочки: изогнутые, прямые, длинные, короткие, толстые, иногда коккобактерии. Характерно расположение бактерий в мазках — они обычно располагаются попарно под острым или тупым углом, в виде растопыренных пальцев и т. д. Расположение в мазках и наличие зерен волютина является дифференциально-диагностическим признаком при микроскопическом исследовании. Непатогенные представители рода коринебактерий — ложнодифтерийные палочки и дифтериоды чаще располагаются в виде частокола, зерна волютина у них могут отсутствовать либо быть на одном конце (см. рис. 4).
Культивирование. Коринебактерий дифтерии — факультативные анаэробы. Растут при температуре 35-37° С, рН среды 7,4-7,8. Они не размножаются на обычных питательных средах. Культивируют их на средах, содержащих кровь или сыворотку.
В конце XIX века французский ученый Э. Ру для культивирования бактерий дифтерии предложил использовать свернутую бычью или лошадиную сыворотку, а Ф. Леффлер рекомендовал добавлять к ней бульон (25%) и 1% глюкозу. На этих средах коринебактерий растут быстро, в течение 14-18 ч образуют несливающиеся выпуклые колонии кремового цвета (рост на скошенной среде напоминает шагреневую кожу). Однако отдифференцировать на этих средах дифтерийные палочки от ложнодифтерийных невозможно.
В настоящее время основными средами для выращивания являются среда Клауберга (содержащая сыворотку крови и теллурит калия), хинозольная среда Бунина, среда Тинсдаля и др. На основании культуральных и ферментативных свойств коринебактерий дифтерии делят на три биовара: гравис (gravis), ми тис (mitis), интермедиус (intermedins). Биовар гравис обычно находится в R-форме. На среде Клауберга бактерии этого биовара растут в виде крупных колоний 2-3 мм, серовато-черного цвета (так как восстанавливают теллурит в теллур), имеют изрезанные края, что придает им вид розетки. При прикосновении к колонии петлей она как бы рассыпается. На бульоне бактерии этого биовара образуют крошащуюся пленку и зернистый осадок.
Коринебактерии биовара митис (mitis) на среде Клауберга растут в виде небольших, гладких колоний (S-форма) черного цвета. На бульоне они дают равномерное помутнение.
Коринебактерии биовара интермедиус (intermedins) являются промежуточными. На среде Клауберга бактерии этого биовара чаще растут в виде блестящих, мелких, черных колоний (этот биовар встречается редко).
Ферментативные свойства. Все три биовара дифтерийных бактерий обладают ферментом цистиназой, расщепляющим цистин с образованием сероводорода. Эти свойства используются для дифференциации возбудителей дифтерии от непатогенных представителей этого рода (табл. 49).
Таблица 49. Свойства возбудителей дифтерии и близких к ним коринебактерий
Примечание. + положительная реакция (расщепляет); — отрицательная реакция (не расщепляет).
Возбудители всех трех биоваров расщепляют глюкозу и мальтозу до образования кислоты. С. gravis расщепляют крахмал. Это свойство отличает его от двух других биоваров. Коринебактерий дифтерии восстанавливают нитраты в нитриты, не образуют индол, не разлагают мочевину.
Коринебактерии дифтерии образуют нейраминидазу, гиалуронидазу и другие ферменты патогенности.
Токсинообразование. Вирулентные штаммы возбудителей дифтерии продуцируют экзотоксин. Химически он представляет собой термолабильный белок, состоящий из Двух фракций. Фракция В фиксирует токсин на чувствительных к нему тканях организма. Фракция А ответственна за токсическое действие. Силу токсина дифтерийных культур можно устанавливать «in vivo» на чувствительных к этому токсину морских свинках. Dim дифтерийного экзотоксина — минимальная смертельная доза, это минимальное количество яда, убивающее морскую свинку массой 250 г на 4-й день.
Наличие экзотоксина можно обнаружить также «in vitro» — на плотной питательной среде. Этот метод широко используется в практической работе. Дифтерийный экзотоксин малоустойчив. Он быстро разрушается под влиянием температуры, света и кислорода воздуха. После добавления к токсину формалина (0,3-0,4%) и выдерживания его при температуре 37-38° С в течение нескольких недель он переходит в анатоксин, который теряет ядовитость, но сохраняет антигенные свойства токсина. Токсины, образуемые различными штаммами, не различаются между собой и могут быть нейтрализованы дифтерийным антитоксином * .
* ( В настоящее время установлено, что все биовары коринебактерий могут быть токсигенными и нетоксигенными.)
Антигенная структура. У бактерий дифтерии имеется поверхностный термолабильный белковый антиген и типоспецифический полисахаридный О-антиген. Кроме этого, среди коринебактерий различают 19 фаговаров, которые учитываются при идентификации культур. С помощью фаговаров выявляют источник заболевания.
Устойчивость к факторам окружающей среды. Возбудители дифтериии сравнительно устойчивы. Температура 60° С убивает их через 10-15 мин, 100° С — через минуту. В пленке они выдерживают нагревание до 90° С. На свернутой сыворотке при комнатной температуре сохраняются до 2 мес, на детских игрушках — несколько суток. Низкие температуры коринебактерий переносят хорошо. К высушиванию возбудители дифтерии довольно устойчивы. Дезинфицирующие вещества (3% раствор фенола, 1% раствор сулемы, 10% раствор перекиси водорода) убивают эти бактерии в течение нескольких минут.
Восприимчивость животных. В естественных условиях животные дифтерией не болеют. Из экспериментальных животных наиболее восприимчивы морские свинки и кролики. При внутрикожном или подкожном заражении у них развивается картина токсикоинфекции с образованием на месте введения воспаления, отека, некроза. В надпочечниках наблюдаются кровоизлияния.
Источники заболевания. Больные люди и бактерионосители.
Пути передачи. Воздушно-капельный путь, контактно-бытовой (через посуду, игрушки, книги, полотенца и т. д.).
Заболевание у человека: 1) дифтерия зева; 2) дифтерия носа.
Реже возникает дифтерия трахеи, бронхов, глаз, уха, влагалища и дифтерия поврежденной кожи.
Патогенез. Входными воротами являются слизистые оболочки дыхательных путей и поврежденная кожа. Попав на слизистую оболочку, возбудители дифтерии размножаются в месте внедрения и вызывают некроз ткани. Образуется пленка, тесно связанная с подлежащими тканями. На поверхности слизистой появляются грязно-серые или желтоватые налеты, состоящие из разрушенного эпителия, фибрина, лейкоцитов и коринебактерий дифтерии. При снятии пленки ватным тампоном или шпателем поверхность слизистой может кровоточить.
В процессе размножения коринебактерий дифтерии в некротических участках накапливается экзотоксин, который может привести к отеку слизистой оболочки и клетчатки. Со слизистой оболочки отек может распространяться на гортань, бронхи и вызвать явления асфиксии. Токсин, циркулирующий в крови, избирательно поражает сердечную мышцу, надпочечники и клетки нервной ткани.
Дифтерия — это токсикоинфекция. Тяжесть процесса зависит от степени токсигенности штамма и от защитных сил организма.
Иммунитет. Невосприимчивость обусловливается антитоксическим и антибактериальным иммунитетом. Грудные дети не болеют, так как у них имеется пассивный иммунитет, переданный от матери.
О наличии антитоксического иммунитета судят по реакции Шика. Для постановки реакции 1 /40 Dlm (летальной дозы токсина для морской свинки), содержащегося в 0,2 мл изотонического раствора натрия хлорида, вводят внутрикожно в области предплечья. При отсутствии в крови антитоксина в месте введения через 24-48 ч появляется краснота и припухлость (до 2 см в диаметре). При наличии антитоксина припухлости и красноты нет (имеющийся в крови антитоксин нейтрализовал введенный токсин).
Перенесенное заболевание оставляет иммунитет. Однако в 6-7% случаев наблюдаются повторные заболевания.
Профилактика. Ранняя диагностика. Изоляция. Дезинфекция. Выявление носителей токсигенной дифтерийной палочки.
Специфическая профилактика осуществляется введением анатоксина. В СССР проводят обязательную вакцинацию детей вакциной АКДС — это комплексная вакцина, в которую входят дифтерийный и столбнячный анатоксин и взвесь убитых коклюшных палочек. Вакцинируют детей с 5-6 месяцев с последующей ревакцинацией. Для ревакцинации вводят вакцину без коклюшных палочек.
Специфическое лечение. Применяют противодифтерийную антитоксическую сыворотку. Доза и кратность определяется лечащим врачом, вводят также антимикробные препараты.
1. Какова морфология коринебактерий дифтерии и какие имеются биовары?
2. На каких средах выращивают бактерии дифтерии и каков характер роста?
3. Отношение к какому углеводу позволяет отличить биовар gravis от других биоваров дифтерии?
4. Каков путь передачи и где чаще локализуется возбудитель дифтерии у больного?
5. Каковы специфическая профилактика и специфическое лечение дифтерии?
Цель исследования: выделение возбудителя для постановки диагноза. Выявление бактерионосителей дифтерии по эпидемиологическим показаниям. Выявление экзотоксина у выделенной культуры.
1. Отделяемое слизистой оболочки зева.
2. Отделяемое слизистой оболочки носа.
3. Отделяемое слизистой оболочки глаза.
5. Отделяемое слизистой оболочки влагалища.
Материал для исследования зависит от локализации процесса.
Способы сбора материала
При любой локализации процесса обязательно исследует слизистую зева и носа. Материал собирают ватным тампоном, для чего используют металлическую проволоку, желательно алюминиевую, на один конец которой плотно накручивают вату, затем тампон монтируют в корковую пробку, помещают в пробирку и стерилизуют в печи Пастера при температуре 160° С 1 тампон течение часа или в автоклаве при температуре 112° С.
Примечания. 1. Материал собирают натощак либо не раньше чем через 2 ч после еды и не ранее чем через 4 дня после лечения антибиотиками или другими антибактериальными средствами. 2. Если материал берут из зева и носа, то пробирки с обоими тампонами надписывают и связывают вместе. Посевы делают раздельно и исследование материала из каждого тампона ведут как самостоятельную работу. 3 Материал, собранный сухим тампоном, должен быть посеян не позднее чем через 2-3 ч после забора. При необходимости транспортировки собранного материала тампон предварительно смачивают 5% раствором глицерина в изотоническом растворе натрия хлорида.
Первый день исследования
Чашки вынимают из термостата и просматривают. Рост бактерий на среде Клауберга может быть замедлен из-за наличия ингибиторов в среде. В этом случае чашки ставят в термостат еще на 24 ч.
Чашки вынимают из термостата, просматривают их с помощью лупы или стереоскопического микроскопа. При наличии подозрительных колоний часть их под контролем стереоскопического микроскопа выделяют на агар с 25% сывороткой и на столбик со средой Пизу для определения фермента цистиназы. Из другой части колоний ставят пробу на токсигенность.
При микроскопическом исследовании колоний, снятых со среды Клауберга, коринебактерии дифтерии теряют свою специфичность: отсутствует зернистость, изменяется величина, расположение сохраняется. При посеве их на среды с сывороткой морфологическая специфичность возбудителей дифтерии восстанавливается.
Проба на наличие фермента цистиназы и определение токсигенности являются обязательными при идентификации возбудителей дифтерии. Если результат этих опытов, проведенных с частью колоний со среды Клауберга, недостаточно четкий или отрицательный, то опыт повторяют, используя выделенную чистую культуру.
Проба на цистиназу. Проводят посев исследуемой культуры уколом в центр столбика среды Пизу. При положительной реакции через 18-24 ч по ходу укола наблюдается почернение, а вокруг черного стержня образуется темное облачко; почернение происходит в результате того, что фермент цистиназа расщепляет цистин, входящий в состав среды Пизу, и освободившаяся сера вступает в реакцию с ацетатом свинца — образуется сульфит свинца черного цвета. Дифтероиды и ложнодифтерийные палочки не содержат фермент цистиназу, поэтому при росте их на среде Пизу цвет среды не изменяется.
Определение экзотоксина. Проводят методом диффузной преципитации в геле. Метод основан на взаимодействии токсина с антитоксином. В тех участках агара, где эти компоненты взаимодействуют, образуется преципитат в виде закругленных линий.
Методика определения: в чашки Петри разливают растопленный и охлажденный до 50° С агар Мартена рН 7,8 (на агаре Мартена лучше продуцируется экзотоксин). Количество агара в чашке должно быть не более 12-15 мл, чтобы сохранить прозрачность, — в толстом слое линии преципитации плохо видны. После застывания агара накладывают полоску стерильной фильтровальной бумаги, смоченной противодифтерийной антитоксической сывороткой.
Испытуемую культуру засевают «бляшками». Посев производят петлей. Диаметр бляшек 0,8-1,0 см. Расстояние бляшек от края полосок бумаги 0,5-0,7 см, между двумя бляшками испытуемой культуры засевают бляшки заведомо токсигенного штамма. Испытуемую культуру считают токсигенной, если линии преципитации четки и сливаются с линиями преципитации контрольного (токсигенного) штамма. Если линии преципитации перекрещиваются с линиями контрольного штамма или отсутствуют, выделенную культуру считают нетоксигенной (рис. 50).
Рис. 50. Выявление экзотоксина C.Diphtheriae методом диффузной преципитации в агаре. 1 — бляшки нетоксигенного штамма (линии преципитации перекрещиваются); 2 — бляшки токсигенного штамма (линии преципитации соединяются)
Приготовление полосок бумаги. Из фильтровальной бумаги нарезают полоски размером 1,5×8 см, заворачивают по несколько штук в бумагу и стерилизуют в автоклаве при температуре 120° С в течение 30 мин. Перед постановкой опыта стерильным пинцетом вынимают одну полоску, укладывают ее в стерильную чашку Петри и смачивают противодифтерийной антитоксической сывороткой. Предварительно сыворотку разводят так, чтобы в 1 мл содержалось 500 АЕ (антитоксических единиц). Бумажку смачивают 0,25 мл сыворотки (125 АЕ) и помещают на поверхность среды. Затем делают посевы указанным выше способом. Все посевы ставят в термостат. Учет результатов производят через 18-24 и 48 ч.
Вынимают посевы из термостата, учитывают результат. Делают мазки из культуры, выросшей на среде с сывороткой, и окрашивают их синим Леффлера.
Наличие в мазках характерных по морфологии палочек, черного с облачком стержня в среде Пизу и линий преципитации в агаре позволяет дать предварительный ответ: «Обнаружены коринебактерии дифтерии». Исследование продолжают. При отсутствии линий преципитации в агаре или их недостаточной четкости исследование на токсигенность обязательно повторяют с выделенной чистой культурой.
Для окончательной идентификации выделенной культуры и определения биовара возбудителя производят посев на глюкозу, сахарозу, крахмал и бульон с мочевиной (для выявления фермента уреазы). Посев на среды делают обычным способом.
Проба на уреазу. Выделенную культуру засевают на бульон с мочевиной и индикатором (крезоловый красный) и ставят в термостат. Уже через 30-40 мин можно учитывать результат: при посеве истинных возбудителей дифтерии цвет среды не изменяется, так как они не содержат уреазу. Псевдодифтерийные палочки расщепляют мочевину и изменяют индикатор — среда приобретает малиново-красный цвет.
Производят учет результатов (табл. 50).
Таблица 50. Ферментативные свойства выделенных возбудителей
1. Какой материал исследуют для выявления возбудителя дифтерии?
2. Как собирают материал для исследования на дифтерию из зева и носа?
3. Что нужно сделать с тампоном, если собранный материал необходимо транспортировать?
4. При помощи какого прибора изучают колонии на среде Клауберга?
5. Какие исследования проводят для окончательной идентификации выделенной культуры?
6. Какими методами определяют токсигенность коринебактерий дифтерии?
1. Возьмите у преподавателя проволоку и вату и приготовьте 10 тампонов, вмонтируйте их в корковую пробку, вставьте в пробирку и простерилизуйте.
Внимание! Перед стерилизацией проверьте, достаточно ли плотно накручен тампон.
2. Возьмите у преподавателя стерильные тампоны и произведите забор материала друг у друга из зева и носа (разными тампонами).
3. Изучите по табл. 49 свойства возбудителей дифтерии и близких к ним коринебактерий.
4. Поставьте пробу на токсигенность. Бляшки сделайте петлей без культуры.
5. Зарисуйте ход исследования и положительный и отрицательный результат пробы на токсигенность.
Теллуровая среда Клауберга: первая смесь — предварительно за 1,5 мес готовят смесь из 20 мл бараньей или лошадиной крови и 10 мл глицерина. В день приготовления среды готовят две другие смеси; вторая смесь — 50 мл МПА рН 7,5 растапливают и охлаждают до температуры 50° С, после чего прибавляют 2,5 мл первой смеси; третья смесь — смешивают 17 мл бараньей крови и 33 мл дистиллированной воды (смесь приготавливают стерильно), подогревают на водяной бане до температуры 50° С. Соединяют вторую и третью смеси, прибавляют 4 мл 1% раствора теллурита калия К2ТеО3, быстро все перемешивают и разливают в чашки. Среда прозрачная, имеет цвет красного вина.
Среда Пизу. К 90 мл расплавленного 2% МПА (рН 7,6) добавляют 2 мл раствора цистина (1% раствор цистина в 0,1 н. растворе гидроксида натрия), тщательно перемешивают и добавляют такой же объем 0,1 н. раствора серной кислоты. Среду стерилизуют 30 мин при температуре 112° С. К расплавленной и охлажденной до 50° С среде добавляют 1 мл 10% раствора ацетата свинца, стерилизованного двукратно текучим паром, перемешивают и добавляют 9 мл нормальной лошадиной сыворотки. Среду стерильно разливают в маленькие пробирки по 2 мл. Посев производят уколом.
Среда Бунина. Сухую хинозольную среду добавляют к 100 мл холодной воды (рН 7,6-7,8), размешивают и нагревают на слабом огне до расплавления агара (по прописи на этикетке). Затем среду кипятят 2-3 мин до образования пены, после чего среду остужают до 50° С и добавляют 5-10 мл стерильной дефибринированной крови. Среду перемешивают и разливают в чашки Петри. Готовую среду можно сохранять 3-4 дня при температуре 4-10°.
Среда Тинсдаля. К 100 мл 2% питательного агара, расплавленного и охлажденного до 50° С, добавляют: 1) 12 мл 1% раствора цистина на 0,1 н. растворе серной кислоты; 2) 12 мл 1% раствора гидроксида натрия; 3) 1,8 мл 2% раствора теллурита калия; 4) 1,8 мл 2,5% раствора гипосульфита натрия, 20 мл нормальной лошадиной или бычьей сыворотки. После добавления каждого ингредиента среду тщательно перемешивают. Чашки со средой хранят 3-4 дня при 10° С.
источник
В основе метода определения токсигенности коринебактерий дифтерии (тест Элека) лежит процесс встречной иммунодиффузии токсина и антитоксических антител в плотной питательной среде. В местах оптимального количественного соотношения между токсином, продуцируемым коринебактериями, и антитоксином, нанесенным на фильтровальную бумагу, происходит их взаимодействие с образованием преципитата в виде белой линии или «усов».
Токсигенность коринебактерий дифтерии определяют, как правило, в чистой культуре (отдельные колонии или культура со скошенного агара, или с пробы Пизу). Смесь колоний или культуры, загрязненные посторонней микрофлорой, также могут быть испытаны на токсигенность. При отсутствии, в этом случае, преципитатов в агаровом геле, опыт следует повторить с выделенными чистыми культурами.
Культуру засевают в виде «бляшек» диаметром 0,6-0,7 см на расстоянии 0,7-0,8 см друг от друга и 0,5 см от края полоски фильтровальной бумаги. На одну чашку следует засевать не более 10 «бляшек». Из них 6 «бляшек» испытуемой культуры, 4-контрольного штамма. При небольшом количестве испытуемого материала засевают 6 контрольных «бляшек» и 4 — испытуемых. Чашки с посевом помещают в термостат при 37 град. C.
Результат учитывают через 18-24 часа и 48 часов роста. Следует иметь в виду, что препарат антитоксической противодифтерийной сыворотки, помимо антител к дифтерийному антитоксину, содержит антитела к антигенам микробной клетки. Поэтому при постановке пробы на токсигенность с использованием данного препарата преципитаты могут образовываться не только в результате связывания токсина с антитоксином (специфические преципитаты), но и при взаимодействии антибактериальных антител с компонентами клетки коринебактерий дифтерии (неспецифические преципитаты). Последние могут формироваться как у токсигенных, в том числе и у контрольного штамма, так и у нетоксигенных коринебактерий дифтерии. Иногда отмечается появление множественных линий преципитации. Неспецифические преципитаты, как правило, слабо выражены, имеют нечеткие контуры, появляются чаще через 48-72 часа, в редких случаях могут появляться и на первые сутки. Критерием оценки специфичности преципитатов является слияние линий преципитации испытуемого штамма со специфическими линиями контрольного токсигенного штамма. В тех случаях, когда у контрольного штамма формируется несколько линий преципитации, специфическими следует считать более четкие и рано появляющиеся преципитаты. Поэтому просмотр чашек с пробой на токсигенность осуществляют через 18-24 часа от момента ее постановки. Если в течение данного времени у контрольного штамма линии преципитации не обнаруживаются, это свидетельствует о нарушении условий постановки реакции.
Варианты оценки результатов реакции:
- 1. Испытуемые культуры коринебактерий дифтерии являются токсигенными, если образуемые ими линии преципитации сливаются или имеют тенденцию к слиянию с соответствующими специфическими линиями контрольного токсигенного штамма.
- 2. Испытуемые культуры коринебактерий дифтерии являются нетоксигенными, если:
- а) линии преципитации, образуемые испытуемой культурой, отсутствуют, при наличии специфических линий преципитации у контрольного штамма;
- б) линии преципитации не могут слиться со специфическими линиями преципитации контрольного штамма, а скрещиваются или имеют тенденцию к скрещиванию с ними (неидентичные, неспецифические линии);
- в) линии преципитации испытуемой культуры сливаются с неспецифическими линиями контрольного штамма;
- г) линии преципитации испытуемой культуры перекрещиваются со специфическими линиями и сливаются с неспецифическими линиями контрольного штамма.
Очищенный ферментолизом и специфической сорбцией антитоксин не содержит антител к компонентам микробной клетки. При использовании этого препарата неспецифические линии преципитации не образуются.
источник
С целью раннего выявления дифтерии и определения носителей дифтерийной палочки необходимы выделение и идентификация возбудителя, а также определение его способности к токсинообразованию. Материалом для исследования служат дифтеритические плёнки, слизь из носоглотки или отделяемое из подозрительных поражений кожных покровов.
Забор материала на дифтерию проводят двумя стерильными тампонами: один используют для посева, с другого делают мазки и окрашивают их по Граму и Найссеру. Взятый материал следует доставлять в лабораторию не позднее чем через 3 ч.
Окраска по Граму не является специфичной, так как дифтерийные палочки сравнительно плохо воспринимают красители, но позволяет косвенно идентифицировать непатогенные коринебактерии, располагающиеся в виде палисада (параллельно) или в виде китайских иероглифов. Окраска по Найссеру позволяет выявить характерные зёрна Бабеша-Эрнста и отличить дифтерийную палочку от ложнодифтерийной палочки С. pseudodiphtheriticum (С. hofmannii), часто обитающей в носоглотке.
Бактерии дифтерии выделяют посевом на элективные среды с теллуритом (например, Клауберга II или Маклёода), ложнодифтерийная палочка (палочка Хофманна) теллур не восстанавливает (см. рис. 8 на вклейке). Для выделения чистой культуры дифтерии часть подозрительной колонии засевают на скошенный агар (или среду Ру), вторую часть — на твёрдую питательную среду для определения токсигенности и (не обжигая петли) проводят определение цистиназной активности (проба Пизу). При положительном результате наблюдают образование коричневого облачка вокруг линии укола. Чистую культуру идентифицируют на средах Хйсса, пользуясь укороченным пёстрым рядом (глюкоза, мальтоза, сахароза, мочевина), что позволяет отличить С. diphtheriae от непатоген пых коринебактерии (рис. 14-3).
Для идентификации биоваров дифтерии используют «длинный» ряд углеводов, включающий крахмал и гликоген. Для полной идентификации можно исследовать способность бактерий расти в анаэробных условиях посевом уколом в столбик 0,5% сахарного агара (растёт только С. diphtheriae).
Определение токсигенности дифтерийной палочки in vivo. Проводят подкожным или внутрикожным заражением 0,5-1,0 мл бактериальной культуры морских свинок массой 250 г. За 24 ч до заражения одно животное иммунизируют дифтерийным антитоксином. При положительном результате неиммунизированные животные погибают в течение 3-5 сут.
Определение токсигенности дифтерийной палочки in vitro. Способность к образованию токсина можно определять заражением куриных эмбрионов или культур клеток с регистрацией последующего цитопатнческого эффекта. Можно использовать твердофазный ИФА с использованием антитоксинов, меченных пероксидазой. Также предложены ПЦР и ДНК-зонды для обнаружения гена tox в бактериальной хромосоме. Однако наибольшее распространение получил тест иммунодиффузии Илека. На среду с пониженным содержанием Fe2+ (для более интенсивного токсинообразования) проводят посев исследуемого изолята и эталонных токсигенного и нетокси-генного штаммов параллельными штрихами. На выросшие колонии накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной дифтерийным антитоксином. Образующийся токсин и антитоксин диффундируют в агар и в месте встречи образуют линии преципитации, так называемые «усы» или стрелы. На практике используют модификацию метода. Полоску бумаги, пропитанную антитоксином (500 ME в 1 мл), наносят на чашку, а исследуемые культуры засевают бляшками по обе стороны бумажной полоски. Контролем служит заведомо токсигенная культура, также посеянная «бляшкой». В результате встречной диффузии токсина и антитоксина в месте их контакта выпадает линия преципитации, сливающаяся с линией преципитации токсигенного штамма.
Для дифференциальной диагностики возбудителей используют набор из 9 кори нефагов. С его помощью можно типировать большинство токсигенных и нетоксигенных штаммов биовара gravis.
источник
Дифтерия — острое инфекционное заболевание, вызываемое дифтерийной палочкой (Corynebacterium diphtheriae), характеризующеесяместным фибринозным поражением слизистых оболочек рото- и носоглотки (diphthera – пленка), а также тяжелой интоксикацией с поражением сердечно-сосудистой, нервной системы и надпочечников. Лабораторная диагностика дифтерии осуществляется в соответствии со схемой 14.
Схема 14.Микробиологическая диагностика дифтерии
Микроскопический метод в настоящее время фактически не применяется из-за его низкой информативности в связи с субъективизмом учета и выполняется только по требованию лечащего врача. Микроскопии подвергают мазки, окрашенные по Граму, метиленовым синим, по Нейссеру (для выявления включений волютина). Дифтерийные палочки (Corynebacteriumdiphtheriae) при окраске по Нейссеру содержат полярно расположенные темно-синие, почти черные, включения волютина и располагаются в виде римских цифр V или Х, тогда как сходные с ними дифтероиды и ложнодифтерийные бактерии (Corynebacteriumpseudodiphtheriae) зерен волютина не имеют и располагаются в виде частокола. Разработан также метод прямого флюорохромирования дифтерийных палочек корифосфином, окрашивающим включения волютина в красно-коричневый цвет, а цитоплазму в зеленый или желтый цвет, что позволяет повысить эффективность бактериоскопического метода.
Бактериологический метод-основной метод диагностики дифтерии. Исследуемый материал засевают на одну из специальных питательных сред для культивирования дифтерийных палочек, наиболее часто на среду Клауберга (МПА с глицерином, дефибринированной кровью и теллуритом натрия, задерживающим рост сопутствующей непатогенной микрофлоры). На среде Клауберга Corynebacterium diphtheriae образует 2 типа колоний:
а) серовато-черного цвета с радиальной исчерченностью поверхности, напоминающие цветок маргаритки или розетку (биовар gravis);
б) черные, круглые, выпуклые колонии колонии за счет восстановления теллурита (биовар mitis).
В мазке из типичной для дифтерийной палочки колонии обнаруживают грамположительные палочки булавовидной формы, расположенные в виде римских цифр V или Х, содержащие зерна волютина (рис. 16). Оставшуюся часть колонии пересевают на кровяной МПА для выделения чистой культуры.
Рис. 16. Возбудитель дифтерии — Corynebacteriumdiphtheriae. Окраска по Нейссеру. Расположение в виде римских цифр V или Х, включения волютина по полюсам. х900
Идентификацию выделенной культуры проводят с учетом, прежде всего, ключевых свойств (токсигенность, наличие цистиназы). Токсигенность обычно определяют с помощью реакции преципитации в геле («чашечный» метод). Для этого в чашку Петри с питательной средой (МПА, 15—20 % лошадиной сыворотки, 0,3 % мальтозы, 0,03 % цистина) накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой (5000 АЕ/мл), чашку подсушивают 30 минут в термостате, после чего засевают штрихами исследуемые культуры перпендикулярно полоске бумаги. В качестве контроля используют токсигенную культуру. Посевы инкубируют в термостате при 37 0 С в течение 18-20 часов. При наличии токсигенности в местах соединения токсина с антитоксическими антителами в питательной среде образуются белые линии преципитата, напоминающие усики. Для определения токсигенности дифтерийных бактерий также разработаны ИФА и ПЦР.
Цистиназу у выделенных культур (проба Пизу) определяют путем посева методом укола петли исследуемой культуры на цистиновый МПА с азотнокислым свинцом. Посевы помещают на сутки в термостат при 37 0 С. При наличии цистиназы в среде образуется почернение (образование сульфида свинца) по ходу укола, вокруг которого появляется коричневое облачко.
Выделенную культуру идентифицируют и дифференцируют от сходных с ней непатогенных коринебактерий по биологическим свойствам (табл. 16). Для определения уреазы петлю исследуемой культуры вносят в пробирку, содержащую спиртовый раствор мочевины и индикатор феноловый красный. Пробирку выдерживают 30 минут в термостате при 37 0 С, при наличии уреазы содержимое пробирки окрашивается в красный цвет.
При выделении нетоксигенной культуры ставят реакцию агглютинации с противодифтерийной сывороткой для выявления видового антигена Corynebacterium diphtheriae.
Серологический метод –РА, РНГА с целью определения антител в парных сыворотках крови больных дифтерией.
Таблица 16.Биологические свойства коринебактерий
| Вид | Волютин | Гемолиз | ферментация | токсин | цистиназа | уреаза | РА с ПДС | ||
| сахарозы | глюкозы | крахмала | |||||||
| C. diphtheriae биовар биовар | + + | — + | — | + + | + — | ± ± | + + | — — | + + |
| C.xerosis | ± | — | + | + | — | — | — | — | — |
| C. pseudodiphtheriae | ± | — | — | — | — | — | — | + | — |
Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:
Лучшие изречения: Увлечёшься девушкой-вырастут хвосты, займёшься учебой-вырастут рога 9510 — 
| 7531 — 
или читать все.
195.133.146.119 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.
Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно
источник
Полоска фильтровальной бумаги размером 1,5×8 см, простерилизованная в автоклаве, пропитывается антитоксической противодифтерийной сывороткой «Диаферм-3», разведенной физиологическим раствором до содержания 500 АЕ в I мл.
Смоченную сывороткой бумагу стерильным пинцетом переносят на поверхность питательной среды в чашке Петри. Чашку подсушивают в термостате 20 минут. Испытуемые культуры (колонии) засевают петлей бляшками диаметром в I см на расстоянии 0,5 см от бумаги. На одну чашку засевают несколько штаммов, в том числе один заведомо токсигенный. Рекомендуется каждую культуру засевать не менее чем четырьмя бляшками (по две с каждой стороны от бумаги). Посевы помещают в термостат. Учет производят через 24, 48, 72 часа. Определение токсигенности основано на следующем принципе: образующийся в процессе роста дифтерийных бактерий экзотоксин диффундирует в питательную среду. Одновременно в среду диффундирует специфическая антитоксическая противодифтерийная сыворотка. В тех местах среды, где токсин и антитоксин встречаются в оптимальных соотношениях, выпадает реакция преципитации в виде белой изогнутой линии. Исследуемые бактерии считаются токсигенными, если линии преципитата их сливаются с линиями преципитата контрольного штамма. Демонстрация опыта по определению токсина методом преципитации в агаре.
б)Для определения гемотоксина произвести посев золотистого, стафилококка на пластинки кровяного МПА. Для этого чашка с кровяным МПА делится на два сектора. На одном из них засевается культура золотистого стафилококка, а на другом — для контроля — культура нетоксигенного белого стафилококка.
в)Определение некротоксина производится путем внутрикожного введения лабораторному животному 0,2 мл бульонной культуры (или фильтрата бульонной культуры) испытуемого микроба.
Через сутки или двое суток на месте введения образуется очаг некроза. Демонстрация опыта. Зарисовать дермонекротическую пробу.
§ 5. Демонстрация опыта по выявлению брюшнотифозного эндотоксина внутрикожной пробы на кролике. 0,2 мл эндотоксина, полученного путем обработки культуры трихлоруксусной кислотой, вводят внутрикожно кролику. На месте введения эндотоксина через 24-48 часов отмечается воспалительная реакция. Зарисовать.
§ 6. а) Для выявления гиалуронидазы кролику в один участок депилированнои кожи вводят внутрикожно 0,2 мл туши в физиологическом растворе, а в такой же соседний участок — 0,2 мл туши с прибавлением фильтрата бульонной культуры стафилококка.
Пятно на месте инъекции туши с фильтратом бульонной культуры стафилококка через 24-48 часов в несколько раз превосходит по размерам пятно на месте введения туши без фильтрата за счет повышения проницаемости ткани в присутствии гиалуронидазы. Демонстрация опыта.
б)Для выявления фибринолитического фермента в чашки Петри с агаровой средой, содержащей плазму, засевают испытуемую культуру. После инкубации в течение 24-48 часов при 37 0 образуется зона про светления вокруг колоний бактерий, продуцирующих фибринолизин. Демонстрация опыта.
в)Для выявления фермента плазмокоагулазы испытуемую культуру засевают в 0,2 мл цитратной кроличьей или человеческой плазмы. В случае выработки плазмокоагулазы через 2-4-6-18 часов инкубации при 37 0 происходит свертывание плазмы. В контроле плазма остается жидкой. Демонстрация опыта.
г)Для выявления лецитиназы изучаемую культуру засевают на желточный агар. При наличии лецитиназы вокруг колонии бактерий образу ется зона помутнения и радужного венчика. Демонстрация опыта.
источник
Исследуемый материал содержит
Диагностический препарат содержит
фильтровальная бумага, смоченная антитоксической сывороткой;
а) нетоксигенные б) токсигенные
Принцип метода: _________________________________________________ __________________________________________________________________
Сфера применения: _________________________________________________ __________________________________________________________________
Исследуемый материал содержит
Диагностический препарат содержит
Количество антитоксической сыворотки в мл
Примечание: Доза токсина, внесенного в каждую пробирку — ___________ АЕ.
Расчет активности сыворотки:
Вывод: ____________________________________________________________ __________________________________________________________________
Механизм основных типов аллергических реакций.
Основные клинические формы
Методы выявления сенсибилизации
Кожные аллергические пробы.
Тип гиперчувстви-тельности ГЗТ/ГНТ)
Принцип метода: Внутрикожно или накожно в организм человека вводися небольшое количество аллергена. При наличии сенсибилизации через некоторое время на месте введения препарата возникает местная реакция.
Положительный результат кожной аллергической пробы –
Отрицательный результат кожной аллергической пробы –
Занятие № 8 Дата______________
Тема: иммунитет: иммунные реакции с использованием меченых антител или антигенов. Иммунобиологические препараты.
Цель: Изучить основные иммунобиологические препараты, их особенности, получение и применение в медицине. Получить представление о принципах приготовления диагностических препаратов, меченых флюорохромами, радиоактивными элементами, ферментами; чувствительности отдельных иммунных реакций и областях их применения..
Вакциопрофилактика и вакцинотерапия.
Состав и классификация вакцин.
Живые вакцины, получение и применение.
Инактивированные вакцины, получение и применение.
Синтетические и полусинтетические вакцины, получение и применение.
Календарь профилактических прививок.
Серопрофилактика и серотерапия.
Сывороточные иммунные препараты.
Получение и применение моноклональных антител.
Реакции с мечеными диагностическими компонентами (ИЛМ, РИФ, ИФА, РИА, иммуноблоттинг).
Тема для самостоятельной проработки — опсоно-фагоцитарная реакция.
Иммуно-люминесцентный метод (ИЛМ, РИФ)
Принцип метода: Антитела, соединенные с ФИТЦ (флюоресцсина изотиоционат), фиксируются на соответствующих антигенах. После промывки, в люминесцентном микроскопе виден искомый микроорганизм или пораженная клетка макроорганизма, светящиеся на темном фоне.
Аг — клетка микроорганизма или пораженная клетка макроорганизма.
Люминесцирющая сыворотка против искомого антигена.
Нелюминесцирующая кроличья сыворотка против искомого Аг.
Люминесцирующая сыворотка против иммуноглобулинов кролика.
Люминесцирующая сыворотка против комплемента.
Схема реакций (отметьте соответствующие компоненты цифрами)
Перечислите ингредиенты для ИЛМ (РИФ) с целью:
а) Индикации возбудителя дизентерии в молоке
В непрямой двухэтапной РИФ
б) Серодиагностики сифилиса в непрямой двухэтапной РИФ
В непрямой двухэтапной РИФ
Иммуно-ферментный анализ ИФА.
Принцип метода: Антитела к искомому антигену фиксируются на носителе. Вносят исследуемый материал, добавляют антитела, меченые ферментом, и хромогенный субстрат. Между всеми операциями интенсивно промывают. При соответствии антигенов и антител, содержимое пробирки окрашивается, причем интенсивность окрашивания пропорциональна количеству искомого компонента.
ИФА с целью обнаружения вируса гепатита В в сыворотке больного
Исследуемый материал содержит _______
Диагностические препараты 1._________________________содержит _______
Ответ: _____________________________________________________________ ____________________________________________________________________
Вывод: ____________________________________________________________ __________________________________________________________________
ИФА с целью серодиагностики сифилиса
Исследуемый материал содержит _______
Диагностические препараты 1._________________________содержит _______
Ответ: _____________________________________________________________ ____________________________________________________________________
Вывод: ____________________________________________________________ __________________________________________________________________
Иммуноблоттинг (выявление антител в сыворотках больных к определенным антигенам возбудителя).
Принцип метода: 1. Разделенный с помощью электрофореза комплекс антигенов наносят на полоску из нитроцеллюлозы. При этом разные антигены фиксируются в различных участках полоски. 2. Дальнейшие исследования проводят по схеме обычного ИФА
Иммуноблоттинг для диагностики ВИЧ-инфекции
Ответ: ______________________________________________ ______________________________________________
Вывод: ______________________________________________ ______________________________________________
Радио-иммунный метод (РИМ)(Радиоиммунологический анализ, РИА)
Принцип метода отличается от ИФА тем, что диагностические сыворотки метят радиоактивной меткой, а результат учитывают при помощи счетчика радиоактивности.
Общий вывод (сделайте вывод об экспресс-диагностике и серодиагностике, их возможностях, достоинствах, недостатках):
Задачи, решаемые с помощью серодиагностики:
Аутовакцина — _______________________________________________________ ____________________________________________________________________
Комбинированная вакцина — _________________________________________ ____________________________________________________________________
Ассоциированная вакцина — __________________________________________ ____________________________________________________________________
Сорбированная вакцина — ___________________________________________ ____________________________________________________________________
СЫВОРОТОЧНЫЕ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ
Сыворотка — ________________________________________________________ ____________________________________________________________________
Гамма-глобулин — ___________________________________________________ ____________________________________________________________________
Моноклональные антитела — _________________________________________ ____________________________________________________________________
источник
Возбудитель дифтерии относится к роду Corynebacterium, виду C.diphtheriae. Этот вид включает токсигенные коринебактерии, которые и являются возбудителями дифтерии, и нетоксигенные, не вызывающие заболевания. C.diphtheriae палочки средней величины с булавовидными утолщениями на концах. В мазках нередко имеют характерное расположение под углом друг к другу. В цитоплазме по полюсам клетки локализуются метахроматические гранулы, или зерна волютина, которые выявляются при окраске мазков по методу Нейссера. Спор, капсул не образуют, неподвижны. Грамотрицательны. Факультативные анаэробы.Требовательны к питательным средам. Хорошо растут на свернутой сыворотке (среда Ру), образуя характерные изолированные, не сливающиеся друг с другом колонии (“шагреневая кожа”). Биохимическая активность C.diphtheriae достаточно высока. Ключевыми признаками, которые используются для дифференциации их от других представителей рода являются: ферментация глюкозы, цистеина (проба Пизу), неспособность разлагать сахарозу и мочевину. По культуральным и биохимическим свойствам выделяют три биовара C.diphtheriae: gravis, mitis и intermedius. Основным методом микробиологической диагностики дифтерии является бактериологическое исследование с обязательным определением токсигенности выделенных штаммов в реакции преципитации в агаре с противодифтерийной преципитирующей антитоксической сывороткой. Токсигенность возбудителей дифтерии также можно определять в РПГА с эритроцитарным дифтерийным антительным диагностикумом (взвесь эритроцитов, на которых сорбирован дифтерийный антитоксин-антитела). Материал для исследования берется из очага поражения (чаще это мазок из зева)
ВИЧ-инфекции: характеристика возбудителя, эпидемиология, методы диагностики. Клинические проявления в полости рта оппортунистических инфекций у ВИЧ- инфицированных и ВИЧ-больных. Современная терапия ВИЧ- пациентам
Характеристика возбудителя. Возбудитель инфекции ВИЧ относится к семейству Retroviridae , подсемейству Lentivirida, роду Lentivirus. Ретровирусы – сложные РНК-геномные вирусы. На геномной РНК вируса с помощью вирусспецифического фермента обратной транскриптазы синтезируется комплементарная нить ДНК, которая преобразуется в двунитевую форму и встраивается в геном клетки хозяина в виде ДНК провируса — интегративная инфекция. Известны два типа вируса ВИЧ1 и ВИЧ 2 , которые отличаются по антигенным и структурным свойствам. Строение вириона. ВИЧ является РНК геномным, имеет сферическую форму. Внешняя оболочка вириона суперкапсид-это липидный слой клеточного происхождения, с которым ассоциированы гликопротеины. Сердцевина вируса cor – это нуклеокапсид с кубическим типом симметрии. Внутри расположены две идентичные нити плюс РНК, представляющие собой геном ВИЧ, три энзима – обратная транскриптаза, протеаза (рибонуклеаза), интеграза – и белки, связывающие эти структуры воедино. Геном ВИЧ – содержит 9 генов – 3 структурных и 6 регуляторных
Эпидемиология. В настоящее время различают следующие пути передачи инфекции: половой, парентеральный, трансплацентарный. Группы риска по заболеваемости ВИЧ-инфекцией, в первую очередь, составляют: люди с заболеваниями крови, наркоманы, а также в силу профессиональной специфики — врачи-лаборанты, хирурги, гинекологи, стоматологи.
Лабораторная диагностика. 1.Серологический метод. Он заключается в обнаружении специфических АТ в сыворотке к антигенам ВИЧ — ИФА. Проводят быстрое скрининговое исследование испытуемой сыворотки. При обнаружении антител к ВИЧ сыворотку исследуют дважды. Проводят подтверждающую пробу (иммуноблотинг), выявляют специфические АТ.
2. Вирусологическое исследование.
4. Иммунологические исследования.
Симптомы ВИЧ инфекции в полости рта
Для диагностики поражения слизистой оболочки рта у ВИЧ-инфицированных больных принята рабочая классификация. Все поражения разделены на 3 группы:
· 1-ая группа — поражения, четко связанные с ВИЧ-инфекцией. В эту группу включены следующие нозологические формы:
o кандидозы (эритематозный, псевдомембранозный, гиперпластический);
o язвенно-некротический гингивит;
o деструктивный пародонтит;
· 2-ая группа — поражения, менее четко связанные с ВИЧ-инфекцией:
o тромбоцитопеническая пурпура.
· 3-я группа — поражения, которые могут быть при ВИЧ-инфекции, но не связанные с нею.
Наибольший интерес вызывают и наиболее часто встречаются поражения, относящиеся к 1-ой группе.
Эритематозный или атрофический, характеризуется гиперемированными участками слизистой без налета с локализацией чаще на твердом нёбе, спинке языка и слизистой щек. При локализации на языке отмечается атрофия сосочков.
Псевдомембранозный- наличие беловато-желтоватых снимающихся бляшек либо налета. Локализация — любой отдел слизистой оболочки
Гиперпластический — налет плотно соединен с подлежащей тканью
Встречаются формы, сочетающие атрофический тип вместе с псевдомембранозным
Ангулярный хейлит — гиперемированные поражения, трещины с эрозированием в области углов рта. Наблюдается на ранних и прогрессирующих стадиях болезни, иногда сочетается с ксеростомией
Волосистая лейкоплакия (ВЛ)
Волосистая лейкоплакия (ВЛ) — встречается у 98% инфицированных ВИЧ-инфекцией.
Причину связывают с вирусом Эпштейна-Бара, но окончательно она не выяснена. По клиническим проявлениям ВЛ выглядит в виде выступающих над поверхностью складок или выступов белого цвета, которые по форме напоминают волосы.
Излюбленная локализация — боковая и нижне-боковая поверхность языка.
Иногда проявления ВЛ могут быть на губе или дне полости рта.
Характерной особенностью волосистой лейкоплакии является плотное прикрепление к основанию и отсутствие воспалительной реакции, что подтверждено гистологическими исследованиями. В большинстве случаев течение волосистой лейкоплакии бессимптомно, поэтому осмотр полости рта должен быть очень тщательным
Гингивит возникает в результате обострения бактериальной инфекции. Выделяют маргинальный гингивит или так называемую краевую гингивальную эритему, которая возникает остро, внезапно. Признаки заболевания могут исчезнуть через 3-4 недели, но затем обострения рецидивируют
Язвенно-некротический гингивит характеризуется прогрессированием процесса с изъязвлением и некрозом десневых сосочков и маргинальной десны. Возможны спонтанные кровотечения. Это состояние отмечается у пациентов с высокой иммунной супрессией
Пародонтит характеризуется быстро протекающей деструкцией альвеолярной кости и периодонтальной ткани, сопровождающейся болезненностью и спонтанным десневым кровотечением. Иногда выявляется наличие секвестра. Это состояние связывают с глубокой иммунной супрессией
Рецидивирующий герпетический стоматит
Вирусная инфекция у ВИЧ-инфицированных больных проявляется в виде вирусных папиллом и рецидивирующего герпетического стоматита.
Клиника: появляются круглые или овальные мелкие множественные резко-болезненные язвочки. Локализация — губы, твердое или мягкое нёбо, щеки. Язвочки могут сливаться и образовывать обширные кровоточащие изъязвления, покрытые желтоватым псевдомембранозным налетом. Частые рецидивы и обширные сливные поражения появляются на поздних стадиях ВИЧ-инфекции
Саркома Капоши все случаи были описаны с локализацией на небе.
Клинические проявления характеризуются наличием пятен различной окраски — красные, синеватые, фиолетовые — и различной интенсивности. Позднее пятна темнеют, увеличиваются в размерах, могут изъязвляться. Поражения болезненны. При локализации на десне необходимо дифференцировать с эпулисом. Оральные проявления могут быть первыми признаками Саркомы Капоши.
Нон-Ходжкинская лимфома — поражение, относящееся к новообразованиям, может быть у ВИЧ-инфицированных больных. Локализация — твердое небо и слизистая оболочка альвеолярного отростка
Стоматологическая помощь больным ВИЧ-инфекцией оказывается в полном объеме с соблюдением всех мер безопасности. Медицинский персонал должен быть осведомлен об этиологии, патогенезе, лечении ВИЧ-инфекции, а также об оральных и системных проявлениях, законах, этических нормах, правовых и психологических проблемах.
Лечение ВИЧ инфекции осуществляется химиопрепаратами, нарушающими репродукцию вируса – это ингибиторы обратной транскриптазы – нуклеозидные и нуклеотидные аналоги. Препараты встраиваются в нить ДНК и блокируют его синтез — нарушая процесс обратной транскрипции, а следовательно и репродукцию ВИЧ. Различают нуклеозидные аналоги тимидина и аналоги других нуклеозидов. Производные тимидина: амидотомидин (ретровир, тимидин); ставудин (зерит). Производные других нуклеозидов: диданозин, ламивудин, абакавир. Ингибиторы обратной транскриптазы: ненуклеозидные аналоги – препараты непосредственно соединяются с активным центром активной транскриптазы и блокируют ее – невирапин, ифавиренц.2. Ингибиторы протеазы ВИЧ. 3.Специфическая профилактика ВИЧ инфекции отсутствует.
Практические навыки. Оценка пептолитической активности бактерий (указать принцип изучения, охарактеризовать результаты)
Расщеплять белки могут не все бактерии. Чаще бактерии способны расщеплять
промежуточные продукты распада белков – пептоны, т.е. обладают пептолитической активностью. Продуктами распада пептонов являются: амины (скатол, индол), аминокислоты, газы – сероводород, аммиак, углекислый газ. Их легко обнаружить, укрепив под пробкой пробирки с МПБ индикаторные полоски: лакмусовую для выявления аммиака, смоченную щавелево-уксусной кислотой (реактив Мореля) для выявления индола, уксусно-кислым свинцом — сероводорода. Лакмус синеет в присутствии аммиака, реактив Мореля розовеет в присутствии индола, а при наличии сероводорода на индикаторной полоске
образуется черная соль сульфида свинца.
Общие условия выбора системы дренажа: Система дренажа выбирается в зависимости от характера защищаемого.
Опора деревянной одностоечной и способы укрепление угловых опор: Опоры ВЛ — конструкции, предназначенные для поддерживания проводов на необходимой высоте над землей, водой.
Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций.
источник
Для диагностики дифтерии разработаны различные методы: бактериологический, биологический, иммунохимический (РПГА, ИФА, РКоА, РЛА), также проводятся молекулярно-биологические исследования (ПЦР, риботипирование, энзимотипирование, секвенирование ДНК).
Крайне важны правильное взятие и своевременная доставка материала, а также четкий учет результатов.
Современная лабораторная диагностика дифтерийной инфекции имеет большое значение для установления диагноза, принятия решения о проведении специфической терапии, оценки и прогнозирования эпидемиологической ситуации.
Бактериологический или культуральный метод является основным и используется с диагностической, профилактической и эпидемиологической целями.
Проведение бактериологического исследования на обнаружение возбудителя дифтерии регламентировано и осуществляется в соответствии с методическими указаниями «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции».
Результаты бактериологического исследования в значительной степени зависят от своевременного и правильного забора материала, качества питательных сред, четкого и профессионального выполнения.
С диагностической целью в стационаре обследуют больных с острыми воспалительными заболеваниями в ротоглотке и дыхательных путях при подозрении на дифтерию ежедневно в течение 3 дней; при амбулаторном обследовании — больных ангинами, имеющих патологические выпоты на миндалинах, больных с подозрением на паратонзиллит, заглоточный абсцесс, стенозирующий ларинготрахеит, инфекционный мононуклеоз. Материал берут однократно.
По эпидемиологическим показаниям обследуются лица, бывшие в контакте с источником инфекции. Забор материала у них проводится однократно.
С профилактической целью обследуют лиц, поступающих в детские дома, специальные учреждения для детей с поражением ЦНС, санатории для детей с туберкулезной интоксикацией, в психоневрологические стационары — однократно.
Бактериологическое обследование бактерионосителей токсигенных штаммов С. diphtheriae проводят двукратно.
В период реконвалесценции после завершения антибактериальной терапии обследование проводят через 3 дня после окончания лечения, дважды с интервалом в одни сутки.
Материалом для исследования служат слизь, отделяемое и пленки из ротоглотки и носа. При наличии налета взятие материал производится с границы пораженной и здоровой ткани.
При подозрении на экстрабуккальные формы дифтерии проводят забор из очагов поражения (глаз, ухо, кожа, влагалище и др.), также следует брать материал из носа и зева. От больных материал должен быть взят в течение 3-4 ч (не позднее 12 ч) с момента поступления в стационар до назначения антибактериальной терапии.
При обследовании здоровых лиц на дифтерийное бактерионосительство исследуют слизь из зева (миндалины, дужки) и носа (нижние носовые ходы).
Для взятия проб используют стерильные ватные сухие тампоны. Исследуемый материал из каждого локуса забирают отдельным тампоном. Фибринозную пленку можно снять пинцетом.
Доставка материал в лабораторию осуществляется в течение 3 часов, в холодное время года, предохраняя от охлаждения.
При проведении обследования контингентов в отдаленных от бактериологических лабораторий районах, когда посев не может быть проведен в течение 3 ч, материал засевают у постели больного на транспортную полужидкую среду с теллуритом калия.
При использовании транспортной среды тампоны с материалом погружают в среду. Допускается инкубация посевов на транспортной среде до 18-20 ч, после чего делают высев на плотные питательные среды.
Культивирование материала на тампоне в транспортной среде, используемой в качестве среды обогащения, позволяет повысить показатель высеваеваемости коринебактерий дифтерии и применять иммунохимические методы для выявления токсина, использование которых сокращает сроки выдачи предварительного ответа.
С другой стороны, культивирование исследуемого материала на транспортной среде свыше 8 ч может способствовать размножению не только коринебактерий, но и сопутствующей микрофлоры, в частности S. aureus и S. epidermidis, соответственно более 90 и 10 % штаммов которых обладают теллуритредуктазой.
Для выделения возбудителя дифтерии проводят прямой посев материала, взятого сухим ватным тампоном или тампоном после культивирования в транспортной среде, на одну из элективноселективных сред для коринебактерий дифтерии.
В настоящее время предпочтение отдается кровяным теллуритовым средам. Все среды, используемые для первичного посева и последующей дифференциации выделенной культуры, подлежат предварительному контролю.
Через 24 часа инкубации на кровяных теллуритовых средах формируются колонии, окрашенные в черный или темно-серый цвет. Замедленное формирование подозрительных колоний (через 48 ч) в основном выявляется при исследовании материала, взятого у бактерионосителей.
Признаки, характерные для колоний биоваров gravis, mitis и intermedius, проявляются через 48 ч. Просмотр колоний осуществляют с помощью микроскопа бинокулярного стереоскопического (МБС).
В случае обнаружения подозрительных на коринебактерии дифтерии колоний их сразу же исследуют на токсигенные свойства. Необходимо изучать токсигенные свойства у нескольких колоний, т. к. из исследуемого материала могут быть выделены одновременно токсигенные и нетоксигенные клоны клеток коринебактерий дифтерии.
Для определения токсигенности используют тест Элека (традиционный или модификационный), основанный на методе встречной иммунодиффузии токсина и антитоксических антител (антитоксина) в специальных питательных средах (среда для определения токсина дифтерийного микроба или коринетоксагар) и являющийся одним из вариантов постановки реакции преципитации в геле.
При постановке теста Элека делают посев по 1\2 каждой из 2 изолированных колоний на среду для определения токсигенности и необожженной петлей — уколом в столбик среды Пизу; другую половину колонии отсевают в пробирку со скошенным 10% сывороточным агаром, из оставшихся нескольких 5-7 колоний формируют бляшки.
В случае множественного роста подозрительных колоний проводят определение уреазной активности в пробе Заксе. При обнаружении только одной колонии ее засевают на среду для определения токсигенности и, не обжигая петлю, в среду Пизу для определения цистиназы.
После учета результатов для дальнейшей идентификации используют культуру со среды Пизу или из бляшки.
У выросшей на сывороточном агаре культуры изучают морфологию, используя метод окраски по Леффлеру, биохимические свойства (глюкоза, сахароза, мальтоза, крахмал, декстрин), определяют уреазную активность.
При необходимости идентифицировать С. ulcerans используют тесты на уреазу и восстановление нитратов в нитриты.
Определение токсина является основным дифференциально-диагностическим тестом при бактериологическом исследовании на дифтерию.
Клиническое и эпидемиологическое значение токсигенных и нетоксигенных штаммов различно, поэтому чрезвычайно важно как можно быстрее получить точные данные о токсигенности штаммов, чтобы подтвердить диагноз дифтерии и воспрепятствовать распространению инфекции путем выявления бактерионосителей среди контактных лиц.
Критерием оценки специфичности преципитатов служит время появления и расположение линий преципитации испытуемого штамма по отношению к линиям преципитации контрольного токсигенного штамма. Специфические линии преципитации появляются через 24-48 ч, сливаются или направлены на слияние с линиями контрольного штамма.
Метод преципитации является высокоспецифичным, но его чувствительность составляет 0,5-1,0 мкг/мл по белку антигена. В связи с этим у штаммов коринебактерий дифтерии с низким уровнем продукции токсина специфические линии преципитации могут формироваться гораздо позже.
В практических лабораториях возможна гиподиагностика при определении токсигенности дифтерийных бактерий, что в основном обусловлено нестандартными питательными средами, повышенным содержанием железа в сыворотке, добавляемой в среду, недостаточными посевными дозами и малым содержанием антитоксина на бумажных носителях, а также другими отклонениями от методики постановки теста.
Одной из причин гиподиагностики при определении токсина методом иммунодиффузии является повышенное содержание железа в сыворотке лошади или крупного рогатого скота, которая является обязательным компонентом, добавляемым в среду для определения токсина дифтерийного микроба или коринетоксагар.
У токсигенных штаммов С. diphtheriae способность экспрессировать ДТ, а также интенсивность роста и размножения наблюдаются при малых концентрациях железа, что объясняется снижением потребности в источнике железа у токсиген-ных штаммов С. diphtheriae.
Экспрессия структурного tox-гена, носителем которого является профаг, находится под контролем хромосомного регуляторного гена dtxR. Ген dtxR является ответственным за синтез железо-зависимого белка-репрессо-ра dtxR.
В операторе гена tox имеется участок ДНК, с которым взаимодействует белок-репрессор, препятствуя транскрипции tox-мРНК и, следовательно, продукции дифтерийного токсина. При дефиците железа белок-репрессор инактивируется и начинается синтез токсина.
Неспецифические линии преципитации при определении токсина могут быть выявлены в основном при использовании лечебной антитоксической сыворотки или препаратов нестандартного антитоксина, содержащих антитела к клеточным антигенам С. diphtheriae.
Выявление цистиназной активности, способности окислять глюкозу и мальтозу, отношение к крахмалу, декстрину и отсутствие фермента уреазы наряду с характерными морфокультуральными признаками (полиморфизм, метахроматичное окрашивание, формирование колоний черного или серого цвета на кровяных теллуритовых средах) позволяют отнести выделенный микроорганизм к С. diphtheriae и одному из биоваров.
Выделенный в результате бактериологического исследования штамм C.diphtheriae является возбудителем дифтерии, если он обладает токсигенными свойствами.
Бактериологический метод диф-диагностики дифтерии позволяет в случае выделения токсигенного штамма, обладающего цистиназной активностью, дать окончательный документированный ответ через 48-72-96 часов, нетоксигенного штамма — через 72-96 часов.
Использование высококачественных питательных сред для первичного посева, определения токсигенности, биохимических свойств и микроскопа бинокулярного стереоскопического (МБС) для отбора колоний позволяет ускорить проведение бактериологического исследования и, соответственно, сократить сроки выдачи ответа до 48 часов.
Определение токсина у возбудителя дифтерии является основным дифференциальным тестом при диагностике дифтерии.
Для определения токсигенных свойств коринебактерий дифтерии разработаны и могут быть использованы разные методы, которые значительно различаются по специфичности, чувствительности и времени проведения исследования.
Основной метод определения токсина — иммунодиффузия в агаре — является высокоспецифичным, но позволяет выявлять ДТ только у 84,0 и 80,4 % штаммов, выделенных от больных и бактерионосителей соответственно.
Это связано с наличием у положительных в ПЦР и отрицательных в тесте Элека штаммов «молчащего» гена токсигенности. Роль таких штаммов в патологии пока неясна.
Биологические методы определения токсигенности, основанные на использовании 9-дневных куриных эмбрионов, перевиваемых культур клеток, пробах на вирулентность на морских свинках или кроликах, являются высокочувствительными, но трудоемкими и дорогостоящими.
Наиболее надежным тестом для определения токсина in vivo является подкожный тест на вирулентность на морских свинках.
При диагностике дифтерии комплексное микробиологическое исследование с использованием иммунохимических (РЛА, РКоА, РПГА, ИФА) методов позволяет значительно повысить эффективность лабораторной диагностики дифтерийной инфекции, ускорить обнаружение токсина.
Методы не являются обязательными при проведении диагностики дифтерии, но, по сравнению с традиционным (метод Элека), имеют преимущества по чувствительности и времени проведения анализа.
Современные варианты иммунохимического анализа, использование моноклональных антител к эпитопам дифтерийного токсина гарантируют и их высокую специфичность. Результаты, полученные этими методами, позволяют дать только предварительный ответ о наличии токсина.
Реакция пассивной гемагглютинации (РИГА) и иммуноферментный анализ (ИФА) могут быть использованы для выявления слаботоксигенных штаммов C.diphtheriae, определения уровня токсинопродукции, а также с целью сокращения сроков выявления ДТ.
Токсин обнаруживается в РИГА через 18 часов после посева культуры в жидкую питательную среду, содержащую сыворотку и теллурит калия, и через 3 ч при использовании бульона на основе сред 199 или «Игла» с 20 % сыворотки крупного рогатого скота.
Для проведения ИФА можно использовать культуру и непосредственно надосадок среды культивирования исходного клинического материала. Реакции являются высокочувствительными, и при их использовании токсин определяется в 98 % случаев.
Постановка РИГА основана на использовании эритроцитарного дифтерийного диагностикума, сенсибилизированного поликлональными антитоксическими антителами (антитоксином), способными взаимодействовать только с дифтерийным токсином.
При наличии в исследуемом образце токсина образуется специфический комплекс (ДТ—АТ), который выявляется в виде агглю-тината эритроцитов. Для постановки РПГА необходимо использовать стабильные стандартные диагностикумы, чувствительность которых не ниже 0,003 Lf/мл.
Метод позволяет определять относительное содержание токсина, умножая значение чувствительности диагностикума, выраженного в единицах Lf/мл, на обратное значение титра исследуемой пробы.
Для определения дифтерийного токсина методом ИФА разработан твердофазный вариант «сэндвич». В микробиологии тест-системы ИФА пдля диагностики дифтерии используют моноклональные антитоксические противодифтерийные антитела (МкАт) к концевому участку В-фрагмента дифтерийного токсина, адсорбированные на поверхности полистироловых планшет.
Адсорбированные на поверхности полистирола МкАт взаимодействуют с эпитопами В-фрагмента ДТ, если он присутствует в исследуемой пробе. К комплексу МкАт—ДТ добавляют конъюгат (К), представляющий собой поликлональные антитоксические антитела, конъюгированные с ферментом (пероксидаза хрена).
Свободные эпитопы ДТ взаимодействуют с поликлональными антитоксическими антителами, входящими в состав конъюгата, образуется комплекс МкАт—ДТ—К, который обнаруживают, добавляя смесь перекиси водорода с индикатором.
Результаты реакции учитывают визуально или с использованием спектрофотометра. Использование Fab-фрагментов МкАт гарантирует высокую чувствительность тест-системы. Метод позволяет определять токсин в концентрации 0,8-1,5 нг/мл или 0,0002 Lf/мл анатоксина и используется как в варианте «скрининг», так и для количественного определения ДТ.
Разработан метод определения ДТ на мембранах эпителиоцитов слизистой оболочки больных с помощью ИФА. С этой целью используют тест-систему «Дифтерия-монозим», в которую входят моноклональные антитела к СООН-концевой части В-фрагмента молекулы ДТ.
Данный метод позволяет выявить в течение 5-6 ч даже незначительное количество токсина, адсорбированного на мембранах клеток слизистой оболочки больных в 100 % случаев, провести раннюю дифференциальную диагностику дифтерии с клинически схожими заболеваниями.
РЛА и РКоА являются экспресс-методами обнаружения ДТ в культуральной жидкости.
Разработана аналитическая система для реализации экспресс-способа диагностики токсигенных штаммов, в которую входит дифтерийный латексный диагностикум и микроридер со сменными чипами.
Дифтерийный антительный диагностикум получен путем химической сорбции на поверхности полиакриламидных латексных частиц высокоавидных антитоксических антител с индексом авидности не менее 90 %.
Постановку РЛА осуществляют на чипах, результаты фиксируют в заданном или произвольном режиме в памяти компьютера в виде фотоизображений. Разработанный способ обладает высокой эффективностью, количественная оценка чувствительности метода составляет 0,001 Lf/мл.
В настоящее время большинство иммунохимических методов определения дифтерийного токсина могут применяться только в лабораториях научно-исследовательских учреждений, в которых они разработаны, т. к. соответствующих тест-систем производственного выпуска не существует.
Основным показателем напряженности противодифтерийного иммунитета является уровень дифтерийного антитоксина в сыворотке крови.
Для определения уровня антитоксина в сыворотке крови вакцинированных и больных используют иммунологические методы (РПГА, ИФА, методы Ремера и Йенсена, реакция нейтрализации токсина в клеточной культуре Vero).
Реакцию нейтрализации in vivo на морских свинках по Ремеру или на кроликах по Йенсену считают универсальными методами, или «золотым стандартом» определения антитоксических антител в сыворотке крови человека. Результаты реакции нейтрализации по Йенсену в 100 % случаев совпадают с результатами теста Элека.
Иммунологические методы могут быть полезными при необходимости дифференциации стертых и атипичных форм дифтерии и неспецифических ангин с сопутствующим носительством токсигенных штаммов.
Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) отличается высокой специфичностью и чувствительностью и является регламентированным методом для изучения напряженности противодифтерийного иммунитета.
Это двухкомпонентная сложная реакция, при которой противодифтерийные антитела, находящиеся в исследуемой сыворотке, взаимодействуют с дифтерийным анатоксином, который адсорбирован на эритроцитах.
В результате специфического взаимодействия антитоксических антител с анатоксином образуется комплекс, выявляемый в виде агглютината эритроцитов. За условно-защитный титр противодифтерийных антитоксических антител принимается титр 1:20. Существует и мнение, что нет четко определенного «защитного титра» антител, определяемого в этой реакции.
Результат РПГА подтверждается в реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА), реакция оценивается специфичной при снижении титра антител в РТПГА в 4-8 раз и более.
Реакцию нейтрализации (PH) на кроликах по Йенсену проводят с целью количественного определения антитоксина в крови больного. Метод основан на способности ДТ вызывать воспалительную реакцию и некроз при внутрикожном его введении кроликам.
In vitro исследуемую сыворотку смешивают с различными дозами стандартного токсина и затем вводят кроликам. Отсутствие или степень выраженности внутрикожной реакции зависит от количества антитоксина, содержащегося в крови больного.
С помощью метода Йенсена можно дифференцировать стертые и атипичные формы дифтерии от ангины другой этиологии с сопутствующим носительством токсигенных штаммов. Исследование крови проводят в первые 3-5 дней от начала заболевания.
Отсутствие антитоксина или его низкий уровень (менее 0,01 МЕ/мл) является доводом в пользу заболевания. Уровень антитоксина 0,5-1,0 МЕ/мл свидетельствует в пользу бактерионосительства.
Резкий подъем антитоксина у больных может быть обусловлен вторичным иммунным ответом в случае, если больной вакцинирован, что необходимо учитывать при оценке реакции. Определение титра антитоксина с диагностической целью проводят только до введения лечебной сыворотки. Метод Йенсена применяют редко, т. к. он остается трудоемким и дорогостоящим.
Соответственно рекомендациям ВОЗ для определения уровня антитоксина в сыворотке используют и реакцию нейтрализации токсина в культуре клеток Vero (перевиваемая культура клеток почек обезьян).
Дифтерийный токсин подавляет метаболическую активность и рост культуры клеток Vero. Тест основан на нейтрализации цитотоксического действия ДТ антитоксином, который содержится в сыворотке крови.
Реакцию нейтрализации проводят в микропланшете, в лунки которого с последовательно разведенной исследуемой сывороткой крови вносят ДТ в рабочей дозе и культуру клеток Vero, инкубируют в течение 5-6 дней при 37 °С.
Определение титра антител к дифтерийному токсину проводят по выявлению живых клеток культуры Vero или спектрофотометрически по снижению степени окрашиваемости субстрата митохондриальной дегидрогеназой.
При иммунном ответе на дифтерийный токсин или анатоксин в крови обнаруживаются лимфоциты (1,00-5,71 %), специфически связывающие эти антигены. Определение лимфоцитов, специфически связывающих дифтерийный токсин или анатоксин, проводят в реакции смешанного розеткообразования.
С этой целью в качестве контроля используют эритроциты, сенсибилизированные столбнячным анатоксином, что позволяет дифференцировать антигенсвязывающие лимфоциты (АСЛ) дифтерийной специфичности, обусловленной дифтерийной инфекцией или вакцинацией.
Обнаружение АСЛ дифтерийной специфичности и отсутствие АСЛ столбнячной специфичности является основным критерием для постановки диагноза дифтерийной инфекции.
Вакцинация дифтерийным анатоксином практически всегда осуществляется в комплексе со столбнячным, а иммуногенная активность последнего в АКДС и АДС больше, чем дифтерийного, поэтому в случаях, когда выявление АСЛ дифтерийной специфичности обусловлено вакцинацией, всегда будут обнаружены АСЛ и столбнячной специфичности.
В случае дифтерийной инфекции (заболевание или носительство), наоборот, выявляются АСЛ только дифтерийной специфичности.
Метод количественного определения токсина в составе циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) разработан для ранней диагностики дифтерии и иммунологического мониторинга в процессе лечения.
Для постановки метода используют сыворотку крови больного, из которой с помощью полиэтиленгликоля осаждают ЦИК и исследуют в иммуноферментной реакции согласно инструкции по применению «Дифтерия-монозим». ДТ в составе ЦИК обнаруживается в широком диапазоне концентраций: 0,45-22,3 Lf/мл.
Сроки обнаружения ДТ в ЦИК и его уровень имеют корреляцию с длительностью симптомов интоксикации и развитием осложнений дифтерийного процесса, что является важным для прогнозирования тяжести течения дифтерии и оценки эффективности терапевтических мероприятий.
источник