1.1. Настоящие санитарно-эпидемиологические правила (далее Санитарные правила) устанавливают требования к санитарно-противоэпидемическим (профилактическим) мероприятиям, проводимым с целью предупреждения возникновения и распространения заболеваний ветряной оспой и опоясывающим лишаем.
1.2. Соблюдение Санитарных правил является обязательным для граждан, индивидуальных предпринимателей и юридических лиц.
1.3. Контроль за выполнением Санитарных правил проводится органами, уполномоченными осуществлять федеральный государственный санитарно-эпидемиологический надзор в соответствии с законодательством Российской Федерации.
2.1. Ветряная оспа 1 представляет собой острое вирусное инфекционное заболевание, характеризующееся поражением кожи и слизистых оболочек в виде полиморфной макуло-папулезно-везикулезной сыпи, умеренно выраженной лихорадкой и симптомами общей интоксикации, преимущественно доброкачественным течением.
Опоясывающий лишай 2 развивается у 10 — 20 % пациентов, ранее перенесших ветряную оспу; представляет собой спорадическое заболевание, возникающее в результате активации в организме возбудителя ветряной оспы, проявляющееся воспалением задних корешков спинного мозга и межпозвоночных ганглиев, а также лихорадкой, общей интоксикацией и везикулезной экзантемой по ходу вовлеченных в процесс чувствительных нервов.
1 Код В 01 — ветряная оспа по Международной классификации болезней МКБ-10.
2 Код В 02 — опоясывающий лишай по Международной классификации болезней МКБ-10.
2.2. Возбудитель ветряной оспы, опоясывающего лишая — вирус Варицелла Зостер (Varicella Zoster virus) (далее — ВЗВ), вирус герпеса человека третьего типа (Human herpesvirus 3), неустойчивый во внешней среде (погибает через несколько минут), но длительно сохраняется при низких температурах (минус 65 °С и ниже).
2.3. Резервуаром и источником ВЗВ при ветряной оспе и опоясывающем лишае является человек, больной ветряной оспой или опоясывающим лишаем. Период, в течение которого источник ВЗВ (больной ветряной оспой или опоясывающим лишаем) может заразить окружающих его лиц, длится с конца инкубационного периода и до истечения 5 дней с момента появления последних элементов сыпи (макул).
Индекс контагиозности (заразительности) составляет в среднем 75 — 90 %.
Инкубационный период при ветряной оспе составляет от 10 до 21 дня (в среднем 13 — 17 дней).
Механизм передачи ВЗВ, преимущественно аспирационный (аэрогенный), реализуется воздушно-капельным и контактным путями. Возможна трансплацентарная передача ВЗВ — от больной матери к плоду.
При опоясывающем лишае вирус может персистировать (сохраняться) в организме многие годы.
Распространенность болезни имеет повсеместный характер.
2.4. Ветряная оспа проявляется типичной, атипичной и стертой клиническими формами. Типичная ветряная оспа по тяжести течения подразделяется на легкую, среднетяжелую и тяжелую. Основными факторами риска тяжелого течения заболевания являются лейкозы, солидные опухоли, ВИЧ-инфекция, иммуносупрессивная терапия, а также терапия кортикостероидами. Также ветряная оспа может проявляться в инаппарантной (бессимптомной) форме, в таком случае диагноз устанавливается по результатам лабораторных исследований.
2.5. Беременные относятся к группе риска развития заболеваний, связанных с ВЗВ. Случаи заболевания ветряной оспой новорожденных до 11 дня жизни должны считаться врожденной инфекцией.
К врожденным формам ветряной оспы относятся синдром врожденной ветряной оспы (далее — СВВО) и неонатальная (врожденная) ветряная оспа.
Внутриутробное инфицирование плода ВЗВ в течение первых 20 недель беременности может приводить к самопроизвольному аборту, внутриутробной смерти плода или рождению ребенка с СВВО.
Неонатальная (врожденная) ветряная оспа развивается при заболевании беременной женщины менее чем за 10 суток до родов. Тяжесть течения неонатальной (врожденной) ветряной оспы определяется сроками инфицирования.
В случае заболевания ветряной оспой беременной за 5 — 10 дней до родов, первые клинические признаки у новорожденного появляются сразу после рождения.
Новорожденный, заболевший ветряной оспой, развившейся в результате заболевания беременной за 16 и менее дней до родов, является источником ВЗВ.
В случае внутриутробного заражения ВЗВ в первом триместре беременности (на 13 — 20 неделе), может развиться синдром врожденной ветряной оспы (далее — СВВО), который характеризуется пороками развития конечностей (укорочение, деформация), головного мозга (микроцефалия, гидроцефалия, корковая атрофия, диафрагмальный паралич) и органов зрения (катаракта).
Новорожденный ребенок с СВВО не является источником возбудителя ветряной оспы.
2.6. При заболевании беременной женщины опоясывающим лишаем, врожденные формы инфекции, вызванной ВЗВ, не возникают из-за отсутствия вирусемии и наличия у матери специфических иммуноглобулинов класса G (далее — IgG), защищающих плод.
2.7. Больной опоясывающим лишаем является источником ВЗВ и представляет эпидемиологическую опасность, в отношении него проводятся такие же профилактические и противоэпидемические мероприятия, как и в отношении больного ветряной оспой.
2.8. Эпидемиологически случаи ветряной оспы подразделяются на «подозрительные», «вероятные» и «подтвержденные» случаи:
«подозрительным» считается случай острого заболевания, при котором имеется один или несколько клинических признаков из перечисленных в пункте 2.1 Санитарных правил, один из которых — поражение кожи и слизистых оболочек в виде полиморфной макуло-папулезно-везикулезной сыпи; 
«вероятным» считается случай острого заболевания, при котором имеются один или несколько клинических признаков ветряной оспы и эпидемиологическая связь с другим подозрительным или подтвержденным случаем этой инфекции;
«подтвержденным» считается случай заболевания ветряной оспой, классифицированный как «подозрительный» или «вероятный» после лабораторного подтверждения диагноза.
В случае проявления ветряной оспы в атипичной или стертой форме при наличии лабораторного подтверждения заболевание классифицируется как «подтвержденное».
При отсутствии возможности проведения лабораторных исследований в медицинской организации или отсутствии показаний к их проведению «подозрительный» или «вероятный» случай классифицируется как «подтвержденный».
2.9. Окончательный диагноз ветряной оспы устанавливается на основании клинических данных и (или) при наличии лабораторного подтверждения диагноза или эпидемиологической связи с другими лабораторно подтвержденными случаями данного заболевания.
2.10. Иммунитет к ветряной оспе формируется после перенесенного заболевания или после проведения иммунизации против этой инфекции. Показателем наличия иммунитета к ВЗВ является присутствие в крови специфических IgG в иммунологически значимом (защитном) титре.
2.11. Основным профилактическим мероприятием, направленным На защиту населения от ветряной оспы, является вакцинопрофилактика, которая обеспечивает создание иммунитета (невосприимчивости) к этой инфекции.
III. Выявление, регистрация, учет и статистическое наблюдение больных
ветряной оспой или лиц с подозрением на это заболевание
3.1. Выявление случаев ветряной оспы или опоясывающего лишая, а также случаев, подозрительных на эти заболевания, проводится врачами, фельдшерами и медицинскими сестрами всех специальностей, в том числе индивидуальными предпринимателями, при оказании всех видов медицинской помощи, проведении профилактических и иных видов медицинских осмотров и обследований, диспансеризации, а также при медицинском наблюдении за лицами, общавшимися с больными ветряной оспой и опоясывающим лишаем 2 .
2 Санитарно-эпидемиологических правил СП 3.1/3.2.3146-13 «Общие требования по профилактике инфекционных и паразитарных болезней», утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 16.12.2013 № 65 (зарегистрировано Минюстом России 16.04.2014, регистрационный номер 32001) (далее — СП 3.1/3.2.3146-13 от 16.12.2013 № 65).
3.2. Выявление больных ветряной оспой или опоясывающим лишаем, а также лиц с подозрением на эти заболевания должно осуществляться при оказании населению медицинской помощи в амбулаторных и стационарных условиях (в том числе в условиях дневного стационара), включая оказание медицинской помощи в образовательных и оздоровительных организациях, а также вне медицинских организаций.
3.3. О каждом случае заболевания ветряной оспой или опоясывающим лишаем, а также при подозрении на указанные заболевания, медицинский персонал обязан в течение 2 часов сообщить по телефону, затем в течение 12 часов направить экстренное извещение в территориальный орган (учреждение) федерального органа исполнительной власти, уполномоченного на осуществление федерального государственного санитарно-эпидемиологического надзора, по месту выявления больного (независимо от места проживания и временного пребывания больного). Передача сообщений и экстренных извещений может осуществляться с использованием электронных средств связи и специализированных информационных систем.
3.4. Каждый случай ветряной оспы и опоясывающего лишая подлежит регистрации и учету в журнале учета инфекционных заболеваний по месту их выявления, а также в территориальных органах (учреждениях) федерального органа исполнительной власти, уполномоченного на осуществление федерального государственного санитарно-эпидемиологического надзора 3 .
3.5. Ответственными за полноту, достоверность и своевременность учета заболеваний ветряной оспой и опоясывающим лишаем, а также оперативное и полное сообщение о них в территориальный орган (учреждение), уполномоченный осуществлять федеральный государственный санитарно-эпидемиологический надзор, являются руководители медицинских, оздоровительных, образовательных и других организаций, индивидуальные предприниматели, осуществляющие медицинскую деятельность, выявившие больного 4 .
3.6. Сведения о регистрации случаев ветряной оспы на основании окончательных диагнозов вносятся в формы федерального государственного статистического наблюдения в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами 5 .
3.7. В территориальных органах (учреждениях) федерального органа исполнительной власти, уполномоченного на осуществление федерального государственного санитарно-эпидемиологического надзора, имеющиеся данные о зарегистрированных случаях ветряной оспы и опоясывающего лишая анализируются специалистами в рамках эпидемиологического надзора за инфекцией, вызванной ВЗВ, с целью составления эпидемиологического прогноза и повышения эффективности профилактических и противоэпидемических мероприятий.
4.1. Лабораторные методы исследования в медицинских организациях используются для диагностики атипичных и стертых форм заболевания, для проведения дифференциальной диагностики с другими заболеваниями, сопровождающимися везикулезной сыпью (например: инфекцией, вызванной вирусом простого герпеса, ящуром, энтеровирусной инфекцией, стрептодермией).
Показаниями для лабораторного обследования на инфекцию, вызванную ВЗВ, также являются:
подозрение на ветряную оспу у привитого против этой инфекции лица;
подозрение на повторное заболевание ветряной оспой.
4.2. Материалом для лабораторного исследования, в зависимости от клинических проявлений и локализации инфекционного процесса, служит содержимое везикул, сыворотка крови, спинномозговая жидкость, отделяемое носоглотки.
Выбор лабораторного метода исследования определяется его доступностью и возможностями конкретной лаборатории.
4.3. Лабораторными критериями, подтверждающими клинический диагноз случая ветряной оспы, являются:
выявление ДНК ВЗВ с помощью полимеразно-цепной реакции (ПНР) в клиническом материале (содержимом везикул, смывах со слизистой носоглотки, спинномозговой жидкости);
выявление иммуноглобулинов класса М (далее — IgM) или низкоавидных IgG к ВЗВ в сыворотке крови;
нарастание титра специфических антител в 4 и более раз в течение 10 — 14 дней (метод парных сывороток) при исследовании методом иммуноферментного анализа (ИФА) или в реакции связывания комплемента (далее — РСК);
выявление телец Арагао (скопления вируса) в окрашенных серебрением по Морозову мазках содержимого везикул при обычной или электронной микроскопии;
положительная проба Цанка — выявление многоядерных гигантских клеток в соскобе с основания везикулы, помещенном на предметное стекло, фиксированном 95 % спиртом и окрашенном по методу Романовского-Гимзы;
обнаружение антигенов вируса в мазках-отпечатках содержимого везикул с помощью иммунофлюоресцентного метода (ИФ метода);
выделение вируса из биологического материала (например: содержимого везикул, соскобов со слизистых оболочек и кожи, крови, ликвора) на чувствительных (эмбриональных) культурах клеток с последующей его идентификацией в РСК.
5.1. Мероприятия в отношении источника возбудителя инфекции проводятся медицинским персоналом медицинских и иных организаций в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами 6 .
5.2. Изоляция заболевшего ветряной оспой или опоясывающим лишаем завершается по истечении 5 дней со времени появления последнего свежего элемента сыпи.
Больные с легким течением заболевания изолируются на дому при наличии возможности соблюдения противоэпидемического режима по месту жительства 7 . Госпитализация в медицинские организации, оказывающие медицинскую помощь пациентам с инфекционными заболеваниями в стационарных условиях, осуществляется по клиническим (тяжелые и среднетяжелые формы заболевания) и эпидемиологическим показаниям.
Эпидемиологическими показаниями для госпитализации являются: невозможность обеспечения изоляции на дому и организации соответствующего противоэпидемического режима; выявление больных в учреждениях с постоянным (круглосуточным) пребыванием детей и взрослых (в том числе в медицинских организациях); выявление больных, проживающих в общежитиях; выявление больных, имеющих неблагоприятные бытовые условия проживания.
5.3. В направлениях на госпитализацию больных ветряной оспой (или лиц с подозрением на это заболевание) дополнительно указываются первоначальные симптомы, сведения о профилактических прививках и проведенном лечении, а также сведения о контактах заболевшего с больными ветряной оспой или опоясывающим лишаем.
В направлениях на госпитализацию больных опоясывающим лишаем (или лиц с подозрением на это заболевание) кроме анкетных данных указываются первоначальные симптомы, сведения о перенесенном в прошлом заболевании ветряной оспой или опоясывающим лишаем, о профилактических прививках против ветряной оспы, а также о проведенном лечении.
5.4. Лечение больных ветряной оспой и опоясывающим лишаем проводится в соответствии с порядками оказания медицинской помощи, стандартами медицинской помощи и клиническими рекомендациями (протоколами лечения) до их клинического выздоровления 8 .
8 Федеральный закон от 21.11.2011 № 323-ФЗ «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации» (Собрание законодательства Российской Федерации, 2011, № 48, ст. 6724; 2018, № 1 (ч. I), ст. 49).
5.5. Выписка из стационара пациента с ветряной оспой или опоясывающим лишаем проводится после его клинического выздоровления. В случае госпитализации по эпидемиологическим показаниям, выписка переболевшего (реконвалесцента) проводится не ранее шестого дня со времени появления последнего свежего элемента сыпи.
5.6. Допуск реконвалесцента ветряной оспы или опоясывающего лишая в коллектив разрешается после его клинического выздоровления, но не ранее шестого дня со времени появления у реконвалесцента последнего свежего элемента сыпи независимо от наличия вторичных случаев ветряной оспы в очаге.
5.7. Допуск реконвалесцентов в коллектив разрешается только при наличии справки об отсутствии медицинских противопоказаний для посещения образовательных и иных организаций и осуществления отдельных видов деятельности или учебы 9 от лечащего врача или фельдшера.
9 Приказ Минздравсоцразвития России от 02.05.2012 № 441н «Об утверждении Порядка выдачи медицинскими организациями справок и медицинских заключений» (зарегистрировано Минюстом России 29.05.2012, регистрационный номер 24366).
5.8. Диспансерное наблюдение за переболевшими ветряной оспой лицами не проводится.
VI. Организация и проведение санитарно-противоэпидемических
мероприятий в очагах инфекции, вызванной ВЗВ
6.1. В очагах инфекции, вызванной ВЗВ, первичные противоэпидемические мероприятия (изоляция и при необходимости госпитализация больного (больных), подозрительных на заболевание ветряной оспой или опоясывающим лишаем, осмотр лиц, контактировавших с больным (далее — контактные лица), с целью выявления других случаев заболеваний, вызванных ВЗВ, выяснение их эпидемиологического и прививочного анамнеза) проводятся врачом (фельдшером) медицинской, образовательной или оздоровительной организации в течение 24 часов после выявления больного ветряной оспой, опоясывающим лишаем (при подозрении на ветряную оспу, опоясывающий лишай), или получения экстренного извещения о таких случаях. Профилактические мероприятия проводятся в соответствии с пунктами 6.3 — 6.15 Санитарных правил.
6.2. Специалистами органов и учреждений, уполномоченных осуществлять федеральный государственный санитарно-эпидемиологический надзор, проводится эпидемиологическое расследование очагов инфекции, вызванной ВЗВ:
в медицинских организациях, оказывающих медицинскую помощь по профилю «акушерство и гинекология» — при регистрации каждого случая;
в организациях с круглосуточным пребыванием детей — при регистрации очагов с групповой заболеваемостью (двух и более случаев);
в одной группе или классе детской образовательной организации — при регистрации групповой заболеваемости (двух и более случаев);
в детской образовательной организации — при регистрации пяти и более случаев.
По результатам эпидемиологического расследования выдается предписание о проведении санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий 10 .
10 Статьи 44 и 50 Федерального закона от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
своевременное выявление больных инфекцией, вызванной ВЗВ, а также случаев заболеваний, подозрительных на эту инфекцию;
выявление лиц, не защищенных (не болевших и не привитых) против ветряной оспы, для проведения экстренной профилактики.
6.4. К категории контактных лиц относят:
лиц, общавшихся с заболевшим ветряной оспой в течение двух дней до появления у больного сыпи, в период высыпаний, в течение пяти дней после появления последнего элемента сыпи;
лиц, общавшихся с заболевшим опоясывающим лишаем с момента появления у него сыпи и в период высыпаний (до истечения пяти дней после появления последнего элемента сыпи).
6.5. При наличии среди контактных лиц, не болевших ветряной оспой, не привитых и (или) не получивших завершенный курс вакцинации против ветряной оспы, за ними устанавливается медицинское наблюдение сроком на 21 день с момента изоляции последнего заболевшего из очага ВЗВ инфекции.
Медицинское наблюдение за детьми и взрослыми, переболевшими ветряной оспой, а также получившими завершенный курс вакцинации против ветряной оспы (при наличии документального подтверждения), не проводится.
6.6. В качестве меры экстренной профилактики ветряной оспы в отношении лиц, не болевших ветряной оспой и не привитых против нее, контактировавших с больными ветряной оспой или опоясывающим лишаем, используется активная (вакцинация) и пассивная (введение иммуноглобулина) иммунизация.
Активная иммунизация (вакцинация) против ветряной оспы проводится детям (в возрасте от 12 месяцев) и взрослым, не имеющим медицинских противопоказаний к введению вакцины, в первые 72 — 96 часов после вероятного контакта с больным ветряной оспой или опоясывающим лишаем. Для специфической профилактики ветряной оспы применяют живые аттенуированные вакцины. Иммунизацию проводят в соответствии с инструкцией по применению используемой вакцины против ветряной оспы.
Профилактические прививки несовершеннолетним, не достигшим возраста 15 лет 11 , проводят с согласия родителей или иных законных представителей несовершеннолетних. Согласие или отказ от проведения вакцинопрофилактики оформляется в соответствии с нормативным правовым актом 12 .
Сведения о прививках, проведенных лицам, контактировавшим с больными ветряной оспой или опоясывающим лишаем (название, дата, доза, серия, срок годности вакцины), вносятся врачом в форму первичной медицинской документации медицинских организаций: историю развития ребенка (учетную форму 112/у), медицинскую карту ребенка (учетную форму 026/у), карту профилактических прививок (учетную форму 063/у), сертификат
профилактических прививок (учетную форму 156/у-93), журнал учета профилактических прививок (учетная форму 064/у) 13 .
Специфический (противоветряночный) иммуноглобулин (пассивная иммунизация) вводится медицинским персоналом по назначению врача в течение 72 — 96 часов после контакта с больным ветряной оспой или опоясывающим лишаем следующим лицам:
лицам, имеющим противопоказания к вакцинации;
иммунокомпрометированным детям в возрасте до 15 лет с отрицательным или неизвестным анамнезом в отношении ветряной оспы;
детям (в том числе родившимся недоношенными) в возрасте от 0 месяцев до 11 месяцев 29 дней — при отрицательном результате серологических исследований на IgG к ВЗВ у матери;
новорожденным, матери которых заболели ветряной оспой в период за 5 суток до родов или до 48 часов после них;
беременным женщинам — при отрицательном результате серологических исследований на IgG к ВЗВ;
пациентам, которым выполнена трансплантация костного мозга, независимо от перенесенного заболевания ветряной оспой.
Введение иммуноглобулина осуществляется в соответствии с инструкцией по применению препарата.
11 Пункт 2 статьи 11 Федерального закона от 17.09.1998 № 157-ФЗ «Об иммунопрофилактике инфекционных болезней» (Собрание законодательства Российской Федерации, 1998, № 38, ст. 4736; 2015, № 14, ст. 2008); приказ Минздрава России от 21.03.2014 № 125н «Об утверждении национального календаря профилактических прививок и календаря профилактических прививок по эпидемическим показаниям» (зарегистрировано Минюстом России 25.04.2014, регистрационный номер 32115), с изменениями, внесенными приказами Минздрава России от 16.06.2016 № 370н (зарегистрировано Минюстом России 04.07.2016, регистрационный номер 42728), от 13.04.2017 № 175н (зарегистрировано Минюстом России 17.05.2017, регистрационный номер 46745) (далее — Федеральный закон от 17.09.1998 № 157-ФЗ).
12 Санитарно-эпидемиологические правила СП 3.3.2367-08 «Организация иммунопрофилактики инфекционных болезней», утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 04.06.2008 № 34 (зарегистрировано Минюстом России 25.06.2008, регистрационный номер 11881) (далее — СП 3.3.2367-08 от 04.06.2008 № 34).
13 СП 3.3.2367-08 от 04.06.2008 № 34; приказ Минздравсоцразвития России от 22.11.2004 № 255 «О Порядке оказания первичной медико-санитарной помощи гражданам, имеющим право на получение набора социальных услуг» (зарегистрировано Минюстом России 14.12.2004, регистрационный номер 6188), с изменениями, внесенными приказом Минздрава России от 15.12.2014 № 834н (зарегистрировано Минюстом России 20.02.2015, регистрационный номер 36160).
6.7. При регистрации случая заболевания ветряной оспой в квартирных очагах врач (фельдшер):
осуществляет оценку общего состояния контактных лиц — осмотр зева, кожных покровов (для выявления элементов высыпаний), измерение температуры тела — в целях выявления среди них больных; осуществляет сбор эпидемиологического анамнеза о перенесенном ранее заболевании ветряной оспой или опоясывающим лишаем (дате ранее перенесенного заболевания), о наличии подобных заболеваний по месту работы, по месту учебы;
дает рекомендации по организации проведения профилактических мероприятий в течение всего времени лечения пациента на дому (регулярное проветривание, влажная уборка с моющими средствами помещений, мебели, игрушек);
информирует дошкольные образовательные организации о контактных детях в возрасте до 7 лет 14 , посещающих дошкольные образовательные организации, не болевших ветряной оспой, не привитых и (или) не получивших завершенный курс вакцинации против ветряной оспы, с целью их разобщения в течение 21 календарного дня с момента последнего общения с заболевшим ветряной оспой; при этом если дата контакта с ним установлена точно, дети до 7 лет допускаются в дошкольные образовательные организации в течение 10 календарных дней от начала контакта, с 11 по 21 календарный день обеспечивается их изоляция дома; дети в возрасте старше 7 лет и лица, ранее переболевшие ветряной оспой, разобщению не подлежат.
Наблюдение на дому за контактными лицами из числа детей, не посещающих дошкольные образовательные организации, осуществляется медицинским персоналом или родителями (опекунами), которых врач (фельдшер) информирует о признаках заболевания ветряной оспой и необходимости немедленного обращения за медицинской помощью при их появлении.
Взрослых из числа контактных лиц врач (фельдшер) информирует о признаках заболевания ветряной оспой и необходимости немедленного обращения за медицинской помощью при их появлении.
6.8. При регистрации очага инфекции в дошкольных образовательных организациях, общеобразовательных организациях, в организациях с круглосуточным пребыванием детей, в том числе медицинских организациях неинфекционного профиля, медицинский персонал (врач, фельдшер, медицинская сестра) с целью активного выявления больных ежедневно проводит осмотры детей, контактировавших с источником возбудителя ветряной оспы 15 , результаты осмотра фиксирует в медицинской документации. Осмотр включает оценку общего состояния, осмотр кожных покровов, измерение температуры тела.
В очагах инфекции с числом случаев 2 и более в одном коллективе допускается проведение лабораторного обследования контактных лиц для выявления неиммунных лиц, а также легких и атипичных форм инфекции.
В дошкольных образовательных организациях, в организациях с круглосуточным пребыванием детей в возрасте до 7 лет, в том числе медицинских организациях неинфекционного профиля, на протяжении 21 календарного дня с момента изоляции последнего заболевшего с диагнозом ветряной оспы администрацией и персоналом организуются и проводятся режимно-ограничительные и дезинфекционные мероприятия:
прекращается прием новых и временно отсутствовавших детей, не болевших ветряной оспой и не привитых против этой инфекции в группу (коллектив), где зарегистрирован случай заболевания ветряной оспой;
запрещается участие в массовых мероприятиях детей из группы (коллектива), в котором выявлены случаи заболеваний, а также перевод детей такой группы в другие группы (коллективы);
дважды в день организуется и проводится влажная уборка помещений с применением моющих и (или) дезинфицирующих средств; из обихода исключаются мягкие игрушки, игрушки из других материалов ежедневно в конце дня моются горячей водой с моющим средством; проводится дезинфекция воздушной среды с использованием ультрафиолетового облучения или других способов, разрешенных для этих целей, не менее четырех раз в день проводится проветривание (по 8 — 10 минут) 16 .
16 Санитарно-эпидемиологические правила СП 3.5.1378-03 «Санитарно-эпидемиологические требования к организации и осуществлению дезинфекционной деятельности», введенные в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 09.06.2003 № 131 (зарегистрировано Минюстом России 19.06.2003, регистрационный номер 4757).
6.9. Госпитализация в медицинские организации неинфекционного профиля лиц, контактировавших с заболевшим инфекцией, вызванной ВЗВ, не болевших ветряной оспой и не привитых против нее, в период медицинского наблюдения за ними, осуществляется по жизненным показаниям в отдельную палату или изолятор, при этом в стационаре в целях предупреждения распространения инфекции организуются дополнительные санитарно-противоэпидемические (профилактические) мероприятия в соответствии с пунктами 6.5 и 6.6 Санитарных правил; госпитализация в плановом порядке откладывается до окончания периода медицинского наблюдения.
6.10. В целях предупреждения «заносов» ветряной оспы в медицинские организации неинфекционного профиля, оказывающие медицинскую помощь детскому населению в стационарных условиях и в условиях дневного стационара, в организации отдыха и оздоровления детей, другие организации с круглосуточным пребыванием детей, в направлениях на плановую госпитализацию или иных сопроводительных документах следует указывать 17 : сведения об имеющихся у госпитализируемого ребенка прививках против ветряной оспы, о перенесенном ранее заболевании ветряной оспой, о контакте с больным ветряной оспой или опоясывающим лишаем.
17 Приказ Минздравсоцразвития России от 31.01.2012 № 69н «Об утверждении порядка оказания медицинской помощи взрослым больным при инфекционных заболеваниях» (зарегистрировано Минюстом России 04.04.2012, регистрационный номер 23726).
6.11. Для предупреждения врожденной патологии у новорожденных, в отношении беременных женщин, имевших контакт с заболевшим инфекцией, вызванной ВЗВ, медицинской организацией организуются следующие профилактические мероприятия:
при отсутствии у беременной женщины, контактировавшей с больным ветряной оспой или опоясывающим лишаем, клинических признаков этой инфекции, она подлежит медицинскому наблюдению и серологическому обследованию (первое исследование) до введения иммуноглобулина;
если при первом исследовании антитела IgG и IgM к вирусу ветряной оспы не обнаружены, беременной женщине необходимо ввести иммуноглобулин и через 10 — 14 дней повторить обследование на IgM (второе исследование) к ВЗВ для исключения факта инфицирования;
при отрицательном результате второго исследования на IgM к ВЗВ через 10 — 14 дней проводится следующее серологическое обследование (третье исследование). Если при третьем исследовании IgM не выявлены, то наблюдение прекращается, но женщина предупреждается о том, что она восприимчива (серонегативна) к ветряной оспе. Прививки против ветряной оспы таким женщинам проводятся после родов и окончания периода лактации;
если при первом исследовании у беременной женщины выявлены специфические IgG при отсутствии IgM к возбудителю ветряной оспы, обследование повторяют через 10 — 14 дней для исключения возможных ложноположительных результатов. Если при втором исследовании также выявлены специфические IgG, и не обнаружены IgM к вирусу ветряной оспы, то риск развития синдрома врожденной ветряной оспы у плода исключается, дальнейшее медицинское наблюдение за беременной женщиной по контакту в очаге ветряной оспы не проводят;
если при втором исследовании выявлены специфические IgM антитела, то через 10 — 14 дней проводят третье исследование, продолжая медицинское наблюдение за беременной. При выявлении IgG и IgM антител женщина предупреждается о риске развития у плода СВВО, о чем делают запись в медицинской документации, удостоверяя подписями врача и беременной. При сохранении беременности за женщиной проводят диспансерное наблюдение вплоть до родов 18 ;
если при первом исследовании в крови у беременной обнаружены специфические IgM и IgG антитела к возбудителю ветряной оспы, беременную предупреждают о наличии риска врожденной патологии плода, о чем делается запись в медицинской документации 19 . Через 10 — 14 дней после первого исследования проводят второе исследование с определением авидности IgG антител. При лабораторном подтверждении диагноза (положительные IgM антитела к вирусу ветряной оспы и низкий индекс авидности IgG) женщина предупреждается о высоком риске врожденной патологии плода. При сохранении беременности за женщиной проводят диспансерное наблюдение вплоть до родов.
18 Приказ Минздрава России от 01.11.2012 № 572н «Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи по профилю «акушерство и гинекология (за исключением использования вспомогательных репродуктивных технологий)» (зарегистрировано Минюстом России 02.04.2013, регистрационный номер 27960), с изменениями, внесенными приказами Минздрава России от 17.01.2014 № 25н (зарегистрировано Минюстом России 19.03.2014, регистрационный номер 31644); от 11.06.2015 № 333н (зарегистрировано Минюстом России 10.07.2015, регистрационный номер 37983); от 12.01.2016 № 5н (зарегистрировано Минюстом России 10.02.2016, регистрационный номер 41053).
6.12. При выявлении случая заболевания, вызванного ВЗВ у пациентки медицинской организации, оказывающей медицинскую помощь женщинам в период беременности, родов и в послеродовом периоде по профилю «акушерство и гинекология» в стационарных условиях (в родовспомогательном учреждении), администрация медицинской организации организует и проводит профилактические и противоэпидемические мероприятия в очаге, в том числе:
организует изоляцию заболевшей, ее дальнейшее лечение (в зависимости от клинического состояния и срока беременности) в условиях инфекционного отделения многопрофильной больницы или инфекционной больницы (в боксе стационара другого профиля) или амбулаторно; в случае вступления пациентки в роды, она изолируется в родовой бокс;
организует и проводит ежедневное медицинское наблюдение за пациентами и медицинским персоналом, находившимися в контакте с заболевшей (в отделениях, в которых заболевшая находилась или посещала в течение двух дней до появления клинических симптомов заболевания ветряной оспой и с начала заболевания) — в течение 21 дня с момента ее изоляции (термометрия 2 раза в день, осмотр кожных покровов);
организует экстренную иммунизацию против ветряной оспы в течение 72 — 96 часов с момента контакта медицинского персонала (не привитых или не имеющих сведений о напряженности иммунитета к ветряной оспе; допускается предварительное серологическое обследование на напряженность иммунитета к ветряной оспе); медицинский персонал, не имеющий защитного уровня иммунитета к ветряной оспе и не получивший экстренную иммунизацию, отстраняется от работы с 11 по 21 день от начала контакта с заболевшей;
организует серологическое обследование на напряженность иммунитета к ветряной оспе пациентов с неизвестным прививочным анамнезом и не болевших ветряной оспой; пациентов, не имеющих защитного уровня иммунитета к ветряной оспе, изолируют на период с 11 по 21 день от начала контакта с заболевшей; в зависимости от клинического состояния и потребности в оказании медицинской помощи таких пациентов выписывают и изолируют на дому, либо размещают в боксах или боксированных палатах;
организует экстренную профилактику ветряной оспы в соответствии с пунктами 6.6 и 6.12 Санитарных правил пациентам, контактировавшим с заболевшей, в том числе новорожденному заболевшей ветряной оспой родильницы.
При заболевании кормящей матери грудное вскармливание не противопоказано при условии соблюдения правил общей гигиены, за исключением случаев, когда заболевание у матери проявляется в течение пяти дней до или через два дня после родов. В таком случае ребенок изолируется от матери в бокс до окончания у нее заразного периода (отпадания корочек). На период изоляции кормление ребенка допускается осуществлять сцеженным грудным молоком.
При переводе в другие отделения и выписке пациентов, бывших в контакте с больной ветряной оспой (инфекцией, вызванной ВЗВ), администрация медицинской организации обеспечивает запись о наличии контакта и сроках наблюдения в медицинской документации (при выписке до окончания периода наблюдения информация о контакте по ВЗВ — инфекции в стационаре передается в медицинскую организацию по месту жительства).
Администрация медицинской организации обеспечивает прием новых пациенток в отделение в течение 21 дня с момента изоляции заболевшей только при наличии у них данных о защитном уровне иммунитета к ветряной оспе или документально подтвержденных сведений 20 о перенесенном ранее заболевании ветряной оспой или завершенном курсе вакцинации против ветряной оспы.
6.13. При выявлении больного ветряной оспой, опоясывающим лишаем в стационаре, учреждениях стационарного социального обслуживания для взрослых в очаге администрация таких организаций организует и проводит профилактические и противоэпидемические мероприятия, в том числе:
организует изоляцию и дальнейшее лечение заболевшего (в зависимости от клинического состояния) в условиях инфекционного стационара (в боксе или боксированной палате стационара другого профиля) или направляет на амбулаторное лечение;
организует и проводит ежедневное медицинское наблюдение за пациентами и медицинским персоналом, находившимися в контакте с заболевшим (отделения, в которых заболевший находился или посещал в течение двух дней до появления клинических симптомов заболевания ветряной оспой и с начала заболевания) — в течение 21 дня с момента изоляции больного (термометрия два раза в день, осмотр кожных покровов);
организует среди пациентов, контактных с заболевшим, а также медицинского персонала отделений, в которых находился заболевший, выявление лиц, не болевших ветряной оспой (инфекцией, вызванной ВЗВ), не привитых или имеющих незавершенный курс вакцинации (однократно привитых) против ветряной оспы; при необходимости, организует серологическое обследование на напряженность иммунитета к ветряной оспе, организует экстренную профилактику в соответствии с пунктом 6.6 Санитарных правил;
контактных лиц, не болевших ветряной оспой (инфекцией, вызванной ВЗВ), не привитых (имеющих незавершенный курс вакцинации) против ветряной оспы, не имеющих защитного уровня иммунитета к ветряной оспе и не получивших экстренную иммунизацию, из числа персонала — отстраняет от работы с 11 по 21 день от начала контакта с заболевшим; из числа пациентов — изолирует на период с 11 по 21 день от начала контакта с заболевшим;
при переводе в другие отделения и выписке пациентов, бывших в контакте с больным ветряной оспой (инфекцией, вызванной ВЗВ), обеспечивает запись о наличии контакта и сроках наблюдения в медицинской документации (при выписке до окончания периода наблюдения информация о контакте по инфекции, вызванной ВЗВ, в стационаре передается в медицинскую организацию по месту жительства);
прием новых пациентов (обеспечиваемых) в отделение (группу) в течение 21 дня с момента изоляции заболевшего (или до завершения проведения противоэпидемических мероприятий) в плановом порядке осуществляется только при наличии у этих пациентов данных о защитном уровне иммунитета к ветряной оспе или документально подтвержденных сведений о перенесенном ранее заболевании ветряной оспой или завершенном курсе вакцинации (при наличии двух прививок) против ветряной оспы 21 .
6.14. Мероприятия по прерыванию путей передачи возбудителя:
в очагах инфекции, вызванной ВЗВ заключительная дезинфекция не проводится;
в помещении, в котором находится больной, необходимо дважды в день проводить влажную уборку с применением моющих и (или) дезинфицирующих средств и проветривание (по 8 — 10 минут не менее четырех раз в день);
больному и лицам, осуществляющим уход за ним, необходимо строго соблюдать правила личной гигиены, после контакта с больным тщательно мыть руки.
7.1. Иммунизация населения против ветряной оспы проводится в соответствии с календарем профилактических прививок по эпидемическим показаниям 22 , а также в рамках региональных календарей профилактических прививок. Для иммунизации применяются иммунобиологические лекарственные препараты, разрешенные к применению в Российской Федерации 23 , иммунизация проводится в соответствии с инструкциями к применению данных препаратов.
22 Федеральный закон от 17.09.1998№ 157-ФЗ.
7.2. Вакцинация против ветряной оспы в плановом порядке, в первую очередь показана ранее не болевшим, не привитым или не имеющим завершенного курса иммунизации (привитым однократно) против ветряной оспы детям и взрослым, относящимся к группе высокого риска тяжелого клинического течения и осложнений этой инфекции:
лицам, страдающим тяжелыми хроническими заболеваниями легких, сердечно-сосудистой системы, метаболическими, эндокринными расстройствами, нервно-мышечными расстройствами, муковисцидозом;
лицам, получающим иммунодепрессанты;
лицам, длительно получающим системные стероиды;
лицам, которым планируется проводить лучевую терапию;
пациентам, которым планируется произвести трансплантацию.
Иммунизация таких лиц проводится при отсутствии симптомов, указывающих на недостаточность клеточного иммунитета и с учетом полной гематологической ремиссии (по результатам анализа крови), при уровне лимфоцитов не менее 1200/мм 3 . При необходимости вакцинации в острой фазе лейкоза, терапию следует отменить на неделю до и после прививки.
Вакцинация лиц, которым предстоит трансплантация органов, проводится за несколько недель до начала проведения терапии иммунодепрессантами.
К группам детей и взрослых высокого риска заболевания ветряной оспой, относятся не болевшие, не привитые ранее или не получившие завершенный курс вакцинации, которым также рекомендована вакцинация:
пациенты и воспитанники учреждений стационарного социального обслуживания с круглосуточным пребыванием (дома ребенка, детские дома, интернаты);
женщины, планирующие беременность (не менее чем за 3 месяца);
персонал образовательных организаций и организаций стационарного социального обслуживания, прежде всего, с круглосуточным пребыванием обслуживаемых лиц.
7.3. Для профилактики вакциноассоциированных заболеваний принимают меры по исключению (ограничению) контакта не иммунных к инфекции, вызванной ВЗВ, беременных женщин и лиц с иммунодефицитными состояниями, с лицами, вакцинированными против ветряной оспы в течение второй и третьей недели с момента получения прививки.
8.1. Эпидемиологический надзор за ветряной оспой и опоясывающим лишаем организуется и проводится органами, осуществляющими федеральный государственный санитарно-эпидемиологический надзор, в соответствии с законодательством Российской Федерации 24 .
8.2. Мероприятия по обеспечению федерального государственного санитарно-эпидемиологического надзора включают:
мониторинг эпидемиологической ситуации;
анализ структуры заболеваемости;
слежение за циркуляцией возбудителя, его фенотипическими и генотипическими свойствами;
контроль за организацией и проведением профилактических прививок;
оценку своевременности и эффективности проводимых профилактических и противоэпидемических мероприятий;
своевременное принятие управленческих решений и прогнозирование заболеваемости.
24 Статья 44 и 50 Федерального закона от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
IX. Гигиеническое воспитание и обучение граждан по вопросам
профилактики ветряной оспы и опоясывающего лишая
9.1. Гигиеническое воспитание населения является одним из методов профилактики ветряной оспы и опоясывающего лишая, включает в себя: предоставление населению информации о ветряной оспе, основных симптомах заболевания и мерах профилактики с использованием средств массовой информации, листовок, плакатов, бюллетеней, проведение индивидуальной беседы.
9.2. Мероприятия по санитарно-просветительской работе среди населения о мерах профилактики ветряной оспы и опоясывающего лишая, включая вакцинопрофилактику, проводят органы, осуществляющие федеральный государственный санитарно-эпидемиологический надзор, органы исполнительной власти в сфере охраны здоровья, медицинские организации.
источник
14. Рекомендации по правилам перевозки инфекционных материалов, 2009-2010 годы.* Женева, Всемирная организация здравоохранения (WHO/HSE/ EPR/2008.10).
________________
* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым здесь и далее по тексту, можно получить перейдя по ссылке на сайт http://shop.cntd.ru. — Примечание изготовителя базы данных.
3.1. Натуральная оспа — острое инфекционное высококонтагиозное особо опасное заболевание вирусной этиологии, относящееся к карантинным инфекциям. Возбудитель — ДНК-содержащий вирус, принадлежащий к семейству Poxviridae , роду Orthopoxviruses .
3.2. Естественным резервуаром вируса является больной (а также умерший) человек. Заболевший натуральной оспой человек заразен от начала болезни до полного освобождения от корок. Заражение происходит воздушно-капельным, воздушно-пылевым или контактно-бытовым путями; вирус может также передаваться внутриутробно. Наиболее заразительным является период с 4-го по 9-й день болезни, когда во внешнюю среду при разговоре, кашле и чихании больного с отделяемым слизистых полости рта и зева выделяется большое количество вируса. В дальнейшем источником вируса является в основном содержимое кожных элементов и вируссодержащая пыль из отпавших и подсыхающих корок. Помимо этого заражение может произойти за счет контаминированных вирусом воздуха, белья больного и предметов.
3.3. В результате успешно проведенной под эгидой Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) международной программы (1958-1980 г.) натуральная оспа была искоренена во всем мире. По рекомендации глобальной комиссии по сертификации ликвидации оспы вакцинация против этой инфекции была отменена в 1980 г.
По решению ВОЗ, коллекции штаммов этого возбудителя сохраняются для научных целей в двух Сотрудничающих центрах ВОЗ, регулярно контролируемых этой организацией:
— по диагностике ортопоксвирусных инфекций и музей штаммов и ДНК вируса оспы на базе ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (Россия, Новосибирская область, р.п.Кольцово);
— по оспе и другим поксвирусным инфекциям на базе Центра контроля и предупреждения инфекционных заболеваний (США, Атланта).
3.4. В освобожденном от натуральной оспы мире при отсутствии природного резервуара возбудителя этой инфекции эпидемический процесс может возникнуть снова только при артифициальном заражении. В этом случае источником инфекции может служить вируссодержащий материал, привнесенный в окружающую среду в результате совершения акта биотерроризма или иных причин (внутрилабораторное инфицирование, вскрытие затерянных или забытых хранилищ вируса, а также захоронений умерших от оспы, в некоторых из которых благодаря особым условиям не исключено сохранение жизнеспособного вируса). В результате может возобновиться трансмиссия оспы с передачей инфекции от человека к человеку. При этом резкое падение коллективного иммунитета к оспе у населения и его полное отсутствие у лиц, родившихся после отмены оспопрививания, может привести к более агрессивному, чем ранее, распространению инфекции.
3.5. Опыт борьбы с завозными вспышками оспы в прошлом показал, что клинический диагноз у первых заболевших этой инфекцией в большинстве случаев оказывался неверным. На сегодняшний день эта ситуация усугубляется тем, что современное поколение инфекционистов не встречалось с оспой и знает о ней только по описанию в литературе. В этой связи лабораторная диагностика как никогда раньше становится важнейшим звеном в предупреждении распространения оспы.
3.6. Проведение диагностических исследований при подозрении на натуральную оспу осуществляется в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», который является Референс-центром по мониторингу за ортопоксвирусными инфекциями [6], и имеет на своей базе Сотрудничающий центр ВОЗ по диагностике ортопоксвирусных инфекций и музей штаммов и ДНК вируса оспы (Россия, Новосибирская область, р.п.Кольцово) [7].
В случае чрезвычайной ситуации санитарно-эпидемиологического характера диагностические исследования без выделения возбудителя натуральной оспы (молекулярно-генетические и иммунологические) по поручению Главного государственного санитарного врача Российской Федерации могут осуществлять лаборатории, имеющие лицензии на проведение экспериментальных и диагностических видов работ с возбудителями инфекционных заболеваний 1 группы патогенности.
Врач, выявивший на дому больного с подозрением на натуральную оспу, обязан незамедлительно организовать следующие первичные противоэпидемические мероприятия:
— изолировать больного, снабдив его бельем, посудой, приемником выделений, предметами ухода за больным, личной гигиены и прочими необходимыми вещами, закрыть окна и дверь;
— принять меры для исключения контактов больного с окружающими;
— организовать проведение текущей дезинфекции в помещении, где находится больной до момента его госпитализации;
— срочно известить доступными способами руководство своего учреждения о выявлении подозрительного на натуральную оспу больного;
— собрать предварительные сведения о возможном источнике заражения и круге контактировавших с больными лиц.
Далее информация о выявлении подозрительного на натуральную оспу больного должна быть незамедлительно передана в местные и вышестоящие органы и учреждения санитарно-эпидемиологического надзора по подчиненности, Федерального медико-биологического агентства, отделы и управления здравоохранением по подчиненности, территориальные органы власти и заинтересованные ведомства.
Указанные органы направляют в очаг по месту выявления (или госпитализации) больного группу в составе эпидемиолога, опытного инфекциониста и вирусолога для верификации диагноза и эпидемиологического расследования.
Порядок проведения противоэпидемических и дезинфекционных мероприятий, направленных на обеспечение общественной и личной безопасности граждан при локализации и ликвидации очага (очагов) натуральной оспы при ее появлении на территории Российской Федерации вследствие биотеррористических акций или иных обстоятельств, определен в МУ 3.1/3.5.2497-09 «Организация и проведение противоэпидемических и дезинфекционных мероприятий при натуральной оспе» [12].
4.1. Взятие проб осуществляют врачи-вирусологи, прошедшие специальную подготовку и имеющие недавнюю (в пределах 3 лет) успешную прививку против оспы. Если к взятию проб привлекается невакцинированный сотрудник, то это может быть только тот, который не имеет противопоказаний к вакцинации. Последняя может потребоваться при подтверждении диагноза оспы. Для взятия проб необходимо иметь с собой упаковку с соответствующими стерильными инструментами, одноразовой пластиковой лабораторной посудой и материалами, перечень которых см. в приложении 1. Процедура взятия проб должна выполняться в соответствии с правилами противоэпидемического режима: работа в защитной одежде, маске, очках и перчатках, соблюдение мер личной и общественной безопасности и др. (см. СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)») [8].
4.2. В качестве проб для диагностического исследования используют:
— содержимое кожных поражений (в зависимости от стадии болезни — везикул, пустул, корочки, соскоб со дна пузырьков, макул или папул);
— мазки с задней стенки глотки и миндалин;
— кровь;
— в случае смерти — кусочки органов умерших.
4.2.1. Для вирусологического и других исследований содержимое везикул или пустул отсасывают туберкулиновым шприцем, прокалывая стенку пузырька у его основания; для этой цели может использоваться игла, конец которой помещают над открытой пробиркой и несколько наклоняют его вниз, что облегчает отток жидкости. При недостаточной наполненности пузырьков в периоде подсыхания пустул для получения пробы применяют два способа. После вскрытия пузырька скальпелем или другим острым инструментом сбор остатков жидкости производят небольшими ватными тампонами (на коротком стержне), которые помещают затем в сухую пробирку, отламывая при необходимости стержни. При затруднении в использовании вышеописанного способа скальпелем или маленькими ножницами срезают верхушки пузырьков и помещают их в отдельную пробирку. Корочки отделяют глазным пинцетом.
Собранный из 6-10 однородных кожных элементов больного материал, как уже указывалось, помещают в пластиковые пробирки или флаконы с герметически завинчивающимися крышками. Крышки дополнительно фиксируют — например, парафинизированным полиэтиленом (парафильмом), липкой лентой, расплавленным парафином [14].
Взятие пробы для электронноскопического исследования производят путем легкого прикосновения подготовленной электронноскопической сеточки к основанию вскрытого пузырька (везикулы или пустулы). Используя этот же прием, следует сделать отпечатки на не менее чем трех сеточках, каждый раз несколько меняя давление на основание пузырька. Материал на сеточках должен просохнуть на воздухе. Сетки помещают в специальную коробку или ячейку коробки и записывают, какая ячейка использовалась для данного образца. Коробку обертывают фольгой или адгезивной пленкой.
Помимо этого, на обезжиренных предметных стеклах делают мазки соскоба или содержимого пузырьков, а также мазки-отпечатки с основания кожных элементов и мест удаления плотно «сидящих» корочек (по 2-3 мазка). Мазки высушивают на воздухе в течение 20 мин. Затем стекла маркируют, складывают таким образом, чтобы они не соприкасались между собой той стороной, на которой сделан мазок, и помещают их в специальную пластиковую коробку для стекол. Коробку заворачивают в фольгу или обертывают адгезивной пленкой.
Внимание! Мазки на предметных стеклах и электронноскопических сеточках могут быть сделаны у постели больного только в том случае, если у берущего пробы вирусолога имеются соответствующие навыки. В противном случае это делается в диагностической лаборатории, куда будут направлены пробы .
4.2.2. При отсутствии у больного кожных поражений, что может иметь место в ранней стадии болезни или при некоторых формах оспы (оспа без сыпи, ранняя геморрагическая оспа), берут мазки с задней стенки глотки и миндалин. Процедуру осуществляют с помощью ватных тампонов на стержне, который затем опускают в пластиковую пробирку или флакон, не добавляя жидкости, и герметически ее закрывают. Мазки из зева следует брать и при недостаточном количестве материала из кожных поражений.
4.2.3. Кровь для обнаружения вируса берут из локтевой вены в количестве 4,5 мл шприцем, в который предварительно набирают 0,5 мл стерильного антикоагулянта. Кровь выливают в пробирку, которую осторожно встряхивают, чтобы предотвратить свёртывание крови, и герметично закрывают. Одновременно берут кровь (5-10 мл) для получения сыворотки, необходимой для серологического исследования, и 1 мл для проведения МПЦР.
4.3. Сразу после взятия пробы пробирки маркируют, указывая фамилию и инициалы больного, возраст, день болезни, вид материала (например, кровь, корочки и т.д.) и дату его взятия. Остальные сведения о больном (предполагаемый диагноз, дату поступления, вакцинный статус и прочее указывают в сопроводительной карточке (см. раздел 5).
4.4. В случае смерти больного с подозрением на оспу при аутопсии берут фрагменты кожи с поражениями, кусочки лимфатических узлов и внутренних органов (легких, печени, почек, селезёнки) предпочтительнее с макроскопически видимыми поражениями отдельно для вирусологического и патогистологического исследования. В последнем случае кусочки органов размером до 1х2х3 см помещают в пластиковые флаконы, используя отдельный флакон для каждого кусочка, и заливают 8 мл 4%-го раствора параформальдегида. Фиксация образцов в параформальдегиде обеспечивает их обеззараживание в течение 48 ч. Порядок обращения с образцами для вирусологического исследования аналогичен описанному в пп.4.2, 4.3 и разделе 5.
4.5. После завершения сбора образцов от больного (больных) все инструменты и подсобные материалы, а также использованные средства индивидуальной защиты (перчатки, халат и пр.) дезинфицируют согласно требованиям СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)» [8].
Упаковку и транспортирование проб для исследования осуществляют в соответствии с требованиями СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности» [9], МУ 3.4.2552-09 «Организация и проведение первичных противоэпидемических мероприятий в случаях выявления больного (трупа), подозрительного на заболевания инфекционными болезнями, вызывающими чрезвычайные ситуации в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения» [13] и WHO/HSE/EPR/2008.10 «Рекомендации по правилам перевозки инфекционных материалов» [14].
Маркированные и герметично закрытые пробирки, флаконы с пробами и коробку с мазками от каждого больного помещают отдельно, перекладывая адсорбирующим материалом (например, ватой) в двойной пластиковый пакет, который затем заклеивают или запаивают. Количество адсорбирующего материала должно быть достаточным для того, чтобы поглотить всю жидкость в случае повреждения упаковки. Не допускается упаковка образцов материалов от разных людей в один и тот же пакет.
Заклеенные пакеты с образцами помещают в закрывающийся (с возможностью опломбирования) металлический или пластиковый контейнер, на дне которого размещают адсорбирующий материал (марлевая салфетка, ткань, вата и пр.), смоченный раствором дезинфицирующего средства.
Контейнер с материалом подписывают (фамилия, имя, отчество больного (больных), дата взятия и вид материала), опечатывают, помещают в специальный переносной термоизолирующий контейнер, укомплектованный охлаждающими элементами, и транспортируют в лаборатории, указанные выше (см. п.3.6). Транспортирование осуществляется нарочным, информированным о правилах доставки материала.
Сопроводительные документы составляют в двух экземплярах: один отправляют вместе с пробами в лабораторию, второй (копия) остается у лица, направляющего пробы на исследование. В сопроводительном документе указывают фамилию, имя, отчество, возраст больного, диагноз, даты начала заболевания, появления сыпи, взятия материала, характера материала для исследования, фамилию врача, взявшего пробы. Указывают, был ли привит заболевший против оспы и примерную дату вакцинации, отмечают наличие или отсутствие рубцов после вакцинации, характер контакта с предполагаемым источником инфекции. Указывают адрес места назначения, адрес, фамилию и телефон отправителя. Делается надпись: «Инфекционный материал». Перед транспортированием срочно извещают специализированную лабораторию, в которую направляется материал.
Все работы по проведению исследования материала проводят с соблюдением требований СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)» [8].
Схема проведения лабораторного исследования приведена на рисунке (прилож.8).
6.1. Учитывая, что фактор времени при появлении оспы имеет огромное значение для эффективности противоэпидемических мероприятий, обработка и исследование взятых у больных (или подозреваемых на заболевание) проб должны начинаться немедленно после поступления материала в лабораторию. В ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» исследование начинают одновременно методами ускоренной диагностики, включая электронную микроскопию, и путем выделения возбудителя. В других лабораториях, имеющих соответствующую лицензию, используют молекулярно-генетические и иммунологические методы ускоренной диагностики.
К методам ускоренной диагностики относятся:
— электронная микроскопия содержимого кожных поражений и мазков из глотки;
— обнаружение ортопоксвирусного антигена в обработанных пробах с помощью соответствующей тест-системы ИФА;
— выявления антител к ортопоксвирусам в сыворотке крови в соответствующей тест-системе ИФА;
— полимеразно-цепная реакция (ПЦР), в т.ч. мультиплексная полимеразная цепная реакция (МПЦР).
Проведение исследования с помощью электронной микроскопии и иммуно-ферментного анализа позволяет дать ответ в течение 2-4 ч после начала исследования. (Если используется набор реагентов для ИФА с планшетами, требующими предварительной сенсибилизации, то время проведения ИФА увеличивается до 22-26 ч.) Эти методы не позволяют дифференцировать вирус оспы от других патогенных для человека ортопоксвирусов (вирусов вакцины, оспы обезьян и оспы коров). МПЦР обеспечивает не только идентификацию ДНК вируса оспы, но и ее дифференциацию от близкородственных патогенных для человека ортопоксвирусов. Время проведения теста 5-6 ч.
6.2. Обнаружение при электронной микроскопии вирионов группы герпеса при отсутствии вирионов оспенной группы и ортопоксвирусного антигена позволяет дать заключение о герпетической природе заболевания. При наличии в исследуемом материале ортопоксвирусных вирионов и/или ортопоксвирусного антигена внутривидовая дифференциация осуществляется с помощью МПЦР.
6.3. Для подтверждения диагноза и всесторонней характеристики возбудителя проводят выделение возбудителя на куриных эмбрионах или в культуре клеток.
6.4. При необходимости установления диагноза при отсутствии соответствующих тест-систем ИФА и невозможности исследовать пробу с помощью МПЦР можно использовать вспомогательные методы, описанные в разделе 10.
При подготовке проб следует учесть необходимость сохранить часть материала для контрольных и повторных исследований.
7.1. Для электронной микроскопии везикулярную и пустулезную жидкости исследуют неразведенными и в разведении 1:5 (на дистиллированной воде). При исследовании корок, их (в количестве 1-2) растирают в маленькой фарфоровой ступке или помещают на часовое стекло, покрывают 1-2 каплями дистиллированной воды, через 5-10 мин измельчают скальпелем и слегка растирают. Жидкая фракция представляет собой материал для исследования.
Мазки-отпечатки или мазки соскобов со дна пузырьков, макул или папул смывают 1-2 каплями дистиллированной воды и полученную взвесь используют для приготовления препаратов для электронноскопического исследования (негативное контрастирование). Последние готовят следующим образом. На покрытое парафином предметное стекло помещают последовательно три капли: 1) исследуемого материала; 2) дистиллированной воды и 3) 2%-го раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты с рН 7,0. Заранее подготовленную (покрытую формваром или парлодием и напылённую углем) сетку для адсорбции вируса опускают на 30-60 с в каплю исследуемого материала, затем (для промывки) на 3 с в каплю дистиллированной воды и для контрастирования препарата на 30-40 с в каплю фосфорно-вольфрамовой кислоты. После каждого погружения сетку просушивают лёгким прикосновением её края к фильтрованной бумаге*. Электронноскопические сетки, на которые была нанесена проба у постели больного, следует обрабатывать, начиная с промывки**.
________________
* Обычно используют сетки, предназначенные для исследований взвесей. Их приготовление описано в прилож.2.
** Для негативного контрастирования может быть использован также насыщенный водный или спиртовой раствор уранилацетата.
Если в зоне повышенной безопасности нет электронного микроскопа, то перед выносом сеток для просмотра их обеззараживают парами 37%-го формальдегида и ультрафиолетовым облучением. Один из способов описан ниже. В 60 мм чашку Петри, содержащую приготовленные сетки, помещают небольшой пластиковый контейнер (15 мм в диаметре) с 10 каплями концентрированного (37%-го) раствора формальдегида. Чашку Петри закрывают и ставят в большую (150 мм) чашку Петри без крышки, куда налит тонкий слой 5%-го раствора хлорамина. Все помещается в предназначенное окно под ультрафиолетовые лучи. Источник облучения — 15W-я ультрафиолетовая лампа, расстояние до объекта 5 см, время облучения 30 мин.
7.2. Для выявления ортопоксвирусного антигена в ИФА используют корки, жидкость из пузырьков, соскобы с кожных элементов, кровь, мазки из зева, кусочки органов умерших: корки, соскобы и кусочки органов гомогенизируют и добавляют физиологический раствор или фосфатно-цитратный буфер Мак-Ильвейна (рН 7,2; см. прилож.3) в количестве, необходимом для получения суспензий в разведении примерно 1:5-1:50. Везикулярную и пустулезную жидкости используют цельными или, в зависимости от количества материала, разведенными 1:5-1:50.
Взятую для выделения вируса кровь (со стерильным антикоагулянтом) центрифугируют при 450 g; плазму и светлый (лейкоцитарный) слой отсасывают раздельно, каждую фракцию разводят 1:2 буферным раствором Мак-Ильвейна (рН 7,2) и исследуют по отдельности.
Тампоны с отделяемым зева смывают 1,0 мл физиологического раствора или фосфатно-солевого буфера и исследуют.
7.3. Эти же подготовленные материалы используют для молекулярно-биологического исследования, изоляции вируса в клеточной культуре или куриных эмбрионов и других тестов (см. далее).
Перед заражением эмбрионов или культуры клеток в исследуемые материалы добавляют антибиотики (пенициллин, гентамицин или другие) в везикулярную жидкость и кровь — в расчете 200 ед./мл, в остальные материалы — по 500 ед./мл.
7.4. Для выявления антител к ортопоксвирусам из взятой для этой цели порции крови отсасывается сыворотка, которая исследуется в соответствующей тест-системе ИФА.
_______________
* Наименование пункта 8.1 в бумажном оригинале выделено курсивом. — Примечание изготовителя базы данных.
8.1.1. Электронная микроскопия (метод негативного контрастирования)
Просмотр подготовленных сеток проводят при увеличении 15000-20000. Обнаружение ортопоксвирусов осуществляется по характерной форме, структуре и размеру вирионов. Форма ортопоксвирусов может быть кирпичеобразной либо овальной, размер 200х300 нм. Следует иметь в виду, что иногда вирионы адсорбируются на сетку меньшей плоскостью (торцом), и тогда они имеют вид округлых частиц диаметром около 150 нм.
Как правило, у большинства вирионов внутренняя структура не выявляется. Вместе с тем, у некоторых обнаруживается двухслойная наружная мембрана, разделённая электроннооптически плотным пространством, заполненным фосфорно-вольфрамовой кислотой, у других — на поверхности видны характерные удлинённые трубчатые структуры. Во внутренней полости вириона находится нуклеоид, который выявляется как структура низкой электроннооптической плотности (светлое образование двояковогнутой формы на тёмном фоне перенуклеоидного пространства, заполненного фосфорно-вольфрамовой кислотой). Вирионы могут располагаться по одиночкам или группами. Главными критериями (кроме формы и размеров), облегчающими идентификацию ортопоксвирусов, являются наличие поверхностных трубочек и нуклеоида характерной двояковогнутой формы (рис.1).
Рис.1. Вирионы ортопоксвирусов
При проведении диагностических электронноскопических исследований могут быть выявлены возбудители заболеваний, протекающих с кожными поражениями. К их числу относятся вирусы группы герпеса (ветряной оспы, простого герпеса) и парапоксвирусы (рис.2). Первые имеют меньшие размеры (110-120 нм), округлую форму и сферический нуклеоид. Неповреждённые вирионы группы герпеса окружены внешней оболочкой, имеющей неправильную форму с выступами (рис.2). Вирионы парапоксвируса имеют не кирпичеобразную, а овоидную форму, меньшие размеры и отличаются от ортопоксвирусов характером поверхностного рельефа. При обнаружении вирионов их детальное изучение проводят при увеличении 50000 и более.
Рис.2. Вирионы вируса ветряной оспы (А и Б) и вирионы парапоксвируса (В)
А — вирус ветряной оспы с наружной оболочкой-конвертом при увеличении 100000;
Б — тот же вирус без наружной оболочки при увеличении 168000;
В — вирионы парапоксвирусов (паравакцины)
На рис.1 приведен вид ортопоксвирусов при негативном контрастировании.
Заключение о результатах исследования основывается на данных просмотра не менее 2 сеток от больного. Обнаружение 3 и более вирионов с характерной для ортопоксвирусов морфологией считается достаточным для заключения о наличии в материале ортопоксвирусов. Для отрицательного заключения в каждой из двух сеток просматривают не менее 3/4 ячеек в течение 30 мин.
Иммунная электронная микроскопия
Эффективность выявления возбудителей вирусных инфекций многократно возрастает при обработке материала специфической сывороткой — использовании так называемой иммунной электронной микроскопии (ИЭМ). Метод позволяет увеличить количество выявляемых вирионов, обнаруживать их уже на первых минутах просмотра, а также выявлять вирус в препаратах с низкой его концентрацией. Приготовление препаратов для иммунной электронной микроскопии производится следующим образом. Готовят 4%-й агар «Difco» на физиологическом растворе или фосфатно-солевом буфере (рН 7,2) путём нагревания флакона в кипящей водяной бане. Агар растапливают и охлаждают до 56 °С, затем смешивают с равным объёмом сыворотки кролика, гипериммунизированного вирусом вакцины, в разведении 1:12 и 1:24 (разведения делают на фосфатно-солевом буфере — рН 7,2). Полученные смеси после тщательного перемешивания разливают в лунки полистироловых пластин (до края лунки) и маркируют. После застывания агара на его поверхность наносится по 25-30 мкл исследуемого материала.
На каплю помещается две-три электронноскопических сеточки, покрытые формваровой подложкой, стабилизированной углеродом. В таком виде материал оставляют на 20-30 мин при комнатной температуре. Затем сеточки снимают, излишек жидкости удаляют фильтровальной бумагой и помещают в каплю раствора 2%-й фосфорно-вольфрамовой кислоты (рН 7,0) на 1-2 мин.
Обычно при ортопоксвирусных инфекциях в первые 10 мин просмотра обнаруживаются скопления вирионов ортопоксвируса. Условия для отрицательного заключения те же (см. п.8.1.1).
8.1.2. Иммуноферментный анализ (ИФА) для выявления антигена ортопоксвирусов
Иммуноферментный анализ (ИФА) основан на специфическом взаимодействии антигена и антитела с предварительной иммобилизацией (фиксацией) одного из компонентов реакции (антигена или антител) на твердофазном носителе (в лунках полистироловых планшетов, стрипов и др.) и выявления образовавшегося комплекса антиген-антитело посредством ферментной метки (конъюгата). Выявление образовавшегося комплекса осуществляется по изменению интенсивности окраски (оптической плотности) субстратной смеси, содержащей вещество, с которым реагирует фермент, и индикатор, изменяющий цвет под действием продуктов реакции фермент-субстрат.
Для детекции антигена ортопоксвирусов в материалах от больных используют иммуноферментные тест-системы для выявления антигена ортопоксвирусов, зарегистрированные в Российской Федерации в установленном порядке. Эти наборы реагентов предназначены для выявления антигена ортопоксвирусов (натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, вакцины и др.) в везикулярной и пустулёзной жидкостях, суспензии корок и других материалах, полученных от людей и животных, в культуральной жидкости инфицированных клеточных культур. Детальное описание постановки ИФА, учёта и оценки результатов приводится в соответствующей инструкции по применению наборов реагентов.
8.1.3. Иммуноферментный анализ (ИФА) для выявления антител к ортопоксвирусам
Этот тест, основанный на выявлении IgG антител, может оказаться полезным, начиная с 4-5-го дня болезни. Обнаружение у ранее невакцинированных против оспы лиц даже невысоких титров антител (80-160) указывает на наличие ортопоксвирусной инфекции. У вакцинированных в прошлом только высокие титры антител (640 и выше) могут свидетельствовать о свежей ортопоксвирусной инфекции. Для подтверждения наличия свежей инфекции в неясных случаях проводят повторное исследование сыворотки, взятой спустя несколько дней после первой пробы. При этом 2-4-кратное нарастание титра антител подтверждает диагноз.
Осуществление данного исследования производится в соответствии с инструкциями по применению иммуноферментных тест-систем для определения антител к ортопоксвирусам, зарегистрированных в Российской Федерации в установленном порядке.
Для целей возможно более ранней серологической диагностики ортопоксвирусных инфекций используют выявление в ИФА IgM антител (так называемых «ранних»), появление которых в сыворотке крови предшествует IgG антителам.
8.1.4. Выявление (индикация) вируса натуральной оспы и других патогенных для человека ортопоксвирусов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)
ПЦР применима для ускоренной диагностики при исследовании клинических образцов на наличие ДНК вируса натуральной оспы и для идентификации культуры выделенного вируса.
В данных МУ приведена методика, которая позволяет идентифицировать ДНК вируса оспы в клинических образцах и дифференцировать её от таковой близкородственных патогенных для человека ортопоксвирусов: оспы обезьян, оспы коров и вакцины с помощью набора реагентов для выявления ДНК вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакцины методом мультиплексной полимеразной цепной реакции.
Методика мультиплексной полимеразной цепной реакции (МПЦР) является вариантом классической ПЦР с анализом продуктов амплификации с помощью гель-электрофореза в агарозном геле, однако позволяет в одном анализе идентифицировать ДНК четырех видов ортопоксвирусов, в том числе ДНК вируса оспы в клинических образцах и дифференцировать её от таковой близкородственных патогенных для человека ортопоксвирусов: оспы обезьян, оспы коров и вакцины. Мультипраймерная система состоит из пяти пар праймеров, один из которых является родоспецифичным. Остальные пары праймеров являются видоспецифичными и при амплификации дают продукты длины, характерной для вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакцины.
Требования к организации работ при проведении исследований с использованием МПЦР приведены в МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности» [10] и СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)» [8].
Сотрудники, выполняющие МПЦР с материалом, подозрительным на зараженность вирусом оспы, так же, как и другие, работающие с этим вирусом, подлежат обязательной вакцинации в соответствии с МУ 3.3.1.2044-06 «Вакцинопрофилактика натуральной оспы» [11].
Выявление ДНК ортопоксвирусов с помощью МПЦР включает три стадии. На первой стадии после первичной подготовки проб проводят выделение ДНК из клинических образцов методом фенольной экстракции после разрушения клеток и вирусных частиц протеиназой К. Работа по выполнению этой стадии проводится в помещениях «заразной» зоны при соблюдении условий, указанных в СП 1.3.1285-03 [8] и МУ 1.3.2569-09 [10]. На второй стадии проводят реакцию МПЦР с выделенной ДНК. На третьей стадии проводят детекцию амплифицированной ДНК после гель-электрофореза в агарозном геле с визуализацией полос в УФ-свете после окраски геля бромистым этидием. Обе последние стадии могут проводиться за пределами «заразной» зоны в ПЦР-боксе в защитном костюме IV типа, дополненном резиновыми перчатками, с соблюдением правил выноса предметов из «заразной» зоны (внешняя обработка контейнера).
МПЦР представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза (амплификацию) специфичной области ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ), соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок-праймеров, определяющих границы амплифицируемого участка ДНК. В ходе МПЦР происходит амплификация только с помощью той пары праймеров, которая видоспецифична к ДНК-мишени, присутствующей в клиническом образце. Одна пара праймеров в смеси обеспечивает родоспецифичную амплификацию фрагмента размером 294 п.н. на ДНК любых видов ортопоксвирусов (дополнительный внутренний контроль).
Каждый цикл состоит из трех стадий с различными температурными режимами. На первой стадии при 93 °С происходит разделение цепей ДНК, затем при 62 °С — присоединение (отжиг) праймеров к гомологичным последовательностям на ДНК-мишени, на третьей стадии при температуре 72 °С — синтез новых цепей ДНК путем удлинения праймеров в направлении 3′ конца. В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, ограниченного парой выбранных праймеров, что позволяет за 30 циклов наработать ДНК в количестве, достаточном для ее детекции с помощью электрофореза.
Выделение ДНК, постановка МПЦР, оценка результатов
Выделение ДНК, постановку МПЦР и оценку результатов проводят по соответствующей инструкции по применению диагностической тест-системы для проведения МПЦР, зарегистрированной в Российской Федерации в установленном порядке.
Список рекомендованного оборудования для проведения МПЦР приведен в прилож.4. После выделения ДНК материал передают для проведения МПЦР. Передача материала осуществляется с соблюдением правил выноса предметов из «заразной» зоны (внешняя обработка контейнера) согласно СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)» [8].
Для анализа результатов используют трансиллюминатор. Фрагменты анализируемой ДНК должны проявиться в виде светящихся оранжево-красных полос.
1. Положительный контроль (К+) — должны выявляться специфичные полосы размером 832, 581, 492, 421, 294, 200 пар нуклеотидов:
Длина продукта амплификации, пар нуклеотидов (п.н.)
Вирус оспы обезьян ( Monkeypox virus )
Вирус вакцины ( Vaccinia virus )
Вирус оспы коров ( Cowpox virus )
Родоспецифичный фрагмент ( Orthopoxvirus )
Вирус натуральной оспы ( Variola virus )
* ЗА — Западноафриканский вариант вируса оспы обезьян
** ЦА — Центральноафриканский вариант вируса оспы обезьян
2. Отрицательный контроль (К-) — полосы должны отсутствовать.
3. Анализируемые пробы — отсутствие полос строго на уровне положительного контроля свидетельствует об отрицательном ответе. Наличие полосы, соответствующей по размеру специфичному фрагменту в положительном контроле для какого-либо вида ортопоксвируса, свидетельствует о наличии в пробе ДНК данного вида ортопоксвируса. Внимание! Наличие полос ампликонов, располагающихся выше или ниже контрольных полос, является неспецифичным ответом и результат реакции оценивается как отрицательный .
Результаты анализа не подлежат учету:
— если в положительном контроле отсутствуют специфичные полосы (ошибка в постановке ПЦР, неправильное хранение или загрязнение реактивов в процессе работы, сбой программы амплификатора). Требуется повторная постановка реакции!
— если в отрицательном контроле выявляются специфичные полосы на уровне положительного контроля (контаминация реактивов пробположительной ДНК или продуктами амплификации). Необходимо использовать дополнительные отрицательные контроли при повторной постановке ПЦР. Если результат повторяется — необходимо сменить реактивы!
Действия при возникновении ДНК-контаминации
При проведении ПЦР-анализа в случаях несоблюдения вышеуказанных требований возможно получение ложноположительных результатов. К их появлению ведет ДНК-контаминация — попадание в реакционную смесь положительно реагирующих в ПЦР нуклеиновых кислот (из исследуемых образцов, положительных контролей, продуктов амплификации — ампликонов). Ампликоны могут накапливаться на лабораторном оборудовании, одежде, поверхности кожи сотрудников и легко переноситься аэрозольным путем. О наличии контаминации свидетельствует положительный ответ в отрицательном контроле. В этом случае необходимо повторить анализ, начиная с этапа выделения ДНК.
В случаях повторных положительных ответов в отрицательном контроле производят замену всех используемых для данного анализа реактивов как на этапе подготовки проб, так и при проведении ПЦР, обрабатывают рабочие поверхности столов, приборов, штативов, автоматических пипеток 1 N раствором соляной кислоты; облучают помещение УФ в течение 1,5 ч. Заменяют рабочую одежду, набор инвентаря для уборки и приостанавливают работу в данном помещении до проведения указанных мер.
Режимы обеззараживания различных объектов при лабораторной диагностике натуральной оспы методом МПЦР приведены в СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)» [8] и МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности» [10].
_______________
* Наименование пункта 8.2 в бумажном оригинале выделено курсивом. — Примечание изготовителя базы данных.
Может осуществляться на куриных эмбрионах или в культуре клеток.
8.2.1. Выделение вируса на куриных эмбрионах
Используют хорошо развитые эмбрионы 12-дневного возраста. Эмбрионы готовят к заражению следующим образом. Во время просмотра (осуществляется в затемнённой комнате, пучок света должен падать сверху на тупой конец яйца) делают отметку простым карандашом в центре воздушного мешка. Затем поворачивают яйцо острым концом вверх и замечают место, где белок занимает наибольшее пространство. На противоположной этому месту стороне делают отметку для пропиливания, выбирая участок между двумя сосудами и их ответвлениями. Метку ставят между ветвями соседних вен, но не на самих сосудах.
Пропиливание осуществляется сепарационным вулканитовым диском бормашины, а при её отсутствии — любым инструментом типа маленького напильника. Одно отверстие пропиливают в центре воздушного мешка, второе — очень осторожно во избежание кровоизлияний — по отметке и боковой стороне яйца. Необходимо следить, чтобы была пропилена скорлупа и не затронута подскорлупная оболочка. Величина отверстий: длина — 3-4 мм, ширина — 1,5 мм. После пропиливания отверстий яйца укладывают на бок таким образом, чтобы отверстие на боковой поверхности было обращено вверх.
Подскорлупную оболочку в отверстии в центре воздушного мешка прорывают изогнутой хирургической иглой. Затем на боковое отверстие наносят 0,1 мл буферного раствора, подогретого (в водяной бане) до 50°, и той же иглой очень осторожно расслаивают (продавливают) подскорлупную оболочку для образования маленькой щели, через которую под подскорлупную оболочку проходит капля буферного раствора. Последняя частично отслаивает хориоаллантоисную оболочку (ХАО). Полное её опускание происходит после отсасывания воздуха с помощью резиновой груши через отверстие в центре естественного воздушного мешка. Для контроля наличия и величины искусственных воздушных мешков яйца снова просвечивают и отбрасывают все, имеющие кровоизлияния и с воздушным мешком под ХАО, и без искусственных воздушных мешков.
Подготовленные яйца (с опущенной ХАО) должны находиться до заражения в термостате в течение 2 ч. Для заражения используют материал от больного в исходном разведении, а также в разведениях 10-2-10-5.
После введения инокулята материал равномерно распределяют по оболочке осторожным круговым вращением яйца.
Отверстие на боковой стороне яйца заклеивают липким пластырем с таким расчётом, чтобы оставалась как бы склеенная петля, за которую можно было бы держать яйцо при вскрытии. Яйца укладывают на бок (вверх заклеенным отверстием).
Заражение производят с соблюдением правил асептики. На каждый материал, предварительно обработанный антибиотиками, используют по 2-3 эмбриона на разведение. Инкубацию заражённых эмбрионов проводят при температуре 34,5-35,0 °С в течение 72 ч.
Вскрытие производят над посудой с высокими краями на четверть заполненной 5%-м раствором хлорамина. Одной рукой берут яйцо за петлю липкого пластыря, которым заклеено отверстие над искусственным воздушным мешком. В другую руку берут прямые глазные ножницы. Браншу ножниц вставляют в отверстие над воздушным мешком и осторожно удаляют половину скорлупы, противоположную месту инокуляции, а также все содержимое яйца, за исключением части ХАО, принадлежащей к искусственному мешку (место инокуляции). Последнюю отделяют пинцетом, промывают физиологическим раствором и просматривают в чашке Петри на наличие поражений (на чёрном фоне), отмечают также состояние эмбриона (живой или погибший).
При наличии вируса оспы на ХАО обнаруживаются мелкие (размером около 1 мм в диаметре к 72 ч) белые точечные резко ограниченные возвышающиеся оспины. Их своеобразный характер существенно отличается от поражений, вызываемых другими патогенными для человека ортопоксвирусами. Так, вирус вакцины образует более плоские поражения, имеющие большие размеры (до 3-4 мм в диаметре к 72 ч инкубации). Вирус оспы коров образует поражения, сходные с вакцинными, но отличающиеся резко геморрагическим характером («красные» оспины). Вирус оспы обезьян вызывает поражения, по размерам напоминающие оспенные, но имеющие геморрагии в центре. Кроме того, среди основной массы типичных для вирусов оспы коров и оспы обезьян поражений встречается около 1% более крупных белых оспин без геморрагии.
Вирусы вакцины, оспы коров и оспы обезьян также более патогенны для куриных эмбрионов, чем вирус натуральной оспы: при введении на ХАО 106-107 ООЕ/0,1 мл этих вирусов они, как правило, вызывают гибель куриных эмбрионов. При отсутствии бактериального загрязнения заражённые вирусом оспы эмбрионы, как правило, не погибают. Если в качестве исследуемых проб используют материал из кожных поражений в указанных выше разведениях, положительный результат получают через 72 ч после заражения без проведения пассажа. Пассаж делают при малом количестве материала для исследования и отсутствии поражений на ХАО при первичном заражении. Для этого извлечённые ХАО измельчают и приготовляют суспензию на физиологическом или буферном растворе из расчёта 1:3-1:5. Суспензию центрифугируют 10 мин при 2000 об./мин, надосадочную жидкость используют для заражения куриных эмбрионов.
При отсутствии специфических поражений результат выделения признают отрицательным.
Вирус оспы может быть также выделен из лейкоцитарной фракции или плазмы крови (особенно при тяжёлом течении) в первые дни болезни. В отделяемом зева он обнаруживается в первые 1-2 дня болезни до появления сыпи нерегулярно и в последующем выделяется с момента появления до исчезновения элементов на слизистой. Выделение вируса оспы из крови и отделяемого зева при отсутствии кожных поражений чаще имеет место при проведении пассажа. Отрицательный результат выделения вируса из этих материалов не исключает заболевания.
8.2.2. Выделение вируса в однослойной культуре клеток
Для выделения вируса оспы могут быть использованы первичные и перевиваемые клеточные культуры различного происхождения: полученные от человека (фибробласты эмбриона человека, почки, амниотическая ткань), обезьяны, свиньи и др. Предпочтительнее использовать первичные клеточные культуры эпителиального характера, медленнее дегенерирующие и с более наглядной картиной цитопатического действия вируса (ЦПД). Обработанный антибиотиками исследуемый материал вносят (по 0,1 мл) в 4-6 пробирок с образовавшимся клеточным монослоем, в том числе желательно в 2-3 пробирки со стеклянными пластинками* (для возможно более раннего выявления ортопоксвирусного антигена с помощью МФА). Часть пробирок с незаражённой культурой оставляют в качестве контроля. Пробирки инкубируют при температуре 36 °С и ежедневно оценивают состояние монослоя при малом увеличении микроскопа.
________________
* Метод обработки стеклянных пластин указан в прилож.5.
При достаточной концентрации вируса оспы ЦПД в первичной культуре клеток отмечается, как правило, уже в первые сутки после заражения культуры. В сплошном клеточном монослое появляются очаги округлых клеток с чёткими границами и зеркальной поверхностью (сильно преломляют лучи света); такие клетки часто увеличены в размере («гигантские»). В последующем скопления округлых клеток увеличиваются, клетки обособляются, прорывая монослой; постепенно клеточный пласт превращается в скопления очагов округлых клеток при наличии участков неизмененных клеток монослоя между ними вплоть до полного поражения клеток всего пласта.
Клеточные культуры перевиваемых линий реагируют на заражение вирусом оспы пролиферативным типом поражений — вирус вызывает усиленное размножение клеток, что проявляется в образовании гиперпластических фокусов, участков многослойного роста. Они выглядят как компактные клеточные нагромождения, усиленно преломляющие свет («зеркальные»). Размеры пролиферативных очагов и их количество постепенно увеличиваются, округлые дегенеративные клетки становятся зернистыми, нарушается целость монослоя и затем происходит деструкция всего пласта.
При нечётко выраженных цитопатических изменениях проводят пассаж — вторую партию клеточных культур заражают взвесью клеток в культуральной жидкости (после проведения трёхкратного цикла замораживания и оттаивания культур). Однако длительное (до 7 дней) наблюдение за заражённой культурой более эффективно, чем проведение «слепых» пассажей.
ЦПД вируса оспы и вируса вакцины имеет специфические особенности, что позволяет дифференцировать их в клеточной культуре. Для вируса вакцины характерен ускоренный темп развития клеточных поражений при отсутствии очаговости (за исключением начальной стадии ЦПД при малых дозах заражения), с распространением ЦПД на весь клеточный пласт и быстрым наступлением тотальной дегенерации культуры (через 1-2 дня). Наблюдается стертость клеточных границ, образование симпластов, сохранение цитоплазматических мостиков и др.
Для подтверждения специфичности ЦПД (для ортопоксвирусов), а также дифференциации от ЦПД вируса герпеса, можно использовать реакцию гемадсорбции. Для этого надо удалить культуральную жидкость из части заражённых и контрольных пробирок (по 2 пробирки, которые после постановки реакции уничтожаются) и добавить к клеткам по 0,2 мл 0,5% взвеси куриных эритроцитов*. Пробирки выдерживают в горизонтальном положении 10 мин, после чего их просматривают при малом увеличении микроскопа. При положительном феномене гемадсорбции наблюдаются скопления адсорбированных клетками эритроцитов («ожерелья» из эритроцитов по контурам и на поверхности клеток), которые не удаляются при промывании клеточного пласта физиологическим раствором хлористого натрия (1 мл). Феномен гемадсорбции отрицателен (отсутствие ортопоксвирусов), если эритроциты не оседают на клетках, а свободно перемещаются в поле зрения микроскопа и удаляются при промывании. Клеточный пласт в контрольной (незаражённой) культуре клеток должен оставаться свободным от скоплений адсорбированных эритроцитов. Феномен гемадсорбции обычно опережает видимое ЦПД вируса оспы (в культурах человеческого происхождения и почек обезьян). Вирус герпеса не даёт феномена гемадсорбции. При отсутствии ЦПД в течение 7 дней наблюдения и отрицательной реакции гемадсорбции результат выделения вируса считается отрицательным.
________________
* Для постановки этой и других реакций следует использовать петухов-доноров, эритроциты которых чувствительны к воздействию ортопоксвирусов.
Для быстрого обнаружения вируса в культуре клеток и его серологической идентификации используют метод флюоресцирующих антител (МФА). С этой целью стеклянные пластинки вынимают через 12-24 ч после заражения культуры, отмывают от среды фосфатно-буферным раствором и после заключительного промывания в дистиллированной воде производят их фиксацию и окраску противооспенным люминесцирующим иммуноглобулином, как это описано в разделе 10.
При этом контролем служит: 1) незаражённая культура клеток, окрашенная смесью гомологичного конъюгата и бычьего альбумина и 2) зараженная культура клеток, окрашенная смесью гетерологичного конъюгата и бычьего альбумина.
Препараты просматривают в люминесцентном микроскопе с использованием объектива х40 и х90.
Положительный ответ дают на основании обнаружения в клеточном пласте, окрашенном в оранжево-коричневатый цвет, клеток с ярко-зелёной, перинуклеарной флюоресценцией в цитоплазме, обусловленной наличием антигена ортопоксвирусов. В контрольных препаратах зелёное свечение должно отсутствовать.
При выделении в культуре клеток дифференцировать ортопоксвирусы возможно при использовании дополнительных приёмов дифференциации (см. ниже). Отрицательный ответ дают при отсутствии специфического свечения в культурах при первичном заражении и пассаже.
9. Критерии дифференциации вируса оспы от вирусов, вызывающих заболевания, сопровождающиеся кожными проявлениями
_______________
* Наименование пункта 9.1 в бумажном оригинале выделено курсивом. — Примечание изготовителя базы данных.
Осуществляется при электронной микроскопии по характерной форме и размеру вирусных частиц. Кроме того вирусы группы герпеса дают отрицательный результат в ИФА при выявлении антигена ортопоксвирусов. При наличии вирусов герпеса отсутствует ярко-зелёная флюоресценция при окраске препаратов противооспенным люминесцирующим иммуноглобулином.
При выделении на куриных эмбрионах вирус ветряной оспы не вызывает поражений на ХАО. Некоторые штаммы вируса герпеса простого вызывают поражения, трудно отличимые от оспенных. Дифференциация вирусов в таких случаях проводится на основании исследования суспензии пораженной оболочки в ИФА.
При выделении вируса в культуре клеток дифференциацию ортопоксвирусов от вирусов герпеса проводят на основе отсутствия гемадсорбции и/или свечения при использовании МФА с противооспенным люминесцирующим иммуноглобулином.
9.2. Дифференциация вируса натуральной оспы от других патогенных для человека ортопоксвирусов (вакцины, оспы коров, оспы обезьян)
_______________
* Наименование пункта 9.2 в бумажном оригинале выделено курсивом. — Примечание изготовителя базы данных.
Основным методом дифференциации (кроме МПЦР) является характер поражений (оспин) на ХАО куриных эмбрионов (см. выше п.8.2.1).
При выделении вируса в культуре клеток или в случаях, когда характер поражений на ХАО куриных эмбрионов не позволяет решить вопрос, каким ортопоксвирусом они вызваны, прибегают к дополнительному приёму дифференциации. С этой целью выделенную культуру вируса исследуют на способность вызывать реакцию на коже кроликов (заражение на скарифицированный участок).
Заражение кроликов на скарифицированную кожу
Нанесение вируса оспы на скарифицированный участок выстриженной кожи кролика (размер участка 2,5х2,5 см, объём инокулюма — 0,2 мл) не приводит к развитию специфических элементов. На месте нанесения вируса к 3-5-му дню после заражения остаются лишь сухие бледные царапины (след от скарификации кожи). В противоположность этому вирус вакцины вызывает образование сочных характерных специфических элементов (папул, пустул), зачастую сливающихся между собой и образующих к 3-5 дню после заражения как бы «подушку», выступающую над поверхностью незараженной кожи. Вирус оспы коров и оспы обезьян образует элементы, аналогичные вакцинным, но отличающиеся выраженным геморрагическим характером.
Речь идет о диагностических приемах, которые могут быть использованы при отсутствии ряда описанных выше приборов и реагентов.
_______________
* Наименование пункта 10.1 в бумажном оригинале выделено курсивом. — Примечание изготовителя базы данных.
Метод флюоресцирующих антител для выявления возбудителя непосредственно в материале от больных.
Метод используют для быстрого обнаружения антигена ортопоксвирусов на ранних стадиях заболевания (до появления пустул!). Содержимое кожных элементов — мазки соскобов или отпечатки со дна везикул, макул, папул, мазки везикулярной жидкости на предметных стеклах фиксируют в охлаждённом ацетоне (хч) в течение 10 мин. После 5-минутного просушивания их окрашивают смесью равных объёмов люминесцирующего оспенного иммуноглобулина и бычьего альбумина, меченого фторидом сульфородамина (прилож.6), разведенных предварительно до «рабочего» разведения (см. соответствующую инструкцию по применению).
Обнаружение многочисленных мелких, округлой формы образований, дающих ярко-зелёную флюоресценцию и расположенных на оранжево-коричневом фоне при отсутствии зелёной флюоресценции в контроле свидетельствует о наличии в материале ортопоксвируса.
Внеклеточный вирус может образовывать цепочки, скопления и располагаться попарно. В ряде случаев специфический антиген может обнаруживаться в цитоплазме попавших в мазок клеток слущенного эпителия.
Исследование осуществляется в соответствии с инструкцией по применению препарата люминесцирующего оспенного иммуноглобулина, зарегистрированного в Российской Федерации установленным порядком.
Метод неприменим для исследования материала от больного в стадии пустул из-за наличия аутофлюоресценции элементов белой крови.
_______________
* Наименование пункта 10.2 в бумажном оригинале выделено курсивом. — Примечание изготовителя базы данных.
В качестве дополнительного метода быстрого обнаружения в материале от больного антигена ортопоксвирусов может быть использована РМПА.
В водяной бане растапливают 1%-й агар на фосфатно-солевом буфере (см. прилож.7), затем охлаждают до 60 °С и прибавляют подогретый до этой же температуры мертиолят (0,01%). Агар наносят тонким слоем на предметное стекло (2 мл агара на предметное стекло размером 2,6х7,6 см). После застывания агара полой металлической трубочкой в нём прорезывают 4 круглые лунки диаметром 4 мм, центры которых находятся друг от друга на расстоянии 5-6 мм. Лунки располагают по углам ромба. В одну из боковых лунок наливают диагностическую оспенную сыворотку, в другую — нормальную кроличью сыворотку. В качестве известного антигена используют сухой оспенный диагностикум, который наливают в верхнюю лунку. Испытуемый антиген (везикулярная, пустулёзная жидкость, суспензия корок, органов и т.д.) закапывают в нижнюю лунку.
Стекло с налитыми в лунки реагентами помещают во влажную камеру, в качестве которой может быть использована чашка Петри с влажной фильтровальной бумагой. Камеру оставляют при комнатной температуре. Просмотр стёкол производят через 2-5 и 24 часа в проходящем свете.
Реакция считается положительной в случае появления полосы преципитации между лунками с известным антигеном и диагностической противооспенной сывороткой при одновременном появлении такой же полосы между испытуемым антигеном и этой сывороткой и отсутствии их между антигенами и нормальной сывороткой. Положительный результат исследования свидетельствует о наличии в исследуемом материале антигена ортопоксвирусов. Отрицательный результат не исключает заболевания.
_______________
* Наименование пункта 10.3 в бумажном оригинале выделено курсивом. — Примечание изготовителя базы данных.
Этот простой и доступный метод, дающий ответ в пределах 1,5-2,0 ч, основан на подавлении специфическими антителами феномена агглютинации чувствительных эритроцитов кур, вызываемого рядом ортопоксвирусов. Установлено, что у заболевших оспой обнаруживаются высокие титры антигемагглютининов (АГА), значительно превосходящие таковые у вакцинированных против оспы лиц. Максимальные титры АГА наблюдаются к 10-15-му дню, после чего постепенно снижаются. Следует отметить, что у отдельных больных оспой титры АГА остаются невысокими (20-40), поэтому наличие низких титров АГА не позволяет исключить диагноз оспы. Реакцию обычно ставят с 4 и 2 АЕ (агглютинирующими единицами).
Обнаружение при электронной микроскопии ортопоксвирусных вирионов и/или ортопоксвирусного антигена в ИФА свидетельствует о наличии инфекции, вызванной представителем рода ортопоксвирусов. Дальнейшая идентификация возбудителя проводится по результатам МПЦР. При наличии в исследуемом материале ДНК вируса натуральной оспы ставится диагноз «натуральная оспа».
Серологическое исследование с большой долей определенности дает ответ в отношении невакцинированных против оспы людей. В этом случае наличие даже невысоких (80-160) титров антител свидетельствует об ортопоксвирусной природе болезни.
Окончательный диагноз «натуральная оспа» ставится после выделения и идентификации возбудителя.
1. Противочумный костюм II типа с защитным респиратором ШБ-1 (РБ) «Лепесток-200» или их аналогами отечественного или зарубежного производства.
2. Набор стерильных инструментов в упаковке:
— скальпель глазной;
— ножницы глазные;
— пинцет глазной;
— пинцеты для электронноскопических сеток;
— шприц туберкулиновый;
— иглы.
3. Пробирки пластиковые с завинчивающимися пробками вместимостью 1,5-3,0 мл.
4. Пробирки пластиковые с завинчивающимися пробками вместимостью 5 и 10 мл.
5. Обезжиренные предметные стекла (2-4 шт.).
6. Подготовленные для взятия проб электронноскопические сетки.
10. Маркер для стекол, пробирок.
11. Пластиковые флаконы вместимостью 10 мл с завинчивающейся крышкой.
12. Ватные тампоны на стержне (4-6 шт.).
13. Полиэтиленовые пакеты типа Zip-lock.
17. Дезинфицирующие средства, разрешенные к применению в установленном порядке.
Для приготовления опорных пленок используется 0,25-0,3%-й раствор формвара на дихлорэтане, который хранят в холодильнике. Дихлорэтан должен храниться в холодильнике в плотно закрывающейся посуде и иметь квалификацию «хч» или «чда». Для приготовления пленок раствор нагревают до комнатной температуры и в него опускают чистое обезжиренное предметное стекло на высоты на 20-30 с. Затем стекло просушивают и острым скальпелем или лезвием бритвы вырезают формваровую пленку, отступя от края стекла на 2-3 мм. Для отделения пленки стекло медленно погружают под углом 60° в сосуд с дистиллированной водой. На поверхность пленки выкладывают сетки. Затем пленку с сетками накрывают полоской газетной бумаги (без краски) или плотной фильтровальной бумаги. Бумагу вместе с сетками, покрытыми пленкой, вынимают из воды и укладывают в чашку Петри для просушивания.
Для приготовления опорных пленок может использоваться 1%-й раствор парлодия в амилацетате. При этом каплю раствора наносят на поверхность дистиллированной воды. Через 10-15 с, после испарения амилацетата, на поверхность образовавшейся пленки укладывают сетки, которые затем снимают на бумагу, аналогично формваровым.
После просушки сетки, покрытые формваровой или парлодиевой пленкой, напыляют углем в вакуумной напылительной установке при давлении 10 -10 мм ртутного столба. Визуально напыление контролируют по появлению на бумаге с сетками первых признаков видимого слоя угля светло-серого цвета. Формваровые пленки можно использовать без напыления.
Приготовление смолы для заливки образцов, предназначенных для исследования методом ультратонких срезов
Использование смеси эпоксидных смол эпона и аралдита позволяет получить заливочную среду, обеспечивающую хорошее пропитывание образца, оптимальную для резки твердость блоков и хорошее контрастирование срезов.
Исходный раствор готовится с использованием смол:
15 мл аралдита М
Смолы сливаются в стеклянный сосуд и тщательно перемешиваются до получения гомогенной смеси. Смесь хранится при комнатной температуре в плотно закрытой посуде неограниченное время и используется для пропитки образцов и полимеризации.
Раствор N 1 — 0,84 г лимонной кислоты растворяют в 1 л очищенной воды.
Раствор N 2 — 0,712 г Na HPО · 2Н О растворяют в 1 л очищенной воды.
Для получения буферного раствора с рН — 7,2 следует смешать 130 мл раствора N 1 и 870 мл раствора N 2.
Состав фосфатно-буферного раствора (0,15 М, рН =7,2-7,4), используемого для промывания препаратов, исследуемых МФА.
Раствор N 3 — 10,21 г KH PО растворяют в 500 мл воды очищенной.
Раствор N 4 — 26,85 г Na HPО · 2Н О растворяют в 500 мл воды очищенной.
Для получения буферного раствора требуемой молярности и рН следует к 200,0 мл физиологического раствора добавить 172,0 мл раствора N 4 и 47,8 мл раствора N 3.
Приложение 4
(рекомендуемое)
Наименование, тип и шифр средств испытаний
источник