Методы окраски бактерий в мазке на дифтерию

Диагностика дифтерии основана на клинических данных с последующим подтверждением диагноза бактериологическим исследованием. Лабораторная диагностика дифтерии включает в себя ряд исследований, основным из которых является микробиологическое.

• Зачастую для постановки диагноза бывает достаточно тщательно собранного анамнеза заболевания и осмотра ротоглотки. Всякая задержка при установлении диагноза и назначения адекватного лечения увеличивает вероятность неблагоприятного исхода заболевания.
• Выделение культуры возбудителей с последующим определением у выделенных возбудителей токсикогенности является основным и единственным методом микробиологической диагностики дифтерии. Предварительный результат получается через 24 часа, через 48 часов получается результат исследования дифтерийных палочек на токсикогенность, через 72 часа определяется биовар возбудителя.
• Микроскопическое исследование при дифтерии нерационально.
• Серологическая диагностика основана на определении роста титра антибактериальных антител. Результаты получаются на 2-й неделе заболевания.
• При диагностике дифтерии применяется генетический метод (ПЦР), позволяющий определить ДНК бактерий.
• Реакция латекс агглютинации относится к экспресс-методам. Результат получается уже через два часа.
• Иммунофлуоресцентный анализ результативен. Однако его проведение должно осуществляться только высококвалифицированным персоналом.

Рис. 1. Пленка грязно-белого цвета и выраженный отек подкожной жировой клетчатки шеи — «бычья шея» — классические признаки дифтерии.

Микробиологическое исследование является основным методом лабораторной диагностики дифтерии.

Бактериологическое исследование проводится в следующих случаях:

• с целью диагностики дифтерии зева, носа и глотки у взрослых и детей,
• с целью выявления возможного бактерионосительства у лиц, которые поступают в детские дошкольные учреждения и специализированные учреждения для взрослых,
• с целью выявления заболевания среди контактирующих лиц.

Материал для исследования (мазок на дифтерию) собирается натощак или спустя 2 часа после еды. Для исследования используются дифтерийные пленки или кусочки тканей, расположенных по соседству, отделяемое из мест поражения и носоглоточная слизь.

Забор материала (мазок на дифтерию) осуществляется ватным тампоном. Корень языка прижимается шпателем. Ватным тампоном необходимо коснуться слизистой оболочки миндалин на границе пленки, дужек и задней стенки глотки. Далее тампон опускается в стерильную пробирку, не касаясь ее стенок.

В течение первых 3-х часов должен быть отправлен в лабораторию. При невозможности произвести посев в ближайшие 3 — 4 часа, забор материала осуществляется стерильным ватным тампоном, который смачивают в 5% растворе глицерина в изотоническом растворе хлорида натрия или 2% растворе теллурита калия.

Забор материала (мазок на дифтерию) осуществляется двумя ватными тампонами, один из которых используется для посева, другой — для микроскопии.

При подозрении на дифтерию необходимо оповестить сотрудников лаборатории, чтобы собранный материал был посеян на соответствующие среды (кровяной агар, среда Леффлера или теллуритовая среда).

Посев осуществляется на питательные среды (кровяной агар, среда Леффлера или теллуритовая среда). Теллурит в большой концентрации подавляет рост сопутствующей микрофлоры.

Рис. 2. На фото рост колоний палочки дифтерии на разных средах — кровяном агаре и теллуритовой среде.

При росте бактерий на кровяном агаре колонии приобретают беловатую окраску, они непрозрачные, округлые, выпуклой формы, 1 — 2 мм в диаметре, чаще маслянистой консистенции.

При росте бактерий на теллуритовых средах колонии серого цвета, выпуклые, края ровные. Через двое суток колонии приобретают темно-серый или черный цвет, они имеют металлический блеск, ровные или фестончатые края, поверхность гладкая или радиально исчерчена.

Идентификации разновидностей штаммов возбудителей дифтерии основана на способности бактерий расщеплять гликоген и крахмал. Для этих целей используется методика «длинного» ряда углеводов.

Принимая во внимание ферментативные признаки возбудителей и структуру колоний при росте на теллуритовых средах, выделяют 4 биотипа коринебактерий дифтерии: Corynebacterium diphtheriae gravis, Corynebacterium diphtheriae mittis, Corynebacterium diphtheriae intermedius и Corynebacterium diphtheriae belfanti.

Рис. 3. На фото слева колонии коринебактерий дифтерии гравис (Corynebacterium diphtheriae gravis). Они имеют большой размер, выпуклые по центру, радиально исчерчены, с неровными краями. На фото справа Corynebacterium diphtheriae mittis. Они небольшого размера, темной окраски, гладкие и блестящие, с ровными краями.

Токсикогенность возбудителей дифтерии определяется после выделения культуры бактерий. Для этих целей используется методика диффузной преципитации в геле и методика определения токсикогенности бактерий в живом организме (на морских свинках).

Лабораторная диагностика с применением микроскопии является второстепенным по значимости. Ввиду того, что возбудители дифтерии плохо впитывают красители, окраска по Граму считается не специфичной, однако она позволяет косвенно определить непатогенные коринебактерии, которые в мазке располагаются параллельно друг другу.

При окраске по Нейссеру выявляются характерные для дифтерийных палочек зерна Бабеша-Эрнста, которые располагаются на полюсах клеток, придавая им вид булавы.

В мазках патогенные дифтерийные палочки располагаются под углом друг к другу.

Для выявления зерен Бабеша-Эрнста применяется методика люминесцентной микроскопии. При окрашивании мазков корифосфином в микроскопе можно увидеть желто-зеленые тела бактериальных клеток с оранжево красными зернами волютина.

Рис. 4. Дифтерийные палочки под микроскопом. Окраска по Граму.

Рис. 5. На фото слева ложнодифтерийные палочки Гоффмана. Они часто обнаруживаются в носоглотке. Они толстые, короткие, располагаются в мазках параллельно друг другу. На фото справа патогенные бактерии. В мазке располагаются под углом друг к другу.

Серологические исследования позволяют обнаружить антибактериальные и антитоксические антитела. Значимым является обнаружение антибактериальных антител, так как содержание антитоксина изменяется в связи с применением с первых дней антитоксической сыворотки. Наиболее распространенными в настоящее время является реакция пассивной гемагглютинации (РНГА и РПГА).

Иммуноглобулины G и M говорят об остроте инфекционного процесса.

Иммуноглобулины G говорят о недавно перенесенном заболевании.

Иммуноглобулины М говорят об остропротекающей дифтерии.

При дифтерии титр антител со временем повышается. Понижение концентрации антител свидетельствует о выздоровлении больного.

Противодифтерийные антитела образуются после вакцинации. В крови привитого человека они циркулируют многие годы.

Благодаря применению методики флуоресцирующих антител стало возможным проведение качественного и количественного анализа внутриклеточных и поверхностных антигенов в образцах клеточных суспензий. Антигены визуализируются с помощью специфических антител с флуоресцентными маркерами. Использование данной методики доверяется только высококвалифицированному персоналу.

Методика ПЦР применяется для раннего выявления дифтерийных палочек, подтверждения диагноза и в случаях атипичной ангины. Обнаружение гена токсикогенности методом ПЦР является наиболее быстрым и надежным методом лабораторной диагностики дифтерии.

Рис. 6. ПЦР является наиболее быстрым и надежным методом лабораторной диагностики дифтерии.

• При токсическом поражении сердечной мышцы отмечаются изменения на электрокардиограмме, фонокардиограмме и УЗИ сердца. Исследуется активность целого ряда ферментов (лактатдегодрогиназа, креатинфосфокиназа, аспартатаминотрансфераза).
• Поражение почек при дифтерии проявляется в виде токсического нефроза. При подозрении на это осложнение производится общий анализ крови и мочи, биохимические исследования (определение креатинина, мочевины, остаточного азота), производится УЗИ почек.
• Токсическое поражение печени протекает с явлениями гипогликемии (снижение уровня глюкозы в крови) и глюкозурии (наличие глюкозы в моче).
• Развитие анемии связано с гемолизом эритроцитов.

к содержанию ↑

Наличие или отсутствие противодифтерийного иммунитета устанавливается при помощи внутрикожной пробы Шика, которая проводится с дифтерийным токсином.

В случае отрицательной реакции говорят о невосприимчивости к дифтерии. Реакцию Шика сегодня используют только по эпидпоказаниям. На ее проведение уходит несколько дней. Однако несмотря на это она помогает определить степень восприимчивости к дифтерии лиц, находившихся в контакте с больным и уточнить их иммунный статус.

Рис. 7. Реакция Шика проводится с дифтерийным токсином. Стандартный дифтерийный токсин в дозе 0,2 мл вводится внутрикожно в среднюю треть предплечья туберкулиновым шприцом.

источник

Возбудитель дифтерии относится к роду Corynebacterium (от лат. coryna — булава, diphthera — пленка). Бактерии имеют булавовидные утолщения на концах. К этому роду относятся патогенные для человека дифтерийные палочки и непатогенные виды — ложнодифтерийные палочки и дифтероиды, обнаруживаемые на слизистых оболочках и кожных покровах.

Возбудители дифтерии — Corynebacterium diphtheriae — были обнаружены Т. Клебсом (1883) и выделены в чистом виде Ф. Леффлером (1884).

Морфология. Возбудители дифтерии слегка изогнутые, тонкие палочки, размером 3-6 × 0,3-0,5 мкм, на концах которых имеются утолщения. В этих утолщениях имеются зерна волютина (зерна Бабеша — Эрнста). Бактерии дифтерии неподвижны, не имеют спор и капсул. Грамположительны. Они хорошо окрашиваются основными анилиновыми красителями, при этом волютиновые зерна окрашиваются интенсивнее. Для окраски обычно применяют щелочной метиленовый синий или кристаллический фиолетовый. Особенностью коринебактерий дифтерии является их полиморфность; в одной кулатуре встречаются различные по форме и размерам палочки: изогнутые, прямые, длинные, короткие, толстые, иногда коккобактерии. Характерно расположение бактерий в мазках — они обычно располагаются попарно под острым или тупым углом, в виде растопыренных пальцев и т. д. Расположение в мазках и наличие зерен волютина является дифференциально-диагностическим признаком при микроскопическом исследовании. Непатогенные представители рода коринебактерий — ложнодифтерийные палочки и дифтериоды чаще располагаются в виде частокола, зерна волютина у них могут отсутствовать либо быть на одном конце (см. рис. 4).

Культивирование. Коринебактерий дифтерии — факультативные анаэробы. Растут при температуре 35-37° С, рН среды 7,4-7,8. Они не размножаются на обычных питательных средах. Культивируют их на средах, содержащих кровь или сыворотку.

В конце XIX века французский ученый Э. Ру для культивирования бактерий дифтерии предложил использовать свернутую бычью или лошадиную сыворотку, а Ф. Леффлер рекомендовал добавлять к ней бульон (25%) и 1% глюкозу. На этих средах коринебактерий растут быстро, в течение 14-18 ч образуют несливающиеся выпуклые колонии кремового цвета (рост на скошенной среде напоминает шагреневую кожу). Однако отдифференцировать на этих средах дифтерийные палочки от ложнодифтерийных невозможно.

В настоящее время основными средами для выращивания являются среда Клауберга (содержащая сыворотку крови и теллурит калия), хинозольная среда Бунина, среда Тинсдаля и др. На основании культуральных и ферментативных свойств коринебактерий дифтерии делят на три биовара: гравис (gravis), ми тис (mitis), интермедиус (intermedins). Биовар гравис обычно находится в R-форме. На среде Клауберга бактерии этого биовара растут в виде крупных колоний 2-3 мм, серовато-черного цвета (так как восстанавливают теллурит в теллур), имеют изрезанные края, что придает им вид розетки. При прикосновении к колонии петлей она как бы рассыпается. На бульоне бактерии этого биовара образуют крошащуюся пленку и зернистый осадок.

Коринебактерии биовара митис (mitis) на среде Клауберга растут в виде небольших, гладких колоний (S-форма) черного цвета. На бульоне они дают равномерное помутнение.

Коринебактерии биовара интермедиус (intermedins) являются промежуточными. На среде Клауберга бактерии этого биовара чаще растут в виде блестящих, мелких, черных колоний (этот биовар встречается редко).

Ферментативные свойства. Все три биовара дифтерийных бактерий обладают ферментом цистиназой, расщепляющим цистин с образованием сероводорода. Эти свойства используются для дифференциации возбудителей дифтерии от непатогенных представителей этого рода (табл. 49).

Таблица 49. Свойства возбудителей дифтерии и близких к ним коринебактерий

Примечание. + положительная реакция (расщепляет); — отрицательная реакция (не расщепляет).

Возбудители всех трех биоваров расщепляют глюкозу и мальтозу до образования кислоты. С. gravis расщепляют крахмал. Это свойство отличает его от двух других биоваров. Коринебактерий дифтерии восстанавливают нитраты в нитриты, не образуют индол, не разлагают мочевину.

Коринебактерии дифтерии образуют нейраминидазу, гиалуронидазу и другие ферменты патогенности.

Токсинообразование. Вирулентные штаммы возбудителей дифтерии продуцируют экзотоксин. Химически он представляет собой термолабильный белок, состоящий из Двух фракций. Фракция В фиксирует токсин на чувствительных к нему тканях организма. Фракция А ответственна за токсическое действие. Силу токсина дифтерийных культур можно устанавливать «in vivo» на чувствительных к этому токсину морских свинках. Dim дифтерийного экзотоксина — минимальная смертельная доза, это минимальное количество яда, убивающее морскую свинку массой 250 г на 4-й день.

Наличие экзотоксина можно обнаружить также «in vitro» — на плотной питательной среде. Этот метод широко используется в практической работе. Дифтерийный экзотоксин малоустойчив. Он быстро разрушается под влиянием температуры, света и кислорода воздуха. После добавления к токсину формалина (0,3-0,4%) и выдерживания его при температуре 37-38° С в течение нескольких недель он переходит в анатоксин, который теряет ядовитость, но сохраняет антигенные свойства токсина. Токсины, образуемые различными штаммами, не различаются между собой и могут быть нейтрализованы дифтерийным антитоксином * .

* ( В настоящее время установлено, что все биовары коринебактерий могут быть токсигенными и нетоксигенными.)

Антигенная структура. У бактерий дифтерии имеется поверхностный термолабильный белковый антиген и типоспецифический полисахаридный О-антиген. Кроме этого, среди коринебактерий различают 19 фаговаров, которые учитываются при идентификации культур. С помощью фаговаров выявляют источник заболевания.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Возбудители дифтериии сравнительно устойчивы. Температура 60° С убивает их через 10-15 мин, 100° С — через минуту. В пленке они выдерживают нагревание до 90° С. На свернутой сыворотке при комнатной температуре сохраняются до 2 мес, на детских игрушках — несколько суток. Низкие температуры коринебактерий переносят хорошо. К высушиванию возбудители дифтерии довольно устойчивы. Дезинфицирующие вещества (3% раствор фенола, 1% раствор сулемы, 10% раствор перекиси водорода) убивают эти бактерии в течение нескольких минут.

Восприимчивость животных. В естественных условиях животные дифтерией не болеют. Из экспериментальных животных наиболее восприимчивы морские свинки и кролики. При внутрикожном или подкожном заражении у них развивается картина токсикоинфекции с образованием на месте введения воспаления, отека, некроза. В надпочечниках наблюдаются кровоизлияния.

Источники заболевания. Больные люди и бактерионосители.

Пути передачи. Воздушно-капельный путь, контактно-бытовой (через посуду, игрушки, книги, полотенца и т. д.).

Заболевание у человека: 1) дифтерия зева; 2) дифтерия носа.

Реже возникает дифтерия трахеи, бронхов, глаз, уха, влагалища и дифтерия поврежденной кожи.

Патогенез. Входными воротами являются слизистые оболочки дыхательных путей и поврежденная кожа. Попав на слизистую оболочку, возбудители дифтерии размножаются в месте внедрения и вызывают некроз ткани. Образуется пленка, тесно связанная с подлежащими тканями. На поверхности слизистой появляются грязно-серые или желтоватые налеты, состоящие из разрушенного эпителия, фибрина, лейкоцитов и коринебактерий дифтерии. При снятии пленки ватным тампоном или шпателем поверхность слизистой может кровоточить.

В процессе размножения коринебактерий дифтерии в некротических участках накапливается экзотоксин, который может привести к отеку слизистой оболочки и клетчатки. Со слизистой оболочки отек может распространяться на гортань, бронхи и вызвать явления асфиксии. Токсин, циркулирующий в крови, избирательно поражает сердечную мышцу, надпочечники и клетки нервной ткани.

Дифтерия — это токсикоинфекция. Тяжесть процесса зависит от степени токсигенности штамма и от защитных сил организма.

Иммунитет. Невосприимчивость обусловливается антитоксическим и антибактериальным иммунитетом. Грудные дети не болеют, так как у них имеется пассивный иммунитет, переданный от матери.

О наличии антитоксического иммунитета судят по реакции Шика. Для постановки реакции 1 /₄₀ Dlm (летальной дозы токсина для морской свинки), содержащегося в 0,2 мл изотонического раствора натрия хлорида, вводят внутрикожно в области предплечья. При отсутствии в крови антитоксина в месте введения через 24-48 ч появляется краснота и припухлость (до 2 см в диаметре). При наличии антитоксина припухлости и красноты нет (имеющийся в крови антитоксин нейтрализовал введенный токсин).

Перенесенное заболевание оставляет иммунитет. Однако в 6-7% случаев наблюдаются повторные заболевания.

Профилактика. Ранняя диагностика. Изоляция. Дезинфекция. Выявление носителей токсигенной дифтерийной палочки.

Специфическая профилактика осуществляется введением анатоксина. В СССР проводят обязательную вакцинацию детей вакциной АКДС — это комплексная вакцина, в которую входят дифтерийный и столбнячный анатоксин и взвесь убитых коклюшных палочек. Вакцинируют детей с 5-6 месяцев с последующей ревакцинацией. Для ревакцинации вводят вакцину без коклюшных палочек.

Специфическое лечение. Применяют противодифтерийную антитоксическую сыворотку. Доза и кратность определяется лечащим врачом, вводят также антимикробные препараты.

1. Какова морфология коринебактерий дифтерии и какие имеются биовары?

2. На каких средах выращивают бактерии дифтерии и каков характер роста?

3. Отношение к какому углеводу позволяет отличить биовар gravis от других биоваров дифтерии?

4. Каков путь передачи и где чаще локализуется возбудитель дифтерии у больного?

5. Каковы специфическая профилактика и специфическое лечение дифтерии?

Цель исследования: выделение возбудителя для постановки диагноза. Выявление бактерионосителей дифтерии по эпидемиологическим показаниям. Выявление экзотоксина у выделенной культуры.

1. Отделяемое слизистой оболочки зева.

2. Отделяемое слизистой оболочки носа.

3. Отделяемое слизистой оболочки глаза.

5. Отделяемое слизистой оболочки влагалища.

Материал для исследования зависит от локализации процесса.

Способы сбора материала

При любой локализации процесса обязательно исследует слизистую зева и носа. Материал собирают ватным тампоном, для чего используют металлическую проволоку, желательно алюминиевую, на один конец которой плотно накручивают вату, затем тампон монтируют в корковую пробку, помещают в пробирку и стерилизуют в печи Пастера при температуре 160° С 1 тампон течение часа или в автоклаве при температуре 112° С.

Примечания. 1. Материал собирают натощак либо не раньше чем через 2 ч после еды и не ранее чем через 4 дня после лечения антибиотиками или другими антибактериальными средствами. 2. Если материал берут из зева и носа, то пробирки с обоими тампонами надписывают и связывают вместе. Посевы делают раздельно и исследование материала из каждого тампона ведут как самостоятельную работу. 3 Материал, собранный сухим тампоном, должен быть посеян не позднее чем через 2-3 ч после забора. При необходимости транспортировки собранного материала тампон предварительно смачивают 5% раствором глицерина в изотоническом растворе натрия хлорида.

Первый день исследования

Чашки вынимают из термостата и просматривают. Рост бактерий на среде Клауберга может быть замедлен из-за наличия ингибиторов в среде. В этом случае чашки ставят в термостат еще на 24 ч.

Чашки вынимают из термостата, просматривают их с помощью лупы или стереоскопического микроскопа. При наличии подозрительных колоний часть их под контролем стереоскопического микроскопа выделяют на агар с 25% сывороткой и на столбик со средой Пизу для определения фермента цистиназы. Из другой части колоний ставят пробу на токсигенность.

При микроскопическом исследовании колоний, снятых со среды Клауберга, коринебактерии дифтерии теряют свою специфичность: отсутствует зернистость, изменяется величина, расположение сохраняется. При посеве их на среды с сывороткой морфологическая специфичность возбудителей дифтерии восстанавливается.

Проба на наличие фермента цистиназы и определение токсигенности являются обязательными при идентификации возбудителей дифтерии. Если результат этих опытов, проведенных с частью колоний со среды Клауберга, недостаточно четкий или отрицательный, то опыт повторяют, используя выделенную чистую культуру.

Проба на цистиназу. Проводят посев исследуемой культуры уколом в центр столбика среды Пизу. При положительной реакции через 18-24 ч по ходу укола наблюдается почернение, а вокруг черного стержня образуется темное облачко; почернение происходит в результате того, что фермент цистиназа расщепляет цистин, входящий в состав среды Пизу, и освободившаяся сера вступает в реакцию с ацетатом свинца — образуется сульфит свинца черного цвета. Дифтероиды и ложнодифтерийные палочки не содержат фермент цистиназу, поэтому при росте их на среде Пизу цвет среды не изменяется.

Определение экзотоксина. Проводят методом диффузной преципитации в геле. Метод основан на взаимодействии токсина с антитоксином. В тех участках агара, где эти компоненты взаимодействуют, образуется преципитат в виде закругленных линий.

Методика определения: в чашки Петри разливают растопленный и охлажденный до 50° С агар Мартена рН 7,8 (на агаре Мартена лучше продуцируется экзотоксин). Количество агара в чашке должно быть не более 12-15 мл, чтобы сохранить прозрачность, — в толстом слое линии преципитации плохо видны. После застывания агара накладывают полоску стерильной фильтровальной бумаги, смоченной противодифтерийной антитоксической сывороткой.

Испытуемую культуру засевают «бляшками». Посев производят петлей. Диаметр бляшек 0,8-1,0 см. Расстояние бляшек от края полосок бумаги 0,5-0,7 см, между двумя бляшками испытуемой культуры засевают бляшки заведомо токсигенного штамма. Испытуемую культуру считают токсигенной, если линии преципитации четки и сливаются с линиями преципитации контрольного (токсигенного) штамма. Если линии преципитации перекрещиваются с линиями контрольного штамма или отсутствуют, выделенную культуру считают нетоксигенной (рис. 50).

Рис. 50. Выявление экзотоксина C.Diphtheriae методом диффузной преципитации в агаре. 1 — бляшки нетоксигенного штамма (линии преципитации перекрещиваются); 2 — бляшки токсигенного штамма (линии преципитации соединяются)

Приготовление полосок бумаги. Из фильтровальной бумаги нарезают полоски размером 1,5×8 см, заворачивают по несколько штук в бумагу и стерилизуют в автоклаве при температуре 120° С в течение 30 мин. Перед постановкой опыта стерильным пинцетом вынимают одну полоску, укладывают ее в стерильную чашку Петри и смачивают противодифтерийной антитоксической сывороткой. Предварительно сыворотку разводят так, чтобы в 1 мл содержалось 500 АЕ (антитоксических единиц). Бумажку смачивают 0,25 мл сыворотки (125 АЕ) и помещают на поверхность среды. Затем делают посевы указанным выше способом. Все посевы ставят в термостат. Учет результатов производят через 18-24 и 48 ч.

Вынимают посевы из термостата, учитывают результат. Делают мазки из культуры, выросшей на среде с сывороткой, и окрашивают их синим Леффлера.

Наличие в мазках характерных по морфологии палочек, черного с облачком стержня в среде Пизу и линий преципитации в агаре позволяет дать предварительный ответ: «Обнаружены коринебактерии дифтерии». Исследование продолжают. При отсутствии линий преципитации в агаре или их недостаточной четкости исследование на токсигенность обязательно повторяют с выделенной чистой культурой.

Для окончательной идентификации выделенной культуры и определения биовара возбудителя производят посев на глюкозу, сахарозу, крахмал и бульон с мочевиной (для выявления фермента уреазы). Посев на среды делают обычным способом.

Проба на уреазу. Выделенную культуру засевают на бульон с мочевиной и индикатором (крезоловый красный) и ставят в термостат. Уже через 30-40 мин можно учитывать результат: при посеве истинных возбудителей дифтерии цвет среды не изменяется, так как они не содержат уреазу. Псевдодифтерийные палочки расщепляют мочевину и изменяют индикатор — среда приобретает малиново-красный цвет.

Производят учет результатов (табл. 50).

Таблица 50. Ферментативные свойства выделенных возбудителей

1. Какой материал исследуют для выявления возбудителя дифтерии?

2. Как собирают материал для исследования на дифтерию из зева и носа?

3. Что нужно сделать с тампоном, если собранный материал необходимо транспортировать?

4. При помощи какого прибора изучают колонии на среде Клауберга?

5. Какие исследования проводят для окончательной идентификации выделенной культуры?

6. Какими методами определяют токсигенность коринебактерий дифтерии?

1. Возьмите у преподавателя проволоку и вату и приготовьте 10 тампонов, вмонтируйте их в корковую пробку, вставьте в пробирку и простерилизуйте.

Внимание! Перед стерилизацией проверьте, достаточно ли плотно накручен тампон.

2. Возьмите у преподавателя стерильные тампоны и произведите забор материала друг у друга из зева и носа (разными тампонами).

3. Изучите по табл. 49 свойства возбудителей дифтерии и близких к ним коринебактерий.

4. Поставьте пробу на токсигенность. Бляшки сделайте петлей без культуры.

5. Зарисуйте ход исследования и положительный и отрицательный результат пробы на токсигенность.

Теллуровая среда Клауберга: первая смесь — предварительно за 1,5 мес готовят смесь из 20 мл бараньей или лошадиной крови и 10 мл глицерина. В день приготовления среды готовят две другие смеси; вторая смесь — 50 мл МПА рН 7,5 растапливают и охлаждают до температуры 50° С, после чего прибавляют 2,5 мл первой смеси; третья смесь — смешивают 17 мл бараньей крови и 33 мл дистиллированной воды (смесь приготавливают стерильно), подогревают на водяной бане до температуры 50° С. Соединяют вторую и третью смеси, прибавляют 4 мл 1% раствора теллурита калия К₂ТеО₃, быстро все перемешивают и разливают в чашки. Среда прозрачная, имеет цвет красного вина.

Среда Пизу. К 90 мл расплавленного 2% МПА (рН 7,6) добавляют 2 мл раствора цистина (1% раствор цистина в 0,1 н. растворе гидроксида натрия), тщательно перемешивают и добавляют такой же объем 0,1 н. раствора серной кислоты. Среду стерилизуют 30 мин при температуре 112° С. К расплавленной и охлажденной до 50° С среде добавляют 1 мл 10% раствора ацетата свинца, стерилизованного двукратно текучим паром, перемешивают и добавляют 9 мл нормальной лошадиной сыворотки. Среду стерильно разливают в маленькие пробирки по 2 мл. Посев производят уколом.

Среда Бунина. Сухую хинозольную среду добавляют к 100 мл холодной воды (рН 7,6-7,8), размешивают и нагревают на слабом огне до расплавления агара (по прописи на этикетке). Затем среду кипятят 2-3 мин до образования пены, после чего среду остужают до 50° С и добавляют 5-10 мл стерильной дефибринированной крови. Среду перемешивают и разливают в чашки Петри. Готовую среду можно сохранять 3-4 дня при температуре 4-10°.

Среда Тинсдаля. К 100 мл 2% питательного агара, расплавленного и охлажденного до 50° С, добавляют: 1) 12 мл 1% раствора цистина на 0,1 н. растворе серной кислоты; 2) 12 мл 1% раствора гидроксида натрия; 3) 1,8 мл 2% раствора теллурита калия; 4) 1,8 мл 2,5% раствора гипосульфита натрия, 20 мл нормальной лошадиной или бычьей сыворотки. После добавления каждого ингредиента среду тщательно перемешивают. Чашки со средой хранят 3-4 дня при 10° С.

источник

Материалом для исследования при дифтерии могут быть пленки и слизь из зева и носа, а при редких локализациях дифтеритических воспалений — из глаза, уха, с поверхности раны и кожи. Отделяемое забирают сухим ватным тампоном или смоченным 5% раствором глицерина в физиологическом растворе с рН-8.

До этого уровня его доводят 20% раствором однозамещенного фосфорно-кислого натрия (Na₂HPO₄).

Исследование осуществляют не позднее 3-4 часов после забора, с поэтапной выдачей ответов о подтверждении диагноза.

Морфологические и тинкториальные признаки дифтерийных бактерий настолько своеобразны, что микроскопический метод может примениться как самостоятельный или предварительный к бактериологическому анализу. Кроме того, он дает представление и о сопутствующей микрофлоре.

Для выявления дифтерийных палочек могут быть использованы три метода окраски: Грама, Леффлера, Нейccера.

МЕТОД ГPAМA позволяет выявить способность дифтерийных бактерий вступить во взаимодействие с генцианвиолетом. Дифтерийные бактерии грампозитивиы, но это свойство непостоянно. При контакте с антибиотиками, при длительном пребывании в голодной среде резко изменяется обмен веществ и грамположительность микробов теряется. Поэтому ориентироваться на этот признак нельзя.

МЕТОД НЕЙССЕРА — наиболее ценный дифференциально-диагностический способ, позволяющий не только окрасить микроорганизмы, но и выявить полярно вкрапленные зерна волютина и характерное расположение бактериальных особей под углом.

РЕАКТИВЫ

• УКСУСНОКИСЛАЯ СИНЬКА НЕЙСЕРА: метиленовая синька -0,1 г, спирт 96° -2 мл; 5% раствор ледяной уксусной кислоты в дистиллированной воде — 50 мл.
• РАСТВОР ЛЮГОЛЯ: 2 г йодистого калия растворить в 10 г дистиллированной воды. Затем к этому раствору прибавить; 1 г кристаллического йода и добавить воды до 300 мл.
• РАСТВОР ХРИЗОИДИНА: 2 г хризоидина на 300 мл горячей дистиллированной воды.

Вместо раствора хризоидина можно использовать раствор везувина (краситель бисмаркбраун): везувин-1 г; 96° cпирт-10 мл; кипящая дистиллированная вода-100 мл.

ТЕХНИКА ОКРАСКИ

1. Синька Нейссора- 1 минута
2. Раствор Люголя — 30 секунд.
3. Ополаскивание дистиллированной водой.
4. Докраска расвором хризоидина или везувина — 10-15 секунд.

Тело микробной клетки окрашивается в желтый или желто-коричневый цвет, зерна волютина — коричнево-черного цвета.

ОКРАСКА ПО СПОСОБУ ЛЕФФЛЕРА

Метод Леффлера прост, но по своим дифференциально-диагностическим возможностям он не уступает сложному способу Нейссера. Поэтому он применяется значительно чаще.

Для окраски нужен один реактив — щелочная метиленовая синька Леффлера следующего состава: Дистиллированная вода — 99 мл; 1% раствор едкого калия (КОН) — 1 мл; профильтрованный спиртовой раствор метиленовой синьки (0,5 г синьки на 30 мл спирта) — 30 мл.

Окраска осуществляется 1-2 минуты. При этом тело бактерий приобретает бледно-голубой цвет, зерна волютина — синий или cине-черный.

При выполнении микроскопического исследования важно отличить истинные дифтерийные бактерии от дифтериеподобных палочек Гоффмана и бактерий ксерозис.

II. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД

Дифтерийные бактерии требовательны к питательным средам. Для их выделения и накопления используется комплекс специальных элективных и дифференциально-диагностических сред.

СВЕРНУТАЯ СЫВОРОТКА РУ: 3 мл стерилыной сыворотки лошади (быка или человека) вносят в пробирку, укладывают с наклоном в 45-50° в свертывателе Коха, предварительно нагретом до +50 °C. Затем температуру доводят до 80° и прогревают в течение 1 часа. Готовую среду охлаждают, ставят в термостат для проверки стерильности. В случае прорастания среды последнюю повторно прогревают при + 80 °C в течение 2 часов.

На этой среде бактерии дают шероховатые R-формы, напоминающие в комплексе шагреневую кожу.

ТЕЛЛУРИТОВЫЕ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Дифтерийные бактерии обладают выраженной способностью восстанавливать теллуровокислый калий до металлического теллурита. Для выявления этой способности в среды добавляется дифференцирующий компонент-2% раствор теллурита калия следующего состава: дистиллированная вода-100 мл; теллурит калия (K₂FeO₄)-2 г. Раствор стерилизуют кипячением 30 минут. Для приготовления сред можно использовать также готовый 2% раствор теллурита калия в 40% глицерине, выпускаемый в ампулах для клинических теллуритовых проб.

СЫВОРОТОЧНО-ТЕЛЛУРИТОВЫИ АГАР: к 80 мл расплавленного и охлажденного до +50 °C 2% МПА добавляют 20 мл лошадиной или 30 мл бычьей сыворотки и 1 мл 2% раствора теллурита калия. Готовую среду разливают в стерильные чашки.

КРОВЯНО-ТЕЛЛУРИТОВЫЙ АГАР: к 100 мл расплавленного и охлажденного до +50 °C 2-3% МПА добавляют 5-10% дефибринированной крови человека (донорской, плацентарной) или животного (крупного рогатого окота, кролика, барана, морской свинки) и 1 мл 2% теллурита калия, смешивают и разливают в чашки.

СРЕДА КЛАУБЕРГА: 100 мл 3% МПА расплавляют, добавляют 3 мл 2% теллурита калия, 10 мл глицериновой смеси и 50 мл лаковой крови. Последнюю готовят следующим образом: к 34 мл дистиллированной стерильной воды добавляют 16 мл дефибринированной крови (любой). Состав глицериновой смеси: к 40 мл дефибринироваиной крови крупного рогатого скота или человека добавляют 20 мл химически чистого стерильного глицерина и выдерживают до употребления в холодильнике 3-6 недель.

По характеру роста на теллуритовых средах удается отдифференцировать дифтерийные бактерии как внутри вида, так и от других микроорганизмов.

ХИНОЗОЛЬНУЮ СРЕДУ БУЧИНА готовят по следующей прописи: на 100 мл воды добавляют 3 г хлористого натрия, 1,5 г, глюкозы, 1 мл 3% раствора цистина в 1% растворе соды, 2 мл водного раствора хинозола (1:1000), 0,08 г индикатора водноголубого, 4,0 сухого питательного агара. Смесь растворяют при нагревании. Устанавливают pH = 7,4-7,6. Охлаждают до +50 °C, добавляют 5 мл дефибринированной крови и, соблюдая стерильность, разливают в чашки Петри.

СРЕДА ТИНСДАЛЯ-САДЫКОВОЙ является селективной средой для дифтерийных бактерий. Посторонняя микрофлора на ней не растет или развивается очень скудно. Другим преимуществом среды является то, что она не нуждается в добавлении крови. Ее состав следующий: 100 мл мартеновского или обычного мясопептонного агара, 15-20 мл нормальной лошадиной сыворотки, 12 мл 1% раствора цистина (сначала растворить в 0,1 N р-ре NaOH, потом в воде), 11-12 мл 0,1N HCl (для нейтрализации NaOH); 1,8 мл 2% раствора теллуристого калия и 1,8 мл 2,5% раствора гипосульфита натрия.

Дифтерийные бактерии обладают рядом характерных биохимических признаков. Они хорошо ферментируют глюкозу и крахмал, высвобождают значительные количества активной цистиназы, выявляемой в пробе Пизу. Вместе с тем, названные микроорганизмы инертны в отношении сахарозы и не имеют фермента уреазы, обнаруживая отрицательную пробу Закса. Очень важным видовым признаком этих микробов является токсигенность. С эпидемиологической точки зрения, весьма существенное значение имеет серологическая неоднородность дифтерийных бактерий и наиболее широкое участие в распространении инфекции I и VI серологических типов. Это необходимо учитывать при диагностике дифтерии.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ УГЛЕВОДОЛИТИЧЕСКОИ АКТИВНОСТИ дифтерийных бактерий производится на комплексе углеводных сред, состоящих из 1% пептонной воды с pH-7,6, в которую добавляют различные углеводы: 0,5% сахарозы, 0,5% глюкозы, 0,2% крахмала. В качестве индикатора используется реактив Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью).

Среды разливают по 2 мл и стерилизуют текучим паром 3 дня подряд :по 30 минут. До работы они бесцветны, при ферментации углеводов — краснеют.

На углеводных сывороточно-водных средах, основа которых состоит из дистиллированной воды (80 мл) и сыворотки (20 мл), углеводолитические свойства культур проявляются плохо и ферментация углеводов идет очень медленно.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

ПРОБА ПИЗУ — ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТА ЦИСТИНАЗЫ

К 90 мл расплавленного 2% МПА с pH -7,6 добавляют 2 мл раствора цистина (1% раствор цистина в 0,1N растворе NaOH). Среду стерилизуют при +112 °C 30 минут. K расплавленной и охлажденной до +50 °C среде добавляют 1 мл 10% уксуснокислого свинца (простерилизованного дважды текучим паром) перемешивают и добавляют 9 мл нормальной лошадиной сыворотки. Среду стерильно разливают в маленькие пробирки по 2 мл. Посев производится уколом.

Вместо МПА с цистином можно использовать 2% МПА, приготовленный на переваре Хоттингера, с содержанием аминного азота в 250 мг%.

Дифтерийные бактерии активно перерабатывают белки и цистин с высвобождением сероводорода, который, соединяясь с уксусным свинцом, переходит в сернистый свинец коричнево-черного цвета. Дифтероиды подобных изменений не дают.

ПРОБА ЗАКСА — ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТА УРЕAЗЫ

Проба Закса служит для отличия дифтериеподобных бактерий, обладающих уреазной активностью, от истинных дифтерийных палочек, не имеющих этого фермента.

• 1. ВАРИАНТ СРЕДЫ: к 100 мл МПБ или Хоттингеровского бульона добавляют 1 г мочевины и 0,2 мл 1,6% спиртового раствора крезолрот, разливают по 2-3 млв пробирки и стерилизуют текучим паром 10 минут. Результаты учитывают через 20-24 часа после посева. Покраснение среды свидетельствует о наличии уреазы.
• 2. ВАРИАНТ СРЕДЫ: готовят два реактива: А и В.

Реактив А: мочевина — 1 г, спирт 96°- 2 мл, дистиллированная вода — 4 мл.

Реактив В: 0,2% раствор фенолрота-1 мл, однозамещенный фосфат калия (КН₂Р0₄)-0,1 г, двузамещенный фосфат калия (К₂НРО₄)-0,1 г, хлористый натрий — 0,5 г, дистиллированная вода — 100 мл.

Реактив А стерилизуют фильтрованием и хранят при + 4 °C, реактив В — в автоклаве текучим паром.

Перед работой оба реактива смешивают ex tempore из расчета 1 часть раствора А и 19 частей раствора В, смесь разливают по 0,1 мл в узкие пробирки. Испытуемые культуры вносят в количестве 2-6 капель, помещают в термостат на 30 минут. При положительной реакции смесь краснеет.

Дифференциация дифтерийных бактерий и дифтероидов по биохимическим признакам приведена ниже.

В отдельных случаях после определения биохимических свойств дифтерийных бактерий выясняется серотип штамма. Для этой цели используется ориентировочная агглютинация. Последнюю проводят на стекле с чистыми культурами, которые смывают со среды 1 мл солевого раствора и осторожно набирают стерильной пастеровской пипеткой. Агглютинирующие монотииовые сыворотки (I, II, III, IV, VI серотипы) разводят 1:25 солевым раствором с pH-7,6 (к 100 мл дистиллированной воды прибавляют 3,0 NaOH и устанавливают pH-7,6, доливая 5% раствор Na₂HPO₄). Для контроля испытуемой культуры ставят реакцию с выше указанным солевым раствором без сыворотки.

Положительная реакция характеризуется быстрым появлением хлопьев агглютината (2-3 минуты), особенно заметных при учете реакции над вотеутым зеркалом.

Неиспользованную сыворотку запаивают в ампулу или переливают в стерильную пробирку.

Агглютинирующие сыворотки хранятся в сухом месте при температуре от +4° до +10 °C.

При использовании высушенных сывороток последние перед употреблением растворяют в стерильной дистиллированной воде (1 мл на ампулу). Срок годности сухой сыворотки не ограничен.

УСКОРЕННЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ

ТЕЛЛУРНТОВАЯ ПРОБА — КЛИНИЧЕСКАЯ

Тампоном, смоченным 2% раствором теллуровокислого калия в 40% глицерине (выпускается в ампулах), смазывают пораженные миндалины и слизистую. При наличии дифтерийных бактерий тампон чернеет сразу или после 2-4-часовой инкубации в термостате.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОКСИГЕННОСТИ ДИФТЕРИЙНЫХ БАКТЕРИИ

Определение токсигенности дифтерийных бактерий осуществляется биологическим (в специализированных лабораториях) и диффузионным (на плотных средах) методами.

Рекомендуемая литература:

1. Профилактика дифтерии. Методические материалы для практических работников. М., 1961, стр. 37.
2. Сборник официальных материалов по лабораторному делу. Книга первая. Медгиз, 1961, стр. 331-337.
3. Сборник схем бактериологического исследования при некоторых инфекционных заболеваниях. Методическое пособие для врачей-курсантов заочников, под ред. проф. П. Н. Кашкина, Л., 1965, стр. 17-20.
4. Дяченко С. С. Микробиологические методы диагностики инфекционных заболеваний. Киев, 1962, стр. 224,
5. Пяткин К. Д., Трофимова Н. Д., Маркова Н. С. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии, 1962, стр. 219.
6. Руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных заболеваний, 1964, т. VI, стр. 375.
7. Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней под ред. Матвеева К. И. и Соколова М. И. 1964, стр. 422-430.

Источник: Мотавкина Н.С., Пьянова Р.Е. Микробиологическая диагностика некоторых капельных инфекций и токсоплазмоза. Методическая разработка для студентов. ВГМУ, 1973

источник

Лечение простуды и гриппа

Диагностика дифтерии часто вызывает затруднения. Это связано с тем, что заболевание имеет разнообразные формы проявления. Мазок на дифтерию – это бактериологический метод исследования, который является основным в лабораторной диагностике. Анализ позволяет выделить дифтерийную палочку (Corinebacterium diphtheriae) из очага поражения, определить ее тип и токсигенность (свойство палочки продуцировать экзотоксины в окружающую среду).

Независимо от выявленного очага поражения при подозрении на дифтерию мазок берется из зева и носа. Это необходимо для того, чтобы выявить комбинированные формы заболевания. Для бактериологического анализа берут слизь и пленки.

Нельзя допускать попадание крови в исследуемый биоматериал, так как она обладает бактерицидными свойствами. Это может исказить результаты анализов.

Бактериологический метод – это выделение в чистом виде дифтерийной палочки путем посева материала, взятого у пациента, на специальные питательные среды. В лаборатории изучают свойства патогенного микроорганизма и дают заключение. До того как забирать материал, нельзя проводить лечение антибактериальными препаратами.

Бактериологическое исследование имеет один недостаток. Он связан с тем, сколько делается анализ. Продолжительность исследования на дифтерию в среднем составляет 2-3 суток. Для того, чтобы результативность метода была максимальной, материал после взятия необходимо доставить в лабораторию как можно быстрее.

Для бактериологического анализа собирают слизь из стенок слизистой горла, а также пленки. Важным условием является взятие материала натощак. Лучше всего его сдавать с утра после сна. Если пациент поел, то ротовую полость следует прополоскать от остатков пищи, а анализы брать спустя 2 часа.

Мазок из зева на дифтерию нужно брать аккуратно. Во время забора материала нельзя касаться слизистых оболочек ротовой полости, языка, зубов. В этих местах часто находятся ложнодифтерийные палочки. По своему строению и биохимическим свойствам они очень схожи с настоящим возбудителем дифтерии. Если в области горла и миндалин есть налет, то мазок нужно брать по его краям.

Алгоритм взятия мазка на дифтерию из зева:

Перед тем как взять мазок из носа на дифтерию, носовые ходы необходимо тщательно прочистить путем высмаркивания или применяя сухие ватные палочки (специальные фитили). Если в носу есть корочки, то их необходимо удалить с осторожностью, чтобы не повредить слизистую и не вызвать капиллярное кровотечение.

Тампон для взятия материала из носа готовится по такому же принципу, как и тампон для зева, только он меньшего размера. Вводить его нужно медленно и аккуратно, так, чтобы каждая сторона тампона касалась всех стенок носового хода.

У пациентов мазок из зева и носа на дифтерию берут вместе и отправляют в лабораторию. Для более точного диагноза посевы проводят незамедлительно и сразу на нескольких питательных средах.

Для культивирования дифтерийной палочки посев производят на среды Костюковой (жидкая) и Клауберга (плотная). В их состав входит гелурит натрия и калия, а в плотной среде также содержится гемолизированная кровь и эритроцитарная масса.

На среде Костюковой рост дифтерийной палочки выглядит в виде повсеместного потемнения, на среде Клауберга возбудитель заболевания растет в виде темных или черных полосок.

Если в ходе лабораторных исследований токсигенность выделенной палочки подтверждена, то диагноз на дифтерию положительный. Если выделенный возбудитель оказался нетоксигенный, то окончательный диагноз выносится на основе клинических симптомов болезни.

В норме у здорового человека дифтерийная палочка не присутствует в слизистой зева и не обнаруживается при бактериологическом исследовании.

Анализ на дифтерию не всегда может быть точным. На его результативность влияют такие факторы:

• несоблюдение правил взятия мазков из носа и зева;
• прием антибактериальных средств, сульфаниламидных препаратов;
• несвоевременная доставка взятого материала в лабораторию (с момента взятия прошло более 2-3 часов), после истечения этого срока в биоматериале начинает размножаться сапрофитная (сопутствующая) микрофлора, постепенно развиваются аутолитические процессы, что губительно отражается на дифтерийной палочке.

Мазки на выявление дифтерии берут не только у пациентов с клиническими проявлениями заболевания. Анализы также проводят людям, контактировавшим с больным для своевременного выявления инфекции. Бактериологическое исследование в обязательно порядке назначают пациентам после проведенного лечения для контроля эффективности медикаментозной терапии.

© 2017 pulmono.ru · Копирование материалов разрешено только при указании источника в виде активной индексируемой ссылки.
Вся информация на сайте pulmono.ru предназначена только для ознакомления и не является инструкцией к действию.
Для получения медицинской помощи настоятельно рекомендуем обратиться к врачу.

Простудные заболевания часто сопровождаются покраснением горла, отеком, болью и пр. симптомами, характерными для инфекционных заболеваний, поэтому врач может назначить мазок на дифтерию – специальный анализ, который позволит обнаружить наличие опасных бацилл Леффлера.

Эти бактерии передаются от человека к человеку воздушно-капельным путем и являются возбудителями опасного инфекционного заболевания, дифтерии, которое без должного лечения может привести к серьезным отклонениям в работе различных органов и даже летальному исходу.

Мазок на дифтерию – самый быстрый и безопасный способ диагностировать заболевание и начать правильную антибактериальную терапию.

Биоматериал для проведения лабораторных исследований берет врач, хотя процедура забора мазка достаточно проста и безболезненна.

Мазок берут из зева и носа. Для обеих процедур используются специальные петли из проволоки, обмотанные стерильной ватой, или тонкие деревянные палочки со стерильной ватой на конце.

Для забора мазка из носа врач вводит палочку или петлю на 1-2 см в каждую ноздрю поочередно и аккуратно проводит ватой по слизистой.

Для забора мазка из зева врач сначала фиксирует язык пациента одноразовым шпателем, а затем аккуратно проводит палочкой по небным дужкам, гортани, миндалинам.

Наиболее достоверные результаты дает мазок, взятый ближе к воспаленным тканям, рядом с пленками или в области наибольшей гиперемии. Важно, чтобы в процессе забора материала вата не касалась слизистой ротовой полости, языка или неба.

Палочку с биоматериалом помещают в сухую стерильную пробирку, маркируют фамилией и именем пациента, областью, из которой был взят мазок (нос или ротоглотка).

Сохраненный таким образом материал должен быть доставлен в лабораторию в течение трех часов, а затем храниться в холодильнике.

Если врач считает, что в ближайшие часы не сможет доставить материалы в лабораторию, то мазок помещают в специальный консервант, раствор глицерина. Результаты лабораторных исследований в последнем случае придется ждать немного дольше (3-4 дня).

Чтобы мазок из зева на дифтерию показал максимально точные и достоверные результаты, к процедуре необходимо подготовиться.

Мазок из носовой области берут после того, как пациент прочистит пазухи (высморкается), и особых требований к соблюдению режима перед анализом нет.

Хотя врачи рекомендуют избегать применения капель и спреев против насморка в течение 2-3 часов перед процедурой.

Для получения достоверных результатов анализа мазка из зева важно, чтобы пациент не находился на антибактериальном лечении, не принимал антибиотики. За 2-3 часа до проведения процедуры рекомендуется воздержаться от еды и питья, не принимать антибактериальных пастилок, спреев и других медикаментов, не полоскать горло.

Наиболее достоверными считаются мазки, взятые у пациента натощак. Если по каким-либо причинам пациент не соблюдал перечисленных рекомендаций, то важно сообщить об этом врачу, чтобы в лаборатории мазок исследовали с учетом возможных искажений.

Мазок на дифтерию исследует наличие бацилл Леффлера на слизистой пациента, поэтому результаты анализа достаточно очевидны: бактерии либо обнаружены, либо нет.

Если у пациента диагностируют дифтерию, то его необходимо срочно изолировать, а всех членов семьи, имевших контакт с больным, осмотреть на наличие признаков заболевания.

Если дифтерию обнаруживают у ребенка, посещавшего детский сад или школу, то рекомендуется сообщить об этом в учреждение, чтобы родители других детей могли проявить бдительность к состоянию здоровья своих малышей.

Анализ на дифтерию может дать положительный результат и у внешне здоровых людей. В таком случае решение о проведении дальнейших исследований или назначении терапии принимает врач.

Положительный результат на дифтерийную палочку без других симптомов может свидетельствовать о том, что заболевание протекает скрыто, или о том, что человек является носителем бактерий, но сам не подвержен заболеванию.

Такой результат нередко бывает у взрослых, ухаживающих за больными дифтерией: бактерии присутствуют, но иммунная система предотвращает развитие болезни.

Отрицательный результат анализа («нет роста») в большинстве случаев означает, что пациент дифтерией не болеет, а воспаление в горле вызвано другими микроорганизмами.

Исключение составляют отрицательные результаты мазка на дифтерию, взятые у человека, находящегося на или недавно завершившего бактериальную терапию. В таком случае мазок придется дать повторно через 1 – 3 недели.

Если у пациента присутствуют все признаки развития заболевания, но мазок дает отрицательный результат, то диагноз «дифтерия» все равно считается подтвержденным, поскольку вывод о наличии заболевания врач выносит в первую очередь по внешним признакам.

В таких случаях может быть назначена повторная сдача анализа с соблюдением всех правил подготовки к мазку либо сразу назначено соответствующее лечение.

Дифтерия – это острое инфекционное заболевание. Несмотря на то, что заболевание провоцируют особого рода бактерии, основные негативные последствия вызывают не сами микроорганизмы, а токсичные продукты их жизнедеятельности.

Дифтерия передается от человека к человеку воздушно-капельным путем, т. е. при разговоре, чихании, поцелуе и пр.

В некоторых случаях заболевание может передаваться через третьих лиц, посуду, предметы обихода.

Поэтому при вспышке заболевания в детских учреждениях могут объявить дифтерийный карантин, чтобы продезинфицировать помещение и игрушки.

Чаще всего дифтерия проявляется схожими с ангиной симптомами: болью в горле, покраснением, отеком, появлением белых или зеленоватых гнойных пятен или пленок, повышением температуры.

Но существуют и скрытые формы заболевания, когда заподозрить заболевание по внешним признакам сможет только врач.

Вопреки распространенному мнению дифтерия поражает не только ротоглотку и носовую полость: заболеванию подвержены кожные покровы, глаза, уши, половые органы.

Дифтерия – инфекционное заболевание, возбудителем которого стали бактерии, локализующиеся на ротоглотке, носовых проходах. Реже болезнь поражает глаза и ушную раковину. Внешним признаком патологии, является налет в виде пленки на очаге поражения. Для определения клинической картины необходим мазок на дифтерию.

Определить наличие палочки Леффлера, которая является возбудителем дифтерии, можно по симптомокомплексу. Такие проявления станут побудительной причиной для сдачи мазка на дифтерию:

• резкий скачок температуры, гипертермия достигает отметки 38 градусов и выше;
• сильные головные боли, общее недомогание;
• при дифтерии сильные приступы тахикардии;
• увеличение и уплотнение лимфатических узлов, расположенных около очага поражения, при пальпации они болезненные.

Резкий скачок температуры признак сдачи мазка на дифтерию

Если дифтерия не токсической формы, через три дня нормализуется температура, пленка приобретает мутно-белый цвет. При токсической форме дифтерии к симптомам прибавляется лихорадка, синюшный цвет носогубного треугольника, снижение артериального давления. При интоксикации появляются галлюцинации, отек и уплотнение в области шеи.

Патология входит в список заболеваний, против которых проводится вакцинация в детском возрасте. При несвоевременном обнаружении и лечении дифтерия способна вызвать:

• асфиксию (удушье);
• токсический шок;
• почечную недостаточность;
• поражение нервной системы;
• аномалии сердечной мышцы (миокардит).

При несвоевременном лечении дифтерия способна вызвать токсический шок

В частых случаях мазок на флору и наличие палочки Леффлера, проводится не только для постановки диагноза и подбора терапии, но и для профилактики:

• при трудоустройстве в детское заведение, сферу питания, медицинское учреждение, берется мазок на дифтерию;
• перед началом учебного года;
• во время беременности, чтобы исключить риск осложнений;
• после контакта с инфицированным дифтерией.

С помощью профилактических мероприятий удается предотвратить распространение эпидемии, связанной с бактериальным возбудителем.

Для достоверности анализа на дифтерийную палочку, необходимо соблюдать ряд рекомендаций. С учетом того, что мазок берется с ротовой полости и носовых проходов перед забором необходимо отказаться:

Отказ за несколько дней до сдачи мазка сосудосуживающих назальных препаратов

• от сосудосуживающих назальных препаратов за два дня до процедуры;
• от применения мазей на основе антибиотиков;
• в день сдачи мазка из носоглотки от приема пищи;
• непосредственно перед анализом от чистки зубов.

Если применяются препараты местного действия, в составе которых антибиотики, то их исключают из терапии за 2 дня до сдачи мазка на дифтерию. Прием перорально антибиотиков прекращается за две недели до анализа. При нарушении рекомендаций результат бактериологического исследования может быть неточным, что повлияет на дальнейшее лечение дифтерии.

Процедура проведения мазка на флору несложная, здесь нет необходимости в оборудовании, основное требование – стерильность инструментов.

Как правильно взять мазок из зева

Для исследования на предмет дифтерии собирается слизь или фрагменты пленки со стенок горла. Предварительно пациент предупреждается о нежелательности приема пищи перед процедурой. Если он поел, тщательно полощется ротовая полость, забор анализа на дифтерию проводится по истечении 2 часов.

Мазок из зева делается специалистом, условия для забора – нельзя касаться слизистой горла или языка, избегать контакта с зубами. На данных участках локализуются ложнодифтерийные палочки, по своему строению они схожи с оригиналом, но возбудителем заболевания не являются. Если в полости есть очаги пленочного налета, мазок берется по краю.

Последовательность процедуры:

• пациентом принимается позиция, лежа или сидя;
• максимально широко открывается рот, при помощи шпателя фиксируется язык, для предотвращения рвотного и глотательного рефлексов;
  спиртом обрабатывается зона забора;
• для процедуры берутся стерильные ватные или марлевые тампоны;
• их наматывают на деревянную или металлическую палочку;
• помещается конструкция в 9% физиологический раствор;
• осторожно, не касаясь стенок ротовой полости, берут мазок из зева с места наибольшей концентрации палочки Леффлера, по краю пленочного налета.

Палочка с биологическим материалом помещается в стерильную пробирку для дальнейшего микроскопического исследования.

Алгоритм проведения процедуры мазка из носа не отличается от анализа из зева

После получения мазка из носоглотки и носовых проходов, материал поступает в лабораторию для высевания флоры. Тампоны со слизью помещают в специальную среду, стимулирующую их рост. Лаборант отмечает, какие из них являются доминантами. Процесс роста бактерий занимает 48 часов. Меняя состав питательной среды до тех пор, пока колония перестает расти. Затем приступают к анализу колониеобразующей микрофлоры.

Исследованием результата мазка из носа и зева занимаются врачи-микробиологи, занося результаты в специальный бланк. Нормальное содержание сапрофитов и условных патогенов: или колониеобразующих микроорганизмов на 1 миллиметр. Болезнетворные бактерии должны отсутствовать полностью.

Исследованием результата мазка из носа и зева

После определения рода и вида, тестируют чувствительность к антибиотикам, противомикробным и антибактериальным препаратам. Лечение дифтерии назначается с учетом медикаментозного препарата, к которому менее устойчив патогенный микроорганизм.

Синдром тонзиллита – распространенное явление при заболеваниях инфекционной природы. Небные миндалины поражаются и при такой грозной патологии, как дифтерия. И хотя она возникает преимущественно в детском возрасте, но болеют и взрослые. Поэтому для подтверждения диагноза крайне необходимо провести лабораторное исследование слизи из носоглотки. Анализ на дифтерию часто назначают ЛОР-врачи и инфекционисты.

Трудно найти человека, который бы не слышал о дифтерии. Это инфекционное заболевание, характеризующееся фибринозным воспалением слизистой оболочки носоглотки. Возбудителем является микроб под названием Corynebacterium diphtheriae (бацилла Леффлера). Это небольшие грамположительные палочки, которые имеют утолщения на концах и в мазке располагаются под углом друг к другу. Они вырабатывают очень сильный токсин и ферменты, разрушающие клетки (нейраминидаза, гиалуронидаза, цистиназа).

Дифтерия передается воздушно-капельным путем. Болезнь начинается остро, спустя 3–5 суток после контакта с инфицированным человеком. Повышается температура тела, возникают явления интоксикации: слабость, вялость, бледность кожи. Боль в горле умеренная. При осмотре обращает на себя внимание наиболее специфический признак дифтерии – фибринозные пленки. Они имеют такие характеристики:

• Цвет серовато-белый, с перламутровым оттенком.
• Возвышаются над окружающей поверхностью (эффект плюс-ткань).
• Прочно прикреплены к подлежащим тканям (трудно снимаются).
• Обнажают кровоточащую поверхность.
• Консистенция плотная.
• Не растираются на предметных стеклах.
• Тонут в воде.

Вокруг пленок выявляется неяркая гиперемия застойного типа. Токсические формы дифтерии сопровождаются выраженным отеком мягких тканей, который распространяется на шею. Пленки могут стать механическим препятствием для прохождения воздуха по верхним отделам респираторного тракта (истинный круп). А токсины оказывают повреждающее действие на нервную систему, сердце, почки.

Мазок из зева и носа на бациллу Леффлера проводится пациентам, у которых есть подозрение на дифтерию. То есть врач при осмотре мог увидеть специфические признаки болезни или человек, как стало известно из анамнеза, контактировал с источником инфекции. Анализ необходимо делать еще и в динамике, для оценки эффективности специфической терапии. Но наряду с этим, показаниями для выполнения мазков могут служить другие заболевания, протекающие с синдромом тонзиллита:

• Банальные ангины (фолликулярная, лакунарная).
• Инфекционный мононуклеоз.
• Ангина Симановского-Венсана.
• Паратонзиллярный абсцесс.

С дифтерией гортани приходится дифференцировать ларинготрахеит, ложный круп, эпиглоттит. Эти заболевания также могут быть причиной для проведения исследования на коринебактерии. Поэтому спектр показаний для мазков из носа и зева очень широкий.

Анализ выполняется в тех случаях, когда необходимо подтвердить диагноз дифтерии или исключить его.

Чтобы результат анализа оказался достоверным, необходимо качественно подготовиться к взятию носоглоточной слизи. Поэтому перед тем, как сдавать анализ, необходимо учесть следующие моменты:

1. Не принимать антибиотики (на протяжении 10 суток).
2. Не использовать антисептики в любом виде – полоскания, орошения, аппликации (в течение 5 дней).
3. Не чистить зубы (в день исследования).
4. Прийти натощак (8–10 часов голодания).
5. Высморкаться (непосредственно перед анализом).

Пациент приходит в лабораторию или кабинет инфекционных заболеваний с направлением лечащего врача. Все остальное выполнит медицинский работник.

Мазок из зева на дифтерию берется стерильным тупфером – палочкой с ватным тампоном на конце. Сначала пациента просят широко открыть рот и немного запрокинуть голову назад. Берут материал из мест с наибольшими воспалительными изменениями: около пленок или в участке гиперемии. Затем вторым тупфером проводят по слизистой оболочке носа, заводя его в каждую ноздрю на 2 см и проворачивая там. Каждую палочку опускают в отдельную пробирку, закрывают ее и маркируют: пишут фамилию пациента и место взятия (зев или нос). В лабораторию необходимо доставить биоматериал на протяжении двух часов. Хранится он в холодильнике.

Слизь из носоглотки можно исследовать несколькими путями. Сначала анализируют цитологический состав биоматериала, а затем засевают его на питательные среды. И каждая процедура имеет свои особенности.

Полученный мазок из носа и зева исследуют под микроскопом. Для этого слизь наносят на предметное стекло, фиксируют в пламени горелки и окрашивают по Грамму. После этого рассматривают, какие клетки присутствуют в материале и идентифицируют возбудителя. Обнаружив палочки, схожие по строению с дифтерийными, переходят ко второму этапу исследования.

Более трудоемким и длительным считается посев на дифтерию. Но он крайне важен в плане определения токсигенности и других биохимических свойств выявленных штаммов. Сначала слизь из носоглотки наносят на теллуритовый агар. При выявлении роста колонии отсевают на другие питательные среды (жидкие или твердые). Особенно важно выявить у чистой культуры признаки токсического действия и цистиназную активность, что позволит дифференцировать палочки Леффлера от непатогенных коринебактерий.

Посев слизи из зева и носа на дифтерию – процесс не такой быстрый, как хотелось бы. Но он позволяет точно идентифицировать возбудителя по его культуральным свойствам.

источник