Вакцина против оспы овец и коз вниизж

Оспа овец и коз — высоко контагиозное, быстро передающееся, сопровождающееся лихорадкой, папулёзно-пустулёзными высыпаниями на кожных покровах и слизистых, заболевание. Поражает животных любого возраста, в 50% случаев заканчивается летальным исходом. Для предупреждения распространения заболевания показана иммунизация мелкого скота с трёхмесячного возраста.

Выжившие животные приобретают устойчивый иммунитет к этому вирусу на 2 года. В качестве специфической профилактики используется культуральная вирус-вакцина атте-нуированного штамма НИСХИ (вирус оспы), обеспечивающая защиту привитым козам и овцам на 12 месяцев.

Сегодня для прививания мелкого и крупного рогатого скота против оспы и заразного узелкового дерматита используется вакцина «ШипПокс-ЛСД вак». Это единственный вид иммунизации.

Препарат сделан на основе культуральной жидкости перевиваемых клеток ДНК козы, инфицированной штаммом НИСХИ. В качестве дополнительных элементов в составе присутствует 10% сахарозы и 2% пищевого желатина.

Ответная иммунная реакция на однократное введение вакцины у мелкого скота появляется спустя 5 суток. Препарат безвредный, лечебными свойствами не обладает

Предназначение вакцины — профилактика оспы и нодулярного дерматита у здоровых овец, коз и крупного рогатого скота. Иммунизация проводится с возраста 3-х месяцев. Ревакцинация организовывается каждые 12 месяцев.

В неблагополучных пунктах и хозяйствах угрожаемой зоны проводят прививки для всех возрастных групп скота, вне зависимости от количества времени, которое прошло с момента прошлой иммунизации. Ягнят возрастом до 6 мес. вакцинируют двукратно, с интервалом в 2 недели. Ревакцинацию молодняка проводят спустя 6-7 мес., взрослых особей — 1 год.

Инструкция по применению:

Охладить физраствор (натрий хлорид) 0,9% концентрации до +4°С.
Во флакон с сухой порошковой вакциной, рассчитанный на 50 прививных доз, ввести при помощи шприца 2 см³ натрий хлорида, на 100 доз — 4 см³. Встряхивать ёмкость до полного суспензирования препарата.
Объединить полученную суспензию с 48 см³ физраствора (для 50 доз) иди 96 см³ (для 100 доз).
Ввести при помощи шприца 1 см³ готовой вакцины в бесшерстный участок дермы животного (подмышечная впадина или подхвостовая область).

Запрещено прививать:
больных, ослабленных животных;
самок на последней стадии беременности.

Побочных эффектов при введении препарата не выявлено. При превышении дозировок вспышек оспы не обнаружено.

При использовании нужно соблюдать следующие меры предосторожности:

Надеть чистую одежду.
Руки обработать этиловым спиртом.
Работать в стерильных перчатках.
Вводить суспензию в бесшерстный участок кожного покрова, предварительно обработав его спиртом.
При попадании вакцины на кожные покровы или слизистые человека, промыть участок водой.
Если вакцина случайно была введена подкожно работнику фермы, нужно сразу протереть участок этиловым спиртом, обратиться в больницу и сообщить врачу о происшествии.

Лекарственная форма препарата — порошковая масса, светло-жёлтого цвета. Полностью растворяется в физрастворе 0,9% концентрации за 1,5 минуты. Производитель: ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Плановая профилактическая вакцинация позволяет уберечь поголовье от вспышек оспы. Для поддержания нормального состояния животных необходимо проводить манипуляцию ежегодно.

источник

В последние годы для активной иммунизации против оспы овец с положительными результатами применяют гидроокись-алюминиевую формолвакцину против оспы овец, предложенную научным сотрудником Государственного научно-контрольного института ветеринарных препаратов Н. В. Лихачевым.

Вакцину применяют для активной иммунизации как в местах, неблагополучных в отношении данной инфекции, так и с профилактической целью в благополучных по оспе овцеводческих хозяйствах.

Лечебными свойствами вакцина не обладает, а поэтому в неблагополучных хозяйствах прививаются только здоровые животные. Вакциной прививают (за исключением больных) всё поголовье: молодняк различных возрастов и маток, как холостых, так и суягных. Больным оспой овцам инъицируют сыворотку против оспы овец.

Перед прививкой флаконы с вакциной тщательно встряхивают до получения равномерной взвеси. Встряхивание повторяют каждый раз, перед тем как набрать вакцину в шприц. Вакцина инъицируется подкожно в области средней части шеи, при этом место прививки выстригают и дезинфицируют. Вакцину инъицируют в дозе 5 см 3 однократно. На месте инъекции у привитых животных образуется небольшое утолщение вследствие слабой рассасываемости гидроокиси алюминия.

У привитых животных не должно быть клиники общего переболевания оспой или оспенного процесса на месте инъекции вакцины. Эти животные безопасны в смысле рассеивания вируса оспы. Иммунитет у привитых овец наступает через 10—12 дней. В течение указанного срока привитые овцы не должны соприкасаться с больными оспой. Продолжительность иммунитета свыше 4 месяцев.

Для активной иммунизации овец против оспы применяют также овину или овину, заключённую в желатину (желатинизированиую овину). Овину прививают всем овцам в неблагополучных по оспе пунктах.

Овина и желатинизированная овина рассылается в ампулах ёмкостью в 1 см 3 . Одновременно с овиной рассылают физиологический раствор во флаконах ёмкостью в 50 см 3 .

Перед прививкой овину, после тщательного встряхивания ампулы, вливают во флаконы с физиологическим раствором с таким расчётом, чтобы получить разведение 1 :50, т.е. 1 см 3 овины на 50 см 3 физиологического раствора. Желатинизированную овину перед прививками предварительно расплавляют, для чего ампулы с овиной погружают в ванночку, наполненную тёплой водой (+25—+30°С). Расплавленную, как указано овину, разводят физиологическим раствором в отношении 1 :50. Овина должна быть защищена от прямых солнечных лучей и высокой температуры. Перед тем как набрать овину в шприц, флакон с разведённой овиной тщательно встряхивают. Шприц с имеющейся в нём овиной перед каждым впрыскиванием также встряхивают. Доза овины, разведённой указанным способом, равна 0,1 см 3 , а желатинизированной овины—0,2 см 3 , независимо от возраста прививаемых овец.

Овину вводят шприцем в области нижней бесшёрстной поверхности хвоста или на внутренней поверхности уха. Иглу вкалывают в толщу кожи с последующим незначительным оттягиванием её обратно. Место прививки сначала тщательно обтирают ватой, овлажняют водой, обсушивают сухой ватой, а затем обтирают ватой, смоченной спиртом, и обсушивают. Применение других дезинфицирующих средств не допускается.

Признаки привившейся оспы определяют тщательным поголовным осмотром привитых овец через 10—12 дней после прививки. У привитых овец на месте прививки должна быть папула или пузырь. У животных повышается температура, на бесшёрстных местах иногда появляется слабая папулёзная сыпь, исчезающая через несколько дней. У привитых овиной овец иммунитет наступает примерно через 20 дней и сохраняется до года и более.

Всех овец, не давших реакции, после просмотра вторично прививают овииой в той же дозе или методом овинной школки. Для этого берут опец, привитых овиной, на 10—11-й день после прививки с непрорвавшимся пузырём 1½ — 2½ в диаметре, содержащим чистую прозрачную лимфу. Поверхность пузыря и окружающую кожу осторожно очищают спиртовым тампоном и при высыхании пузырь прокалывают у основания. Вытекающую из него жидкость—лимфу—собирают и иглой прививают овцам. Овцы, привитые овиной и овнной-школкой, карантинируются в течение двух месяцев. Не следует прививать овиной и овиной-школкой маток во второй половине беременности и ягнят до трёх месяцев. Указанные группы животных прививают противооспенной сывороткой.

При осложнениях от прививки вводят оспенную сыворотку в лечебных дозах. Привитые овиной овцы рассматриваются как больные, за ними организуется особо тщательный уход до 20 дней, их обеспечивают лучшими кормами, а при необходимости применяют лечение. В холодное время года должно быть уделено особое внимание обеспечению этих овец кошарами и защите их от холода, ветра, дождя и снега. Указанные меры необходимо проводить особенно тщательно, если овцы острижены вскоре после прививки.

Противооспенную сыворотку применяют с профилактической и лечебной целью. Дозы сыворотки против оспы для разных возрастов овец, прививаемых с профилактической целью, следующие (в см 3 ):

ягнятам весом до 15 кг . . 10

овцам » от 15 до 25 кг . . 10—15

С лечебной целью сыворотку применяют в двойных дозах. Иммунитет при пассивных прививках сывороткой сохраняется до 12—15 дней.

Сыворотку вводят подкожно, на внутренней поверхности бедра.

Допускаются также симультанные прививки, т. е. Одновременное введение сыворотки и овины. При этом сыворотку вводя г подкожно на внутренней поверхности бедра, а овину в установленных дозах внутрикожно, на внутренней бесшёрстной поверхности хвоста.

Через 1½ месяца после прививки формолвакциной и через 20 дней после прививки овнной ветперсонал учитывает результаты прививки и акт отсылает в контрольную лабораторию биофабрики, изготовившей препарат.

источник

Вакцина содержит вируссодержащий материал аттенуированного штамма Sheep capripoxvirus ВНИИЗЖ с титром биологической активности 10 5,0 -10 6,0 ТЦД 50 /мл и стабилизатор в соотношение 80-90/10-20. Штамм ВНИИЗЖ адаптирован к перевиваемой культуре клеток гонад Capra hircus L. В качестве стабилизатора затора используют защитную среду, включающую 3% пептона, 5% сахарозы и 1% желатина. Полученная вакцина представляет гомогенную массу желтовато-белого цвета без посторонней примеси. Вакцину вводят животным однократно в дозе 1 см 3 подкожно. Продолжительность иммунитета 12 месяцев. Технический результат от использования изобретения заключается в обеспечении высокой иммуногенной активности, безвредности, ареактогенности для овец и низкой себестоимости. 4 табл.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии, представляет собой лиофилизированную вирусвакцину из аттенуированного штамма вируса оспы овец, выращенного на перевиваемой культуре клеток гонад козы, и может быть использовано для профилактической иммунизации овец.

Оспа овец — контагиозная вирусная болезнь, характеризующаяся интоксикацией организма, лихорадкой, папулезно-пустулезными поражениями кожи и слизистых оболочек. Она наносит овцеводству огромный экономический ущерб, слагающийся из гибели и вынужденного убоя больных животных, снижения продуктивности, затрат на проведение ветеринарно-санитарных и охранно-карантинных мероприятий. К оспе овец восприимчивы домашние козы, а также дикие животные — сайгаки и козероги, служащие источником инфекции и переносчиками возбудителя. Оспа овец внесена в список наиболее опасных (конвенционных) болезней сельскохозяйственных животных. Она широко распространена во многих странах Азии, Африки и Ближнего Востока. В СССР ее эпизодически регистрировали в южных пограничных регионах.

В нашей стране для специфической профилактики в течение многих лет использовали инактивированную ГОА-формолвакцину, приготовленную из суспензии органов и тканей больных оспой овец (Лихачев Н.В. Ветеринария, 1945, N 2).

Наряду с положительными качествами она имеет ряд недостатков: трудоемка в приготовлении, для получения сырья требуются вирулентный вирус и овцы высокочувствительных пород; иммунитет у животных формируется медленно сроком на 5,5 месяцев, поэтому необходима двукратная иммунизация их в течение года.

В связи с этим предпринимались попытки создать более экономичные, безопасные и эффективные живые вакцины против оспы овец из аттенуированных штаммов. В последние десятилетия предпочтение отдавали культуральным вирусвакцинам.

По сообщениям зарубежных авторов получено несколько аттенуированных культуральных вариантов вируса оспы, отличающихся реактогенностью и продолжительностью создаваемого у овец иммунитета, однако большинство из них изучено лишь в лабораторных опытах (Jassim F.A. et al. Indian Vet. J., 1981, 58, 10; Martin W.B. et al. Res. Vet. Sci., 1973, 14; Mateva-Penkova V. et al. Bull. Off. Int. Epiz., 1974, 81; Ramisse J. et al. Rev. Elev. Med. Vet. Pays trop. , 1978, 31, 1; Pamyar H. et al. Bull. Off. Int. Epiz., 1974, 81; Soman J.P. et al. Indian J. Anim. Sci., 1979, 49, 8).

Известно использование в ряде стран вирусвакцины из аттенуированного штамма RM/65, но она малоэффективна против некоторых местных полевых изолятов вируса оспы в Индии и Марокко (Fassi-Feliri M. et al. Ann. Rech. Vet., 1984, 15, 1; Sharma P.C. et al. Indian J. Anim. Sci., 1987, 57, 9; Singh F. P. et al. J. Anim. Sci., 1984, 54, 7). Поэтому были разработаны аттенуированные варианты вируса оспы овец из местных эпизоотических штаммов (Das S.K. et al. Indian J. Exp. Biol. 1986, 24, 6; Kalra S. K. et al. Indian J. Anim. Sci., 1984, 54, 5).

В нашей стране получили культуральную вирусвакцину против оспы овец из вируса, адаптированного к культуре клеток почки крольчат, и проверили ее в производственных условиях (Жидкова Л.А. и соавт. Тез. докл. IV Всес. вет. вирусол. конф., 1976, 2; Лихачев Н.В. и соавт. Докл. ВАСХНИЛ, 1972, II; Лихачев Н.В. и соавт. Науч.отчет ВГНКИ, 1977; Лихачев Н.В. и соавт. Мат. к заседанию НТС МСХ СССР, 1978).

Указанная вакцина широкого практического применения не нашла по причине ее низкой иммуногенности.

Известен также штамм культивируемых клеток гонад Capra hircus L. — продуцент вирусов животных. Указанный штамм монослойных клеток получен из первичнотрипсинизированной ткани гонад 3-дневной козы путем последовательного пассирования на полусинтетических питательных средах, обладает стабильными морфологическими характеристиками и чувствительностью к заражению вирусами ящура A 22 -663, O 1 -194, Азия-1-48, болезни Гамборо, болезни Ауески и африканской чумы лошадей, репродуцирует их при культивировании в монослое в титрах 5,0 — 8,25 lg ТЦД 50 /мл, хранится в музее клеток ВНИИЗЖ и депонирован на 234 пассаже в монослое в ВСКК (СХЖ) РАСХН под N 45 (пат. РФ N 2061753; МПК 6 C 12 N 5/06, 7/00; 02.08.94 г.).

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина против оспы овей, включающая вируссодержащий материал аттенуированного штамма Variola ovina ВГНКИ (НИСХИ) N 77, репродуцированного в культуре клеток почки ягнят с титром биологической активности 10 5,0 — 10 6,0 ТЦД 50 /мл, и стабилизатор при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Вируссодержащий материал — 40 — 60
Стабилизатор — 40 — 60
В качестве стабилизатора используют защитную среду, включающую 3% пептона и 5% сахарозы (Иванющенков В.Н. и соавт. Реактогенные и иммуногенные свойства вирусвакцины против оспы овец. Ветеринария, 1990, 7, 28 — 30).

Недостатки известной вакцины состоят в ее низкой иммуногенной активности, реактогенности и трудностях, обусловленных получением сырья в виде почек ягнят. Почки телят можно получить только после окотной кампании.

В задачу создания изобретения входила разработка вакцины против оспы овец аттенуированного штамма вируса, адаптированного к перевиваемой культуре клеток гонад козленка (Capra hircus L.). Технический результат от использования изобретения заключается в обеспечении высокой иммуногенной активности, безвредности, ареактогенности для овец и низкой себестоимости.

Указанный технический результат достигнут созданием изобретения, охарактеризованного следующей совокупностью признаков:
1) вакцина против оспы овец;
2) вируссодержащий материал аттенуированного штамма Sheep capripoxvirus ВНИИЗЖ, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток гонад Capra hircus L. , с титром биологической активности 10 5,0 — 10 6,0 ТЦД 50 /мл в концентрации 80 — 90%;
3) стабилизатор в концентрации 10 — 20%.

В качестве стабилизатора используют защитную среду, включающую 3% пептона, 5% сахарозы и 1% желатина.

Предлагаемое изобретение включает совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1) вакцина против оспы овец;
2) вируссодержащий материал аттенуированного штамма Sheep capripoxvirus ВНИИЗЖ, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток гонад Capra hircus L. , с титром биологической активности 10 5,0 — 10 6,0 ТДЦ 50 /мл в концентрации 80-90%;
3) стабилизатор в концентрации 10-20%.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1) вакцина против оспы овец;
2) вируссодержащий материал аттенуированного штамма вируса оспы овей, репродуцированного в культуре клеток, с титром биологической активности 10 5,0 — 10 6,0 ТДЦ 50 /мл;
3) стабилизатор.

По сравнению с прототипом существенными отличительными признаками изобретения являются использование в качестве вируссодержащего материала аттенуированного штамма Sheep capripoxvirus ВНИИЗЖ, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток гонад Capra hircus L. По сравнению с вирусвакциной-прототипом вирусвакцина на основе штамма ВНИИЗЖ обладает более высокой иммуногенной активностью, является ареактогенной и безвредной для овец, более дешевой по себестоимости. Перевиваемая линия клеток исключает необходимость убоя животных для получения почек и позволяет в любое время года получить необходимое количество вирусного сырья. Экономия средств включает также стоимость убоя животных.

Аттенуированный штамм Sheep capripoxvirus ВНИИЗЖ, используемый для изготовления вакцины против оспы овец, депонирован 27.06.96 г. в коллекции вирусов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ), имеет регистрационный шифр «ВНИИЗЖ». Местом хранения штамма определена коллекция микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института защиты животных (600900, Владимир, п/о Юрьевец).

Штамм вируса оспы ВНИИЗЖ получен путем адаптации исходного вируса оспы овец ВГНКИ (НИСХИ) N 77 к перевиваемой культуре клеток гонад Capra hircus L.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентам и научно-техническим источником информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах заявленного изобретения, позволили установить, что заявитель не обнаружил источник, характеризующийся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам заявленного изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности признаков аналога, позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков в заявляемой вакцине, изложенных в формуле изобретения. Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности «новизна».

Для проверки соответствия предлагаемого способа условию патентоспособности «изобретательский уровень» проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть формулы предлагаемого изобретения. Результаты поиска показали, что предлагаемая вакцина не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками заявляемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата, изложенных в п. 19.5.3. Правил составления, подачи и рассмотрения заявки на выдачу патента на изобретение. Следовательно, предлагаемая вакцина соответствует условию патентоспособности «изобретательский уровень».

Пример 1. Вирус адаптирован в 5 последовательных пассажах к перевиваемой линии культуры клеток гонад козленка. В первом пассаже цитопатогенное действие на площади 70-80% монослоя клеток отмечали через 5-6 дней. С увеличением количества пассажей выявлялось сокращение сроков патогенного действия вируса до 2-3 дней. Титр вируса достигал 10 5,0 — 10 6,0 лог. Специфическое действие вируса характеризовалось образованием клеток со светопреломляющим эффектом по всей поверхности монослоя клеток.

Пример 2. Штамм вируса оспы овец ВНИИЗЖ характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства
Вирус штамма обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя оспы овец.

Культуральные свойства
Штамм ВНИИЗЖ выращивается и поддерживается в перевиваемой культуре клеток гонад козленка. Вирус адаптируют к указанной культуре клеток путем проведения 3-5 пассажей. Цитопатогенное действие наступает через 48-96 часов на 18-100% поверхности монослоя заражения культуры клеток вирусом. При стационарном способе культивирования в культуре клеток гонад козленка вирус накапливается в титрах 10 5,0 — 10 6,0 ТЦД 50 /мл.

Антигенные свойства
При подкожном введении овцам вызывает образование вируснейтрализующих и комплементсвязывающих антител.

Безвредность
Штамм безвреден для овец при подкожном введении. Не передается контактным путем чувствительным животным. Для лабораторных животных (кроликов, морских свинок, мышей) не является патогенным. При введении вакцины в прививной дозе в разведении 1:25 кожной и температурной реакции не отмечается.

Реактогенность
Штамм ареактогенен для овец при подкожном введении. У овец может вызывать исчезающую через 5-7 дней местную реакцию в виде воспалительного отека размером 2х3 см при введении штамма в нативном виде по 5 мл подкожно в бесшерстный участок подмышечной области.

Иммуногенные свойства
При подкожном введении штамм в дозе 1000 ТЦД 50 создает стойкий иммунитет у привитых овец на 4-5 день после вакцинации продолжительностью 12 месяцев.

Реверсибельность и контагиозность
Штамм ВНИИЗЖ не восстанавливает вирулентных свойств после пяти последовательных пассажей на овцах (не реверсибелен) и не передается при совместном содержании привитых и интактных овец (не контагиозен).

Стабильность свойств при пассировании
Основные биологические свойства штамма стабильно сохраняются на протяжении 10 пассажей в перевиваемой культуре клеток гонад козленка (период наблюдения).

Сохраняемость
В нативном состоянии штамм вируса оспы овец ВНИИЗЖ не снижает своей активности в течение 3 месяцев при +4 o C, в лиофилизированном виде в присутствии 3% пептона, 5% сахарозы и 1% желатина его активность остается на исходном уровне при +4 o C и -20 o C в течение 2 лет (срок наблюдения). После восстановления из лиофилизированного состояния физиологическим раствором вирус не инактивируется при комнатной температуре в течение 24 часов, при -4 o C — 7 суток.

Пример 3. Изготовление вакцины для профилактики оспы овец на основе штамма ВНИИЗЖ.

Вирус выращивают в перевиваемой монослойной культуре клеток гонад козленка (ГК). Для этого штамм клеток ГК, хранящийся в жидком азоте, размораживают путем оттаивания в водяной бане при 37-38 o C и проводят 1-2 пассажа для восстановления исходной скорости роста в монослое. Из культурального сосуда с монослоем клеток удаляют среду культивирования. Монослой клеток дважды обрабатывают диспергирующим раствором, содержащим 0,25% раствор трипсина и 0,02% раствор версена, взятых в соотношении 1:3, с добавлением 0,5% декстрозы, до начала отслаивания клеток. Диспергирующий раствор сливают, вносят среду Игла с 10% сыворотки КРС и 0,03% глутамина и суспензию разливают в культуральные сосуды. Культуру клеток инкубируют при 37 o C в течение 48-72 часов до момента формирования плотного монослоя. Для пересева выбирают сосуды с культурой клеток ГК в виде сформировавшегося равномерного монослоя. Для выращивания вируса используют сосуды емкостью 200 см 3 с выросшим плотным монослоем клеток ГК. В сосуды вносят 5 см 3 расплодки вируса ВНИИЗЖ производственной серии. После этого сосуда ставят на 1 час в термостат при 37 o C, вносят в них поддерживающую питательную среду Игла по 100 или 200 см 3 в зависимости от объема сосудов и инкубируют при 37 o C. Для контроля оставляют 2-3 сосуда с неинфицированной культурой клеток, в которые вносят поддерживающую среду и инкубируют в тех же условиях, что и инфицированную культуру клеток. Смену среды осуществляют через каждые 2 суток после инфицирования клеток. На 3-5 сутки после заражения клеток при наличии цитопатогенных изменений на 80-90% и более площади монослоя содержимое сосудов подвергают замораживанию при -20 o C и оттаиванию при 25 o C, энергично встряхивая для отделения монослоя. Из каждого сосуда берут пробу по 3 мл для определения загрязнения и цитопатической активности.

Полученный материал хранят при 40 o C + 2 o C не более 30 суток до получения результатов контроля. Содержимое сосудов без бактериального заражения оттаивают, сливают в одну емкость, тщательно перемешивают и из общей массы берут 3 пробы для определения биологической активности. Вируссодержащую суспензию хранят в замороженном состоянии при -20 o C не более 6 мес. При активности вируса не ниже 10 4,5 ТЦД 50 /мл стерильный вируссодержащий материал используют для изготовления производственной серии вирусвакцины. Для этого его оттаивают при 25 o C, добавляют стабилизатор, содержащий 3% пептона, 5% сахарозы и 1% желатина, тщательно перемешивают, разливают в стерильные флаконы по 4,0 см 3 и помещают в холодильники при +4 o C. Лиофилизацию вирусного материала производят при 50 o C. Величину вакуума в камере сублимационного аппарата устанавливают в пределах 4-7 Па. Конечная температура полок аппарата в процессе высушивания 30-40 o C. Высушивание при подогреве полок до указанной температуры осуществляют до того момента, когда температура материала достигнет 8-10 o C, после чего обогрев переводят на температуру 28-30 o C. Высушивание при температуре материала 24-26 o C проводят в течение 5-6 часов. Конечная температура материала не должна превышать 28-30 o C. Ампулы с высушенной вакциной запаивают на карусельно-коллекторном аппарате при остаточном давлении 25-30 Па. Полученная вакцина представляет гомогенную массу желтовато-белого цвета без посторонней примеси. Остаточная влажность препарата составляет 3-6%. Полученная вакцина против оспы овец имеет компонентный состав ,%, представленный в табл. 1.

Полученная вакцина против оспы овец при титровании в культуре клеток ГК имеет титр 4,5-5,5 lgТЦД 50 /мл.

Пример 4. Проведены испытания вакцины, содержащей, мас.%:
Вируссодержащий материал аттенуированного штамма оспы овец ВНИИЗЖ, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ГК, с титром биологической активности 10 5,0 -10 6,0 ТЦД 50 /мл — 80
Стабилизатор — 20
Определение иммуногенной активности вакцины проводят на 4 овцах. В качестве контроля используют 2 неиммуногенные овцы. Вакцину вводят животным однократно в дозе до 1 см 3 подкожно в область бесшерстного участка подмышечной области. Через 12 дней всех вакцинированных и контрольных животных заражают эпизоотическим вирусом оспы овец штамм «Афганский» при 500 ИД 50 /0,5 см 3 внутрикожно в область внутренней поверхности хвоста. Вакцинированные овцы остались устойчивыми к заражению. Контрольные животные заболели оспой в генерализованной форме.

Пример 5. Проведены испытания вакцины против оспы овец, имеющей следующий компонентный состав, мас.%:
Вируссодержащий материал аттенуированного штамма оспы овец ВНИИЗЖ, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ГК, с титром биологической активности 10 5,0 — 10 6,0 ТЦД 50 /мл — 85
Стабилизатор — 15
Определение иммуногенной активности вакцины проводят на 4 овцах. В качестве контроля используют 2 неиммуногенные овцы. Вакцину вводят животным однократно в дозе по 1 см 3 подкожно в область бесшерстного участка подмышечной области. Через 12 дней всех вакцинированных и контрольных животных заряжают эпизоотическим вирусом оспы овец штамм «Афганский» по 500 ИД 50 /0,5 см 3 внутрикожно в область внутренней поверхности хвоста. Вакцинированные овцы остались устойчивыми к заряжению. Контрольные животные заболели оспой в генерализованной форме.

Пример 6. Проведены испытания вакцины против оспы овец, имеющей следующий компонентный состав, мас.%:
Вируссодержащий материал аттенуированного штамма оспы овец ВНИИЗЖ, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ГК, с титром биологической активности 10 5,0 — 10 6,0 ТЦД 50 /мл — 90
Стабилизатор — 10
Определение иммуногенной активности вакцины проводят на 4 овцах. В качестве контроля используют 2 неиммуногенные овцы. Вакцину вводят животным однократно в дозе по 1 см 3 подкожно в область бесшерстного участка подмышечной области. Через 12 дней всех вакцинированных и контрольных животных заражают эпизоотическим вирусом оспы овец штамм «Афганский» по 500 ИД 50 /0,5 см 3 внутрикожно в область внутренней поверхности хвоста. Вакцинированные овцы остались устойчивыми к заражению. Контрольные животные заболели оспой в генерализованной форме.

Пример 7. Изучение безвредности вакцины против оспы овец из штамма ВНИИЗЖ.

Для определения безвредности используют 2 овец 1-2-летнего возраста массой не менее 30 кг. Лиофилизированную вакцину разводят физиологическим раствором до исходного объема и вводят каждому животному подкожно в область бесшерстного участка подмышечной области по 5,0 см 3 . Через 3-4 суток на месте введения вакцины образуется отечность, исчезающая через 5-7 дней. Температура тела остается в пределах нормы.

Пример 8. Изучение иммуногенной активности вакцины против оспы овец из штамма ВНИИЗЖ.

Определение иммуногенной активности вакцины проводят на 4 овцах. В качестве контроля используют 2 неиммуногенные овцы. Для этого лиофилизированную вакцину разводят физиологическим раствором в соотношении 1:25 и вводят по 1 см 3 подкожно в область бесшерстного участка подмышечной области каждому животному. Через 12 дней всех вакцинированных и контрольных животных заражают эпизоотическим вирусом оспы овец штамм «Афганский» по 500 ИД 50 /0,5 см 3 внутрикожно в область внутренней поверхности хвоста. Вакцинированные овцы остались устойчивыми к заражению. Контрольные животные заболели оспой в генерализованной форме. Результаты исследований приведены в табл. 2.

Пример 9. Изучение эффективности вакцины против оспы овей из штамма ВНИИЗЖ при иммунизации различными дозами.

Определение иммуногенной активности вакцины проводят на 8 овцах. Вакцину разводят физиологическим раствором до исходного объема, а затем из него готовят разведения таким образом, чтобы в 1 см 3 содержалось вируса 1200 и 300 ТЦД 50 /1 см 3 . Каждую указанную дозу вводят 4 животным подкожно в область бесшерстного участка подмышечной области. Через 12 дней всех вакцинированных и 2 контрольных неиммунных овец заражают вирулентным вирусом оспы овец штамм «Афганский» внутрикожно в область внутренней поверхности хвоста по 500-1000 ИД 50 /см 3 . Вакцинированные овцы остались устойчивыми к заражению. Контрольные овцы заболели оспой в генерализованной форме. Результаты исследований приведены в табл. 3.

Пример 10. Изучение эффективности вакцины с титром вируса 10 5,5 ТЦД 50 /1,0 см 3 .

Эффективность вакцины оценивают по устойчивости овец, иммунизированных различными дозами вакцины. Для этого вакцину разводят физиологическим раствором до исходного объема, из которого готовят разведения таким образом, чтобы в прививной дозе 1,0 см 3 содержалось 40000, 10000, 1000 и 100 ТЦД 50 /см 3 . С этой целью 12 овец размещают в 4 группы и каждую группу прививают вышеуказанными дозами подкожно в бесшерстный участок подмышечной области. Через 12 дней всех вакцинированных и 2 контрольных овец заражают вирулентным вирусом оспы овец штамм «Афганский» внутрикожно в область внутренней поверхности хвоста по 500-1000 ИД 50 /см 3 . Все вакцинированные овцы оказались устойчивыми к заражению. Контрольные животные заболели оспой в генерализованной форме (см. табл. 4).

Таким образом, изложенные сведения свидетельствуют о выполнении при использовании предлагаемой вакцины следующей совокупности условий:
вакцина против оспы овец, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарии;
для предлагаемой вакцины в том виде, как она охарактеризована в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность ее осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;
вакцина, полученная в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой иммуногенной активностью, безвредностью, аректогенностью и низкой себестоимостью.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности «промышленная применимость».

Источники информации
1. Лихачев Н.В. Ветеринария, 1945, 2.

2. Jassim F.A. et al. Indian. Vet.J., 1981, 58, 10.

3. Martin W.B. et al. Res. Vet. Sci., 1973. 14.

4. Matewa-Penkova V. et al. Bull. Off. Int. Epiz., 1974, 81.

5. Ramisse J. et al. Rev. Elev. Med. Vet. Pays trop., 1978, 31, 1.

6. Ramyar H. et.al. Bull. Off. Int. Epiz., 1974, 81.

7. Soman J.P. et. al. Indian J. Anim. Sci., 1979, 49, 8.

8. Fassi-Fehri M., et. al. Ann. Rech. Vet., 1984, 15, 1.

9. Sharma P.C. et. al. Indian J. Anim. Sci., 1987, 57, 9.

10. Singh J.P. et. al. Anim Sci., 1984. 54, 7.

11. Das S.K. et. al. Indian J. Exp. Biol., 1986, 24, 6.

12. Kabra S.K. Anim. Sci., 1984, 54, 7.

13. Жидкова Л.А. и соавт. Тез. докл. IV Всес.вет.вирусол. конф., 1976, 2.

14. Лихачев Н.В. и соавт. Докл. ВАСХНИЛ, 1972, 11.

15. Лихачев Н.В. и соавт. Научн.отчеты ВГНКИ, 1977.

16. Лихачев Н.В. и соват. Материалы к заданию НТС МСХ СССР, 1978.

17. Патент РФ N 2061753, МПК 6 C 12 N 5/06, 7/00; 02.08.94 г.

18. Иванющенков В.Н. и соавт. Реактогенные с иммуногенные свойства вирусвакцины против оспы овец. /Ветеринария, 1990, 7, 28 — 30 (прототип).

19. Авт. свид. СССР N 1356460, МПК 4 C 12 N 7/00, 05.06.85.

20. Авт. свид. СССР N 1614201, МПК 5 A 61 K 39/275,24.03.89.

21. Иванющенков В.Н. и соавт. Биологические свойства вакцинного штамма НИСХИ вируса оспы овец. /Ветеринария, 1990, 8.22 — 26.

22. Черняк Е.П. и соавт. Биологические свойства производственных штаммов вируса оспы овец. /Ветеринария, 1991, 3, 24 — 26.

23. Курченко Ф.П. и соавт. Эффективность сухой культуральной вирусвакцины из штамма НИСХИ против оспы овец. /Ветеринария, 1991, 10, 21 — 24.

24. Иванющенков В.Н. и соавт. Реактогенные и иммуногенные свойства вирусвакцины против оспы овец из штамма НИСХИ. Вирусные и микробные болезни животных. Сб. науч. трудов. Владимир, 1995, 186 — 191.

25. Иванющенков В.Н. и соавт. Биологические свойства вакцинного штамма НИСХИ вируса оспы овец. Вирусные и микробные болезни животных. Сб. науч. трудов. Владимир, 1995, 254 — 259.

Вакцина против оспы овец, включающая вируссодержащий материал аттенуированного штамма оспы овец и стабилизатор, отличающаяся тем, что в качестве вируссодержащего материала вакцина содержит штамм Sheep capripoxvirus ВНИИЗЖ, репродуцированный в перевиваемой культуре клеток гонад Capra hircus L., с титром биологической активности 10 5,0 — 10 6,0 ТЦД 50 /мл при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Вируссодержащий материал штамма Sheep capripoxvirus ВНИИЗЖ, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток гонад Capra hircus L., с титром биологической активности 10 5,0 — 10 6,0 ТЦД 50 /мл — 80 — 90
Стабилизатор — 10 — 20п

источник

Владельцы патента RU 2396977:

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Вирус-вакцина в качестве активного вещества содержит антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз (ВОК) Variola vims caprmum сем. Poxviridae, подсем. Chordopoxvirinae, рода Capripoxvirus, депонированного в коллекцию ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером (ссылкой) «ВНИИЗЖ 2003» — ДЕП, в эффективном количестве. Штамм репродуцируется в культуре клеток Ch-91 в течение 5-7 суток и накапливается в титре от 5,5 lg ТЦД₅₀/см 3 до 7,0 lg ТЦД₅₀/см 3 . Штамм сохраняет исходные характеристики при пассировании в культуре клеток Ch-91 в течение 35 пассажей. Вирус-вакцина защищает иммунизированных животных от прямого заражения эпизоотическим вирусом оспы коз, циркулирующим на территории России. 4 ил., 7 з.п. ф-лы, 7 табл.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении средств специфической профилактики оспы коз.

Оспа коз — высококонтагиозное вирусное заболевание, которое протекает в тяжелой форме, с характерными клиническими признаками, часто с летальным исходом, особенно среди молодняка. Экономический ущерб, причиняемый оспой козоводству, чрезвычайно велик. Прямые убытки слагаются из отхода животных (гибель молодняка при тяжелом течении болезни может достигать 50÷80%, а взрослого поголовья — 5÷10%), снижения продуктивности — удоев молока, качества и привеса мяса, потерь шерсти и пуха, снижения качества кожи.

В соответствии с классификацией, установленной Международной комиссией по таксономии вирусов (International Committee on Taxonomy of Vimses — ICTV), вирус оспы коз (ВОК) относится к роду 00.058.1.04 Capripoxvirus, принадлежащему к подсемейству 00.058.1 Chordopoxvirinae семейства 00.058 Poxviridae [1].

Род Capripoxvirus включает вирус оспы овец (BOO), ВОК и вирус кожной бугорчатки КРС (вирус нодулярного дерматита (ВБ)). Представители рода близкородственны, что доказывается иммунологическим анализом и структурой гена. Так ВОК является близкородственным BOO, но таксономически самостоятельным видом. BOO и ВОК не обладают четко выраженной хозяйской специфичностью: несмотря на то, что обычно вирусы вызывают наиболее выраженное заболевание либо у овец, либо у коз, некоторые штаммы патогенны для обоих видов животных-хозяев [2, 3].

В связи с этим на практике, как правило, не дифференцируют два этих заболевания, а обычно обозначают как единое заболевание — оспа овец и коз. Именно под таким названием заболевание оспа овец и коз приводится в перечне Международной организации здравоохранения животных (МЭБ) болезней, обязательных к декларированию, хотя это и затрудняет анализ реальной распространенности оспы овец и оспы коз как отдельных заболеваний.

По данным МЭБ это заболевание регистрируется на всех континентах, за исключение Австралии и Океании. В последние годы оспа получила широкое распространение и в тех странах, где раньше никогда не регистрировалась (Вьетнам, 2005; Монголия, 2006; Греция, 2007).

Напряженная ситуация остается в странах СНГ Среднеазиатского и Кавказского регионов (Казахстан, Таджикистан, Киргизия, Азербайджан, Грузия). В 1996-2003 гг. неблагополучными по этому заболеванию были 55 стран, в том числе 7 стран СНГ. Так, в Таджикистане оспу коз регистрировали в виде отдельных случаев, в 2001 г. — уже в 11 хозяйствах, а в 2002 г. — практически во всех зонах республики. Вначале заболевание выявилось только у коз ангорской породы, а в 2002 г. — и у коз местных пород.

В течение длительного времени Россия оставалась благополучной по данному заболеванию. В 2002 г. во время вспышки оспы овец на Дальнем Востоке отмечались единичные случаи заболевания коз, а в 2003 г. оспа коз проявила себя как самостоятельное заболевание.

В связи с тем, что Россия имеет общую границу и тесные экономические связи со многими неблагополучными по оспе государствами, заболевание представляет большую угрозу для нашей страны в отношении возможности заноса возбудителей болезни.

Создавшаяся эпизоотическая ситуация по оспе овец и оспе коз свидетельствует о необходимости иметь высокоэффективные диагностические препараты и средства специфической профилактики как против оспы овец, так и против оспы коз, которые в короткие сроки позволили бы идентифицировать возбудителей этих заболеваний и быстро купировать распространение инфекций.

Это обстоятельство вынуждает вести постоянный поиск новых штаммов ВОК, пригодных для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики оспы коз.

В странах, где отмечены вспышки этого заболевания, специфическая профилактика оспы коз проводится с помощью культуральных вирусвакцин из аттенуированных штаммов ВОК и инактивированных тканевых и культуральных вакцин. Однако инактивированные вакцины уступают вирус-вакцинам по иммуногенной активности.

Известна вирус-вакцина против оспы коз, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «Durg» ВОК, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде стабилизатора в эффективном соотношении [4].

Известна вирус-вакцина против оспы коз, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «GT₄-STV₄₂» ВОК, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде стабилизатора в эффективном соотношении [5].

Известна вирус-вакцина против оспы коз, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «Mysore» ВОК, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде стабилизатора в эффективном соотношении [6].

Известна вирус-вакцина против оспы коз, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «Gorgan» ВОК, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде стабилизатора в эффективном соотношении [7].

Известен также штамм культивируемых клеток гонады козы домашней Capra hircus L. — продуцент вирусов животных. Авторами данного изобретения определена чувствительность клеток Ch-91 к заражению вирусами ящура, болезни Ауески, болезни Гамборо и африканской чумы лошадей [8].

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существующих признаков является вирус-вакцина против оспы коз культуральная сухая, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «ОК/А-04» ВОК, репродуцированного в культуре клеток почки овцы ПО-ВНИИВВиМ с титром инфекционной активности 5,5÷6,0 lg ТЦД₅₀/см 3 , и целевую добавку в виде лактозо-пептонного стабилизатора в соотношении, мас.%, 50,0:50,0 [9].

Недостатки вышеуказанных вирусвакцин, в том числе и вирусвакцины-прототипа, состоят в том, что они обеспечивают эффективную защиту животных только от заражения гомологичным вирусом.

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в получении вирусвакцины против оспы коз культуральной сухой, создающей эффективную защиту восприимчивых животных от эпизоотического ВОК, циркулирующего на территории Российской Федерации.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения состоит в расширении арсенала вирусвакцин против оспы коз культуральных сухих, обладающих высокой антигенной и иммуногенной активностью и обеспечивающих эффективную защиту восприимчивых животных от эпизоотического возбудителя оспы коз, циркулирующего на территории России.

Указанный технический результат достигнут созданием вирусвакцины против оспы коз культуральной сухой, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.

Предлагаемая вирус-вакцина содержит активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» (авторское наименование) ВОК, репродуцированного в культуре клеток гонады козы Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД₅₀/см 3 , и целевую добавку в виде стабилизатора в соотношении, мас.%:

Вирусный изолят, послуживший источником для получения аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, был выделен в 2003 г. в Приморском крае Российской Федерации от больных оспой коз.

Для получения вируса, обладающего оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали различные системы культивирования, в том числе линии клеток: ПО, Ch-91, ПСГК, МДВК, СПЭВ, Vero, ВНК-21 и Marc-145. В процессе адаптации было установлено, что гомологичная система культивирования перевиваемая линия клеток гонады козы Ch-91 высокочувствительна к ВОК и оказалась оптимальной культурой для выращивания выделенного вируса. В результате осуществления 35 последовательных пассажей изолята на культуре клеток Ch-91 был получен аттенуированный штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, имеющий стабильные биотехнологические, антигенные и иммуногенные свойства.

В зависимости от дозы заражения и количества пассажей в условиях стационарного культивирования накопление ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» в культуре клеток Ch-91 обеспечивалось на уровне от 6,0 до 7,5 lg ТЦД₅₀/см 3 .

По сравнению с исходным изолятом штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК имеет генетические и фенотипические отличия. По результатам сравнительного изучения иммунобиологических характеристик различных штаммов ВОК установлено, что штамм «ВНИИЗЖ 2003» является авирулентным, обладает хорошей антигенной и иммуногенной активностью и защищает от контрольного заражения гомологичным эпизоотическим вирусом.

Преимущество штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК по сравнению со штаммом «ОК/А-04» ВОК заключается в стабильно высоком накоплении вируса в культуре клеток Ch-91 и его высокой биологической, антигенной и иммуногенной активности.

Штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК депонирован 6 июня 2006 г. во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») под регистрационным номером (ссылкой) — производственный вакцинный штамм «ВНИИЗЖ 2003» — ДЕП ВОК.

Для изготовления вирусвакцины против оспы коз культуральной сухой в качестве чувствительной биологической системы используют культуру клеток Ch-91 с хорошо сформировавшимся монослоем 2÷3 суточного возраста в клинских матрасах.

В качестве активного вещества используют суспензию лиофилизированного или нативного ВОК аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» с титром инфекционной активности от 5,0 до 6,0 lg ТЦД₅₀/см 3 . Для заражения культуры клеток Ch-91 используют вирус в дозе 0,1 ТЦД₅₀/кл. Внесенную вирусную суспензию экспонируют на монослой культуры клеток Ch-91 в термостате в течение часа при (37±0,5)°С. Культивирование вируса проводят в течение 12 суток при указанной температуре. При поражении вирусом площади монослоя не менее 80% (округление и появление светопреломляющего эффекта) проводят сбор вируса.

Для изготовления вирусвакцины против оспы коз культуральной сухой используют антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученного в культуре клеток Ch-91 с титром инфекционной активности не менее 5,5 lg ТЦД₅₀/см 3 .

Вирусвакцину против оспы коз кульуральную сухую получают путем смешивания антигенного материала из аттенуировнного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК и стабилизатора в соотношении, мас.%, 80:20÷90:10 соответственно. В качестве стабилизатора используют растворы сахарозы, желатозы и гидролизата лактальбумина.

Содержание антигенного материала и стабилизатора в прививной дозе вирусвакцины против оспы коз культуральной сухой в соотношении, мас.%, 80:20÷90:10 является оптимальным, так как обеспечивает толерантную презентацию антигена в организме иммунизированного животного.

Полученную вирусвакцину фасуют в ампулы по 2,0 см 3 или во флаконы по 2,0 см 3 или по 4,0 см 3 , замораживают при температуре минус 50°С и подвергают лиофильному высушиванию.

Вирус-вакцина против оспы коз культуральная сухая, расфасованная во флаконы или ампулы, представляет собой однородную пористую массу цилиндрической формы светло-желтого цвета, растворяющуюся в течение 1-1,5 минут в физрастворе. В одной ампуле содержится 2,0 см 3 , а во флаконе — 2,0 см 3 или 4,0 см 3 сухой вирусвакцины, что соответствует в ампуле 50 и во флаконе 50 или 100 прививным дозам препарата для коз.

Полученный препарат подвергают контролю на стерильность, специфичность и иммунобиологическую активность в соответствии с показателями, установленными стандартом организации-изготовителя.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:

1. Вирус-вакцина против оспы коз культуральная сухая.

2. Активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК в эффективном количестве.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:

1. Вирус-вакцина против оспы коз культуральная сухая.

По сравнению с вирусвакциной-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемой вирусвакцины является то, что в качестве активного вещества она содержит антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, обладающего высокой антигенной и иммуногенной активностью, в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, репродуцированного в культуре клеток гомологичного происхождения.

2. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, репродуцированного в культуре клеток гонады козы Ch-91.

3. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, репродуцированного в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД₅₀/см 3 .

4. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, репродуцированного в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД₅₀/см 3 , в количестве 80-90 мас.%.

5. Из целевых добавок стабилизатор.

6. Стабилизатор в количестве 10-20 мас.%.

7. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, репродуцированного в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД₅₀/см 3 , и стабилизатор в соотношении, мас.%:

Предлагаемое изобретение расширяет арсенал вирусвакцин против оспы культуральных сухих, обладающих высокой антигенной и иммуногенной активностью и обеспечивающих эффективную защиту восприимчивых животных от эпизоотического возбудителя оспы коз, циркулирующего на территории России.

Достижение технического результата от использования предлагаемого изобретения объясняется тем, что в качестве активного вещества оно содержит антигенный материал из нового авирулентного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, обладающего высокой антигенной и иммуногеной активностью.

Экспериментально подтверждена возможность его использования в составе вирусвакцины против оспы коз. Штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК обеспечивает получение эффективной вирусвакцины против оспы коз, создающей защиту восприимчивых животных от возбудителя оспы коз, циркулирующего на территории России.

Сущность изобретения пояснена на графических материалах, на которых на:

фиг.1 представлено графическое изображение изменения титра ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» при его пассировании в культуре клеток Ch-91 (доза заражения 0,01÷0,05 ТЦД₅₀/кл);

фиг.2 — фотографическое изображение под электронным микроскопом характерной морфологии ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» (фото получено д.б.н. А.П.Пономаревым), увеличение х76000;

фиг.3 — хроматограмма результатов видовой дифференциации каприпоксвирусов, полученных методом мультиплексной ПЦР с видоспецифическими праймерами, на которой:

1 — отрицательный контроль;

2 — маркер (снизу вверх — 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 п.н. и т.д.);

3 — BOO, вакцинный штамм «ВНИИЗЖ»;

4 — BOO, эпизоотический штамм «Афганский»;

5 — BOO, эпизоотический штамм «Приморский»;

6 — BOO, эпизоотический штамм «ЕАО»;

7 — BOO, эпизоотический штамм «Таджикский»;

8 — ВОК, вакцинный штамм «ВНИИЗЖ 2003»;

9 — ВОК, эпизоотический штамм «Приморский 2003»;

10 — ВОК, эпизоотический штамм «Pellor»;

фиг.4 — хроматограмма результатов видовой дифференциации BOO и ВОК, полученных методом рестрикции гена «ankyrin-repeat» белка, на которой:

1 — маркер (снизу вверх — 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 п.н. и т.д.);

2 — BOO, вакцинный штамм «ВНИИЗЖ»;

3 — BOO, эпизоотический штамм «Афганский»;

4 — BOO, эпизоотический штамм «Приморский»;

5 — BOO, эпизоотический штамм «ЕАО»;

6 — ВОК, вакцинный штамм «ВНИИЗЖ 2003»;

7 — ВОК, эпизоотический штамм «Приморский 2003»;

8 — BOO, эпизоотический штамм «Таджикский»;

9 — ВОК, эпизоотический штамм «Pellor».

Штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК характеризуется следующими признаками и свойствами.

Штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК относится к роду Capripoxvirus, семейства Poxviridae и обладает морфологическими признаками, характерными для ВОК.

Вирион ВОК состоит из вирусной сердцевины (нуклеоида), овальных латеральных тел и наружной оболочки. Нуклеоид окружен гладкой мембраной толщиной 5 нм. Внутри него находится нуклеопротеин (ДНК, связанная с белком), имеющий S — образную или более сложную форму. Чувствительные к трипсину структуры, называемые боковыми телами, сдавливают нуклеоид, придавая ему форму двояковогнутого диска, имеющего на срезе вид гантели. Нуклеоид и боковые тела окружены наружной оболочкой, состоящей из липидов и трубчатых белковых структур (10×5 нм).

Геном представлен двухцепочечной ДНК. Две цепи ДНК соединены шпилькообразными петлями, в результате чего образуется одна непрерывная, ковалентно связанная полинуклеотидная цепь. Флип-флоп формы ДНК (т.н. «шпильки») образованы инвертированными концевыми повторами: идентичными, но противоположно ориентированными последовательностями ДНК, длина которых варьирует даже в пределах одного рода (Классификация и номенклатура вирусов позвоночных, 2002).

По своим антигенным свойствам штамм «ВНИИЗЖ 2003» относится к ВОК.

Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой в реакции нейтрализации (РН) на культуре клеток Ch-91, в реакции диффузионной преципитации (РДП) и в реакции длительного связывания комплемента (РДСК). Штамм проявляет антигенную активность в РДП 1:16÷1:32, в РДСК 1:120÷1:160 и в иммуноферментном анализе (ИФА) 1:1000÷1:4000.

Испытания вирусвакцины против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» в лабораторных условиях показали, что иммунизация коз сопровождается образованием вируснейтрализующих антител в крови животных в титре не менее 2,0 log₂.

Штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК проявляет высокую биологическую, антигенную и иммунологическую активность в лиофилизированном виде и в виде культуральной вируссодержащей суспензии. Штамм предназначен для изготовления вакцинных и диагностических препаратов. Вирус штамма «ВНИИЗЖ 2003» репродуцируется в монослойных культурах клеток: первичнотрипсинизированной культуре клеток почки овцы и перевиваемой культуре клеток Ch-91 и в течение 5÷7 суток инкубирования накапливается в титре не менее 5,5 lg ТЦД₅₀/см 3 . Сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 35 пассажей.

Геном ВОК не обладает инфекционностью и представлен молекулой линейной двухцепочечной ДНК с центральным менее вариабельным участком длиной около 145 kb и более вариабельными концами.

При электронной микроскопии штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК были выявлены вирусные частицы, структура и размеры которых характерны для каприпоксвирусов.

Вирионы оспы имеют линейную двухспиральную ДНК длиной 45÷60 мкм, молекулярной массой 80÷240 МДа. Плавучая плотность ДНК вирусов оспы в хлористом цезии и сахарозе равна 1,676÷1,723 г/см 3 . Важной особенностью ДНК вируса оспы является необычно прочная структура двухспиральной молекулы. Обе нити молекулы ДНК связаны между собой ковалентно.

Устойчивость к внешним факторам

ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» устойчив к высушиванию, эфиру, не стоек к воздействию высокой температуры, различных химических веществ, например формалину (0,5-1%), слабым растворам йода (1:10000), соляной, серной кислот (2,5%), спирту, его инфекционная активность сохраняется при рН 6,0÷7,4.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность — иммуногенен в составе живой лиофилизированной вакцины.

Реактогенность — в месте подкожного введения нативного вируса в объеме 5 см 3 образуется кожный тяж длиной до 4 см.

Патогенность — при внутримышечном введении животным заболевания не вызывает. При испытании вирусвакцины против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» на козах было установлено, что она не вызывала ответной местной реакции на подкожное введение в объеме 5 см 3 (125 прививных доз), была безвредна и ареактогенна для коз.

Вирулентность — авирулентен для мелких жвачных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Антигенные свойства — вирус индуцирует у коз и овец образование вируснейтрализующих антител.

Стабильность биологических свойств. Сохраняет исходные характеристики при пассировании на культуре клеток гонады козы Ch-91 в течение 35 пассажей. Штамм нереверсибелен в течение 5 пассажей на козах.

Сущность предложенного изобретения пояснена примерами его исполнения и использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма «ВНИИЗЖ 2003», был выделен в 2003 г. от больных оспой коз в Приморском крае Российской Федерации. Подготовку материала проводили общепринятым методом.

Биологические и вирусологические методы включали адаптацию вируса, выделенного от больных коз, к культурам первично трипсинизированных и перевиваемых линий клеток и его аттенуацию. Для выращивания ВОК были испытаны разные линии культур клеток: ПО, Ch-91, ПСГК, MDBK, СПЭВ, Vero, BHK — 21, Marc-145. В процессе адаптации было установлено, что перевиваемая линия клеток Ch-91 высокочувствительна к ВОК и оказалась оптимальной культурой для получения расплодки штамма для изготовления вирусвакцины.

В дальнейшем для получения расплодки вирусную суспензию вносили на освобожденный от ростовой среды монослой культуры клеток и экспонировали час в термостате при температуре (37±0,5)°С. После этого вносили поддерживающую среду ПСП или Игла с добавлением 1÷2% сыворотки крови КРС. Инфицированную культуру инкубировали при (37±0,5)°С до появления ЦПД вируса, которое характеризовалось округлением клеток, скоплением их в виде групп по 10÷20 клеток и в дальнейшем тотальной деструкцией монослоя клеток. При поражении площади монослоя не менее 70÷80% (округление и появление светопреломляющего эффекта, отслоение от стекла) 3-кратным промораживанием культуральных матрасов производили сбор вируса с последующим отбором проб для исключения микробной контаминации и определения инфекционной активности вируса титрованием в культуре клеток Ch-91.

Выделенный вирус обладал цитопатическим действием на культуре клеток Ch-91 с первоначальным титром 3,0÷4,0 lg ТЦД₅₀/см 3 . В последующих пассажах на этой же культуре клеток титр вируса повышался в 6÷7-м пассажах до 5,0÷5,5 lg ТЦД₅₀/см 3 , в 8÷10-м пассажах до 6,0 lg ТЦД₅₀/см 3 .

В зависимости от дозы заражения, составлявшей 0,01÷1,0 ТЦД₅₀/кл, накопление аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ-2003» ВОК в культуре клеток Ch-91 обеспечивалось на уровне 5,33÷7,17 lg ТЦД₅₀/см 3 за 4÷7 суток при 50÷90% поражении клеточного монослоя. Оптимальной инфицирующей дозой вируса считали 0,01÷0,05 ТЦД₅₀/кл, вызывающей при стационарном культивировании в течение 5÷7 суток накопление вируса в титре от 6,67±0,08 до 7,17±0,10 lg ТЦД₅₀/см 3 при 80÷90% поражении клеточного монослоя. Результаты исследований представлены в таблице 1. Стабильность культуральных свойств лиофилизированного вируса при определении степени его накопления в течение 35 пассажей в культуре клеток Ch-91 при заражающей дозе 0,01-0,05 ТЦД₅₀/кл представлена на фиг.1.

Из данных, представленных на фиг.1, следует, что в процессе пассирования в условиях стационарного культивирования ВОК с дозой заражения 0,01-0,05 ТЦД₅₀/кл его инфекционная активность на уровне 6,0÷7,50 lg ТЦД₅₀/см 3 отмечалась в течение первых 13 пассажей. При увеличении количества пассажей инфекционная активность вируса постепенно снижалась. Результаты исследования сроков культивирования ВОК в культуре клеток Ch-91 представлены в таблице 2.

Инфекционная активность штамма «ВНИИЗЖ-2003» ВОК при дозе заражения 0,01÷0,05 ТЦД₅₀/кл зависела от количества пассажей. На уровне 8÷13 пассажей продолжительность культивирования ВОК не превышала 7 дней. За это время достигалось наиболее выраженное (80÷90%) ЦПД вируса и его максимальное накопление в культуре клеток Ch-91. В дальнейшем, накопление вируса установлено на более низком уровне и инфекционная активность вируса следующих пассажей характеризовалась меньшими значениями с увеличением продолжительности культивирования.

В результате осуществления 35 последовательных пассажей выделенного ВОК на культуре клеток Ch-91 был получен аттенуированный штамм «ВНИИЗЖ 2003» (авторское наименование), имеющий стабильные биотехнологические, антигенные и иммуногенные свойства, которые позволяют использовать его для получения антигенного материала при изготовлении диагностикумов и вирусвакцины против оспы коз.

В дальнейшем культуру клеток Ch-91 использовали для получения расплодки ВОК при изготовлении вирусвакцины.

Полученный штамм ВОК был испытан в лабораторных, а затем и в эпизоотических условиях. В результате проведенных исследований установлено следующее:

1. Проверку на стерильность осуществляли путем высева проб вируссодержащей жидкости на бактериальные питательные среды МПБ, МПА, МППБ, агар Сабуро (жидкий) и тиогликолевую среду, а также среды Эдварда или Мартена для выявления микоплазм. Бактериальные или грибковые загрязнения штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК отсутствовали, как и контаминация другими вирусами.

2. При электронной микроскопии штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК были выявлены вирусные частицы, структура и размеры которых характерны для каприпоксвирусов (фиг.2).

3. Видовая принадлежность штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК подтверждена двумя молекулярно-генетическими методами: мультиплексной ПЦР с видоспецифичными праймерами (фиг.3) и рестрикционным анализом фрагмента гена «ankyrin-repeat» белка (фиг.4).

4. Специфичность штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК была подтверждена в РДП, РДСК и ИФА.

Полученный штамм депонирован 6 июня 2006 года во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером (ссылкой) — производственный вакцинный штамм «ВНИИЗЖ 2003» — ДЕП ВОК.

В ходе разработки мультиплексной ПЦР для индикации и видовой дифференциации каприпоксвирусов в результате анализа полных нуклеотидных последовательностей генома каприпоксвирусов, представленных в базе данных GenBank, были установлены видоспецифичные участки для BOO, ВОК и ВБ. На основе этих данных были сконструированы видоспецифичные праймеры S1 и S2 — для BOO, G1 и G2 -для ВОК, L1 и L2 — для ВБ. Видоспецифичные праймеры были рассчитаны таким образом, что чтобы синтезируемые с их участием ампликоны имели разную длину: 415 п.н. для ВОК, 311 п.н. для BOO и 254 п.н. для ВБ. Это позволило использовать все три пары праймеров в одной реакции и различать продукты мПЦР по размеру с помощью электрофореза в агарозном геле.

В ходе видовой дифференциации каприпоксвирусов было исследовано 11 проб вируссодержащих клеточных культур с вакцинным штаммом «ВНИИЗЖ» и с эпизоотическими штаммами «Афганский», «Приморский», «EAO» BOO, с вакцинным штаммом «ВНИИЗЖ 2003» и с эпизоотическими штаммами «Приморский 2003», «Pellor» ВОК, с ВБ, а также с изолятами «ЕАО»и «Таджикский» в виде суспензии кожи больных животных.

На фиг.3 отражены результаты ПЦР с видоспецифичными праймерами. В пробах, содержащих ДНК штамма «ВНИИЗЖ 2003», синтезировался фрагмент длиной 415 п.н., в амплификации которого участвуют видоспецифичные для ВОК праймеры.

С помощью метода рестрикционного анализа можно также дифференцировать BOO и ВОК и определять штаммовую принадлежность BOO. С использованием родоспецифических праймеров проводится амплификация участка гена «ankyrin-repeat» белка длиной 564 п.н. Затем проводится обработка амплификонов рестриктазой Dra I. В пределах амплифицируемого фрагмента генома у эпизоотических изолятов BOO расположен один сайт рестрикции Dra I, у вакцинных штаммов BOO — два сайта, у ВОК таких сайтов нет. Анализ продуктов рестрикции в агарозном или полиакриламидном геле позволяет легко отличать BOO от ВОК и вакцинные штаммы BOO от эпизоотических изолятов по характерному набору фрагментов ДНК.

При проведении данного метода у вакцинного штамма «ВНИИЗЖ» BOO ампликон в результате обработки рестриктазой Dra I расщеплялся на три фрагмента, у всех эпизоотических изолятов BOO — на два фрагмента, а у вакцинного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК и двух эпизоотических изолятов ВОК расщепления ампликона не происходило (фиг.4).

Таким образом, при обработке эндонуклеазой Dra I фрагмента гена «ankyrin-repeat» белка штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК расщепления ДНК не наблюдалось, что указывает на принадлежность штамма к ВОК.

Дополнительно специфичность штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК была подтверждена и серологическими методами в РДП и РДСК. РДП и РДСК были положительными только между специфическим вирусом с гомологичной сывороткой (табл.3, табл.4).

Технологический процесс изготовления вирусвакцины против оспы коз включает два этапа: получение посевного ВОК и изготовление производственной серии вирусвакцины.

Для получения посевного вируса используют культуру клеток Ch-91 с хорошо сформировавшимся монослоем 2÷3 — суточного возраста в клинских матрасах и суспензию лиофилизированного или нативного ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» с инфекционным титром от 5,0 до 6,0 lg ТЦД₅₀/см 3 . Средняя инфицирующая доза вируса составляет 0,1 ТЦЦ₅₀/кл. Внесенную вирусную суспензию экспонируют на предварительно отмытый от остатков ростовой среды раствором Хенкса монослой в термостате в течение часа при (37±0,5)°С, затем в необходимом объеме вносят поддерживающую питательную среду ПСП. Культивирование вируса проводят в течение 12 суток при указанной температуре.

При поражении вирусом площади монослоя не менее 80% (округление и появление светопреломляющего эффекта) проводят сбор вируса. Для этого содержимое клинских матрасов замораживают при температуре минус 40°С и проводят оттаивание при комнатной температуре, энергично встряхивая.

Для получения одного миллиона доз вирусвакцины необходимо сорок литров вируссодержащей суспензии.

Вирусвакцину против оспы коз получают путем смешивания полученного антигенного материала из штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, репродуцированного в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД₅₀/см 3 , и стабилизатора в соотношении, мас.%: 80:20÷90:10 соответственно. В качестве стабилизатора используют растворы сахарозы, желатозы и гидролизата лактальбумина.

Из полученного антигенного материала готовят 2 серии вирусвакцины против оспы коз, отличающиеся процентным содержанием стабилизатора в препарате.

Серия №1 вирусвакцины против оспы коз из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК содержит, мас.%:

Серия №2 вирусвакцины против оспы коз из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК содержит, мас.%:

Полученную вирусвакцину фасуют в ампулы по 2,0 см 3 или во флаконы по 2,0 см 3 или 4,0 см 3 , замораживают при температуре минус 50°С и подвергают лиофильному высушиванию. После сублимации флаконы (ампулы) заполняют сухим стерильным воздухом или инертным газом, закрывают резиновыми пробками и закатывают металлическими колпачками, ампулы запаивают.

Вирус-вакцина против оспы коз культуральная сухая, расфасованная во флаконы или ампулы, представляет собой однородную пористую массу цилиндрической формы светло-желтого цвета, растворяющуюся в течение 1÷1,5 минут в физрастворе. В одной ампуле содержится 2,0 см 3 , а во флаконе 2,0 см 3 или 4,0 см 3 сухой вирусвакцины, содержащей соответственно в ампуле 50 и во флаконе 50 или 100 прививных доз препарата для коз.

Полученный препарат подвергают контролю на стерильность, специфичность и иммуногенную активность в соответствии с показателями, установленными стандартом организации-изготовителя.

Инфекционную активность штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК в вирусвакцине после лиофилизации определяют титрованием десятикратных разведений вирусной суспензии в культуре клеток Ch-91 во флаконах. Учет результатов проводят в течение 12 суток по наличию цитопатического действия. Результаты титрования 2-х серий вирусвакцины представлены в таблице 5.

Титр вируса в вакцине определен в значениях от 5,11±0,09 до 5,41±0,15 lg ТЦД₅₀/см 3 . При хранении в течение 1,0÷1,5 лет титр вируса снижался не более чем на 0,5 lg ТЦД₅₀/см 3 .

Однако следует отметить, что хранение вакцины в течение 2÷3 недель при комнатной температуре снижало инфекционную активность ВОК на 1,0÷1,5 lg ТЦД₅₀/см 3 . Поэтому транспортировка вирусвакцины против оспы коз должна осуществляться при низких температурах.

Для определения безвредности и реактогенности вирусвакцину против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» вводили козам по 5,0 см 3 в исходном разведении (125 прививных доз) подкожно в область бесшерстного участка внутренней поверхности передней конечности. За животными вели наблюдение в течение 21 суток.

При исследовании вакцины на безвредность и реактогенность в единичных случаях у животных на месте введения вакцины в исходном разведении установлено образование на 4÷6 сутки воспалительного отека в виде небольшого тяжа размером от 1 до 3 см, который исчезал на 3÷14 сутки после появления и никак не отражался на клиническом состоянии животных. На протяжении всего срока наблюдения (21 сутки) температура тела коз оставалась в пределах физиологической нормы. Это позволило заключить, что вирус-вакцина против оспы коз из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК является безвредным и нереактогенным препаратом.

Антигенную активность вирусвакцины против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» серии №1 и №2 определяли на 7, 14 и 21-е сутки после иммунизации коз различными разведениями препарата. От животных в указанные сроки отбирали пробы крови с целью получения сыворотки крови, которую исследовали в реакции нейтрализации (РН) в культуре клеток Ch-91 на наличие вируснейтрализующих антител (ВНА) с постоянной дозой ВОК 100 ТЦД₅₀/см 3 и последовательными двукратными разведениями сыворотки от 1:2 до 1:32. Учет результатов проводили в течение 12 суток со сменой поддерживающей среды через 3-4 суток. Титр антител определяли по методу Рида и Менча и выражали в логарифмах с основанием 2 (log₂).

Уровень антител в крови иммунизированных животных зависел от дозы введенной вакцины и сроков после вакцинации (таблицы 6 и 7). Так, титр ВНА после введения вакцины серии №1 в объеме 5 см 3 в исходном разведении, составлявшем 125 прививных доз, на 7-е сутки был 2,34±0,46 log₂, на 14-е сутки — 2,53±0,19 log₂ и на 21-е сутки — 3,00±0,50 log₂, в одной прививной дозе — 1,50±0,31, 2,02±0,30 и 2,50±0,12 log₂ соответственно. Во всех случаях наличие максимального уровня антител установлено на 21-е сутки после иммунизации животных. После иммунизации в дозе 0,00001 ПВД (разведение вакцины 1:100000) в крови животных выявлено по сравнению с другими разведениями наличие невысокого титра антител, который соответствовал на 21-е сутки 1,20±0,15 log₂.

После введения вакцины серии №2 на 7-е сутки титры антител в крови коз, привитых в дозах от 10 2 до 10 4 ТЦД₅₀ и в цельном виде, находились в пределах от 1,08±0,11 до 1,63±0,20 log₂; в дозах 10 и 1 ТЦД₅₀ от 0,20±0,18 до 0,63±0,32 log₂ соответственно. На 14-е сутки активность сывороток крови коз, привитых в указанных дозах, составляла от 0,75±0,35 до 1,96±0,19 log₂. На 21-е сутки после иммунизации коз вакциной в цельном виде титр антител в крови животных достигал 2,33±0,9, в разведении 1:25-2,54±0,22; 1:100-1,83±0,24; 1:1000-1,75±0,12; 1:10000-1,36±0,13 и 1:100000-1,13±0,18 log₂.

Иммуногенную активность вирусвакцины против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» проверяли методом контрольного заражения. На 21-е сутки после иммунизации животным, привитым различными разведениями препарата серии №1 и серии №2, а также контрольным козам вводили внутрикожно в область подхвостовой складки вирулентный штамм «Приморский 2003» ВОК в дозе 1000 ИД₅₀/см 3 . После заражения животных наблюдали 14 суток с ежедневной термометрией и осмотром.

В период иммунизации и после контрольного заражения температура тела коз, иммунизированных различными дозами вирусвакцины против оспы коз, оставалась на уровне физиологической нормы. Контрольно зараженные животные заболевали оспой в генерализованной форме и погибали на 8-10 день после заражения.

Результаты исследования иммуногенной активности вирусвакцины против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» представлены в таблицах 6 и 7.

Несмотря на различную специфическую активность сыворотки крови животных, привитых различными дозами вирусвакцины (от 10 4 до 1 ТЦД₅₀), все козы были предохранены от заболевания оспой при экспериментальном заражении вирулентным штаммом «Приморский 2003» ВОК в летальной дозе (1000 ИД₅₀/0,5 см 3 ).

Таким образом, получены данные, свидетельствующие о невосприимчивости к заболеванию животных, привитых вирусвакциной против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003».

Проведены испытания эффективности вирусвакцины против оспы коз культуральной сухой (серия №3) из штамма «ВНИИЗЖ 2003», полученной так, как описано в примере 3, и содержащей, мас.%:

в угрожаемых хозяйствах ряда районов Республики Таджикистан в связи с возникновением оспы коз.

Всего вирусвакциной против оспы коз иммунизировано 5000 коз. Коз иммунизировали в соответствии с Инструкцией по применению препарата. После применения вакцины клинических осложнений у животных не отмечали. Вакцинация коз в угрожаемых по оспе хозяйствах обеспечила образование активного иммунитета у животных и их полную защиту от заболевания оспой. Случаев прорыва иммунитета после иммунизации животных не было отмечено.

Для определения уровня поствакцинального иммунитета от 10 животных по каждой из групп животных перед иммунизацией, а также на 10, 20 и 30 дни после вакцинации были отобраны сыворотки крови, которые направлены в ФГУ «ВНИИЗЖ».

Было установлено, что вирус-вакцина против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003», примененная в угрожаемых по оспе хозяйствах Республики Таджикистан, обладала высокой иммунобиологической активностью, безвредна для животных и предохраняла привитых животных от заболевания оспой.

2. Kitching R.P. The control of sheep and goats pox // Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. — 1986. — V.5, №2. — Р.503-511.

3. Gershon P.O., Black D.N. A comparison of the genomes of capripoxvirus isolates of sheeps, goats and cattle // Virology. — 1988. — V.164. — P.341-349.

4. Joshi R.K. Physico-chemical characterization of «Durg» isolate of goat pox virus // Indian Vet. J. — 2001. — V.78, №5. — P.369-370.

5. Wang Shaohua et al. The pathomorphological studies on immunological effect of attenuated goat pox cellular virus // Acta vet. Zootechn. Sinica. — 1988. — V.19, №2. — P.111-116.

6. Kitching R.P., Cam V.M. Sheep pox and goat pox // OIE Manual of standarts for diagnostic test and vaccines; 4 th edn. — Paris: World organization for animal health, 2000. — P.168-177.

7. Tulman E.R. et al. The genomes of pox and goat pox viruses // J.of Virol. — 2000. — V.76, №12. — Р.6054-6061.

8. Пат. РФ №2061753; C12N 5/06, 7/00; 10.06.1996 г.

9. Грачев Д.В. Иммунобиологические свойства вируса оспы коз, выделенного в Республике Таджикистан // Автореф. дисс. на соискание уч. степ. канд. вет. наук. — Покров, 2006. — 26 с. (прототип).

Классы МПК:	A61K39/275 Poxviridae, например вирус оспы птиц C12N7/00 Вирусы, например бактериофаги; их композиции; приготовление или очистка их C12N5/00 Недифференцированные клетки человека, животных или растений, например, клеточные линии; ткани; культивирование или сохранение их; питательные среды для них C12N5/02 размножение одиночных клеток или клеток в суспензии; сохранение их; питательные среды для них
Автор(ы):	Гусев А.А. , Диев В.И. , Курченко Ф.П. , Иванющенков В.Н. , Соколов Л.Н. , Куляшбекова Ш.К. , Захаров В.М.
Патентообладатель(и):	Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных
Приоритеты:

Таблица 1
Влияние дозы заражения на репродукцию ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» в культуре клеток гонады козы Ch-91
Доза (ТЦД₅₀/кл)	Период культивирования (сут.)	Площадь поражения монослоя клеток (%)	Титр вируса (lg ТЦД₅₀/см 3 )
0,01	6÷7	80÷90	7,17±0,10
0,05	5÷6	80÷90	6,67±0,08
0,1	5÷6	60÷70	6,17±0,72
1	4÷5	50÷60	5,33±0,17

Таблица 2
Биологическая активность штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК в культуре клеток Ch-91 в зависимости от количества пассажей и сроков культивирования в стационарных условиях
№ пассажа	Титр вируса (lg ТЦД₅₀/см 3 ) при дозе заражения 0,01-0,05 ТЦД₅₀/кл
№ пассажа	Дни культивирования
1	2	4	5	6	8
8	2,50±0,25	3,25±0,23	4,75±0,25	5,25±0,13	6,75±0,16	6,33±0,23
9	3,00±0,11	4,00±0,22	5,50±0,25	6,00±0,28	6,66±0,15	6,25±0,61
10	2,33±0,13	2,59±0,18	3,50±0,40	5,55±0,34	6,55±0,25	6,00±0,23
13	2,00±0,31	2,33±0,13	3,75±0,41	4,25±0,28	6,00±0,31	5,50±0,25
14	1,50+0,31	2,03+0,28	3,03±0,30	4,25±0,43	5,33±0,14	5,77±0,20
19	1,00±0,12	1,51±0,35	2,50±0,24	3,51±0,45	4,50±0,26	5,00±0,25

Таблица 4
Дифференцирование BOO и ВОК в РДСК
Наименование материала	Активность в РДСК
SSBOK	SSBOO
органо-тканевая суспензия ВОК штамм «ВНИИЗЖ 2003»	1:30÷1:240	1:10
концентрированный антиген ВОК	1:60÷1:320	1:10
органо-тканевая суспензия BOO штамм «ВНИИЗЖ»	неспециф.	1:40
Концентрированный антиген BOO	неспециф.	1:40

Таблица 5
Биологическая активность вирус-вакцины против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003»
№ серии	Повторность	Разведения вакцины	Титр, ТЦД₅₀/см 3	Средний титр, ТЦД₅₀/см 3
10 -4	10 -5	10 -6	10 -7
Серия №1	1	++ ++	++ —	— —	— —	5,0	5,11±0,09
Серия №1	2	++ +-	++ +-	— —	— —	5,17	5,11±0,09
3	++ +-	++ +-	++ +-	— —	5,17
Серия №2	1	++ ++	++ —	+- —	— —	5,23	5,41±0,15
Серия №2	2	++ ++	++ +-	+- —	— —	5,50	5,41±0,15
3	++ ++	++ +-	+- —	— —	5,50

Таблица 6
Антигенная и иммуногенная активность вирус-вакцины против оспы коз культуральной сухой из штамма «ВНИИЗЖ 2003» серии №1
№ п/ п	Разведение вакцины и доза	Количество животных	Титр ВНА, log₂	Результат заражения
до вакцинации	через 7 сут	через 14 сут	через 21 сут
1	Цельная, 5 см 3	2	—	1,42±0,59	1,92±0,59	2,33±0,95	2/0
2	1:25 (10 4 ТЦД₅₀)	7	—	1,63±0,20	1,96±0,19	2,54±0,22	7/0
3	1:100 (10 3 ТЦД₅₀)	3	—	1,22±0,42	1,53±0,22	1,83±0,24	3/0
4	1:1000 (10 2 ТЦД₅₀)	2	—	1,08±0,11	1,42±0,14	1,75±0,12	2/0
5	1:10000 (10 ТЦД₅₀)	4	—	0,63±0,32	1,08±0,24	1,36±0,13	4/0
6	1:100000 (1 ТЦД₅₀)	2	—	0,20±0,18	0,75±0,35	1,13±0,18	2/0
7	Контроль	10	—	—	—	—	10/10
Примечание: «-» — сыворотка не активна. В графе «результат заражения» — в числителе — количество животных в опыте, в знаменателе — количество заболевших животных.

Таблица 7
Антигенная и иммуногенная активность вирус-вакцины против оспы коз культуральной сухой из штамма «ВНИИЗЖ 2003» серии №2
№ п/п	Разведение вакцины и доза	Количество животных	Титр ВНА, log2	Результат заражения
через 7 сут	через 14 сут	через 21 сут
1	Цельная, 5 см 3	4	2,34±0,46	2,53±0,19	3,00±0,50	0/4
2	1:25(10 4 TЦД₅₀)	7	1,50±0,31	2,02±0,30	2,50±0,12	0/7
3	1:100(10 3 TЦД₅₀)	3	1,18±0,42	1,52±0,15	1,97±0,15	0/3
4	1:1000(10 2 ТЦД₅₀)	2	1,12±0,23	1,41±0,20	1,75±0,12	0/2
5	1:10000 (10 ТЦД₅₀)	3	0,56±0,10	0,94±0,36	1,45±0,27	0/3
6	1:100000 (1 ТЦД₅₀)	2	0,26±0,12	0,79±0,15	1,20±0,15	0/2
7	Контроль	2	—	.	—	2/2
Примечание: «-» — сыворотка не активна. В графе «результат заражения» — в числителе — количество животных в опыте, в знаменателе — количество заболевших животных

1. Вирус-вакцина против оспы коз культуральная сухая, содержащая активное вещество и целевую добавку, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества она содержит антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз (ВОК) Variola vims caprmum сем. Poxviridae, подсем. Chordopoxvirinae, рода Capripoxvirus, депонированного в коллекцию ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером (ссылкой) «ВНИИЗЖ 2003» — ДЕП, в эффективном количестве.

2. Вирус-вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она содержит антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, репродуцированного в культуре клеток гомологичного происхождения.

3. Вирус-вакцина по п.2, отличающаяся тем, что она содержит антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, репродуцированного в культуре клеток гонады козы Ch-91.

4. Вирус-вакцина по п.3, отличающаяся тем, что она содержит антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, репродуцированного в культуре клеток гонады козы Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД₅₀/см 3 .

5. Вирус-вакцина по п.4, отличающаяся тем, что она содержит антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК в количестве 80-90 мас.%.

6. Вирус-вакцина по п.1, отличающаяся тем, что из целевых добавок она содержит стабилизатор.

7. Вирус-вакцина по п.6, отличающаяся тем, что из целевых добавок она содержит стабилизатор в количестве 10-20 мас.%.

8. Вирус-вакцина по любому из пп.1-7, отличающаяся тем, что она содержит антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК и стабилизатор в соотношении, мас.%:

источник