Гепатит – серьезное заболевание печени. Оно может развиваться под действием токсинов, вирусов или воспалительного процесса. Чем раньше диагностирована проблема, тем больше шансов у человека сохранить здоровье. В первое время болезнь может протекать бессимптомно, поэтому периодически необходимо проходить обследование. Для этого необязательно каждый раз обращаться в медицинское учреждение. Сегодня в любой аптеке можно приобрести специальный тест на гепатит С, В или А. Главное, знать особенности таких систем и правила их применения.
С помощью экспресс-теста на гепатит можно быстро выявить наличие или отсутствие заболевания прямо у себя дома. Он представляет собой набор специальных полосок, которые меняют свой цвет при попадании на них биологического материала человека. Достоверность современных тестов достигает 99%.
Тесты выпускаются в форме полосок или кассет. Они имеют одинаковый принцип действия. Содержащийся в них реагент изменяет свою окраску. По этому процессу можно судить о наличии или отсутствии заболевания.
Подобные наборы для проведения анализа в домашних условиях изготавливают несколько производителей. В зависимости от этого их комплектация может быть различной. Среди обязательных составляющих набора выделяют:
- Кассеты или полоски, которые помещены в индивидуальную герметичную упаковку.
- Реагент.
- Приспособление для забора биологического материала. Это может быть пипетка или небольшая подушечка.
- Инструмент, при помощи которого делается прокол кожи для получения образца крови.
- Дезинфицирующая салфетка для обработки места прокола.
- Инструкция по использованию теста.
В состав набора всходит все необходимое для проведения анализа. Они продаются по одной или несколько штук в упаковке.
Приобретайте тесты только в аптеке. Только так вы будете защищены от подделки и сможете рассчитывать на достоверный результат.
От гепатита не застрахован никто. При этом специалисты выделяют группы людей, которым проходить подобное обследование необходимо регулярно:
- Люди, страдающие хроническими заболеваниями печени.
- Те, кому предписаны периодические переливания крови.
- Наркоманы.
- Работники медицинских учреждений, которые контактируют с кровью пациентов.
- Половые партнеры людей, страдающих гепатитом.
- Дети, рожденные от инфицированных матерей.
- Пациенты, регулярно проходящие гемодиализ.
В этих случаях велика вероятность развития болезни. Чем раньше она будет выявлена, тем больше шансов сохранить здоровье.
Домашний экспресс-тест прост в применении. Для него достаточно небольшой капли биологического материала человека. Чаще всего используют слюну или кровь.
Использование слюны максимально быстрый способ исследования. Но такой тест имеет большую вероятность ложного результата. Немаловажную роль в этом играют правила сбора материала. За полчаса до тестирования запрещено употребление любых напитков и пищи. Нельзя пользоваться какими-либо гигиеническими средствами.
Исследование крови оказывается более результативным. Но для этого придется делать прокол кожи, что причиняет дискомфорт. При этом необходимо придерживаться правил дезинфекции раны, чтобы исключить вероятность ее инфицирования.
Экспресс-тесты на гепатиты необходимо проводить по определенным правилам. Все они прописаны в инструкции, которая вложена в каждую упаковку. Исследование лучше всего проводить в утреннее время до завтрака. Так его достоверность будет максимальной.
При проведении анализа необходимо соблюдать определенную последовательность действий:
- Извлеките кассету или тест-полоску из упаковки.
- Проведите забор исследуемого биологического материала. Если это слюна, то она берется при помощи специальной подушечки. Ее просто необходимо приложить на несколько секунд к деснам с внешней стороны. Для получения крови необходимо проткнуть палец при помощи стерильного скарификатора и собрать образец пипеткой.
- Поместите пару капель отобранного материала на выделенную зону полоски или кассеты. Если ест предполагает использование растворителя, то капните его.
- Выждите положенное время.
- Оцените результат согласно прилагаемой к упаковке инструкции.
Чаще всего результат оценивается по количеству появляющихся в специальном окне полосок. Одна линия говорит об отсутствии инфекции, а две обозначают вероятность наличия заболевания. Если полоски вовсе отсутствуют, значить тестирование вы провели с нарушением технологии. Необходимо повторить анализ, используя при этом новый набор.
Если тест показал положительный результат, незамедлительно обратитесь к врачу. Достоверный диагноз может поставить только специалист после глубоко изучения крови пациента в лабораторных условиях.
Гепатит А считается наиболее мягкой формой заболевания. Он хорошо лечится и редко перерастает в хроническую форму. При этом эта форма остается наиболее распространенной, так как легко передается бытовым путем. Для того чтобы избежать серьезных последствий для здоровья и вовремя диагностировать проблему, необходимо регулярное проведение эскпресс-теста на гепатит.
Самыми популярными становятся следующие марки:
- ИммуноКомб. Эта система позволяет выявлять присутствие вируса в крови. Диагностировать болезнь удается на любой стадии. В одной упаковке содержится 36 тестов.
- Vegal. Время тестирования составляет все 15 минут. В упаковке имеется все необходимое для проведения исследования. Чувствительность теста доходит до 99%.
- Vitrotest. Исследование проводится по образцу крови. результат можно считать уже спустя 15 минут.
При проведении таких тестов необходимо внимательно придерживаться инструкции. Тогда вероятность получения ложного результат будет минимальна.
Гепатит В может развиваться очень быстро. Нередко переходит в хроническую форму. При запоздалом или неправильном лечении приводит к летальному исходу. В этом случае своевременная диагностика становится жизненно важной.
Среди самых популярных тестов на гепатит В в домашних условий можно выделить следующие:
- Мед-экспресс-диагностика. Это иммунохроматографический тест, который проводится с использованием крови из пальца. Общее время тестирования не превышает 15 минут. Производители уверяют, что достоверность такого анализа составляет 99%. В состав набора входят: тест полоска, буфер, скарификатор, две дезинфицирующие салфетки, пропитанные спиртовым раствором, пипетка для сбора крови.
- iSKREEN-Help. Позволяет выявлять наличие вирусных антигенов в крови, плазме и сыворотке. В тестовой зоне находятся анти-HBsAg антитела козы. В состав реагента входит коллоидное золото. Если полоса в отведенной для этого области не появилась, то результат можно считать отрицательным. В комплектацию набора входит кассета, а также все необходимые приспособления для забора крови, упакованные в герметичный пакет.
- New Vision Diagnostics. Позволяет выявить наличие заболевания путем исследования цельной крови. Результат появляется в тестовой зоне спустя 15 минут. В наборе содержится кассета, флакон с растворителем, ланцет для прокола кожи, пипетка для забора материала, дезинфицирующие салфетки.
- ИммуноХром-HBsAg-Экспресс. При помощи этого теста можно в считанные минуты выявить наличие антигена вируса гепатита в образце цельной крови. Достоверность по уверениям производителей составляет 99%. В одной упаковке содержится тест-полоска, пробирка с растворителем, скарификатор, пипетка для сбора крови, спиртовые салфетки для дезинфекции.
Регулярное проведение таких тестов позволяет выявлять заболевание на ранней стадии. Только в этом случае прогноз может быть благоприятным. При покупке тестов обращайте внимание на срок их годности. Просроченные наборы дают неправильный результат.
Самым опасным считается гепатит С. Это сильный воспалительный процесс, протекающий в печени. Вакцины, подавляющей возбудитель, на сегодняшний день не существует. Поэтому заболевание признано неизлечимым. Шанс на выздоровление имеют только 20% заболевших, и только при условии диагностирования проблемы на ранней стадии.
В современных аптеках представлены следующие тесты:
- In-vitro. Тест крайне прост в применении. Для исследования понадобится всего капля капиллярной крови. В упаковке с набором вы найдете: индикаторный планшет, специальный реагент, который примешивается к крови, все необходимо для прокола кожи и забора образца. Результат вы получите уже через 10 минут. Стоит помнить, что максимальное время сохранения результата 20 минут. В последствие он искажается. О наличии заболевания будет свидетельствовать появление двух полос яркого красного цвета в соответствующем окошке.
- OraQuock HCV Rap >
Первые признаки гепатита С могут проявляться только спустя 90 дней после инфицирования. Драгоценное время, необходимое для лечения, упускается. Поэтому при появлении слабости, апатичного состояния, ухудшения самочувствия сразу же сделайте тест на гепатит.
Экспресс-тесты пользуются заслуженной популярностью у людей, которые хотят постоянно контролировать свое здоровье. Отмечают следующие преимущества подобных систем:
- Простота в применении. Никаких знаний и навыков для проведения исследования не нужно. Достаточно соблюдать прилагаемую к упаковке инструкцию.
- Пройти тест можно анонимно. В случае положительного результат об этом не узнает никто кроме вас.
- Приобрести тест может каждый. Стоит он относительно недорого и представлен практически во всех современных аптеках.
- Скорость получения результата. Подтвердить иди опровергнуть диагноз можно в течение 15-20 минут.
- Имеют высокий процент достоверности. Производитель большинства моделей уверяют, что этот показатель доходит до 99%.
- Набор полностью укомплектован всем необходимым. Не нужно будет приобретать дополнительные приспособления.
- Для проведения теста не нужно обращаться в медицинское учреждение и стоять в очередях. Исследование вы проведете самостоятельно прямо у себя дома.
Несмотря на такой широкий перечень преимуществ специалисты отмечают и некоторые недостатки подобных систем. Они не могут гарантировать 100% результата. В любом случае диагноз требует подтверждения в лабораторных условиях. Во время проведения теста существует вероятность инфицирования раны, оставшейся после прокола кожи. Кроме того, остается вероятность приобрести поддельный или бракованный экземпляр, который может дать ложноотрицательный результат. В этом случае человек будет уверен, что полностью здоров в то время, как болезнь начнет прогрессировать, а драгоценное время на лечение будет упущено.
Для того чтобы минимизировать риск приобретения недоброкачественной продукции, выбирайте тесты только известных производителей с хорошей репутацией. Не стоит покупать их в интернете и других местах, не предназначенных для реализации лекарственных препаратов. Обращайтесь только в крупные аптеки.
Производители гарантируют высокую точность совей продукции. Но иногда тест все-таки может показать неправильный результат. Это возможно при следующих обстоятельствах:
- Нарушение инструкции проведения теста. Перед началом исследования еще раз перечитайте все правила и убедитесь в том, что все пункты вам полностью понятны.
- Нарушение технологии сбора биологического материала. Забор должен проводиться в стерильных условиях специально предназначенными для этого инструментами.
- Оценка результата проводится слишком рано или слишком поздно. Каждый тест имеет временной промежуток, в течение которого его результат можно считать достоверным. Поэтому перед началом тестирования отыщите эти цифры в инструкции и приготовьте таймер.
- Просроченный или низкокачественный тест. Проверить качество теста самостоятельно невозможно. Остается только следить за сроком его годности. Даже если он просрочен на день, использовать его нельзя.
- Недостаточный объем биологического материала для исследования. Этот показатель также прописывается в инструкции. Если крови или слюны будет слишком мало, то результат теста будет недостоверным. Использовать неудавшийся тест повторно и добавлять в него материал нельзя. Повторный тест можно проводить только с использованием нового набора.
- Неудачное время для проведения теста. Если в крови еще слишком мало антител, говорящих о заболевании, то экспресс-тест просто не сможет их распознать.
- Попадание на тестовую зону посторонних жидкостей. Вскрывать герметичную упаковку с кассетой или тест-полоской можно только в момент проведения исследования. Любые попавшие на нее загрязнения искажают результат.
Перед проведением теста внимательно осмотрите все приспособления. Убедитесь в том, что они стерильны. Строго придерживайтесь инструкции.
Экспресс-тест на гепатит – идеальное решение для людей, которые заботятся о своем здоровье. Тем, кто относится к группе риска особенно важно их проведение. Вам не придется тратить время на стояние в очереди в лабораторию, исследование вы можете проводить прямо у себя дома.
источник
Гепатит А считается врачами относительно мягкой формой инфекционного процесса из-за редких случаев хронизации заболевания, но в последнее время этот недуг приобретает более широкое распространение. Вирусный гепатит А является наиболее распространенной формой гепатита. Микробиологические исследования доказали, что передается от человека к человеку инфекция парентальным путем, с пищей и питьем.
В некоторых случаях может иметь место молниеносный гепатит, такая разновидность патологического процесса способна закончиться смертельным исходом. По этой причине пускать развитие недуга на самотек нельзя.
Развитие болезни происходит в три этапа:
- преджелтушная;
- разгара болезни — желтушная;
- реконвалесценции – выздоровления.
Сразу после инфицирования начинается инкубационный период, в течение которого, изменения не выявляются, этот период характеризуется накоплением вирусных частиц в организме.
Патогенез гепатита А сопровождается формированием в организме больного различных синдромов, представляющих собой комплексы симптомов, свидетельствующих о возникновении различных нарушений провоцируемых интоксикацией.
Диагностика гепатита А предполагает использование нескольких диагностических методов. При появлении подозрений на наличие указанной инфекции больной в первую очередь должен обратиться к врачу-инфекционисту для проведения экспресс-теста.
Для диагностирования наличия заболевания инфекционисту достаточно провести беседу с пациентом, в процессе которой выясняются особенности способа жизни человека. После проведения беседы врач осуществляет осмотр больного, обследует печень методом пальпации и ставит первичный диагноз.
Так как большинство симптомов у различных типов вирусных инфекций сходны между собой, поэтому требуется лабораторная диагностика гепатитов.
После первичного осмотра и обследования врач дает направление на анализы.
Проведение лабораторной диагностики гепатита А во многом сходно с лабораторной диагностикой гепатита С.
При проведении первичной диагностики вирусного гепатита А показательной будет следующая информация:
- Посещал ли пациент в последнее время страны Азии и Африки, где недостаточно развита работа коммунальных служб. Это связано с тем, что передача инфекции осуществляется пищевым и водным путем.
- Соблюдает ли человек элементарные гигиенические правила.
- Важной является информация о том, контактировал ли пациент с больными гепатитом А.
На основании полученной информации врач может сделать предварительное заключение и проводить дальнейшую диагностику заболевания. Одновременно с проведением осмотра врач выясняет, как осуществляет функционирование пищеварительная система пациента, присутствуют ли признаки мышечной интоксикации. При проведении процедуры пальпирования доктор определяет размеры печени.
Очень часто течение заболевания происходит в безжелтушной форме, но опытный врач проводит осмотр склер глаз, появление даже небольшой желтушности говорит о возможном факте инфицирования организма.
В качестве первичного метода диагностики на наличие у пациента вирусной инфекции можно использовать экспресс-тест на определение антигена вируса гепатита А в составе кала или крови.
Фармацевтическая промышленность предлагает использовать два вида тестовых наборов – тест компании Vegal и иммуноферментные тест-системы Vintrotest Vitrotest HAV-IgM TK069.
Первая разновидность экспресс-тестов включает в своем составе весь комплект необходимых реактивов и инструментов. Для проведения исследования требуется не более 15 минут. Этот способ не дает 100% точности.
Иммуноферментные тест-системы Vintrotest Vitrotest HAV-IgM TK069 позволяют достаточно быстро определить присутствие антител IgM к вирусным частицам. Это исследование позволяет получить результат в домашних условиях уже через 15 минут.
Использование результатов гемотестов, несмотря на большое количество положительных отзывов о них, не могут использоваться в качестве единственного способа проведения диагностики.
После использования такого метода рекомендуется провести дополнительные лабораторные исследования. Помимо этого, в связи с тем, что появляющиеся симптомы могут свидетельствовать о наличии в организме не только гепатита, а также, например, у взрослых людей алкогольного гепатоза и некоторых других заболеваний печени. По этой причине требуется проведение дифференциальной диагностики. Дополнительно нужно установить какая разновидность вируса поразила организм и спровоцировала появление болезни.
Проведение диагностических мероприятий при подозрении на наличие патологии требует проведения целого комплекса исследований.
При диагностировании недуга применяются лабораторные и инструментальные методы проведения исследований.
Показательные данные позволяет получить биохимический анализ крови и мочи.
В том случае, если выявлены повышенный билирубин, а также увеличенная концентрация печеночных ферментов, то это означает, что развивающийся в организме гепатит уже привел к нарушению работы клеток печеночной паренхимы.
Проведение детальной расшифровки анализа крови и мочи позволяет определить в некоторых случаях степень повреждения печени и организма в целом.
Наиболее показательными лабораторными методами диагностики гепатита А являются:
- анализ мочи;
- общий анализ крови;
- биохимия крови;
- коагулограмма.
Лучше всего сдавать анализы натощак, это позволит получить наиболее точные результаты.
Присутствие вируса в организме можно увидеть по анализу мочи, при появлении в ней билирубина, она начинает светлеть. У здорового человека в моче оно не выявляется, при наличии гепатита А наблюдается повышение концентрации в составе мочи уробилиногена. При тяжелом течении патологии в моче выявляется наличие низкомолекулярных плазменных белков, которые не должны выявляться в моче здорового человека.
При общем анализе крови при гепатите А наблюдается снижение концентрации гемоглобина и лейкоцитов. Помимо этого фиксируется снижение концентрации тромбоцитов. Эти изменения свидетельствуют о наличии аномальных процессов в печени.
Биохимия крови позволяет выявить отклонения в концентрации печеночных ферментов. Такие отклонения свидетельствуют о патологических нарушениях в функционировании печени и разрушении гепатоцитов.
После проведения первичного осмотра и лабораторных анализов можно поставить диагноз, но для качественной диагностики требуется проведение дополнительных тестов и исследований.
После ряда анализов врач-инфекционист направляет больного для количественных и качественных обследований гепатита А.
Существует ряд методик, позволяющих определить количество вируса в организме и степень его агрессивности.
Наиболее распространенными методами проведения такой диагностики являются:
- Иммуноферментная диагностика.
- Ультразвуковое исследование.
- Полимеразная цепная реакция.
Наиболее точной и специфической диагностикой является выявление РНК вируса в крови при помощи ПЦР.
Для точного определения наличия антител к вирусу необходимо проверить кровь на маркеры. Специфическими маркерами являются иммуноглобулины класса М анти-HAV IgM. Наличие этого компонента можно установить с первых дней после проникновения патогена в организм при помощи методики ИФА.
Иммуноглобулины появляются в организме больного в первые месяцы развития патологии. Выработка антител у больного происходит в независимости от тяжести, формы и симптомов болезни. Эти антитела носят название ранних, это связано с тем, что спустя полгода после инфицирования их уже невозможно выявить методом ИФА в организме. Спустя 6 месяцев наблюдается их возврат в крови пациента, после возвращения анти тела способны сохраняться в составе крови на протяжении всей жизни.
Наличие указанных антител к вирусу является доказательством того, что человек инфицировался гепатитом А и у него выработался иммунитет к этому патогену. Аналогичные антитела появляются у человека, если ему делалась прививка против вируса в качестве профилактики развития патологии.
Для определения наличия маркеров требуется сдать кровь для проведения лабораторных тестов. Сотрудники клинической лаборатории в процессе проведения тестов имеют возможность выявить не только само наличие антител, но и их количество в организме пациента.
Эта методика определения патологии относится к высокоточным лабораторным методам, требующим наличие специального оборудования и реактивов.
Применение ультразвукового исследования позволяет выявить наличие нарушений вызванных инфекционным процессом в структуре и форме печени. Такие нарушения являются частым спутником при развитии у человека гепатита А.
В процессе исследования выявляется наличие пятен на органе что говорит о повышении эхогенности, наличие уплотнений может свидетельствовать о развитии в печени цирроза.
УЗИ может помочь диагностировать присутствие в железе любых серьезных изменений на самых ранних стадиях их прогрессирования. Так, например, при помощи ультразвука выявляются нарушения, возникающие в результате развития холестаза и цитолиза гепатоцитов.
УЗИ может быть назначено человеку для подтверждения наличия вирусной инфекции даже в случае наличия у него на руках результатов ИФА, это требуется для того чтобы определить полную картину развивающихся патологических изменений в тканях железы.
Для получения максимально точной картины нарушений УЗИ рекомендуется проводить натощак, а за два дня до процедуры исключить из рациона питания такие продукты как:
Исключение указанных компонентов из рациона связано с тем, что они усиливают процессы газообразования, а это в свою очередь приводит к неточностям при проведении ультразвукового обследования.
Метод ПЦР дает возможность определить уровень нуклеиновых кислот и присутствие чужеродной ДНК или РНК.
Использование ПЦР позволяет выявить генетический материал патогена еще на самой начальной стадии, когда в составе крови отсутствуют антитела. Эта методика диагностики является наиболее многогранной и точной, что позволяет проводить наиболее раннюю диагностику заболевания.
Использование этого метода оправдано в тех случаях, когда требуется получение наиболее точного результата в максимально короткие сроки для предотвращения распространения инфекционного процесса.
Недостатком методики является высокая стоимость инструментов необходимых в процессе анализа, а также его недоступность в целом ряде стран с высокой степенью распространения вирусной инфекции.
Методика ПЦР дает возможность определить чувствительность вируса к определенным противовирусным препаратам и определяет точное расположение очагов заболевания – мест наибольшего скопления частиц патогена. Наличие у лечащего врача такой информации позволяет подобрать наиболее оптимальный вариант проведения терапевтических мероприятий.
Специфичность методики составляет около 98%. Наличие у ПЦР высокой степени чувствительности позволяет его использовать, как наиболее показательный при проведении диагностики гепатита А.
источник
М.И.Михайлов, Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН, Москва
При постановке диагноза «гепатит С» необходимо учитывать следующие наиболее важные факторы:
При этом основными направлениями работ, выполняемых лабораторными сотрудниками, являются:
Основой лабораторной диагностики гепатита С служат знания о ВГС, его репликации, информация о динамике появления и исчезновения маркеров инфицирования, а также современные иммунохимические и молекулярно-биологические методы детекции антигенов, антител и нуклеиновых кислот.
ВИРУС ГЕПАТИТА С. ВГС впервые был идентифицирован в 1988 году, когда группа исследователей во главе с М. Houghton и Choo Q.L, применив новые молекулярнобиологические методы исследования, клонировала и секвинировала геном вируса [I]. Частица вируса гепатита С имеет сферическую форму со средним диаметром около 50 нм [2,3]. Попытки визуального обнаружения и изучения строения вируса гепатита С предпринимались с момента открытия вируса, однако до сих пор отсутствуют хорошо документированные результаты этих исследований, что, возможно, связано с трудностями накопления вирусных частиц в необходимых количествах.
ВГСединственный член рода Hepacivirus в семействе Flaviviridae, в которое входят такие вирусы, как вирус диареи быков и лихорадки свиней (род Pestivirus) и вирус желтой лихорадки, вирус дэнге и GB-вирусы: GBV-A, GBV-B и GBV-C/HGV (род Flavivi-rus). Схема строения вируса гепатита С может быть представлена следующим образом (схема № 1). Нуклеокапсид содержит РНК вируса гепатита С. Сверху нуклеокапсид покрыт липидной оболочкой с утопленными в ней оболочечными белками, кодированными РНК ВГС. Геном вируса представлен однонитевой линейной молекулой РНК положительной полярности, протяженностью около 9600 нуклеотидов. Организация генома ВГС подобна другим флавивирусам. В нем выделяют две зоны, кодирующие структурные и неструктурные (функциональные) белки. Гены, кодирующие структурные белки, расположены у 5′ области генома вируса, а неструктурные у 3′ области. Ген ВГС имеет одну открытую рамку считывания (ОРС), единый полипептид (приблизительно в 3000 аминокислот), который под действием вирусных и клеточных протеаз нарезается на структурные и неструктурные белки.
Рис. 1. Структурные элементы HCV 
К структурным белкам относят белки, кодированные Core, El и Е2 зонами РНК ВГС. Выявлено три формы С-белка ВГС: полноразмерная (р21) с молекулярной массой — 21 kD, усеченная (р19) и форма (р16), обнаруженная в ядрышках инфицированных гепатоцитов. На своей поверхности С-белок несет различные высококонсервативные В-клеточные эпитопы, существование которых чрезвычайно важно для выявления антител к ВГС в процессе лабораторной диагностики гепатита С.
Зоны РНК ВГС — Е1 и Е2 кодируют белки с молекулярной массой 31 и 70 kD . Эти белки имеют несколько участков N-гликозилирования; в Е1 белке определено до 6 таких участков, а в Е2 — 11. В участке Е2 заключена информация о небольшом белке — р7, который в структуре вируса не обнаружен.
Обозначение регионов, расположенных ближе к 3′- концу РНК ВГС — как зон, несущих информацию о неструктурных белках вируса, указывает на то, что эти белки не являются структурными компонентами вирусной частицы. В неструктурной зоне РНК ВГС выделяют участки, обозначенные как: NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B. Большинство из белков, кодированных неструктурными зонами РНК ВГС, необходимы для репликации вируса.
Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей РНК изолятов ВГС, полученных в различных регионах мира и даже в процессе заболевания от одного и того же пациента, выявил основную особенность этого вируса — высокую гетерогенность РНК. Положение о значительной генетической вариабельности РНК ВГС легло в основу теорий, объясняющих: длительное (иногда пожизненное) носительство вируса, частое развитие хронического заболевания, трудности в терапии и создании эффективных вакцинных препаратов. Наиболее значительные отличия последовательностей РНК ВГС сосредоточены в N-концевой части региона Е2, которую обозначают — «гипервариабельный регион» (HVR) [4].
В настоящее время определено 6 основных генотипов и свыше 100 субтипов ВГС. Генотипы 1а, 1в, 2а, 2в, 2с и За составляют более 90% HCV-изолятов, полученных в Северной и Южной Америке, Европе, России, Китае, Японии и Австралии/Новой Зеландии [5]. Генотипы 4, 5а и 6 соответственно регистрируются в Центральной и Южной Африке, Юго-Восточной Азии. В России и странах СНГ зарегистрировано преобладание генотипа 16 (не менее 68,9%) [6,7]. Считается, что пациенты, инфицированные генотипом 1 (особенно 1в), отвечают хуже на лечение по сравнению с пациентами, инфицированными другими генотипами вируса.
У больного ВГС циркулирует как популяция частиц вируса, у которых геномы отличаются друг от друга на 1-2% (квазиспецифичности) в результате мутаций, накапливающихся во время инфекции и/или попавших в организм пациента при заражении. Эти мутантные формы могут способствовать более активной репликации или могут помогать вирусу уклоняться от иммунного ответа организма и потенциально влиять на исход острой инфекции, различия в течении заболевания и ответе на интерферонотерапию [8].
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИ-ВГС. После открытия вируса ВГС и определения его роли в развитии посттрансфузионного гепатита — «ни А, ни В» перед исследователями стояла задача разработать методы, способные выявлять лиц с ВГС и пригодные для диагностики острого и хронического гепатита С. Было установлено, что антигены ВГС циркулируют в чрезвычайно низких концентрациях, и очевидно, что методический уровень конца 80-х годов XX века, применяемый для детекции вирусных антигенов, был явно недостаточен.
В 1989 году группа исследователей фирмы «Chiron Corporation» под руководством Q-L.Choo осуществила клонирование РНК ВГС и получила иммунореактивные олигопептиды, вступающие в реакцию с антителами, циркулирующими в крови больных хроническим гепатитом «ни А, ни В». Эти олигопептиды стали основой диагностических препаратов для выявления антител к ВГС. Это определило быстрый прогресс в разработке и промышленном выпуске диагностических препаратов. Основным методом, применяемым для детекции анти-ВГС, стал твердофазный иммуноферментный анализ, как метод, отвечающий требованиям практического здравоохранения -т.е. обладающий высокой чувствительностью, специфичностью и простотой проведения.
Учитывая, что ВГС персистирует в крови больных острым и хроническим гепатитом С одновременно с анти-ВГС, внимание разработчиков диагностических препаратов концентрировалось на создании тест-систем для детекции антител, обеспечивающих максимально полное выявление носителей вируса и максимально ранние сроки диагностики острой инфекции. Многообразие антигенов и антигенных детерминант, кодированных структурной и неструктурной зоной РНК ВГС, определило направление в конструировании диагностических препаратов выбором и аранжировкой олигопептидов, применяемых для их создания. За время, прошедшее с момента открытия ВГС, созданы диагностические системы трех поколений ( таблица 1).
Таблица 1
Диагностические препараты для выявления анти-ВГС [9]
Применяемые пептиды,
зоны РНК ВГС, в которых
они кодированы
Время первого
выявления
анти-ВГС от
начала желтухи
С22-3 Core
С200 NS3 и NS4
СЗЗс NS3
С 100-3 NS4
С22-3 Core
С200 NS3 и NS4
СЗЗс NS3
Пептид NS5
Введение дополнительных пептидов, прежде всего с22-3 (Core), в диагностические препараты 2-го и 3-го поколения позволило решить главную задачу, то есть увеличить чувствительность, специфичность и, самое главное, выявляемость анти-ВГС . Благодаря диагностикумам 3-го поколения удается выявлять до 97% носителей ВГС. Вместе с тем, определенную дискуссию вызвало решение о введении в диагностикум пептида, кодированного NS5 регионом РНК ВГС. По мнению некоторых исследователей, присутствие этого пептида не имеет принципиального значения для улучшения качества диагностического препарата. [10,11]. Однако антитела к NS5 могут быть выявлены в более ранние сроки инфекции, что улучшает качество лабораторной диагностики острого гепатита С. [12].
В настоящее время во всем мире, в том числе и в России, применяются диагностические препараты 3-го поколения. Пептиды, применяемые в диагностических препаратах, получены при помощи рекомбинантной технологии (например, диагностикумы фирм: «Диагностические препараты», г. Нижний Новгород; «Вектор» г. Новосибирск; «Roche»; «Abbott» и др.), или синтетической (000 МЦ «Авиценна» г. Санкт-Петербург; «Organon» и др.). Диагностикумы, в которых одновременно использованы оба вида пептидов, получили обозначения, как препараты 4-го поколения. По своим характеристикам эти препараты не обладают значимыми различиями. Сравнительные испытания, регулярно проводимые МЗ России, продемонстрировали сопоставимую чувствительность диагностических препаратов отечественных и зарубежных производителей.
Установлено, что применение диагностикумов 3-го поколения для выявления анти-ВГС среди иммунокомпетентного населения (например, доноров крови) оценивается в 98,8-100%. В то же время среди иммунокомпрометированных лиц, например, таких как пациенты после трансплантации почки, костного мозга или лица, инфицированные ВИЧ, этот показатель значительно ниже — 50 — 95% [12]. S.George с соавт. [13] продемонстрировали, что у 8,4% больных ВИЧ-инфекцией регистрируются ложно-негативные результаты выявления анти-ВГС. Причем у таких пациентов в процессе наблюдения может регистрироваться серореверсионный эффект, т.е. регистрация позитивного результата после серонегативного анти-ВГС периода [14].
Одна из наиболее важных проблем при проведении исследований на наличие анти-ВГС — ложнопозитивные результаты. Их появление может быть связано с неспецифическим взаимодействием компонентов реакции, возможными перекрестными реакциями с другими вирусными антигенами и многими другими факторами. Уровень ложно-позитивных результатов при выявлении анти-ВГС с различными диагностическими препаратами может достигать 10-20% [15,16]. Повышенный уровень таких результатов отмечен среди больных онкологическими и аутоиммунными заболеваниями, лиц с иммунодефицитными состояниями и больных сифилисом [16,17]. Существование ложнопозитивных результатов ставит перед лабораторным работником задачу их разграничения с истинным выявлением анти-ВГС. Для решения этой задачи служит обнаружение в образце сыворотки крови РНК ВГС. Однако отрицательный результат обнаружения РНК ВГС не позволяет говорить о наличии ложнопозитивного выявления анти-ВГС. Необходимо учитывать, что анти-ВГС могут изолированно циркулировать в крови пациента, который выздоровел после острого гепатита С (10-15%) или у которого произошла элиминация РНК ВГС в результате проводимой терапии.
КОНФИРМАЦИОННЫЕ (SUPPLEMENTAL) ТЕСТЫ. Для разграничения ложнопозитивных образцов и образцов, действительно содержащих антитела к ВГС, разработаны дополнительные (Supplemental) тесты. Наиболее часто в этих тестах используется принцип иммуноблота [например — тест RIBA («Ortho-Clinical Diagnostics»); «LiaTek HCV» (Organon Teknika)], когда на нитроцеллюлозной мембране адсорбируются в виде отдельных полос антигены, кодированные различными зонами РНК ВГС. Анти-ВГС взаимодействуют с адсорбированными антигенами с помощью меченных ферментом антител против Ig G человека с последующей их детекцией при помощи субстратного комплекса. Помимо иммуноблота в качестве дополнительных тестов также используют диагностические препараты для выявления анти-ВГС против конкретных антигенов, кодированных различными зонами РНК ВГС [«Спектр 4» («Имбио», г. Нижний Новгород; РекомбиБест АНТИ-ВГС-СПЕКТР» — ЗАО «Вектор Бест», г. Новосибирск; ИФА- Анти-НСУ-Спектр, НПО «Диагностические системы», г. Нижний Новгород].
Разработка и внедрение этих тестов идет параллельно с внедрением скрининговых тестов для выявления анти-ВГС, повторяя принцип расширяющегося спектра использованных пептидов в каждом последующем поколении диагностических препаратов. Так, диагностикум RIBA-III отличается от предыдущего поколения добавлением пептида, кодированного зоной NS5. Принципы, позволяющие подтвердить позитивный результат выявления анти-ВГС, прежде всего включают: возможность (в некоторых случаях) получения более четких результатов ферментативной реакции при взаимодействии с отдельными пептидами, а также применение в диагностикуме расширенного спектра пептидов, которые не используются в скрининговых тестах. Только введение новых пептидов позволяет повысить диагностическую ценность подтверждающих тестов.
Трактовка полученных результатов, например в таком тесте, как RIBA-III, включает три возможных ответа : позитивный, негативный и неопределенный результат. Последний из них выдается в случае отсутствия четких показаний (согласно инструкции, прилагаемой к диагностическому набору), позволяющих определенно судить о наличии или отсутствии анти-ВГС в исследуемом образце. Соотношение спектра регистрируемых ответов при проведении подтверждающих тестов колеблется в зависимости от характеристик групп пациентов, у которых первично выявлены анти-ВГС [18]. По данным J.M. Pawlotsky с соавт. [19], в половине случаев результатов, трактуемых как «неопределенные», удается обнаружить РНК ВГС. На наш взгляд, правомочность ответа — «неопределенный результат выявления анти-ВГС», выдаваемого лабораторным работником клиницисту, очевидна не только при проведении подтверждающего теста, но и рутинном исследовании на наличие анти-ВГС. Необходимость такой трактовки полученных результатов является отражением современного состояния лабораторной диагностики гепатита С.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ IgM АНТИ- ВГС. В настоящее время созданы и промышленно выпускаются диагностические наборы для выявления IgM анти-ВГС фирмами: «Вектор Бест»; «Диагностические системы»; «Имбио», «Abbott» и др. На этапе конструирования диагностических наборов были созданы наборы для ИФА, основой которых являлись пептиды, кодированные различными регионами РНК ВГС [20] . Выбор был остановлен на пептиде, кодированном Core регионом РНК ВГС и выявлении антител к нему класса IgM. Так же как и при использовании тестов для выявления анти-ВГС (IgG), при исследовании IgM анти-ВГС могут быть зарегистрированы ложнопозитивные результаты. По данным Stevensona D.L. с соавт. [21], до 70% больных с хроническим гепатитам С с наличием IgM анти-ВГС одновременно имели повышенный уровень ревматоидного фактора, который способствует появлению ложнопозитивных результатов. Вместе с тем, по мнению Pawlotsky J.M., наличие ревматоидного фактора не влияет на качество выявления IgM анти-ВГС [22].
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИГЕНОВ ВГС. Возможность определения антигенов ВГС привлекала внимание исследователей сразу же после открытия вируса. Принципиальная возможность их тестирования была продемонстрирована К. Krawczynski с соавторами [23], которые иммуногистохимически обнаружили в печеночной ткани антигены ВГС, доказав специфичность иммунофлюоресцентного свечения. Применение поли- и моноклональных антител к различным антигенам ВГС установило наличие ВГС core Ag, антигенов, кодированных NS3 и NS4 зонами РНК ВГС, в ядре и цитоплазме гепатоцитов, у 60-90% больных хроническим ГС [24].Однако дальнейшие исследования продемонстрировали, что антигены ВГС удается обнаружить менее чем в 5% печеночных клеток.
Первые диагностические тест-системы («Ortho Antibody to Core Antigen (Murine Monoclonal) EL1SA Test System» и «Imucheck F-HCV Ag Core Kokusai») для выявления антигена ВГС появились на рынке иммунобиологических препаратов в 1999 году. В качестве цели детекции был избран Core антиген ВГС, который определяют при помощи твердофазного варианта ИФА, сконструированного на основе моноклональных антител. Первые исследования по применению этих тестов определили их высокую чувствительность, специфичность, и перспективность применения, прежде всего, в службе переливания крови [25,26]. Установлены:
МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ РНК ВГС. Современный этап лабораторной диагностики гепатита С можно охарактеризовать как этап начала широкого применения молекулярно — биологических методов выявления РНК ВГС. Подавляющее большинство методов выявления нуклеиновых кислот было апробировано для выявления РНК ВГС. Принципам конструирования диагностических препаратов и их применению для детекции вирусных ДНК или РНК посвящено значительное количество литературных обзоров, опубликованных как в отечественных [28], так и зарубежных изданиях [29]. Все эти методы можно разделить на две группы, в основе которых лежит применение принципов гибридизации без амплификации избранного участка нуклеиновой кислоты или с их амплификацией, что позволяет значительно повысить разрешающую способность метода.
Метод гибридизации основан на соединении меченных гибридизационных зондов (генноинженерные или синтетические молекулярные структуры, содержащие в себе нуклеотидные последовательности, комплементарные избранным участкам РНК). Учет результатов осуществляют по интенсивности сигнала, поступающего от метки в составе образовавшегося комплекса.
При гепатите С этот метод выявления РНК ВГС прежде всего нашел применение для ее идентификации непосредственно в гепатоцитах, в тестах обозначаемых — in situ hibidization [30]. Возможность непосредственной детекции РНК ВГС в ткани позволила обнаружить ее в мононуклеарных клетках крови, клетках слюнных желез и других тканях организма больного гепатитом С [31,32].
Метод гибридизации, применяемый для детекции РНК ВГС, позволяет продемонстрировать наличие негативных (репликативных) цепей РНК ВГС, что свидетельствует об активной репликации вируса [33].
Метод полимеразнной цепной реакции — в настоящее время наиболее широко применяемый методический прием, лежащий в основе практически всех молекулярно-биологических методов детекции РНК ВГС. Причем определение РНК ВГС возможно как в качественном, так и количественном варианте, что особенно важно для назначения, мониторинга и оценки эффективности применяемой терапии.
В качестве основных вариантов метода можно выделить:
Полимеразная цепная реакция — широко применяемый как в России, так и за рубежом метод детекции РНК ВГС. В его основе лежит многоцикловой процесс, напоминающий естественную репликацию нуклеиновой кислоты, причем каждый цикл состоит из последовательных этапов.
Из исследуемого материала (сыворотка или плазма крови, печеночный биоптат) выделяется РНК ВГС. Учитывая, что нуклеиновая кислота ВГС представлена РНК, а для амплификации необходима молекула кДНК, при помощи фермента — обратной транскриптазы, происходит образование однонитевых молекул кДНК ВГС. На следующем этапе к определенному участку каждой из цепей кДНК ВГС присоединяются т.н. праймеры — короткие олигонуклеотиды, комплементарные известным нуклеотидным последовательностям. Сравнение первичной структуры 5’UTR области генома различных изолятов ВГС выявило их незначительную изменчивость (между генотипами, гомология нуклеотидов — 92-98%, а внутри генотипа 98-99%). Это сделало предпочтительным выбор праймеров из этой зоны РНК ВГС и их применение в диагностических тест-системах, выпускаемых у нас в стране и за рубежом.
Далее, при помощи фермента ДНК- зависимой ДНК полимеразы происходит синтез новых участков ДНК. В настоящее время в качестве источника этого фермента чаще всего используют бактерии Thermophilus termus (Tth-полимераза) или Thermophilus aquaticus (Taq-полимераза). Обладая термостабильностью в присутствии ионов марганца и магния, этот фермент может быть одновременно использован для синтеза комплементарных одноцепочечных молекул кДНК ВГС и амплификации избранных участков кДНК. На завершающем этапе одного цикла реакции, при помощи ДНК полимеразы происходит синтез новых цепей комплементарных кДНК ВГС. Многократное повторение циклов реакции приводит к накоплению фрагментов кДНК ВГС, которые возможно зарегистрировать при помощи электрофореза в полиакриламидном геле с последующей визуальной детекцией или же с применением гибридизации с олигонуклеотидными зондами, что увеличивает чувствительность и специфичность применяемых диагностических препаратов. Применение праймеров, меченных ферментами, позволяет проводить учет результатов ПЦР при помощи иммуноферментного анализа.
Постоянная цель, стоящая перед исследователями, конструирующими диагностические системы для выявления РНК ВГС, — повышение чувствительности и специфичности. Этой цели служит вариант ПЦР, обозначенный — «гнездовой ПЦР» (nested PCR) [34]. Отличительной особенностью этого метода от «классического» является одновременное использование двух пар праймеров, одна из которых комплементарно связывается с внутренним участком ампликона, полученного после первого раунда амплификации. Вместе с тем считается, что при этом варианте ПЦР более высок риск контаминации образцов, что может привести к ложноположительным результатам [35] .
Острая потребность в определении РНК ВГС и сложности, связанные с крупномасштабным производством высокочувствительных и специфичных диагностических наборов для ПЦР диагностики, определили широкое применение препаратов, изготовленных в научных лабораториях. Сравнение этих тест-систем, так называемых — «домашних» тестов («in house tests»), продемонстрировало их высокую вариабельность по чувствительности и специфичности, а также отсутствие воспроизводимости результатов между лабораториями и сериями диагностических препаратов. Так, при проведении первого Европейского цикла «внешнего» контроля качества оценки выявления РНК ВГС (1996 г.) из 136 лабораторий только 22 (16%) смогли абсолютно правильно определить наличие или отсутствие вирусной РНК в предоставленных контрольных образцах [36]. Подобный результат отмечен и в нашей стране, во время проведения аналогичной работы в рамках Федеральной системы внешнего контроля качества (2001 г.), когда из 14 участвующих лабораторий лишь 3 (21,4%) смогли правильно решить поставленную задачу [37].
Причины появления ложнонегативных и ложнопозитивных результатов выявления РНК ВГС разнообразны. При ложноотрицательных результатах:
— потеря или разрушение РНК ВГС в ходе подготовки к реакции клинического материала;
— наличие в образце ингибиторов, влияющих на различные компоненты ПЦР. Эти ингибиторы представлены различными химическими или белковыми субстанциями. Например: наличие в спермальной жидкости ингибиторов обратной транскриптазы не позволяло обнаружить РНК ВГС и говорить о возможности реализации полового пути передачи гепатита С [38]; наличие гепаприна [39]; высокий уровень криоглобулинов в сыворотке крови [40];
— несоблюдение теплового режима хранения и транспортировки клинического материала. При ложнопозитивных результатах:
— контаминация между пробами (при обработке образцов и/или работе с реакционной смесью), в том числе и контаминацией позитивным контрольным образцом;
— контаминация продуктами предшествующий амплификации (ампликонами), которые могут загрязнять исследуемые образцы и растворы через аэрозоли или лабораторное оборудование.
Массовое внедрение ПЦР диагностики по определению РНК ВГС поставило перед органами практического здравоохранения задачи перехода на новый уровень проведения лабораторных исследований. Выделение изолированных зон для осуществления основных этапов ПЦР (для подготовки проб; проведения амплификации; для учета полученных результатов); отдельный комплект для каждого этапа реакции лабораторной одежды, автоматических пипеток; существование стандартных диагностических наборов и самое главное — наличие высококвалифицированных лабораторных сотрудников позволяет снизить уровень появления ложных результатов.
Первый стандартизированный набор для определения РНК ВГС («AmplicorTM HCV», «Roche Diagnostic Systems») изготовлен в 1993 году. За прошедшие годы наборы для выявления РНК ВГС прошли эволюцию, основной целью которой стало повышение их чувствительности и специфичности. При конструировании «Amplicor TM HCV» использовано несколько оригинальных методических приемов, позволяющих выявлять 100 и выше копий РНК ВГС в мл., а также бороться с возможными случаями контаминации образцов и растворов, применяемых в наборе. Использование фермента — амперазы и дезиксиуридинтрифосфата (dUTP) позволяет разрушать в первом цикле амплификации предшествующие апликоны, которыми могла произойти контаминация. Разрушение амперазы в конце первого цикла амплификации (при +55 С) не позволяет ферменту разрушать ампликоны, избранные в качестве мишени. Принципиальным новшеством стало введение внутреннего контроля. Смысл этого новшества заключается во введении в каждый исследуемый образец последовательности, подобной амплифицируемому участку РНК ВГС, которая в дальнейшем выявляется с помощью соответствующих праймеров в реакции амплификации в аналогичном режиме. Отсутствие позитивной реакции при выявлении внутреннего контроля свидетельствует о наличии ложнонегативного результата реакции на наличие РНК ВГС в исследуемом образце. Диагностикумом следующего поколения стал препарат, обозначенный — «HCV Amplicor 2,0», при использовании обладающий пределом чувствительностью 50 молекул РНК ВГС.
Систему выявления РНК ВГС при помощи наборов фирмы «Roche» нельзя рассматривать в отрыве от их приборного обеспечения, определяющего высокое качество тестирования. Разработчики метода стремились к полной автоматизации всех этапов реакции. Воплощением этой идеи стала система «COBASAmpliPrepTM», позволяющая полностью автоматизировать процесс выделения РНК ВГС, амплификации и детекции, тем самым уменьшить риск получения ложнопозитивных и ложнонегативных результатов, сохранив при этом высокую чувствительность и специфичность [41].
Лигазная цепная реакция выявления РНК BГC.(LCR). Метод основан на способности фермента «ДНК- зависимой ДНК-лигазы» сшивать (лигировать) разрывы фосфодиэфирной связи в ДНК в присутствии АТФ и ионов Mg 2+. Так же как и при проведении «классической» ПЦР для выявления РНК ВГС, первый этап LCR — обратная транскрипция с получением кДНК ВГС. Далее ДНК-лигаза осуществляет связывание двух пар праймеров (комплементарных 5′ некодированной зоне РНК ВГС), которые в дальнейшем амплифицируются. Детекция продуктов амплификации LCR осуществляется при помощи учета реакции антиген-антитело. Каждый из двух прайеров метится различным гаптеном. Первый из них захватывается антителами, адсорбированными на микрочастицах. После процедуры промывания при помощи второй пары антител, меченных флуоресцентной меткой, происходит их избирательное взаимодействие с гаптеном в амплификационном продукте с последующим проведением субстратной реакции и учетом на флюориметре.
Чувствительность этого метода составляет около 200 копий РНК ВГС в мл, что позволяет его использовать для решения различных клинико-диагностических задач [42]. В настоящее время диагностические наборы выявления РНК ВГС, основанные на LCR, изготовлены фирмой «Abbott».
Nucleic Acids Seaquencence Amplification — NASBA —метод детекции РНК ВГС основан на одновременном действии трех ферментов: обратной транскриптазы вируса миелобластомы птиц, РНК-азы Н и РНК-полимеразы Т7 [43.]. В отличие от RT PCR на первом этапе не проводится обратная транскрипция РНК ВГС. При помощи использованных ферментов удается получить более 10(9) копий участка кДНК ВГС в течение 90 минут [44]. Возможность проведения реакции при небольших температурах (+41 С) значительно упрощает работу и позволяет отказаться от оборудования, обеспечивающего циклические изменения высоких температур. Учет результатов реакции осуществляется при помощи электрохемилюминесценции. Несмотря на то, что по своей чувствительности NASBA близка к RT PCR, метод широко не используется для выявления РНК ВГС. В настоящее время проводится разработка варианта метода, сочетающего принципы проведения NASBA и «Real-time RT PCR».
Метод транскрипционно опосредованной амплификации (Transcription-mediated amplification — ТМА) отличается от ПЦР и LCR прежде всего тем, что непосредственно амплифицируются фрагменты РНК ВГС , а не кДНК ВГС. На начальном этапе реакции к РНК ВГС присоединяется праймер (№1) и с помощью фермента (обратной транскриптазы) синтезируется копия молекулы мишени — кДНК. Обратная транскриптаза, обладая также активностью РНКазы-Н, разрушает вирусную РНК в гибриде РНК-кДНК. Далее к молекуле кДНК присоединяется второй праймер с последующей достройкой двухцепочечной ДНК при помощи обратной транскриптазы. При помощи другого фермента -РНК-полимеразы происходит транскрипция РНК с кДНК, что приводит к образованию от 100 до 1000 копий ампликона РНК ВГС в одном цикле реакции. К этим РНК-апликонам присоединяется праймер № 2 с дальнейшим синтезом кДНК-копий и разрушением молекулы РНК. Присоединение праймера №1 на кДНК с последующей достройкой двухцепочечной ДНК запускает следующий цикл амплификации. Учет результатов реакции осуществляют на люменометре, так как образовавшиеся РНК-ампликоны специфически взаимодействуют с ДНК-зондами, меченными хемилюминафорами.
В качестве преимуществ ТМА-метода при выявление РНК ВГС отмечают:
Сравнительные исследования по детекции РНК ВГС при помощи ТМА и другими методами продемонстрировали высокий уровень совпадений результатов [45].
Сочетание принципов гибридизации и амплификации лежит в основе метода выявления РНК ВГС, обозначенного как «Метод гибридизации с использованием разветвленных зондов или Branched DNA assay (bDNA) [46]. В отличие от ПЦР в данном тесте осуществляется амплификация не молекул кДНК ВГС, а сигнала. Реакция проводится в 96 луночных планшетах, на которых адсорбированы фрагменты РНК ВГС из 5′ нетранслируемой зоны и core-гена РНК ВГС. За счет последующего связывания с синтетической молекулой разветвленной ДНК и гибридизацией с пробой, меченной щелочной фосфотазой с усилителем и последующей ферментативной реакцией достигается резкое увеличение полученного сигнала. В настоящее время на диагностическом рынке появились диагностикумы третьего поколения (Вауег 3.0 Hepati-tis С Virus RNA Quantitation by bRNА), обладающие чувствительностью, позволяющей выявлять 520 IU/ml (2500 копий РНК ВГС).
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ РНК ВГС. Для оценки концентрации РНК ВГС применяют количественный вариант ПЦР. Первоначально концентрацию РНК ВГС пытались охарактеризовать порядковыми величинами, например»+»,»++» и т.д., визуально отражающими интенсивность полос, полученных при электрофорезе продуктов амплификации, или же методом конечных разведений, т.е по наличию позитивного результата в конечной точке титрования. Трудности стандартизации всех этапов ПЦР не позволяют объективно оценить концентрацию РНК ВГС, что приводит к существенным ошибкам трактовки полученных результатов.
В настоящее время результаты исследования выражают в количественных единицах: количество копий РНК ВГС, содержащихся в 1 мл., в абсолютном или логарифметическом выражении (log 10). Исходя из того, что концентрация обнаруженной РНК ВГС отражает количество вирусных частиц, данный показатель обозначают как «вирусный эквивалент (eq)», с добавлением приставки k (килограмм, тысяча) или М (миллион). Еще одним способом выражения количества вирусных частиц являются их весовые эквиваленты. Например, в граммах или пикограммах (1 pg соответствует приблизительно 1 миллиону eq). Разнообразие применяемых величин создает трудности трактовки результатов, полученных в различных лабораториях. Поэтому комитет экспертов ВОЗ по биологической стандартизации изготовил «международный стандартный образец», содержащий РНК ВГС (лиофильновысушенная сыворотка крови, содержащая РНК ВГС 1-го генотипа), концентрация которой выражена в международных единицах (IU/mL) [47]. Специальные коэффициенты позволяют пересчитывать полученные показатели концентрации в международные единицы.
Для определения концентрации РНК ВГС применяют практически все варианты ПЦР. При этом к диагностическим препаратам предъявляется ряд специфических требований, важнейшим из которых является строгая линейность результатов, т.е. увеличение сигнала регистрируемой реакции при увеличении концентрации РНК ВГС в исследуемом образце. Применение внутренних стандартов с различным содержанием РНК ВГС позволяет избежать многих методических ошибок, которые могут отразиться на конечном результате реакции [28]. Чувствительность применяемых диагностикумов (Amplicor HCV Monitor v2.0; LCx HCV RNA Quantitative Assay) позволяет выявлять РНК ВГС, начиная с 50 копий в мл [48,49], что особенно важно для прогнозирования эффективности избранной противовирусной терапии.
ПЦР в реальном времени («Real-time RT PCR») —один из наиболее перспективных вариантов количественного метода выявления РНК ВГС. Метод и его аппаратное обеспечение совместно разработаны специалистами фирм «Roche» и «Percin Elmer». Принцип метода заключается в способности гидролизовать последовательности кДНК в направлении 5′—- 3′. В реакции применяется специальный зонд, меченный двумя флюоресцентными красителями, имеющими близкие максимумы поглощения и флюоресценции. При наличии продуктов амплификации Tag-полимераза расщепляет зонд, что приводит к предотвращению переноса энергии от одной молекулы красителя к другой, и тем самым предотвращает выход кванта света. Специальный прибор осуществляет учет реакции и математическое моделирование кинетики флюоресценции на каждом этапе реакции, что позволяет получить информацию об исходной концентрации РНК ВГС.
Отличительной особенностью «ПЦР в реальном времени» считают возможность получать информацию о наличии РНК ВГС непосредственно в процессе реакции, что позволяет уменьшить время анализа в сочетании с высокой чувствительностью и линейностью получаемых результатов [50]. По данным Татьяны Яшиной с соавторами, данный метод позволяет выявлять от 200 копий РНК ВГС в мл. [51].
МЕТОДЫ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ РНК ВГС. Определение принадлежности ВГС к определенному генотипу и субтипу нашло свое применение для решения не только чисто научных, но и практических вопросов. Например: поиск источника инфекции во время вспышек гепатита С или прогнозирование эффективности применяемой терапии.
«Золотой стандарт» генотипирования ВГС — непосредственное определение первичной структуры РНК ВГС с его последующим филогенетическим анализом [52], что позволяет четко охарактеризовать данный изолят вируса. Получить эту информацию возможно при использовании следующих вариантов секвенирования:
Несмотря на точность получаемого результата, метод непосредственного секвенирования не используется в практическом здравоохранении из-за технических сложностей проведения исследования и высокой стоимости работ. Вместе с тем наличие информации о первичной структуре РНК ВГС является референтным методом генотипирования, а наличие приборов для автоматического секвинирования упрощает получение результата.
В настоящее время в большинстве случаев для генотипирования РНК ВГС применяются методы, основанные на использовании ПЦР с типоспецифическими праймерами. Впервые генотипирование РНК ВГС проведено Н. Okamoto с соавторами в 1992 году при помощи RT-ПЦР [53], включающего два этапа амплификации. Первый из них проводился с универсальными, для всех генотипов ВГС, праймерами, второй со смесью типоспецифических праймеров с получением специфических продуктов амплификации различной длины. О наличии того или иного генотипа судили по размеру амплифицированного продукта. В качестве праймеров используются типоспецифические зонды, информация о которых расположена в 5’UTR, Core или NS5 — областях РНКВГС[54].
Гибридизация амплифицированных продуктов с адсорбированными геноспецифическими зондами (из 5′-нетранслируемой зоны РНК ВГС), адсорбированными на нитроцеллюлозной мембране, лежит в основе теста — обозначенного «INNO-LiPA HCV, INNO-GENETICS» [55]. Первоначально с помощью этого теста удавалось типировать генотипы: la; lb; 2a; 2b;3a; 3Ь; 4 и 5а. В дальнейшем тест-системы 2-го поколения «INNO-LiPA HCV II , INNOGENETICS» позволяют различать все 6 генотипов и дополнительно 2с; 2d; 2i; 3с; 4a-h; 6а и 10а. [56]
Методический арсенал определения генотипов ВГС не ограничивается вышеперечисленными способами и включает в себя разнообразные методы:
СЕРОТИПИРОВАНИЕ Анти-ВГС стало возможным благодаря исследованиям P.Simmonds с соавторами, установившим наличие антител, направленных к генотипспецифичным эпитопам, информация о которых кодирована NS4 зоной РНК ВГС [60]. При помощи диагностикума для ИФА, сконструированного на основе синтетических пептидов, удалось разграничить случаи гепатита С, вызванные вирусами 1, 2 и 3 генотипа (89% совпадения с результатами генотипирования). Разработка тестсистем с использованием синтетических и рекомбинантных антигенов, кодированных NS4 и Core зонами РНК ВГС, позволила расширить перечень типируемых вариантов вируса, а также судить о наличии подтипов (1а, lb, 2a, 2Ь, За, и 4а) [61,62]. В настоящее время осуществляется коммерческий выпуск диагностических препаратов для проведения серотипирования как в плашечном варианте проведения ИФА — «Мurех НС 1-6 Serotyping Assay, Murex Diagnostics», так и в варианте «иммуноблот» — RIBA HCV Serotyping Assay, Chiron Diagnostics. Сравнительные данные результатов серотипирования и генотипирования РНК ВГС продемонстрировали высокий уровень совпадения результатов, достигая 95% [62].
Серотипирование анти- ВГС по сравнению с генотипированием РНК ВГС обладает такими преимуществами, как простота проведения реакции и более низкая стоимость. Вместе с тем, этот метод ни в коем случае не может заменить генотипирование. Результаты серотипирования анти-ВГС свидетельствуют о типовой принадлежности анти-ВГС при текущей или ранее перенесенной инфекции. В некоторых случаях (наиболее часто у больных гемофилией) регистрируется одновременное выявление анти-ВГС различных подтипов, что может свидетельствовать о множественном инфицировании различными субтипами и генотипами ВГС [63]. Кроме того, у пациентов с гепатитом С на фоне выраженного иммунодефицитного состояния РНК могут быть единственным маркером, что делает невозможным проведение серотипирования.
ВЫЯВЛЕНИЕ и ТРАКТОВКА РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕСТИРОВАНИЯ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ВГС-ИНФЕКЦИИ. Наличие широкого спектра серологических маркеров текущей или предшествующей ВГС инфекции, а также современная методологическая база позволяют решить многие задачи лабораторной диагностики и профилактики гепатита С. В таблице № 2 представлены серологические маркеры ВГС инфекции и наиболее важные направления их тестирования.
Таблица 2
Диагностическая значимость маркеров текущей или предшествующей ВГС инфекции
Подтвер-
ждение
результата
+ анти-ВГС
Одной из главных задач лабораторной диагностики гепатита С является постановка диагноза и разграничение острого от хронического гепатита С при помощи выявления серологических маркеров инфицирования. Так же как и при других острых вирусных гепатитах, серологические маркеры инфицирования ВГС последовательно появляются и исчезают по ходу инфекции и процесса выздоровления (Рисунок 2).
РНК ВГС удается обнаружить на 7 — 21-й день после инфицирования ВГС, а анти-ВГС на 20 — 150-й день (в среднем 50-й день) [64]. Спектр анти-ВГС может различаться в зависимости от периода острого гепатита. Считается, что первыми удается определить антитела, кодированные Core и NS5 зоной РНК ВГС. Анти-ВГС к белкам, кодированным NS4 зоной, в острую фазу гепатита С отсутствуют [65]. Сравнительное изучение уровня концентраций анти-ВГС, спектра анти-ВГС и РНК ВГС у больных острым и хроническим гепатитом продемонстрировало некоторые различия [66]. На наш взгляд, эти различия могут быть связаны с индивидуальными особенностями инфекционного процесса, что снижает их диагностическую ценность.
Рис. 2. Острый гепатит С 
По аналогии с лабораторной диагностикой гепатита А и В ожидали, что определение антител к ВГС класса IgM будут иметь столь же большое диагностическое значение как IgM анти-ВГА и IgM анти-НВс. Однако данные тестирования сывороток крови больных острым и хроническим гепатитом С на наличие IgM анти-ВГС указывают на частое их выявление среди этих больных — 50-93% и 50-70% соответственно [67,68], эти результаты свидетельствуют, что обнаружение IgM анти-ВГС не может быть использовано как маркер острой ВГС инфекции.
Отсутствие маркера, претендующего на роль «золотого» стандарта острого гепатита С, определяет необходимость комплексной оценки полученных результатов, основанных на динамическом наблюдении за пациентом.
Не менее важное направление использования высокочувствительных методов тестирования РНК ВГС — снижение риска развития посттрансфузионного гепатита С. Необходимость таких работ определяется наличием фазы «окна», т.е. временем между первым обнаружением РНК ВГС и появлением анти-ВГС , а также существованием доноров крови (больных хроническим гепатитом С), у которых имеются РНК ВГС при отсутствии анти-ВГС. Современная система контроля донорской крови на наличие ВГС включает только тестирование анти-ВГС, риск заражения гепатитом С сохраняется. Исходя из этого правомерна постановка вопроса о тестировании крови на наличие РНК ВГС современными методами (методы NAT — «nucleic acid amplification test»). Фактор, ограничивающий эту работу, — высокая цена исследований. Для сокращения затрат рекомендуется тестирование пулов сывороток крови (от 8 до 96 образцов) с последующим поиском позитивного образца в случае выявления РНК ВГС в пуле сывороток. Учитывая фактор разведения искомой РНК ВГС при пулировании сывороток крови, принципиальным становится вопрос о применении наиболее чувствительных методов детекции. Считается, что использование диагностических наборов для NAT — с чувствительностью 50-100 IU/mL позволяет значительно уменьшить риск посттрансфузионного гепатита С.
Несомненно, перечень вопросов, которые можно решить при тестировании всего спектра маркеров ВГС-инфекции, не исчерпывается этими двумя направлениями. Наличие современных методов тестирования в совокупности со знанием их возможностей открывает широкие перспективы научных и прикладных работ по гепатиту С.
источник