Кольцевая реакция с молоком при бруцеллезе

При исследовании молока кольцевой пробой на бруцеллез в пробирку диаметром 5 — 8 мм наливают 1 мл молока и 1 каплю цветного бруцеллезного антигена (взвесь бруцелл, окрашенных гематоксилином) и ставят ее в термостат при температуре 37 град. C на 40 — 45 минут. Положительная реакция характеризуется появлением в верхнем слое жидкости кольца синего цвета, при сомнительной реакции слабо окрашенное синеватое кольцо, а при отрицательной — никаких изменений не наступает.

ФАЛЬСИФИКАЦИЯ МОЛОКА И МЕТОДЫ ЕЁ ВЫЯВЛЕНИЯ

Контроль пастеризации молока

Проба на пероксидазу:

В пробирку наливают 5 мл пастеризованного молока, добавляют 5 капель р-ра крахмального КСl и 5 капель 0,5 % р-ра перекиси водорода. Содержимое перемешивают. Если цвет содержимого пробирки не изменился, то молоко пастеризовано правильно. Окрашивание содержимого пробирки в синий цвет показывает, что молоко пастеризовано с нарушением режима или к правильно пастеризованному молоку добавлено сырое молоко.

Лактоальбуминовая проба:

Используется для установления пастеризации при температуре выше 80 °С.

В колбе смешивают 5 мл пастеризованного молока и 20 мл воды, добавляют 3 мл 0,1 н р-ра серной кислоты для осаждения казеина и отфильтровывают. В пробирку вносят 5 мл фильтрата и кипятят. Если молоко пастеризовано при 80 °С, то при его кипячении не образуется хлопьев альбумина, а при охлаждении фильтрата не будет осадка.

Определение добавления воды в молоко

Для установления наличия добавленной воды по нейтральной пробе в пробирку наливают 1,5-2см3 концентрированной химически чистой серной кислоты. К такому же количеству контролируемого молока прибавляют одну каплю формалина и перемешивают. Молоко осторожно наливают по стенке в пробирку с серной кислотой. При наличии в молоке воды на границе соприкосновения кислоты и молока образуется сине-фиолетовое кольцо. В натуральном молоке такого кольца не будет.

Определение примеси соды ГОСТ 24065-80

Примесь соды в молоке и молочных продуктах определяют путем добавления к 3-5 мл исследуемого молока или молочного продукта такого же количества 0,2%-кого спиртового раствора розоловой кислоты. При наличии соды содержимое в пробирке окрашивается в розово-красный цвет, а при отсутствии — в оранжевый.

Определение примеси крахмала

Фальсификацию молокакрахмалом определяют путем добавления в пробирку с 5 мл хорошо перемешанного молока (сметаны, сливок) 2-3 капель люголевского раствора. Содержимое пробирки тщательно взбалтывают. Появление через 1-2 минуты синей окраски указывает на присутствие в исследуемой пробе крахмала.

ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНАЯ ЭКСПЕРТИЗА

КИСЛОМОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ

Продукты, получаемые из молока в результате молочнокислого брожения (иногда с участием спиртового брожения), называются кисломолочными. Различают продукты, получаемые в результате только молочнокислого брожения (1-я группа) — ряженка, простокваша различных видов, ацидофильное молоко, творог, сметана, йогурт, и продукты, получаемые при смешанном молочнокислом и спиртовом брожении (2-я группа) — кефир, кумыс и др. Продукты 1-й группы имеют достаточно плотный, однородный сгусток и кисломолочный вкус, обусловленный накоплением молочной кислоты. Продукты 2-й группы обладают кисломолочным освежающим, слегка щиплющим вкусом, обусловленным присутствием этилового спирта и углекислоты, и нежным сгустком, пронизанным мельчайшими пузырьками углекислого газа. Сгусток этих продуктов легко разбивается при встряхивании, благодаря чему продукты приобретают однородную жидкую консистенцию, поэтому их часто называют напитками.

При производстве кисломолочных продуктов применяют чистые культуры молочнокислых бактерий. В зависимости от вырабатываемых продуктов в состав чистых культур входят молочнокислый стрептококк (Str. lactis), болгарская палочка (Васt. bulgaricum), ацидофильная палочка (Васt. аcidophilum), ароматообразующие бактерии (Str. diacetilactis) и молочные дрожжи (Тorula). Каждый продукт изготовляется с помощью определенных культур микроорганизмов.

Основные биохимические процессы, протекающие при получении кисломолочных продуктов, таковы: молочнокислое и спиртовое брожение молочного сахара, коагуляция казеина и гелеобразование; в результате этих процессов формируются консистенция, вкус и запах готовых продуктов.

Кисломолочные продукты тщательно перемешивают. Для всех продуктов объем средней пробы составляет 50 мл (за исключением сметаны и сливок – 15 г, творог – 20 г). Во всех случаях исследуют органолептически и выборочно содержание жира и кислотность. При необходимости выявляют фальсификацию и контролируют режим (пастеризации или кипячения). Продукт исследуют не позднее 4 часов после отбора. Для отбора используют трубчатые и цилиндрические пробоотборники.

Рисунок 2 – Пробоотборники для сливочного масла, творога и сметаны

Методика оценки качества кисломолочной продукции:

Органолептика: Простокваша должна иметь вкус и запах чистые, кисломолочные, без посторонних, не свойственных продукту привкусов и запахов, в простокваше южной допускается спиртовой привкус, в варенце и ряженке – привкус пастеризации. Цвет молочно-белый, у ряженки и варенца – с буроватым оттенком. Сгусток в меру плотной, ненарушенный, без газообразования, на поверхности допускается незначительное выделение сыворотки, на изломе сгусток глянцевидный, устойчивый, для варенца и ряженки допускается наличие молочных пенок, для ацидофильной и южной – слегка тягучий. Не допускается к приемке простокваша с пустотами, дряблую, вспученную, загрязненную, с кормовым, горьким вкусом и запахом. Кислотность простокваши 80-1100Т, южной – 90-1400Т, ряженки 75-1000Т.

Кефир должен иметь вкус чистый, кисломолочный, освежающий, слегка острый, специфический, без посторонних привкусов и запахов. Консистенция однородная, наполняющая жидкую сметану. Допускается газообразование в виде отдельных глазков, не более 2% отделившейся сыворотки. Кислотность 85-1200Т не допускается к приемке кефира с горьким, аммиачным, кормовым и другими привкусами и запахами, а также грязный.

По качеству творог делят на высший и 1-й сорта. Творог высшего сорта должен иметь вкус и запах чистые, нежные, кисломолочные, без посторонних привкусов и запахов. Консистенция нежная, допускается неоднородная. Цвет белый, слегка желтоватый, с кремовым оттенком, равномерный по всей массе. В 1-м сорте допускаются слабовыраженные привкусы кормов, тары и наличие слабой горечи. Консистенция рыхлая, мажущаяся, а для обезжиренного творога – с незначительным выделением сыворотки, рассыпчатая кислотность жирного творога высшего сорта не более 200 0 Т, полужирного – 210 0 Т, нежирного – 220 0 Т. Пороками творога являются кормовые привкусы, выраженный кисломолочный вкус, горечь, крупитчатость. Не допускают к приемке творог плесневелый и загрязненный.

Сметану 30%-ой жирности по качеству делят на высший и 1-й сорта. Цвет белый с кремовым оттенком. Вкус и запах чистый, молочнокислый, с выраженными вкусом и ароматом, свойственными пастеризованным продуктам.

Консистенция однородная, в меру густая, без крупинок жира и белка, глянцевитая. Кислотность сметаны 65-900 о Т. В 1-м сорте допускается слабо выраженный кормовой вкус, наличие горечи, консистенция недостаточно густая, слегка комковатая, наличие легкой тягучести; кислотность 65-110 0 Т.

Остальные виды сметаны на сорта не подразделяют. Пороками сметаны являются жидкая, комковатая консистенция, прогорклый вкус и др. Не допускают к приемке сметану с горьким, кислым, кормовым вкусом и запахом, тягучую, загрязненную и с выделившейся сывороткой.

Лабораторные методы исследования исследования:

источник

Your browser does not support iframes.

Молоко крупного рогатого скота.

Для ориентировочной диагностики бруцеллеза, исследованием молока крупного рогатого скота в молочных стадах и для проверки молока при продаже его на рынках.

Противопоказания
Не исследуют в кольцевой реакции молоко от коров, больных ящуром, маститом и другими болезнями, которые сопровождаются повышением температуры тела, а также от коров в стадии запуска и в первые 12 суток после родов.

Перед применением нагреть 30-40 минут при комнатной температуре и встряхнуть

ПРИМЕНЕНИЕ
Техника постановки реакции

Оборудование, необходимое для постановки кольцевой реакции с молоком :

— пипетки градуированные или дозаторы емкостью 0,1-2 см 3 ;

— термостат или водяная баня.

Компоненты для постановки кольцевой реакции с молоком:

— исследуемое молоко ( надо брать цельное, главным образом свежее молоко или консервированное формалином ( из расчета 0,1 см 3 10% раствора на 10 см 3 молока);
— положительная бруцеллезная сыворотка;

— антиген бруцеллезный для КР.

Техника постановки кольцевой реакции с молоком :

При постановке кольцевой реакции в бактериологические пробирки наливают по 2 см 3 исследуемого молока и добавляют по 0,1 см 3 антигена. Одновременно с опытным молоком ставят контроль — молоко здоровой коровы с положительной бруцеллезной сывороткой (0 ,05 см 3 сыворотки на 1 см 3 молока). Затем пробирки взбалтывают, штативы с пробирками ставят на водяную баню или в термостат на 45-50 минут при температуре 37 ± 1 ° С.

Учет реакции проводят по следующей схеме:

а) При наличии четко выраженного синего кольца в слое сливок ( нижняя часть столбика молока не прокрашена) — реакция считается положительной (100 % или 75% агглютинации);
b) При наличии достаточно выраженного синего кольца в слое сливок ( нижняя часть столбика молока имеет синеватый цвет) реакция также считается положительной (50 % агглютинации);
c) Если синее кольцо в слое сливок слабо выражено, а весь столбик молока имеет синий цвет, реакция считается сомнительной (25 % агглютинации);

Если столбик молока остается равномерно окрашенным в начальный синий цвет, который был получен сразу после добавления к нему антингена, а сливки остаются белыми или чуть желтоватого цвета, реакция считается отрицательной.

При получении положительного или сомнительного результата КР с молоком в дальнейшем исследуются сыворотки крови животных в реакции РБП или РА и РСК.

Особые меры предосторожности при обращении с неиспользованным ВИП, способы его обезвреживания и утилизации

Остатки препарата и флаконы содержащие антиген обезвреживают кипячением в течение 30-40 минут.

2 года со дня изготовления. После вскрытия использовать в течение 12 часов.

Условия хранения и транспортировки

В сухом темном месте при температуре от 4 ° С до 12 ° С. Не замораживать. Транспортируют всеми видами транспорта в соответствии с требованиями ГОСТ 17768 и « Правил транспортировки и хранения ветеринарных препаратов, субстанций, готовых кормов, кормовых добавок и средств ветеринарной медицины в ветеринарных аптеках, их структурных подразделениях, на базах, складах и т.д.», утвержденных приказом Государственного департамента ветеринарной медицины Украины № 44 от 13.08.2002 и зарегистрированы в Министерстве юстиции Украины № 719/7007 от 30.08.2002 года.
Упаковка
Флаконы из нейтрального стекла емкостью 10 см 3 , 15 см 3 , 20 см 3 , закрытые резиновыми пробками и обкатанные алюминиевыми колпачками.

Название, местонахождение и место осуществления деятельности владельца регистрационного свидетельства и производителя

Херсонское государственное предприятие — биологическая фабрика, Украина, 73011, г. Херсон, ул. Адмирала Макарова, 9.

Если препарат не отвечает требованиям листка-вкладыша или возникли осложнения, применение этой серии прекращают и сообщают в Государственный научно-контрольный институт биотехнологии и штаммов микроорганизмов ( ГНКИБШМ) и поставщика ( производителя). Одновременно с нарочным в ГНКИБШМ направляют, согласно « Инструкции о порядке предъявления рекламаций на биологические препараты, предназначенные для применения в ветеринарной медицине» от 03.06.98 № 2 три нераскрытых флакона этой серии препарата по адресу 03151, г. Киев, ул. Донецкая, 30, ГНКИБШМ.

источник

При заболевании коров бруцеллезом в молоке появляются антитела, которые при добавлении к молоку бруцеллезного антигена склеиваются (реакция агглютинации) и адсорбируются на жировых шариках.

Ход определения в пробирку диаметром 5-8мм наливают 1мл молока и 1 каплю цветного бруцеллезного антигена (взвесь бруцелл, окрашенных гематоксилином) и ставят в термостат при температуре 37°С на 40-45мин. Положительная реакция характеризуется появлением в верхнем слое жидкости кольца синего цвета, при сомнительной реакции -слабоокрашенного синеватого кольца, а при отрицательной — никаких изменений не наступает.

5. УИРС. Ветеринарно-санитарная оценка исследуемых проб молока с заполнением качественного удостоверения.

Контрольные вопросы

1. Отбор проб молока. Пороки молока.

2. Методы исследования молока.

3. Ветеринарно-санитарная оценка молока, полученного от животных, больных инфекционными болезнями (туберкулез, бруцеллез, лейкоз, ящур и др.).

4. Ветеринарно-санитарная экспертиза молока коров при незаразных болезнях и субклинических маститах.

УДОСТОВЕРЕНИЕ О КАЧЕСТВЕ №

Выдано на молоко____________________________________________________ ,

предприятие-изготовитель, район, город

Показатели безопасности подтверждены сертификатом

Дата выработки «_____» ___________г.

ВЕТЕРИНАРНОЕ СВИДЕТЕЛЬСТВО № 00 – 000000

от«_____»_______________________________200 г

Я, нижеподписавшийся ветеринарный врач, выдал настоящее ветеринарное свидетельство

(кому — наименование юридического лица или ФИО физического лица)

в том, что_______________________________________________________________

( наименование продукта или сырья животного происхождения согласно ГОСТ, ОСТ, ТУ)

в количестве ___________ ____________ _____________

(мест, штук, кг) (упаковка) (маркировка)

(наименование предприятия. Ф.И.О. владельца, адрес), (дата выработки) подвергнута ветеринарно-санитарной экспертизе в полном объеме изготовлена из сырья, прошедшего ветеринарно-санитарную экспертизу (ненужное зачеркнуть), и признана годной для

(реализации без ограничений, с ограничением — указать причины

или переработки согласно правилам ветсанэкспертизы)

(вид транспорта, маршрут следования)

(наименование и адрес (№ товаротранспортных документов)

Продукция подвергнута дополнительным лабораторным исследованиям

(наименование лаборатории, № экспертизы и результаты исследования)

_________________________________________________________________ (указываются эпизоотическое благополучие местности, дата и номер разрешений вышестоящего)

_____________________госветинспектора на вывоз продукции за пределы территории, перечисляются №№ клейм и др )

Свидетельство предъявляется для контроля при погрузке в пути следования и передается грузополучателю Копии свидетельства недействительны. При установлении нарушений порядка заполнения бланка свидетельство передается главному госветинспектору Субъекта российской Федерации по месту выхода груза с указанием выявленных нарушений

М.П. ФИО ветеринарного врача (полностью)

Пороки цвета молока.

Дата добавления: 2016-10-06 ; просмотров: 1841 | Нарушение авторских прав

источник

Применяется КР с целью проверки благополучия стад на бруцеллез крупного рогатого скота и для проверки молока при продаже его на рынках.

Компонентами реакции являются:

— антиген цветной бруцеллезный для кольцевой реакции с молоком, который представляет собой стандартизованную взвесь убитых бруцелл, окрашенных гематоксилином в синий цвет;

— сыворотка позитивная бруцеллезная.

В агглютинационные пробирки берут по два мл молока и добавляют по 0,1 мл антигена, затем пробирки тщательно встряхивают для перемешивания молока с антигеном.

При каждой постановке реакции одновременно с испытуемыми пробами молока ставят контроли: с молоком от заведомо здоровой коровы; со смесью молока здоровой коровы и позитивной бруцеллезной сыворотки (0,05 мл сыворотки на 1 мл молока). Штативы с испытуемыми и контрольными пробами молока помещают в водяную баню или термостат при 37-38°С на 1 час. Если в молоке имеются бруцеллезные антитела, то они образуют с антигеном комплекс, который адсорбируется на капельках жира и при отстаивании всплывают вверх, образуя синее кольцо (остальная часть молока остается белой) – реакция положительная.

При отрицательной реакции столбик молока остается равномерно окрашенным в первоначальный синий цвет, который был получен сразу после добавления к нему антигена, а слой сливок – белого или слегка желтоватого цвета.

Рис. 67. Капельная реакция агглютинации на предметном стекле: а – положительная; б – отрицательная

При получении положительного или сомнительного результата КР от всех животных берут кровь для исследования на бруцеллез в РБП или РА и РСК (РДСК), проводят эпизоотологическое обследование хозяйства, клинический осмотр и исследование животных на заболевание маститами.

К а п е л ь н ы й м е т о д РА применяют в основном для идентификации культур бактерий, а также для установления их принадлежности к определенным серогруппам и серовариантам. Так поступают при диагностике колибактериоза и сальмонеллезов. Техника постановки РА сводится к следующему. На предметное стекло наносят каплю сыворотки и каплю физиологического раствора (контроль). Петлю с бактериальной культурой увлажняют в капле сыворотки, затем культуру тщательно растирают рядом с каплей, смешивают с сывороткой и энергично 6-10 раз покачивают стекло круговыми движениями. Агглютинация наступает сразу или не позднее 1-2 мин. Реакцию агглютинации учитывают при хорошем освещении. Пользование лупой облегчает учет реакции.

Агглютинация проявляется в виде склеивания бактериальной массы и полного или частичного просветления жидкости.

При отрицательной реакции культура после тщательного смешивания с каплей сыворотки образует гомогенную взвесь (рис. 67). То же самое должно быть при проведении контроля (антиген + физиологический раствор).

Р о з-б е н г а л п р о б а (РБП)

Пластинчатую реакцию агглютинации с бруцеллезным роз-бенгал антигеном применяют для исследования сывороток крови при диагностике бруцеллеза у многих видов животных.

Компонентами РБП являются:

— испытуемые сыворотки крови;

— бруцеллезный антиген для РБП, изготовляемый на биопредприятиях, представляет собой стандартизированную суспензию в буферном растворе инактивированных нагреванием и фенолом бруцелл, окрашенных бенгальским розовым в розовый цвет;

— позитивная бруцеллезная и негативная сыворотки;

— 0,5%-ный карболизированный физиологический раствор.

Реакцию проводят на чистых сухих эмалированных пластинках с лунками при температуре 18-30°С.

Исследуемые сыворотки крови в дозе 0,03 мл вносят на дно лунки. При исследовании сывороток крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов, свиней в каждую лунку рядом с сывороткой вносят 0,03 мл антигена, а при исследовании сывороток других животных – 0,015 мл, тщательно смешивают покачиванием и легким вращением в течение 4 мин. Одновременно проводят контроли антигена с позитивной и негативной сыворотками, с физраствором.

Реакцию считают положительной при выраженной агглютинации окрашенных бруцелл в виде мелких или крупных хлопьев розового цвета, выделяющихся на белом фоне лунки. Реакцию считают отрицательной при отсутствии агглютинации (смесь гомогенна, равномерно окрашена).

Р е а к ц и я г е м а г г л ю т и н а ц и и (РГА)

Эта реакция не относится к реакциям иммунитета, так как является результатом действия естественных гемагглютининов некоторых бактерий и вирусов на эритроциты, что влечет за собой их агглютинацию.

Реакцию ставят на плексигласовых панелях с лунками.

Исследуемый материал разводят физраствором и к этим разведениям добавляют равный объем 1-2%-ной взвеси эритроцитов, после чего панели с реакцией помещают в термостат на 30 мин или оставляют при комнатной температуре на 1 ч.

Учет реакции производят по характеру осадка. При положительной реакции осадок из склеившихся эритроцитов имеет форму раскрытого «зонтика» с изрезанными краями, а при отрицательной — компактный диск в виде «кнопки» с ровными краями.

Реакция гемагглютинации позволяет только выявить гемагглю-тинирующую способность бактерий и вирусов.

Для идентификации этих микроорганизмов в дальнейшем используют реакцию торможения гемагглютинации.

Р е а к ц и я т о р м о ж е н и я г е м а г г л ю т и н а ц и и (РТГА)

РТГА – иммунная реакция, в которой специфические антитела, взаимодействуя с антигеном, лишают его способности агглютинировать эритроциты.

Реакция проводится в два этапа. На первом этапе разводят специфическую сыворотку от 1:10 до 1:1280, К каждому разведению сыворотки добавляют равный объем жидкости, содержащий антиген в четырехкратном титре, который определен в РГА. Если титр антигена равен 1:640, агглютинируют эритроциты, делают разведение в 4 раза концентрированнее – 1:160.

После инкубирования при 37°С в течение 30 мин на втором этапе к этой смеси добавляют равный объем 1-2%-ной взвеси эритроцитов. Если сыворотки и антигена взято по 0,25 мл, то эритроцитов добавляют 0,5 мл.

Контролем является проба, где сыворотка заменена физраствором. Реакция читается после выдерживания в течение 30 мин в термостате или 45 мин при комнатной температуре.

При положительной РТГА образуется плотный осадок эритроцитов (задержка реакции) на дне пробирки, имеющих вид «пуговки» диска.

При отрицательной РТГА отмечается выраженная гемагглютинация в виде «зонтика».

Реакция используется для идентификации и типизации выделенного антигена, титрования вируссодержащих жидкостей и материалов и серологическом диагностики вирусных инфекций.

Р е а к ц и я н е п р я м о й (п а с с и в н о й) г е м а г г л ю т и н а ц и и (Р Н Г А)

Сущность этой реакции заключается в том, что на поверхность эритроцитов адсорбируют или антиген, или антитела (иммуноглобулины), которые приобретают способность агглютинироваться в присутствии специфических антител или антигена.

Главными достоинствами РНГА – высокая чувствительность и специфичность, техническая простота, стабильность используемых компонентов.

РНГА применяют при диагностике инфекционных болезней:

1) для обнаружения в титрования антител в исследуемой сыворотке крови с помощью известного эритроцитарного антигенного диагностикума;

2) для идентификации неизвестного антигена с помощью известного иммуноглобулинного эритроцитарного диагностикума.

Учет РНГА проводится так же, как и при постановке РГА.

Задания для самостоятельной работы

1. Провести постановку и учет результатов реакции агглютинации капельным методом с неизвестным антигеном с использованием набора агглютинирующих сальмонеллезных сывороток.

2. Провести постановку реакции агглютинации классическим (пробирочным методом) на бруцеллез с сыворотками крови крупного рогатого скота (учет результатов провести на следующем занятии).

3. Ознакомиться с результатами кольцевой реакции с молоком на бруцеллез, с реакцией гемагглютинации с Роз-бенгаловой пробой на бруцеллез.

Вопросы для самоподготовки и контроля знаний

1. Как называются компоненты в реакции агглютинации?

3. Осадок, продукт соединения антигена с антителом.

2. Для постановки реакции агглютинации необходимо приготовить исходное разведение исследуемой сыворотки 1:25. Какой из приведенных вариантов удовлетворяет это условие?

А. 0,3 мл сыворотки + 4,7 мл физраствора.

Б. 0,2 мл сыворотки + 4,8 мл физраствора.

В. 0,1 мл сыворотки + 4,9 мл физраствора.

3. При чтении реакции агглютинации в одной из пробирок установлены следующие признаки – жидкость мутная (непрозрачная), на дне небольшой осадок. Дать оценку реакции агглютинации на плюсовой системе.

4. При чтении реакции агглютинации на бруцеллез с сывороткой крупного рогатого скота получены результаты:

1:50 +++, 1:100 +++, 1:200 ++, 1:400 ++. Дайте оценку реакции.

5. В лабораторию присланы пробы сыворотки крови крупного рогатого скота. Какие разведения сыворотки нужно приготовить для постановки реакции агглютинации на бруцеллез?

6. Какие изменения претерпевает антиген под действием специфических антител в реакции агглютинации?

А. Выпадает осадок на границе обеих жидкостей.

7. При положительной реакции агглютинации в пробирке наблюдается осадок в виде «зонтика», при встряхивании которого образуются крупные хлопья. К какому виду агглютинации относится данная реакция?

8. Проведена реакция агглютинации методом кольцевой пробы с молоком на бруцеллез, в результате чего проба молока стала белой и на его поверхности образовалось синее кольцо. Дайте оценку реакции.

источник

Реакция Хеддльсона (пластинчатый метод)

Преимущество этого метода заключается в простоте постановки реакции, быстром получении результатов и чувствительности реакции. В качестве антигена для постановки реакции Хеддлсона и Райта применяют единый бруцеллезный диагностикум. Реакцию ставят на обычном оконном, тщательно вымытом, обезжиренном стекле, расчерченном на квадраты величиной 4 x 4 см каждый, по горизонтали должно быть 5 квадратов. На первом квадрате с левой стороны записывается номер испытуемой сыворотки, в последующие квадраты слева направо разливают (микропипеткой или 1 мл градуированной пипеткой) испытуемую сыворотку в следующих дозах: 0,04, 0,02, 0,01 и 0,03 (контроль сыворотки). К первым трем дозам сыворотки добавляют по 0,03 мл антигена. К последней дозе сыворотки (0,03) добавляют 0,03 мл физиологического раствора. Сыворотку осторожно смешивают с антигеном палочкой, начиная с минимальной дозы сыворотки. Контроль антигена ставят, добавляя 0,03 мл физиологического раствора к 0,03 мл антигена. Затем стекло слегка подогревают над пламенем спиртовки так, чтобы происходило равномерное нагревание всей поверхности стекла.

В случае положительной реакции в первые же минуты в каплях сыворотки с антигеном появляются хлопья (агглютинат). Максимальный срок наблюдения 8 минут. Контроль сыворотки ставят с каждой испытуемой сывороткой для исключения спонтанной агглютинации; контроль антигена ставят один (при любом числе испытуемых сывороток) для исключения спонтанной агглютинации применяемого антигена. Учет реакции проводят невооруженным глазом по следующей схеме: а) полное просветление жидкости с крупными и мелкими хлопьями, т.е. 100 % агглютинации (4+); б) почти полное просветление жидкости с ясно заметными хлопьями, т.е. 75 % агглютинации (3+); в) незначительное просветление жидкости с заметными хлопьями, т.е. 50 % агглютинации (2+); г) мутная жидкость с едва заметной зернистостью (+); д) равномерная мутная жидкость (-).

Для оценки результатов рекомендуется следующая схема: а) агглютинация на 4+ во всех дозах сыворотки — результат «резко положительный»; б) агглютинация не менее 2+ во всех дозах сыворотки — результат «положительный»; в) агглютинация только в первой или в первой и второй дозах сыворотки — результат «сомнительный»; г) отсутствие агглютинации во всех дозах сыворотки — реакция «отрицательная».

Для диагностики бруцеллеза имеет значение только положительный результат реакции. При сомнительном или отрицательном результатах реакции и наличии эпидемических и эпизоотических показаний, а также в стационаре и при обследовании доноров, где необходимо определение титра агглютининов и их динамики, следует применять реакции Райта и Кумбса, РПГА и ИФА.

Роз-Бенгал проба (РБП)

Роз-Бенгал проба, по сравнению с другими методами серологической диаг­ностики бруцеллеза, обладает следующими преимуществами: большой чувстви­тельностью, способностью в короткие сроки после заражения выявлять специ­фические бруцеллезные антитела и, благодаря кислой реакции антигена, ингибировать проявления неспецифических антител, а также стабильностью показаний, технической простотой постановки, требующей небольшой затраты труда и времени, четкостью и быстротой получаемых результатов.

Сыворотки крови, подлежащие исследованию, должны быть прозрачные, без примеси эритроцитов. Их исследуют не позднее, чем через 4 дня хранения при температуре плюс 4-8 °С.

Допускается исследовать сыворотки, консервированные сухой борной кис­лотой (2 % борной кислоты к объему сыворотки). Консервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 14 дней.

Антиген представляет собой суспензию инактивированных нагреванием и фенолом бруцелл в буферном растворе, окрашенных бенгальским розовым в розовый цвет. Расфасован во флаконы из темного стекла, подлежит хранению в темном сухом месте при температуре плюс 4-12 °С. Срок годности антигена при соблюдении условий хранения 18 месяцев со дня его изготовления.

Антиген во флаконах без этикетки (надписи) или с трещинами, содержащий постороннюю примесь, неразвивающиеся хлопья, плесень, с истекшим сроком годности или подвергавшиеся замораживанию, для применения не годен.

Перед употреблением антиген выдерживают 30-40 мин. при комнатной температуре и затем тщательно встряхивают.

Техника постановки Роз-Бенгал пробы: реакцию проводят на чистых сухих металлических эмалированных пластинках или изразцовых плитках с лунками при комнатной температуре (плюс 18-30 °С).

Исследуемые сыворотки крови в дозе 0,03 мл вносят на дно лунки шприцем-полуавтоматом или микропипеткой, которые трижды промывают фенолизированным (карболизированным) физиологическим раствором и подсушивают фильтро­вальной бумагой.

В каждую лунку рядом с сывороткой пипеткой-капельницей вносят равное количество (0,03 мл антигена) и тщательно смешивают активным движением ручного полисмесителя на 5 или 25 проб для получения однородной смеси, рас­пределяя ее при этом по всей поверхности лунки.

Пластину с внесенными на нее сыворотками и антигеном покачивают в течение 4 мин осторожными вращательными движениями вручную или при помощи автоматического прибора, предназначенного для этой цели. При положительной реакции появляются хлопья агглютината розового цвета.

В начале работы ставят контроль антигена с нормальной (отрицательной) и положительной агглютинирующей сыворотками в тех же дозах, а также контроль антигена на спонтанную агглютинацию (к 0,03 мл антигена добавляют 0,03 мл физиологического раствора).

Учет реакции проводят невооруженным глазом в течение 4 мин. после смеши­вания сыворотки с антигеном при слегка наклонном положении пластинки.

Агглютинацию, которая наступает позже, чем через 4 мин — не учитывают.

Реакцию считают положительной при наличии выраженной агглютинации в виде мелких или крупных хлопьев розового цвета.

При отсутствии агглютинации (смесь гомогенна, равномерно окрашена) реакцию считают отрицательной.

После учета реакции пластинки дезинфицируют погружением на 5 мин в 3 % раствор фенола или 1 %-ный раствор хлорамина, затем тщательно промывают водопроводной водой, высушивают и используют повторно. Для этих целей можно применять кассеты и штативы сушилки.

При нечетко выраженной агглютинации проводят повторное исследование.

По результатам повторного исследования дают окончательную оценку реакции (положительная или отрицательная).

Сыворотки, с которыми получена положительная РБП, исследуют в РА и РСК (РДСК) для установления титра агглютининов и наличия комплементсвязывающих антител. Сыворотки, с которыми получена отрицательная РБП, дополнительно в РА и РСК (РДСК) не исследуют.

Кольцевая реакция с молоком

Кольцевая реакция применяется с целью ориентировочной проверки благо­получных по бруцеллезу молочных стад и для проверки молока на рынках.

Сущность кольцевой реакции заключается в том, что в молоке бруцеллезных животных при добавлении антигена образуется комплекс антитела с антигеном, который адсорбируется жировыми частицами молока. Жировые частицы вслед­ствие своего малого удельного веса поднимаются наверх, увлекая адсорбиро­ванный агглютинат, который в зависимости от цвета антигена образует на по­верхности жидкости окрашенное кольцо.

Для кольцевой реакции применяют цветной антиген Триленко, представ­ляющий взвесь убитых, окрашенных бруцеллезных микробов.

Для исследования необходимо брать цельное, лучше свежее, молоко или консервированное формалином (из расчета 0,1 мл 10 % раствора формалина на 10 мл молока).

В пробирку берут 2 мл молока и добавляют 0,1 мл (2 капли) концентрирован­ного антигена, тщательно встряхивают и помещают в водяную баню или термостат на 45-50 мин при температуре 37-39 °С.

Учет реакции: а) если в верхней части столбика молока (в слое сливок) четко выражено синее кольцо, а остальная часть молока белая, реакция оценивается положительной — 100 или 75 % агглютинации (+ + + + и + + +); б) при наличии достаточно выраженного синего кольца в слое сливок, а ос­тальная часть молока синеватого цвета, реакция оценивается положительной – 50 % агглютинации (+ +); в) если синее кольцо в слое сливок слабо выражено и весь столбик молока имеет синий цвет, реакция считается сомнительной — 25 % агглютинации (+ и ±); г) если столбик молока равномерно окрашен в синий цвет, а слой сливок ос­тается белым или слегка желтоватым, реакция отрицательная (-).

Молоко от коров с сомнительной реакцией исследуют повторно через 10-15 суток. При получении отрицательного или снова сомнительного результата животных считают благополучными по бруцеллезу.

Пластинчатая реакция агглютинации (исследование молока)

Данная реакция применяется для исследования только свежего молока и молочной сыворотки. Не подлежит исследованию пастеризованное, кипяченое и замороженное молоко (в таком молоке антибруцеллезные агглютинины раз­рушаются), а также молоко, имеющее кислотность выше 30 °С по Тернеру (во избежание получения неспецифических результатов).

Реакцией агглютинации можно исследовать молоко жирное (цельное), обез­жиренное (снятое) и молозиво. Жирное молоко предварительно обезжиривают отстаиванием или центри­фугированием, затем из-под слоя сливок забирают молоко для исследования. Обезжиренное молоко и молозиво исследуют без предварительной подго­товки, но так, чтобы сливок попало минимальное количество.

Обезжиренное молоко наносят на стекло (чашку Петри) в коли­честве 0,1 мл (или двух капель) и 0,05 мл (или одной капли). К каждой дозе испытуемого молока добавляют по одной капле бруцеллезного диагностикума. Реакция сопровождается двумя контролями: к 0,05 мл диагностикума добавляют 0,1 мл физиологического раствора и 0,1 мл испытуемого молока смешивают с 0,05 мл 12 % раствора хлористого натрия. Путем покачивания стекла смеши­вают ингредиенты. Учет реакции производят в первые 3-5 мин.

Положительная реакция агглютинации характеризуется выпадением хлопьев с большим или меньшим обесцвечиванием молока. При отрицательном резуль­тате молоко остается равномерно окрашенным в голубой цвет (цвет антигена).

Исследование молочной сыворотки

Перед получением молочной сыворотки жирное молоко обезжиривают путем центрифугирования или отстаивания. Молочную сыворотку получают при ство­раживании молока сычужным ферментом. Для этого к 5 мл молока добавляют 1-2 капли 10 % сычужного фермента на физиологическом растворе хлористого натрия. Пробирки помещают при температуре 37 °С на 20-30 мин (до свертывания молока). Молочную сыворотку можно получить также путем помещения молока при 37 °С на сутки. Молочную сыворотку сразу отделяют путем фильтрования через бумажный фильтр. Дальнейшие манипуляции: постановка реакции и учет результатов анало­гично постановке и учету реакции агглютинации с цельным молоком.

При оценке результатов исследования молока на бруцеллез при помощи пластинчатой реакции агглютинации необходимо учесть возможность образования мелкохлопчатого агглютината, который из-за мутности молока может быть не отмечен и результаты реакции могут быть приняты за отрицательные. В отри­цательных реакциях рекомендуется молоко исследовать в реакции агглютинации с молочной сывороткой.

Последнее изменение этой страницы: 2016-12-30; Нарушение авторского права страницы

источник

Сущность кольцевой реакции.

По наблюдениям некоторых ученых данная реакция пригодна для исследования фляжного молока, если оно содержит молоко хотя бы одной бруцеллезной коровы.

Молоко повышенной кислотности (32-33ºТ), молозиво, молоко коров, больных маститом, и содержимое молочной железы сухостойных коров не дают правильных показателей по этой реакции. Пробы молока, консервированные формалином, разведенные пополам водой, и свежие сливки после их разведения 10% раствором хлорида натрия 1:1 можно исследовать по кольцевой реакции.

Реакция заключается в том, что добавленный в молоко бруцеллезный антиген соединяется (склеивается) с антителом. Возникший комплекс антитело+антиген адсорбируется на жировых шариках, которые при температуре реакции поднимаются на поверхность содержимого пробирки, образуя кольцо синего цвета. При отсутствии антител антиген распределяется равномерно в молоке и синее кольцо не образуется.

Техника определения.

В агглютинационные пробирки наливают 1мл исследуемого молока и добавляют 1каплю цветного бруцеллезного антигена (смыв культуры бруцелл, окрашенных гематоксилином). Для равномерного распределения антигена в молоке содержимое встряхивают и пробирки ставят в термостат при 37-39ºС на час, после чего читают реакцию.

При исследовании молока овец кольцевой реакцией рекомендуется разводить молоко 10-20% раствором хлорида натрия или молоком коровы (здоровой) 1:1.

«+» реакция – характеризуется тем, что в верхнем слое пробирки появляется кольцо, окрашенное в интенсивно синий цвет при некотором просветлении содержимого пробирки;

«-»реакция – равномерное окрашивание содержимого; слой сливок остается белого или коричневого цвета.

«±» реакция – наличие слабого окрашивания кольца без просветления содержимого пробирки.

Техника определения.

К 10мл теплого молока (35-37ºС) + 5капель 10% сычужного фермента (на физ.растворе) и помещают на 5мин в водяную баню при температуре 38-40ºС для быстрого свертывания. Свернувшееся молоко обводят стеклянной палочкой по стенке пробирки, центрифугируют и полученную прозрачную надосадочную жидкость (сыворотку) используют для исследования. Для реакции берут по 1мл сыворотки в 6 разведениях (1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 и 1:160), добавляют в каждую пробирку по 0.5 мл стандартного антигена, затем пробирки встряхивают и помещают на 30мин в термостат при 37ºС. После выдержки в термостате пробы центрифугируют 5мин при 3000об/мин и читают реакцию.

«+» реакция – в пробирке появляется осадок в виде круглой шляпки, которая при взбалтывании разбивается на хлопья и комочки.

«-» реакция – осадок при взбалтывании образует равномерную муть.

Для осаждения казеина вместо сычужного фермента можно применять уксусную кислоту.

Способы установления молока коров, больных маститом.

Методические указания.

Для диагностики субклинических маститов используют основные пробы с димастином или мастопримом. Если эти реакции положительные, их уточняют пробой «отстаивания». При заболевании у коров вымени в молоке увеличивается число лейкоцитов и проявляется щелочная реакция (рН 7 и выше), что устанавливают с помощью димастина и мастоприма, содержащих поверхностноактивные вещества, которые, взаимодействуя с лейкоцитами, образуют сгусток, а индикатор изменяет цвет в зависимости от реакции среды (рН).

А. Бромтимоловая проба.

Техника определения.

На белую фарфоровую пластинку наносят 2-4капли исследуемого молока и 1-2капли 0.2% спиртового (спирт 60%) раствора бромтимолового синего.

Желтое, зеленовато-желтое или желто-зеленое окрашивание характерно для молока, полученного от здоровой коровы. Молоко коров, больных маститом, в зависимости от стадии заболевания и его характера окрашивается в цвета от сине-зеленого до желтоватого.

Б. Лейкоцитарная проба.

Техника определения.

На молочно-контрольную пластинку наносят 5капель молока и 1каплю 4% едкого натра, перемешивают палочкой в течение 20с и определяют результат пробы. При воспалительном процессе в молочной железе (мастит) на пластинке появляется желеобразная масса (значительное количество лейкоцитов), а при нормальном количестве лейкоцитов изменения не наблюдаются – проба отрицательная.

Реакция заключается в том, что под влиянием щелочи лейкоциты растворяются с освобождением ДНК (вещество ядра), обуславливающей желеобразование в пробе.

В.Проба отстаиванием.

Техника определения.

В пробирку наливают по 10-15мл исследуемого молока и отстаивают его при температуре 4-8ºС. Пробирки просматривают вначале через 2-3ч и окончательно через 16-24ч.

В молоке с наличием мастита на дне пробирки появляется осадок белков молока, клеток и микробов, в котором при микроскопировании обнаруживается значительное количество лейкоцитов. Такое молоко часто бывает водянистым, с синеватым оттенком (субклиническая форма). Появление розового цвета в слое сливок будет свидетельствовать о наличии эритроцитов.

Г. Проба с димастином.

Техника определения

В луночки молочно-контрольной пластинки помещают по 1мл исследуемого молока, затем вносят по 1мл димастина. Перемешивают реактив и молоко вращательными движениями и в каждой луночке определяют консистенцию и цвет смеси.

Папиллярные узоры пальцев рук — маркер спортивных способностей: дерматоглифические признаки формируются на 3-5 месяце беременности, не изменяются в течение жизни.

Общие условия выбора системы дренажа: Система дренажа выбирается в зависимости от характера защищаемого.

Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций.

источник

Основными тестами при массовых диагностических исследованиях явля­ются пробирочная РА, РА на стекле (Роз-бенгал проба), РСК и РДСК, коль­цевая реакция с молоком, реакция диффузионной преципитации.

Пробирочная реакция агглютинации.Используют при диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота, шец, коз, лошадей, буйволов, верблюдов, оленей, собак, пушных зверей И т.д. Реакцию проводят в объеме
1 мл. Сыворотки крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов исследуют в разведениях 1:50-1:400; онец, коз, свиней, буйволов, оленей и собак — 1:25 -1:200; пушных зве­рей и морских свинок — 1:10-1:80. При массовых исследованиях до­пускается постановка РА в двух первых разведениях, но при этом надо иметь в виду возможность феномена «прозоны». Сыворотки крови круп­ного рогатого скота, лошадей, собак, пушных зверей, верблюдов разво­дят 0,85%-ным раствором натрия хлорида с 0,5% фенола; сыворотки кро­ви овец, коз и буйволов разводят 5%-ным, а сыворотки крови оленей — 10%-ным фенолизированным раствором натрия хлорида. Разведения сы­воротки крови делают в объеме 0,5 мл, затем в каждую пробирку вносят 0,5 мл единого бруцеллезного антигена, разведенного 1:10, при этом раз­ведения сыворотки крови удваиваются. Компоненты перемешивают Встряхиванием и штатив с пробирками помещают в термостат при 37-38° С на 18-20 часов, затем выдерживают несколько часов при комнат­ной температуре и учитывают результат общепринятым способом (техни­ку постановки и учета результатов РА см. в разделе «Серологические ре­акции»). В качестве контролей параллельно исследуют заведомо положи­тельную и отрицательную сыворотки. РА при бруцеллезе крупного рога­того скота, лошадей и верблюдов считают положительной при титре 1:100 и более (1:50 — сомнительный результат), у овец, коз, оленей, буйволов и собак — 1:50 (1:25 — сомнительный результат). При получении сомни­тельных результатов сыворотки крови от этих животных исследуют через три-четыре недели повторно.

Помимо титра результаты пробирочной РА выражают в международ­ных единицах (ME). В разных странах готовят антигены, различающиеся по агглютинабилыюсти, что приводит к несопоставимости титров РА. По­этому была предложена международная стандартная бруцеллезная сыво­ротка, по отношению к которой определяют активность национальных ан­тигенов. Активность стандартной сыворотки определена в 1000 МЕ/мл. Например, при исследовании этой сыворотки с определенным нацио­нальным антигеном она показывает в РА титр 1:500. Следовательно, если в РА с этим антигеном исследуют сыворотку крови от животного из хозяй­ства и получают титр РА 1:500, то она также содержит 1000 ME бруцеллез­ных антител, а вторая сыворотка, давшая титр 1:400, содержит 1000 х 400 : 500 = 800 ME и т.д. В настоящее время в странах разработаны национальные стандартные бруцеллезные сыворотки, соответствующие по активности международной сыворотке. В РФ в соответствии с «Наставлением по диаг­ностике бруцеллеза животных» (2000) приняты следующие критери оценки РА в ME. Реакцию считают положительной у невакцинироваппого крупного рогатого скота, верблюдов, лошадей, а также иммунизированных неаг-глютиногенными вакцинами при наличии 200 ME антител (сомнительной — 50-100 ME); у овец и коз — 100 ME; оленей и собак — 50 ME; пушных зверей и морских свинок —10 ME. PA считают сомнительной у овец, коз, оленей, собак этой группы на уровне 25-50 ME. При сомнительных пока­заниях РА животных повторно исследуют через 15-30 суток. В случае повышения уровня антител животных признают больными, при отсутствии динамики — здоровыми. Выявление в стадах крупного рогатого скота, иммунизированного ра­нее агглютиногенными вакцинами, животных с уровнем антител не более 200 ME предполагает через 15-30 суток их повторное исследование. Если при повторном исследовании наблюдают повышение уровня антител, то животных признают больными. При отсутствии повышения дополнитель­ными методами уточняют специфичность результатов РА.

При обнаружении в неблагополучных по бруцеллезу стадах крупного рогатого скота (ранее иммунизированного или не иммунизированного) жи­вотных с уровнем антител 100 ME и более их признают больными,
50 ME — результат РА сомнительный. В случае сомнительной РА животных исследу­ют через 15-30 суток повторно и при вторичном сомнительном результате животных признают больными.

При исследовании в РА невакцинированных баранов-производителей, пробников, ярок, козлов, содержащихся в благополучных отарах, где про­водилась иммунизация, РА оценивают как положительную при уровне ан­тител 100 ME и более, сомнительной — 50 ME. В последнем случае живот­ных через 15-30 суток исследуют повторно, и, если содержание антител не увеличилось, их признают здоровыми.

Роз-бенгал проба (РБП).РА на стекле с корпускулярным антигеном, окрашенным розовым бен­гальским, используют для диагностики бруцеллеза крупного рогатого ско­та, овец, коз, лошадей, свиней, буйволов, верблюдов и северных оленей. Реакцию проводят на чистых, сухих эмалированных пластинках с лунками при температуре не ниже 18°С. Исследуемые сыворотки в дозе 0,03 мл вно­сят на дно лунки, затем в лунку рядом с сывороткой помещают при исследо­вании крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов и свиней 0,03 мл ан­тигена, сывороток овец, коз, буйволов и северных оленей — 0,015 мл анти­гена. Компоненты должны иметь температуру не ниже 18°С.

Затем компоненты перемешивают в течение 4 минут, одновременно учи­тывая результат. В положительных случаях в течение указанного времени появляются розовые хлопья агглютината. В РБП исследуют неразведен-ные сыворотки, влияние нормальных антител нивелируется использовани­ем кислого антигена со значениями рН, при которых нормальные антитела с низкой авидностыо не реагируют с антигеном, что обеспечивает специ­фичность результата реакции. Перед началом исследований антиген проверяют в РБП на активность, специфичность и на спонтанную агглютинацию соответственно с позитивной, негативной сыворотками и в последнем случае — с физиологическим раствором. В соответствии с «Наставлением по диагностике бруцеллеза животных» в РФ результат РБП считают положительным при наличии четко выраженной агглютинации. В благополучных по бруцеллезу хозяйствах в случае позитивной РБП сыворотки крови исследуют в РА и РСК (РДСК) или РА и РИД. Если при этом получают отрицательные результаты, то животных с позитивной РБП повторно исследуют через 15-30 дней в этих же серологических реакциях. В неблагополучном по бруцеллезу хозяйствах овец, коз, северных оленей с позитивной РБП признают больными. Сыворотку крови крупного рогатого скота, вер­блюдов и лошадей дополнительно исследуют в РА, РСК (РДСК) или РА и РИД, животных с положительными результатами этих серологических ре­акций признают больными, сомнительно реагирующих исследуют повторно через 15-30 суток в РА, РСК (РДСК) или РА и РИД. При получении положительных или сомнительных результатов животных признают больными бруцеллезом.

Кольцевая реакция с молоком (КР).Реакцию применяют для проверки благополучных по бруцеллезу стад крупного рогатого скота и молока на рынках.

В РФ, в соответствии с «Наставлением по диагностике бруцеллеза животных», реакцию и оценку результатов проводят следующим образом. В уленгутовские пробирки наливают 0,05 мл антигена (клетки бруцелл, окрашенные гематоксилином) и 1 мл исследуемого молока. Если используют пробирки Флоринского — 2 мл молока и 0,1 мл антигена, компоненты пе­ремешивают, пробирки помещают в водяную баню (37-38° С) на 1 час, затем учитывают результат по нижеследующим критериям:

КР на 2-3 креста считают положительной, 1 крест — сомнительной. При положительной КР от всех животных стада берут кровь для исследо­вания в РА или РСК (РДСК) или РА и РИД. Если получают их отрицатель­ный результат, то независимо от позитивной КР животных признают здоро­выми.

Реакция связывания комплемента (РСК, РДСК). Данную серологическую реакцию применяют для диагностики бруцел­леза практически у всех видов животных. Согласно «Наставлению по ди­агностике бруцеллеза животных» исследуемые сыворотки крови крупного рогатого скота для РСК инактивируют разведенными 1:5 в водяной бане в течение 30 минут при 60-62°С; сыворотки крови ослов, мулов при 64-65°С; буйволов — 62-64° С; свиней — 60-62° С 50 минут; при постанов­ке РДСК 30 минут при 62-64° С. Используют единый бруцеллезный анти­ген в рабочем титре, гемолизин для РСК в удвоеном титре, для РДСК — в утроенном, 2,5%-ную взвесь эритроцитов барана для РСК и 3%-ную для РДСК. Комплемент в количестве 1,2 единицы (титр комплемента принима­ется за 1 единицу). Реакцию проводят в объеме 1 мл с сыворотками, разве­денными 1:5 или 1:10 (технику постановки и учета результатов см. в разде­ле «Серологические реакции»).

При исследовании сывороток в одном разведении (1:5) и задержке гемо­лиза на один крест эти сыворотки повторно исследуют в двух разведениях (1:5, 1:10). В случае сомнительной РСК животных повторно исследуют че­рез 15-30 суток. Если при повторном исследовании животных из благопо­лучного по бруцеллезу хозяйства вновь получена сомнительная РСК — жи­вотных признают здоровыми. Если аналогичный результат получен у жи­вотных неблагополучного хозяйства, их рассматривают как больных. По­лучение только позитивной РСК в разведении 1:10 в благополучных по бруцеллезу стадах ранее вакцинированного крупного рогатого скота пред­полагает повторное исследование через 15-30 суток. При нарастании титров РСК диагноз на бруцеллез считают установленным, в обратном слу­чае результат исследования считают отрицательным («Наставление по ди­агностике бруцеллеза животных», 2000).

Реакция иммунодиффузии (РИД). Согласно «Наставлению по диагностике бруцеллеза животных» (2000) в РФ РИД используют при плановых исследованиях в благополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота хозяйствах, где не применяются вак­цины, одновременно с РА, а также при проверке сомнительно реагирую­щих в РА или РСК (РДСК) животных для дифференциации неспецифичес­ких реакций; в благополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота хозяйствах, где проводится иммунизация крупного рогатого скота аг-глютиногенными вакцинами при контроле эпизоотического состояния (не ранее 1,5 месяца после вакцинации); для дифференциации реакций, полу­ченных в РА (не более
200 ME) или РСК (РДСК) в разведениях не выше 1:10; при плановых исследованиях животных одновременно с РА; в не­благополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота хозяйствах через 1,5 месяца после иммунизации; среди телок и нетелей в течение первых шести месяцев после иммунизации (реиммунизации) 2-4-кратно; через месяцев после иммунизации (реиммунизации) животных для оздоровления стада от бруцеллеза в комплексе предусмотренных реакций; при постановке хозяйства на контроль и снятии ограничений одновременно с РА и РСК (РДСК).

При диагностике бруцеллеза северных оленей для оценки эпизоотического состояния стад, благополучных по бруцеллезу, вакцинированных против бруцеллеза; для исследования на бруцеллез не ранее чем через два месяца после применения вакцин; для дифференциации неспецифических реакций.

Техника проведения РИД. Расплавленный агар разливают по 2,5 мл на предметные стекла, пластинки размером 6×9 см —12 мл, стандартные чашки Петри слоем не менее 2 мм, которые предварительно размещают на строго горизонтальной поверхности. В застывшем агаровом геле штампом делают лунки: центральную диаметром 5 мм и шесть переферических по 3 мм.

В центральную лунку вносят 20 мкл О-полисахаридного антигена, в пе­риферические — 40 мкл исследуемых сывороток крови. Одновременно на каждой пластинке (чашке Петри) ставят контроль с позитивной сывороткой крови. Затем стекла (чашки Петри) выдерживают во влажной камере при температуре не ниже 18° С и учитывают результат в косопроходящем свете через 24 и 48 часов. Как положительный результат оценивают наличие ли­нии преципитации, появившейся через 24 часа. Сыворотки крови, давшие реакцию преципитации через 48 часов, исследуют повторно и при получении линии преципитации через 24 или 48 часов результат реакции признают по­ложительным.

Печеночно-сывороточный или печеночно-аминопептидный агар.Готовят печеночный отвар: 500 г свежего фарша говяжьей печени смешивают с 500 мл воды, кипятят 1 час, фильтруют через ватный фильтр, стерилизуют в автоклаве, смешивают равные объемы печеночного отвара и водопроводной воды, добавляют 1% пептона, 0,5% натрия хлорида, 2% агар-агара. На 1000 мл смеси вносят 17 мл 10%-ной двууглекислой соды, автоклавируют 20-25 минут при 115° С, фильтруют через ватный фильтр, ус­танавливают рН 7,0-7,2, добавляют 1% глюкозы и 2% глицерина, разливают по колбам и стерилизуют 20-25 минут при 110° С. Перед использо­ванием агар расплавляют, остужают до 50° С, добавляют 10-20% сыво­ротки крови лошади или крупного рогатого скота (печеночно-сывороточ-иый агар) или 10-15% аминопептида (печеночно-аминопептидный агар) и разливают по чашкам или пробиркам. Также готовят полужидкие агары, внося 0,15-0,2% агар-агара. Рекомендуют среды данного типа для культивирования В. ovis.

Печеночный агар Хеддльсона.В 500 мл воды вносят 10 г пентона,
5 г натрия хлорида, 20 г агар-агара, автоклавируют 30 минут, добавляют 500 мл печеночного отвара, охлаж­дают до 60° С, устанавливают рН 7,0. К 1 л среды добавляют один яичный белок, автоклавируют 30 минут при 120° С, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают рН 7,0, разливают по емкостям и стерилизуют 30 минут при 115° С.

Плотный печеночно-глюкозо-глицериновый агар (ППГГА). 400 г свежей говяжьей печени освобождают от жира и пленок, измель­чают, добавляют 500 мл водопроводной воды, кипятят 1 час, фильтруют через ватный фильтр. Полученный печеночный отвар разводят водопро­водной водой 1:1, добавляют 1% пептона, 0,5% натрия хлорида, 2,5% ага­ра и
17 мл 10%-ного раствора гидрокарбоната натрия на 1000 мл. Среду автоклавируют 20 минут при 115° С, отстаивают в автоклаве 3-4 часа, фильтруют через ватный фильтр, устанавливают рН 7,2. Затем в среду вно­сят 1% глюкозы и 2-3% глицерина, разливают по пробиркам, колбам, сте­рилизуют 20-25 минут при 110° С. Данную среду рекомендуется приме­нять для культивирования В. abortus, В. melitensis и В. suis, при бактериостатическом методе дифференциации бруцелл. ППГГБ готовят так же, но агар не добавляют.

Сывороточно-декстрозиый агар.К 835 мл дистиллированной воды добавляют 15г агар-агара, 10г пептона, 5 г химически чистого натрия хлорида и 165 мл мягкой воды. Прогре­вают 1 час текучим паром, устанавливают рН 7,8, автоклавируют 30 мин при 127° С, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 7,4. Среду разливают по сосудам и стерилизуют при 116° С 15 минут. Перед использованием среду расплавляют, охлаждают до 50° С, добавляют сте­рилизованные фильтрованием сыворотку крови лошади или крупного ро­гатого скота до концентрации 5% и раствор декстрозы до уровня 1%. Сре­да рекомендуется для первичного выделения бруцелл.

Сывороточно-декстрозный бульон.Готовят так же, как сывороточно-декстрозный агар, но без добавления агар-агара.

Альбими-агар.В 1000 мл дистиллированной воды добавляют 20 г сухого пептона, 20 мл дрожжевой воды, 5 г натрия хлорида, 20 г агар-агара. Устанавливают рН 7,3, все компоненты растворяют в аппарате Коха, фильтруют через ватный фильтр. Вносят 1 г глюкозы, 0,2 г бисульфита натрия, устанавливают рН 7,2 0-7,3, разливают по колбам и стерилизуют 40 минут текучим паром, затем 20 минут в автоклаве при 110° С. Дрожжевую воду получают путем кипячения 1 кг хлебных дрожжей в 1000 мл дистиллированной воды, затем фильтруют через полотно и хранят под флороформом в темноте (не более 15 дней).

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник