Вирусный гепатит с верификация диагноза

Эпидемиологические:

При вирусных гепатитах В, С, D и G имеет значение парентеральный анамнез и выяснение возможности трансплацентарного или перинатального инфицирования. К группам высокого риска инфицирования относятся дети из семейного очага вирусных гепатитов В, С, D и G; наркоманы и дети из этих семей; дети, страдающие хроническими заболеваниями, требующие регулярных парентеральных вмешательств (с учетом максимального инкубационного периода до 180 дней). Отсутствие вакцинации против ВГВ.

Анамнестические:

При ВГВ преджелтушный период от 1 дня до 2 недель. Для вирусного гепатита В также характерны артралгический и геморрагический синдромы, синдром экзантемы.

Клинические:

Длительность желтушного периода при гепатитах В и С до 4 недель.

С появлением желтухи состояние больных при ВГВ не улучшается, а в ряде случаев – ухудшается.

Нарушения пигментного обмена: желтушность кожи и склер, темная моча, ахоличный стул.

Поражение печени: увеличение и болезненность с изменением плотности и эластичности.

Синдром токсикоза: выраженность диспептического и болевого синдромов, астенические проявления.

Лабораторные:

Постановка предварительного диагноза ВГ, без уточнения его этиологии:

– высокое и стойкое повышение активности печеночноклеточных энзимов – АлАТ и, менее информативно, АсАТ;

– при типичных (желтушных) формах – гипербилирубинемия, преимущественно за счет конъюгированной фракции (при фульминантных формах быстропрогрессирующая гипербилирубинемия за счет неконъюгированной фракции на фоне быстрого снижения активности печеночноспецифических ферментов – билирубин-ферментная диссоциация);

– в _:моче – появление желчных пигментов и уробилина (в преджелтушном периоде и периоде реконвалесценции).

Постановка окончательного диагноза (этиологическая верификация).

СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА

ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТОВ В, D, C и G.

Верификация диагноза ГВ основана на выявлении методом ИФА антигенов и антител или обнаружении методом ПЦР нуклеиновых кислот HBV: HBsAg, HBeAg, anti-HBs, anti-HBe, anti-HBcore, anti-HBcore IgM, ДНК HBV.

Выявление HBsAg. Возможно с конца инкубации, в течение периода разгара и ранней реконвалесценции (до 3-4 недель, но не более 3-6 месяцев).

HBeAg в периоде разгара (в течение первых 2 недель от начала болезни) с последующей сероконвереией на anti-HBe.

Выявление anti-HBcore IgM в период разгара и ранней реконвалесценции (до 3 мес.).

Сероконверсия anti-HBcore IgM на anti-HBсore IgG.

Появление через 3-6 мес. от начала болезни anti-HBs (показатель выздоровления).

Определение ДНК HBV методом ПЦР.

Рис. Маркерный спектр при ОГВ.

Трактовка результатов серологического исследования на маркеры при вирусном гепатите В.

НВsAg	Анти-НВs	Анти-НВсore	НВеAg	Анти-НВе	Диагноз
IgM	IgG
+ (-)	—	+	+	+ (-)	— (+)	Острый гепатит В
— (+)	— (+)	— (+)	+	—	+	Острый ВГВ период реконвалесценции
—	+ (-)	—	+	—	+	Острый ВГВ выздоровление
(+) —	+	+	+	+	—	Фульминантный ВГВ
(+) —	—	+ (-)	+	+ (-)	+ (-)	ХПГ
(+) —	—	+	+	+	—	ХАГ
±	— (+)	—	+	—	—	Здоровые носители
—	+	—	—	—	—	Активная иммунизация
—	+	—	(+)	—	—	Пассивная иммунизация

Верификация диагноза ГС осуществляется выявлением в сыворотке крови антител к HCV anti-HCV, anti-HCV IgM иммуноферментным или радиоиммунным методами; РНК HCV в ПЦР. В последние годы стал использоваться более чувствительный метод – рекомбинантный иммуноблоттинг с определением антител к структурным (С-22с, С-100-3, С-ЗЗс, С-5-1-1 и др.) и неструктурным белкам (NS 3, 4, 5 и др.).

источник

Гепатитами называют острые и хронические воспалительные заболевания печени, носящие не очаговый, а распространенный характер. У разных гепатитов способы заражения различные, отличаются они также по скорости прогрессирования болезни, клиническим проявлениям, способам и прогнозам терапии. Даже симптоматика у различных видов гепатитов разная. Причем одни симптомы проявляются сильнее, чем другие, что определяется видом гепатита.

Желтушность. Симптом встречается часто и обусловлен тем, что в кровь больного при повреждениях печени попадает билирубин. Кровь, циркулируя по организму, разносит его по органам и тканям, окрашивая их в желтый цвет.
Появление боли в районе правого подреберья. Возникает она из-за увеличения размеров печени, приводящих к появлению болей, которые бывают тупыми и длительными или же носят приступообразный характер.
Ухудшение самочувствия, сопровождаемое повышением температуры, головными болями, головокружением, расстройством пищеварения, сонливостью и вялостью. Все это следствие действия на организм билирубина.

Гепатиты у больных имеют острую и хроническую формы. В острой форме они проявляются в случае вирусного поражения печени, а также, если имело место отравление разными видами ядов. При острых формах течения болезни состояние больных быстро ухудшается, что способствует ускоренному развитию симптомов.

При такой форме заболевания вполне возможны благоприятные прогнозы. За исключением ее превращения в хроническую. В острой форме болезнь легко диагностируется и проще лечится. Невылеченный острый гепатит легко развивается в хроническую форму. Иногда при сильных отравлениях (например, алкоголем) хроническая форма возникает самостоятельно. При хронической форме гепатитов происходит процесс замещения соединительной тканью клеток печени. Выражен он слабо, идет медленно, а потому иногда остается недиагностированным до момента возникновения цирроза печени. Хронический гепатит лечится хуже, да и прогноз его излечения менее благоприятный. При остром течении заболевания значительно ухудшается самочувствие, развивается желтушность, появляется интоксикация, снижается функциональная работа печени, в крови увеличивается содержание билирубина. При своевременном выявлении и эффективном лечении гепатитов в острой форме пациент чаще всего выздоравливает. При продолжительности заболевания более шести месяцев гепатиты переходят в хроническую форму. Хроническая форма болезни приводит к серьезным нарушениям в организме — увеличиваются селезенка и печень, нарушается метаболизм, возникают осложнения в виде цирроза печени и онкологических образований. Если у больного пониженный иммунитет, схема терапии подобрана неправильно или имеется алкогольная зависимость, то переход гепатита в хроническую форму угрожает жизни пациента.

Гепатит имеет несколько видов: А, B, C, D, E, F, G, их называют еще вирусными гепатитами, так как причиной их возникновения является вирус.

Эту разновидность гепатита называют еще болезнью Боткина. Она имеет инкубационный период, длящийся в течение от 7 дней и до 2 месяцев. Ее возбудитель — РНК-вирус — может передаваться от больного человека здоровому при помощи некачественных продуктов и воды, контакта с бытовыми предметами, которыми пользовался больной. Гепатит А возможен в трех формах, их подразделяют по силе проявления заболевания:

при острой форме с желтухой серьезно повреждается печень;
при подострой без желтухи можно говорить о более легком варианте болезни;
при субклинической форме можно даже не заметить симптомов, хотя зараженный является источником вируса и способен заражать других.

Эту болезнь называют еще сывороточным гепатитом. Сопровождается увеличением печени и селезенки, появлением болей в суставах, рвоты, температуры, поражением печени. Протекает либо в острой, либо в хронической формах, что определяется состоянием иммунитета заболевшего. Пути заражения: во время инъекций с нарушением санитарных правил, половых контактов, во время переливания крови, применения плохо продезинфицированных мединструментов. Длительность инкубационного периода 50 ÷ 180 дней. Заболеваемость гепатитом В снижается при использовании вакцинации.

Данный вид болезни относится к наиболее тяжелым заболеваниям, так как часто сопровождается циррозом или раком печени, приводящим впоследствии к смертельному исходу. Заболевание плохо поддается терапии, и более того, переболев один раз гепатитом С, человек повторно может подвергнуться заражению этим же недугом. Излечить ВГС непросто: после заболевания гепатитом С в острой форме 20% заболевших выздоравливают, а у 70% больных организм самостоятельно не в состоянии излечиться от вируса, и заболевание становится хроническим. Установить причину, по которой одни излечиваются сами, а другие нет, пока не удалось. Хроническая форма гепатита С сама не исчезнет, в потому нуждается в проведении терапии. Диагностику и лечение острой формы ВГС проводит врач-инфекционист, хронической формы заболевания — гепатолог или гастроэнтеролог. Заразиться можно во время переливания плазмы или крови от зараженного донора, при использовании некачественно обработанных мединструментов, половым путем, а больная мать передает инфекцию ребенку. Вирус гепатита С (ВГС) стремительно распространяется по миру, число больных уже давно превысило полторы сотни миллионов человек. Ранее ВГС плохо поддавался терапии, но теперь заболевание можно вылечить, используя современные антивирусники прямого действия. Только терапия эта достаточно дорогостояща, а потому по карману далеко не каждому.

Этот вид гепатита D возможен только при коинфекции с вирусом гепатита В (коинфекция — случай заражения одной клетки вирусами различных видов). Его сопровождает массовое поражение печени и острое течение болезни. Пути заражения — попадание вируса болезни в кровь здорового человека от вирусоносителя или заболевшего человека. Инкубационный период тянется 20 ÷ 50 дней. Внешне течение болезни напоминает гепатит В, но форма его более тяжелая. Может стать хроническим, перейдя потом в цирроз. Возможно проведение вакцинации, аналогичной применяемой при гепатите В.

Слегка напоминает гепатит А течением и механизмом передачи, так как точно также передается через кровь. Его особенностью является возникновение молниеносных форм, вызывающих смертельный исход за срок, не превышающий 10 дней. В остальных случаях его удается эффективно излечивать, да и прогноз на выздоровление чаще всего благоприятный. Исключением может быть беременность, так как риск потерять ребенка приближается к 100%.

Этот вид гепатита исследован пока недостаточно. Известно только, что болезнь вызывается двумя разными вирусами: один выделили из крови доноров, второй обнаружили в фекалиях больного, получившего гепатит после переливания крови. Признаки: появление желтухи, лихорадки, асцита (скопления жидкости в брюшной полости), увеличение размеров печени и селезенки, возрастание уровней билирубина и печеночных ферментов, возникновение изменений в моче и кале, а также общая интоксикация организма. Результативных методов терапии гепатита F пока не разработано.

Эта разновидность гепатита похожа на гепатит С, но не столь опасна, так как не способствует возникновению цирроза и рака печени. Цирроз может появиться только в случае коинфекции гепатитов G и С.

Вирусные гепатиты по своей симптоматике похожи один на другой, точно также как и на некоторые иные вирусные инфекции. По этой причине точно установить диагноз у заболевшего бывает затруднительно. Соответственно для уточнения вида гепатита и правильного назначения терапии требуются лабораторные анализы крови, позволяющие выявить маркеры — показатели, индивидуальные для каждого вида вируса. Выявив наличие таких маркеров и их соотношение, можно определить стадию заболевания, его активность и возможный исход. С целью отслеживания динамики процесса, спустя промежуток времени обследования повторяют.

Современные схемы лечения хронических форм ВГС сводятся к комбинированной противовирусной терапии, включающей антивирусники прямого действия типа софосбувира, велпатасвира, даклатасвира, ледипасвира в различных сочетаниях. Иногда для усиления эффективности к ним добавляются рибавирин и интерфероны. Такое сочетание действующих веществ останавливает репликацию вирусов, спасая печень от их разрушительного воздействия. Подобная терапия обладает рядом недостатков:

Стоимость лекарств для борьбы с вирусом гепатита высока, приобрести их сможет далеко не каждый.
Прием отдельных препаратов сопровождается неприятными побочными эффектами, в том числе повышением температуры, тошнотой, диареей.

Продолжительность лечения хронических форм гепатита занимает от нескольких месяцев до года в зависимости от генотипа вируса, степени поражения организма и используемых препаратов. Поскольку гепатит С в первую очередь поражает печень, пациентам требуется соблюдать строгую диету.

Гепатит С относится к числу наиболее опасных вирусных гепатитов. Заболевание вызывается РНК-содержащим вирусом, получившим название Flaviviridae. Вирус гепатита С называют еще «ласковый убийца». Столь нелестный эпитет он получил из-за того, что на начальном этапе болезнь не сопровождается вообще никакими симптомами. Отсутствуют признаки классической желтухи, нет и болезненности в районе правого подреберья. Выявить наличие вируса удается не ранее, чем через пару месяцев после инфицирования. А до этого полностью отсутствует реакция иммунной системы и в крови невозможно обнаружить маркеры, а потому и провести генотипирование нет возможности. К особенности ВГС относится также то, что после попадания в кровь в процессе размножения вирус начинает стремительно мутировать. Такие мутации мешают иммунной системе зараженного подстраиваться и бороться с болезнью. В результате болезнь может несколько лет протекать без всяких симптомов, вслед за чем почти срезу появляется цирроз или злокачественная опухоль. Причем в 85% случаев заболевание из острой формы переходит в хроническую. У вируса гепатита С есть важная особенность – разнообразие генетического строения. Фактически гепатит С является совокупностью вирусов, классифицируемых в зависимости от вариантов их строения и подразделяемых на генотипы и подтипы. Генотип — это сумма генов, кодирующих наследственные признаки. Пока медицине известны 11 генотипов вируса гепатита С, имеющих собственные подтипы. Генотип обозначают цифрами от 1 до 11 (хотя в клинических исследованиях используют в основном генотипы 1 ÷ 6), а подтипы, используя буквы латинского алфавита:

1a, 1b и 1с;
2a, 2b, 2с и 2d;
3a, 3b, 3с, 3d, 3e и 3f;
4a, 4b, 4с, 4d, 4e, 4f, 4h, 4i и 4j;
5a;
6a.

В разных странах генотипы ВГС распространены по-разному, например, в России наиболее часто можно встретить с первого по третий. От разновидности генотипа зависит тяжесть протекания болезни, они определяют схему терапии, ее продолжительность и результат лечения.

По территории земного шара генотипы гепатита С распространены разнородно, причем чаще всего можно встретить генотипы 1, 2, 3, а по отдельным территориям это выглядит так:

в Западной Европе и в ее восточных регионах наиболее часто встречаются генотипы 1 и 2;
в США — подтипы 1a и 1b;
в северной части Африки самым распространенным является генотип 4.

В зоне риска возможного заражения ВГС находятся люди с заболеваниями крови (опухоли кроветворной системы, гемофилия и др.), а также больные, лежащие на излечении в отделениях диализа. Наиболее распространенным по странам мира считается генотип 1 — на его долю приходится

50% от общего числа заболевших. На втором месте по распространенности — генотип 3 с показателем чуть больше 30%. Распространение ВГС по территории России имеет существенные отличия от мирового или европейского вариантов:

50% случаев;
на генотип 3a

20%,
гепатитом 1a заражены

10% больных;
гепатит с генотипом 2 обнаружен у

Но не только от генотипа зависят трудности терапии ВГС. На результативность лечения оказывают влияние еще и следующие факторы:

возраст пациентов. Шанс на излечение у молодых значительно выше;
женщинам вылечиться проще, чем мужчинам;
немаловажна степень повреждения печени — благоприятность исхода выше при меньшем ее повреждении;
величина вирусной нагрузки — чем меньше в организме вирусов на момент начала лечения, тем эффективнее терапия;
вес больного: чем он выше тем сильнее усложняется лечение.

Потому и схему терапии выбирает лечащий врач, основываясь на вышеперечисленных факторах, генотипировании и рекомендациях EASL (Европейской ассоциации, занимающейся болезнями печени). Свои рекомендации EASL постоянно поддерживает в актуальном состоянии и по мере появления новых эффективных препаратов для лечения гепатита С корректирует рекомендуемые схемы терапии.

Как известно вирус гепатита С передается через кровь, а потому с наибольшей вероятностью заразиться могут:

пациенты, которым делают переливание крови;
больные и клиенты в стоматологических кабинетах и медучреждених, где ненадлежащим образом стерилизуют мединструменты;
из-за нестерильных инструментов может оказаться опасным посещение маникюрного и косметического салонов;
от плохо обработанных инструментов могут пострадать также любители пирсинга и татуировок,
велик риск инфицирования у тех, кто употребляет наркотики из-за многократного употребления нестерильных игл;
плод может инфицироваться от матери, зараженной гепатитом С;
при половом акте инфекция также может попасть в организм здорового человека.

Вирус гепатита С не зря считали «ласковым» вирусом-убийцей. Он способен годами не проявлять себя, после чего внезапно обнаружиться в виде осложнений, сопровождаемых циррозом или раком печени. А ведь диагноз ВГС поставили более чем 177 млн. человек в мире. Лечение, которое применяли до 2013 г., сочетавшее инъекции инетрферона и рибавирин, давало больным шанс на исцеление, не превышавший 40-50%. Да к тому же сопровождалось оно серьезными и мучительными побочными эффектами. Ситуация изменилась летом 2013 г. после того, как фармгигантом из США Gilead Sciences было запатентовано вещество софосбувир, выпускавшееся в виде препарата под брендом Sovaldi, в состав которого входило 400 мг лекарственного средства. Он стал первым противовирусным препаратом прямого действия (ПППД), предназначенным для борьбы с ВГС. Итоги клинических испытаний sofosbuvir порадовали медиков результативностью, которая достигала в зависимости от генотипа величины 85 ÷ 95%, при этом продолжительность курса терапии по сравнению с лечением интерферонами и рибавирином сократилась более чем вдвое. И, хотя запатентовала софосбувир фармкомпания Gilead, синтезирован он был в 2007 г. Майклом София, работником компании Pharmasett, приобретенной впоследствии Gilead Sciences. От фамилии Майкла синтезированное им вещество получило название sofosbuvir. Сам же Майкл София вместе с группой ученых, сделавших ряд открытий, раскрывших природу ВГС, что позволило создать эффективный препарат для его лечения, получил премию Ласкера-Дебейки по клиническим медицинским исследованиям. Ну а прибыль от реализации нового эффективного средства почти вся в основном досталась Gilead, установившей на Совалди монопольно высокие цены. Тем более, что свою разработку компания защитила спецпатентом, согласно которому Gilead и некоторые ее партнерские компании стали обладателями исключительного права на изготовление оригинального ПППД. В результате прибыли Gilead только за первые два года реализации препарата многократно перекрыли все затраты, которые компания понесла на приобретение Pharmasett, получение патента и последующие клинические испытания.

Эффективность этого лекарственного средства в борьбе с ВГС оказалась столь высока, что сейчас практически ни одна схема терапии не обходится без его применения. Софосбувир не рекомендуют применять в качестве монотерапии, но при комплексном использовании он показывает исключительно высокие результаты. Первоначально препарат применяли в сочетании с рибавирином и интерфероном, что позволяло в неосложненных случаях добиваться излечения всего за 12 недель. И это при том, что терапия только интерфероном и рибавирином была в два раза менее результативна, да и продолжительность ее порой превышала 40 недель. После 2013 г. каждый последующий год приносил известия о появлении все новых и новых лекарственных средств, успешно сражающихся с вирусом гепатита С:

в 2014 появился даклатасвир;
2015 стал годом рождения ледипасвира;
2016 обрадовал созданием велпатасвира.

Даклатасвир выпустила компания Bristol-Myers Squibb в виде препарата Daklinza, содержащего 60 мг действующего вещества. Два следующих вещества созданы были силами ученых Gilead, а поскольку ни одно из них не годилось для монотерапии, применяли лекарственные средства только в сочетании с sofosbuvir. Для облегчения проведения терапии Gilead предусмотрительно вновь созданные лекарства выпустила сразу же в сочетании с софосбувиром. Так появились препараты:

Harvoni, сочетающий софосбувир 400 мг и ледипасвир 90 мг;
Epclusa, в которую входили sofosbuvir 400 мг и velpatasvir 100 мг.

При терапии с применением даклатасвира принимать приходилось два различных препарата Совалди и Даклинзу. Каждое из парных сочетаний действующих веществ применялось для лечения определенных генотипов ВГС согласно схемам терапии рекомендованным EASL. И только сочетание софосбувира с велпатасвиром оказалось пангенотипным (универсальным) средством. Эпклюса излечивала все генотипы гепатита С практически с одинаково высокой результативностью приблизительно 97 ÷ 100%.

Клинические испытания подтверждали результативность лечения, но у всех этих высокоэффективных лекарств был один существенный недостаток — слишком высокие цены, не позволяющие их приобрести основной массе заболевших. Монопольно высокие цены на продукцию, установленные Gilead, вызвали возмущения и скандалы, что заставило патентодержателей пойти на определенные уступки, предоставив некоторым компаниям из Индии, Египта и Пакистана лицензии на производство аналогов (дженериков) столь эффективных и востребованных препаратов. Причем борьбу с патентодержателями, предлагающими для лечения препараты по необъективно завышенным ценам, возглавила Индия, как страна, в которой проживают миллионы больных гепатитом С в хронической форме. В результате этой борьбы — Gilead выдала 11 индийским компаниям лицензии и патентные разработки для самостоятельного выпуска сначала софосбувира, а потом и других своих новых препаратов. Получив лицензии, индийские производители быстро наладили изготовление дженериков, присваивая выпускаемым препаратам собственные торговые наименования. Так появились сначала дженеркики Sovaldi, потом и Daklinza, Harvoni, Epclusa, а Индия стала мировым лидером по их производству. Индийские производители по лицензионному соглашению выплачивают 7% заработанных средств в пользу патентодержателей. Но даже с этими выплатами стоимость выпускаемых в Индии дженериков оказалась в десятки раз меньше, чем у оригиналов.

Как уже сообщалось выше, появившиеся новинки терапии ВГС относятся к ПППД и воздействуют непосредственно на вирус. Тогда как применяемые ранее для лечения интерферон с рибавирином усиливали иммунную систему человека, помогая организму противостоять заболеванию. Каждое из веществ действует на вирус по-своему:

Sofosbuvir блокирует РНК-полимеразу, тормозя тем самым репликацию вируса.

Даклатасвир, ледипасвир и велпатасвир являются ингибиторами NS5A, мешающими распространению вирусов и их проникновению в здоровые клетки.

Такое направленное воздействие позволяет успешно бороться с ВГС, применяя для терапии софосбувир в паре с daklatasvir, ledipasvir, velpatasvir. Иногда для усиления воздействия на вирус к паре добавляют третий компонент, в качестве которого чаще всего выступает рибавирин.

Фармкомпании страны воспользовались предоставленными им лицензиями, и теперь Индия выпускает следующие дженерики Sovaldi:

Hepcvir — изготовитель Cipla Ltd.;
Hepcinat — Natco Pharma Ltd.;
Cimivir — Biocon ltd. & Hetero Drugs Ltd.;
MyHep — производитель Mylan Pharmaceuticals Private Ltd.;
SoviHep — Zydus Heptiza Ltd.;
Sofovir — изготовитель Hetero Drugs Ltd.;
Resof — производит компания Dr Reddy’s Laboratories;
Virso — выпускает Strides Arcolab.

Изготавливают в Индии также и аналоги Даклинзы:

Natdac от Natco Pharma;
Dacihep от Zydus Heptiza;
Daclahep от Hetero Drugs;
Dactovin от Strides Arcolab;
Daclawin от Biocon ltd. & Hetero Drugs Ltd.;
Mydacla от Mylan Pharmaceuticals.

Вслед за Gilead индийские производители лекарств освоили также производство Harvoni, в результате чего появились такие дженерики:

Ledifos — выпускает Hetero;
Hepcinat LP — Natco;
Myhep LVIR — Mylan;
Hepcvir L — Cipla Ltd.;
Cimivir L — Biocon ltd. & Hetero Drugs Ltd.;
LediHep — Zydus.

И уже в 2017 году было освоено производство следующих индийских дженериков Эпклюсы:

Velpanat выпустила фармкомпания Natco Pharma;
выпуск Velasof освоила Hetero Drugs;
SoviHep V начала производить компания Zydus Heptiza.

Как видите, индийские фармкомпании не отстают от американских производителей, достаточно оперативно осваивая вновь разработанные ими препараты, соблюдая при этом все качественные, количественные и лечебные характеристики. Выдерживая в том числе и фармакокинетическую биоэквивалентность по отношению к оригиналам.

Дженериком называют препарат, способный по основным фармакологическим свойствам заменить лечение дорогими оригинальными лекарствами с патентом. Выпускать их могут как при наличии, так и при отсутствии лицензии, только ее наличие делает выпускаемый аналог лицензионным. В случае выдачи лицензии индийским фармкомпаниям, Gilead обеспечила для них также и технологию производства, предоставив владельцам лицензии права на самостоятельную ценовую политику. Чтобы аналог лекарственного средства считался дженериком, он должен соответствовать ряду параметров:

Необходимо соблюдать соотношение по важнейшим фармацевтическим компонентам в препарате по качественному, а также количественному нормативам.

Следует придерживаться выполнения соответствующих международных норм.

Требуется обязательное соблюдение надлежащих условий производства.

В препаратах следует выдержать соответствующий эквивалент параметров всасывания.

Стоит отметить, что на страже обеспечения доступности медикаментов стоит ВОЗ, стремящаяся с помощью бюджетных дженериков заместить ими дорогостоящие брендированные лекарственные средства.

В отличие от Индии, фармкомпании Египта не выбились в мировые лидеры по производству джененриков от гепатита С, хотя и они освоили производство аналогов sofosbuvir. Правда, в основной массе выпускаемые ими аналоги являются нелицензионными:

MPI Viropack, производит препарат Marcyrl Pharmaceutical Industries — один из самых первых египетских дженериков;

Heterosofir, выпускает компания Pharmed Healthcare. Является единственным лицензионным дженериком в Египте. На упаковке под голограммой запрятан код, позволяющий проконтролировать оригинальность препарата на сайте производителя, исключив тем самым его подделку;

Grateziano, изготавливаемый Pharco Pharmaceuticals;

Sofolanork, производимый Vimeo;

Sofocivir, выпускаемый ZetaPhar.

Еще одной страной, в больших объемах производящая дженерики против ВГС, является Бангладеш. Причем этой стране даже не требуются лицензии на производство аналогов брендированных лекарственных средств, так как до 2030 г. ее фармацевтическим компаниям разрешено выпускать такие медпрепараты без наличия соответствующих лицензионных документов. Наиболее известной и оборудованной по последнему слову техники является фармкомпания Beacon Pharmaceuticals Ltd. Проект производственных мощностей ее создавался европейскими специалистами и соответствует мировым стандартам. Beacon выпускает следующие дженерики для терапии вируса гепатита С:

Soforal — дженерик софосбувира, содержит активного вещества 400 мг. В отличие от традиционных упаковок во флаконы по 28 штук, Софорал выпускают в виде блистеров по 8 таблеток в одной пластине;
Daclavir — дженерик даклатасвира, одна таблетка препарата содержит 60 мг действующего вещества. Выпускают его также в виде блистеров, но в каждой пластинке содержится по 10таблеток;
Sofosvel — дженерик Epclusa, содержит sofosbuvir 400 мг и velpatasvir 100 мг. Пангенотипный (универсальный) препарат, эффективен при терапии ВГС генотипов 1 ÷ 6. И в этом случае нет привычной упаковки во флаконы, таблетки упакованы в блистеры по 6 штук в каждой пластине.
Darvoni — комплексный препарат, сочетающий в себе софосбувир 400 мг и даклатасвир 60 мг. При необходимости сочетать терапию sofosbuvir с daklatasvir, применяя препараты других производителей, необходимо принимать по таблетке каждого вида. А Beacon соединила их в одну пилюлю. Упаковывается Дарвони в блистеры по 6 таблеток в одной пластинке, отправляется только на экспорт.

При покупке препаратов от Beacon из расчета на курс терапии следует учесть оригинальность их упаковки, чтобы приобрести необходимое для лечения количество. Самые известные индийские фармкомпании Как было указано выше, после получения фармкомпаниями страны лицензий на выпуск дженериков для терапии ВГС, Индия превратилась в мирового лидера по их производству. Но среди множества всех компаний стоит отметить несколько, продукция которых в России пользуется наибольшей известностью.

Наиболее популярна фармкомпания Natco Pharma Ltd., препараты которой спасли жизни нескольким десяткам тысяч заболевших хронической формой гепатита С. Она освоила выпуск практически всей линейки антивирусных лекарственных средств прямого действия, включая софосбувир с даклатасвиром и ледипасвир с велпатасвиром. Появилась Natco Pharma в 1981 г. в городе Хайдарабаде с первоначальным капиталом 3,3 млн. рупий, тогда количество работающих составляло 20 человек. Сейчас в Индии на пяти предприятиях Натко работает 3,5 тыс. человек, а ведь есть еще филиалы в других странах. Кроме производственных подразделений в компании имеются хорошо оснащенные лаборатории, позволяющие заниматься разработкой современных медпрепаратов. Среди ее собственных разработок стоит отметить лекарства для борьбы с онкологическими заболеваниями. Одним из наиболее известных препаратов в этой сфере, считается Veenat, выпускаемый с 2003 г. и применяемый при лейкемии. Да и выпуск дженериков для лечения вируса гепатита С относится к приоритетному направлению деятельности Natco.

Эта компания своей целью поставила выпуск дженериков, подчинив этому стремлению собственную сеть производств, включающих в себя заводы с филилалами и офисы с лабораториями. Производственная сеть Hetero заточена на выпуск лекарственных средств по получаемым компанией лицензиям. Одним из направлений ее деятельности являются медпрепараты, позволяющие бороться с серьезными вирусными заболеваниями, лечение которых для многих больных стало невозможным из-за высокой стоимости оригинальных лекарств. Приобретаемая лицензия позволяет Гетеро оперативно приступить к выпуску дженериков, продаваемых потом по доступной для пациентов цене. Создание Hetero Drugs относится к 1993 году. За прошедшие 24 года на территории Индии появился десяток заводов и несколько десятков производственных подразделений. Наличие собственных лабораторий позволяет компании проводить опытные работы по синтезу веществ, что способствовало расширению производственной базы и активному экспорту лекарств в зарубежные государства.

Zydus — индийская компания, поставившая своей целью формирование здорового общества, за которым, по мнению ее владельцев, последует изменение в лучшую сторону качества жизни людей. Цель благородная, а потому для ее достижения компания ведет активную просветительскую деятельность, затрагивающую беднейшие слои населения страны. В том числе и путем бесплатной вакцинации населения от гепатита В. Зидус по объемам выпускаемой продукции на индийском фармацевтическом рынке находится на четвертом месте. К тому же 16 ее препаратов попали в перечень 300 важнейших лекарственных средств индийской фармотрасли. Продукция Zydus востребована не только на внутреннем рынке, ее можно найти в аптеках 43 государств нашей планеты. А производимый на 7 предприятиях ассортимент лекарств превышает 850 препаратов. Одно из самых мощных ее производств находится в штате Гуджарат и относится к крупнейшим не только в Индии, но также и в Азии.

Схемы лечения гепатита С для каждого пациента выбираются врачом индивидуально. Для правильного, эффективного и безопасного подбора схемы врачу необходимо знать:

генотип вируса;
продолжительность болезни;
степень поражения печени;
наличие /отсутствие цирроза, сопутствующей инфекции (например, ВИЧ или другого гепатита), негативного опыта предыдущего лечения.

Получив эти данные после проведения цикла анализов, врач на базе рекомендаций EASL выбирает оптимальный вариант терапии. Рекомендации EASL из года в год корректируются, в них добавляются вновь появившиеся лекарственные средства. Перед тем, как рекомендовать новые варианты терапии, их представляют на рассмотрение Конгресса или специального заседания. В 2017 г. спецзаседание EASL рассматривало в Париже обновления рекомендуемых схем. Было принято решение полностью прекратить использовать в Европе при лечении ВГС интерфероновую терапию. Кроме того не осталось ни одной рекомендованной схемы, использующей один единственный препарат прямого действия. Приводим несколько рекомендуемых вариантов схем лечения. Все они даны исключительно для ознакомления и не могут стать руководством к действию, так как назначение терапии может дать только врач, под наблюдением которого она и будет потом проходить.

Возможные схемы лечения, предложенные EASLв случае моноинфекции гепатита С или сопутствующей инфекции ВИЧ+ВГС у больных, не имеющих цирроза и не проходивших ранее лечения:

для лечения генотипов 1a и 1b можно использовать:

— sofosbuvir + ledipasvir, без рибавирина, продолжительность 12 недель; — софосбувир + даклатасвир, тоже без рибавирина, срок лечение 12 недель; — или же sofosbuvir + velpatasvir без рибавирина, длительность курса 12 недель.

при терапии генотипа 2 применяют без рибавирина в течение 12 недель:

— sofosbuvir + dklatasvir; — или же софосбувир + велпатасвир.

при лечении генотипа 3 без применения рибавирина при сроке терапии 12 недель используют:

— софосбувир + даклатасвир; — или же sofosbuvir + velpatasvir.

при терапии генотипа 4 можно без рибавирина в течение 12 недель применять:

— sofosbuvir + ledipasvir; — софосбувир + даклатасвир; — или же sofosbuvir + velpatasvir.

Рекомендованные EASL схемы терапии при моноинфекции гепатита С или сопутствующей инфекции ВИЧ/ВГС у больных, имеющих компенсированный цирроз, ранее не лечившихся:

для лечения генотипов 1a и 1b можно использовать:

— sofosbuvir + ledipasvir с рибавирином, продолжительность 12 недель; — или же 24 недели без рибавирина; — и еще один вариант — 24 недели с рибавирином при неблагоприятном прогнозе ответа; — софосбувир + даклатасвир, если без рибавирина, то 24 недели, а с рибавирином срок лечения 12 недель; — или же sofosbuvir + velpatasvir без рибавирина, 12 недель.

при терапии генотипа 2 применяют:

— sofosbuvir + dklatasvir без рибавирина продолжительность 12 недель, а с рибавирином при неблагоприятном прогнозе — 24 недели; — или же софосбувир + велпатасвир без сочетания с рибавирином в течение 12 недель.

при лечении генотипа 3 используют:

— софосбувир + даклатасвир в течение 24 недель с рибавирином; — или же sofosbuvir + velpatasvir опять же с рибавирином, срок лечения 12 недель; — как вариант возможен софосбувир + велпатасвир 24 недели, но уже без рибавирина.

при терапии генотипа 4 применяют те же схемы, что и при генотипах 1a и 1b.

Как видите, на результат терапии оказывают влияние кроме состояния больного и особенностей его организма также еще и выбранная врачом комбинация назначенных лекарств. Кроме того, от выбранной медиком комбинации зависит и продолжительность лечения.

Принимают таблетки препаратов прямого антивирусного действия по назначению врача перорально раз в сутки. Их не делят на части, не жуют, а , запивают простой водой. Лучше всего делать это в одно и то же время, так поддерживается постоянная концентрация в организме активных веществ. Привязываться к срокам приема пищи не требуется, главное — не делать это на голодный желудок. Начав принимать препараты, обращайте внимание на самочувствие, так как в этот период проще всего заметить возможные побочные явления. У самих ПППД их не очень много, а вот у назначаемых в комплексе лекарств значительно меньше. Чаще всего побочные эффекты проявляются в виде:

головных болей;
рвоты и головокружения;
общей слабости;
ухудшения аппетита;
боли в суставах;
изменении био-химических показателей крови, выраженном в низком уровне гемоглобина, уменьшения тромбоцитов и лимфоцитов.

Побочные проявление возможны у небольшого числа пациентов. Но все равно обо всех замеченных недомоганиях следует ставить в известность лечащего врача для принятия им необходимых мер. Чтобы не возникло усиление побочных эффектов, следует исключить из употребления алкоголь и никотин, так как они вредно воздействуют на печень.

В некоторых случаях прием ПППД исключен, касается это:

индивидуальной сверхчувствительности больных к некоторым ингредиентам лекарственных средств;

пациентов, не достигших 18 лет, так как нет точных данных об их воздействии на организм;

женщин, вынашивающих плод и кормящих младенцев грудью;

женщины должны применять надежные способы контрацепции во избежание зачатия в период проведения терапии. Причем распространяется это требование и на женщин, партнеры которых также проходят терапию ПППД.

Хранят антивирусные препараты прямого действия в местах недоступных для детей и действия прямых солнечных лучей. Температура хранения должна находиться в интервале 15 ÷ 30ºС. Начиная прием препаратов, проверяйте их сроки изготовления и хранения, указываемые на упаковке. Просроченные препараты принимать запрещается. Как приобрести ПППД жителям России К сожалению, найти в российских аптеках индийские дженерики не удастся. Фармкомпания Gilead, предоставив лицензии на выпуск препаратов, предусмотрительно запретила их экспорт во многие страны. В том числе и во все европейские государства. Желающие приобрести бюджетные индийские дженерики для борьбы с гепатитом С могут воспользоваться несколькими путями:

заказать их через российские интернет-аптеки и получить товар через несколько часов (или дней) в зависимости от места доставки. Причем в большинстве случаев даже предоплата не потребуется;
заказать их через индийские интернет-магазины с доставкой на дом. Здесь понадобится предоплата в валюте, и время ожидания продлится от трех недель до месяца. Плюс добавится еще необходимость общения с продавцом на английском языке;
отправиться в Индию и привезти препарат самостоятельно. На это тоже потребуется время, плюс языковый барьер, плюс сложности проверки оригинальности купленного в аптеке товара. Ко всему еще добавится проблема самостоятельного вывоза, требующая термоконтейнера, наличия заключения врача и рецепта на английском языке, а также копии чека.

Заинтересованные в приобретении лекарств люди решают сами, какой из возможных вариантов доставки выбрать. Только не забывайте, что в случае с ВГС благоприятный исход терапии зависит от быстроты ее начала. Здесь в прямом смысле промедление смерти подобно, а потому не стоит затягивать начало процедуры.

источник

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему: Идентификация и метаболическая верификация вирусных гепатитов А, В, С

Автореферат диссертации по медицине на тему Идентификация и метаболическая верификация вирусных гепатитов А, В, С

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ ВЕРИФИКАЦИЯ ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТОВ А, В, С

14.00.46 — клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Работа выполнена на кафедре фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет МЗ РФ»

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук

Радомская Виктория Марковна Баишева Гульнара Максимовна

доктор медицинских наук, профессор Рубин Владимир Иванович

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник лабораторного отдела

Саратовского НИИТО Коршунов Геннадий Васильевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Ижевская государственная медицинская академия МЗ РФ»

Защита диссертации состоится «_»_2005 года в_час.

на заседании диссертационного совета К208.094.01 при Саратовском государственном медицинском университете

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Саратовского государственного медицинского университета

Автореферат разослан «_»_2005 г.

доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

За последние годы заболеваемость вирусными гепатитами возросла, преобладают среди заболевших пациенты молодого репродуктивного возраста (Суздальцев А.А. с соавт., 2003). Из гепатитов, вызываемых вирусами гепатита А,В,СДЕ,С,ТТ наиболее высока частота встречаемости гепатитов А,В,С (Жи-буртЕ.Б., 1998)

В мире проживает около 500 млн человек, инфицированных вирусом гепатита С (Балаян М.С., Михайлов М.И., 1999). Особенностью HCV-инфекции является ее преимущественно бессимптомное течение. Персистенция вируса гепатита С может длится многие годы, приводя к развитию хронического гепатита С (более 85%), цирроза печени (20-30%) и гепатокарциномы (4-8%) (Miaihes Р., Тгеро С, 2000). Частота формирования хронической патологии печени, вызванной HCV, по крайней мере, в 10 раз выше, чем при вирусном гепатите В. Изучение течения HBV-инфекции выявило, что у 5-15% заболевших заболевание рецидивирует, а у 2-6% пациентов прогрессирует в цирроз печени (Chu CM. et all., 2004).

Проблема вирусных гепатитов создает впечатление неисчерпаемости в силу высокой мутируемости возбудителя и относительной изменчивости организма человека, проживающего в экологически трансформируемой окружающей среде. Актуальным является поиск аргументированных диагностических критериев вирусоносительства, диагностика безжелтушных, стертых форм.

В настоящее время с учетом множества известных и появления мутант-ных штаммов вирусов, возбудителей заболевания, проводится углубленное изучение иммунологических, гистопатологических, клинических особенностей HBV, HCV- инфекции, переосмысление методических подходов к осуществле-

нию эпидемиологической диагностики, выявлению и обоснованию причин хро-низации заболевания.

Использование методов генодиагностики, в частности, полимеразной цепной реакции, позволяет провести количественную оценку возбудителей HBV, HCV в исследуемом биологическом материале. Наряду с общим цитопа-тическим эффектом всех возбудителей гепатита, проявляющимся поражением печени, показано, что HCV является также и лимфотропным вирусом (Игнатова Т.М. с соавт., 1998; Лесняк О.М., 1999). Очевидно, это не исключает и другой локализации вируса, более широкого спектра его повреждающего действия.

Как известно, различия в клинической картине вирусных гепатитов достаточно неспецифичны, а эпидемиология, патогенез, отдаленные последствия вызываемых ими заболеваний не одинаковы. Это обуславливает исключительную ценность результатов лабораторных исследований, поскольку они позволяют дифференцировать этиологический фактор, фазу заболевания, анамнестические и активные формы (Рахманова А.Г. с соавт., 2001). Представляет интерес вопрос о взаимосвязи выраженности виремии с характером сдвигов в показателях обмена, выявление специфики метаболического статуса при вирусных гепатитах с различным этиологическим фактором. Совершенствование диагностического процесса включает в качестве обязательного условия проведение внешней оценки качества и внутрилабораторного контроля качества. Актуальным является разработка новых чувствительных тест-систем и контрольных материалов для определения спектра маркеров вирусных гепатитов методом ПЦР, ИФА, иммуноэлектрохемилюминесцентного анализа.

Цель настоящего исследования заключается в выяснении характера метаболического ответа на различные молекулярно-биологические свойства вирусов гепатитов А,В>С в повышении эффективности и качества диагностики.

1. Идентифицировать вирусы гепатитов А,В,С с помощью различных диагностических методов, оценить информативность и выявляемость патогенов с

использованием полимеразной цепной реакции, иммуноферментного, им-муноэлектрохемилюминесцентного методов.

2. Изучить характер метаболического ответа в различные фазы заболевания гепатитом А,В,С в период репликации при отсутствии РНК и ДНК вирусов.

3. Оценить взаимосвязь между выраженностью виремии и особенностями метаболического статуса у больных с гепатитами А,В,С по показателям угле-водно-липидного, белкового обменов,

4. Сопоставить функциональное состояние печени при гепатитах АД С, оценив белоксинтезирующую, детоксикационную способность, глубину гисто-патологических нарушений.

5. Исследовать тип структурообразования сыворотки крови в зависимости от молекулярно-биологических свойств вирусов гепатитов АД С и характера метаболического ответа на них.

6. Апробировать систему контроля качества диагностики гепатитов В и С с использованием новых тест-систем и контрольных материалов в различных лабораториях региона, проанализировать результаты и выявить наиболее типичные ошибки на преаналитическом и аналитическом этапах.

Научная новизна. Впервые получены данные, характеризующие диапазон метаболических нарушений при гепатитах А, В, С в различные фазы патологического процесса в случаях репликации и при отсутствии РНК и ДНК вирусов. Получены новые сведения, раскрывающие этиопатогенетическую роль степени выраженности виремии в индукции метаболических нарушений в организме больных. Раскрыта взаимосвязь между молекулярно-биологическими свойствами возбудителей гепатитов, выраженностью виремии и характером метаболических расстройств при гепатитах В и С. При низкой концентрации ДНК-вируса HBV наблюдается слабовыраженная гиперферментемия аспарта-таминотрансферазы. При высокой виремии отмечается диспротеинемия за счет снижения содержания альбумина и увеличения высокая ти-

моловая проба, резкая активация ферментов, гипербилирубинемия за счет фракции прямого билирубина.

При гепатите С даже при минимальной виремии проявляются более глубокие структурные и функциональные нарушения гепатоцитов, чем при гепатите В, о чем свидетельствует высокий уровень активности аланин-аспартатаминотрансфераз, у- глутамилтрансферазы даже при нормальных величинах общего билирубина. По данным количественной оценки ПЦР при виремии свыше 6,03 Е5, соответствующей титру 1:10000, выраженная диспротеи-немия отсутствует, тимоловая проба в границах референтных величин, что прогностически неблагоприятно. Выявленные особенности течения гепатитов, вызванных различными патогенами, могут служить для метаболической верификации гепатитов, прогнозирования течения и исхода заболевания.

Впервые получена морфологическая картина сыворотки крови больных гепатитом А,В,С. Показано, что изменение физико-химических параметров, соотношения липофильных и гидрофильных метаболитов, нарушение баланса ионизированных интермедиатов при различных видах гепатитов проявляется в изменении белковой и солевой зоны, появлении характерных для каждого гепатита вариантов структурирования фаций.

Установленное нарушение белоксинтезирующей способности, диспро-теинемия, снижение содержания альбумина, детоксикациошюй функции печени, целостности гепатоцитов, о чем свидетельствует гиперферментемия, повышение фракции прямого билирубина даже при безжелтушных формах в целом служит подтверждением того, что вирусные гепатиты являются системным, заболеванием организма с преимущественным поражением печени.

Новым является аргументирование эффективности применения высокочувствительных тест-систем и контрольных материалов для проведения качества диагностики вирусных гепатитов с использованием методики ИФА.

сию белоксинтезирующей способности, иммуносупрессию при высокой вире-мии, что косвенно диагностируется с помощью тимоловой пробы, свидетельствующей о слабо выраженном антительном ответе, отсутствии прироста у-глобулинов.

Возможность метаболической верификации различных форм гепатита обеспечивает базу данных для повышения точности диагностики вирусных гепатитов, улучшения эффективности работы клинико-диагностической лабораторий, не располагающих высокими научно-диагностическими технологиями. Проведенная нами лабораторная диагностика вирусных гепатитов с использованием ПЦР, ИФА, иммуноэлектрохемилюминесцентного анализа на одних и тех же образцах крови больных и сравнительный анализ выявляемости вирусов гепатитов, базирующийся на определении РНК и ДНК-вируса, а также на изучении антительного ответа позволили прийти к заключению о том, что максимальная выявляемость установлена для ПЦР и иммуноэлектрохемилюминес-центного анализа, при этом ИФА является более экономичным способом

Чтобы избежать, ложноположительных. и ложноотрицательных результатов и выяснить причины ошибок при выполнении исследований, целесообразно организовать проведение внутрилабораторного контроля качества определения HBsAg и анти-НСУ-антител методом ИФА с помощью контрольных карт, построенных по расчетному коэффициенту позитивности для данного метода, применяя тест-системы и контрольные материалы отечественных производителей, что важно для диагностики и мониторинга течения заболевания, оценки эффективности терапии.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ 1. Аргументирование диагностической информативности в идентификации вирусов гепатитов А, В, С методом полимеразной цепной реакции, иммуноэлек-трохемилюминисцентного и иммуноферментного анализа в различные фазы заболевания; взаимосвязь характера метаболического ответа с молекулярно-биологическими свойствами патогенов.

2. Степень нарушения белоксинтезирующей, обезвреживающей функции печени, глубины цитопатологического процесса в зависимости от выраженности виремии.

3. Специфика структурообразования — интегральный тест, отражающий особенности физико-химических характеристик, соотношение высоко- и низкомолекулярных соединений в ионизированной и молекулярной форме в сыворотке крови больных вирусными гепатитами А,В,С.

4. Информативность использования новых тест систем, материалов для проведения контроля качества диагностики вирусного гепатита С по оценке антительного ответа методом ИФА, гепатита В — по изучению уровня антигенов и антител. Преимущественное распределение отдельных штаммов возбудителя гепатитов по региону, типичные диагностические ошибки в лабораторной практике.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ В ПРАКТИКУ. Результаты диссертационного исследования внедрены в лекционный материал на кафедре фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой Самарского государственного медицинского университета, в работу клинико-диагностической лаборатории клиник Самарского государственного медицинского университета, клинико-диагностической лаборатории, инфекционного и терапевтического отделений городской клинической больницы №2 им. Н.А. Семашко г.Самары.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты диссертационной работы представлены в материалах Пятой международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2004), Международного семинара по проблемам пожилых «Самарские лекции» (Самара, 2004), IX Международной научной конференции «Здоровье семьи XXI век» (Далянь,2005), совместном заседании Самарского отделения Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, кафедр общей бионеорганической и биоорганической химии и фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой Самарского государственного медицинского университета и Са-

марского отделения научного общества специалистов клинической лабораторной диагностики (Самара, 2005).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной характеристике объекта и методов исследования, 3-х глав собственных данных, заключения, выводов, практически рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 172 страницах, иллюстрирована 14 рисунками, содержит 36 таблиц. В работе использовано 216 литературных источников, из них 116 отечественных и 100 зарубежных авторов.

Материал и Методы исследования

Работа включала два этапа:

— Исследование маркеров вирусных гепатитов и метаболического статуса у больных вирусными гепатитами А,В,С.

— Анализ работы 63 лабораторий Приволжского Федерального округа по определению HBsAg, включая внешнюю оценку качества и внутрилабораторный контроль качества.

Общаяхарактеристика больныхвирусными гепатитами

Проведено клинико-лабораторное обследование 215 больных с диагнозом вирусный гепатит. Работа выполнена в Центральной клинико-диагностической лаборатории клиник Самарского государственного медицинского университета, которая является базой кафедры фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой.

По диагнозу больные распределялись следующим образом: острый вирусный гепатит А — 5,5 %; острый вирусный гепатит В — 1,8 %; хронический вирусный гепатит В -16,5 %; носитель HBs А — 6,4 %, острый вирусный гепатит С — 12,7 %; хронический вирусный гепатит С — 33,6 %; хронический гепатит неясной этиологии -10,9 %.

В качестве объекта исследования использовалась сыворотка крови.

Определение маркеров вирусных гепатитов проводилось методами им-муноферментного анализа на иммуноферментном анализаторе «Униплан» (Россия) с применением термостатируемого шейкера Elmi и автоматического промывающего устройства «Проплан» (Россия). Для иммуноферментного анализа использованы реагенты фирмы «Вектор-Бест» (Россия). Принцип метода заключается в специфическом взаимодействии антитела и антигена с последующим присоединением к полученному комплексу конъюгата (антивидового иммуноглобулина, меченого ферментом). Фермент вызывает разложение хро-могенного субстрата с образованием окрашенного продукта, который выявляется фотометрически. Использован гетерогенный твердофазный иммунофер-ментный анализ, что позволяет упростить процесс разделения компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов на твердой фазе и удаления субстанций, не участвующих в реакции. В качестве твердой фазы использованы полистироловые планшеты. Для ферментативной метки конъюгата применена пероксидаза хрена. Специфические антигены пришиты к пластику лунок планшета. В лунку добавляется исследуемая сыворотка, если в ней есть антитела (эти антитела называются первыми) к данным антигенам, во время инкубации происходит взаимоузнавание, в результате которого образуется принципиально значимая связь антиген/антитело. После отмывки лунок от не-связавшихся (а значит неспецифичных) субстанций в каждую лунку добавляются так называемые вторые антитела. Они узнают человеческие антитела определенного типа (IqA, IqG, IqM). К этим вторым антителам химически пришит активный фермент (Е). Такое комплексное соединение называется конъю-гат. Во время инкубации происходит взаимоузнавание первых и вторых антител, в результате чего в лунке образуется структура типа «сэндвич» (2/3/4). После отмывки несвязавшегося конъюгата в лунку добавляется бесцветный субстрат, на который действует фермент, в результате субстрат превращается в окрашенный продукт, измеряемый на фотометре.

Проводилось определение следующих тестов:

• Anti-HAV Ig M — твердофазным двухступенчатым «sandwich» — вариантом иммуноферментного анализа с тетраметилбензидином в качестве хромогена.

• Anti-HAV Ig G — методом твердофазного непрямого иммуноферментного анализа с тетраметилбензидином в качестве хромогена.

• HBs-Ag — методом твердофазного одноступенчатого прямого иммуноферментного анализа на планшетах, с подтверждающим тестом методом конкурентного анализа с использованием в качестве хромогена тетраметил-бензидина.

• Anti-HBs-Ag — твердофазным двухступенчатым «sandwich» — вариантом им-муноферментного анализа с тетраметилбензидином в качестве хромогена.

• Anti-HBc-Ag (суммарные антитела) — методом одноступенчатого конкурентного ИФА на планшетах с использованием ТМБ в качестве хромогена.

• Anti-HBc-Ag Ig M — методом двухступенчатого «capture» ИФА с использованием ТМБ в качестве хромогена.

• HBe-Ag — с использованием «sandwich» — варианта одноступенчатого твердофазного ИФА на планшетах с хромогеном ТМБ.

• Anti-HBe Ig G — методом двухступенчатого непрямого иммуноферментного анализа на планшетах с использованием в качестве хромогена тетраметил-бензидина.

• Anti-HCV Ig M — методом твердофазного двухступенчатого непрямого ИФА на планшетах с хромогеном ТМБ.

• Anti-HCV Ig G — методом твердофазного двухступенчатого ИФА на планшетах с использованием в качестве хромогена ТМБ.

Аналогичный перечень маркеров гепатита определяли твердофазным пробирочным методом в электрохемилюминесцентной реакции (магнитные микрочастицы) на основе стрептовидин-биотиновой технологии с рутениевой меткой на электрохемилюминесцентном иммуноанализаторе Elecsys 2010 фирмы «Roche»c реагентами фирмы «Ф.Хоффман — Ла Рош Лтд.» (Швейцария).

Определение ДНК вируса гепатита В и РНК вируса гепатита С выполнено

количественным методом полимеразной цепной реакции с расчетом числа ко-

пий и определением титра (1:1, 1:100, 1:1000, 1:100000) на анализаторе Ampli-сог. .

Биохимические методы исследования показателей сыворотки крови проводили на автоматическом биохимическом анализаторе «Hitachi-902″ фирмы «Roch-Diagnostics», производства Японии с помощью коммерческого набора реактивов фирмы «Roch-Diagnostics» (Швейцария). Оценивали концентрацию общего белка, альбумина, глюкозы, холестерина, р-липопротеинов, билирубина, активность аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, гамма-глютамилтрансферазы, лактатдегидрогеназы. Тимоловую пробу проводили фотометрическим методом с реактивами фирмы «Lachema». Элетрофорез белков сыворотки крови — на приборе «Астра» (Россия)

Исследование морфологии сыворотки крови проводили методом клиновидной дегидратации (Шабалин В.Н., Шатохина С.Н.,2001) при естественном высыхании биологических жидкостей, комнатной температуре в течение одних суток. Результаты оценивали с помощью компьютерного микроскопа Intel (США). Анализировали рисунок солевой и белковой зон при увеличении 60.

Статистическая обработка результатов исследований проведена с помощью специализированной статистической программы Statistica 5.0 и MS Exel 7.0, использовали критерии согласия Колмогорова-Смирнова, хи-квадрат и коэффициенты асимметрии и эксцесса. Для обработки полученных результатов были использованы непараметрические статистические методы (Гленц С, 1999; 2002). Для сравнения двух выборок применяли U-критерий Манна-Уитни (непараметрическая альтернатива t-критерию Стьюдента). Выявление взаимосвязей между показателями проводили с помощью корреляционного анализа R Спирмена и х Кендалла (Боровиков В.П., 2001).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительный анализ результатов определения различных маркеров вируса гепатита В показал, что процент выявляемости HBs Ag и НВе Ag зависит от фазы инфекционного процесса (табл.1). В активную фазу репликации вируса гепатита В (ДНК +) процент выявления HBs Ag составляет 68,9 % от общего числа обследованных больных гепатитом В. В Эту фазу в 3 % случаев отмечены отрицательные результаты определения данного антигена, что, возможно, связано с мутациями генов, определяющих его синтез. В фазу ремиссии (ДНК -) HBsAg выявлен у каждого пятого больного (21%), что позволяет использовать его определения для выявления больных, перенесших вирусный гепатит.В.

Выявляемость НВе Ag меньше, в фазу репликации вируса он определялся в 13 % случаев, чаще наблюдались отрицательные результаты его определения — у 58 % больных гепатитом. Известно, что в результате мутаций в ргеС регионе синтез HBeAg прекращается, тогда как способность вируса к репликации сохраняется (KremsdorfD.etaL, 1991; Hadziyannis S.I., 1995).

Соотношение выявляемости ДНК вируса гепатита В, HBs Ag и НВе Ag

HBsAg-(% от общего числа) HBs Ag + (% от общего числа) HBeAg-(% от общего числа) НВе Ag + (% от общего числа)

Связь между наличием HBs Ag и выявляемостью ДЕЖ вируса гепатита В у больных вирусным гепатитом В подтверждена статистически (х 22,10, р=0,001). Связь между наличием НВе Ag и ДНК вируса гепатита В у больных вирусным гепатитом В отсутствовала (х2=1»88,р=0,17).

Характер метаболического ответа организма при вирусных гепатитах определялся видом возбудителя и фазой инфекционного процесса.

При вирусном гепатите В в фазе активной репликации вируса по сравнению с показателями контрольной группы отмечена более высокая концентрация общего билирубина (+58%; р 7/—

1.1. Медико-биологическая характеристика возбудителей вирусных гепатитов.

1.2. Лабораторная диагностика вирусных гепатитов.

1.2.1. Обнаружение ДНК вируса гепатита В и РНК вируса гепатита С методом полимеразной цепной реакции.

1.2.2. Определение маркёров вирусных гепатитов методом иммуноферментного анализа.

1.2.3. Оценка функционального состояния печени при вирусных гепатитах.

1.3 Контроль качества лабораторных исследований.

1.3.1. Этапы развития системы контроля качества лабораторных исследований.

1.3.2. Система контроля качества лабораторных исследований в России.

1.3.3. Контроль качества лабораторной диагностики вирусных гепатитов.

ГЛАВА П. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Общая характеристика больных вирусными гепатитами.

2.2. Определение маркёров вирусных гепатитов методами иммуноферментного и иммуноэлектрохемилюминесцентного анализа.

2.3. Определение ДНК вируса гепатита В и РНК вируса гепатита С методом полимеразной цепной реакции.

2.4. Биохимические методы исследования показателей сыворотки крови.

2.5. Исследование морфологии сыворотки крови методом клиновидной дегидратации.

2.6. Статистическая обработка результатов исследований.

ГЛАВА III. ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ ПРИ ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТАХ А,В,С

3.1. Метаболический статус больных вирусным гепатитом В.

3.2. Метаболический статус больных вирусным гепатитом С.

3.3. Сравнительная оценка метаболических процессов при вирусных 88 гепатитах ВиС.

3.4. Метаболический статус больных острым вирусным гепатитом А.

ГЛАВА IV. ОСОБЕНОСТИ МЕТАБОЛИЗМА У БОЛЬНЫХ ВИРУСНЫМИ ГЕПАТИТАМИ В И С В ЗАВИСИМОСТИ

4.1. Сравнительная оценка выявляемое™ маркёров гепатита В методами полимеразной цепной реакции, иммуноэлектрохемилюминесцентного и иммуноферментного анализа.

4.2. Метаболический ответ организма при вирусных гепатитах ВиС при разной степени* виремии.

ГЛАВА V. ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТОВ НА ПРЕАНАЛИТИЧЕСКОМ И

5.1. Результаты внешней оценки качества работы лабораторий ИФА по исследованию HBsAg.

5.2. Использование результатов анкетирования лабораторий для выявлений источников ошибок при определении HBsAg.

5.3. Внутрилабораторный контроль качества в диагностике HBsAg и анти-НВС методом ИФА.

Введение диссертации по теме «Клиническая лабораторная диагностика», Сидорова, Ирина Флуровна, автореферат

Актуальность. Вирусные гепатиты, занимая одно из первых мест в инфекционной патологии человека, являются актуальной проблемой здравоохранения, имеют высокую социальную, экономическую, эпидемиологическую значимость. За последние годы заболеваемость вирусными гепатитами возросла, преобладают среди заболевших пациенты молодого репродуктивного возраста. Из гепатитов, вызываемых вирусами гепатита А,В,С,Д,Е,0,ТТ наиболее высока частота встречаемости гепатитов А,В,С (Суздальцев A.A. с соавт., 2003).

В мире проживает около 500 млн человек, инфицированных вирусом гепатита С (HCV). Особенностью HCV-инфекции является ее преимущественно бессимптомное течение. Персистенция вируса гепатита С может длится многие годы, приводя к развитию хронического гепатита С (более 85%), цирроза печени (20-30%) и гепатокарциномы (4-8%). Частота формирования хронической патологии печени, вызванной HCV, по крайней мере, в 10 раз выше, чем при вирусном гепатите В. Изучение течения HBV-инфекции выявило, что у 5-15% заболевших заболевание рецидивирует, а у 2-6% пациентов прогрессирует в цирроз печени (Балаян М.С., Михайлов М.И., 1999; Chu С.М. et all., 2004).

Использование методов генодиагностики, в частности, полимеразной цепной реакции, позволяет провести количественную оценку HBV, HCV в исследуемом биологическом материале. Наряду с общим цитопатическим эффектом всех возбудителей гепатита, проявляющимся поражением печени, показано, что HCV является также и лимфотропным вирусом. Очевидно, это не исключает и другой локализации вируса, более широкого спектра его повреждающего действия (Koenig A.S. et al., 1989; McGowan J.E. 1995; Kenny-Walsh

E., 1999; Kronenberg В. et al, 2000; Tseliou P. et al., 2000; Laperehe S. et al.,2001; Valentine-Thon E. et al., 2001).

F.L.1998; Bartenschlanger R., Lohmann V., 2004; Hwang S.J. et al., 2000). Представляет интерес вопрос о взаимосвязи выраженности виремии с характером сдвигов в показателях обмена, выявление специфики метаболического статуса при вирусных гепатитах с различным этиологическим фактором. Совершенствование диагностического процесса включает в качестве обязательного условия проведение внешней оценки качества и внутрилабораторного контроля качества (Гаранина E.H.,1997; Назареенко Г.И., Кишкун A.A.,2001; Меньшиков В.В., 1998; 2002; Мошкин A.B., Долгов В.В., 2004; Bull M.J., 1992). Актуальным является разработка новых чувствительных тест-систем и контрольных материалов для определения спектра маркеров вирусных гепатитов методом ПЦР, ИФА, иммуноэлектрохемшпоминесцентного анализа (Кудрявцева E.H. с соавт.,2002; Исаева О.В. с соавт.,2004; Нетесова И.Г. с соавт.,2004; Садикова Н.В. с соавт., 2004).

Цель настоящего исследования заключается в выяснении характера метаболического ответа на различные молекулярно-биологические свойства вирусов гепатитов А,В,С в повышении эффективности и качества диагностики.

1. Идентифицировать вирусы гепатитов А,В,С с помощью различных диагностических методов, оценить информативность и выявляемость патогенов с использованием полимеразной цепной реакции, иммуноферментного, им-муноэлектрохемилюминесцентного методов.

2. Изучить характер метаболического ответа в различные фазы заболевания гепатитом А,В,С в период репликации и отсутствии РНК и ДНК вирусов.

4. Сопоставить функциональное состояние печени при гепатитах А,В,С, оценив белоксинтезирующую, детоксикационную способность, глубину гисто-патологических нарушений.

5. Исследовать тип структурообразования сыворотки крови в зависимости от молекулярно-биологических свойств вирусов гепатитов А,В,С и характера метаболического ответа на них.

Научная новизна. Впервые получены данные, характеризующие диапазон метаболических нарушений при гепатитах А, В, С в различные фазы патологического процесса в случаях репликации и при отсутствии РНК и ДНК вирусов. Получены новые сведения, раскрывающие этиопатогенетическую роль степени выраженности виремии в индукции метаболических нарушений в организме больных. Раскрыта взаимосвязь между молекулярно-биологическими свойствами возбудителей гепатитов, выраженностью виремии и характером дисметаболических расстройств при гепатитах В и С. При низкой концентрации ДНК-вируса В наблюдается слабовыраженная гиперферментемия аспарта-таминотрансферазы. При высокой виремии отмечается диспротеинемия за счет снижения содержания альбумина и увеличения р и у-глобулинов, высокая тимоловая проба, резкая активация ферментов, гипербилирубинемия за счет фракции прямого билирубина.

При гепатите С даже при минимальной виремии проявляются более глубокие структурные и функциональные нарушения гепатоцитов, чем при гепатите В, о чем свидетельствует высокий уровень активности аланин-аспартатаминотрансфераз, у- глутамилтрансферазы даже при нормальных величинах общего билирубина. По данным количественной оценки ПЦР при виремии свыше 6,03 Е5, соответствующей титру 1:10000, выраженная диспротеинемия отсутствует, тимоловая проба в границах референтных величин, что прогностически неблагоприятно. Выявленные особенности течения гепатитов, вызванных различными патогенами, могут служить для метаболической верификации гепатитов, прогнозирования течения и исхода заболевания.

Установленное нарушение белоксинтезирующей способности, диспротеинемия, снижение содержания альбумина, детоксикационной функции печени, целостности гепатоцитов, о чем свидетельствует гиперферментемия, повышение фракции прямого билирубина даже при безжелтушных формах в целом служит подтверждением того, что вирусные гепатиты являются системным заболеванием организма с преимущественным поражением печени.

Научно-практическая значимость. Получен новый блок сведений, раскрывающих взаимосвязь характера и глубины метаболических нарушений при гепатитах А, В, С с молекулярно-биологическими свойствами патогенов, количеством антигенов в крови. Сравнительное изучение метаболического статуса больных с гепатитом В и С с титром антигена 1:1 и 1: 10000 показало депрессию белоксинтезирующей способности, иммуносупрессию при высокой вире-мии, что косвенно диагностируется с помощью тимоловой пробы, свидетельствующей о слабо выраженном антительном ответе, отсутствии прироста у-глобулинов.

Возможность метаболической верификации различных форм гепатита обеспечивает базу данных для повышения точности диагностики вирусных гепатитов, улучшения эффективности работы клинико-диагностических лабораторий, не располагающих высокими научно-диагностическими технологиями. Проведенная нами лабораторная диагностика вирусных гепатитов с использованием ПЦР, ИФА, иммуноэлектрохемилюминесцентного анализа на одних и тех же образцах крови больных и сравнительный анализ выявляемости вирусов гепатитов, базирующийся на определении РНК и ДНК-вируса, а также на изучении антительного ответа позволили прийти к заключению о том, что максимальная выявляемость установлена для ПЦР и иммуноэлектрохемилюминес-центного анализа, хотя ИФА является более экономичным способом.

Чтобы избежать ложноположительных и ложноотрицательных результатов и выяснить причины ошибок при выполнении исследований, целесообразно организовать проведение внутрилабораторного контроля качества определения HBsAg и анти-НСУ-антител методом ИФА с помощью контрольных карт, построенных по расчетному коэффициенту позитивности для данного метода, применяя тест-системы и контрольные материалы отечественных производителей, что важно для диагностики и мониторинга течения заболевания, оценки эффективности терапии.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Аргументирование диагностической информативности в идентификации вирусов гепатитов А, В, С методов полимеразной цепной реакции, иммуноэлек-трохемилюминисцентного и иммуноферментного анализа в различные фазы заболевания; взаимосвязь характера метаболического ответа с молекулярно-биологическими свойствами патогенов.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ В ПРАКТИКУ. Результаты диссертационного исследования внедрены в лекционный материал на кафедре фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой Самарского государственного медицинского университета, в работу клинико-диагностической лаборатории клиник Самарского государственного медицинского университета, инфекционного, терапевтического отделений, клиникодиагностической лаборатории городской клинической больницы №2 им. H.A. Семашко г.Самары.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты диссертационной работы представлены в материалах Пятой международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2004), Международного семинара по проблемам пожилых «Самарские лекции» (Самара, 2004), IX Международной научной конференции «Здоровье семьи XXI век» (Далянь,2005), совместном заседании Самарского отделения Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, кафедр общей бионеорганической и биоорганической химии и фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой Самарского государстве’нного медицинского университета и Самарского отделения научного общества специалистов клинической лабораторной диагностики (Самара, 2005).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 6 работ. СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной объекту и методам исследования, 3-х глав собственных данных, заключения, выводов, практически рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 172 страницах, иллюстрирована 14 рисунками, содержит 36 таблиц. В работе использовано 216 литературных источников, из них 116 отечественных и 100 зарубежных авторов.

источник