Лабораторная диагностика дифтерии микробиология

Материалом для исследования при дифтерии могут быть пленки и слизь из зева и носа, а при редких локализациях дифтеритических воспалений — из глаза, уха, с поверхности раны и кожи. Отделяемое забирают сухим ватным тампоном или смоченным 5% раствором глицерина в физиологическом растворе с рН-8.

До этого уровня его доводят 20% раствором однозамещенного фосфорно-кислого натрия (Na₂HPO₄).

Исследование осуществляют не позднее 3-4 часов после забора, с поэтапной выдачей ответов о подтверждении диагноза.

Морфологические и тинкториальные признаки дифтерийных бактерий настолько своеобразны, что микроскопический метод может примениться как самостоятельный или предварительный к бактериологическому анализу. Кроме того, он дает представление и о сопутствующей микрофлоре.

Для выявления дифтерийных палочек могут быть использованы три метода окраски: Грама, Леффлера, Нейccера.

МЕТОД ГPAМA позволяет выявить способность дифтерийных бактерий вступить во взаимодействие с генцианвиолетом. Дифтерийные бактерии грампозитивиы, но это свойство непостоянно. При контакте с антибиотиками, при длительном пребывании в голодной среде резко изменяется обмен веществ и грамположительность микробов теряется. Поэтому ориентироваться на этот признак нельзя.

МЕТОД НЕЙССЕРА — наиболее ценный дифференциально-диагностический способ, позволяющий не только окрасить микроорганизмы, но и выявить полярно вкрапленные зерна волютина и характерное расположение бактериальных особей под углом.

РЕАКТИВЫ

• УКСУСНОКИСЛАЯ СИНЬКА НЕЙСЕРА: метиленовая синька -0,1 г, спирт 96° -2 мл; 5% раствор ледяной уксусной кислоты в дистиллированной воде — 50 мл.
• РАСТВОР ЛЮГОЛЯ: 2 г йодистого калия растворить в 10 г дистиллированной воды. Затем к этому раствору прибавить; 1 г кристаллического йода и добавить воды до 300 мл.
• РАСТВОР ХРИЗОИДИНА: 2 г хризоидина на 300 мл горячей дистиллированной воды.

Вместо раствора хризоидина можно использовать раствор везувина (краситель бисмаркбраун): везувин-1 г; 96° cпирт-10 мл; кипящая дистиллированная вода-100 мл.

ТЕХНИКА ОКРАСКИ

1. Синька Нейссора- 1 минута
2. Раствор Люголя — 30 секунд.
3. Ополаскивание дистиллированной водой.
4. Докраска расвором хризоидина или везувина — 10-15 секунд.

Тело микробной клетки окрашивается в желтый или желто-коричневый цвет, зерна волютина — коричнево-черного цвета.

ОКРАСКА ПО СПОСОБУ ЛЕФФЛЕРА

Метод Леффлера прост, но по своим дифференциально-диагностическим возможностям он не уступает сложному способу Нейссера. Поэтому он применяется значительно чаще.

Для окраски нужен один реактив — щелочная метиленовая синька Леффлера следующего состава: Дистиллированная вода — 99 мл; 1% раствор едкого калия (КОН) — 1 мл; профильтрованный спиртовой раствор метиленовой синьки (0,5 г синьки на 30 мл спирта) — 30 мл.

Окраска осуществляется 1-2 минуты. При этом тело бактерий приобретает бледно-голубой цвет, зерна волютина — синий или cине-черный.

При выполнении микроскопического исследования важно отличить истинные дифтерийные бактерии от дифтериеподобных палочек Гоффмана и бактерий ксерозис.

II. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД

Дифтерийные бактерии требовательны к питательным средам. Для их выделения и накопления используется комплекс специальных элективных и дифференциально-диагностических сред.

СВЕРНУТАЯ СЫВОРОТКА РУ: 3 мл стерилыной сыворотки лошади (быка или человека) вносят в пробирку, укладывают с наклоном в 45-50° в свертывателе Коха, предварительно нагретом до +50 °C. Затем температуру доводят до 80° и прогревают в течение 1 часа. Готовую среду охлаждают, ставят в термостат для проверки стерильности. В случае прорастания среды последнюю повторно прогревают при + 80 °C в течение 2 часов.

На этой среде бактерии дают шероховатые R-формы, напоминающие в комплексе шагреневую кожу.

ТЕЛЛУРИТОВЫЕ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Дифтерийные бактерии обладают выраженной способностью восстанавливать теллуровокислый калий до металлического теллурита. Для выявления этой способности в среды добавляется дифференцирующий компонент-2% раствор теллурита калия следующего состава: дистиллированная вода-100 мл; теллурит калия (K₂FeO₄)-2 г. Раствор стерилизуют кипячением 30 минут. Для приготовления сред можно использовать также готовый 2% раствор теллурита калия в 40% глицерине, выпускаемый в ампулах для клинических теллуритовых проб.

СЫВОРОТОЧНО-ТЕЛЛУРИТОВЫИ АГАР: к 80 мл расплавленного и охлажденного до +50 °C 2% МПА добавляют 20 мл лошадиной или 30 мл бычьей сыворотки и 1 мл 2% раствора теллурита калия. Готовую среду разливают в стерильные чашки.

КРОВЯНО-ТЕЛЛУРИТОВЫЙ АГАР: к 100 мл расплавленного и охлажденного до +50 °C 2-3% МПА добавляют 5-10% дефибринированной крови человека (донорской, плацентарной) или животного (крупного рогатого окота, кролика, барана, морской свинки) и 1 мл 2% теллурита калия, смешивают и разливают в чашки.

СРЕДА КЛАУБЕРГА: 100 мл 3% МПА расплавляют, добавляют 3 мл 2% теллурита калия, 10 мл глицериновой смеси и 50 мл лаковой крови. Последнюю готовят следующим образом: к 34 мл дистиллированной стерильной воды добавляют 16 мл дефибринированной крови (любой). Состав глицериновой смеси: к 40 мл дефибринироваиной крови крупного рогатого скота или человека добавляют 20 мл химически чистого стерильного глицерина и выдерживают до употребления в холодильнике 3-6 недель.

По характеру роста на теллуритовых средах удается отдифференцировать дифтерийные бактерии как внутри вида, так и от других микроорганизмов.

ХИНОЗОЛЬНУЮ СРЕДУ БУЧИНА готовят по следующей прописи: на 100 мл воды добавляют 3 г хлористого натрия, 1,5 г, глюкозы, 1 мл 3% раствора цистина в 1% растворе соды, 2 мл водного раствора хинозола (1:1000), 0,08 г индикатора водноголубого, 4,0 сухого питательного агара. Смесь растворяют при нагревании. Устанавливают pH = 7,4-7,6. Охлаждают до +50 °C, добавляют 5 мл дефибринированной крови и, соблюдая стерильность, разливают в чашки Петри.

СРЕДА ТИНСДАЛЯ-САДЫКОВОЙ является селективной средой для дифтерийных бактерий. Посторонняя микрофлора на ней не растет или развивается очень скудно. Другим преимуществом среды является то, что она не нуждается в добавлении крови. Ее состав следующий: 100 мл мартеновского или обычного мясопептонного агара, 15-20 мл нормальной лошадиной сыворотки, 12 мл 1% раствора цистина (сначала растворить в 0,1 N р-ре NaOH, потом в воде), 11-12 мл 0,1N HCl (для нейтрализации NaOH); 1,8 мл 2% раствора теллуристого калия и 1,8 мл 2,5% раствора гипосульфита натрия.

Дифтерийные бактерии обладают рядом характерных биохимических признаков. Они хорошо ферментируют глюкозу и крахмал, высвобождают значительные количества активной цистиназы, выявляемой в пробе Пизу. Вместе с тем, названные микроорганизмы инертны в отношении сахарозы и не имеют фермента уреазы, обнаруживая отрицательную пробу Закса. Очень важным видовым признаком этих микробов является токсигенность. С эпидемиологической точки зрения, весьма существенное значение имеет серологическая неоднородность дифтерийных бактерий и наиболее широкое участие в распространении инфекции I и VI серологических типов. Это необходимо учитывать при диагностике дифтерии.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ УГЛЕВОДОЛИТИЧЕСКОИ АКТИВНОСТИ дифтерийных бактерий производится на комплексе углеводных сред, состоящих из 1% пептонной воды с pH-7,6, в которую добавляют различные углеводы: 0,5% сахарозы, 0,5% глюкозы, 0,2% крахмала. В качестве индикатора используется реактив Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью).

Среды разливают по 2 мл и стерилизуют текучим паром 3 дня подряд :по 30 минут. До работы они бесцветны, при ферментации углеводов — краснеют.

На углеводных сывороточно-водных средах, основа которых состоит из дистиллированной воды (80 мл) и сыворотки (20 мл), углеводолитические свойства культур проявляются плохо и ферментация углеводов идет очень медленно.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

ПРОБА ПИЗУ — ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТА ЦИСТИНАЗЫ

К 90 мл расплавленного 2% МПА с pH -7,6 добавляют 2 мл раствора цистина (1% раствор цистина в 0,1N растворе NaOH). Среду стерилизуют при +112 °C 30 минут. K расплавленной и охлажденной до +50 °C среде добавляют 1 мл 10% уксуснокислого свинца (простерилизованного дважды текучим паром) перемешивают и добавляют 9 мл нормальной лошадиной сыворотки. Среду стерильно разливают в маленькие пробирки по 2 мл. Посев производится уколом.

Вместо МПА с цистином можно использовать 2% МПА, приготовленный на переваре Хоттингера, с содержанием аминного азота в 250 мг%.

Дифтерийные бактерии активно перерабатывают белки и цистин с высвобождением сероводорода, который, соединяясь с уксусным свинцом, переходит в сернистый свинец коричнево-черного цвета. Дифтероиды подобных изменений не дают.

ПРОБА ЗАКСА — ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТА УРЕAЗЫ

Проба Закса служит для отличия дифтериеподобных бактерий, обладающих уреазной активностью, от истинных дифтерийных палочек, не имеющих этого фермента.

• 1. ВАРИАНТ СРЕДЫ: к 100 мл МПБ или Хоттингеровского бульона добавляют 1 г мочевины и 0,2 мл 1,6% спиртового раствора крезолрот, разливают по 2-3 млв пробирки и стерилизуют текучим паром 10 минут. Результаты учитывают через 20-24 часа после посева. Покраснение среды свидетельствует о наличии уреазы.
• 2. ВАРИАНТ СРЕДЫ: готовят два реактива: А и В.

Реактив А: мочевина — 1 г, спирт 96°- 2 мл, дистиллированная вода — 4 мл.

Реактив В: 0,2% раствор фенолрота-1 мл, однозамещенный фосфат калия (КН₂Р0₄)-0,1 г, двузамещенный фосфат калия (К₂НРО₄)-0,1 г, хлористый натрий — 0,5 г, дистиллированная вода — 100 мл.

Реактив А стерилизуют фильтрованием и хранят при + 4 °C, реактив В — в автоклаве текучим паром.

Перед работой оба реактива смешивают ex tempore из расчета 1 часть раствора А и 19 частей раствора В, смесь разливают по 0,1 мл в узкие пробирки. Испытуемые культуры вносят в количестве 2-6 капель, помещают в термостат на 30 минут. При положительной реакции смесь краснеет.

Дифференциация дифтерийных бактерий и дифтероидов по биохимическим признакам приведена ниже.

В отдельных случаях после определения биохимических свойств дифтерийных бактерий выясняется серотип штамма. Для этой цели используется ориентировочная агглютинация. Последнюю проводят на стекле с чистыми культурами, которые смывают со среды 1 мл солевого раствора и осторожно набирают стерильной пастеровской пипеткой. Агглютинирующие монотииовые сыворотки (I, II, III, IV, VI серотипы) разводят 1:25 солевым раствором с pH-7,6 (к 100 мл дистиллированной воды прибавляют 3,0 NaOH и устанавливают pH-7,6, доливая 5% раствор Na₂HPO₄). Для контроля испытуемой культуры ставят реакцию с выше указанным солевым раствором без сыворотки.

Положительная реакция характеризуется быстрым появлением хлопьев агглютината (2-3 минуты), особенно заметных при учете реакции над вотеутым зеркалом.

Неиспользованную сыворотку запаивают в ампулу или переливают в стерильную пробирку.

Агглютинирующие сыворотки хранятся в сухом месте при температуре от +4° до +10 °C.

При использовании высушенных сывороток последние перед употреблением растворяют в стерильной дистиллированной воде (1 мл на ампулу). Срок годности сухой сыворотки не ограничен.

УСКОРЕННЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ

ТЕЛЛУРНТОВАЯ ПРОБА — КЛИНИЧЕСКАЯ

Тампоном, смоченным 2% раствором теллуровокислого калия в 40% глицерине (выпускается в ампулах), смазывают пораженные миндалины и слизистую. При наличии дифтерийных бактерий тампон чернеет сразу или после 2-4-часовой инкубации в термостате.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОКСИГЕННОСТИ ДИФТЕРИЙНЫХ БАКТЕРИИ

Определение токсигенности дифтерийных бактерий осуществляется биологическим (в специализированных лабораториях) и диффузионным (на плотных средах) методами.

Рекомендуемая литература:

1. Профилактика дифтерии. Методические материалы для практических работников. М., 1961, стр. 37.
2. Сборник официальных материалов по лабораторному делу. Книга первая. Медгиз, 1961, стр. 331-337.
3. Сборник схем бактериологического исследования при некоторых инфекционных заболеваниях. Методическое пособие для врачей-курсантов заочников, под ред. проф. П. Н. Кашкина, Л., 1965, стр. 17-20.
4. Дяченко С. С. Микробиологические методы диагностики инфекционных заболеваний. Киев, 1962, стр. 224,
5. Пяткин К. Д., Трофимова Н. Д., Маркова Н. С. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии, 1962, стр. 219.
6. Руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных заболеваний, 1964, т. VI, стр. 375.
7. Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней под ред. Матвеева К. И. и Соколова М. И. 1964, стр. 422-430.

Источник: Мотавкина Н.С., Пьянова Р.Е. Микробиологическая диагностика некоторых капельных инфекций и токсоплазмоза. Методическая разработка для студентов. ВГМУ, 1973

источник

Диагностика дифтерии основана на клинических данных с последующим подтверждением диагноза бактериологическим исследованием. Лабораторная диагностика дифтерии включает в себя ряд исследований, основным из которых является микробиологическое.

• Зачастую для постановки диагноза бывает достаточно тщательно собранного анамнеза заболевания и осмотра ротоглотки. Всякая задержка при установлении диагноза и назначения адекватного лечения увеличивает вероятность неблагоприятного исхода заболевания.
• Выделение культуры возбудителей с последующим определением у выделенных возбудителей токсикогенности является основным и единственным методом микробиологической диагностики дифтерии. Предварительный результат получается через 24 часа, через 48 часов получается результат исследования дифтерийных палочек на токсикогенность, через 72 часа определяется биовар возбудителя.
• Микроскопическое исследование при дифтерии нерационально.
• Серологическая диагностика основана на определении роста титра антибактериальных антител. Результаты получаются на 2-й неделе заболевания.
• При диагностике дифтерии применяется генетический метод (ПЦР), позволяющий определить ДНК бактерий.
• Реакция латекс агглютинации относится к экспресс-методам. Результат получается уже через два часа.
• Иммунофлуоресцентный анализ результативен. Однако его проведение должно осуществляться только высококвалифицированным персоналом.

Рис. 1. Пленка грязно-белого цвета и выраженный отек подкожной жировой клетчатки шеи — «бычья шея» — классические признаки дифтерии.

Микробиологическое исследование является основным методом лабораторной диагностики дифтерии.

Бактериологическое исследование проводится в следующих случаях:

• с целью диагностики дифтерии зева, носа и глотки у взрослых и детей,
• с целью выявления возможного бактерионосительства у лиц, которые поступают в детские дошкольные учреждения и специализированные учреждения для взрослых,
• с целью выявления заболевания среди контактирующих лиц.

Материал для исследования (мазок на дифтерию) собирается натощак или спустя 2 часа после еды. Для исследования используются дифтерийные пленки или кусочки тканей, расположенных по соседству, отделяемое из мест поражения и носоглоточная слизь.

Забор материала (мазок на дифтерию) осуществляется ватным тампоном. Корень языка прижимается шпателем. Ватным тампоном необходимо коснуться слизистой оболочки миндалин на границе пленки, дужек и задней стенки глотки. Далее тампон опускается в стерильную пробирку, не касаясь ее стенок.

В течение первых 3-х часов должен быть отправлен в лабораторию. При невозможности произвести посев в ближайшие 3 — 4 часа, забор материала осуществляется стерильным ватным тампоном, который смачивают в 5% растворе глицерина в изотоническом растворе хлорида натрия или 2% растворе теллурита калия.

Забор материала (мазок на дифтерию) осуществляется двумя ватными тампонами, один из которых используется для посева, другой — для микроскопии.

При подозрении на дифтерию необходимо оповестить сотрудников лаборатории, чтобы собранный материал был посеян на соответствующие среды (кровяной агар, среда Леффлера или теллуритовая среда).

Посев осуществляется на питательные среды (кровяной агар, среда Леффлера или теллуритовая среда). Теллурит в большой концентрации подавляет рост сопутствующей микрофлоры.

Рис. 2. На фото рост колоний палочки дифтерии на разных средах — кровяном агаре и теллуритовой среде.

При росте бактерий на кровяном агаре колонии приобретают беловатую окраску, они непрозрачные, округлые, выпуклой формы, 1 — 2 мм в диаметре, чаще маслянистой консистенции.

При росте бактерий на теллуритовых средах колонии серого цвета, выпуклые, края ровные. Через двое суток колонии приобретают темно-серый или черный цвет, они имеют металлический блеск, ровные или фестончатые края, поверхность гладкая или радиально исчерчена.

Идентификации разновидностей штаммов возбудителей дифтерии основана на способности бактерий расщеплять гликоген и крахмал. Для этих целей используется методика «длинного» ряда углеводов.

Принимая во внимание ферментативные признаки возбудителей и структуру колоний при росте на теллуритовых средах, выделяют 4 биотипа коринебактерий дифтерии: Corynebacterium diphtheriae gravis, Corynebacterium diphtheriae mittis, Corynebacterium diphtheriae intermedius и Corynebacterium diphtheriae belfanti.

Рис. 3. На фото слева колонии коринебактерий дифтерии гравис (Corynebacterium diphtheriae gravis). Они имеют большой размер, выпуклые по центру, радиально исчерчены, с неровными краями. На фото справа Corynebacterium diphtheriae mittis. Они небольшого размера, темной окраски, гладкие и блестящие, с ровными краями.

Токсикогенность возбудителей дифтерии определяется после выделения культуры бактерий. Для этих целей используется методика диффузной преципитации в геле и методика определения токсикогенности бактерий в живом организме (на морских свинках).

Лабораторная диагностика с применением микроскопии является второстепенным по значимости. Ввиду того, что возбудители дифтерии плохо впитывают красители, окраска по Граму считается не специфичной, однако она позволяет косвенно определить непатогенные коринебактерии, которые в мазке располагаются параллельно друг другу.

При окраске по Нейссеру выявляются характерные для дифтерийных палочек зерна Бабеша-Эрнста, которые располагаются на полюсах клеток, придавая им вид булавы.

В мазках патогенные дифтерийные палочки располагаются под углом друг к другу.

Для выявления зерен Бабеша-Эрнста применяется методика люминесцентной микроскопии. При окрашивании мазков корифосфином в микроскопе можно увидеть желто-зеленые тела бактериальных клеток с оранжево красными зернами волютина.

Рис. 4. Дифтерийные палочки под микроскопом. Окраска по Граму.

Рис. 5. На фото слева ложнодифтерийные палочки Гоффмана. Они часто обнаруживаются в носоглотке. Они толстые, короткие, располагаются в мазках параллельно друг другу. На фото справа патогенные бактерии. В мазке располагаются под углом друг к другу.

Серологические исследования позволяют обнаружить антибактериальные и антитоксические антитела. Значимым является обнаружение антибактериальных антител, так как содержание антитоксина изменяется в связи с применением с первых дней антитоксической сыворотки. Наиболее распространенными в настоящее время является реакция пассивной гемагглютинации (РНГА и РПГА).

Иммуноглобулины G и M говорят об остроте инфекционного процесса.

Иммуноглобулины G говорят о недавно перенесенном заболевании.

Иммуноглобулины М говорят об остропротекающей дифтерии.

При дифтерии титр антител со временем повышается. Понижение концентрации антител свидетельствует о выздоровлении больного.

Противодифтерийные антитела образуются после вакцинации. В крови привитого человека они циркулируют многие годы.

Благодаря применению методики флуоресцирующих антител стало возможным проведение качественного и количественного анализа внутриклеточных и поверхностных антигенов в образцах клеточных суспензий. Антигены визуализируются с помощью специфических антител с флуоресцентными маркерами. Использование данной методики доверяется только высококвалифицированному персоналу.

Методика ПЦР применяется для раннего выявления дифтерийных палочек, подтверждения диагноза и в случаях атипичной ангины. Обнаружение гена токсикогенности методом ПЦР является наиболее быстрым и надежным методом лабораторной диагностики дифтерии.

Рис. 6. ПЦР является наиболее быстрым и надежным методом лабораторной диагностики дифтерии.

• При токсическом поражении сердечной мышцы отмечаются изменения на электрокардиограмме, фонокардиограмме и УЗИ сердца. Исследуется активность целого ряда ферментов (лактатдегодрогиназа, креатинфосфокиназа, аспартатаминотрансфераза).
• Поражение почек при дифтерии проявляется в виде токсического нефроза. При подозрении на это осложнение производится общий анализ крови и мочи, биохимические исследования (определение креатинина, мочевины, остаточного азота), производится УЗИ почек.
• Токсическое поражение печени протекает с явлениями гипогликемии (снижение уровня глюкозы в крови) и глюкозурии (наличие глюкозы в моче).
• Развитие анемии связано с гемолизом эритроцитов.

к содержанию ↑

Наличие или отсутствие противодифтерийного иммунитета устанавливается при помощи внутрикожной пробы Шика, которая проводится с дифтерийным токсином.

В случае отрицательной реакции говорят о невосприимчивости к дифтерии. Реакцию Шика сегодня используют только по эпидпоказаниям. На ее проведение уходит несколько дней. Однако несмотря на это она помогает определить степень восприимчивости к дифтерии лиц, находившихся в контакте с больным и уточнить их иммунный статус.

Рис. 7. Реакция Шика проводится с дифтерийным токсином. Стандартный дифтерийный токсин в дозе 0,2 мл вводится внутрикожно в среднюю треть предплечья туберкулиновым шприцом.

источник

Дифтерия — острое инфекционное заболевание, вызываемое дифтерийной палочкой (Corynebacterium diphtheriae), характеризующеесяместным фибринозным поражением слизистых оболочек рото- и носоглотки (diphthera – пленка), а также тяжелой интоксикацией с поражением сердечно-сосудистой, нервной системы и надпочечников. Лабораторная диагностика дифтерии осуществляется в соответствии со схемой 14.

Схема 14.Микробиологическая диагностика дифтерии

Микроскопический метод в настоящее время фактически не применяется из-за его низкой информативности в связи с субъективизмом учета и выполняется только по требованию лечащего врача. Микроскопии подвергают мазки, окрашенные по Граму, метиленовым синим, по Нейссеру (для выявления включений волютина). Дифтерийные палочки (Corynebacteriumdiphtheriae) при окраске по Нейссеру содержат полярно расположенные темно-синие, почти черные, включения волютина и располагаются в виде римских цифр V или Х, тогда как сходные с ними дифтероиды и ложнодифтерийные бактерии (Corynebacteriumpseudodiphtheriae) зерен волютина не имеют и располагаются в виде частокола. Разработан также метод прямого флюорохромирования дифтерийных палочек корифосфином, окрашивающим включения волютина в красно-коричневый цвет, а цитоплазму в зеленый или желтый цвет, что позволяет повысить эффективность бактериоскопического метода.

Бактериологический метод-основной метод диагностики дифтерии. Исследуемый материал засевают на одну из специальных питательных сред для культивирования дифтерийных палочек, наиболее часто на среду Клауберга (МПА с гли­церином, дефибринированной кровью и теллуритом натрия, задерживающим рост сопутствующей непатогенной микрофлоры). На среде Клауберга Corynebacterium diphtheriae образует 2 типа колоний:

а) серовато-черного цвета с радиальной исчерченностью поверхности, напоминающие цве­ток маргаритки или розетку (биовар gravis);

б) черные, круглые, выпуклые колонии колонии за счет восстановления теллурита (биовар mitis).

В мазке из типичной для дифтерийной палочки колонии обнаруживают грамположительные палочки булавовидной формы, расположенные в виде римских цифр V или Х, содержащие зерна волютина (рис. 16). Оставшуюся часть колонии пересевают на кровяной МПА для выделения чистой культуры.

Рис. 16. Возбудитель дифтерии — Corynebacteriumdiphtheriae. Окраска по Нейссеру. Расположение в виде римских цифр V или Х, включения волютина по полюсам. х900

Идентификацию выделенной культуры проводят с учетом, прежде всего, ключевых свойств (токсигенность, наличие цистиназы). Токсигенность обычно определяют с помощью реакции преципитации в геле («чашечный» метод). Для этого в чашку Петри с питательной средой (МПА, 15—20 % лошадиной сыворотки, 0,3 % мальтозы, 0,03 % цистина) накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную анти­токсической противодифтерийной сывороткой (5000 АЕ/мл), чашку подсушивают 30 минут в термостате, после чего засевают штрихами исследуемые культуры перпендикулярно полоске бумаги. В качестве контроля используют токсигенную куль­туру. Посевы инкубируют в термостате при 37 0 С в течение 18-20 часов. При наличии токсигенности в местах соединения ток­сина с антитоксическими антителами в питательной среде образуются белые линии преципитата, напоминающие усики. Для определения токсигенности дифтерийных бактерий также разработаны ИФА и ПЦР.

Цистиназу у выделенных культур (проба Пизу) определяют путем посева методом укола петли исследуемой культуры на цистиновый МПА с азотнокислым свинцом. Посевы помещают на сутки в термостат при 37 0 С. При наличии цистиназы в среде образуется почернение (образование сульфида свинца) по ходу укола, вокруг которого появляется коричневое облачко.

Выделенную культуру идентифицируют и дифференцируют от сходных с ней непатогенных коринебактерий по биологическим свойствам (табл. 16). Для определения уреазы петлю исследуемой культуры вносят в пробирку, содержащую спиртовый раствор мочевины и индикатор феноловый красный. Пробирку выдерживают 30 минут в термостате при 37 0 С, при наличии уреазы содержимое пробирки окрашивается в красный цвет.

При выделении нетоксигенной культуры ставят реакцию агглютинации с противодифтерийной сывороткой для выявления видового антигена Corynebacterium diphtheriae.

Серологический метод –РА, РНГА с целью определения антител в парных сыворотках крови больных дифтерией.

Таблица 16.Биологические свойства коринебактерий

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Учись учиться, не учась! 10072 — | 7743 — или читать все.

источник

Род Corynebarteriurn (от лат. Сoryne — булава) – Гр+ палочковидные бактерии, длиной 1–8 мкм и шириной 0,3–0,8 мкм, не образующие спор, не имеющие жгутиков. Содержат зерна волютина, расположенные чаще всего на концах палочек, они часто превышают размеры поперечника бактерии и придают вид булавы. Также имеются включения липидов и крахмала, который откладывается при недостатке кислорода.

В состав клеточной стенки входят специфические только для бактерий рода Corynebacterium липиды: эфиры коринемиколовой и коринемиколиновой кислот, димикола, фосфатиды маннозы и инозита.

В организме человека обитают условно-патогенные: С.diphtheriae, С.pseudodiphtheriticiim (hofmanii), С.xerosis, С.ulcerans. С.diphtheriae вызывает у человека дифтерию, другие являются возбудителями вторичных инфекций.

КОРИНЕБАКТЕРИЙ ДИФТЕРИИ С.diphtheriae.

Морфология. Прямые или слегка изогнутые палочки. В препаратах располагаются под углом друг к другу в виде букв L, V или китайских иероглифов. Зерна волютина (на концах палочек) выявляются при окраске синькой Леффлера или по методу Нейссера. Факультативные анаэробы, хорошо размножаются при свободном доступе кислорода. К питательным средам требовательны: не способны утилизировать азот из аммонийных соединений, требуют наличия почти всех АК, солей Mg, Zn, Cu, Fe; необходимы углеводы Þ используются среды, полученные на основе ферментативного расщепления белка (казеина, дрожжей) с добавлением крови или сыворотки. На поверхностях плотных сред дифтерийные палочки образуют темно-серые или черные колонии (биовары гравис, способны расщеплять крахмал, или миттис). Рост на скошенном сывороточном агаре сравнивают с шагреневой кожей, колонии не сливаются.

Расщепляют глюкозу и другие моно- и дисахариды с образованием кислоты без газа, восстанавливают нитраты, расщепляют цистеин.

Лизируются специфичны для отдельных видов вирулентными фагами, что позволяет устанавливать фаговары исследуемых культур.

АГ. Имеют белковую капсулу, которая содержит К-АГ. Определение этого АГа позволяет установить серовар (их более 10). Группоспецифический полисахарид АГ клеточной стенки дает перекрестные реакции с микобактериями, нокардиями.

Экология и распространение. Передается аэрозольным (воздушно-капельным) путем. В настоящее время часто регистрируется у взрослых (тяжелая формы). Токсигенность связана лизогенизацией специфическим профагом. Выделяясь в окружающую среду со слюной, пленками, дифтерийные палочки сохраняют жизнеспособность в течение нескольких дней. Хорошо переносят высыхание. Чувствительны к дезинфицирующим растворам, антибиоткам.

Патогенность и патогенез. Заболевание развивается у лиц, не имеющих антитоксического иммунитета. На месте внедрения (зев, гортань, трахея, реже – нос, ухо) развивается местный воспалительный процесс. Все патогенные виды обладают фимбриями Þ АДГЕЗИЯ к клеткам хозяина, они выявляются в РА трипсинизированных бараньих эритроцитов.

Токсигенность – способность секретировать гистотоксин, что проявляется в виде локальной воспалительной реакции и в общей интоксикации организма, особенно чувствительны к нему надпочечники, миокард, НС. Токсин блокирует синтез белка, что приводит к гибели клеток, возникает некроз и летальный исход.

Ферменты (гиалуронидаза, нейраминидаза,фибринолизин) обеспечивают распространение в тканях, но бактериемия клинически не проявляется.

Корд-фактор нарушает фосфорилирование и дыхание клеток микроорганизмов.

Иммунитет. Наиболее восприимчивы дети 1–4 лет. Вырабатывается не очень прочный антитоксический иммунитет, возможны повторные заболевания дифтерией. Невосприимчивость зависит главным образом от содержания в крови антитоксина и АТ (опсонины, преципитины, комплементсвязывающие). Уровень антитоксического иммунитета устанавливают, определяя в крови антитела в РНГА с эритроцитарным диагностикумом (эритроциты нагружены дифтерийным анатоксином). Титр 1:20 и выше Þ иммунность обследуемого. Такжеже применяется реакция Шика (внутрикожно вводят дифтерийный токсин, у неимунных людей – местная воспалительная реакция, при наличии антитоксина реакции нет).

Лабораторная диагностика. В диагностике дифтерии важное значение имеет микроскопический метод. Мазки из налетов зева и носа окрашивают метиленовым синим, по Нейссеру и Граму. Одновременно материал засевают на элективную и дифференциально–диагностическую среды. Выделив культуру, ее идентифицируют по культурально–биохимическим признакам. Затем определяют токсигенность, испытывая культуру на морских свинках или в реакции преципитации на пластинчатом фосфатно–пептонном агаре, подсевая ее бляшками к расположенной вдоль чашки полоске фильтровальной бумаги, смоченной антидифтерийной сывороткой.

Токсигенные штаммы коринебактерии дифтерии при внутрикожном введении вызывают местный некроз, а при подкожном – гибель животных с экссудацией в серозные полости и резкое увеличение надпочечников. Положительная реакция преципитации в агаре проявляется образованием на границе взаимодействия антитоксина и продуцируемого экзотоксина равномерно сливающихся полос преципитации или «стрел–усиков».

Экспресс–диагностика. Если прямой микроскопией мазков, окрашенных обычными способами, выявить коринебактерии дифтерии в материале не удается, то его берут тампоном со свернутой сывороткой (метод Фольгера). Тампон помещают в термостат для подращивания культуры и через 3–5 ч им делают мазки.

Профилактика и лечение. Для профилактики дифтерии используют адсорбированную коклюшно–дифтерийно–столбнячную вакцину (АКДС), содержащую в 1 мл 20 млрд микробных тел палочек коклюша, 30 АЕ (антигенные единицы) дифтерийного анатоксина, 10 АЕ столбнячного анатоксина. Вакцинацию начинают с 5–6–месячного возраста. Курс иммунизации состоит из трех внутримышечных инъекций по 0,5 мл препарата с интервалом 30–40 дней. Ревакцинацию проводят в 3 года, 6 и 11 лет. По эпидемическим показаниям вакцинируют все население, даже людей старше 50 лет.

Специфическое лечение проводится лошадиной антитоксической иммунной сывороткой, которую вводят дробно по методу Безредки в зависимости от тяжести заболевания в количестве от 10 000 до 250 000 АЕ Антибиотики и сульфаниламиды сокращают сроки бактериовыделения у реконвалесцентов и санируют организм здоровых бактерионосителей. Для этих целей назначают пенициллины, тетрациклины, эритромицин.

источник

Дифтерийная палочка – возбудители дифтерии.

Дифтерия – острое инфекционное заболевание, характеризующееся токсическим поражением сердечно-сосудистой и нервной систем, а также специфическим фибринозным (дифтеритическим) воспалением в месте входных ворот.

Возбудитель был открыт в 1883 г. Клебсом, в 1884 г. Ф. Леффлер выделил его в чистой культуре. В 1888 г. Ру и Йерсен получили дифтерийный токсин, а в 1895 г. Беринг и Ру независимо друг от друга получили противодифтерийную сыворотку. В 1923 г. Рамон разработали технологию получения дифтерийного анатоксина, а позднее получил противодифтерийную сыворотку. Н.Г. Габричевский применил противодифтерийную сыворотку с лечебной целью и организовал ее производство в России.

В род Corynebacterium входят около 60 видов. Согласно Международной классификации Берджи этот род разделен на 3 секции:

1) патогенные для человека и животных;

2) патогенные для растений;

Прямые или слегка изогнутые палочки размером 0,3 — 0,6 х 4 — 8 мкм, спор не образуют, имеют микрокапсулу, неподвижны.

Особенностями дифтерийной палочки является наличие булавовидных утолщениях на концах; палочки отличаются также полиморфизмом; характерно взаимного расположения бактерий в мазках – в виде цифр V,X, L (не полное расхождение при делении);

В толстых мазках располагаются в виде «пучка булавок». Булавовидные утолщения на концах связаны с наличием зерен волютина (тельца Бабеша-Эрнста) – производные нуклеиновых кислот, метахроматиновые гранулы полиметафосфата. Бактерии могут образовывать фильтрующиеся и L-формы.

Грамположительные микроорганизмы. При окраске по методу Нейссера тело клетки окрашивается в синий цвет, а зерна волютина — в желтый. Метод Леффлера окрашивает цитоплазму в голубой цвет, а зерна волютина – в темно-синий.

Культуральные свойства.

Возбудители дифтерии — факультативные анаэробы, отимальная температура их культивирования 37 о С, рН 7,3-8,0. Требовательны к питательной среде, для роста необходимо наличие цистина, гистидина, фенилаланина, метионина и т.д. Факторами роста являются Са 2+ , Mg 2+ , Fe 2+ , Zn 2+ , Mn 2+ , Cu 2+ . Для культивирования применяют сывороточные (среда Леффлера), среды с добавлением крови, хинозальную среду Бучина. Дифференциально-диагностические среды: теллуритовая среда (Конради, Трох, 1913г.), глицериновокровяная среда с теллуритом (среда Клауберг ΙΙ), сывороточно-теллуритовый агар с цистином (Тиндаль), теллурит-шоколадный агар Маклеода.

На среде Леффлера бактерии растут в виде серовато-кремовых колоний, по типу «шагреневой кожи».

На теллуритовых средах возбудитель образует серовато-черные колонии, что обусловлено восстановлением теллурита до металлического теллура, имеющего черный цвет и аккумулирующегося бактериями.

Биохимическая активность.

Дифтерийные палочки малоактивны, сбраживают с образованием кислоты глюкозу, мальтозу, галактозу, декстрин, не разлагают сахарозу, лактозу, маннит, восстанавливают нитраты в нитриты. Не гидролизуют мочевину (проба Закса отрицательная), не образуют индол. Разлагают цистеин (проба Пизу положительная).

По культуральным, биохимическим, патогенетическим и некоторым другим свойствам дифтерийные палочки разделяются на 3 биовара.

1) биовар митис, характеризуется свойствами:

• ферментирует глюкозу, крахмал, мальтозу, не сбраживает сахарозу, гликоген, декстрин;
• обладает цистиназной активностью;
• восстанавливает нитраты;
• уреазная проба отрицательная;
• на средах с теллуритом образует мелкие гладкие блестящие черные колонии с ровным краем;
• на жидкой среде дает равномерное помутнение и порошкообразный осадок;
• дает зоны гемолиза на кровяных средах;
• малотоксичен;
• возбудители вызывают легкую спорадическую заболеваемость.

2) биовар гравис, характеризуется свойствами:

• ферментирует глюкозу, крахмал,декстрин, мальтозу,
• обладает цистиназной активностью;
• восстанавливает нитраты;
• уреазная проба отрицательная;
• на средах с теллуритом формирует крупные, сухие, матовые, плоские, серо-черные колонии, приподнятые в центре, с радиальной исчерченностью и неровным краем (напоминают маргаритку);
• на жидкой среде образуется пленка, помутнение, крошковидный или крупнозернистый осадок;
• дает гемолиз на кровяных средах;

· обладает выраженными токсигенными свойствами;

· выделяется от больных с тяжелой формой дифтерии, вызывает групповые вспышки.

3) биовар интермедиус, характеризуется свойствами:

· на средах с теллуритом образует мелкие сухие матовые серо-черные колонии с прозрачной периферией и неровным краем;

· на жидкой среде дает помутнение с последующим просветлением и образованием мелкозернистого осадка;

· гемолиз на кровяных средах отсутствует.

Антигенная структура.

Дифтерийная палочка имеет 2 антигена

1. О – антиген (групповой), полисахарид клеточной стенки, термостабильный, дает перекрестные реакции с микобактериями и нокардиями;

2. К – антиген (типовой), капсульный, термолабильный, иммуногенный, видоспецифичный.

На практике серотипирование не применяется, однако выпускаются диагностические сыворотки для РА, РПГА.

Для идентификации используют фаготипирование (22 фага) и бактериоцинотипирование (25 бактериоцинов).

Факторы патогенности.

Токсины. Палочка выделяет токсин – дифтерийный экзотоксин. По силе он занимает 3-е место после ботулинического и столбнячного. Термолабильный, высокотоксичный, иммуногенный, протективный, обладает анестезирующим действием. Гистотоксин обладает дермонекротическими, гемолитическими свойствами. Синтезируется в виде неактивного предшественника — единой полипептидной цепи с молекулярной массой 61 кД. Активируется под действием собственной протеазы, которая разрезает полипептид на 2 связанные между собой дисульфидными связями пептида: А (21 кД) и В (39 кД). Пептид В выполняет акцепторную функцию – распознает рецептор, связывается с ним, формирует внутримембранный канал, через который проникает в клетку пептид А. Пептид А – это фермент, который обеспечивает перенос аденозиндифосфатрибозы из НАД на один из аминокислотных остатков (гистидина) белкового фактора элонгации EF-2. В результате модификации EF-2 утрачивает свою активность, что приводит к подавлению синтеза белка рибосомами на стадии транслокации. Токсин синтезируют только С. diphtheriae, лизогенные умеренным конвертирующим tox-профагом, интегрирующимся с помощью сайт-специфической рекомбинации. Оперон, кодирующий синтез токсина имеет промотор tox Р и 3 участка: tox S, tox А, tox В. Тox S – обеспечивает выход токсина через мембрану в периплазматическое пространство бактериальной клетки. Утрата клеткой профага или мутации в tox-опероне делают клетку малотоксичной.

Ферменты патогенности: гиалуронидаза, нейраминидаза, фибринолизин, каталаза – факторы инвазии, лейкоцидин – обеспечивает устойчивость к фагоцитозу;

Структурные и химические компоненты клетки – пили (способствуют адгезии на чувствительных клетках), микрокапсула (обеспечивает устойчивость к фагоцитозу), корд-фактор (6-6-дифосфоэфир трегалозы, коринемиколовая и коринемиколиновая кислоты, обладающие нарушает фосфорилирование в митохондриях), бактериоцины (корицины) кодирование синтеза которых передается плазмидами.

Резистентность.

При нагревании до 60 о С палочки погибают за 10 мин, при 100 о С наступает мгновенная гибель. 5% раствор карболовой кислоты обеспечивает инактивацию через – 1 мин. Под действием прямого солнечного света палочка выживает несколько часов, в высохших пленках и кале – 3-4 мес., на предметах обихода и одежде сохраняется до 15 дней, на мягких игрушках – 3 мес., в воде и молоке – до 20 дней, в пыли – до 5 мес. Дифтерийные палочки чувствительны к пенициллину, тетрациклину, эритромицину.

Эпидемиология.

Источник инфекции – больной человек, носитель или реконвалесцент.

Механизмы передачи инфекции:

– аэрогенный (пути — воздушно-капельный и воздушно-пылевой);

– контактный (путь — непрямой контактный).

Больной опасен (в смысле заражения) с последних дней инкубационного периода.

Входные ворота – слизистые оболочки носа, зева, гортани, трахеи, бронхов, конъюнктивы глаз, наружных половых органов; раневая поверхность, пупочная рана.

Инкубационный период – 2-14-20 дней.

Возбудители адсорбируются на чувствительных клетках, колонизируют эпителий. Секретируют гистотоксин, который инициирует развитие местного фибринозного воспаления, некроз эпителия, паретическое расширение сосудов с нарушением их проницаемости, отек тканей и выход фибриногена из сосудов. Фибриноген под влиянием тканевого тромбопластина, некротизированных тканей и атмосферным кислородом свертывается. На поверхности образуется фибринозная пленка. На многослойном плоском эпителии — плотная, спаянная с прилежащими тканями; на однослойном – тонкая, легко снимается. Разрастание пленок в воздухоносных путях может привести к асфиксии (истинный круп). Процесс сопровождают регионарные лимфадениты. Системное действие токсина приводит к гемодинамическим нарушениям. Развивается токсический миокардит и ранний паралич сердца. Возможно поражение канальцевого аппарата почек, некроз коркового слоя. В нервной системе – цитолиз нервных клеток с развитием поздних параличей мягкого неба, диафрагмы, сердца, блуждающего нерва. Смерть при дифтерии может наступить от раннего или позднего паралича сердца и диафрагмы, а также в результате истинного крупа (закупорки дыхательных путей оторвавшимися пленками).

У детей грудного возраста чаще развивается дифтерия зева (насмокр, слабая выраженность общих проявлений). Необходимо осматривать пупочную ранку для исключения местного процесса.

После перенесенного заболевания развивается стойкий напряженный антитоксический и мало выраженный антимикробный иммунитет. Возможно развитие носительства (10%) и повторное заражение (6-8%). Уровень иммунитета можно установить в РПГА. Диагностические – титры — 1:200 и выше. С той же целью применяется реакция Шика – внутрикожное введение микродоз дифтерийного токсина (1/40 Dlm 0,2 мл) внутрикожно. Через 48 ч появляется покраснение и инфильтрат, что свидетельствует об отсутствии антитоксических антител; при их наличии реакция не возникает. Из-за опасности сенсибилизации организма эту пробу проводят редко.

Микробиологическая диагностика.

Исследуемый материал – слизь из зева, носа, пленки с миндалин, раневое отделяемое, кровь

1. Бактериоскопический метод – микроскопия мазков из исследуемого материала (окраска по Граму, Нейссеру, Леффлеру).

2. Бактериологический метод – выделение чистой культуры возбудителя и ее идентификация. Необходимо не только выделить из исследуемого материала дифтерийную палочку, но и определить ее токсигенность.

Определение токсигенности С. dphtheriae:

а) биологическая проба на животных – внутрикожное заражение морских свинок фильтратом культуры дифтерийных бактерий – вызывает некроз в месте введения. Минимальная смертельная доза (20-30 нг) убивает морскую свинку на 4-5 день;

б) заражение куриных эмбрионов (наблюдается гибель под действием токсина);

в) внесение в культуру клеток ( выявление ЦПД);

г) метод твердофазного ИФА с меченными пероксидазой антителами;

д) использование ДНК-зонда для обнаружения tox-оперона в геноме;

е) тест Илека и Оухтерлони (1948 г.) – основу составляет способность токсина и антитоксина диффундировать в агар и образовывать преципитаты (усы, стрелы) по ходу диффузии – метод двойной преципитации в геле, предварительный ответ может быть выдан через 48 часов, через 72 часа – заключение о наличии токсигенных коринебактерий, через 96 часов – окончательный ответ.

3. Серодиагностика – РПГА, ИФА, РИА, реакция ко-агглютинации, реакция Шика.

4. Экспресс – диагностика – РИФ, ИФА, РПГА, реакция ко-агглютинации.

5. Биохимический и молекулярно-биологический метод – ПЦР (обнаружение tox-гена).

источник

Возбудители капельных инфекций.

Микробиология дифтерии.

Дифтерия — острое инфекционное заболевание преимущественно детского возраста, которое проявляется глубокой интоксикацией организма дифтерийным токсином и характерным фибринозным воспалением в месте локализации возбудителя. Название болезни происходит от греческого слова diphthera — кожа, пленка, так как в месте размножения возбудителя образуется плотная, серовато-белого цвета пленка.

Возбудитель дифтерии — Corynebacterium diphtheriae — был обнаружен впервые в 1883г. Э. Клебсом в срезах из пленки, получен в чистой культуре в 1884г. Ф. Леффлером. В 1888г. Э. Ру и А. Иерсен обнаружили его способность продуцировать экзотоксин, играющий главную роль в этиологии и патогенезе дифтерии. Получение в 1892г. антитоксической сыворотки Э. Берингом и использование ее с 1894г. для лечения дифтерии позволило значительно снизить летальность. Успешное наступление на эту болезнь началось после 1923г. в связи с разработкой Г. Районом метода получения дифтерийного анатоксина.

Возбудитель дифтерии относится к широко распространенной в природе группе так называемых коринеформных бактерий, к роду Corynebacterium. В морфологическом отношении эти бактерии характеризуются тем, что клетки булавовидно утолщены на концах (от греч. согуnе — булава), образуют ветвление, особенно в старых культурах, и имеют зернистые включения.

Род Corynebacterium включает в себя большое количество видов, которые делят на 3 группы:

1. Коринебактерии — паразиты человека и животных и патогенные для них.

2. Коринебактерии, патогенные для растений.

3. Непатогенные коринебактерии. Многие виды коринебактерий являются нормальными обитателя­ми кожи, слизистых зева, носоглотки, глаз, дыхательных путей, уретры и половых органов.

С.diphtheriae — прямые или слегка изогнутые неподвижные палочки длиной 1,0-8,0мкм и диаметром 0,3-0,8мкм, спор и капсул не образуют. Очень часто они имеют вздутия на одном или обоих концах, часто содержат метахроматические гранулы — зерна волютина (полиметафосфаты), которые при окрашивании метиленовым синим приобретают голубовато-пурпурный цвет. Для их обнаружения предложен особый метод окрашивания по Нейссеру. При этом палочки окрашиваются в соломенно-желтый, а зерна волютина — в темно-коричневый цвет, и располагаются обычно по полюсам. C.diphtheriae хорошо окрашивается анилиновыми красите­лями, грамположительна, но в старых культурах нередко обесцвечивается и имеет отрицательную окраску по Граму. Для нее характерен выраженный полиморфизм, особенно в старых культурах и под влиянием антибиотиков.

Дифтерийная палочка является аэробом или факультативным анаэробом, температурный оптимум для роста 35-37 °С (границы роста 15-40 °С), оптимальная рН 7,6-7,8. К питательным средам не очень требовательна, но лучше растет на средах, содержащих сыворотку или кровь. Избирательными для дифтерийных бактерий являются свернутые сывороточные среды Ру или Леффлера, рост на них появляется через 8-12 ч в виде выпуклых, величиной с булавочную головку колоний серовато-бело­го или желтовато-кремового цвета. Поверхность их гладкая или слегка зернистая, на периферии колонии несколько более прозрачные, чем в центре. Колонии не сливаются, вследствие чего культу­ра приобретает вид шагреневой кожи. На бульоне рост проявляется в виде равномерного помутне­ния, либо бульон остается прозрачным, а на его поверхности образуется нежная пленка, которая постепенно утолщается, крошится и хлопьями оседает на дно.

Особенностью дифтерийных бактерий является их хороший рост на кровяных и сывороточных средах, содержащих такие концентрации теллурита калия, которые подавляют рост других видов бакте­рий. Это связано с тем, что C.diphtheriae восстанавливают теллурит калия до металлического теллура, который, откладываясь в микробных клетках, придает колониям характерный темно-серый или черный цвет. Применение таких сред повышает процент высеваемости дифтерийных бактерий.

C.diphtheriae разлагают глюкозу, мальтозу, галактозу с образованием кислоты без газа, но не ферментируют (как правило) сахарозу, имеют цистиназу, не имеют уреазы и не образуют индола. По этим признакам они отличаются от тех коринебактерий, которые часто встречаются на слизистой оболочке глаза (C.xerosis), носоглотки (C.pseudodiphtheriticum).Деление дифтерийных бактерий на биотипы было произведено с учетом того, при каких формах течения дифтерии у больных они выделяются с наибольшей частотой. Тип gravis чаще выделяется от больных с тяжелой формой дифтерии и вызывает групповые вспышки. Тип mitis вызывает более легкие и спорадические случаи заболеваний, а тип intermedius занимает промежуточное положение между ними. Некоторые штаммы имеют настолько смешанные характеристики, что их трудно отнес­ти к какому-то определенному типу. Существенно, однако, что токсигенные штаммы всех трех биотипов продуцируют идентичный токсин, большинство нетоксигенных или слаботоксигенных штам­мов соответствует типу mitis.

Антигенная структуракоринебактерий очень гетерогенна и мозаична. У возбудителей дифтерии всех трех типов обнаружено несколько десятков соматических антигенов, по которым их делят на серотипы. В России принята серологическая классификация, по которой различают 11 серотипов дифтерийных бактерий, из них 7основных (1-7) и 4 дополнительных, редко встречающихся сероти­пов (8-11). Шесть серотипов (1, 2, 3, 4, 5, 7) относятся к типу gravis, а пять (6, 8, 9, 10, 11) -— к типу mitis. Недостатком метода серотипирования является то, что многие штаммы, особенно нетоксигенные. обладают спонтанной агглютинацией или полиагглютинабельностью.

ФаготипированиеC.diphtheriae. Для дифференциации дифтерийных бактерий предложены раз­личные схемы фаготипирования. По схеме М. Д. Крыловой с помощью набора из 9 фагов (А, В, С, D, F, G, Н, I, К) удается типировать большинство токсигенных и нетоксигенных штаммов типа gravis. С учетом чувствительности к указанным фагам, а также культуральных, антигенных свойств и способности синтезировать корицины (бактерицидные белки) М. Д. Крылова выделила 3 самостоя­тельные группы коринебактерий типа gravis (I-III). В каждой из них имеются подгруппы токсигенных и их нетоксигенных аналогов возбудителей дифтерии.

Резистентность возбудителей дифтерии.C.diphtheriae проявляет большую устойчивость к низ­ким температурам, но быстро погибает при высокой температуре: при 60 °С — в течение 15-20 мин, при кипячении — через 2-3 мин. Все дезинфицирующие вещества (лизол, фенол, хлорамин и другие) в обычно применяемой концентрации уничтожают ее за 5-10 мин. Однако возбудитель дифтерии хорошо переносит высушивание и может долго сохранять жизнеспособность в высохшей слизи, слюне, в частичках пыли. В мелкодисперсном аэрозоле дифтерийные бактерии сохраняют жизнеспособность в течение 24-48 ч.

В связи с тем, что дифтерийный токсин в организме больных оказывает избирательное и специфическое воздействие на определенные системы(поражаются в основном симпатико-адреналовая система, сердце, сосуды и периферические нервы), то очевидно, он не только угнетает биосинтез белка в клетках, но и вызывает другие нарушения их метаболизма.

Для обнаружения токсигенности дифтерийных бактерий можно использовать следующие способы:

1. Биологические пробы на животных. Внутрикожное заражение морских свинок фильтратом бульонной культуры дифтерийных бактерий вызывает у них некроз в месте введения. Одна минимальная смертельная доза токсина (20-30 нг.) убивает морскую свинку весом 250 г. при подкожном введении на 4-5 день. Наиболее характерным проявлением действия токсина является поражение надпочечников – они увеличены и резко гиперемированы.

2. Заражение куриных эмбрионов – дифтерийный токсин вызывает их гибель.

3. Заражение культур клеток – дифтерийный токсин вызывает отчетливый цитопатический эффект.

4. Метод твердофазного иммуноферментного анализа с использованием меченных пероксидазой антитоксинов.

5. Использование ДНК-зонда для непосредственного обнаружения tox-оперона в хромосоме дифтерийных бактерий.

Однако наиболее простым и распространенным способом определения токсигенности дифтерийных бактерий является серологический – метод преципитации в геле. Суть его состоит в следующем. Полоску стерильной фильтрованной бумаги размером 1,5*8см смачивают антитоксической противодифтерийной сывороткой, содержащей 500АЕ в 1 мл, и наносят на поверхность питательной среды в чашке Петри. Чашку подсушивают в термостате 15-20 мин. Испытуемые культуры засевают бляшками по обе стороны от бумажки. На одну чашку засевают несколько штаммов, один из которых, заведомо токсигенный, служит контролем. Чашки с посевами инкубируют при 37 С, результаты учитывают через 24-48 ч. Вследствие встречной диффузии в геле антитоксина и токсина в месте их контрольного токсигенного штампа. Полоски неспецифической преципитации (они образуются, если в сыворотке кроме антитоксина присутствуют в небольшом количестве другие антимикробные антитела) проявляются поздно, выражены слабо и никогда не сливаются с полоской преципитации контрольного штампа.

Эпидемиология. Единственным источником заражения является человек – больной, выздоравливающий или здоровый бактерионоситель. Заражение происходит воздушно-капельным, воздушно-пылевым путём, а также через различные предметы, бывшие в употреблении у больных или здоровых бактерионосителей: посуда, книги, бельё, игрушки и т.п. В случае инфицирования пищевых продуктов (молоко, кремы и т.п.) возможно заражение алиментарным путем. Наиболее массивное выделение возбудителя имеет место при острой форме заболевания. Однако наибольшее эпидемиологическое значение имеют лица со стертыми, нетипичными формами заболевания, так как они часто не госпитализируются и выявляются далеко не сразу. Больной дифтерий заразен в течение всего периода болезни и части периода выздоровления. Средний срок бактерионосительства у выздоравливающих варьирует от 2 до 7 нед, но может продолжаться и до 3 мес.

Особую роль в эпидемиологии дифтерии играют здоровые бактерионосители. В условиях спорадической заболеваемости именно они являются основными распространителями дифтерии, способствуют и сохранению возбудителя в природе. Средняя продолжительность носительства токсигенных штаммов несколько меньше (около 2 мес.), чем нетоксигенных (около 2-3 мес.).

Причина формирования здорового носительства токсигенных и нетоксигенных дифтерийных бактерий раскрыта не до конца, так как даже высокий уровень антитоксического иммунитета не всегда обеспечивает полное освобождение организма от возбудителя. Возможно, определенное значение имеет уровень антибактериального иммунитета. Первостепенное эпидемиологическое значение имеет носительство токсигенных штаммов дифтерийных бактерий.

Особенности патогенеза и клиники.К дифтерии восприимчивы люди любого возраста. Возбудитель может проникнуть в организм человека через слизистые оболочки различных органов или через поврежденную кожу. В зависимости от локализации процесса различают дифтерию зева, носа, гортани, уха, глаза, половых органов и кожи. Возможны смешанные формы, например, дифтерия зева и кожи и т. п. Инкубационный период — 2-10 дней. При клинически выраженной форме дифтерии месте локализации возбудителя развивается характерное фибринозное воспаление слизистой оболочки. Токсин, вырабатываемый возбудителем, сначала поражает эпителиальные клетки, а затем — близлежащие кровеносные сосуды, повышая их проницаемость. В выходящем экссудате содержите фибриноген, свертывание которого приводит к образованию на поверхности слизистой оболочки серовато-белого цвета пленчатых налетов, которые плотно спаяны с подлежащей тканью и при отрыве от нее вызывают кровотечение. Следствием поражения кровеносных сосудов может быть развитие местного отека. Особенно опасной является дифтерия зева, так как она может стать причиной дифтерийного крупа вследствие отека слизистой оболочки гортани и голосовых связок, от которого раньше погибало в результате асфиксии 50-60% больных дифтерией детей. Дифтерийный токсин, поступая в кровь, вызывает общую глубокую интоксикацию. Он поражает преимущественно сердечно-сосудистую, симпатико-адреналовую системы и периферические нервы. Таким образом, клиника дифтерии складывается из сочетания местных симптомов, зависящих от локализации входных ворот, и общих симптомов, обусловленных отравлением токсином и проявляющихся в виде адинамии, вялости, бледности кожных покровов, понижения кровяного давления, миокардита, паралича периферических нервов и других нарушений. Дифтерия у привитых детей, если и наблюдаетеся, то протекает, как правило, в легкой форме и без осложнений. Летальность в период до применения серотерапии и антибиотиков составляла 50-60%, ныне — 3-6%.

Постинфекционный иммунитетпрочный, стойкий, фактически пожизненный, повторные случаи заболевания наблюдаются редко — у 5-7% переболевших. Иммунитет носит главным образом антитоксический характер, меньшее значение имеют антимикробные антитела.

Лабораторная диагностика.Единственным методом микробиологической диагностики дифтерии является бактериологический, с обязательной проверкой выделенной культуры коринебактерий на токсигенность. Бактериологические исследования на дифтерию проводят в трех случаях:

1) для диагностики дифтерии у детей и взрослых с острыми воспалительными процессами в области зева, носа, носоглотки;

2) по эпидемическим показаниям лиц, находившихся в контакте с источником возбудителя дифтерии;

3) лиц, вновь поступающих в детские дома, ясли, школы-интернаты, другие специальные учреждения для детей и взрослых, с целью выявления среди них возможных бактерионосителей дифтерийной палочки.

Материалом для исследования служат слизь из зева и носа, пленка с миндалин или других слизистых оболочек, являющихся местом входных ворот возбудителя. Посевы производят на теллуриновые сывороточные или кровяные среды и одновременно на свернутые сывороточные среды Ру (свернутая лошадиная сыворотка) или Леффлера (3 части бычьей сыворотки + 1 часть сахарного бульона), на которых рост коринебактерий появляется уже через 8-12 ч. Выделенную культуру идентифицируют по совокупности морфологических, культуральных и биохимических свойств, по возможности используют методы серо- и фаготипирования. Во всех случаях обязательна проверка на токсигенность одним из указанных выше методов. Морфологические особенности коринебактерий лучше изучать, используя три метода окрашивания препарата-мазка: по Граму, Нейссеру и метиленовым синим (или толуидиновым синим).

Лечение.Специфическим средством лечения дифтерии является применение противодифтерийной антитоксической сыворотки, содержащей не менее 2000 ME в 1 мл. Сыворотку вводят внутримышечную в дозах от 10 000 до 400 000 ME в зависимости от тяжести течения болезни. Эффективным методом лечения является применение антибиотиков (пенициллины, тетрациклины, эритромицин и р.) и сульфаниламидных препаратов. С целью стимулирования выработки собственных антитоксинов мжно использовать анатоксин. Для освобождения от бактерионосительства следует использовать те антибиотики, к которым данный штамм коринебактерий высокочувствителен.

Специфическая профилактика.Основным методом борьбы с дифтерией является массовая плановая вакцинация населения. Для этой цели используются различные варианты вакцин, содержа­щих дифтерийный анатоксин: АКДС, АДС, АДС-М, АД и АД-М. АКДС — адсорбированная (на гидроокиси алюминия) взвесь коклюшных бактерий, убитых формалином или мертиолятом (20 млрд. в мл), 30 флоккулирующих единиц дифтерийного и 10 единиц связывания столбнячного анатоксина 1 мл. Этой вакциной прививают детей с 3-месячного возраста. Курс вакцинации состоит из трех внутримышечных инъекций по 0,5 мл с интервалом в 1,5мес. Первую ревакцинацию АКДС-вакциной проводят через 1,5-2 года после законченной вакцинации однократно в дозе 0,5 мл. Последующие ревакцинации проводят вакциной АДС-М однократно в дозе 0,5 мл в 9 и в 16 лет, а затем через каждые 10 лет — в возрасте 26, 36, 46, 56 лет.

Вакцина АДС-М содержит уменьшенное количество антигенов — 10 флоккулирующих единиц дифтерийногои 10 единиц столбнячного анатоксинов в 1 мл, адсорбированных на гидроокиси алюминия.

Вакцина АДС содержит только дифтерийный и столбнячный анатоксины (60 и 20 единиц соответственно в 1 мл) и применяется для прививок детей, переболевших коклюшем, а также возрасте старше 3 лет.

Вакцина АД — очищенный, концентрированный и адсорбированный на гидроокиси алюминия дифтерийный анатоксин (в 1 мл — 60 флоккулирующих единиц). АД применяют по эпидемическим показаниям к детям, переболевшим дифтерией, с положительной реакцией Шика или с низким титром антитоксических антител, выявленных в РПГА.

АД-М — содержит уменьшенное количество дифтерийного анатоксина (в 1 мл — 10 единиц). применяется по эпидемическим и иным показаниям лицам старше 12 лет. Максимальный эффект вакцинация дает, когда прививками охвачены не менее 95% детей.

источник