Микробиологическая диагностика дифтерии коклюша

Коклюш относят к инфекциям с весьма длительным течением, что делает возможным применение двух основных (бактериологический, серологический) и одного вспомогательного (микроскопический) методов диагностики.

Микроскопический метод является вспомогательным вариантом диагностики, так как коклюшные бактерии не имеют четких морфотинкториальиых особенностей.

Диагностическое значение имеет лишь 1 фаза существования коклюшных бактерий, соответствующих S — форме. В таком варианте патогенные штаммы возбудителя коклюша выделяются из организма. Это грамотрицательные, мелкие однородные, овоидной формы палочки без спор, но с нежными капсулами. При переходе во II и III фазы появляются полиморфные длинные или, наоборот, кокковидные бактерии. Для отличия названных стадий развития коклюшных палочек микроскопический метод незаменим.

II. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД

Выделение чистой культуры возбудителя является самым ранним и достоверным способом диагностики коклюша. Материалом для исследования служат мокрота, слизь и смывы из носоглотки больного, выделяемые цри кашле или искусственно собранные стерильными носоглоточными тампонами.

Возбудитель коклюша очень требователен к питательным средам. Поэтому для его выделения используются элективные среды: казеиново-угольный агар (КУА), Борде-Жангу и молочно-кровяной агар Осиповой.

КАЗЕИНОВО-УГОЛЬНЫЙ АГАР ИЛИ СРЕДУ КУА готовят из сухого субстрата, выпускаемого ИЭМ имени Н. Ф. Гaмалей. Перед употреблением 4-5 г сухого порошка растворяют в 100 мл дистиллированной воды, стерилизуют в автоклаве 30 минут при +110 °C и, соблюдая стерильность, разливают в чашки Петри или пробирки. Готовые среды можно хранить при +4, +10 °C до двух недель.

Колонии коклюшных бактерий на среде КУА появляются на 3-4 день. Они мелкие, выпуклые, блестящие, гладкие, серовато-кремовые. Колонии паракоклюшных бактерий такие же, но более крупные и дают коричневое окрашивание среды.

СРЕДА БОРДЕ-ЖАНГУ. 500 г мелко нарезанного очищенного картофеля заливают 1 л дистиллированной воды с 40 мл глицерина, варят до размягчения, а затем доводят дистиллированной водой до исходного объема, фильтруют через 2-3 слоя марли и дают отстояться до просветления. К 500 мл прозрачного картофельно-глицеринового экстракта добавляют 1,5 л солевого раствора, содержащего следующий комплекс солей: К₂НРО₄— 2,25 г; MgS0₄-0,075 г; КН₂Р0₄ -0,75 г; NaCl-7,5 г; КС1 -1,50 г. После этого прибавляют 60 г агар-агара (3%), кипятят на огне с асбестовой сеткой до растворения, устанавливают pH = 7,1-7,2, фильтруют и, разлив в соответствующую посуду, стерилизуют 30 минут при +110 °C или 25 минут при +120 °C. Это основа среды. Она может храниться очень долго.

Перед употреблением среду растапливают, охлаждают до 4-45 °C и добавляют 15-20% стерильной дефебринированной крови (барана, кролика, человека, лошади).

Готовая среда светло-вишневого цвета (без пузырьков воздуха). Для подавления посторонней микрофлоры добавляют 0,25-0,50 единиц пенициллина на 1 мл среды (1 ед. тормозит развитие коклюшных бактерий).

Колонии коклюшных бактерий на этой среде гладкие, блестящие, прозрачные, куполообразные с жемчужным или ртутным оттенком, окруженные зоной гемолиза. Колонии паракоклюшных бактерий крупные с коричневым окрашиванием среды и зоной гемолиза.

МОЛОЧНО-КРОВЯНОЙ АГАР ОСИПОВОЙ. 5% МПА расплавляют на водяной бане, добавляют 1% поваренной соли и смешивают с таким же количеством обезжиренного подогретого молока. Стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм. 40 минут. Горячую смесь отфильтровывают от свернувшегося молока, разливают по флаконам и автоклавируют при 0,5 атм. 20 минут. К остуженному до +45°, +50 °C агару добавляют 20% дефибринированной крови барана и пенициллин из того же расчета, что и в среде Борде-Жангу.

При выделении чистой культуры возбудителя следует учитывать большую требовательность к питательным средам, сравнительно медленное развитие колоний, отсутствие потемнения среды вокруг колоний, относительную биохимическую инертность, морфологическую однородность и способность агглютинироваться специфической противококлюшной сывороткой первой фазы.

При выделении чистой культуры коклюшных бактерий очень важно отдифференцировать их от часто встречающихся гемоглобинофильных бактерий паракоклюша и септического бронхита.

Антигенная дифференциация коклюшных и паракоклюшных бактерий должна проводиться с учетом общности и различий в их антигенном составе. При отсутствии необходимых монорецепторных сывороток отличием могут служить прочие, в частности культурально-биохимические признаки.

Отношение к мочевине выясняется пробой Закса, широко используемой при дифтерии.

Основные различия между коклюшными палочками и бактериями септического бронхита приведены ниже.

СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ДИАГНОСТИКИ КОКЛЮША

Начиная с 3-4 недели заболевания в крови больных начинают появляться антитела, которые можно обнаружить серологическим методом c помощью реакции агглютинации и реакции связывания комплемента по Борде-Жангу.

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ. Для выполнения реакции берут кровь больного в количестве 0,8-1 мл (из пальца или пятки ребенка), помещают на 10-15 минут в термостат, а после этого — в холодильник для уплотнения и отделения сгустка. Затем проводят центрифугирование, сьшоротку отсасывают и разводят физиологическим раствором от 1:5 до 1:2500. В качестве антигена используется изготовленный производственным способом диагностикум. Схема постановки реакции следующая.

Пробирки с разведенной сывороткой и добавленным в них диагностикумом помещают на 2 часа в термостат при 37 °C, а затем на сутки оставляют при комнатной температуре.

Агглютинация носит мелкозернистый характер. Поэтому учет ее производят с помощью агглютиноскопа.

Реакция считается положительной при четкой агглютинации с интенсивностью на ++ + + и + + +. Диагностическим является титр 1:40. Результаты серологических реакций имеют диагностическое значение только при изучении их в динамике, в связи с чем они повторяются не менее двух раз в течение болезни с интервалами 5-7 дней.

РСК ПО БОРДЕ-ЖАНГУ. Реакцию ставят по общепринятой методике. Особенностью ее является: длительное связывание (18-24 часа на холоду при +4 °C); в качестве диагностикума берется свежеприготовленная 1 млрд. взвесь 2-дневной культуры палочек коклюша, выращенных на 20% картофельно-глицериновом агаре и смытых физиологическим раствором. Омыв бактерий центрифугируют до полного просветления, осадок эмульгируют в дистиллированной воде для растворения случайно смытых со среды эритроцитов. После повторного центрифугирования готовят 1 млрд. суспензию культуры, инактивируют при +56 °C 1 час и подвергают титрованию.

Антиген титруют в присутствии комплемента.

Титром антигена считают то его максимальное количество, при котором еще возможен гемолиз (в данном примере — 0,15 мл). Рабочая доза должна быть на 20% ниже (0,12 мл).

После этого антиген используют для постановки РСК.

Рекомендуемая литература:

1. Дяченко С. С. Микробиологические методы диагностики инфекционных заболеваний. 1962; стр. 238-244.
2. Земсков М. В., Степанов И. И. Медицинская микробиология. Пособие для студентов медицинских институтов, 1962, стр. 182-185.
3. Руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных болезней, 1964, т. VI, разд. VI, стр. 349-374.
4. Руководство по микробиологической диагностике инфекционных заболеваний, под ред. проф. К. И. Матвеева и М. И. Соколова, 1964, стр. 438-449, 493, 497.
5. Сборник официальных материалов по лабораторному делу. Книга первая, 1961, стр. 338-343.
6. Ашмарин И. И. Практическая медицинская микробиология, 1966, изд. «Медицина», Уз. ССР, стр. 157.

Источник: Мотавкина Н.С., Пьянова Р.Е. Микробиологическая диагностика некоторых капельных инфекций и токсоплазмоза. Методическая разработка для студентов. ВГМУ, 1973

источник

Возбудители капельных инфекций.

Микробиология дифтерии.

Дифтерия — острое инфекционное заболевание преимущественно детского возраста, которое проявляется глубокой интоксикацией организма дифтерийным токсином и характерным фибринозным воспалением в месте локализации возбудителя. Название болезни происходит от греческого слова diphthera — кожа, пленка, так как в месте размножения возбудителя образуется плотная, серовато-белого цвета пленка.

Возбудитель дифтерии — Corynebacterium diphtheriae — был обнаружен впервые в 1883г. Э. Клебсом в срезах из пленки, получен в чистой культуре в 1884г. Ф. Леффлером. В 1888г. Э. Ру и А. Иерсен обнаружили его способность продуцировать экзотоксин, играющий главную роль в этиологии и патогенезе дифтерии. Получение в 1892г. антитоксической сыворотки Э. Берингом и использование ее с 1894г. для лечения дифтерии позволило значительно снизить летальность. Успешное наступление на эту болезнь началось после 1923г. в связи с разработкой Г. Районом метода получения дифтерийного анатоксина.

Возбудитель дифтерии относится к широко распространенной в природе группе так называемых коринеформных бактерий, к роду Corynebacterium. В морфологическом отношении эти бактерии характеризуются тем, что клетки булавовидно утолщены на концах (от греч. согуnе — булава), образуют ветвление, особенно в старых культурах, и имеют зернистые включения.

Род Corynebacterium включает в себя большое количество видов, которые делят на 3 группы:

1. Коринебактерии — паразиты человека и животных и патогенные для них.

2. Коринебактерии, патогенные для растений.

3. Непатогенные коринебактерии. Многие виды коринебактерий являются нормальными обитателя­ми кожи, слизистых зева, носоглотки, глаз, дыхательных путей, уретры и половых органов.

С.diphtheriae — прямые или слегка изогнутые неподвижные палочки длиной 1,0-8,0мкм и диаметром 0,3-0,8мкм, спор и капсул не образуют. Очень часто они имеют вздутия на одном или обоих концах, часто содержат метахроматические гранулы — зерна волютина (полиметафосфаты), которые при окрашивании метиленовым синим приобретают голубовато-пурпурный цвет. Для их обнаружения предложен особый метод окрашивания по Нейссеру. При этом палочки окрашиваются в соломенно-желтый, а зерна волютина — в темно-коричневый цвет, и располагаются обычно по полюсам. C.diphtheriae хорошо окрашивается анилиновыми красите­лями, грамположительна, но в старых культурах нередко обесцвечивается и имеет отрицательную окраску по Граму. Для нее характерен выраженный полиморфизм, особенно в старых культурах и под влиянием антибиотиков.

Дифтерийная палочка является аэробом или факультативным анаэробом, температурный оптимум для роста 35-37 °С (границы роста 15-40 °С), оптимальная рН 7,6-7,8. К питательным средам не очень требовательна, но лучше растет на средах, содержащих сыворотку или кровь. Избирательными для дифтерийных бактерий являются свернутые сывороточные среды Ру или Леффлера, рост на них появляется через 8-12 ч в виде выпуклых, величиной с булавочную головку колоний серовато-бело­го или желтовато-кремового цвета. Поверхность их гладкая или слегка зернистая, на периферии колонии несколько более прозрачные, чем в центре. Колонии не сливаются, вследствие чего культу­ра приобретает вид шагреневой кожи. На бульоне рост проявляется в виде равномерного помутне­ния, либо бульон остается прозрачным, а на его поверхности образуется нежная пленка, которая постепенно утолщается, крошится и хлопьями оседает на дно.

Особенностью дифтерийных бактерий является их хороший рост на кровяных и сывороточных средах, содержащих такие концентрации теллурита калия, которые подавляют рост других видов бакте­рий. Это связано с тем, что C.diphtheriae восстанавливают теллурит калия до металлического теллура, который, откладываясь в микробных клетках, придает колониям характерный темно-серый или черный цвет. Применение таких сред повышает процент высеваемости дифтерийных бактерий.

C.diphtheriae разлагают глюкозу, мальтозу, галактозу с образованием кислоты без газа, но не ферментируют (как правило) сахарозу, имеют цистиназу, не имеют уреазы и не образуют индола. По этим признакам они отличаются от тех коринебактерий, которые часто встречаются на слизистой оболочке глаза (C.xerosis), носоглотки (C.pseudodiphtheriticum).Деление дифтерийных бактерий на биотипы было произведено с учетом того, при каких формах течения дифтерии у больных они выделяются с наибольшей частотой. Тип gravis чаще выделяется от больных с тяжелой формой дифтерии и вызывает групповые вспышки. Тип mitis вызывает более легкие и спорадические случаи заболеваний, а тип intermedius занимает промежуточное положение между ними. Некоторые штаммы имеют настолько смешанные характеристики, что их трудно отнес­ти к какому-то определенному типу. Существенно, однако, что токсигенные штаммы всех трех биотипов продуцируют идентичный токсин, большинство нетоксигенных или слаботоксигенных штам­мов соответствует типу mitis.

Антигенная структуракоринебактерий очень гетерогенна и мозаична. У возбудителей дифтерии всех трех типов обнаружено несколько десятков соматических антигенов, по которым их делят на серотипы. В России принята серологическая классификация, по которой различают 11 серотипов дифтерийных бактерий, из них 7основных (1-7) и 4 дополнительных, редко встречающихся сероти­пов (8-11). Шесть серотипов (1, 2, 3, 4, 5, 7) относятся к типу gravis, а пять (6, 8, 9, 10, 11) -— к типу mitis. Недостатком метода серотипирования является то, что многие штаммы, особенно нетоксигенные. обладают спонтанной агглютинацией или полиагглютинабельностью.

ФаготипированиеC.diphtheriae. Для дифференциации дифтерийных бактерий предложены раз­личные схемы фаготипирования. По схеме М. Д. Крыловой с помощью набора из 9 фагов (А, В, С, D, F, G, Н, I, К) удается типировать большинство токсигенных и нетоксигенных штаммов типа gravis. С учетом чувствительности к указанным фагам, а также культуральных, антигенных свойств и способности синтезировать корицины (бактерицидные белки) М. Д. Крылова выделила 3 самостоя­тельные группы коринебактерий типа gravis (I-III). В каждой из них имеются подгруппы токсигенных и их нетоксигенных аналогов возбудителей дифтерии.

Резистентность возбудителей дифтерии.C.diphtheriae проявляет большую устойчивость к низ­ким температурам, но быстро погибает при высокой температуре: при 60 °С — в течение 15-20 мин, при кипячении — через 2-3 мин. Все дезинфицирующие вещества (лизол, фенол, хлорамин и другие) в обычно применяемой концентрации уничтожают ее за 5-10 мин. Однако возбудитель дифтерии хорошо переносит высушивание и может долго сохранять жизнеспособность в высохшей слизи, слюне, в частичках пыли. В мелкодисперсном аэрозоле дифтерийные бактерии сохраняют жизнеспособность в течение 24-48 ч.

В связи с тем, что дифтерийный токсин в организме больных оказывает избирательное и специфическое воздействие на определенные системы(поражаются в основном симпатико-адреналовая система, сердце, сосуды и периферические нервы), то очевидно, он не только угнетает биосинтез белка в клетках, но и вызывает другие нарушения их метаболизма.

Для обнаружения токсигенности дифтерийных бактерий можно использовать следующие способы:

1. Биологические пробы на животных. Внутрикожное заражение морских свинок фильтратом бульонной культуры дифтерийных бактерий вызывает у них некроз в месте введения. Одна минимальная смертельная доза токсина (20-30 нг.) убивает морскую свинку весом 250 г. при подкожном введении на 4-5 день. Наиболее характерным проявлением действия токсина является поражение надпочечников – они увеличены и резко гиперемированы.

2. Заражение куриных эмбрионов – дифтерийный токсин вызывает их гибель.

3. Заражение культур клеток – дифтерийный токсин вызывает отчетливый цитопатический эффект.

4. Метод твердофазного иммуноферментного анализа с использованием меченных пероксидазой антитоксинов.

5. Использование ДНК-зонда для непосредственного обнаружения tox-оперона в хромосоме дифтерийных бактерий.

Однако наиболее простым и распространенным способом определения токсигенности дифтерийных бактерий является серологический – метод преципитации в геле. Суть его состоит в следующем. Полоску стерильной фильтрованной бумаги размером 1,5*8см смачивают антитоксической противодифтерийной сывороткой, содержащей 500АЕ в 1 мл, и наносят на поверхность питательной среды в чашке Петри. Чашку подсушивают в термостате 15-20 мин. Испытуемые культуры засевают бляшками по обе стороны от бумажки. На одну чашку засевают несколько штаммов, один из которых, заведомо токсигенный, служит контролем. Чашки с посевами инкубируют при 37 С, результаты учитывают через 24-48 ч. Вследствие встречной диффузии в геле антитоксина и токсина в месте их контрольного токсигенного штампа. Полоски неспецифической преципитации (они образуются, если в сыворотке кроме антитоксина присутствуют в небольшом количестве другие антимикробные антитела) проявляются поздно, выражены слабо и никогда не сливаются с полоской преципитации контрольного штампа.

Эпидемиология. Единственным источником заражения является человек – больной, выздоравливающий или здоровый бактерионоситель. Заражение происходит воздушно-капельным, воздушно-пылевым путём, а также через различные предметы, бывшие в употреблении у больных или здоровых бактерионосителей: посуда, книги, бельё, игрушки и т.п. В случае инфицирования пищевых продуктов (молоко, кремы и т.п.) возможно заражение алиментарным путем. Наиболее массивное выделение возбудителя имеет место при острой форме заболевания. Однако наибольшее эпидемиологическое значение имеют лица со стертыми, нетипичными формами заболевания, так как они часто не госпитализируются и выявляются далеко не сразу. Больной дифтерий заразен в течение всего периода болезни и части периода выздоровления. Средний срок бактерионосительства у выздоравливающих варьирует от 2 до 7 нед, но может продолжаться и до 3 мес.

Особую роль в эпидемиологии дифтерии играют здоровые бактерионосители. В условиях спорадической заболеваемости именно они являются основными распространителями дифтерии, способствуют и сохранению возбудителя в природе. Средняя продолжительность носительства токсигенных штаммов несколько меньше (около 2 мес.), чем нетоксигенных (около 2-3 мес.).

Причина формирования здорового носительства токсигенных и нетоксигенных дифтерийных бактерий раскрыта не до конца, так как даже высокий уровень антитоксического иммунитета не всегда обеспечивает полное освобождение организма от возбудителя. Возможно, определенное значение имеет уровень антибактериального иммунитета. Первостепенное эпидемиологическое значение имеет носительство токсигенных штаммов дифтерийных бактерий.

Особенности патогенеза и клиники.К дифтерии восприимчивы люди любого возраста. Возбудитель может проникнуть в организм человека через слизистые оболочки различных органов или через поврежденную кожу. В зависимости от локализации процесса различают дифтерию зева, носа, гортани, уха, глаза, половых органов и кожи. Возможны смешанные формы, например, дифтерия зева и кожи и т. п. Инкубационный период — 2-10 дней. При клинически выраженной форме дифтерии месте локализации возбудителя развивается характерное фибринозное воспаление слизистой оболочки. Токсин, вырабатываемый возбудителем, сначала поражает эпителиальные клетки, а затем — близлежащие кровеносные сосуды, повышая их проницаемость. В выходящем экссудате содержите фибриноген, свертывание которого приводит к образованию на поверхности слизистой оболочки серовато-белого цвета пленчатых налетов, которые плотно спаяны с подлежащей тканью и при отрыве от нее вызывают кровотечение. Следствием поражения кровеносных сосудов может быть развитие местного отека. Особенно опасной является дифтерия зева, так как она может стать причиной дифтерийного крупа вследствие отека слизистой оболочки гортани и голосовых связок, от которого раньше погибало в результате асфиксии 50-60% больных дифтерией детей. Дифтерийный токсин, поступая в кровь, вызывает общую глубокую интоксикацию. Он поражает преимущественно сердечно-сосудистую, симпатико-адреналовую системы и периферические нервы. Таким образом, клиника дифтерии складывается из сочетания местных симптомов, зависящих от локализации входных ворот, и общих симптомов, обусловленных отравлением токсином и проявляющихся в виде адинамии, вялости, бледности кожных покровов, понижения кровяного давления, миокардита, паралича периферических нервов и других нарушений. Дифтерия у привитых детей, если и наблюдаетеся, то протекает, как правило, в легкой форме и без осложнений. Летальность в период до применения серотерапии и антибиотиков составляла 50-60%, ныне — 3-6%.

Постинфекционный иммунитетпрочный, стойкий, фактически пожизненный, повторные случаи заболевания наблюдаются редко — у 5-7% переболевших. Иммунитет носит главным образом антитоксический характер, меньшее значение имеют антимикробные антитела.

Лабораторная диагностика.Единственным методом микробиологической диагностики дифтерии является бактериологический, с обязательной проверкой выделенной культуры коринебактерий на токсигенность. Бактериологические исследования на дифтерию проводят в трех случаях:

1) для диагностики дифтерии у детей и взрослых с острыми воспалительными процессами в области зева, носа, носоглотки;

2) по эпидемическим показаниям лиц, находившихся в контакте с источником возбудителя дифтерии;

3) лиц, вновь поступающих в детские дома, ясли, школы-интернаты, другие специальные учреждения для детей и взрослых, с целью выявления среди них возможных бактерионосителей дифтерийной палочки.

Материалом для исследования служат слизь из зева и носа, пленка с миндалин или других слизистых оболочек, являющихся местом входных ворот возбудителя. Посевы производят на теллуриновые сывороточные или кровяные среды и одновременно на свернутые сывороточные среды Ру (свернутая лошадиная сыворотка) или Леффлера (3 части бычьей сыворотки + 1 часть сахарного бульона), на которых рост коринебактерий появляется уже через 8-12 ч. Выделенную культуру идентифицируют по совокупности морфологических, культуральных и биохимических свойств, по возможности используют методы серо- и фаготипирования. Во всех случаях обязательна проверка на токсигенность одним из указанных выше методов. Морфологические особенности коринебактерий лучше изучать, используя три метода окрашивания препарата-мазка: по Граму, Нейссеру и метиленовым синим (или толуидиновым синим).

Лечение.Специфическим средством лечения дифтерии является применение противодифтерийной антитоксической сыворотки, содержащей не менее 2000 ME в 1 мл. Сыворотку вводят внутримышечную в дозах от 10 000 до 400 000 ME в зависимости от тяжести течения болезни. Эффективным методом лечения является применение антибиотиков (пенициллины, тетрациклины, эритромицин и р.) и сульфаниламидных препаратов. С целью стимулирования выработки собственных антитоксинов мжно использовать анатоксин. Для освобождения от бактерионосительства следует использовать те антибиотики, к которым данный штамм коринебактерий высокочувствителен.

Специфическая профилактика.Основным методом борьбы с дифтерией является массовая плановая вакцинация населения. Для этой цели используются различные варианты вакцин, содержа­щих дифтерийный анатоксин: АКДС, АДС, АДС-М, АД и АД-М. АКДС — адсорбированная (на гидроокиси алюминия) взвесь коклюшных бактерий, убитых формалином или мертиолятом (20 млрд. в мл), 30 флоккулирующих единиц дифтерийного и 10 единиц связывания столбнячного анатоксина 1 мл. Этой вакциной прививают детей с 3-месячного возраста. Курс вакцинации состоит из трех внутримышечных инъекций по 0,5 мл с интервалом в 1,5мес. Первую ревакцинацию АКДС-вакциной проводят через 1,5-2 года после законченной вакцинации однократно в дозе 0,5 мл. Последующие ревакцинации проводят вакциной АДС-М однократно в дозе 0,5 мл в 9 и в 16 лет, а затем через каждые 10 лет — в возрасте 26, 36, 46, 56 лет.

Вакцина АДС-М содержит уменьшенное количество антигенов — 10 флоккулирующих единиц дифтерийногои 10 единиц столбнячного анатоксинов в 1 мл, адсорбированных на гидроокиси алюминия.

Вакцина АДС содержит только дифтерийный и столбнячный анатоксины (60 и 20 единиц соответственно в 1 мл) и применяется для прививок детей, переболевших коклюшем, а также возрасте старше 3 лет.

Вакцина АД — очищенный, концентрированный и адсорбированный на гидроокиси алюминия дифтерийный анатоксин (в 1 мл — 60 флоккулирующих единиц). АД применяют по эпидемическим показаниям к детям, переболевшим дифтерией, с положительной реакцией Шика или с низким титром антитоксических антител, выявленных в РПГА.

АД-М — содержит уменьшенное количество дифтерийного анатоксина (в 1 мл — 10 единиц). применяется по эпидемическим и иным показаниям лицам старше 12 лет. Максимальный эффект вакцинация дает, когда прививками охвачены не менее 95% детей.

источник

Методы, применяемые для лабораторной диагностики коклюша, представлены в схеме 14.

Схема 14.Микробиологическая диагностика коклюша

Микроскопический метод для диагностики коклюша и паракоклюша не применяется. В качестве экспресс-метода можно использовать ИФМ.

Бактериологический метод является основным в лабораторной диагностике коклюша и паракоклюша. Материал для исследования берут с помощью стерильного носоглоточного ватного тампона, у маленьких детей – тампоном на тонкой эластичной проволоке, а также методом «кашлевых пластинок» (в момент приступа кашля открытую чашку Петри с питательной средой подносят ко рту ребенка и держат в течение 6-8 кашлевых толчков). Для посева чаще всего используют казеиново-угольный агар (КУА), а также кровяной или картофельно-глицериновый кровяной агар (среда Борде-Жангу), содержащие пенициллин для подавления роста сопутствующей микрофлоры. Бордетеллы вырастают при температуре 37 0 С через 48-72 часа в виде мелких (около 1 мм в диаметре), выпуклых, блестящих колоний, напоминая капельки ртути (рис. 17). Из колоний готовят мазки и окрашивают их по Граму. При наличии в препаратах мелких овоидных грамотрицательных палочек ставят реакцию агглютинации с коклюшной и паракоклюшной сыворотками и делают пересев для выделения чистой культуры. Чистую культуру идентифицируют на основании изучения комплекса биологических свойств (табл. 17). Bordetella pertussis не растет на простых питательных средах, не меняет цвета специальных сред. Серотипирование проводится с помощью РА на стекле с адсорбированным факторными сыворотками. Фактор (антиген) 7 является родовым, общим для всех бордетелл, фактор 1 специфичен для Bordetella pertussis, фактор 14 – для Bordetella parapertussis фактор 12 – для Bordetella bronchiseptica.

Рис. 17. Колонии Bordetella pertussis на КУА (выпуклые, блестящие в виде капелек ртути)

Таблица 17.Биологические свойства некоторых представителей рода Bordetella

Обозначения: (+)- наличие признака, (-) – отсутствие признака.

Серодиагностика.Применяется РА и РСК (как правило, с парными сыворотками больных для констатации нарастания титра антител) с целью ретроспективного подтверждения диагноза и диагностики атипичных форм коклюша. Диагностический титр 1:20.

Генодиагностика. Разработана ПЦР для обнаружения ДНК возбудителя коклюша.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: На стипендию можно купить что-нибудь, но не больше. 8740 — | 7143 — или читать все.

195.133.146.119 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно

источник

План изучения темы. 1. Микробиологическая диагностика, лечение и профилактика дифтерии, коклюша и гемофильной инфекции

1. Микробиологическая диагностика, лечение и профилактика дифтерии, коклюша и гемофильной инфекции.

2. Особенности эпидемиологии, диагностики и лечения легионёллеза.

3. Микробиологическая диагностика, лечение и профилактика туберкулёза, лепры, актиномикоза.

После изучения темы студент должен уметь

1. Дифференцировать возбудителей дифтерии по морфологическим, тинкториальным, биохимическим и токсигенным свойствам.

2. Окрасить микропрепарат из мокроты больного туберкулёзом по Цилю-Нильсену и идентифицировать возбудителей туберкулёза.

3. Проводить идентификацию актиномицетов в тканях.

4. Классифицировать биологические препараты по теме занятия в соответствии с их назначением.

Контрольные вопросы

Возбудитель коклюша. Название по-латыни. Морфология: форма, взаимное расположение, споры, жгутики, капсула, отношение к окраске по Граму. Физиология: требовательность к питательным средам, факторы роста, основные питательные среды, время образования и характер колоний, ферментативная активность. Антигенная структура; токсинообразование, характеристика токсинов. Источник инфекции, способ передачи, патогенез. Микробиологическая диагностика на ранней стадии заболевания: методы забора материала, питательные среды, выделение чистой культуры, критерии для отличия возбудителей коклюша от других бордетелл. Препараты для специфической профилактики и лечения. Гемофильные бактерии. Название возбудителей по-латыни. Морфология, отношение к окраске по Граму. Культуральные свойства, антигенная структура. Факторы патогенности. Основные формы инфекций, вызываемых гемофильными бактериями. Бактериологическое исследование при диагностике гемофильной инфекции. Специфическое лечение и профилактика. Легионеллы. Название возбудителя по-латыни. Морфология, отношение к окраске по Граму. Особенности физиологии: температурный оптимум, требовательность к питательным средам, тип биологического окисления, ферментативная активность. Антигенная структура, серологические группы, виды. Экология легионелл: постоянное место обитания, условия, способствующие их размножению и накоплению. Основные формы легионеллёза. Пути передачи. Микробиологическая диагностика. Препараты для лечения. Возбудители туберкулёза. Кем открыт первый возбудитель? Чем объясняется название «микобактерии»? Название по-латыни. Морфология: форма, морфологические варианты, зёрна Муха, споры, жгутики, капсула. Особенности химического состава туберкулёзных бактерий и связанных с этим свойств. Какой способ окраски применяется и на каких свойствах возбудителя он основан? Способ биологического окисления, среды для культивирования, скорость роста. Виды туберкулёзных палочек: различия между ними по морфологии, отношению к глицерину, по патогенности для человека и лабораторных животных. Токсические вещества туберкулёзных палочек, их действие в организме. Туберкулёз у человека: источники инфекции, пути проникновения возбудителя в организм; какие органы поражаются чаще всего? Особенности иммунитета при туберкулёзе, механизм иммунитета, аллергия; к какому типу аллергических реакций относится? Микробиологический диагноз туберкулёза: материалы для исследований, способы обогащения мокроты, схемы исследования, ускоренные методы диагностики, дифференцировка видов туберкулёзных палочек и способы дифференциации от потенциально-патогенных микобактерий, определение лекарственной устойчивости. Кожно-аллергическая проба; что вводится в организм, что образуется на месте введения при положительном результате? На какое состояние организма указывает положительный результат? Для чего ставится аллергическая проба? Специфическая профилактика: название вакцины; что содержит, как получена? С какого возраста производят вакцинацию, способ введения вакцины. Какой вид иммунитета формируется? Перечислите препараты, применяемые для лечения туберкулёза. Характеристика потенциально-патогенных микобактерий: классификация, название основных видов по-латыни. Морфология и физиология. Источники инфекции и условия возникновения заболеваний. Дифференцировка от возбудителей туберкулёза. Препараты для лечения. Характеристика возбудителя лепры: название по-латыни, морфология и физиология, абсолютный паразитизм. Распространение лепры, клинические формы, микробиологическая диагностика. Препараты для лечения. Возбудители актиномикоза: название по-латыни двух видов; наиболее часто вызывающих заболевания, морфология и физиология. Актиномикоз у человека. Какие органы поражаются чаще всего? Материалы для исследования, методы исследования. Препараты для диагностики и лечения.

Работа студента на практическом занятии

1. Окончание исследования отделяемого раны. Изучите и опишите колонии в глубине агара в трубках Вейон–Виньяля; отберите и отметьте колонии, характерные для возбудителей анаэробной газовой инфекции; после распила трубки приготовьте мазки, окрасьте по Граму. На основании микроскопии мазков определите наличие сходства по морфологии (с учётом характера колоний) с возбудителями анаэробной газовой инфекции; сделайте вывод. Запишите предварительный диагноз в графу «Результат», в графе «Примечания» опишите, что необходимо ещё сделать для постановки окончательного диагноза.

2. Ознакомьтесь со схемами и запишите в дневник последова-
тельность исследований при диагностике коклюша, гемофильной инфек-
ции, легионеллёза.

3. Изучение посевов на носительство дифтерийной палочки. Изучите посев макроскопически, а затем приготовьте мазок со свёрнутой сыворотки, окрасьте по Нейссеру и кислым генциан-виолетом. После микроскопии приготовленного мазка и демонстрационного мазка из чистой культуры дифтерийной палочки (для сравнения) сделайте заключение: имеются ли палочки, сходные с дифтерийной, в изучаемом посеве.

4. Познакомьтесь по таблицам со схемой исследования при дифтерии, характером роста на теллуритовой среде колоний типов гравис и митис; методикой определения токсигенности дифтерийных палочек. Просмотрите и опишите «пёстрые» ряды культур дифтерийной палочки и дифтероидов, результаты проб на уреазу и цистиназу.

5. Изучение морфологии и культуральных свойств туберкулёзных палочек. Промикроскопируйте и зарисуйте демонстрационные препараты из культуры туберкулёзных палочек и микроколонии, полученные по методу Прайса. Изучите и опишите характер роста туберкулёзных палочек на питательных средах. Бактериоскопический диагноз туберкулёза: запишите в журнал данные из сопроводительной записки. Приготовьте из мокроты больного мазок, окрасьте по Цилю-Нильсену, микроскопируйте. Результаты занесите в журнал, сделайте вывод, заполните графу «Результат».

6. Изучение схемы микробиологической диагностики лепры. Микроскопируйте препарат из слизи носа больного лепрой.

7. Проведение бактериоскопической диагностики актиномикоза. Микроскопируйте и зарисуйте препарат «друза» в срезе из органа и мазок из чистой культуры актиномицетов. Изучите схему микробиологического диагноза актиномикоза.

8. Изучение диагностических, профилактических и лечебных препаратов, применяемых при коклюше, дифтерии, туберкулёзе. Посмотрите препараты, прочитайте этикетки, охарактеризуйте каждый препарат по схеме.

Дата добавления: 2014-10-15 ; Просмотров: 222 ; Нарушение авторских прав? ;

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

источник

Дифтерия – острое инфекционное заболевание, характеризующееся токсическим поражением сердечно-сосудистой и нервной систем, а также специфическим фибринозным (дифтеритическим) воспалением в месте входных ворот.

Возбудитель был открыт в 1883 г. Клебсом, в 1884 г. Ф. Леффлер выделил его в чистой культуре. В 1888 г. Ру и Йерсен получили дифтерийный токсин, а в 1895 г. Беринг и Ру независимо друг от друга получили противодифтерийную сыворотку. В 1923 г. Рамон разработали технологию получения дифтерийного анатоксина, а позднее получил противодифтерийную сыворотку. Н.Г. Габричевский применил противодифтерийную сыворотку с лечебной целью и организовал ее производство в России.

В род Corynebacterium входят около 60 видов. Согласно Международной классификации Берджи этот род разделен на 3 секции:

1) патогенные для человека и животных;

2) патогенные для растений;

Прямые или слегка изогнутые палочки размером 0,3 — 0,6 х 4 — 8 мкм, спор не образуют, имеют микрокапсулу, неподвижны.

Особенностями дифтерийной палочки является наличие булавовидных утолщениях на концах; палочки отличаются также полиморфизмом; характерно взаимного расположения бактерий в мазках – в виде цифр V,X, L (не полное расхождение при делении);

В толстых мазках располагаются в виде «пучка булавок». Булавовидные утолщения на концах связаны с наличием зерен волютина (тельца Бабеша-Эрнста) – производные нуклеиновых кислот, метахроматиновые гранулы полиметафосфата. Бактерии могут образовывать фильтрующиеся и L-формы.

Грамположительные микроорганизмы. При окраске по методу Нейссера тело клетки окрашивается в синий цвет, а зерна волютина — в желтый. Метод Леффлера окрашивает цитоплазму в голубой цвет, а зерна волютина – в темно-синий.

Возбудители дифтерии — факультативные анаэробы, отимальная температура их культивирования 37 о С, рН 7,3-8,0. Требовательны к питательной среде, для роста необходимо наличие цистина, гистидина, фенилаланина, метионина и т.д. Факторами роста являются Са 2+ , Mg 2+ , Fe 2+ , Zn 2+ , Mn 2+ , Cu 2+ . Для культивирования применяют сывороточные (среда Леффлера), среды с добавлением крови, хинозальную среду Бучина. Дифференциально-диагностические среды: теллуритовая среда (Конради, Трох, 1913г.), глицериновокровяная среда с теллуритом (среда Клауберг ΙΙ), сывороточно-теллуритовый агар с цистином (Тиндаль), теллурит-шоколадный агар Маклеода.

На среде Леффлера бактерии растут в виде серовато-кремовых колоний, по типу «шагреневой кожи».

На теллуритовых средах возбудитель образует серовато-черные колонии, что обусловлено восстановлением теллурита до металлического теллура, имеющего черный цвет и аккумулирующегося бактериями.

Дифтерийные палочки малоактивны, сбраживают с образованием кислоты глюкозу, мальтозу, галактозу, декстрин, не разлагают сахарозу, лактозу, маннит, восстанавливают нитраты в нитриты. Не гидролизуют мочевину (проба Закса отрицательная), не образуют индол. Разлагают цистеин (проба Пизу положительная).

По культуральным, биохимическим, патогенетическим и некоторым другим свойствам дифтерийные палочки разделяются на 3 биовара.

1) биовар митис, характеризуется свойствами:

ферментирует глюкозу, крахмал, мальтозу, не сбраживает сахарозу, гликоген, декстрин;

обладает цистиназной активностью;

уреазная проба отрицательная;

на средах с теллуритом образует мелкие гладкие блестящие черные колонии с ровным краем;

на жидкой среде дает равномерное помутнение и порошкообразный осадок;

дает зоны гемолиза на кровяных средах;

возбудители вызывают легкую спорадическую заболеваемость.

2) биовар гравис, характеризуется свойствами:

ферментирует глюкозу, крахмал,декстрин, мальтозу,

обладает цистиназной активностью;

уреазная проба отрицательная;

на средах с теллуритом формирует крупные, сухие, матовые, плоские, серо-черные колонии, приподнятые в центре, с радиальной исчерченностью и неровным краем (напоминают маргаритку);

на жидкой среде образуется пленка, помутнение, крошковидный или крупнозернистый осадок;

дает гемолиз на кровяных средах;

обладает выраженными токсигенными свойствами;

выделяется от больных с тяжелой формой дифтерии, вызывает групповые вспышки.

3) биовар интермедиус, характеризуется свойствами:

на средах с теллуритом образует мелкие сухие матовые серо-черные колонии с прозрачной периферией и неровным краем;

на жидкой среде дает помутнение с последующим просветлением и образованием мелкозернистого осадка;

гемолиз на кровяных средах отсутствует.

Дифтерийная палочка имеет 2 антигена

О – антиген (групповой), полисахарид клеточной стенки, термостабильный, дает перекрестные реакции с микобактериями и нокардиями;

К – антиген (типовой), капсульный, термолабильный, иммуногенный, видоспецифичный.

На практике серотипирование не применяется, однако выпускаются диагностические сыворотки для РА, РПГА.

Для идентификации используют фаготипирование (22 фага) и бактериоцинотипирование (25 бактериоцинов).

Токсины. Палочка выделяет токсин – дифтерийный экзотоксин. По силе он занимает 3-е место после ботулинического и столбнячного. Термолабильный, высокотоксичный, иммуногенный, протективный, обладает анестезирующим действием. Гистотоксин обладает дермонекротическими, гемолитическими свойствами. Синтезируется в виде неактивного предшественника — единой полипептидной цепи с молекулярной массой 61 кД. Активируется под действием собственной протеазы, которая разрезает полипептид на 2 связанные между собой дисульфидными связями пептида: А (21 кД) и В (39 кД). Пептид В выполняет акцепторную функцию – распознает рецептор, связывается с ним, формирует внутримембранный канал, через который проникает в клетку пептид А. Пептид А – это фермент, который обеспечивает перенос аденозиндифосфатрибозы из НАД на один из аминокислотных остатков (гистидина) белкового фактора элонгации EF-2. В результате модификации EF-2 утрачивает свою активность, что приводит к подавлению синтеза белка рибосомами на стадии транслокации. Токсин синтезируют только С. diphtheriae, лизогенные умеренным конвертирующим tox-профагом, интегрирующимся с помощью сайт-специфической рекомбинации. Оперон, кодирующий синтез токсина имеет промотор tox Р и 3 участка: tox S, tox А, tox В. Тox S – обеспечивает выход токсина через мембрану в периплазматическое пространство бактериальной клетки. Утрата клеткой профага или мутации в tox-опероне делают клетку малотоксичной.

Ферменты патогенности: гиалуронидаза, нейраминидаза, фибринолизин, каталаза – факторы инвазии, лейкоцидин – обеспечивает устойчивость к фагоцитозу;

Структурные и химические компоненты клетки – пили (способствуют адгезии на чувствительных клетках), микрокапсула (обеспечивает устойчивость к фагоцитозу), корд-фактор (6-6-дифосфоэфир трегалозы, коринемиколовая и коринемиколиновая кислоты, обладающие нарушает фосфорилирование в митохондриях), бактериоцины (корицины) кодирование синтеза которых передается плазмидами.

При нагревании до 60 о С палочки погибают за 10 мин, при 100 о С наступает мгновенная гибель. 5% раствор карболовой кислоты обеспечивает инактивацию через – 1 мин. Под действием прямого солнечного света палочка выживает несколько часов, в высохших пленках и кале – 3-4 мес., на предметах обихода и одежде сохраняется до 15 дней, на мягких игрушках – 3 мес., в воде и молоке – до 20 дней, в пыли – до 5 мес. Дифтерийные палочки чувствительны к пенициллину, тетрациклину, эритромицину.

Источник инфекции – больной человек, носитель или реконвалесцент.

Механизмы передачи инфекции:

аэрогенный (пути — воздушно-капельный и воздушно-пылевой);

контактный (путь — непрямой контактный).

Больной опасен (в смысле заражения) с последних дней инкубационного периода.

Входные ворота – слизистые оболочки носа, зева, гортани, трахеи, бронхов, конъюнктивы глаз, наружных половых органов; раневая поверхность, пупочная рана.

Инкубационный период – 2-14-20 дней.

Возбудители адсорбируются на чувствительных клетках, колонизируют эпителий. Секретируют гистотоксин, который инициирует развитие местного фибринозного воспаления, некроз эпителия, паретическое расширение сосудов с нарушением их проницаемости, отек тканей и выход фибриногена из сосудов. Фибриноген под влиянием тканевого тромбопластина, некротизированных тканей и атмосферным кислородом свертывается. На поверхности образуется фибринозная пленка. На многослойном плоском эпителии — плотная, спаянная с прилежащими тканями; на однослойном – тонкая, легко снимается. Разрастание пленок в воздухоносных путях может привести к асфиксии (истинный круп). Процесс сопровождают регионарные лимфадениты. Системное действие токсина приводит к гемодинамическим нарушениям. Развивается токсический миокардит и ранний паралич сердца. Возможно поражение канальцевого аппарата почек, некроз коркового слоя. В нервной системе – цитолиз нервных клеток с развитием поздних параличей мягкого неба, диафрагмы, сердца, блуждающего нерва. Смерть при дифтерии может наступить от раннего или позднего паралича сердца и диафрагмы, а также в результате истинного крупа (закупорки дыхательных путей оторвавшимися пленками).

У детей грудного возраста чаще развивается дифтерия зева (насмокр, слабая выраженность общих проявлений). Необходимо осматривать пупочную ранку для исключения местного процесса.

источник

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: мокрота, слизь из носоглотки. Материал берут стерильным ватным тампоном из носоглотки больного ребенка. Для взятия материала у малень­ких детей тампон, приготовленный на тонкой эластичной про­волоке, вводят через нос.

МЕТОДЫДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование(схема 14.2.2). Бактерио-скопический метод как таковой при диагностике коклюша не применяется. Для быстрого обнаружения и идентификации Bordetella pertussis используют иммунофлюоресцентный метод (см. ниже).

Бактериологическое исследование.Основной метод лабора­торной диагностики коклюша. Материал для посева берут с помощью носоглоточного тампона или методом «кашлевых пластинок». Для этого в момент появления кашля открытую чашку Петри с питательной средой подносят ко рту ребенка и держат в течение 6—8 кашлевых толчков. Правильное и раннее взятие материала позволяет выделить возбудителя в начальном периоде болезни от 80—90 % больных. Материал засевают на КУА или кровяные среды — картофельно-глицериновый кро­вяной агар (среда Борде—Жангу) и молочно-кровяной агар. В питательные среды добавляют пенициллин для угнетения роста посторонней микрофлоры. Колонии B.pertussis на указан­ных средах обычно появляются через 48—72 ч культивирова­ния. В.parapertussis — несколько раньше: через 24—72 ч. Борде-теллы образуют мелкие (диаметром около 1 мм) выпуклые влажные блестящие колонии. На КУА колонии имеют серова­то-кремовый цвет, а на среде Борде—Жангу приобретают жем­чужный или ртутный блеск. Колонии В.parapertussis более круп­ные. На среде Борде—Жангу и молочно-кровяном агаре они образуют ограниченную зону гемолиза. Из колоний, выросших на чашках, готовят мазки, окрашивают их по методу Грама и микроскопируют. При наличии в мазках овоидных грамотри-цательных палочек ставят ориентировочную реакцию агглюти­нации с коклюшной и паракоклюшной сыворотками. Затем подозрительные колонии пересевают в пробирки для дальней­шего изучения чистых культур.

Идентификацию выделенной культуры производят на осно­вании комплексного изучения морфологических, культураль-ных, биохимических и серологических свойств (табл. 14.2.2). В отличие от других бордетелл B.pertussis не растет на простом питательном агаре и не изменяет цвета специальных питатель­ных сред.

Таблица 14.2.2. Дифференциальные признаки Bordetella spp.

окраска
на агаре с тирозином + +

Ярко-коричневая окраска Изменение окраски:

КУА— Буро-коричневая —

кровяного агара — Потемнение —

видового (специфического) 1 14 12

Условные обозначения: (+) — наличие признака; (—) — отсутст­вие признака; цифрами обозначены номера антигенов.

Для определения уреазы в агглютинационные пробирки вносят 0,3 мл 2 % раствора мочевины, 0,3 мл густой суспензии испытуемой культуры и 2—3 капли 0,1 % спиртового раствора фенолфталеина. В положительном случае через 20—30 мин появляется малиновое окрашивание, указывающее на расщеп­ление мочевины уреазой.

Серологическую идентификацию бордетелл, дифференциа­цию видов и определение сероваров (серотипирование) прово­дят в реакции агглютинации с адсорбированными факторными сыворотками. При этом исходят из того, что антиген (фактор) 7 является родовым, а антиген (фактор) 1 присущ только В.рег-tussis, 14 — В.parapertussis и 12 — B.bronchiseptica.

При бактериологической диагностике коклюша может воз­никнуть необходимость дифференциации бордетелл от Haemo­philus influenzae. H.influenzae часто встречается на слизистой оболочке дыхательных путей и вызывает пневмонии и другие воспалительные заболевания дыхательных путей. В отличие от бордетелл H.influenzae растет только на кровяных питательных средах — кровяном агаре, «шоколадном» агаре Левинталя, со­держащих гемин и коэнзим дегидрогеназы. Бактериологичес­кое исследование продолжается не менее 5 дней.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие имолекулярно-биологические исследования. Иммуно­химические исследования. Метод ИФ: тампоном делают два мазка, высушивают их на воздухе и фиксируют на пламени. Один мазок обрабатывают флюоресцирующими противокок-

люшными антителами, другой — паракоклюшными антитела­ми. Препараты микроскопируют в люминесцентном микроско­пе, просматривая не менее 50 полей зрения. О положительном результате свидетельствует обнаружение темных бактериаль­ных клеток с четким светящимся венчиком.

Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих моле­кул можно поставить предварительный диагноз.

Серодиагностика.Реакции агглютинации и РСК применяют в основном для ретроспективного подтверждения диагноза и дифференциальной диагностики атипичных форм коклюша. Агглютинины в крови больных появляются на 3—4-й неделе заболевания в титрах 1:20 и выше. В условиях массовой вак­цинации детей против коклюша диагностическое значение имеет нарастание титра антител в динамике болезни, поэтому реакцию ставят повторно через 4—5 дней.

• Микробиологическая диагностика дифтерии

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: мазки со слизистой оболочки зева и носа, пленки с поверхности миндалин и но­соглотки. Материал берут двумя ватными стерильными тампо­нами, один из которых используют для приготовления мазков, другой — для посева.

Бактериоскопическое исследование(схема 14.2.3). Мазки ок­рашивают по методу Грама, метиленовым синим по Леффлеру, по Нейссеру. Для Corynebacterium diphtheriae характерно нали­чие полярно расположенных зерен волютина и расположение в виде буквы «V» (см. рис. 2.2.4). Corynebacterium pseudodiphth-eriae и дифтероиды не имеют зерен волютина или содержат их не на концах, а по длине палочки. Кроме того, сами бактерии располагаются в виде частокола. Применение люминесцентной микроскопии позволяет повысить эффективность исследова­ния. При этом C.diphtheriae можно отличить от других корине-бактерий по коричнево-красному свечению зерен волютина, которое они приобретают после окраски флюорохромом кори-фосфином. Цитоплазма этих бактерий дает зеленое или желтое свечение. Однако C.diphtheriae часто изменяют свою морфоло­гию, в частности при санации зева антибиотиками. В настоя­щее время бактериоскопическое исследование при дифтерии практически не используют в связи с его низкой надежностью (высокой частотой ложноположительных и ложноотрицатель-ных результатов).

Бактериологическое исследование.Является ведущим мето-

дом диагностики дифтерии. Материал засевают на кровяной агар и элективные питательные среды, содержащие теллурит: среда Клауберга (питательный агар с теллуритом натрия, гли­церином и дефибринированной кровью) и др. На средах с теллуритом задерживается рост кокков и другой микрофлоры зева, что способствует размножению возбудителя дифтерии. На теллуритовой среде C.diphtheriae образует черные колонии (рис. 14.2.1; на вклейке) за счет восстановления теллурита (биовар gravis формирует колонии серовато-черного цвета с радиальной исчерченностью поверхности, напоминающие цве­ток маргаритки, биовар mitis — круглые выпуклые колонии черного цвета). Типичные колонии, представленные грамполо-жительными палочками булавовидной формы с характерным расположением, содержащими зерна волютина, пересевают на кровяной агар для получения чистой культуры.

Для подтверждения диагноза дифтерии в первую очередь необходимо установить токсигенность выделенной культуры (способность к продукции дифтерийного токсина). Наличие токсина определяют с помощью различных серологических реакций (преципитации в агаре, ИФА и др.). Применяют также метод ПЦР, позволяющий обнаружить присутствие у выделен­ных бактерий fox-гена, контролирующего синтез дифтерийного токсина. До последнего времени общепринятым методом оп­ределения токсигенности являлась реакция преципитации в агаре с антитоксической противодифтерийной сывороткой. Методы ИФА и ПЦР, разработанные в последние годы, явля­ются более чувствительными и позволяют получить результат в течение 3—5 ч.

Определение токсигенности в реакции преципитации: в чашку Петри с питательным агаром, содержащим 15—20 % лошадиной сыворотки, 0,3 % мальтозы и 0,03 % цистина, кладут полоску фильтровальной бумаги, пропитанную анти­токсической противодифтерийной сывороткой, содержащей 5000 АЕ/мл. Чашку подсушивают при 37 °С в течение 30 мин и засевают исследуемые культуры в виде перпендикулярных к бумаге штрихов на расстоянии 0,6—0,8 см от края бумаги. В качестве контроля используют заведомо токсигенную куль­туру. Посевы инкубируют при 37 «С до следующего дня. При размножении токсигенной культуры в месте соединения ток­сина с антитоксическими антителами в плотной питательной среде образуется преципитат в виде белых линий — «усов» (см. рис. 10.1.7).

Выделенную культуру идентифицируют и дифференцируют от сходных с ней непатогенных коринебактерий по морфоло­гическим особенностям, культуральным и биохимическим признакам: пробы на цистиназу, уреазу, ферментация углево­дов и др. (табл. 14.2.3). В случае выделения нетоксигенной культуры ставят дополнительную реакцию агглютинации с

Условные обозначения: (+) — 85—100 % штаммов положитель­ны, (±) — 16—84 % штаммов положительны; (—) — отсутствие признака.

противодифтерийной сывороткой с целью выявления видоспе-цифического антигена С. diphtheriae.

Для определения цистиназы (проба Пизу) в столбик питательного агара с цистином уколом засевают исследуемую культуру. Посевы инкубируют при 37 «С до следующего дня. C.diphtheriae вызывают почернение среды по ходу посева (в ре­зультате образования сульфида свинца), вокруг которого появ­ляется зона коричневого цвета, а на глубине 1 см от поверх­ности агара в среде образуется коричневое «облачко».

Для определения уреазы (проба Закса) готовят спирто­вой раствор мочевины и раствор индикатора — фенолового красного, которые перед употреблением смешивают в соотно­шении 1:9 и разливают по 1—2 мл в агглютинационные про­бирки. Затем исследуемые бактерии петлей вносят и растирают по стенке пробирки. После 20—30-минутной инкубации при 37 «С наблюдают расщепление мочевины уреазой, в результате чего среда приобретает красный цвет.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования.Биохими­ческие и молекулярно-биологические исследова­ния. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения tax-гена C.diphtheriae с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить предварительный диагноз.

• Диагностические, профилактические и лечебные препараты

Преципитирующие антименингококковые сыворотки.Приме­няют с диагностической целью для обнаружения менингокок-кового антигена в спинномозговой жидкости (методом встреч­ного иммуноэлектрофореза).

Дата добавления: 2016-03-27 ; просмотров: 1282 | Нарушение авторских прав

источник