Диссертация по вирусному гепатиту с

ВИНОГРАДОВА Елена Николаевна

Вирусные гепатиты В и С (проблемы диагностики и терапии)

14.00.10 — инфекционные болезни

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Работа выполнена в Специализированной клинике вирусных инфекций

А. А. Яковлев доктор медицинских наук, профессор,

О. И. Киселев доктор биологических наук. Официальные оппоненты:

Академик МАН ЭБ, член-корр. РАЕН, доктор медицинских наук, профессор Ю. В. Лобзин,

Академик МАН ЭБ, заслуженный деятель науки , доктор медицинских наук, профессор Н. М. Грачева,

член-корр. РАМН, заслуженный деятель науки, доктор

медицинских наук, профессор

Ведущая организация — Российский государственный медицинский Университет.

Защита состоится » _ 1997 г. в часов на

заседании диссертационного совета Д 074. 16.05 по защите докторских диссертаций при Санкт-Петербургской Медицинской Академии последипломного образования (193015, Санкт-Петербург, ул. Салтыкова-Щедрина, 41).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Академии.

Автореферат разослан «_» _ 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, к.м.н., доцент

Вирусные гепатиты В и С, занимая лидирующее место в группе заболеваний вирусной этиологии, имеют повсеместное распространение, вызывая в некоторых случаях пожизненное хроническое течение болезни. На современном этапе установлена не только высокая заболеваемость вирусными гепатитами, представляющими угрозу развитию общества, но и их четкая связь с онкологическими заболеваниями, с гепатоцеллюлярной карциномой (Покровский В.И., 1996; Шувалова Е.П., 1996).

В последние годы спектр вирусов, вызывающих гепатит, увеличился благодаря открытию вирусов гепатита G и F, а также других вирусов, ожидающих своего изучения (Соринсон С.Н., 1996; Deka N. et al., 1994; Kirn J. et a. 1995; Simmonds J. ei al., 1995).

Во многих странах, в том числе развивающихся, по-прежнему регистрируется на высоком уровне вирусный гепатит А, а с учетом накопления нсиммун-ных лиц среди населения развитых стран гепатит А и для них представляет серьезную проблему как «экзотическая», в основном импортируемая инфекция, с возможными эпидемическими вспышками в условиях «открытых» границ и широкой миграции населения (Балаян М.С., Каретный Ю.В., 1987; Балаян М.С., 1995; Лобзин Ю.В., 1996). Возможное развитие тяжелых и затяжных форм гепатита А требует изучения с учетом новых сведений об этиологии вирусных гепатитов и увеличения возможности их диагностики. Еще более серьезную проблему представляют гепатиты В, С, D, повсеместное распространение которых не способна приостановить даже вакцинация против гепатита В, введенная в календарь профилактических прививок многих стран мира (Шахгильдян И.В., 1994; Лучшее В.И., 1994, Шляхтенко Л.И., 1994; Ивашкин В.Т. и соавт., 1995). По данным ВОЗ, в мире насчитывается более 300 млн. носителей HBV, широко распространена HCV инфекция.

Большую актуальность в последние годы приобрели вирусные гепатиты микст, вызываемые двумя или тремя гепатотропными вирусами, регистрирующиеся нередко у лиц с насыщенным парентеральным анамнезом, в том числе у инъекционных наркоманов, а также у лиц, злоупотребляющих алкоголем, оказывающим повреждающее действие на печень (Дунаевский О.А. и соавт., 1995; Логинов А.С., 1995; Рахманова А.Г. и соавт., 1995, 1996).

Накопившиеся новые данные в связи с внедрением молекулярнобиологи-ческих методов диагностики позволили выделить HBeAg негативный мутант HBV, что затрудш ло подтверждение гепатита вирусной В этиологии и выделение репликативных форм болезни (Михайлов М.И., 1990; Zanetti et al., 1988; Liang Т. etal., 1991).

Большие сложности вызывает диагностика гепатита С, ибо в широкой клинической практике используется преимущественно определение суммарных антител к HCV, позднее появление которых, а также возможность их наличия у реконвалесцентов заболевания не позволяет осуществлять выявление больных в начальных стадиях болезни и решать вопросы важной этиологической

значимости (Мукомолов C.J1. и соавт., 1994; Сологуб Т.В. и соавт., 1995; Stevens S. et al., 1990).

Возникают большие затруднения в лечении больных с затяжными и хроническими формами вирусных гепатитов. Традиционно используемые стандартные средства патогенетической терапии недостаточно эффективны при прогрессирующих тяжелых и хронических формах болезни (Змызгова А.В. и соавт., 1990, 1996; Грачева Н.М. и соавт., 1993; Корочкина О.В., 1993; Hoofnagle J., 1989, 1993). Новейшими исследованиями установлено значение выявления РНК HCV и ДНК HBV в сыворотке крови для диагностики и назначения средств этиотропной терапии, а также оценки их результативности (Bogard М. et al., 1997; Fearon М. et al., 1997).

Вышеизложенное определяет актуальность дальнейших исследований по проблеме диагностики и терапии вирусных гепатитов.

На основе молекулярнобиологических методов исследования определить критерии диагностики моно- и микст вирусных гепатитов В и С и усовершенствовать тактику их комплексной терапии.

1. Определить клинико-диагностическое значение выявления ДНК и РНК вирусов гепатитов В и С в сыворотке крови методом полимеразной цепной реакции.

2. Определить генотипы вируса гепатита С, циркулирующие в Санкт-Петербурге, при различных формах заболевания.

3. Уточнить значение вирусов гепатитов В и С в развитии затяжных и тяжелых форм болезни у больных с вирусным гепатитом А.

4. Сопоставить при прогрессирующих тяжелых и хронических формах вирусных гепатитов клинико-морфологические данные с результатами серологического и вирусологического обследования больных.

5. Охарактеризовать механизмы реагирования иммунной системы больных вирусными гепатитами В и С с учетом наличия репликативной активности вирусов и применения противовирусных препаратов в комплексной терапии заболеваний.

Положения, выносимые на защиту

При вирусных гепатитах В и С установлено клинико-патогенетическое значение репликативной активности вирусов. Комплексными клинико-серо-логическими и молекулнрно-билогичсскими методами исследования показано значение детекции геномов HBV. HCV, HDV в полимеразной цепной реакции (ПЦР) Д-1Я диагностики вирусных гепатитов и оценки эффективности спосо-

бов терапии заболевания. Результаты ПЦР позволяли подтверждать вирусную этиологию гепатитов у больных с отсутствием антигенов и антител в И ФА с использованием высокочувствительных тест-систем.

Определение генотипов НСУ в Санкт-Петербурге выявило преобладание генотипов вируса 1Ь и 2а (56,1% и 17,1% соответственно), реже выявлялись генотипы 1а, За (14,6 и 7,4%), — в 4,8% выявлены одновременно два генотипа 1Ь и За. Высказывается положение о зависимости наличия в регионе преимущественно среднетяжелых форм гепатита С во взаимосвязи с генотипами НСУ.

Показана возможность и значение одновременной репликации ИВУ, НСУ и НЭУ и установлено ее значение в развитии прогрессирующих тяжелых и/или хронических форм болезни. Сопоставление клинико-лабораторных данных с результатами аутопсий и гистоморфологических исследовании печени позволяет обсуждать положение о значении микст-репликации НВУ, НСУ и НОУ как основной причины смертельных исходов у больных хроническими гепатитами, в том числе в циррогической стадии.

Обосновывается положение о взаимосвязи репликации НВУ НСУ с характером клинического течения вирусного гепатита А и хронических вирусных гепатитов В и С. Тяжелые формы гепатита А развиваются у больных с хроническими репликативнымн формами гепатитов В и С и микст-гепатитами В, С и При субклинических формах вирусных гепатитов В и С НАУ может способствовать репликации НВУ и НСУ, вызывая манифестацию хронических форм болезни разной степени тяжести. Серологическими исследопа-ниями установлено, что затяжное течение гепатита А и обострение болезни у реконвалесцентов может быть обусловлено герпес-вирусами, выявление которых определяет адекватность терапевтической тактики.

На основании изучения комплекса показателей иммунной защиты организма, клеточного и гуморального иммунитета обосновывается положение о зависимости степени их изменений от микст-репликации НВУ, НСУ. У больных с микст-репликацией НВУ и НСУ была достоверно снижена поглотительная и метаболическая активность лейкоцитов и уровень циркулирующих иммунных комплексов. Недостаточное формирование иммунных комплексов, изменения в макрофагальном звене иммунитета, низкий уровень Т-хелперов и, в особенности, В-лимфоцитов отражали наиболее существенные нарушения в иммунном статусе у больных с микст репликацией.

Обосновывается положение о терапевтической эффективности при гепатитах В и С противовирусных и иммуномодулиругощих препаратов (ази-дотимидина, рекомбинантного интерферона) преимущественно при затяжных прогредиентных формах болезни и, в меньшей степени, при хронических гепатитах.

По клинико-лабораторным данным в работе показано, что применение с лечебной целью коммерческой рекомбинантной вакцины против гепатита В при хроническом моногепатите В со слабо выраженной активностью не сопровождается побочными эффектами, а у 2/3 больных способствует исчезновению репликации НВУ, на основании чего выдвигается положение о том,

что вакцина является препаратом выоора в комплексном лечении больных хроническим вирусным гепатитом В.

Установлены патогенетические закономерности развития тяжелых, прогрессирующих затяжных и хронических форм вирусных гепатитов В и С. Внедрение молекулярнобиологических методов диагностики привело к появлению нового патогенетического критерия — репликативной активности вирусов, которая является основой для суждения о прогрессии болезни и оценки эффективности методов терапии.

Впервые установлены факты, характеризующие тяжесть современного течения вирусных гепатитов. Показано значение сочетанной репликации HBV, HCV и HDV в развитии прогрессирующих хронических форм болезни. Установлено, что репликативные формы гепатитов В и С, моно- и микст-, при суперинфекции HAV приобретают тяжелое течение болезни.

Охарактеризованы особенности клинического течения острых и хронических вирусных гепатитов моно- и микст, впервые выделены циркулирующие в Санкт-Петербурге генотипы вирусов гепатита С и показана их взаимосвязь с тяжестью заболевания. Впервые определено значение репликативной активности IIDV, выявляемой в ПЦР для прогрессирующего течения хронического гепатита С. Новыми являются данные о высокой частоте неманифестных форм моногепатита В у лиц с насыщенным парентеральным анамнезом, завершающиеся выработкой протективных антител.

Показано, что изменения иммунологической реактивности отражают характер течения вирусных гепатитов, а возникающие иммунорегуляторные нарушения являются важным звеном патогенеза репликативных форм вирусных гепатитов. Дисбаланс, выявляемый в интерфероновом статусе организма, снижение функциональной и метаболической активности, сокращение численности популяций CD4 Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, повышение уровня естественных киллеров и HLA DR клеток (при микст-инфекции) выражаются прогрессирующим течением гепатита и свидетельствуют о нарушении гомеос-тагической функции иммунной системы.

Впервые по клинико-иммунологическим данным показана терапевтическая эффективность азидотимидина при остром гепатите С. Установлено, что у большинства больных после завершения курса лечения прекращается репликация HCV, что подтверждено результатами отдаленных наблюдений рекон-валесцентов.

В дополнение и развитие данных литературы по результатам определения комплекса клинико-вирусологических показателей и интерферонового статуса организма уточнены показания к назначению рекомбинантных интерферо-нов при вирусных гепатитах и коммерческой рекомбинантной вакцины против гепатита В.

Внедрение молекулярно-биологических методов диагностики привело к существенному улучшению этиологической расшифровки вирусных гепатитов.

Выявленное значение моно- и микст инфекции в развитии различных форм тяжести острого и хронического гепатита позволяет более обоснованно сузить о степени выраженности и характере иммунопатологических состоянии у больных вирусными гепатитами с индивидуализацией показаний к их комп-нексной терапии.

Данные о распределении генотипов IICV, циркулирующих в Санкт-Петербурге, должны быть учтены для изучения клинических форм болезни, создания банка данных типирования вирусов и назначения комплексной противовирусной терапии.

Установлена терапевтическая эффективность азидотимидина и рекомбп-нантного интерферона при затяжных гепатитах В и С, определены схемы лечения с конкретизацией доз препаратов и длительности курса терапии.

Установлена зависимость терапевтической эффективности интерферона у больных гепатитом В от интерферонового статуса и чувствительности имму-нокомпетентных клеток к препарату, что указывает на необходимость их определения в клинической практике. Установлена терапевтическая эффективность комплексной терапии, включающей одновременное назначение интерферона и азидотимидина при хронических репликативных моно- и микст-гепатитах В и С. Впервые показана эффективность использования вакцинотерапии при хроническом вирусном гепатите В.

Апробация и внедрение результатов работы

Материалы диссертации обсуждались на проблемной комиссии «Инфекционные болезни» Медицинской академии последипломного образования (1995, 1996).

Фрагменты работы доложены: на XVII Всемирной конференции терапевтических обществ «»Санкт-Петербург, сентябрь 1996), на Международном симпозиуме «Клиническая медицина» (Калининград, май 1996.), на сателлитном симпозиуме «Противовирусная терапия» (октябрь 1996), на Юбилейной Всероссийской конференции, посвященной 100-летию первой кафедры инфекционных болезней Военно-Медицинской академии (октябрь 1996 г.), на обществе терапевтов им. С.П.Боткина (Санкт-Петербург, февраль 1997).

Результаты работы представлены в виде стендовых докладов на Международной коференции «Прогресс в клинической вирусологии» (Стокгольм, 1994), на IV Международной конференции по ведущим тенденциям в диагностике и лечении хронических вирусных гепатитов (Перуджа, Италия, 1995), на Международной конференции «Прогресс в клинической вирусологии» (Прага, 1995), на IX Международном симпозиуме по вирусным гепатитам и заболеваниям печени (Рим, 1996), на VII Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиоло-

гов и паразитологов (Москва, январ1» 1997 г.), на конференции инфекционис тов Германии (Берлин, март 1997), на Российском национальном конгресс« «Человек и лекарства» (Москва, апрель 1997).

По материалам диссертации опубликовано 59 печатных работ, в том числе главы в «Руководстве для врачей общей практики».

Результаты диссертационной работы внедрены в практическую работ> городской клинической больницы г. Якутска Республики Саха, госпитале в/ч 63784, городской клинической больнице №1 г. Калининграда, городской инфекционной больницы № 30 им. С.П. Боткина (Санкт-Петербург).

Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедрах инфекционных болезней Медицинской академии последипломного образования, Санкт-Петербургской Медицинской академии им. Мечникова, Калининградского университета, Якутского Медицинского института, Университета Республики Саха.

По материалам диссертации составлены «Информационное письмо по диагностике вирусного гепатита С», рекомендации для врачей «Хронический вирусный гепатит».

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 315 стр. машинописи, включает введение, заключение и 5 глав. Обзор литературы составлен на основании анализа 154 источников на русском языке и 298 на иностранных. Таблиц в диссертации 76, рисунков 21.

Материалы и методы исследований

Работа выполнена в специализированной клинике вирусных инфекций НИИ гриппа РАМН (директор д.б.н. О.И. Киселев). Необходимые данные официальной статистики были получены в Центре Госсанэпиднадзора (зав. эпидотделом О.В. Парков, ведущий городской эпидемиолог по проблеме вирусных гепатитов Л.Н. Крыга). В работе использованы также данные больных инфекционной больницы № 30 им. С.П. Боткина (главный врач д.м.н., проф. A.A. Яковлев).

Клиническое течение вирусных гепатитов было изучено у 4570 больных, из них с острыми вирусными гепатитами 3312: гепатит А (ГА) — 1887, гепатит В (ГВ) — 824, гепатитом С (ГС) — 183, гепатитами микст этиологии — 401, невери-фицированной этиологии — 7 больных.

С хроническими вирусными гепатитами наблюдалось 1258 больных в том числе: с хроническим гепатитрм В (ХГВ) — 251, хроническим гепатитом С (ХГС) — 270, хроническим гепатитом микст этиологии (ХВГ) — 713 и ^верифицированной этиологии — 18 больных.

С целью выявления субклинических форм гепатитов В и С обследовано 1248 лип с насыщенным парентеральным анамнезом для решения вопросов последующей их иакцннации против гепатит;! В.

Наблюдения за больными включали кроме клинического обследования, оценку гемограмм, результатов определения уровня билирубина, активности аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ), гаммаг-лютаминтранспептидазы (ГГТП), 5-нуклеотидазы (5-НУК), щелочной фосфо-тазы (ЩФ), вычислялся альбумино-гаммаглобулиновый коэффициент, определялись при необходимости и другие общепринятые биохимические показатели. При острых гепатитах оценка тяжести заболевания проводилась согласно приказу МЗ СССР №408 от 12 июля 1989 г., при хронических гепатитах -по международной классификации 1994 года.

Лабораторная верификация вирусных гепатитов А, В, С, D, Е проводилась путем определения в ИФА специфических серологических маркеров анти-HAV IgM, определения HBsAg и его концентрации и анти-HBs, а также HBeAg и анти НВе, анти HBcIgG и анти HBcIgM, анти HCV IgG, ainи IICV IgM, анти HDV IgG, анти HDV IgM, анти HEV, анти CMV IgM и IgG.

Использовались отечественные (НПО «Аквапаст» и АО «Вектор») и импортные («Ордженикс», «Лабсистемс») тест-системы. Наряду с серологическими проводились молекулярно-биологические исследования в лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии (зав. лаб. М. П. Грудинин), для выявления в образцах крови специфических участков вирусного генома с использованием полимеразной цепной реакции. Обследовано 1491 больной (всего 2500 исследований).

Генотипирование гепатита С проводили с использованием коммерческого набора «INNO — LIPA HCV П»( Innogenetics N.V., Belgium) и метода, разработанного в лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии НИИ гриппа РАМН, основанного на полиморфизме длин рестринированных фрагментов (restricton length fragments poliphmorphysm — RLFP) амплифицирован-ных последовательностей HCV.

Результаты ПЦР и серологических исследований оценивали полуколичественно, в зависимости от степени выраженности.

Иммунологические исследования были проведены у 178 больного в динамике (всего 2030 исследований) и включали определение показателей иммунной защиты организма: функциональной активности фагоцитов крови по их поглотительной и метаболической активности (по спонтанному и нагрузочному НСТ тесту с использованием частиц латекса), определялось процентное содержание фагоцитирующих клеток, реакция торможения миграции лимфоцитов (РТМЛ), спонтанная и индуцированная конконвалином, ЦИК. В цитотоксическом тесте с использованием моноклональных антител определялись В-лимфоциты, Т-лим-фоциты и их субпопуляции CD2, CD3, CD4, CD8, их низкодифференцирован-ные предшественники клетки с «двойными знаками» CD4+CD8- и CD4-CD8+, клетки с маркерами CD 16 — естественные киллеры и один из показателей главного комплекса гистосовместимости — IILA DR. Эти исследования проведены в лаборатории иммунологии клиники (зав. лаб. к.м.н. З.Н. Кннго).

Интерфероновый статус организма оценивался по содержанию общего сывороточного интерферона (ИФ) в циркулирующей крови и способности лейко-

цитов продуцировать при индукции к л вирусом Ныо-Кастла или фитогемаглю-тинином ИФ a/ß и ИФ у по модифицированной методике Г.А. Кондратьева и соавт. (1988). Эти исследования проведены совместно сР.Ю. Ариненко.

Чувствительность иммунокомпетентных клеток к ИФ определяли по от-ношению.миграции лейкоцитов после инкубации их с ИФ в сравнении со стандартным митогеном конконвалином в РТМЛ. Определение в динамике содержания в сыворотке крови антиинтерфероновых антител проводилось в РИГА.

Терапевтическую эффективность противовирусных препаратов, синтетических аналогов нуклеозидов (азидотимидин) и рекомбинантного интерферона оценивали с учетом правил и направлений GCP с использованием протоколов клинических исследований «слепым» открытым методом. Статистическую обработку результатов проводили на персональном компьютере IBM/PC АТ’486 с использованием программ Microsoft Exel и Stat Graph.

Результаты собственных исследований

Изучение официальных материалов регистрации вирусных гепатитов за последние 4 года позволили установить, что заболеваемость вирусными гепатитами в Санкт-Петербурге по мере введения в практику выявления специфических маркеров для диагностики всех регистрируемых случаев гепатита А и гепатита С стала изменяться в своих соотношениях. Так, при суммарной заболеваемости вирусными гепатитами на 100 000 населения 232,7 в 1994, 189,8 в 1995 и 139,7 в 1996 году удельный вес гепатитов В и С составлял 48,7, 38,7,32,4 и 10,5, 14,5 и 16,3 соответственно. Снижение общей заболеваемости было обусловлено преимущественно гепатитом А (со 178 до 89,2 на 100.000 населения города). Следует отметить, что выявляемость гепатита С ежегодно, несмотря на снижение общей заболеваемости вирусными гепатитами, возрастала: с ?0,5 на 100.000 населения в 1994 году до 16,3 в 1996 году, что в определенной мере отражает увеличение диагностических возможностей. Аналогичная ситуация была выявлена в наших наблюдениях.

При обследовании более чем 800 сывороток крови больных с диагнозом направления вирусный гепатит А в эпидемический сезон заболевания (август — ноябрь) выявлен лишь один больной с гепатитом Е по результатам ИФА с анти HEV. Больной прибыл из Средней Азии, заболевание протекало в сред-нетяжелой форме с благоприятным отдаленным исходом. Эти данные г.озво-ляют считать, что гепатит Е не характерен для нашего региона.

Изучение совокупности серологических маркеров у больных с вирусным гепатитом А, подтвержденным эпидемиологически и выявлением IgM анти HAV позволило установить, что вирусный гепатит А выявлялся из 2000 — 2200 больных, ежегодно лечившихся в клинике, у 50 — 65% больных.

Целенаправленное изучение клиники и исходов гепатита А у 733 больных позволило выявить у 521 больного характерное циклическое течение болезни: у 54% больных заболевание протекало в легкой, а у 46% — в форме’ средней тяжести.

Затяжное течение гепатита А наблюдалось у 212 из 733 целенаправленно >бследованных больных (28,9%). Из них у 47 больных установлена коинфек-;ия с гепатитами В и С, у 143 — суперинфекция HAV при хронических гепатитах В и С, а у 22 больных с затяжным течением гепатита А выявлена цнтоме-«аловирусная инфекция. Клинико-биохпмические, серологические данные, а гакже данные ПЦР, а при необходимости биопсии печени позволили выде-ипъ у 47 больных коинфекцию ГА+ГВ — 15 больных, ГА+ГС — 20 больных, ГА+ГВ+ГС — 12 больных. Из этих 47 больных 28 были инъекционными наркоманами, остальным проводились парентеральные вмешательства за 2-3 месяца до настоящего заболевания. Клинически у этих больных отмечалось двух-золновое течение заболевания с повторным повышением уровня билирубина и активности AJIT, что обуславливало затяжное течение болезни с последующим развитием хронического гепатита у 8 из 15 с ГВ, у 5 из 8 обследованных с ГС и у 6 из 12 больных с тройной коинфекцией (ГА+ГВ+ГС).

Среднетяжелые формы ГА при коинфекции с ГВ и ГС отмечены у 27 из 47 больных (57,4%), в то время как при моно ГА — у 46% больных. Хронические формы заболевания развились у 19 больных из 35 обследованных (54,2%). Исключить хронический гепатит В и С в дебюте заболевания было сложно, однако по клиническим и эпидемиологическим данным, а также по результатам серологических данных с использованием ПЦР следовало предполагать наличие микст острого гепатита В, С и гепатита А.

Вирусный гепатит А при хроническом гепатите В наблюдался у 80 больных, хроническом гепатите С у 36 больных, хроническом гепатите В+С у 27 больных. При этом отмечено, что среднетяжелые формы суммарно наблюдались у 47 больных (32,8%), а тяжелые формы у 27 больных (18,8%). Наиболее часто тяжелые формы регистрировались у больных с гепатитом А и хроническим гепатитом микст В и С (29,6%) и у больных с гепатитом А и хроническим гепатитом В (18,7%).

У 22 больных причиной затяжного течения ГА можно считать развитие цитомегаловирусной (ЦМВ) инфекции, у которых в период затяжной рекон-валесценции были выявлены специфические антитела класса IgM. Течение заболевания имело бтагоприятный характер, вероятно, в следствие назначения фамвира (0,750-1,0 г в сутки), спустя 3 месяца от начала заболевания отмечена нормализация клинико-биохимнческих показателей и сероконверсня анти IgM ЦМВ на анти IgG ЦМВ.

Результаты изучения циркуляции HBV и HCV у населения Санкт-Петербурга было проведено с целью выявления их у медицинских работников отделений гемодиализа, хирургии, лабораторий и сотрудников инфекционного стационара. Нами обследовано 1248 человек, в том числе 774 -сотрудники отделений гемодиализа и хирургии, 342 — отделения по пересадке костного мозга, 75 лаборантов, 37 санитарок и 20 административных работников. У них определялись анти-HBs, HBsAg, анти НВс суммарные и содержание общих анти HCV в целях последующей иммунизации против гепатита В.

При этом наиболее высокий уровень субклинических форм вирусных гепатитов преимущественно HBV этиологии выявлен у персонала отделений хирургии и гемодиализа — 58,7±1,6 и отделений по пересадке костного мозга -84,6±1,9.

Анализ распределения лиц с маркерами HBV в зависимости от стажа работы и возраста обследуемых выявил следующие закономерности. У лиц молодого возраста, 19-20 лет, со стажем работы 1-2 года HBsAg выявлен у лаборантов в 7,3%, у врачей — в 3,8%, в то время как у лиц в возрасте 31-49 лет HBsAg выявлен в 1,3%, а анти HBs и анти НВс — в 40,2 и 71,9% соответственно.

Определение содержания анти HBs выявило наличие их в защитной дозе (10-15 ME/мл) у 26,8% врачей отделений гемодиализа и хирургии и в 31,3% — у медсестер.

Результаты определения общих анти HCV у медицинских работников показало их наличие у сотрудников хирургических отделений в 5 раз реже, чем HBV, у 12-20% из 1820 обследуемых. Вместе с тем РНК HCV по данным ПЦР обнаружена у 7 из 10 лиц с общими анти-HCV при отсутствии каких-либо кли-нико-биохимических проявлений болезни. Эти данные позволяют считать, что в отличии от гепатита В, при котором возможно благоприятное течение субклинических форм болезни с формированием у 1/3 больных протективного иммунитета, гепатит С является более агрессивным заболеванием. Наличие виремии у практически здоровых лиц с анти-HCV свидетельствует о необходимости диспансеризации с тщательным обследованием «носителей» антител к HCV. Это важно в особенности-с учетом данных литературы о преимущественно иеманифестном и медленно прогрессирующим течением этого «коварного» заболевания с выявлением его лишь в цирротической стадии, нередко при суперинфекции другими гепатотропными вирусами (Linnen J. et al., 1996).

Результаты наших исследований о высокой частоте инфицирования HBV медицинских работников подтверждают данные литературы (Ивашкин В.Т. и соавт., 1993; Шахгильдян И.В. и соавт., 1994; Нечаев В.В. и соавт., 1995; Огарков И.И., 1996). В дополнении к ним нами установлена частота выявления анти-HBs в защитной дозе при клинически не регистрируемых формах заболевания. Показана также частота обнаружения анти-HCV у лиц с высоким риском парентерального инфицирования.

Для определения значения в комплексной клинико-лабораторной диагностики вирусных гепатитов были использованы результаты детекции ДНК HBV и РНК HCV полуколичественным методом ПЦР в сопоставлении с серологическими маркерами, выявленными в ИФА. Обследовано 1491 больной с использованием ПЦР в динамике заболевания. При этом мы выделили 487 больных с моно и микст репликативными формами гепатита В и С.

Из 195 больных ¡05 больных были с монорепликативным вирусным гепатитом В, а у 90 больных с рсшшкативным гепатитом В были одновременно обнаружены антитела к HCV.

Оценка значения серологических маркеров в диагностике HBV-инфекции проводилась путем сопоставления клипико-биохпмпческих, анамнестических

и эпидемиологических данных с результатами количественного определения HBsAg, HBeAg, анти-НВе, анти-НВс IgM и IgG, с наличием ДНК HBV, определяемой в ГЩР.

источник

Клинико-вирусологические варианты течения хронических вирусных гепатитов и персонифицированная противовирусная терапия

Наталья Ивановна

КЛИНИКО-ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ВАРИАНТЫ ТЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКИХ ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТОВ И ПЕРСОНИФИЦИРОВАННАЯ ПРОТИВОВИРУСНАЯ ТЕРАПИЯ

14.01.09. — инфекционные болезни

диссертации на соискание учёной степени

Работа выполнена в ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных

энцефалитов имени М.П. Чумакова» РАМН

Научные консультанты:

Доктор медицинских наук, профессор Л.Ю. Ильченко

Член-корреспондент РАМН, доктор медицинских

наук, профессор М.И. Михайлов

Официальные оппоненты:

Сторожаков Г.И. доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН,

Президент ГБОУ ВПО «Российский национальный

исследовательский медицинский университет имени Н.И.

Пирогова», заведующий кафедрой госпитальной терапии №2

Беляева Н.М. доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ДПО

заведующая кафедрой инфекционных болезней

Климова Е.А. доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО

«Московский государственный медико-стоматологический

университет имени А.И. Евдокимова»,

профессор кафедры инфекционных болезней

Ведущая организация – ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России

Защита диссертации состоится «27» декабря 2012 г. в «10-00» часов на заседании диссертационного совета Д 208.071.02 при ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава России (123995, Москва, ул. Баррикадная, д.2/1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава России (123445, Москва, ул. Беломорская, д.19)

Автореферат разослан « 15 » ноября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор В.Я. Кицак

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Появление новых методов вирусологической диагностики в конце XX века позволило доказать единую природу острых и хронических вирусных гепатитов, представляющих собой фазы общего инфекционного процесса. Стало очевидным, что инфицирование гепатотропными вирусами является одной из основных причин хронических заболеваний печени, которые остаются важной медико-социальной проблемой здравоохранения [Соринсон С.Н., 1998]. Высокий уровень заболеваемости вирусными гепатитами, их хрониогенный потенциал с возможным исходом в цирроз и первичный рак печени, частое поражение лиц молодого возраста определяют актуальность и важность дальнейшего изучения этой проблемы.

По данным ВОЗ почти треть населения земного шара (2 млрд. человек) имели контакт с вирусом гепатита В (ВГВ), из них у 400 млн. человек HBV-инфекция приобретает хроническое течение [Абдурахманов Д.Т., 2010, Ghendon YZ., 1993]. Ежегодно от заболеваний, связанных с ВГВ, умирает 1 млн. человек, при этом HBV-инфекция занимает 10 место среди всех причин смерти. Естественное течение HBV-инфекции зависит от особенностей иммунного ответа организма и влияния таких факторов, как генетическая вариабельность вируса, иммуносупрессия, коинфекция вирусом гепатита D, употребление алкоголя и других токсических веществ. В настоящий момент совершенствование методов диагностики позволило выявить новую форму заболевания — латентную HBV-инфекцию, которая характеризуется наличием ДНК HBV в ткани печени при отсутствии HBsAg в крови. Изучение латентной HBV-инфекции затруднено необходимостью исследования молекулярно-биологическими методами биоптатов печени «благополучных» HBsAg-негативных пациентов, у которых отсутствуют показания к биопсии печени. Однако такие исследования необходимы не только для понимания патогенеза и характеристики выздоровления при HBV-инфекции, но также для определения понятия выздоровления с позиций современной молекулярной биологии и вирусологии при вирусных заболеваниях в целом.

Коинфицирование или суперинфицирование пациентов с HBsAg в крови вирусом гепатита D существенно ухудшает прогноз заболевания в связи с его необычно высоким хрониогенным потенциалом. В случае присоединения HDV-инфекции быстро нарастает фиброз печени, а сроки формирования цирроза печени существенно сокращаются [Smedile A et al., 2002, Шахгильдян И.В. с соавт., 2003].

Вирусом гепатита С в мире по мнению разных авторов заражено от 130 до 200 млн. человек, распространенность HCV-инфекции имеет географические различия [Esteban JI et al., 2008, Shepard CW et al., 2005]. Естественное течение HCV-инфекции характеризуется развитием у 50-90% инфицированных лиц хронического гепатита с медленными темпами последующего прогрессирования заболевания [Afdhal N., 2004]. По мнению большинства авторов у 25% больных хроническим гепатитом С развивается цирроз печени, а у 1-5% из них – гепатоцеллюлярная карцинома. Вместе с тем, при HCV-инфекции, как и при других инфекционных заболеваниях, имеют место случаи спонтанного выздоровления, которые выпадают из поля зрения врачей и не находят отражения в медицинской литературе.

Появление возможности тестирования крови больных на недавно открытые вирусы G и ТТ ставит научный вопрос об их этиологической роли в патологии печени и других органов человека. В настоящий момент значение виремии HGV и TTV продолжает изучаться.

Наиболее эффективным методом лечения больных хроническими вирусными гепатитами является комбинированная интерферонотерапия с использованием пегилированных интерферонов в сочетании с различными препаратами противовирусного действия. Эффективность монотерапии аналогами нуклеоз(т)идов при ХГВ ограничена высокой частотой рецидивов после окончания лечения, что ведет к необходимости неопределенно долгой продолжительности противовирусной терапии. Кроме того, на фоне длительного лечения АН развивается лекарственная устойчивость к применяемым препаратам. Эффективность лекарственных препаратов при HBV-, HBV/HDV-инфекции, а также у пациентов с 1 генотипом ВГС не удовлетворяет ожидания врачей и пациентов. В связи с этим во всем мире продолжается поиск методов совершенствования этиотропной терапии хронических вирусных заболеваний печени, а также критериев оценки эффективности проведенного лечения.

Таким образом, можно выделить ряд актуальных направлений научных исследований обусловленных проблемами клинической практики и тактическими вопросами ведения пациентов с хроническими вирусными гепатитами. Это изучение клиническо-вирусологических вариантов течения и исходов хронических вирусных гепатитов; разработка критериев реконвалесценции; изучение закономерностей персистенции вирусов В и С в организме человека при естественном течении и после ПВТ; изучение факторов резистентности к лекарственным препаратам; изучение темпов прогрессирования заболевания и формирования фиброза у больных хроническими вирусными гепатитами; оптимизация противовирусной терапии. Актуальность нерешенных клинических проблем хронических вирусных гепатитов позволила сформулировать цели и задачи данного исследования.

Цель исследования.

Оптимизировать выбор персонифицированной противовирусной терапии на основе определения и клинико-вирусологической характеристики вариантов течения хронических вирусных гепатитов.

Задачи исследования:

Выявить клинические варианты течения хронических вирусных гепатитов В, С и D и провести их сравнительную оценку с учетом вирусологических особенностей возбудителя, уровня активности процесса и стадии заболевания.
Определить частоту выявления латентного гепатита В среди больных с хроническими поражениями печени и реконвалесцентов HBV-инфекции.
Характеризовать клиническое течение гепатита В в сочетании с дельта-вирусом и другими гепатотропными вирусами (G, TT).
Выявить особенности естественного течения и частоту формирования цирроза печени при хронической HBV- и HCV-инфекциях.
Оценить особенности микст-инфекции вирусами гепатитов G и TT у больных хроническим гепатитом С.
Оценить распространенность первичной лекарственной резистентности вируса гепатита В к аналогам нуклеоз(т)идов.
Обосновать выбор персонифицированной терапии больных хроническими вирусными гепатитами с учетом клинической картины болезни, особенностей возбудителя, вида лекарственных препаратов и схем терапии.

Научная новизна исследования

С помощью современных молекулярно-биологических технологий на большой когорте пациентов выделены клинико-вирусологические варианты течения хронических вирусных заболеваний печени с определением их состава.

Впервые обосновано выделение формы хронической HBV-инфекции с нормальным уровнем трансаминаз в т. ч. в группе, так называемых, «носителей HBsAg».

Выявлена низкая частота латентной формы HBV-инфекции у больных с хроническими заболеваниями печени, характеризующаяся минимальными клинико-биохимическими изменениями, низким уровнем виремии и отсутствием в структуре HBsAg значимых аминокислотных замен. Иммуногистохимическим и иммуноцитохимическим методами с применением электронной микроскопии доказано, что после вирусного гепатита В в клетках печени сохраняются вирусные частицы и антигены вируса.

Установлено преобладание больных с наличием микст-инфекций (HBV/HGV, HBV/TTV, HBV/HDV, HCV/HGV, HCV/TTV) среди обследованной когорты пациентов. Выявлено, что вирусы G и TT не оказывают влияния на течение ХГВ, ХГС и эффективность противовирусной терапии, а моноинфицирование вирусами G и TT в половине случаев приводит к стеатозу печени. Установлено подавление виремии HGV и TTV на фоне интерферонотерапии с последующим возобновлением репликации после отмены препаратов интерферона.

Среди пациентов с HBV-инфекцией впервые определена частота мутаций, ассоциированных с первичной лекарственной резистентностью к аналогам нуклеоз(т)идов. При многолетнем наблюдении за больными с хронической HBV- и HCV-инфекцией получены новые данные частоты формирования цирроза печени и ГЦК.

Усовершенствованы подходы к выбору персонифицированной противовирусной терапии больных с хроническими вирусными гепатитами. Впервые показана клиническая значимость определения содержания HBsAg для оценки эффективности противовирусной терапии хронического гепатита В. Получены новые данные эффективности комбинированной ПВТ препаратами интерферона и аналогами нуклеоз(т)идов в сравнении с монотерапией аналогами нуклеоз(т)идов у больных ХГВ.

Практическая значимость.

Современные серологические и молекулярно-биологические методы исследования в комплексе с лабораторно-инструментальными способами оценки фиброза позволяют выделить новые клинические формы вирусных заболеваний печени, провести сравнительный анализ течения и исходов болезни.

Клиническое выздоровление после HBV-инфекции сопровождается персистенцией возбудителя в клетках печени на фоне авиремии, что делает реконвалесцентов заболевания потенциально опасными при донорстве тканей и органов.

Исследование большой когорты пациентов свидетельствуют о преобладании больных с наличием микст-инфекций (HBV/HGV, HBV/TTV, HBV/HDV, HCV/HGV, HCV/TTV).

Использование метода ПЦР с высокой чувствительностью у, так называемых, «носителей HBsAg» и выявление низких концентраций ДНК HBV позволяет рассматривать данную клиническую форму, как хроническую HBV-инфекцию с нормальным уровнем трансаминаз.

Высокий уровень виремии HBV соответствует более высоким показателям цитолитической активности у больных хроническим гепатитом В.

Отсутствие в крови РНК HCV при наличии антител к HCV класса IgG в подтверждающем тесте, нормальная активность трансаминаз, нормальные размеры печени и селезенки являются основанием для выделения группы спонтанных реконвалесцентов HCV-инфекции.

Персонифицированный метод выбора противовирусных препаратов при хронических вирусных гепатитах В, С и D позволяет повысить эффективность лечения. Сочетание препаратов интерферона и аналогов нуклеоз(т)идов по сравнению с монотерапией аналогами нуклеоз(т)идов увеличивает частоту сероконверсии HBsAg у больных хроническим гепатитом В.

Применение индукционного метода лечения интерферонами «короткого действия» и рибавирином при хроническом гепатите С увеличивает частоту устойчивого вирусологического ответа. Коинфицирование вирусами G и TT не оказывает влияния на эффективность противовирусной терапии у больных хроническим гепатитом С.

Внедрение в практику и учебно-педагогический процесс.

Результаты проведенных исследований применяются при обследовании и лечении больных хроническими вирусными гепатитами в клинических отделениях ФГБУ «Поликлиника №1» и инфекционных отделениях ФГБУ «Центральная клиническая больница с поликлиникой» Управления делами Президента РФ, а также в клинических отделениях ФГБУ МСЧ №165 ФМБА России. Материалы диссертации используются в преподавании курса инфекционных болезней студентам факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова, на кафедре микробиологии и вирусологии медицинского факультета Российского Университета Дружбы Народов, а также при чтении лекций врачам и ординаторам лечебно-профилактических учреждений УД Президента РФ.

Личное участие автора

Автором лично проведено обследование и клиническое наблюдение 907 больных с хроническими вирусными заболеваниями печени. Личное участие автора состоит в непосредственной организации работы на всех этапах исследования: при формулировании цели и задач исследования, при разработке методических подходов и организации исследования, наборе и обработке статистического материала, анализе и интерпретации полученных данных, а также в подготовке материалов к публикациям по теме диссертации. Автором лично подготовлены рисунки (52) и таблицы (53), документально подтверждающие полученные результаты.

Основные положения, выносимые на защиту:

Использование комплекса современных высокочувствительных серологических и молекулярно-биологических методов исследования позволяет определить состав больных при различных клинико-вирусологических вариантах течения хронических вирусных гепатитов.
Выздоровление после перенесенного вирусного гепатита В представляет собой не полную элиминацию вируса, а формирование состояния контроля иммунной системы над возбудителем заболевания, при котором вирусные частицы длительно сохраняются в гепатоцитах, но отсутствуют в крови.
Среди больных с хроническими вирусными гепатитами преобладают пациенты с микст-инфекций HBV/HGV, HBV/TTV, HBV/HDV, HCV/HGV, HCV/TTV.

Хроническая HCV-инфекция в сравнении с хронической HBV-инфекцией характеризуется более высоким уровнем воспаления и фиброза.
Среди пациентов с ХГВ, проживающих в Москве и Московской области частота мутаций первичной лекарственной резистентности к аналогам нуклеоз(т)идов выше, чем в других регионах РФ.
Применение персонифицированной противовирусной терапии, основанной на индивидуальном подходе к выбору лекарственных препаратов с учетом молекулярно-биологической характеристики возбудителя, особенностей организма больного, активности и стадии заболевания позволяет повысить эффективность лечения.

Апробация работы

Диссертация обсуждена и рекомендована к защите на межлабораторном совете Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН совместно с сотрудниками кафедры инфекционных болезней РМАПО 28.05.12 г.

источник

МАСАЛОВА ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА

ВИРУСНЫЙ ГЕПАТИТ С: НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ИЗУЧЕНИЮ ПАТОГЕНЕЗА И РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ ДИАГНОСТИКИ И ПРОФИЛАКТИКИ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Доктор биологических наук, профессор Кущ Алла Александровна

доктор биологических наук Зверев Виталий Васильевич

доктор медицинских наук Михайлов Михаил Иванович

доктор медицинских наук Наровлянский Александр Наумович

НИИ переливания крови им. A.A. Богданова ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздравсоцразвития Российской Федерации

Защита состоится «06» июня 2011 г. в 12 00 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.131.01 при ФГУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития Российской Федерации по адресу: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития Российской Федерации

Автореферат разослан « мая 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор медицинских наук Бурцева Елена Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Гепатит С по оценкам экспертов ВОЗ и Европейского Союза относится к наиболее важным социально значимым инфекционным заболеваниям человека и является одной из главных причин хронических заболеваний печени. Около 3% человеческой популяции на Земле инфицировано вирусом гепатита С (ВГС) [Albeldawi et al., 2010]. Современные проявления эпидемического процесса при гепатите С характеризуются снижением частоты острых форм этой инфекции, но ростом числа лиц с наличием антител к ВГС в крови, а также увеличением числа микст-инфекций (в том числе сочетание ВГС- и ВИЧ-инфекции); отмечается также изменение возрастного состава больных, структуры путей передачи ВГС, увеличение показателей смертности от хронических гепатитов и цирроза печени [Михайлов М.И. и др., 2007, Шахгильдян И.В. и др., 2008]. Гепатит С характеризуется высокой частотой формирования хронической инфекции (до 70% — 80% острых форм переходят в хронический гепатит) и широким спектром клинических проявлений. Тяжесть заболевания варьирует от бессимптомного носительства до тяжелых форм с повреждением печени, прогрессирующим в цирроз и гепатоцеллюлярную карциному. Кроме того, с хроническим гепатитом С (ХГС) связывают многочисленные внепеченочные проявления, что позволяет рассматривать гепатит С как системное заболевание [Bowen, Walker, 2005, Heller, Rehermann, 2005]. Эффективность комбинированного лечения больных ХГС с помощью пегилированного альфа-интерферона с рибавирином не превышает 50%, к тому же данная терапия сопряжена с серьезными побочными эффектами [Ghany et al., 2009].

Несмотря на успехи в изучении молекулярно-биологических свойств вируса, до сих пор не существует единой концепции патогенеза ВГС-инфекции и ясного понимания механизма повреждающего действия ВГС на клетки печени. По-прежнему, не совсем ясно, какие факторы вируса и хозяина определяют исходы острого гепатита С (ОГС) — реконвалесценцию или формирование хронической инфекции, а также обусловливают прогрессирующее в цирроз течение ХГС [Sumida et al., 2010, Wadhawan et al., 2010]. Возможности изучения структуры ВГС и патогенеза заболевания ограничены сложностями культивирования вируса in vitro и узким кругом восприимчивых к вирусу животных. Большинство исследователей полагает, что ВГС не обладает прямым цитопатогенным действием, и главным фактором хронизации и прогрессирования заболевания является нарушение Т-клеточного ответа, а именно дисбаланс в соотношении Thl и Th2 лимфоцитов и секретируемых ими цитокинов [Albeldawi et al., 2010, Sharma, 2010].

выяснена функциональная роль белков ВГС в формировании хронического гепатита, а также не выявлены маркеры инфекции, ассоциированные с активностью и стадией ХГС. Выяснение структуры и свойств вирусных белков необходимо как для решения теоретических проблем (локализация антигенных и иммуногенных детерминант, определение протективных эпитопов), так и для решения задач практической медицины — создания профилактических средств, терапевтических препаратов и диагностических тест-систем.

Вакцина против гепатита С до настоящего времени не создана. Одна из основных причин — недостаточная изученность защитных механизмов врожденного и адаптивного иммунитета в ходе взаимодействия ВГС и иммунной системы хозяина. Сложность разработки вакцины заключается в высокой гетерогенности ВГС и способности вируса ускользать от иммунного ответа хозяина (escape effect). Имеющиеся данные позволяют заключить, что решающим фактором при элиминации ВГС является ранний, сильный, мультиспецифичный и функционально активный иммунный ответ клеточного звена иммунитета [Albeldawi et al., 2010, Sharma, 2010]. Основным подходом к созданию вакцин против гепатита С в настоящее время является использование индивидуальных рекомбинантных белков, отдельных пептидов или участков генома ВГС в составе ДНК-конструкций [Abdulhaqq et al., 2008, Houghton, Abrignani, 2005, Encke et al., 2007]. Анализ результатов опубликованных работ показал, что ни одна из кандидатных вакцин пока не способна обеспечить полноценный профилактический и терапевтический эффекты против ВГС. Можно констатировать, что, несмотря на определенные успехи, разработка вакцин против гепатита С требует дальнейших усилий и новых решений.

Актуальной проблемой здравоохранения является усовершенствование диагностики гепатита С. Для ограничения распространения ВГС-инфекции особое значение имеет надежное обнаружение ВГС в крови и продуктах крови. Индикация анти-ВГС антител, в основном, решает задачу этиологического диагноза, но не характеризует течение инфекции и не решает задачу прогноза исхода заболевания. По этим причинам важным является развитие методов прямого определения вирусспецифических маркеров — РНК и белков, как в сыворотке крови, так и непосредственно в клетках организма. Обнаружение указанных маркеров ВГС может решить проблему серонегативного «окна», а также дать ответ на вопрос о репликации ВГС и вирусной нагрузке.

Вышеизложенное свидетельствует об актуальности работ, направленных на комплексный анализ роли вирусных факторов (РНК и белков ВГС) и иммунного ответа хозяина (спектра антител к ВГС, иммунокомпетентных клеток, цитокинов и других иммунорегуляторных молекул) в патогенезе гепатита С. Эти знания необходимы для разработки эффективных средств диагностики, профилактики и создания специфических препаратов для лечения гепатита С, что позволит контролировать это широко распространенное заболевание.

Перечисленные нерешенные проблемы в изучении гепатита С определили актуальность настоящей работы, цель и задачи, которые в ней были поставлены.

Цель и задачи исследования

Цель работы — разработать критерии оценки активности гепатита путем комплексного определения РНК и белков ВГС в печени и периферической крови, маркеров функциональной активности иммунной системы у больных острым и хроническим гепатитом С для прогнозирования исходов заболевания и на основании полученных данных разработать вакцинную композицию, обеспечивающую эффективный иммунный ответ против ВГС.

Для достижения цели был поставлен ряд как фундаментальных, так и прикладных задач:

1. Получить панель моноклональных антител к белкам ВГС для изучения антигенной структуры белков и разработки иммунохимических методов выявления белков ВГС;

2. Оценить степень накопления белков ВГС в инфицированных клетках печени и в мононуклеарных клетках периферической крови больных гепатитом С;

3. Исследовать количественное содержание белка нуклеокапсида (core) ВГС в сыворотках крови больных гепатитом С и ВГС-инфицированных лиц;

4. Оценить частоту встречаемости геномных и репликативных форм РНК ВГС в печени и периферической крови больных гепатитом С;

5. Выявить особенности спектра и активности антител к белкам ВГС у пациентов с острым и хроническим гепатитом С;

6. Определить популяционный состав лимфоцитов периферической крови и исследовать содержание растворимых форм дифференцировочных антигенов в сыворотке крови больных с разными формами и стадиями гепатита С;

7. Исследовать концентрацию про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови, а также продукцию цитокинов in vitro клетками периферической крови пациентов с гепатитом С;

8. С помощью комплексного корреляционного анализа сопоставить результаты выявления вирусных маркеров и параметров иммунного ответа с клинико-морфологическими и биохимическими данными больных гепатитом С. Оценить роль вирусных и хозяйских факторов в повреждении печени, в течение и прогнозе гепатита С;

9. Провести иммунизацию мышей рекомбинантными белками ВГС и ДНК-конструкциями, сравнить эффективность иммунного ответа;

10.Дать сравнительную оценку иммуномодулирующего действия адьювантов, усиливающих гуморальный и клеточный иммунные ответы;

11.Выбрать оптимальные антигенные сочетания и адъюванты, создать вакцинную композицию, обеспечивающую эффективный иммунный ответ против ВГС.

С использованием полученных моноклональных антител (МКА) к белкам ВГС установлена структурная организация 10 антигенных детерминант, не описанных ранее. Впервые установлено, что антигенные детерминанты белков ВГС выявляются в инфицированных клетках печени и мононуклеарных клетках

периферической крови (МКПК) больных гепатитом С с различной частотой. Наиболее часто выявляются пять эпитопов на белках NS4A, NS4B и NS5A, что может быть связано с пространственной доступностью этих детерминант.

С помощью иммунохимических методов, разработанных на основе МКА, получены новые данные о патогенетической роли белков ВГС. Впервые установлено, что у больных ХГС накопление соге-белка в печени и в МКПК прямо коррелирует с выявлением репликативной формы РНК ВГС. Таким образом, соге-белок может служить маркером активной репликации вируса. Частота обнаружения репликативной формы РНК ВГС, а также экспрессия белка NS4A в печени и в МКПК больных ХГС сокращается при тяжелых некрозо-воспалительных процессах в печени, что может свидетельствовать о снижении репликативной активности ВГС при прогрсссировании заболевания. Впервые показано, что гистологическая активность ХГС и повышение уровня ферментов печени прямо связана с наличием как геномной РНК ВГС, так и белков ВГС в ткани печени, РНК и соге-белка ВГС в сыворотках крови и белков ВГС в МКПК. При ХГС впервые установлена прямая зависимость между экспрессией белка NS5A в печени, выработкой антител к этому белку, увеличением гистологической активности и развитием фиброза, что позволяет рассматривать NS5A как один из маркеров степени повреждения ткани печени.

Анализ белков ВГС в печени больных гепатитом С впервые позволил получить прямые доказательства более высокой транскрипционной активности ВГС при ОГС по сравнению с ХГС. При ОГС выявлена прямая зависимость между накоплением белков core, NS3 и NS5A в гепатоцитах и некрозо-воспалительными изменениями ткани печени. Интенсивная экспрессия белков NS4A и NS3 в печени в период около 1 месяца после манифестации ОГС является предпосылкой спонтанной реконвалесценции.

Впервые установлено, что накопление белков ВГС в МКПК ассоциируется с иммунными расстройствами — сокращением доли мононуклеарных клеток и лимфоцитов в популяции лейкоцитов. При ОГС уменьшение количества СШ6+-лимфоцитов связано с более активной экспрессией белков NS3 и NS5A ВГС в печени (г= -0,7, р 200 пг/мл. Средняя концентрация соге-белка у пациентов с ХГС была выше, чем в других группах (рис. 2 Б), статистически значимые различия получены между больными ОГС и ХГС (р 0,05 9/44 (20%) *

27 7/19 (37%) 3/26 (12%) р>0,05 12/60 (20%)

D4 9/19 (47%) 1/17 (6%) р=0,01 11/48(23%)

ВСЕГО** 18/19 (95%) 17/61 (28%) р 0,05 2/7 (28,5%)

5G2 12/19 (63%) 8/41 (20%) р=0,002 4/14 (28,5%)

5В2 14/19 (74%) 1/4 (25%) р>0,05 8/38 (21%)

4Н8 10/19 (53%) 3/30 (10%) р=0,003 4/24 (17%)

ВСЕГО** 17/19 (90%) 18/42 (43%) р=0,003 29/83 (35%)

NS4A 3F12 18/19 (95%) 17/40 (43%) р=0,0007 32/80 (40%)

NS4B 1D11 17/19 (89%) 31/56 (55%) р=0,01 3/10 (30%)

6В11 14/19 (74%) 46/69 (67%) р>0,05 6/8 (75%)

ВСЕГО ** 17/19 (89%) 46/69 (67%) р=0,008 34/78 (43%)

NS5A 2С9 15/19 (79%) 29/50 (58%) р . в -V ***

0,05). У 18 больных исследовали РНК ВГС в ткани печени, у 17 из них (94%) обнаружена геномная (плюс-цепи) РНК. Репликативная форма РНК выявлена у 8 из 17 пациентов, содержащих геномную РНК в печени (47%), и у 13 (76%) из этих пациентов обнаружены белки ВГС в печени. В наибольшей степени совпали результаты детекции репликативной формы РНК и белка core — в 83% образцов (р t

Минус-цепи РНК 22/69 (32%) 1 о 44

Белки сумма 71/83 (86%) 44 44 t

В таблице 6 схематично представлены выявленные в данной части исследования закономерности, характеризующие связи между обнаружением РНК и экспрессией белков ВГС в печени и периферической крови у больных

ХГС в зависимости от активности и стадии заболевания. Следует отметить, что указанные закономерности установлены впервые.

Показано, что повышение уровня ферментов печени прямо связано с общей вирусной нагрузкой: наличием как геномной РНК ВГС, так и белков ВГС в ткани печени, РНК и соге-белка в сыворотках крови и белков ВГС в МКПК (табл. 6). С повышением гистологической активности ассоциированы активная экспрессия белка NS5A в печени и обнаружение белка core в периферической крови. В то же время, при тяжелых некрозо-воспалительных процессах в печени (ИГА 9-12, А=3) частота обнаружения минус-цепей РНК ВГС, а также экспрессия белка NS4A в печени и в МКПК больных ХГС сокращается, что может свидетельствовать о снижении репликативной активности ВГС при прогрессировании заболевания. Прямые корреляционные связи установлены между развитием тяжелого фиброза и цирроза ткани печени (ИФ>3) и накоплением белка NS5A в печени, а также белка core в МКПК и сыворотке крови, при этом у пациентов с циррозом преобладающей формой циркуляции ВГС являются иммунные комплексы.

Сравнивая частоту обнаружения маркеров ВГС, можно сделать вывод, что отсутствие ВГС в сыворотке или плазме крови, которые наиболее часто используются для диагностических целей, не означает отсутствие РНК и белков ВГС в клетках. Полученные данные указывают на большую диагностическую ценность анализа клеток крови или цельной крови, в том числе, методом ПЦР.

3. ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУННОГО ОТВЕТА НА ВГС-ИНФЕКЦИЮ И АНАЛИЗ ИММУННОГО СТАТУСА БОЛЬНЫХ ГЕПАТИТОМ С

Третья часть работы посвящена изучению роли белков ВГС в индукции антивирусного иммунного ответа. Анализировали спектр и активность антител к белкам ВГС и ряд маркеров иммунного статуса и активации иммунной системы. Нас интересовала также связь этих параметров с активностью и стадией заболевания и влияние вирусных белков и РНК ВГС на Т- и В-клеточный ответ при ВГС-инфекции.

3.1. Активность антител к белкам ВГС в сыворотке и плазме крови

Спектр антител к рекомбинантным белкам ВГС определяли в ИФА. Данные о выявлении антител к белкам ВГС у больных ХГС с различной активностью и стадией заболевания представлены в табл. 7. Антитела к белку core и NS3 обнаруживались у большинства больных ХГС, однако их выявление не коррелировало с гистологической и биохимической активностью и стадией заболевания. Антитела к белку NS5A достоверно чаще обнаруживались у больных с более высокими показателями ИФ и AJIT; при оценке ИГА по шкале METAVIR положительная корреляция установлена между титрами airra-NS5A антител и гистологической активностью (г=0,35, р=0,01). Пациенты, у которых найдены белки ВГС в печени, также значительно чаще имели airm-NS5A антитела. Положительная корреляция (i=0,42, р=0,03) найдена между экспрессией белка NS5A в клетках печени и наличием антител к этому белку. У больных с определяемыми белками ВГС в печени и одновременно РНК ВГС

в сыворотке достоверно чаще по сравнению с пациентами без этих вирусных маркеров выявлялись антитела к белкам N84 и ^5А.

При исследовании пациентов с ОГС у 5 из 22 больных (23%) наиболее вероятно произошла реконвалесценция, у 17 сформировался ХГС. Сравнение больных ОГС с различным исходом заболевания показало, что активность антител к белку №5А была достоверно больше в группе больных с хронизацией гепатита (табл. 8).

Таблица 7. Частота встречаемости антител к белкам ВГС у пациентов с ХГС в зависимости от активности и стадии заболевания и наличия вирусных маркеров

Морфологические, биохимические и вирусологические характеристики Частота встречаемости нтител к белкам ВГС, %

Показатели активности и стадии ХГС ИГА (баллы) * (п=52) 1-8 96 74 65 56

ИФ (баллы) * (п=52) 1-2 96 77 70 60

АЛТ (мкмоль/мин. л) (ч=52) 40 98 77 72 72

Маркеры ВГС Белки в печени (п=52) Есть 96 78 75 72

РНК в сыворотке (п=37) Есть 98 84 72 66

РНК в сыворотке и белки в печени (п=20) Есть 100 86 71 67

Пациенты с ХГС (п=52), средние значения 96 77 70 60

Примечания: * по модифицированной системе Кло 25%) ВГС-позитивных МКПК, по сравнению с больными, не содержащими вирусные белки в МКПК (р=0,02). Это может быть связано с установленным нами сокращением популяции ВГС-инфицированных МКПК и, как следствие, снижением экспрессии мембранного Fas и образования растворимой формы Fas-антигена. Следует отметить, что вклад мононуклеаров крови в продукцию sFas существенен только при острой форме гепатита С: корреляция между sFas и числом С095+-лимфоцитов при ОГС была статистически значимой (г=0,4; р 0,05).

При сравнении двух групп пациентов с различными исходами ОГС установлено, что больные, у которых сформировался ХГС, характеризовались более высокой концентрацией s-форм в первый месяц от начала заболевания в отличие от возможных реконвалесцентов (рис. 8). Для sCD38 полученные отличия оказались статистически достоверными. Это означает, что концентрация sCD38 в сыворотке крови пациентов с ОГС может иметь прогностическое значение при оценке исхода заболевания.

Негативная роль растворимых форм дифференцировочных антигенов состоит также в снижении популяции иммунокомпетентных клеток: у больных ОГС обнаружена обратная корреляция между количеством CD4+ -лимфоцитов периферической крови и концентрациями sFas (г= -0,52; р Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Масалова, Ольга Владимировна, Москва

Министерство здравоохранения и социального развития Российской Федерации Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д. И. Ивановского

Масалова Ольга Владимировна

ВИРУСНЫИ ГЕПАТИТ С: НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ИЗУЧЕНИЮ ПАТОГЕНЕЗА И РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ ДИАГНОСТИКИ И

ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

доктор биологических наук, профессор Кущ А.А.

ГЛАВА 1. ВИРУС ГЕПАТИТА С: ПАТОГЕНЕЗ, ДИАГНОСТИКА И

1.1. Эпидемиология и клиническое течение гепатита С. 18

1.2. Молекулярная организация вируса гепатита С. 25

1.2.2. Организация вирусного генома. 26

1.2.3. Структура и функции вирусных белков. 28

1.2.4. Жизненный цикл ВГС. 46

1.2.5. Антигенная структура белков ВГС и методы картирования В-клеточных эпитопов. 48

1.3. Иммунопатогенез вирусного гепатита С. 54

1.3.1. Врожденный иммунный ответ. 54

1.3.2. Адаптивный иммунный ответ. 55

1.3.3. Иммунный статус больных гепатитом С. 64

1.3.4. Лечение гепатита С. 75

1.3.5. Вирусные и хозяйские факторы, связанные с исходом ОГС и эффективностью IFN-терапин. 77

1.4. Разработка вакцин против гепатита С. 78

1.5. Молекулярные основы диагностики гепатита С. 84

1.5.1. Определение маркеров ВГС в сыворотке крови. 84

1.5.2. Выявление ВГС в инфицированных клетках больных гепатитом С. 91

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. 97

2.1. Характеристика клинического материала. 97

2.2. Лабораторные животные и клеточные линии. 101

2.3. Основные материалы (рекомбинантные белки, синтетические пептиды, ДНК-конструкции, адъюванты). 101

2.4. Получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела (МКА) к рекомбинантным белкам вируса гепатита С.. 106

2.5. Биохимические и иммунохимические методы исследования. 107

2.5.1. Определение концентрации белка. 107

2.5.2 Изотипирование MICA. 107

2.5.3. Очистка МКА из асцитных жидкостей. 107

2.5.4. Приготовление конъюгатов. 107

2.5.5. Подготовка биологического материала. 108

2.5.6. Иммуноферментный анализ (ИФА). 110

2.5.7. Реакция иммунофлюоресценции. 113

2.5.8. Иммуногистохимическое и иммуноцитохимическое окрашивание in situ. 113

2.5.9. Выявление белков ВГС в МКПК методом проточной цитофлюориметрии.. 115

2.5.10. Иммуноблоттинг и иммунодот. 115

2.5.11. Истощение МКА и сывороток. 116

2.6. Картирование антигенных детерминант белков ВГС с помощью технологии фагового дисплея. 116

2.7. Иммунологические методы исследования. 117

2.7.1. Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ). 117

2.7.2. Определение содержания популяций лимфоцитов. 118

2.7.4. Определение содержания цитокинов. 119

2.7.5. Определение содержания растворимых форм дифференцировочных антигенов. 1X9

2.8. Детекция РНК вируса гепатита С и генотипирование ВГС. 120

2.9. Статистическая обработка результатов. 121

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ, ХАРАКТЕРИСТИКА И ГШИТОП ПАЯ

3.1. Получение МКА к рекомбинанатным белкам core, NS3, NS4 и NS5 ВГС. 122

3.2. Иммунохимические свойства МКА. 123

3.3. Эпитопная специфичность МКА. 123

3.4. Взаимодействие MICA с денатурированными антигенами. 128

3.5. Реципрокный конкурентный анализ МКА. 130

3.6. Конкуренция МКА с антителами в сыворотках больных гепатитом С. 133

3.7. Картирование антигенных детерминант с помощью технологии фагового дисплея. 134

ГЛАВА 4. ВЫЯВЛЕНИЕ ВГС В МАТЕРИАЛАХ ОТ БОЛЬНЫХ ГЕПАТИТОМ С.. 140

4.1. Детекция РНК ВГС в материалах от больных гепатитом С. 140

4.2. Экспрессия вирусных белков в клетках печени у пациентов с острым и хроническим гепатитом С. 142

4.3. Детекция белков ВГС в мононуклеарных клетках периферической крови. 156

4.3.1. Выявление белков ВГС в клетках крови in situ. 156

4.3.2. Анализ белков ВГС в клетках крови методом проточной цитометрии. 159

4.4. Обнаружение белков ВГС в лизатах инфицированных клеток. 162

4.5. Количественное определение содержания белка core ВГС в сыворотке и плазме крови. 164

4.5.1. Разработка метода выявления соге-белка ВГС. 164

4.5.2. Анализ содержания соге-белка в сыворотках больных гепатитом С

ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУННОГО ОТВЕТА НА ВГС-ИНФЕКЦИЮ И АНАЛИЗ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО СТАТУСА БОЛЬНЫХ ГЕПАТИТОМ С. 178

5.1. Активность антител к белкам ВГС в сыворотке и плазме крови.. 178

5.2. Анализ относительного содержания различных популяций

5.3. Изменение содержания растворимых форм дифференцировочных антигенов в сыворотках крови больных гепатитом С. 183

5.4. Цитокиновый профиль больных гепатитом С. 189

ГЛАВА 6. ИНДУКЦИЯ И АНАЛИЗ ИММУННОГО ОТВЕТА НА ИММУНИЗАЦИЮ МЫШЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫМИ БЕЛКАМИ

ВГС, ОТДЕЛЬНЫМИ ДЕТЕРМИНАНТАМИ И ДНК- ^

6.1. Иммунный ответ на введение рекомбинантных белков. 193

6.2. Иммунный ответ при иммунизации мышей ВГС-специфическими фагами и синтетическими пептидами. 203

6.3. Анализ иммунного ответа на ДНК-иммунизацию. 207

6.4. Сочетанная иммунизация животных рекомбинантными белками и ДНК-конструкциями. 215

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ. 234

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ. 300

АГ — антиген, АГ+ — антиген-позитивный

АД — антигенная детерминанта

а.о. — аминокислотный остаток

АПК — антигенпрезентирующая клетка

БСА — бычий сывороточный альбумин

ВПЧ — вирусоподобная частица

ИГА — индекс гистологической активности

ИГХ — иммуногистохимические методы

ИКК — иммуннокомпетентные клетки

ИПО — иммунопероксидазное окрашивание

ИСП — индекс стимуляции пролиферации

ИФА — иммуноферментный анализ

ЛПК — лимфоциты периферической крови

МЕ — международные единицы

МКА — моноклональные антитела

МКПК — мононуклеарные клетки

НАФ — неполный адъювант Фрейнда

НТР — нетранслируемый регион

ОТ-ПЦР — обратная транскрипция-

полимеразная цепная реакция

ПАФ — полный адъювант Фрейнда

ПБП — пункционная биопсия печени

РБТЛ — реакция бласттрансформации

ТМ — трансмембранный домен

ТМБ — тетраметилбензидин гидрохлорид

ФИТЦ — изотиоционат флюоресцеина

ХГС — хронический гепатит С

ЭКС — эмбриональная сыворотка крупного

ЭР — эндоплазматический ретикулум

Сбо-АКК — производное фуллерена С6о с

натриевой солью аминокапроновой кислоты

Сбо-ГМДП — производное фуллерена Сбо с

CD — маркеры дифференцировки

CD8+, CTL — цитотоксические Т-лимфоциты CD16+, NK — натуральные (естественные) киллерные клетки CD19+ — В-клетки

CTLA — (cytotoxic Т lymphocyte antigen) —

цитотоксический Т-лимфоцитарный антиген

ELISpot — (enzyme-linked immunosorbent

spot) полуколичественный метод

определения цитокин-секретирующих клеток

GFP—зеленый флюоресцентный белок

HLA — (Human Leukocyte Antigens) —

лейкоцитарный антиген человека

HVR — гипервариабельный регион

1RES — (Internal Ribosome Entry Site) -участок внутренней посадки рибосомы ISDR — (interferon sensitivity determining region) — сайт устойчивости к интерферону LDLR — рецептор липопротеинов низкой плотности

LN — интралобулярный (внутридольковый) некроз

М±т — среднее ± стандартная ошибка

МНС — (Major Histocompatibility Complex) —

главный комплекс гистосовместимости

NTPase — нуклеотид трифосфатаза

OAS -2-5′ олигоаденилсинтетаза

ORF — (open reading frame) — открытая рамка

PBS — фосфатно-солевой буфер, PBST — PBS

РКЯ — с^РНК-зависимая протеинкиназа Р]УЕЧ — ступенчатый (пери портальный) некроз

К(Шр — (КМА-с1ерепс1еп1 ИЫА-ро1утеп5е) -РНК-зависимая РНК-полимераза ИТ — комнатная температура в — растворимые формы антигенов вБ — стандартное отклонение

SDS — додецилсульфат натрия

TLR — (Toll-like receptor) — То11-подобный

TNF — фактор некроза опухоли Treg — Т-регуляторные клетки

А — аланин R — аргинин N — аспарагин D — аспарагиновая кислота С — цистеин

Е — глутаминовая кислота Q — глутамин G — глицин Н — гистидин I — изолейцин

L — лейцин К — лизин М — метионин F — фенилаланин Р — пролин S — серин Т — треонин W — триптофан

Гепатит С по оценкам экспертов ВОЗ и Европейского Союза относится к трем наиболее важным социально значимым инфекционным заболеваниям человека и является одной из главных причин хронических заболеваний печени. Около 3% человеческой популяции на Земле (примерно 170 млн. человек) инфицировано вирусом гепатита С (ВГС), и ежегодно около 3-4 млн. человек вновь инфицируется [Albeldawi et al., 2010]. Современные проявления эпидемического процесса при гепатите С характеризуются снижением частоты острых форм этой инфекции, но ростом числа лиц с наличием антител к ВГС в крови, а также увеличением числа микст-инфекций (в том числе сочетание ВГС- и ВИЧ-инфекции); отмечается также изменение возрастного состава больных, структуры путей передачи ВГС, увеличение показателей смертности от хронических гепатитов и цирроза печени [Михайлов М.И., Шахгильдян И.В., 2007, Шахгильдян И.В. и др., 2008]. Гепатит С характеризуется высокой частотой формирования хронической инфекции (до 70% — 80% острых форм переходят в хронический гепатит) и широким спектром клинических проявлений. Тяжесть заболевания варьирует от бессимптомного носительства до тяжелых форм с повреждением печени, прогрессирующим в цирроз и гепатоцеллюлярную карциному. Кроме того, с хроническим гепатитом С (ХГС) связывают многочисленные внепеченочные проявления, что позволяет рассматривать гепатит С как системное заболевание [Bowen, Walker, 2005, Heller, Rehermann, 2005]. Эффективность комбинированного лечения больных ХГС с помощью пегилированного интерферона-альфа (IFN-a) с рибавирином не превышает 50%, к тому же данная терапия сопряжена с серьезными побочными эффектами [Ghany et al., 2009].

За 20 лет интенсивных исследований со времени открытия ВГС определены структура вирусного РНК-генома и функции значительной части кодируемых им белков. Несмотря на успехи в изучении молекулярно-биологических свойств вируса, до сих пор не существует единой концепции патогенеза ВГС-

инфекции и ясного понимания механизма повреждающего действия ВГС на клетки печени. По-прежнему, не совсем ясно, какие факторы вируса и хозяина определяют исходы острого гепатита С (ОГС) — реконвалесценцию или формирование хронической инфекции, а также обусловливают прогрессирующее в цирроз течение ХГС [Sumida et al., 2010, Wadhawan et al., 2010]. Возможности изучения структуры ВГС и патогенеза заболевания ограничены сложностями культивирования вируса in vitro и узким кругом восприимчивых к вирусу животных. Большинство исследователей полагает, что ВГС не обладает прямым цитопатогенным действием, и главным фактором хронизации и прогрессирования заболевания является нарушение Т-клеточного ответа, а именно дисбаланс в соотношении ТЫ и Th2 лимфоцитов и секретируемых ими цитокинов [Albeldawi et al., 2010, Sharma, 2010].

Белки вируса изучены недостаточно в связи с их малой доступностью, так как ВГС циркулирует и накапливается в организме больных в низких концентрациях. Сведения о воздействии белков ВГС на клетки и организм противоречивы: вирусные белки могут супрессировать или усиливать иммунный ответ, ингибировать или индуцировать апоптоз [Irshad, Dhar, 2006, Pindel, Sadler, 2010, Siavoshian et al., 2005, Tang, Grisé, 2009]. До сих пор не выяснена функциональная роль белков ВГС в формировании хронического гепатита, а также не выявлены маркеры инфекции, ассоциированные с активностью и стадией ХГС. Выяснение структуры и свойств вирусных белков необходимо как для решения теоретических проблем (локализация антигенных и иммуногенных детерминант, определение протективных эпитопов), так и для решения задач практической медицины — создания профилактических средств, терапевтических препаратов и диагностических тест-систем.

Актуальной проблемой здравоохранения является усовершенствование диагностики гепатита С. Для ограничения распространения ВГС-инфекции особое значение имеет обнаружение ВГС в крови и продуктах крови. Серодиагностика, основанная на определении специфических антител к вирусным белкам, сегодня является одним из основных методов диагностики

ВГС-инфекции. Однако, одного этого теста недостаточно, поскольку антитела не выявляются на ранних стадиях инфицирования вирусом (фаза серонегативного «окна» продолжительностью до нескольких месяцев), а также при иммунодефицитных состояниях [Daniel et al., 2008]. Высокий уровень антигенной вариабельности ВГС может обусловливать ложноотрицательные результаты. Возможно также получение ложноположительных результатов за счет перекрестно-реагирующих детерминант [Pawlotsky, 2003]. Часто отмечаются несовпадения в результатах тестирования контрольных панелей сывороток с помощью различных тест-систем [Chen, Morgan et al., 2006, Chou et al., 2004]. В основе перечисленных недостатков — использование в тест-системах рекомбинантных белков и пептидов, недостаточно точно моделирующих антигенную структуру возбудителя, а также неполное знание особенностей взаимодействия ВГС с иммунной системой хозяина.

Индикация анти-ВГС антител, в основном, решает задачу этиологического диагноза, но не характеризует течение инфекции и не решает задачу прогноза исхода заболевания. По этим причинам важным является развитие методов прямого определения вируссп�

источник