Разнообразные клинические проявления бруцеллеза приводят к необходимости широкого использования лабораторных методов исследования: бактериологического, биологического, сероло­гического и аллергического. Комплекс лабораторных исследований с обязательным учетом клинических, эпидемиологических и эпизоотологических данных обеспечивает правильную диагностику заболевания.

Работа по выделению и дифференциации бруцелл из любого исследуемого материала должна проводиться в строгом соответ­ствии с санитарными правилами СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)».

Бактериологический метод.Для исследования на бруцеллез в лабораторию поступает патологический материал от больных людей (кровь, мокрота, гной, суставная жидкость, пунктат из селезенки, моча), сельско­хозяйственных животных (абортированный плод, лимфатические узлы, паренхиматозные органы, кровь, моча, молоко, молочные продукты) и различные объекты окружающей среды (вода, навоз). Материал для исследования забирают в стерильную посуду.

Для выделения культур бруцелл всех видов используют печеночные и мясопептонные агары в различных модификациях, агар Альбими, сухие питательные среды — агар «Д» и эритрит агар. Посев материала производят на качественные, предвари­тельно проверенные питательные среды, выращивают при 37 °С в аэробных условиях и с повышенным (5-10 %) со­держанием углекислого газа.

Исследование крови необходимо проводить во время лихо­радочного состояния больного до лечения антибиотиками, так как в этот период наблюдается наибольший процент выделения культур. Кровь в количестве не менее 10 мл стерильно берут из локтевой вены и засевают по 5 мл в два флакона среды Кастанеда. Начиная с четвертого дня, посевы ежедневно просматривают и, при отсутствии роста культуры, поверхность агара орошают бульоном путем осторожного покачивания фла­кона. При положительном результате на поверхности агара появляются колонии бруцелл. Если в течение месяца роста бруцелл не обнаруживают, то делают контрольный высев из бульона среды Кастанеда на твердую питательную среду.

При обследовании людей на бруцеллез для удобства доставки флаконов с кровью можно пользоваться транс­портной жидкой средой, которую готовят заранее и хранят в лаборатории в течение полугода. Кровь доставляют в лабораторию в транспортной среде, засевают на среду Каста­неда и исследуют по общепринятой схеме.

Бруцеллы можно выделить из костного мозга, мочи, спинно­мозговой жидкости, грудного молока, желчи, мокроты, трупного материала и т. д. Исследуемый материал по 0,1 мл засевают на плас­тинки питательного агара и по 5-10 мл на жидкие питатель­ные среды. Для задержки роста посторонней микрофлоры при исследовании загрязненного материала к среде добавляют генцианвиолет (1:200 000) или антибиотики (пенициллин 0,25 ед/мл и стрептомицин 0,05 ед/мл).

Особого внимания заслуживает получение культуры из моло­ка сельскохозяйственных животных. Забор молока у овец, коров, верблюдов и коз рекомендуется проводить путем сдаивания его последних порций из каждого соска вымени по 10 мл в стерильную посуду. Если исследовать молоко в течение первых суток не удается, то его консервируют добавлением сухой борной кислоты 1 %, генцианвиолета 1:25 000. Для исследования молока из больших емкостей забирают 100 мл верхнего слоя, затем перемешивают и набира­ют еще 100 мл.

Лучшие результаты дает посев сливок, полученных центри­фугированием молока при 2,5-3 тыс. об/мин в течение 3-5 мин или путем отстаивания в течение одних суток в холо­дильнике. Сливки в количестве 0,1-0,2 мл засевают на твердую питательную среду с подавителем посторонней микрофлоры (4-6 пробирок на 1 пробу).

Бактериологический метод считается самым достоверным, т. к. выделение бруцелл является неопровержимым доказа­тельством бруцеллезной инфекции. Отрицательные результаты бактериологического исследования не дают права для заключе­ния об отсутствии заболевания.

Биологический метод.Для выделения бруцелл из материала, загрязненного посто­ронней микрофлорой или содержащего малые концентрации возбудителя, в качестве биологической пробы используют морских свинок (весом 250-300 г) или белых мышей (весом 17-18 г). Исследуемый материал в объеме не более 0,5 мл вводят под­кожно в паховую область белой мыши и 1 мл морской свинке.

Вскрытие белых мышей производят через 20-25 дней, а мор­ских свинок — через 30-35 дней после введения материала. Перед вскрытием у свинок кровь из сердца исследуют в реакции агглютинации. Для посевов у морских свинок берут лимфатические узлы (паховый, подчелюстной, шейный, парааортальный), кусочки селезенки, печени, костный мозг, кровь, мочу; у белых мышей — лимфатические узлы (пахо­вый, аксиллярный, парааортальный, подчелюстной), кусочки селезенки и печени. Лимфатические узлы, кусочки печени и селе­зенки помещают в стерильную чашку. Костный мозг извлекают пипеткой из рассеченной бедренной кости. Посевы крови из сердца, мочи и костного мозга производят стерильной пипеткой непосредственно на питательную среду (агар и бульон). Лимфа­тические узлы и органы перед посевом надсекают ножницами, берут стерильной деревянной палочкой, вносят первоначально в пробирку с агаром, раздавливают и тщательно втирают мате­риал в поверхность питательной среды. Затем остатки посевного материала переносят в пробирку с бульоном. Палочка должна быть длиной 25-30 см, диаметром 4-5 мм, хорошо отструганная, с несколько заостренным концом. После использования ее погру­жают на 1 час в дезраствор.

Все посевы дублируют (часть помещают в условия повышен­ного содержания углекислоты), выдерживают при 37 °С до 30 дней. Для предотвращения высыхания питатель­ных сред пробирки заливают парафином или закрывают резино­выми колпачками.

Посевы просматривают каждые 3-4 дня. Из помутневших бульонов делают высев в пробирки со скошенным агаром. Коло­нии бруцелл на пластинчатом агаре становятся видимыми на 5-7 сутки, иногда позднее. По истечении 30 дней наблюдение прекращают. Если за это время рост не появился, посевы уничто­жают, а результаты бактериологического исследования считают отрицательными.

Результат оценивают положительно при выделении хотя бы одной колонии бруцелл. Идентификацию возбудителя бруцеллеза проводят по: по характеру роста культуры на плотных питательных средах; морфологии микроба в мазках, окрашенных по Граму, Козловскому; агглютинации со специфической бруцеллезной сывороткой на стекле и объемным методом; свечению на 3-4+ культур, обработанных бруцеллез­ной люминесцирующей сывороткой.

Культуры предварительно проверяют на наличие признаков диссоциации, одним из перечисленных выше методов.

Дифференциации (определение видов и биоваров) подлежат культуры в S-форме после идентификации.

Подкомитетом по таксономии бруцелл Международного комитета номенклатуры бактерий и Объединенным комитетом экспертов ФАО/ВОЗ по бруцеллезу в 1972 г. были определены единые тесты для проведения идентификации и дифференциации бруцелл для всех стран мира.

О видовой принадлежности культуры бруцелл и биоварах судят на основании результатов комплексного изучения отноше­ния выделенных культур к условиям выращивания (при повышенном содержании углекислоты или в обычных аэроб­ных условиях), чувствительности к анилиновым краскам (бактериостатическим методом), способности образовывать серо­водород, чувствительности к бруцеллезному фагу «Тb», окислительно-метаболических тестов, агглютинабельных свойств культур с использованием монорецепторных сывороток (антиабортус и антимелитензис) и дополнительного исследования уреазной активности, вирулентности и других признаков. Дифференциацию бруцелл на виды и биовары про­водят в параллельных опытах испытуемых штаммов с рефе­рентными всех трех видов бруцелл.

Серологические и аллергические методы исследования на бруцеллез.Серологические реакции и аллергическая проба являются общедоступными методами и применяются для диагностики бруцеллеза наряду с бактериологическим и биологическим методами.

В случае малой обсемененности пробы и отрицательных результатов, полученных при посеве исследуемого материала на питательные среды и заражении лабораторных животных, серологический метод может быть единственным, позволяющим диагностировать бруцеллез. В зависимости от целей исследования используют те или иные серологические методы.

При проведении эпидемиологического исследования в очагах применяют реакцию агглютинации пластинчатую (Хеддльсона) и объемную (Райта), реакцию Кумбса, РСК, РДСК, РПГА, кожную аллергическую пробу, иммуноферментный анализ (ИФА). Перед профилакти­ческой вакцинацией населения можно ограничиться постанов­кой пластинчатой реакции агглютинации (Хеддльсона) и кожной аллергической пробы.

Для диагностики острого и подострого бруцеллеза ставят реакцию Хеддльсона, Райта и РПГА. В случаях отрицательного результата используют реакцию Кумбса.

При диагностике хронического бруцеллеза и проведении диспансерного наблюдения за переболевшими рекомендуют наряду с реакциями Хеддльсона, Райта, РПГА, использовать реакцию Кумбса и аллергическую пробу (Бюрне).

Серологические реакции и аллергическая кожная проба по своему диагностическому значению в различные периоды заболевания не равноценны, вследствие чего не могут заменить друг друга. Это обусловливает необходимость применения комплексного серологического метода, являющегося наиболее надежным способом диагностики бруцеллеза.

В ранние сроки от начала заболевания (первые 6 месяцев) диагностическая ценность серологического метода выше, чем аллергического. Серологические реакции в этот период оказы­ваются положительными почти в 95 % случаев. По мере удлине­ния срока заболевания процент положительных серологических реакций начинает снижаться. При проведении обследования необходимо учитывать, что высокие титры антител всегда указывают на наличие инфекции, антитела в низких титрах или их полное отсутствие не исключает возможности заболевания. В связи с этим рекомендуется про­водить повторные исследования с интервалом 1-2 недели, особенно при подозрении на острую форму бруцеллеза.

Для постановки диагноза бруцеллеза у крупного рогатого скота применяют серологические и аллергические методы. Обследование начинают с постановки роз-бенгал пробы (РБП). Сыворотки, с которыми получена положительная РПБ, исследуют в РА Райта, РСК (РДСК), РПГА для установления титра агглютининов и наличия комплементсвязывающих анти­тел. Исследование проводят двукратно с промежутком в 30 дней.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ

Последнее изменение этой страницы: 2016-12-30; Нарушение авторского права страницы

источник

Автор: Шубина Е. А., технолог, кандидат биологических наук, ФГУП «Щелковский биокомбинат»

Опубликовано: 14 февраля 2011

Бруцеллез (Brucellosis) — инфекционная, хронически протекающая болезнь домашних, некоторые виды диких животных и человека, характеризующаяся поражением многих систем жизнеобеспечения, нарушением функций сосудистой, пищеварительной, мочеполовой систем и системы воспроизводства.

Сообщение об этом заболевании, по данным Хаджеса (1897), встречается уже у древнегреческого врача Гиппократа. Первое научное описание бруцеллеза было сделано в 1861 году английским военным врачом Мэрстоном. Широкое распространение среди людей отмечалось в 18 и 19 веках в странах, расположенных в бассейне Средиземного моря.

Изучая причины мальтийской лихорадки, английский врач Д. Брюс в 1886 – 1887 гг. установил, что виновником ее является специфический микрококк, названный им Micrococcus melitensis. Дальнейшие исследования показали, что источником возбудителя мальтийской лихорадки являются козы, пораженные инфекцией, а причиной заражения людей — потребление молока от таких коз. Несколько позже Micrococcus melitensis был выделен у овец.

В1897 г. датские ученые Банг и Стриболд установили, что массовые аборты у коров вызывает микроорганизм, названные B. abortus bovis. В 1914 г. Траум обнаружил очень сходный микроорганизм, названный Br. abortus suis, при массовых абортах у свиней.

Для диагностики бруцеллеза в 1897 г. Райтом была предложена серологическая реакция агглютинации, а в 1922 г. Берне разработал внутрикожную аллергическую пробу, облегчающую распознавание болезни.

Долгое время мальтийская лихорадка у людей и массовые аборты у домашних животных считались самостоятельными заболеваниями. В 1918 – 1920 гг. Ивенс, Мейер и Фезье, изучая биологические свойства возбудителя мальтийской лихорадки и массовых абортов у крупного рогатого скота, обнаружили их чрезвычайную близость. Эти исследования явились основанием объединить указанных возбудителей, в том числе и возбудителя массовых абортов у свиней, в одну родовую группу под наименованием Brucella (в честь Брюса), а вызываемые ими заболевания именовать бруцеллезом.

В России начало изучения бруцеллеза было положено работами Е. И. Марциновского (1911), но детальному изучению заболевание подверглось в различных местностях СССР лишь с 1935 г. Большой вклад в изучение бруцеллеза сельскохозяйственных животных внесли отечественные ученые: С. Н. Вышелесский, П. Ф. Здродовский, П. А. Вершилова, М. К. Юсковец, Е. С. Орлов, Р. А. Цион, А. П. Бессонов и др. Были всесторонне изучены биологические свойства возбудителя, усовершенствованы методы диагностики, показаны значение в борьбе с бруцеллезом вакцинальной профилактики и пути ее совершенствования.

Клинические признаки бруцеллеза у крупного рогатого скота

Длительность инкубационного периода 2 – 3 недели. Первым показателем развившегося инфекционного процесса служит появление в крови инфицированных животных агглютининов в постепенно нарастающих титрах.

У коров основным клиническим признаком бруцеллеза является аборт и реже рождение нежизнеспособного приплода. Коровы, заразившиеся до покрытия, в большинстве случаев приносят нормальный приплод. Аборт чаще всего происходит на 5 – 8-м месяце. За 1 – 2 дня до наступления аборта у коров отмечается припухание наружных половых органов, выделение из влагалища бесцветной или буроватой жидкости и набухание вымени. После аборта происходит задержка последа и развивается эндометрит, сопровождающийся обильными слизисто-гнойными или гнойно-фибринозными выделениями. При тяжело протекающем эндометрите повышается температура тела, снижаются удои, отмечается потеря веса, убыстряется СОЭ; умеренный лейкоцитоз. Эндометритам нередко сопутствуют серозные или серозно-катаральные маститы. В процессе могут вовлекаться яичники и фаллопиевы трубы, что приводит к нарушению полового цикла и временному или стойкому бесплодию.

У отдельных животных в связи с абортом или независимо от него можно наблюдать развитие серозных бурситов или серофибринозных артритов. Последние в большинстве случаев возникают в суставах передних конечностей — запястном, путовом, коленном, локтевом. У быков бруцеллез, хотя и редко, сопровождается развитием орхитов и эпидидимитов.

Лабораторная диагностика бруцеллеза основана на результатах бактериологического и серологического исследований. Бактериологическое исследование в основном применяют при первичной постановке диагноза на бруцеллез в ранее благополучных хозяйствах.

В лабораторию направляются пробы крови (сыворотки) для серологического исследования, абортивный плод с плодными оболочками, околоплодную жидкость, истечения из родовых путей или желудок плода, кусочки печени, селезенки, пробы молока (последние порции). При убое животных берут паренхиматозные органы, лимфатические узлы, пораженные суставы, у самцов — семенники. Объектом исследования могут быть молочные продукты (брынза, сыр, масло), объекты внешней среды.

При массовых диагностических исследованиях ставят пробирочную РА, роз бенгал пробу (РА на стекле), РСК, РДСК, кольцевую реакцию с молоком (КР). Диагностикумы для этих исследований, а также бруцеллин ВИЭВ для аллергической диагностики готовятся на Щелковском биокомбинате.

Для специфической профилактики бруцеллеза ФГУП «Щелковский биокомбинат» выпускает живые сухие вакцины из штамма B. abortus 19, 82 и 75/79-АВ; инактивированную адъювант — вакцину из штамма B. abortus КВ 17/100.

По данным К. В. Шумилова до 1952 года борьба с бруцеллезом крупного рогатого скота в нашей стране сводилась к проведению диагностических исследований и удалению из стад больных животных, без применения противобруцеллезных вакцин. В связи с осложнением эпизоотической ситуации в 1953 году в систему противобруцеллезных мероприятий была включена иммунизация животных вакциной из штамма B. abortus 19.

Вакцину из штамма B. abortus 19 применяли до 1970 года. За 20 лет применения вакцины многие хозяйства, даже области, были оздоровлены от болезни. Однако в регионах с широким распространением бруцеллеза эффективность оздоровительных мероприятий оказалась низкой. В первую очередь, это было обусловлено высокой агглютиногенностью вакцины. Агглютинины и комплементсвязывающие антитела, вырабатывающиеся в ответ на введение вакцины, сохраняются в организме животных до 5 – 8 лет и затрудняют дифференциацию иммунизированных животных от больных бруцеллезом.

С 1971 по 1974 год вакцину из штамма B. abortus 19 использовали только на телках 5 – 8 месячного возраста. С 1974 года и по настоящее время в России в комплексе противобруцеллезных мероприятий применяются вакцины из штаммов B. abortus 82 и 19. Живая сухая вакцина против бруцеллеза из слабоагглютиногенного штамма № 82 отличается от вакцины из штамма 19 слабым серологическим ответом с быстрым снижением уровня гуморальных антител, что позволяет при помощи серологических реакций дифференцировать вакцинированных животных.

За 30 лет работы с применением вакцины из штамма B. abortus 82 и смены пяти поколений коров к 2004 году (К. В. Шумилов) количество неблагополучных по бруцеллезу пунктов и заболевших животных значительно сократилось.

Сухая живая вакцина против бруцеллеза крупного рогатого скота из штамма B. abortus 75/79-АВ разработана сотрудниками ВГНКИ и Алтайской НИВС с использованием культуры штамма 75/79, выделенного от коровы, ранее иммунизированной вакциной из штамма B. abortus 82. После многократных пассажей выделенного штамма через организм морских свинок и телок и целенаправленной селекции на питательных средах, был получен новый вакцинный штамм 75/79-АВ. Вакцины не обладает абортогенными свойствами, что дает возможность проводить иммунизацию маточного поголовья независимо от сроков стельности. Вакцина является слабоагглютиногенной; агглютинины и комплементсвязывающие антитела регистрируются у привитых животных в течение трех месяцев после иммунизации, что делает возможным их исследование по истечении указанного срока. У животных, иммунизированных вакциной, выраженный иммунитет сохраняется в течение года, что позволяет за указанный срок оздоравливать неблагополучные хозяйства от бруцеллеза.

Значительный интерес для практики представляет адъювант-вакцина против бруцеллеза крупного рогатого скота, сконструированная во ВГНКИ. Вакцина представляет собой эмульсию типа «вода в масле», состоящую из инактивированной культуры штамма B. abortus КВ 17/100 и масляного адъюванта.

Штамм B. abortus КВ 17/100, находящийся в R-форме, получен путем целенаправленной селекции по культуральным, морфологическим, биохимическим и антигенным свойствам из вакцинного штамма B. abortus 104М, находящегося в S-форме. Адъювант-вакцина не индуцирует синтез S-бруцеллезных антител в диагностических титрах у животных, не сенсибилизированных бруцеллами. Адъювант-вакцина индуцирует синтез S-бруцеллезных антител у крупного рогатого скота с латентной формой бруцеллеза, что позволяет за счет быстрого удаления из стад таких животных, ускорить оздоровление хозяйств, неблагополучных по бруцеллезу.

Адъювант-вакцина не абортогенна и может быть использована для иммунизации маточного поголовья крупного рогатого скота независимо от сроков стельности.

источник

Бруцеллез КРС (этиология, эпизоотология, патологоанатомические изменения, диагностика, дифференциальная диагностика, профилактика и меры борьбы)

Бруцеллез (brucellessis) – хроническая инфекционная болезнь животных и человека. У многих животных проявляется абортами и задержанием последа, орхитами, рождением нежизнеспособного молодняка и бесплодием. В связи с социальной опасностью бруцеллез включен в список карантинных болезней.

Бруцеллез распространен во многих странах мира – в Африке, Центральной и Южной Америке, в некоторых странах Азии и Европы, в том числе СНГ (Украина, Россия, Казахстан). В Республике Беларусь бруцеллез не регистрируется с 1982 года.

Экономический ущерб складывается из недополучения приплода (аборты могут регистрироваться у 60% животных), яловости, снижения продуктивности, большие затраты идут на проведение карантинных мероприятий. Заболевание у человека может привести к инвалидности (чаще из-за поражения суставов) и даже к смерти.

Этиология. Бактерии из рода Brucella подразделяют на 6 видов: Br. abortus (возбудитель бруцеллеза крупного рогатого скота); Br. melitensis (овец и коз; особенно восприимчив человек); Br. suis(свиней); Br. neotomae (крыс); Br. ovis (инфекционного эпидидимита баранов); Br. canis (бруцеллез собак). Все виды бруцелл по морфологии и культуральным свойствам не отличаются друг от друга. Это мелкие неподвижные бактерии размером 0,3-0,5 х 0,6-2,5 мкм, спор не образует, грамотрицательны, растут на обычных питательных средах. К физическим и химическим факторам устойчивость бруцелл невысокая: в почве, воде, навозе, грубых кормах возбудитель сохраняет жизнеспособность до 4 мес.; прямые солнечные лучи убивают за 3-4 часа, нагревание до 900-1000С – моментально. По устойчивости к дезосредствам отнесены к 1-й группе возбудителей инфекционных болезней (малоустойчивы).

Эпизоотологические данные. Восприимчивы многие виды диких и домашних животных. Чаще заболевает крупный рогатый скот, свиньи, овцы, реже – лошади и верблюды. К бруцеллезу восприимчив человек. Молодняк до 5-ти мес. возраста относительно устойчив к бруцеллезу. Его восприимчивость возрастает к периоду созревания половой системы. Из лабораторных животных – восприимчивы морские свинки, реже – белые мыши. Источник возбудителя инфекции – больные животные. Возбудитель выделяется из организма с абортированным плодом, околоплодными водами, истечениями из половых органов, с молоком, спермой, мочой и калом. Факторами передачи являются контаминированные объекты внешней среды, акушерские инструменты, продукция и сырье животного происхождения, инвентарь и спецодежда. Заражение происходит алиментарным и половым путем, через кожу и слизистые оболочки (даже неповрежденные), трансмиссивно (через укусы клещей и кровососущих насекомых). Для заболевания характерна стационарность, которая обусловлена носительством возбудителя мышевидными грызунами, кровососущими насекомыми, дикими животными. Сезонность болезни не выражена.

У крупного рогатого скота, свиней и овец бруцеллез протекает в виде эпизоотий, заболеваемость может достигать 60%, больные животные погибают в редких случаях.

Патогенез. Бруцеллы проникают из внешней среды в организм через слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта, мочеполовой системы, конъюнктиву, а также через поврежденную кожу. В течение первых 6-10 дней бруцеллы с током лимфы попадают в лимфоузлы, обусловливая скрытую форму болезни, затем в течение 10-15 дней локализуются в соответствующем лимфоузле (фаза регионарной инфекции). Через 20-30 дней, преодолев регионарный барьер, бруцеллы выхолят из лимфоузла, и с током лимфы и крови распространяются по всему организму, обсеменяя все органы, и в случае беременности – плод. Воспалительные процессы развиваются в различных органах, клинически проявляясь артритами, маститами, эпидидимитами, бурситами, абсцессами и абортами.

Течение и симптомы болезни. Инкубационный период – 3-4 недели (время от попадания бруцелл в организм до появления антител в сыворотке крови). Течение болезни чаще хроническое, в отдельных случаях протекает бессимптомно. Ведущим симптомом у беременных животных является аборт. У коров аборты чаще регистрируются во второй половине беременности, имеют место задержание последа, приводящее к эндометриту и яловости, маститы и повышается температура тела. У быков чаще регистрируют эпидидимиты и артриты.

У свиноматок нередки аборты в первую половину супоросности, проходят легко, они малозаметны. Животное через 7-10 дней после аборта может снова приходить в охоту. У свиноматок также часто наблюдаются абсцессы в подкожной клетчатке, парезы и параличи задних конечностей.

Патологоанатомические изменения. Взрослые животные гибнут от бруцеллеза очень редко. При вскрытии отмечают у самок основные поражения в половой системе (гнойно-катаральный метрит), также – гнойно-некротические изменения в суставах и придатках семенников, абсцессы в печени, почках, селезенке.

Наибольшее диагностическое значение имеют патизменения в абортированных плодах: отеки подкожной клетчатки, скопление в брюшной и грудной полостях жидкости буро-красного цвета с фибрином, кровоизлияния на слизистых и серозных оболочках, некрозы в печени.

Диагностика. Учитывают эпизоотологические, клинические и патологоанатомические данные. Окончательная диагностика осуществляется на основании лабораторных исследований.

Во всех случаях аборта проводят бактериологическое исследование плода (желудок) и ставят биопробу. Основной метод прижизненной диагностики бруцеллеза – серологический (РА, РСК, РДСК, РБП – розбенгалпроба и КР с молоком). Кроме того, у овец, коз и свиней используют аллергическую пробу. Бактериологические исследования проводят в случае аборта или появления других признаков бруцеллеза. Диагноз считают установленным при положительных результатах бактериологического исследования и при сохранении у подозрительных по заболеванию животных реакций при повторных исследованиях.

При постановке диагноза исключают кампилобактериоз, хламидиоз, инфекционный эпидидимит, лептоспироз, сальмонеллез, незаразные болезни с симптомами аборта.

Лечение. Больные животные подлежат убою.

Специфическая профилактика. В ряде стран для специфической профилактики бруцеллеза используют живые вакцины из штаммов №19, №82, REV – 1 и др. В Республике Беларусь Специфическая профилактика бруцеллеза у животных не проводится.

Мероприятия по профилактике и ликвидации. В благополучных по бруцеллезу хозяйствах осуществляют постоянный контроль за состоянием поголовья, перегруппировками, ввозом и вывозом животных, соблюдением ветеринарно-санитарных правил, раз в два года проводят серологические исследования сывороток крови животных.

При установлении впервые бруцеллеза в ранее благополучном хозяйстве животных вместе с молодняком отправляют на убой. В стационарно неблагополучных районах молодняк выращивают изолированно, формируя из него дойные стада. Неблагополучные хозяйства карантинируют и оздоравливают путем систематических диагностических исследований. При этом проводят серологическое исследование сыворотки крови, через каждые 15-30 дней, до получения двух подряд отрицательных результатов, затем стадо ставят на профилактический контроль сроком на 6 месяцев и в этот период проводят два контрольных исследования через 3 месяца. При получении отрицательных результатов карантин снимают при условии проведения всего комплекса мероприятий по ликвидации болезни

Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим.

Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций.

Папиллярные узоры пальцев рук — маркер спортивных способностей: дерматоглифические признаки формируются на 3-5 месяце беременности, не изменяются в течение жизни.

источник

Цель занятия: изучить методы диагностики бруцеллеза.

Материалы и оборудование: безыгольный инъектор или набор для аллергических исследований, набор для постановки РБП, иглы для взятия крови, набор диагностикумов, позитивных сывороток, антигенов, противобруцеллезные вакцины; бруцеллин ВИЭВ, дезсредства.

Место проведения занятия: лаборатория кафедры эпизоотологии.

Бруцеллез — хронически протекающая инфекционная болезнь животных, вызываемая бактериями рода Brucella, в который входят 6 самостоятельных видов: В. melitensis — возбудитель бруцеллеза у коз и овец, В. abortus — у крупного рогатого скота, В. suis — у свиней, северных оленей, зайцев, В. ovis—у овец, В. canis—y собак, В. neotomae — у древесных крыс. В. melitensis и В. abortus могут мигрировать на животных других видов. От больных животных могут заразиться люди, для которых наиболее опасен возбудитель бруцеллеза овец и коз.

Диагноз на бруцеллез основан на результатах бактериологических, серологических, аллергических исследований и клинико-эпизоотических данных.

Клинические признаки болезни у животных нехарактерны — аборты, артриты, бурситы, эндометриты, вагиниты, орхиты, эпидидимиты могут встречаться при многих других заболеваниях.

Патологоанатомические изменения при бруцеллезе также малохарактерны. Самый надежный и точный диагноз—лабораторный, т. е. выделение и дифференциация возбудителя.

При лабораторных исследованиях возбудителя обнаруживают тремя методами: бактериоскопией мазков, выделением чистой культуры из исходного материала и, при необходимости, методом биопробы на морских свинках.

Мазки окрашивают по Граму, Козловскому, Шуляку—Шину, Стампу. Бруцеллы — мелкие грамотрицательные коккобактерии, располагаются попарно или кучно. При окраске по Козловскому, Шуляку—Шину, Стампу клетки бруцелл красного цвета.

Для культивирования бактерий используют мясопептонный печеночный бульон (МППБ), печеночно-глюкозо-глицериновый бульон (ПГГБ), картофельный агар и др. Посевы помещают в термостат при 37…38 °С и просматривают каждые 3…4 дня до 30 дней. В бульоне бруцеллы образуют равномерное помутнение и пристеночное кольцо, в дальнейшем — небольшой осадок на дне пробирки. На агаре растут в виде мелких блестящих выпуклых просвечивающихся колоний сероватого оттенка. Выделенные культуры идентифицируют в реакции агглютинации (РА) на стекле с позитивной бруцеллезной сывороткой.

Для биопроб используют двух морских свинок массой 350…400 г, предварительно проверенных на бруцеллез серологическим методом (отрицательный результат РА в разведении 1 : 5).

Суспензию исходного материала на стерильном физиологическом растворе (соотношение 1:10) вводят подкожно с внутренней стороны бедра морским свинкам в дозе 1 мл. На 15, 25, 40-й день сыворотки крови свинок исследуют в пробирочной РА в разведении от 1 : 10 до 1 : 80. При положительной РА (в разведении 1 : 10 и выше) морских свинок убивают, материал от них исследуют бактериологическим методом. При отрицательной РА биопробу считают отрицательной.

При массовых исследованиях большое значение имеют серологические и аллергические методы диагностики бруцеллеза:

У крупного рогатого скота, яков, зебу, буйволов — серологический: РА в пробирках, реакция связывания комплемента (РСК) или реакция длительного связывания комплемента (РДСК), пластинчатая реакция агглютинации с Роз-Бенгал антигеном — Роз-Бенгал проба (РБП), кольцевая реакция с молоком (КР), реакция иммунодиффузии с О-ПС-антигеном (РИД);

У овец, коз, оленей, маралов, лошадей, верблюдов—серологический: РА, РСК/РДСК, РБП; аллергический;

У свиней — серологический: РСК/РДСК, РБП; аллергический;

У собак и животных других видов — серологический: РА, РСК.

Повторно животных исследуют на бруцеллез серологическим методом через 15…30 дней, аллергическим — через 25…30 дней.

Коров (нетелей), буйволиц, верблюдиц исследуют независимо от периода беременности, овцематок (козематок) и свиноматок— через 1…2 мес после родов, молодняк животных всех видов — начиная с 4-месячного возраста.

Крупный и мелкий рогатый скот, иммунизированный против бруцеллеза, исследуют в порядке и в сроки, предусмотренные наставлением по применению вакцины, и оценивают их состояние

Заболевание бруцеллезом считают установленным при выделении культуры бруцелл из биоматериала, положительной биопробе или при положительных результатах следующих серологических исследований невакцинированных животных: крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), верблюдов и лошадей — одновременно в РИД и РА с титром антител 200 МЕ/мл и выше; овец и коз — в РА с титром антител 100 МЕ/мл и выше; оленей (маралов) и собак—в РА с титром антител 50 МЕ/мл и выше; животных всех видов — в РСК в разведении сыворотки 1 : 5 и выше.

При положительных результатах серологических исследований невакцинированных животных: крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), верблюдов, лошадей — только в РА с титром антител 50…100 МЕ/мл; овец, коз, оленей (маралов) в РА с титром антител 25…50 МЕ/мл — обследуют повторно через 15…30 дней. При повышении титров заболевание считают установленным;

Если титры остались прежними, прибегают к дополнительным исследованиям (согласно утвержденным Правилам).

Заболевание считают установленным, если в неблагополучных по бруцеллезу стадах крупного рогатого скота выявлены ранее не вакцинированные животные, положительно реагирующие в РА с титром антител 100 МЕ/мл и выше или (и) в РСК (РДСК) в разведении 1 : 5 и выше.

Иммунизированные отары овец и коз признают неблагополучными по бруцеллезу при положительном результате бактериологического исследования абортированных плодов или положительной биопробе, а также при выявлении среди баранов-производителей, пробников и ярок животных, положительно, реагирующих в РА с титром антител 100 МЕ/мл и выше, РСК в разведении сыворотки 1 : 5 и выше.

Свиней признают больными бруцеллезом, если аллергическая проба подтверждается положительной РСК.

Бруцеллин вводят свиньям с наружной стороны ушной раковины в дозе 0,2 мл. Реакцию учитывают через 24 и 48 ч пальпацией места инъекции. У больных животных на месте введения аллергена отмечают воспалительную реакцию в виде припухлости плотной или тестоватой консистенции. У здоровых местная реакция отсутствует.

Результаты обследования крупного рогатого скота в РИД и КР оценивают в соответствии с наставлениями по постановке и учету этих реакций.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Исследовать под микроскопом готовые препараты.

2. Описать рост культуры бруцелл на питательных средах.

3. Оценить результаты заранее поставленных РА в пробирке и КР с молоком.

4. Поставить и учесть РБП на бруцеллез (рис. 8).

источник

Бруцеллез — инфекционная хроническая болезнь домашних и диких животных и человека. Клинические признаки и последствия заболевания, дифференциальная диагностика. Эпизоотологические данные, патогенез, течение болезни и патологоанатомические изменения.

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru

Министерство сельского хозяйства и продовольствия Республики Беларусь

УО «Витебская ордена « Знак Почета»

Государственная академия ветеринарной медицины

Кафедра эпизоотологии и инфекционных болезней животных

бруцеллез инфекционная болезнь эпизоотологический

На тему: БРУЦЕЛЛЕЗ: ДИАГНОСТИКА И ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ У ЖИВОТНЫХ

Определение болезни
• Историческая справка
• Распространение
• Экономический ущерб
• Этиология
• Эпизоотологические данные
• Патогенез
• Течение и симптомы болезни
• Патологоанатомические изменения
• Диагностика
• Дифференциальная диагностика
• Лечение

Бактериологическому исследованию (включая постановку биопробы) подвергают биоматериал от животных в случае наличия у них признаков, вызывающих подозрение на заболевание бруцеллезом. Абортированные плоды, поступающие в ветеринарную лабораторию для исследования на фихомоноз, кампилобактериоз, сальмонеллез, лептоспироз, хламидиоз, подлежат также обязательному исследованию на бруцеллез. В лабораторию направляют абортированный плод с плодными оболочками и желудок плода с содержимым, кусочки печени, селезенки, семенники с придатками, измененные участки рогов матки и лимфоузлы, содержимое бурс, пробы молока. Одновременно в лабораторию направляют I р (ни, или сыворотку абортировавшего животного. Бактериологическое исследование на бруцеллез включает микроскопию мазков, окрашенных по Граму и одному из следующих специальных мг к >дон: по Стемпу, Козловскому или Шуляку-Шину; выделение культуры бруцелл путем посевов материала на мясо-пептонный печеночный бульон (МПБ), печеночно-глюкозо-глицериновый бульон, печеночно-глюкозо-глицериновый агар (МППГГА), печеночно-глицериновый агар (ПГГА), картофельный агар и др. Выделение культуры идентифицируют по морфологическим, культуральным « пометам и в реакции агглютинации на стекле с позитивной бруцеллезной сывороткой. Биопробу ставят на морских свинках (не менее двух) массой 400 г. Диагноз на бруцеллез считается установленным в одном из следующих случаев:

при выделении культуры бруцелл из биоматериала или положительной биопробе, а также при положительных результатах серологических исследований не вакцинированных животных при следующих показателях: для крупного рогатого скота и лошадей — РА с наличием антител 200 МЕ/мл и выше; для овец и коз — РА 100 МЕ/мл и выше; для собак — РА 50 МЕ/мл и выше; для всех видов животных РСК в разведении сыворотки 1: 5 и выше;

при выявлении в стадах крупного рогатого скота положительно реагирующих животных только в РА не выше 200 МЕ/мл и РСК в разведении сыворотки крови не выше 1: 10 проводят повторное исследование через 15-30 дней в РА, РСК. При повышении титров в РА или РСК заболевание считается установленным.

Оздоровление крупного рогатого скота от бруцеллеза осуществляется путем полной ликвидации поголовья неблагополучного хозяйства (фермы) и проведения санации помещений. Животных, положительно реагирующих при исследовании на бруцеллез, абортировавших или имеющих другие клинические признаки болезни, немедленно изолируют от другого поголовья и в течение 15 дней сдают на убой без откорма и нагула, независимо от их племенной и производственной ценности, весовых кондиций, возраста, состояния беременности. Хозяйство признается оздоровленным от бруцеллеза крупного рогатого o нота и с него снимается карантин после убоя неблагополучного поголовья, санации животноводческих помещений, территории ферм и получения двух отрицательных результатов серологических исследований на (бруцеллез с интервалом 30 дней животных, имевших контакт с животными неблагополучного стада, включая скот, принадлежащий гражданам, проживающим в данном населенном пункте. На неблагополучных фермах проводят дезинфекцию, дезинсекцию, дератизацию, санитарный ремонт животноводческих помещений и другие ветеринарно-санитарные мероприятия. Для дезинфекции в хозяйствах применяют 20% -ю взвесь свежегашеной и жести, взвесь или осветленный раствор хлорной извести, содержащей активного хлора, препарат ДП — 2,2% -й горячий раствор гидроксида па грим, 3% -й горячий раствор каустифицированной содопогашенной смеси, и раствор формальдегида, 5% -й горячий раствор кальцинированной годы, 0,5% -й раствор глутарового альдегида, 5% -й раствор технического натрия, растворы нейтрального гипохлорита кальция, тексанита, содержащие 3 % активного хлора. При установлении диагноза у овец (коз) в благополучных районах, все неблагополучное поголовье овец (коз) хозяйства, независимо от форм собственности, вместе с приплодом подвергают немедленному убою. Остальное поголовье овец (коз), бывшее в контакте с неблагополучной тарой, подвергается двукратному серологическому исследованию с интервалом в 30 дней. При получении отрицательного результата исследований, убоя неблагополучной отары, проведении санации территории ферм, животноводческих помещений карантин снимается. На фермах и комплексах с поголовьем до 12 тыс. животных, на которых установлено заболевание свиней бруцеллезом, все поголовье, в том числе молодняк, сдают на убой. Супоросных маток сдают на убой после окончании опороса и отъема поросят. Ликвидацию очага бруцеллеза осуществляют в срок не более 6 месяцев. На неблагополучной ферме осеменение свиноматок запрещается. На комплексах по выращиванию свиней, имеющих более 12 тыс. голов, при установлении бруцеллеза убою подвергается все поголовье неблагополучных технологических групп, секторов (блоков) или свинарников. При установлении заболевания крупного рогатого скота в отдельных хозяйствах граждан все поголовье животных, содержащихся в этих хозяйствах, подвергается исследованиям серологическим методом до получения двукратных отрицательных результатов.

Распространение бруцеллеза животных, степень опасности и ущерб. Возбудитель болезни. Возникновение, патогенез, течение и клиническое проявление. Патологоанатомические признаки. Диагностика и лечение. Иммунитет, специфическая профилактика заболевания.

курсовая работа [3,3 M], добавлен 06.11.2014

Ознакомление с патогенезом, клиническими признаками, течением и основными симптомами бешенства у домашних и диких теплокровных животных. Изучение патологоанатомических изменений организма. Дифференциальная диагностика, лечение и профилактика заболевания.

реферат [24,2 K], добавлен 07.12.2011

Хламидиоз — зооантропонозная, инфекционная болезнь животных, причины и условия ее возникновения, экономический ущерб от нее. Развитие, течение и симптомы заболевания, патологоанатомические изменения. Диагностика, профилактика и лечение хламидиоза.

реферат [19,4 K], добавлен 06.02.2012

Характеристика станции по борьбе с болезнями животных. Бруцеллез — хроническая инфекционная болезнь млекопитающих, возбудитель заболевания. План мероприятий против бруцеллеза, особенности его составления. Течение, симптомы, меры борьбы и профилактика.

курсовая работа [86,7 K], добавлен 12.04.2012

Распространение инвазионных болезней среди домашних и диких млекопитающих животных. Биология развития ценуроза овец, вызываемого личиночной стадией ленточного гельминта. Эпизоотологические данные, патогенез и иммунитет, диагностика и лечение заболевания.

курсовая работа [1,2 M], добавлен 01.04.2012

Понятие и история исследований бруцеллеза у животных, его проявления и степень опасности, оценка ущерба для хозяйства. Возбудитель заболевания и характер его воздействия на организм животного. Дифференциальная диагностика и меры профилактики заболевания.

реферат [20,7 K], добавлен 21.09.2009

Возбудитель ньюкаслской болезни птиц. Эпизоотологические данные, патогенез, клинические признаки и патологоанатомические изменения. Диагностика, методы лечения ньюкаслской болезни и инфекционного бронхита кур. Иммунитет и специфическая профилактика.

курсовая работа [62,3 K], добавлен 24.05.2012

Группа инфекционных болезней, общих для животных и человека. Бруцеллез — инфекционная, хронически протекающая болезнь. Описание симптомов бруцеллеза у Гиппократа. Источник возбудителя инфекции — больные бруцеллезом животные, характеристика возбудителя.

курсовая работа [86,4 K], добавлен 13.12.2010

Инфекционная болезнь сельскохозяйственных и диких животных. Определение и распространение сибирской язвы. Течение и симптомы болезни, патологоанатомические изменения. Иммунитет и специфическая профилактика. Мероприятия по профилактике и ликвидации.

реферат [37,5 K], добавлен 21.01.2012

Биология возбудителя пироплазмоза у собак. Эпизоотологические характеристики данного заболевания. Его симптомы и клинические признаки. Воздействие токсинов piroplasma canis на организм. Диагностика и лечение болезни. Патологоанатомические изменения.

реферат [247,4 K], добавлен 19.06.2014

источник

1.1. Бруцеллез — инфекционная, хронически протекающая болезнь животных.

Возбудитель — бактерии из рода бруцелла, в который входят шесть самостоятельных видов: мелитензис (овец и коз), абортус (крупного рогатого скота), суис (свиней), канис (собак), овис (баранов и овец) и неотома (кустарниковых крыс).

Микроорганизмы первых четырех видов вызывают бруцеллез животных, а пятого вида — инфекционный эпидидимит баранов (ИЭ).

От животных, больных бруцеллезом, могут заражаться люди, для которых наиболее опасен возбудитель бруцеллеза овец и коз.

1.2. Диагноз на бруцеллез у животных ставят на основании результатов бактериологического, серологического, молекулярно-генетического и аллергического исследований с учетом эпизоотологических данных и клинических признаков болезни, руководствуясь при этом санитарными и ветеринарными правилами по профилактике и борьбе с заразными болезнями, общими для человека и животных.

1.2.1. При установлении диагноза на бруцеллез необходимо учитывать следующее:

— различные виды возбудителя являются патогенными, в основном, для животных соответствующего вида. Бруцеллы видов мелитензис, абортус и суис могут мигрировать на животных других видов;

— клинические признаки бруцеллеза у животных не характерны. Наиболее часто клиническое проявление болезни у маточного поголовья — аборт, у свиноматок наблюдается мумификация плодов.

При абортах отмечается утолщение плодовых оболочек, образование на них фибринозных или гнойных хлопьев. Бруцеллез сопровождается нередко поражением суставов (артриты), синовиальной системы (тендовагиниты, бурситы), половой системы (у самок — эндометрит, вагинит, у самцов — орхит, эпидидимит);

— патологоанатомическая картина при бруцеллезе не имеет характерных особенностей, позволяющих использовать их для диагностики этой болезни. Только у свиней на слизистой оболочке матки иногда находят желтовато-гнойные или казеозные узелки величиной с просяное зерно, так называемый «милиарный бруцеллез матки»;

— у баранов, больных бруцеллезом, в семенниках и придатках обнаруживают некротические или гнойные очаги различной величины; отмечают заполнение полости мошонки серозно-гнойным транссудатом, разрастание фиброзной ткани, сращение придатка с семенником и общей влагалищной оболочкой, иногда атрофию семенников.

1.3. Диагностика бруцеллеза включает лабораторные (бактериологическое, серологическое и молекулярно-генетическое) исследования материала и аллергическое исследование свиней в хозяйствах.

Плановые серологические исследования являются основным методом выявления больных и подозрительных по заболеванию животных.

Бактериологическую диагностику проводят в случае аборта или при появлении у животных других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты и прочие), вызывающих подозрение на данное заболевание. Одновременно проводят серологическое исследование сывороток крови этих животных.

Молекулярно-генетическое исследование (ПЦР) проводят в случае аборта и при появлении у животных других клинических признаков, вызывающих подозрение на бруцеллез, а также при получении положительных и сомнительных результатов серологического исследования на бруцеллез животных, не иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, из хозяйств, благополучных по данному заболеванию.

1.4. При взятии проб крови, молока и патологического материала, а также проведении лабораторных исследований необходимо соблюдать меры, предупреждающие заражение людей и обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями.

2.1. Материал для лабораторных исследований отбирают от каждого животного в отдельности.

2.2. Для бактериологического исследования на бруцеллез направляют абортированный плод с плодовыми оболочками (от свиноматок берут не менее трех плодов) или селезенку, печень, желудок плода с содержимым, перевязанный со стороны пищевода и двенадцатиперстной кишки, и околоплодную жидкость.

Для прижизненной диагностики бруцеллеза от животных берут кровь, молоко, содержимое гигром (бурситов) и абсцессов. При диагностическом убое — дополнительно селезенку, печень, подчелюстные, заглоточные, предлопаточные, надколенные, подколенные, надвыменные, парааортальные, тазовые лимфатические узлы и половые органы. Жидкий материал берут в стерильную посуду (пробирки, банки).

При взятии содержимого гигром, бурс в области поражения выстригают шерсть, кожный покров дезинфицируют 70%-ным спиртом и смазывают настойкой йода. Затем стерильным шприцем с иглой большого диаметра делают пункцию, отсасывают содержимое гигромы (бурсы) и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.

Перед взятием проб молока у коров вымя обмывают теплой водой, соски обрабатывают 70%-ным спиртом. Для исследования из каждой доли вымени берут последние порции молока в количестве 10 — 15 мл в отдельные стерильные пробирки с резиновыми пробками.

У овец и коз пробы молока берут путем пункции цистерны вымени. Для этого животное фиксируют в боковом положении, вымя у основания соска протирают 70%-ным спиртом и смазывают настойкой йода. Стерильным шприцем с иглой делают пункцию у основания соска и после попадания иглы в цистерну (о чем судят по свободному движению конца иглы) набирают в шприц молоко и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.

Молоко должно быть доставлено в лабораторию и исследовано в день взятия пробы. Если это невозможно, молоко консервируют сухой борной кислотой (0,1 г на 10 мл) или генцианвиолетом (0,4 мл 1%-ного спиртоводного раствора краски на 10 мл молока). Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 10 дней.

2.2.1. Отобранные для бактериологического исследования пробы упаковывают в целлофан или пергаментную бумагу, помещают в непроницаемую тару (ящик, банка, полиэтиленовый пакет) и в этот же день направляют в лабораторию. От абортировавшего животного одновременно с патологическим материалом направляют кровь (сыворотку крови) для серологического исследования на бруцеллез. Если в течение 24 — 30 ч взятый материал доставить в лабораторию не представляется возможным, его консервируют стерильным 30%-ным водным раствором химически чистого глицерина. Материал заливают консервирующей жидкостью в количестве, превышающем его объем в 4 — 5 раз. Крупные плоды направляют в неконсервированном виде.

2.3. Для серологического исследования в лабораторию направляют кровь (сыворотку крови) и молоко.

2.3.1. Кровь у животных берут из яремной вены (у свиней — из яремной, ушной или хвостовой; у собак — головной предплечья или латеральной подколенной голени; у лисиц и песцов — из бедренной вены; у норок — путем отсечения подушечки среднего пальца задней лапы или кончика хвоста в стерильные пробирки по 5 — 7 мл (от пушных зверей по 1 — 2 мл). Пробирки нумеруют и составляют опись проб.

Сыворотку крови получают методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают в термостате при 30 — 38 °С в течение 1 ч или при комнатной температуре 8 — 10 ч, сгусток крови от стенок отделяют стальной спицей, а затем пробирки выдерживают при 4 — 10 °С. Через 20 — 24 ч после взятия крови отстоявшуюся сыворотку сливают в сухие стерильные пробирки и направляют для исследования в лабораторию в свежем или консервированном виде (сыворотку крови собак сливают через 3 — 4 ч и повторно через 10 — 12 ч).

Консервирование сывороток проводят:

— добавлением 0,05 мл (1 капля) 5%-ного раствора фенола на каждый миллилитр сыворотки при тщательном перемешивании;

— сухой борной кислотой (2 — 4% к объему сыворотки) до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка;

— путем однократного замораживания.

Неконсервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 сут. со дня взятия крови при условии хранения их при 4 — 8 °С.

Сыворотки, консервированные фенолом или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 сут.; замороженные сыворотки — в течение 3 сут. после однократного оттаивания.

Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки исследованию на бруцеллез не подлежат.

2.3.2. Для исследования на бруцеллез в кольцевой реакции пробу цельного свежего молока от коровы (буйволицы) берут сборную из каждой доли вымени одного удоя в одну стерильную пробирку в количестве 10 — 15 мл. При этом, если молоко берут перед дойкой, то первые порции молока сдаивают. Пробы молока на рынках берут из каждой отдельной посуды (бидон, фляга и проч.) после тщательного его перемешивания. Пробирки нумеруют и составляют опись проб.

Молоко исследуют свежее (охлажденное до 4 — 10 °С или неохлажденное) или консервированное добавлением в каждую пробу одной капли 10%-ного раствора формалина на 5 мл молока. Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 2 — 3 сут. Перед исследованием молоко необходимо тщательно перемешать для равномерного распределения сливок.

При массовом исследовании молока работу по отбору проб и постановке кольцевой реакции можно проводить непосредственно на ферме в специально отведенном помещении.

Не разрешается исследовать в кольцевой реакции молоко от коров (буйволиц), больных маститом или болезнями, сопровождающимися повышением температуры тела, а также молоко животных в первые две недели после родов. Молоко, имеющее повышенную кислотность (30° по Тернеру и выше), исследованию не подлежит, т.к. антиген обесцвечивается.

2.4. На направляемый в лабораторию материал заполняют сопроводительный документ установленной формы.

3.1. Бактериологическую диагностику бруцеллеза проводят в случае аборта или при появлении у животных других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты и прочие), вызывающих подозрение на данное заболевание.

3.2. Бруцеллы обнаруживают бактериоскопией мазков из патологического материала, выделением культуры бруцелл на питательных средах и, при необходимости, путем постановки биологической пробы на морских свинках.

3.3. Бактериоскопическое исследование

Из доставленного на исследование патологического материала делают по два мазка из каждого объекта. При исследовании абортированных плодов мазки готовят из содержимого желудка, жидкости брюшной и грудной полостей, печени, селезенки, а также котиледонов плодовых оболочек. Из паренхиматозных органов, котиледонов и другого плотного материала делают мазки-отпечатки, жидкий материал наносят на предметные стекла пипеткой.

Мазки, фиксированные над пламенем горелки, окрашивают по Граму и одному из следующих специальных методов: по Стампу (модифицированный метод Циль-Нильсена), Козловскому или Шуляку-Шину (см. Прил. N 1, п. 1). При микроскопии мазков учитывают, что бруцеллы — мелкие, грамотрицательные, расположенные отдельно, попарно или кучно коккобактерии, окрашивающиеся по Стампу, Козловскому или Шуляку-Шину в красный цвет.

3.4. Бактериологическое исследование

3.4.1. Для культивирования бруцелл используют мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ), печеночный глюкозо-глицериновый бульон (ПГГБ), мясо-пептонный печеночно-глюкозо-глицериновый агар (МППГГА), печеночный глюкозо-глицериновый агар (ПГГА), картофельный агар, эритрит-агар, сывороточно-декстрозный агар, печеночно-сывороточный агар и печеночно-аминопептидный агар, (см. Прил. N 1, п. 2) и другие питательные среды, предназначенные для этой цели.

3.4.2. Перед посевом материала кожу абортированного плода с поверхности по белой линии протирают тампонами, смоченными 5%-ным раствором фенола. Стерильными ножницами вскрывают брюшную стенку и грудную клетку плода, содержимое грудной и брюшной полостей набирают пастеровскими пипетками и высевают в 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром, а содержимое желудка — в 2 пробирки с бульоном и не менее 5 пробирок с агаром.

Из печени и селезенки вырезают кусочки размером не менее 2,0 х 1,5 х 2,5 см, увлажняют их спиртом, обжигают с поверхности и растирают в стерильной ступке с песком. Затем в ступку добавляют равное количество стерильного физиологического раствора и вновь растирают. Полученную взвесь пастеровской пипеткой по 0,1 — 0,2 мл высевают на поверхность предварительно подсушенных плотных сред (в пробирках или чашках). Допускается высев материала пастеровской пипеткой из органов (место прокола органа предварительно прижигают раскаленным шпателем). Из каждого органа делают посев на 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром.

Если в лабораторию доставлен только желудок плода, высев проводят не менее чем на 10 пробирок агара.

При поступлении нескольких плодов от одного животного посевы делают из органов и тканей каждого плода отдельно.

Из плодовых оболочек и плаценты вырезают кусочки тканей с утолщенными ворсинками и стенками, наличием на поверхности фибрина или гнойного экссудата (выбирают менее загрязненные участки без некротических изменений).

Для уничтожения посторонней микрофлоры кусочки плаценты помещают в чашку Петри и заливают 3%-ным раствором гидроокиси калия на 30 мин. Затем их обмывают стерильным физиологическим раствором, готовят из этого материала суспензию в ступке со стерильным песком и делают посев пастеровской пипеткой на чашки со средой, содержащей бактериостатические препараты: генцианвиолет 1:200000 (0,1 мл 0,5%-ного спиртоводного раствора на 100 мл среды) или кристаллвиолет 1:100000, генцианвиолет и малахитовую зелень в концентрации каждой краски 1:200000, уксуснокислый натрий из расчета 12,5 мг на 100 мл среды и др.

Содержимое бурс, гигром высевают на 3 — 4 чашки с плотной питательной средой, содержащей бактериостатические препараты.

Пробы молока центрифугируют 30 мин. при 3000 об./мин. Верхний слой (сливки) и осадок набирают в пастеровскую пипетку и по 0,1 — 0,2 мл вносят на 3 — 4 чашки с агаром, содержащим бактериостатические препараты. Молоко, консервированное генцианвиолетом или другими консервантами, высевают на среды без бактериостатических веществ.

3.4.3. Для выращивания культур посевы помещают в термостат при 37 — 38 °С.

При исследовании материала от крупного рогатого скота половину

засеянных пробирок и чашек культивируют в обычных условиях, другую

— в атмосфере с повышенным содержанием углекислого газа (10 — 15%)

в СО -инкубаторе или эксикаторе (микроанаэростате). Аналогичные

условия можно создать в пробирках, закрытых резиновыми пробками

Перед парафинированием пробирки закрывают ватными пробками, пронося последние над пламенем горелки. Затем верхнюю часть пробки обрезают, а оставшуюся часть углубляют на 0,5 — 1,0 см внутрь пробирки и заливают расплавленным парафином.

Необходимое содержание углекислого газа в эксикаторе можно получить путем:

— заполнения части объема углекислым газом из баллона или аппарата Киппа;

— внесения бикарбоната натрия и серной или соляной кислоты (0,48 г бикарбоната натрия и 5 мл 25%-ного раствора кислоты или 0,4 г бикарбоната натрия и 0,35 мл концентрированной соляной кислоты на 1 л объема);

— сжигания ваты, смоченной спиртом. При этом пробирки и чашки с посевами должны занимать не более половины объема эксикатора. Для определения концентрации углекислого газа в эксикаторе можно использовать химический метод (см. Прил. N 1, п. 3).

3.4.4. Посевы выдерживают в термостате при 37 — 38 °С в течение 30 сут. Первичный осмотр посевов проводят через 24 — 48 ч. Пробирки с агаром и бульоном, заросшие посторонней микрофлорой, обезвреживают путем автоклавирования при 1,5 атм. в течение 1 ч.

В дальнейшем для обнаружения роста бруцелл посевы просматривают каждые 3 — 4 сут. визуально, при необходимости через лупу или малом увеличении микроскопа. При отсутствии роста часть поверхности агара орошают посевным материалом.

При значительном росте посторонней микрофлоры (80% и более засеянных пробирок) бактериологическое исследование прекращают.

При просмотре посевов обращают внимание на характер роста микробов. На поверхности агара бруцеллы образуют мелкие, блестящие, выпуклые, с ровными краями и гладкой поверхностью просвечивающиеся колонии, имеющие в отраженном свете голубоватый оттенок, в падающем свете — сероватый. С возрастом колонии мутнеют и приобретают более темную окраску, что связано с появлением пигмента.

В бульоне бруцеллы образуют равномерное помутнение и пристеночное кольцо, возвышающееся над уровнем бульона, а в дальнейшем небольшой осадок на дне пробирки. В отраженном свете пристеночное кольцо имеет голубоватый оттенок.

При обнаружении роста на жидких средах и отсутствии характерного роста на агаре из каждой пробирки готовят мазки, которые окрашивают одним из специальных методов, и делают пересев на чашки с плотной средой для выделения чистой культуры. Пересевы на чашках культивируют так же, как и высевы из патологического материала.

Выделенные культуры идентифицируют по тинкториальным (окраска мазков по Граму и одним из специальных методов — по Стампу, Козловскому или Шуляку-Шину), морфологическим, культуральным свойствам и в реакции агглютинации на стекле с использованием набора компонентов для серологической дифференциации бруцелл.

Для постановки пластинчатой реакции агглютинации на стекле необходимы следующие компоненты: испытуемая культура, набор для серологической дифференциации бруцелл (выпускается биопредприятием), 0,5%-ный фенолизированный физиологический раствор рН 7,0 — 7,2.

Для исследования берут двухсуточные агаровые культуры. R- и S-сыворотки бруцеллезные агглютинирующие разводят 0,5%-ным фенолизированным физиологическим раствором до рабочего разведения, указанного на этикетке коробки. Разведенные сыворотки допускается использовать в течение месяца. R-антиген бруцеллезный цветной для РА и антиген бруцеллезный для роз бенгал пробы в пластинчатой РА применяют неразведенными. Предметные стекла для реакции подготавливают общепринятым способом. Физиологический раствор, пробирки и пипетки должны быть стерильными.

Техника постановки реакции. На предметное стекло раздельно наносят по одной капле R- и S-сывороток бруцеллезных агглютинирующих и физиологического раствора. Испытуемую культуру бактериологической петлей отдельно эмульгируют в каплях R- и S-сывороток и в капле физиологического раствора для определения самоагглютинации культуры. Параллельно в каждом опыте ставят контроли: R- и S-сыворотки в разведении, указанном на этикетке, с цветным R-бруцеллезным антигеном и с роз бенгал антигеном.

Учет и оценка реакции. Реакцию учитывают невооруженным глазом или с помощью увеличительного стекла в течение 2 минут по следующей схеме:

++++ (4 креста) — полное просветление жидкости с образованием четко выраженного агглютината — положительная реакция;

+++ (3 креста) — неполное просветление жидкости с выраженным агглютинатом — положительная реакция;

++ (2 креста) — неполное просветление жидкости со слабо выраженным агглютинатом — положительная реакция;

+ (1 крест) — жидкость без просветления с едва заметным агглютинатом — сомнительная реакция;

— (минус) — просветление жидкости не наступило, смесь гомогенная — отрицательная реакция.

Следует иметь ввиду, что реакция с R-бруцеллезной сывороткой проходит замедленно; агглютинат, как правило, мелкозернистый. Результаты реакции с испытуемой культурой считают достоверными, если в контролях R- и S- бруцеллезных сывороток с гомологичными антигенами агглютинация четко выражена не менее чем 3 креста, а с гетерологичными — отсутствует.

Реакцию с испытуемой культурой считают положительной при наличии агглютинации на 2 креста и более. При отрицательной реакции ее проводят повторно с этой же культурой, взятой из трех-четырех мест посева.

Культуры, обладающие типичными для бруцелл морфологическими, культуральными и тинкториальными свойствами, а также дающие положительную реакцию агглютинации с R- и S- бруцеллезными сыворотками в отдельности или с обеими сыворотками одновременно при отсутствии самоагглютинации в физиологическом растворе, признают бруцеллами.

Культура возбудителя инфекционного эпидидимита баранов и бруцеллеза собак, вызванного B. canis, постоянно агглютинируется только R — бруцеллезной сывороткой.

3.5. Биологическое исследование

3.5.1. Биологическое исследование проводят на морских свинках (не менее двух) массой 350 — 400 г, предварительно проверенных на бруцеллез исследованием в РА сыворотки крови в разведении 1:5 с отрицательным результатом.

3.5.2. Для постановки биологической пробы используют тот же материал, что и для бактериологического исследования.

Из органов и содержимого желудка абортированного плода готовят суспензию на стерильном физиологическом растворе в соотношении 1:10 и вводят морской свинке подкожно с внутренней стороны бедра в объеме 1 мл.

Из плаценты и плодовых оболочек, предварительно обработанных тампонами, смоченными дезинфицирующим раствором, и подсушенных сухими стерильными тампонами, вырезают кусочки размером 0,5 х 0,5 см, фламбируют на пламени горелки, растирают в ступке со стерильным песком и заливают физиологическим раствором в соотношении 1:10. Полученную суспензию вводят морской свинке в объеме 1 мл.

Содержимое гигром, бурс вводят морской свинке подкожно в объеме 0,2 — 0,3 мл. При этом необходимо учитывать возможность гибели животного от сопутствующей микрофлоры, особенно стрептококков.

Пробы молока центрифугируют 30 мин. при 3000 об./мин. Морской свинке вводят подкожно 2 — 3 мл материала из верхнего слоя (сливки) и осадка молока после центрифугирования.

3.5.3. На 15, 25 и 40-е сут. после заражения у морских свинок берут кровь в количестве 1 — 2 мл из ушной вены путем надреза или из сердца — путем пункции. Сыворотку крови исследуют в пробирочной РА в разведениях от 1:10 до 1:80.

При положительной реакции агглютинации в разведении 1:10 и выше морских свинок убивают. В случае необходимости получения культуры возбудителя материал от них исследуют бактериологически. Высевы делают пастеровскими пипетками в одну пробирку бульона и две пробирки агара из паховых, парааортальных лимфатических узлов (правых и левых), селезенки (2 высева), печени и костного мозга. Посевы культивируют, как описано в подпунктах 3.4.3 и 3.4.4.

При отрицательной РА у морских свинок в указанные выше сроки биопробу считают отрицательной, подопытных животных убивают, бакисследование не проводят.

3.5.4. При выделении культуры бруцелл на питательных средах из исходного материала биологическое исследование по данной экспертизе прекращают, а ранее зараженных морских свинок убивают без бакисследования.

3.6. Результат исследования на бруцеллез считают положительным при выделении культуры возбудителя или при получении у морской свинки положительной РА в разведении сыворотки крови 1:10 и выше, если из исходного материала культура не выделена.

При положительных результатах бактериоскопии и отрицательных результатах бактериологического исследования и биопробы материал считают подозрительным на бруцеллез. При сохранении патматериала или возможности взятия нового (кровь, молоко, моча и др.) исследование проводят методом полимеразной цепной реакции. По ее результатам делают заключение о заболевании животных бруцеллезом.

— бактериологического — до 1 мес.;

3.8. В ветеринарных лабораториях все выделенные культуры бруцелл после их идентификации подлежат уничтожению путем автоклавирования при 1,5 атм. в течение 1 ч.

3.9. При необходимости определения вида бруцелл выделенные от животных культуры направляют в республиканские, краевые, областные ветеринарные лаборатории или ветеринарные научно-исследовательские учреждения, в которых имеются лаборатории или отделы, занимающиеся изучением бруцеллеза животных и имеющие разрешение органов здравоохранения на работу с микроорганизмами второй группы.

4.1. Серологическая диагностика бруцеллеза заключается в обнаружении специфических антител в сыворотке крови животных в реакции агглютинации (РА) в пробирках, реакции связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента на холоде (РДСК), реакции иммунодиффузии с 0-полисахаридным антигеном (РИД), пластинчатой реакции агглютинации с роз бенгал антигеном (роз бенгал проба — РБП) и в молоке коров — кольцевой реакции (КР) и других реакциях, утвержденных в установленном порядке.

4.2. Постановка и учет результатов реакции агглютинации (РА) в пробирках

4.2.1. Реакцию агглютинации в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), овец, коз, лошадей, верблюдов, оленей (маралов), собак, пушных зверей и морских свинок.

4.2.2. Компоненты реакции агглютинации:

— испытуемые сыворотки крови (см. п. 2.3.1);

— позитивная бруцеллезная сыворотка, изготовленная биопредприятием;

— негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных из опыта или консервированная), изготовленная биопредприятием или полученная в лаборатории;

— антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК (см. Прил. N 2, п. 6);

— 0,5%-ный фенолизированный раствор хлорида натрия. При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок для разведения испытуемых сывороток и антигена используют фенолизированный физиологический раствор хлорида натрия (0,85%-ный); при исследовании крови овец и коз — 5%-ный и оленей (маралов) — фенолизированный 10%-ный раствор хлорида натрия (см. Прил. N 2, п. 1).

4.2.3. Постановка реакции агглютинации

Реакцию агглютинации проводят в серологических пробирках в объеме 1 мл в четырех разведениях:

— при исследовании сывороток крови овец, коз, оленей (маралов) и собак — 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200;

— крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов — 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;

— пушных зверей и морских свинок — 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

При массовых исследованиях допускается постановка реакции в первых двух разведениях.

Компоненты реакции вносят индивидуальными мерными пипетками (дозаторами) или групповыми дозаторами Флоринского.

Для исследования каждой испытуемой сыворотки крови требуется 5 пробирок. В пробирках первого ряда делают исходное разведение. Для этого сыворотку крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов берут в дозе 0,1 мл, вносят в пробирку, добавляют к ней 2,4 мл соответствующего раствора хлорида натрия, смешивают и получают разведение сыворотки 1:25. Сыворотку крови овец, коз, оленей (маралов) и собак берут в дозе 0,2 мл и добавляют 2,3 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:12,5), а сыворотку крови пушных зверей и морских свинок берут в дозе 0,3 мл и добавляют 1,2 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:5). Таким образом делают исходное разведение испытуемых сывороток в пробирках первого ряда штатива (по 10 проб в ряду).

После приготовления исходного разведения сывороток в первом ряду в пробирки третьего, четвертого и пятого рядов вносят по 0,5 мл соответствующего раствора хлорида натрия. Затем из пробирок первого ряда при помощи группового дозатора Флоринского или индивидуальных пипеток-дозаторов переносят в пробирки второго и третьего рядов по 0,5 мл исходного разведения сывороток (1:25; 1:12,5 или 1:5). В пробирках третьего ряда сыворотки смешивают, по 0,5 мл этого разведения переносят в пробирки четвертого ряда и так же из пробирок четвертого ряда — в пятый. Из пробирок пятого ряда 0,5 мл жидкости удаляют. Таким образом делают последовательные двукратные разведения сывороток.

После этого в каждую пробирку второго, третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными сыворотками вносят при помощи группового дозатора Флоринского или другого дозирующего устройства по 0,5 мл антигена, предварительно разведенного 1:10 соответствующим раствором хлорида натрия. После добавления антигена разведение сыворотки в каждой пробирке удваивается и, в зависимости от вида исследуемых животных, будет составлять 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400; 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200 или 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

В пробирки первого ряда бруцеллезный антиген не вносят, они служат контролем качества сыворотки. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты реакции агглютинации не учитывают.

При массовых исследованиях сыворотки разливают индивидуальной микропипеткой (с грушей) или групповыми дозаторами Флоринского в две пробирки в дозах 0,02 и 0,01 мл (сыворотки крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов) или 0,04 и 0,02 мл при исследовании сывороток овец, коз, оленей (маралов) и собак. Затем в каждую пробирку добавляют по 1,0 мл антигена, разведенного соответствующим раствором хлорида натрия 1:20. При этом разведения сывороток будут соответственно 1:50 и 1:100 или 1:25 и 1:50.

При постановке реакции агглютинации одновременно с испытуемыми сыворотками ставят контроли с негативной и позитивной бруцеллезной сыворотками в таких же разведениях.

После добавления к испытуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками встряхивают для смешивания компонентов и помещают в термостат при 37 — 38 °С на 16 — 20 ч, затем выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч и проводят учет реакции.

4.2.4. Учет реакции агглютинации. Результаты реакции учитывают визуально, определяя степень просветления жидкости, внешний вид агглютината (при его наличии) или антигена на дне пробирки до и затем, после легкого встряхивания, оценивают в крестах по следующей схеме:

++++ (4 креста) — полное просветление жидкости, микробные клетки антигена осели на дно пробирки в виде «зонтика», при легком встряхивании «зонтик» разбивается на хлопья и комочки, а жидкость остается прозрачной (100% агглютинации);

+++ (3 креста) — неполное просветление жидкости и хорошо выраженный «зонтик» (75% агглютинации);

++ (2 креста) — неполное просветление жидкости, «зонтик» умеренно выражен (50% агглютинации);

+ (1 крест) — едва заметное просветление жидкости, «зонтик» выражен слабо, при встряхивании заметно небольшое количество хлопьев или комочков (25% агглютинации);

— (минус) — просветления жидкости и образования «зонтика» не наступило, на дне пробирки по центру образуется небольшой осадок микробов антигена в виде точки или пятна. При встряхивании осадок легко разбивается, поднимается вверх в виде косички и равномерно распределяется в жидкости, которая при этом приобретает первоначальную мутность.

За титр антител принимают наибольшее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация на 2 креста (++), что соответствует количеству международных единиц (МЕ) антител в 1 мл сыворотки (например, сыворотка с титром 1:100 содержит 100 МЕ, 1:200 — 200 МЕ и т.д.).

Для более объективной оценки результатов РА в крестах готовят стандарты мутности, соответствующие 75, 50, 25 и 0% просветления жидкости.

В четыре пробирки последовательно наливают 1, 2, 3 и 4 мл антигена, разведенного 1:10. Затем в том же порядке в три первые пробирки добавляют 3, 2 и 1 мл физиологического раствора. В четвертую пробирку раствор не добавляют. После встряхивания пробирок из каждой из них переносят по 0,5 мл в серологические пробирки и добавляют по 0,5 мл физиологического раствора. Полученные стандарты соответствуют 75, 50 и 25% просветления жидкости. В четвертой пробирке просветление отсутствует. Стандарты мутности готовят каждый раз при постановке РА и выдерживают в термостате одновременно с основной реакцией.

При массовых исследованиях в двух разведениях все сыворотки, давшие агглютинацию с оценкой не менее чем на 2 креста (++) в каком-либо из указанных разведений, исследуют повторно в четырех разведениях.

4.2.5. Диагностическая оценка реакции агглютинации

Реакцию считают положительной при наличии агглютинации с сывороткой крови крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), верблюдов и лошадей, не иммунизированных или иммунизированных неагглютиногенными противобруцеллезными вакцинами (см. Прил. N 2, п. 7), содержащей 200 МЕ антител и выше; овец и коз — 100 МЕ и выше; оленей (маралов) и собак — 50 МЕ и выше; пушных зверей и морских свинок — 10 МЕ и выше.

При выявлении среди не иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, а также иммунизированных неагглютиногенными вакцинами крупного рогатого скота, верблюдов и лошадей, животных, реагирующих только в РА с содержанием антител 50 — 100 МЕ, а среди овец, коз, оленей (маралов), собак — 25 МЕ, считают сомнительно реагирующими и исследуют повторно через 15 — 30 сут. При повышении титров заболевание считают установленным. При сохранении титров на прежнем уровне проводят дополнительные исследования по дифференциации, согласно утвержденным методам.

При выявлении в стадах крупного рогатого скота, ранее иммунизированного против бруцеллеза агглютиногенными вакцинами (см. Прил. N 2, п. 7), животных, реагирующих только в РА с содержанием не выше 200 МЕ антител и РСК в разведении сыворотки крови не выше 1:10, их повторно исследуют через 15 — 30 сут. в РА, РСК и РИД. При повышении содержания антител в исследуемых сыворотках в РА и (или) РСК или положительной РИД заболевание считают установленным.

При выявлении в неблагополучных по бруцеллезу стадах крупного рогатого скота, ранее не иммунизированных или иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, животных, положительно реагирующих в РА с содержанием 100 МЕ антител и выше, признают больными. Реакцию считают сомнительной при содержании 50 МЕ антител. Сыворотки крови от таких животных через 15 — 30 сут. исследуют повторно. При получении вновь сомнительного результата животных признают больными бруцеллезом.

При исследовании в РА неиммунизированных баранов-производителей, козлов, пробников и ярок, содержащихся в благополучных по бруцеллезу отарах, где овцы (козы) иммунизированы против бруцеллеза, реакцию считают положительной, а заболевание установленным при содержании в сыворотке крови животных 100 МЕ антител и выше. Реакцию считают сомнительной при наличии 50 МЕ антител. Сыворотки крови от таких животных через 15 — 30 сут. исследуют повторно. При получении вновь сомнительных результатов животных признают здоровыми, а отару — благополучной по бруцеллезу.

В заключении лаборатории о результатах исследования должна быть сообщена диагностическая оценка каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр) сыворотки, в котором получен соответствующий результат, выраженный в международных единицах (например: титр сыворотки крови крупного рогатого скота 1:200 с оценкой 2 — 4 креста — «положительная» 200 МЕ; титр сыворотки 1:100 с оценкой 2 — 4 креста — «сомнительная» 100 МЕ).

Суммарные результаты исследования испытуемых сывороток, серию антигена, срок его годности, а также титр позитивной сыворотки записывают в журнал серологических исследований.

4.3. Постановка и учет реакции связывания комплемента (РСК) и реакции длительного связывания комплемента (РДСК)

4.3.1. Реакцию связывания комплемента применяют при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), овец, коз, свиней, верблюдов, лошадей, оленей (маралов), собак и пушных зверей.

Реакцию длительного связывания комплемента, как более чувствительную, применяют вместо РСК при исследовании на бруцеллез сывороток крови животных.

4.3.2. Компоненты реакции и их подготовка к работе:

— испытуемые сыворотки крови (см. п. 2.3.1);

— позитивная бруцеллезная сыворотка, изготовленная биопредприятием или полученная от больного бруцеллезом животного;

— негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных из опыта или консервированная), изготовленная на биопредприятии или полученная в лаборатории.

Испытуемые и контрольные (позитивную и негативную) сыворотки инактивируют в водяной бане в день постановки реакции: для РСК — при 60 — 62 °С в течение 30 мин. (сыворотки крови ослов и мулов — 64 — 65, буйволов — 62 — 64, свиней — 58 — 60 °С); для РДСК — сыворотки крови животных всех видов — при 63 — 64 °С в течение 30 мин.;

— антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК в рабочем титре, указанном биопредприятием-изготовителем (см. Прил. N 2, п. 6);

— комплемент — сыворотка крови морской свинки, лиофильно высушенная, биофабричного изготовления или нативная (свежая или консервированная добавлением 2 — 4% борной кислоты).

Сухой биофабричный комплемент растворяют физиологическим раствором, как указано на этикетке коробки. Берут такое количество ампул (флаконов), в которых содержится необходимое для проведения всего опыта количество комплемента. В каждую ампулу (флакон) вносят физиологический раствор и, не встряхивая, помещают в холодильник на 20 — 30 мин. Растворившийся комплемент осторожно перемешивают путем легкого встряхивания ампул (флаконов), сливают в одну пробирку, смешивают и помещают в холодильник при 4 — 10 °С. Непосредственно перед внесением в пробирки для титрования растворенный или нативный комплемент разводят физиологическим раствором 1:20, а остальной — хранят в холодильнике для постановки главного опыта. Рабочее разведение комплемента также готовят непосредственно перед внесением в пробирки главного опыта;

— гемолитическая сыворотка (гемолизин) — сыворотка крови кролика, гипериммунизированного эритроцитами барана, — для РСК и РДСК в удвоенном титре. Титрование гемолизина проводят при использовании каждой новой серии и по истечении срока годности (см. Прил. N 2, п. 5);

— эритроциты барана — 2,5%-ная от осадка взвесь эритроцитов барана в физиологическом растворе для РСК и РДСК (см. Прил. N 2, п. 3).

Для приготовления гемолитической системы взвесь эритроцитов и раствор гемолизина в рабочем разведении смешивают в равных объемах и при постановке РСК выдерживают в водяной бане при 37 — 38 °С в течение 15 — 20 мин. при периодическом перемешивании, а при постановке РДСК — в холодильнике. При смешивании компонентов раствор гемолизина вливают во взвесь эритроцитов;

— физиологический раствор — 0,85%-ный раствор химически чистого хлорида натрия в дистиллированной воде с рН 6,8 — 7,2 или физиологический раствор, содержащий ионы магния и кальция (см. Прил. N 2, п. 2). Последний в обязательном порядке готовят в случае использования нативного комплемента (свежей или консервированной сыворотки крови морской свинки).

Рабочие разведения всех компонентов для РСК или РДСК готовят перед постановкой реакции и при необходимости проверяют их на антикомплементарность и гемотоксичность по следующей схеме:

источник