Модифицированный вирус коровьей оспы анкара

Изобретение относится к области генной инженерии и вирусологии. Предложен способ получения модифицированного вируса коровьей оспы Ankara (MVA). Способ предусматривает инфицирование клеток непрерывной линии клеток млекопитающего вирусом коровьей оспы Ankara (MVA) дикого типа, последующее культивирование и сбор вирусов. Далее проводят инфицирование свежих клеток той же самой клеточной линии новообразованными вирусами. При необходимости вышеуказанные этапы повторяют. Предложены также штаммы модифицированного вируса коровьей оспы Ankara (MVA), полученные таким способом, и их использование. Предложенные штаммы имеют значительно пониженную вирулентность в отношении млекопитающих, но также способны расти в непрерывных клеточных линиях. Изобретение может быть использовано в медицине. 13 н. и 7 з.п. ф-лы, 5 табл.

Данное изобретение относится к новым штаммам модифицированного вируса коровьей оспы Ankara (MVA), которые имеют значительно пониженную вирулентность в отношении большинства млекопитающих, особенно людей, но тем не менее растут в клетках непрерывной клеточной линии, одобренной для продуцирования лекарственного средства, такого как вакцина. Данное изобретение относится также к способу получения указанных адаптированных штаммов MVA. Эти MVA могут быть использованы, например, для парентеральной иммунизации, в качестве векторной системы или в активной или инактивированной форме в качестве адъюванта или в качестве регулятора неспецифических компонентов иммунной системы.

Организм постоянно подвергается воздействию инфекционных агентов, таких как бактерии, вирусы, грибки или паразиты. Иммунная система предохраняет организм от перманентной инфекции, вызываемой этими агентами, посредством деструкции и элиминации этих инфекционных агентов и токсичных молекул, продуцируемых ими. Иммунная система может быть подразделена на специфическую и неспецифическую часть, хотя обе части являются тесно связанными. Неспецифическая иммунная реакция делает возможной немедленную защиту против большого разнообразия чужеродных веществ и инфекционных агентов. В противоположность этому, специфическая иммунная реакция индуцируется после лаг-фазы, когда организм подвергается действию вещества в первый раз. Однако специфическая иммунная реакция является высокоэффективной. Специфическая иммунная реакция ответственна за то, что индивидуум, выздоравливающий от специфичной инфекции, защищен от этой специфичной инфекции, но все еще восприимчив к другим инфекционным болезням. Обычно повторная инфекция тем же самым или очень сходным инфекционным агентом вызывает гораздо более слабые симптомы или вообще не вызывает симптомов. Иммунитет сохраняется в течение длительного времени, в некоторых случаях даже в течение всей жизни. Эта иммунологическая память используется при вакцинации, когда организм стимулируют безвредной или инактивированной формой инфекционного агента для индуцирования специфического иммунитета. Иногда в вакцины включают адъюванты для усиления специфической иммунной реакции.

Большой объем знаний об инфекционных заболеваниях и иммунитете был получен в исследованиях натуральной оспы. Это заболевание вызывается вирусом натуральной оспы, членом рода Orthopoxvirus. Почти два столетия назад были начаты профилактические инокуляции вирусом коровьей оспы, приводящие к иммунизации против натуральной оспы. Повторную иммунизацию выполняли вирусом коровьей оспы. В ранние 1950-е годы многие промышленно развитые страны ликвидировали эндемическую натуральную оспу посредством использования вакцинации вирусом коровьей оспы. Однако вакцинация против натуральной оспы вирусом коровьей оспы приводила в некоторых случаях к серьезным осложнениям, таким как поствакцинальный энцефалит, генерализованная вакциния или контактная инфекция.

Новая вакцина, которая не обнаруживает этих осложнений, была создана Anton Mayr. Эта противооспенная вакцина состояла из поксвируса модифицированного вируса коровьей оспы Анкары (MVA), и ее использовали для парентеральной вакцинации против натуральной оспы в приблизительно 150000 вакцинаций без каких-либо осложнений, связанных с этой вакцинацией. Серьезных побочных эффектов не наблюдалось даже у детей с иммунодефицитами. MVA получали мутацией и отбором первоначального вируса коровьей оспы Ankara после 575 пассажей в культурах фибробластов куриных эмбрионов. Безопасность этого MVA подтверждается биологическими, химическими и физическими характеристиками. MVA имеет уменьшенную молекулярную массу, шесть делеций в геноме и является высокоаттенуированным в отношении клеток млекопитающих, т.е. ДНК и белок синтезируются, но фактически не образуются вирусные частицы. Модифицированный вирус коровьей оспы Ankara, разработанный Anton Mayr, был депонирован в Европейской Коллекции Клеточных Культур Животных (ЕСАСС), Salisbury, UK, под депозитным номером V 94012707.

Вакцинация против натуральной оспы была чрезвычайно успешной. В 1979 году Всемирная организация здравоохранения заявила о ликвидации натуральной оспы. Поэтому массовая вакцинация детей была прекращена, и только некоторых работников и членов вооруженных сил некоторых стран вакцинируют.

С ликвидацией натуральной оспы была удалена преобладающая причина оспенной инфекции у людей. Однако некоторые поксвирусы, отличные от человеческого, уменьшили свою специфичность, т.е. они вызывают инфекции не только в их обычном хозяине (например, коровах в случае коровьей оспы), но также и в других животных (например, крысах и кошках). Люди также могут быть инфицированы этим путем. Поскольку часть населения уже не является иммунизированной против натуральной оспы, инфекции ортопоксвирусом животных могут быть опасными для нее. Домашние животные являются главным источником инфекции для людей. Таким образом значение вакцинации домашних животных против ортопоксвирусов все возрастает. Кроме того, MVA может быть применимым в качестве вектора для генотерапии, т.е. для переноса последовательностей нуклеиновых кислот в клетку-мишень, где они экспрессируются.

Для логарифмического размножения MVA необходимы клеточные культуры первичных или вторичных фибробластов куриных эмбрионов. Эти клетки получают из куриных яиц, которые инкубируют в течение 10-12 дней. Поскольку яйца подвержены биологической изменчивости, клетки, полученные для системы клеточной культуры, также являются вариабельными на клеточном уровне. Кроме того, в «культуре фибробластов» куриных эмбрионов часто находят другие типы клеток, такие как эпителиальные клетки. Эта изменчивость клеток приводит также к изменчивости вирусов, продуцируемых в фибробластах куриных эмбрионов. Таким образом трудно стандартизовать и одобрить эту систему культуры клеток для гарантии постоянно высокого качества получаемого MVA. Кроме того, загрязнение этой системы культуры клеток микроорганизмами или вирусами, уже присутствующими в инкубированных яйцах, не может быть полностью исключено. Когда MVA растет в загрязненных вирусами клетках, этот MVA может подвергаться рекомбинации с загрязняющим вирусом. В результате этого может продуцироваться MVA с новыми и непредсказуемыми характеристиками. Для получения этого вируса в крупном масштабе в суспензионной культуре первичные или вторичные фибробласты куриных эмбрионов являются не очень подходящими. Кроме того, очистка и концентрирование MVA градиентным ультрацентрифугированием была бы предпочтительной. Однако такая очистка является затруднительной, когда MVA культивируют на первичном или вторичном фибробласте куриного эмбриона. Наконец, у большого числа пациентов на альбумин куриного яйца развиваются аллергические реакции. Хотя условия культивирования in vitro сильно уменьшают аллергенный потенциал, риск аллергической реакции не может быть исключен полностью.

Таким образом, с одной стороны, MVA может эффективно расти только в первичных или вторичных фибробластах куриных эмбрионов, что вызывает ряд недостатков, но, с другой стороны, безопасность применения MVA на людях была показана крупномасштабным применением его в качестве вакцины.

Целью данного изобретения является создание условий для получения гомогенных вирусных частиц MVA. Кроме того, указанные условия должны обеспечивать легкое и крупномасштабное получение MVA.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для достижения вышеуказанных и других целей данное изобретение обеспечивает штамм MVA, который адаптирован к росту в клетках непрерывной клеточной линии, причем указанная клеточная линия является одобренной для получения лекарственного средства.

Согласно данному изобретению впервые возможно эффективное и крупномасштабное получение MVA. Поскольку клетки непрерывной клеточной линии являются гомогенными и их характеристики являются стабильными, MVA, собранный из этих клеточных линий, является также гомогенным и имеет высокопредсказуемые характеристики. Кроме того, риск загрязнения микроорганизмами может контролироваться, и загрязнение препарата MVA белками куриного яйца — наблюдаемое при культивировании MVA на фибробластах куриных эмбрионов — может быть исключено. Работа с перманентной клеточной линией является удобной и, следовательно, чрезвычайно применимой для промышленного применения.

В предпочтительном варианте данного изобретения MVA адаптируют для роста в клетках клеточной линии млекопитающего, которая одобрена для получения вакцины. Неожиданно было обнаружено, что MVA, адаптированный к клеточной линии млекопитающего, такой как линия клеток Vero, все еще имеет пониженную вирулентность для людей, а также для широкого диапазона других млекопитающих. Таким образом, этот MVA является высокоаттенуированным, т.е. ДНК и белок синтезируются, но практически не образуются вирусные частицы, что практически обеспечивает устранение болезнетворной способности. Таким образом, MVA в соответствии с данным изобретением является также чрезвычайно применимым в качестве вакцины для людей и для широкого круга млекопитающих. Таким образом, MVA применим, в частности, в области ветеринарии.

Кроме того, обеспечен способ получения штамма MVA по данному изобретению. Согласно этому воплощению данного изобретения клетки клеточной линии, которая одобрена для получения лекарственного вещества, инфицируют MVA дикого типа. Предпочтительно, для инфицирования применяют высокую множественность заражения (MOI), т.е. высокое число вирусов на клетку. Затем вирусы собирают и свежие клетки той же самой клеточной линии инфицируют новообразованными вирусами. Указанный процесс повторяют (серийное пассирование), пока MVA не адаптируется к указанной клеточной линии. Адаптация достигается при 72 ч после инфекции, титр вируса равен по меньшей мере 1-9-кратно, предпочтительно 10-99-кратно, более предпочтительно 100-10 6 -кратно и наиболее предпочтительно более чем 10 7 -10 10 -кратно увеличенному титру в сравнении с введенным титром вируса. Адаптация достигается после ограниченного числа пассажей.

«Адаптирован для роста» означает, что количество вируса, продуцируемого из инфицирования (выход), является увеличенным в сравнении с количеством вируса, первоначально используемого для инфицирования клеток (входом). В этом случае отношение выход/вход является большим, чем 1.

«Производное» MVA, депонированное в ЕСАСС, Salisbury, UK, под депозитарным номером 99101431 и/или предварительным номером доступа 01021411, означает MVA, который адаптирован для роста в клетках Vero при скорости, которая является по существу одинаковой со скоростью роста депонированного штамма, но несет по меньшей мере одно различие в его геноме в сравнении с этим депонированным штаммом.

Термин «иммунная система» описывает по существу комплекс, участвующий в защите организма против чужеродных веществ и микроорганизмов. Она подразделяется на клеточную часть, включающую в себя несколько типов клеток, таких как, например, лимфоциты и другие клетки, произведенные из лейкоцитов, и гуморальную часть, включающую в себя пептиды и белки, такие как антитела, факторы комплемента и цитокины.

Термин «иммунная реакция» описывает реакцию иммунной системы, когда чужеродное вещество или микроорганизм проникают в данный организм. Обычно иммунная реакция подразделяется на специфическую и неспецифическую реакцию, хотя обе реакции являются тесно связанными. Неспецифическую реакцию рассматривают как немедленную защиту против большого разнообразия чужеродных веществ и инфекционных агентов. Специфическая иммунная реакция может быть охарактеризована как высокоэффективный защитный механизм организма против чужеродного вещества, который индуцируется против указанного вещества после лаг-фазы и является высоко специфическим для указанного вещества. Специфическая иммунная реакция ответственна за феномен, заключающийся в том, что индивидуум, который выздоровел от специфичной инфекции, является защищенным против этой специфичной инфекции в будущем.

«Активатор иммунной системы» обозначает любое вещество, способное вызывать или усиливать иммунную реакцию.

«Супрессор иммунной системы» обозначает любое вещество, способное ослаблять или ингибировать иммунную реакцию.

«Стабилизатор иммунной системы» обозначает любое вещество, способное поддерживать иммунную реакцию на постоянном уровне.

Авторы изобретения описали два предпочтительных штамма MVA, которые адаптированы к линии клеток Африканской зеленой мартышки, называемой клеточной линией Vero (ATCC №CCL-81). Штамм MVA, который был пассирован 100 раз в клетках Vero, был назван «Vero-MVA» и депонирован в Европейской Коллекции Клеточных Культур, Salisbury, UK, под депозитарным номером 99101431. Штамм MVA после 200 пассажей в клетках Vero был назван «Vero-MVA-200» и депонирован в ЕСАСС под предварительным номером доступа 01021411.

MVA, полученный, как описано выше, размножают дополнительно культивированием клеток этой одобренной клеточной линии при подходящих условиях, инфицированием клеток MVA и сбором вирусных частиц, продуцируемых указанными клетками. Таким образом, MVA может быть эффективно и легко размножен в крупном масштабе. Неожиданно, MVA данного изобретения не обнаруживает увеличенной вирулентности в клетках, иных, чем клетки Vero, таких как клеточные линии человека, в том числе HL, НЕР-2 или HeLa.

В другом варианте данного изобретения MVA содержит по меньшей мере одну гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, т.е. последовательность нуклеиновой кислоты, которая не содержится в нативном геноме MVA (рекомбинантный MVA). Предпочтительно, гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты является геном, более предпочтительно геном, кодирующим иммунизирующий белок, и наиболее предпочтительно кодирующим белок, иммунизирующий против малярии, бешенства и/или гепатита. Экспрессия указанной гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты находится предпочтительно под транскрипционным контролем промотора вируса коровьей оспы, более предпочтительно собственного промотора MVA. В следующем предпочтительном варианте данного изобретения гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты встраивают в природно встречающийся делеционный сайт в геноме MVA (описанный в РСТ/ЕР96/02926).

Рекомбинантный MVA используют для введения последовательности нуклеиновой кислоты в клетку-мишень, причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты является гомологичной или гетерологичной для клетки-мишени. Введение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в клетку-мишень может быть использовано для получения гетерологичных нуклеиновых кислот, пептидов и/или полипептидов и/или белков, кодируемых указанной последовательностью нуклеиновой кислоты in vitro. Этот способ предусматривает инфицирование клетки-хозяина рекомбинантным MVA, культивирование инфицированной клетки-хозяина при подходящих условиях и необязательное выделение и/или обогащение пептида и/или белка, продуцируемого указанной клеткой-хозяином.

Кроме того, введение гомологичной или гетерологичной последовательности может применяться для генотерапии in vitro и предпочтительно in vivo. Для генотерапии in vitro и ex vivo, соответственно, клетки выделяют из индивидуума, подлежащего лечению, трансформируют рекомбинантным MVA и повторно вводят индивидууму, из которого были взяты эти клетки. Для генотерапии in vivo рекомбинантный MVA вводят непосредственно в тело живого животного, в том числе в тело человека. В предпочтительном варианте данного изобретения рекомбинантный MVA экспрессирует антиген или антигенный эпитоп. Наиболее предпочтительно указанный вектор экспрессирует антигенную детерминанту из Plasmodium falciparum, Mycobacteria, вируса простого герпеса, вируса гриппа, вируса гепатита или вируса иммунодефицита человека.

Поскольку MVA в соответствии с данным изобретением является — неожиданно — все еще высокоаттенуированным, MVA является идеальным для иммунизации большого разнообразия млекопитающих, в том числе человека. Таким образом, данное изобретение обеспечивает также вакцину, содержащую MVA, для иммунизации живого животного организма, в том числе человеческого организма, против оспенных инфекций, предпочтительно инфекций Orthopoxvirus. Эта вакцина может содержать, кроме MVA, одну или несколько добавок, например антибиотик, консервант или стабилизатор. Вакцина особенно применима в области ветеринарии, например, для иммунизации животных против инфекций ортопоксвируса, например, кошек, против кошачьей оспы, мышей против эктромелии или верблюдов против оспы верблюдов. Иммунизацию проводят предпочтительно парентерально.

Иммунизирующее действие антигенной детерминанты в вакцине часто усиливают добавлением так называемого адъюванта. Адъювант костимулирует иммунную систему неспецифическим образом, вызывая более сильную специфическую иммунную реакцию против антигенной детерминанты этой вакцины. В соответствии с данным изобретением MVA используют в качестве адъюванта для костимуляции иммунной реакции против антигенной детерминанты вакцины. В этом случае предпочтительно, чтобы этот MVA был инактивированным. Инактивацию MVA можно выполнять, например, нагреванием или с использованием химикалиев. Предпочтительно, MVA инактивируют -пропиолактоном. Согласно этому варианту данного изобретения инактивированный MVA может быть добавлен к вакцинам против многочисленных инфекционных болезней для усиления иммунитета против такой болезни.

При инфекции иммунная, нервная, эндокринная и сосудистая система индивидуума работают в тесной взаимосвязи. Эти взаимодействия могут регулироваться элементами неспецифической иммунной системы, например цитокинами, такими как интерфероны и интерлейкины. Поксвирусы могут влиять на регуляцию этой иммунной системы (Swiss Vet 11/99, 13-17). Следовательно, в следующем варианте данного изобретения MVA и предпочтительно инактивированный MVA используют в млекопитающих, в том числе человеке, для регуляции клеточных и гуморальных элементов неспецифической (природной) иммунной системы. Предпочтительно, MVA используют в качестве биорегулятора, причем дисфункции иммунной системы элиминируются, и собственные защитные механизмы организма активируются, стабилизируются и/или супрессируются. Наиболее предпочтительно, MVA используют в качестве биорегулятора в случае вирусной инфекции, например, вирусом герпеса, вирусом гепатита В или С, в случае хронического воспалительного заболевания и/или для подкрепления опухолевой терапии. MVA может быть также использован для стабилизации иммунной системы в ситуации увеличенной чувствительности к инфекциям, например в случае стресса или у новорожденных. Активный и/или предпочтительно инактивированный MVA может вводиться системно, например, внутримышечно и/или локально, например, через слизистые мембраны и/или кожу.

Таким образом, данное изобретение обеспечивает штаммы MVA, которые могут обычно использоваться для тех же самых применений, что и MVA дикого типа, но исключают проблемы, вызываемые размножением MVA дикого типа в фибробластах куриных эмбрионов.

Данное изобретение inter alia включает в себя следующее, по отдельности или в комбинации.

Модифицированный вирус коровьей оспы Ankara (MVA), адаптированный для роста в клетках непрерывной клеточной линии, причем указанная клеточная линия является одобренной для получения лекарственного вещества.

MVA, указанный выше, адаптированный для роста в клетках клеточной линии млекопитающего.

MVA, указанный выше, где клеточная линия является одобренной для получения вакцины.

MVA, указанный выше, где указанная одобренная клеточная линия является линией клеток Vero.

MVA, указанный выше, где указанная одобренная клеточная линия является линией клеток Vero ATCC №CCL-81.

MVA, указанный выше, депонированный в Европейской Коллекции Клеточных Культур, Salisbury, UK, под номером депозитария 99101431, и/или его производное.

MVA, указанный выше, депонированный в ЕСАСС, Salisbury, UK, под временным номером доступа 01021411, и/или его производное.

MVA, указанный выше, содержащий по меньшей мере одну гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты.

MVA, указанный выше, содержащий гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую, например, лекарственный белок и/или антигенную детерминанту, например, пептид, иммунизирующий против инфекции малярии, гепатита и/или бешенства.

Клетка-хозяин, инфицированная вышеописанным MVA.

Композиция, предпочтительно фармацевтическая композиция, содержащая вышеописанный MVA и/или ДНК этого MVA.

Фармацевтическая композиция, описанная выше, где эта фармацевтическая композиция является вакциной.

Вакцина, описанная выше, для иммунизации живого организма животного, в том числе человека.

Вакцина, описанная выше, для иммунизации против инфекции ортопоксвируса.

Вакцина, описанная выше, для иммунизации кошек против инфекции кошачьей оспы, мышей против инфекции эктромелии и/или верблюдов против инфекции оспы верблюдов.

Фармацевтическая композиция, описанная выше, где MVA является активатором, супрессором и/или стабилизатором неспецифической иммунной системы.

Фармацевтическая композиция, описанная выше, содержащая вышеописанный MVA и/или ДНК этого MVA в качестве адъюванта.

Фармацевтическая композиция, содержащая вышеописанный рекомбинантный MVA и/или ДНК этого рекомбинантного MVA.

Фармацевтическая композиция, описанная выше, для применения в генотерапии.

Способ для введения гомологичной и/или гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в клетку-мишень, предусматривающий инфицирование клетки-мишени вышеописанным MVA.

Способ получения штамма MVA, описанного выше, предусматривающий: а) инфицирование клеток одобренной клеточной линии MVA дикого типа, предпочтительно MVA, депонированным в ЕСАСС под номером депозитария V 94012707; b) сбор этих вирусов; с) инфицирование свежих клеток той же самой клеточной линии новообразованными вирусами и, необязательно, d) повторение b) и с) пока вирус не будет адаптирован к росту в клетках указанной клеточной линии.

Способ получения вирусных частиц вышеописанного MVA, предусматривающий культивирование клеток одобренной клеточной линии при подходящих условиях, инфицирование указанной клеточной линии указанным MVA и сбор вирусных частиц, продуцируемых указанной клеточной линией.

Способ, описанный выше, где указанную клеточную линию инфицируют MVA, депонированным в ЕСАСС под номером депозитария 99101431, и/или MVA, депонированным в ЕСАСС под временным номером доступа 01021411, или производным одного из этих штаммов.

Способ получения последовательности нуклеиновой кислоты, пептида, полипептида и/или белка, предусматривающий инфицирование клетки-хозяина с вышеописанным рекомбинантным MVA, культивирование инфицированной клетки-хозяина при подходящих условиях и, необязательно, выделение и/или обогащение последовательности нуклеиновой кислоты, пептида и/или белка, продуцируемых указанной клеткой-хозяином.

Применение вышеописанного MVA для приготовления фармацевтической композиции для лечения или профилактики заболевания или нарушения, чувствительного к указанному MVA.

Применение вышеописанного MVA для приготовления вакцины для иммунизации живого организма животного, в том числе человека.

Применение вышеописанного MVA для получения активатора, супрессора и/или стабилизатора неспецифической иммунной системы.

Применение, описанное выше, для приготовления адъюванта.

Применение вышеописанного MVA в качестве вакцины.

Применение вышеописанного MVA в качестве адъюванта.

Применение вышеописанного MVA в качестве активатора, супрессора и/или стабилизатора неспецифической иммунной системы.

Способ иммунизации живого организма животного, в том числе человека, предусматривающий введение лицу, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества вышеописанной фармацевтической композиции.

Способ введения гомологичной и/или гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в клетку-мишень, предусматривающий инфицирование клетки-мишени описанным выше MVA и/или ДНК этого MVA.

Способ активации, супрессии и/или стабилизации иммунной системы живого организма животного, в том числе человека, предусматривающий введение вышеописанной фармацевтической композиции живому организму животного, в том числе человеку.

Способ усиления специфической иммунной реакции против антигенной детерминанты в вакцине, предусматривающий введение вышеописанного MVA в качестве адъюванта живому организму животного, в том числе человеку.

Модифицированный вирус коровьей оспы Ankara, адаптированный для роста в клетках непрерывной клеточной линии, который может быть получен способом, предусматривающим следующее: инфицирование клеток клеточной линии, которая является одобренной для получения терапевтического вещества, сбор вирусных частиц, продуцируемых указанными клеточными линиями, и, необязательно, повторение вышеуказанных стадий пока не будут получены желаемые характеристики роста указанного MVA в указанных клетках.

Следующие примеры будут дополнительно иллюстрировать данное изобретение. Специалисту с квалификацией в данной области будет хорошо понятно, что приведенные примеры никаким образом не могут интерпретироваться как ограничивающие применимость технологии, обеспечиваемой данным изобретением, только этими примерами.

Пример. Адаптация MVA к клеткам Vero и характеристика указанного штамма MVA

1. Адаптация MVA к клеткам Vero

Разработанный Anton Mayr MVA дикого типа, т.е. модифицированный вирус коровьей оспы Ankara, был депонирован в ЕСАСС под депозитарным номером V 94012707. Этот MVA дикого типа был адаптирован для роста в клетках Vero серийным пассированием этого вируса в клетках Vero (таблица 1). Клеточный клон ATCC№. CCL-81 стационарной клеточной линии Vero (исходный материал для посева WHO (Всемирной организации здравоохранения) ЕСАСС №88020401)) использовали в пассажах №148-165 (партия для посева WHO, Master and Working Bank). Эти клетки размножали в среде, состоящей из минимальной поддерживающей среды (Earle’s MEM (ICN)), pH 7,4-7,6 и 5% заменителя сыворотки BMS (Biochrom). Согласно способу, известному квалифицированным в данной области специалистам, всегда одни и те же клетки банка культивируемых репродуктивных клеток высевали разделением этих клеток на части 1:2-1:4. Среда содержала приблизительно 250000 клеток на мл. Клетки соответственно размножали в пробирках (2 мл), чашках Roux (100 мл) и пластиковых чашках (6 и 40 мл, соответственно). Обычно клетки образовывали конфлюентный монослой после 16-24 ч. После этого среду заменяли простой минимальной поддерживающей средой (Eagle’s MEM) без каких-либо добавок.

Для адаптации MVA дикого типа использовали систему культуры в пробирках. Результаты пассажей суммированы в таблицах 1 и 2. Клетки Vero инфицировали при множественности заражения 10 MOI MVA дикого типа, т.е. в среднем 10 вирусными частицами на одну клетку Vero. Исходный MVA дикого типа был генетически гомогенным, очищенным из бляшек MVA после 575 пассажей в фибробластах куриных эмбрионов (титр: 10 7,75 KID 50 /мл). После 24 ч 90% клеток Vero конфлюентного монослоя разрушались токсичными процессами (50% вследствие токсичности, 40% вследствие лизиса). Среду плюс клеточные остатки после замораживания и оттаивания клеток, содержащие продуцированные вирусы, собирали и 0,2 мл этой смеси засевали на монослой клеток Vero в культуральных пробирках (2-ой пассаж). Эту процедуру повторяли 200 раз. После третьего пассажа больше уже не наблюдали токсического эффекта, тогда как наблюдали слабое цитопатическое действие (СРЕ), характеризующееся округлением клеток и лизисом в период 4-6 дней после инфекции (p.inf.). Титр вируса был 10 1,0 KID 50 /мл. Был сделан вывод, что пролиферация MVA в клетках Vero началась, хотя очень неэффективно. После пятого пассажа наблюдали типичное СРЕ, которое завершалось после 4-5 дней после инфекции. Титр вируса увеличивался с 10 1,0 KID 50 /мл после третьего пассажа до 10 4,0 KID 50 /мл после пятого пассажа. Таким образом, вирус размножался более эффективно в клетках Vero. В пассажах №5-11 полное СРЕ наблюдали все более и более рано, и титр вируса увеличивался с каждым пассажем. При пассаже №11 достигалось плато при 10 7,5 KID 50 /мл. Соответственно после одиннадцати пассажей достигалась адаптация MVA к клеткам Vero. В следующих 30 дополнительных пассажах результаты для всех пассажей были одинаковыми и высоковоспроизводимыми: СРЕ начиналось уже при 24 ч после инфекции, и все клетки были поражены после трех дней после инфекции. В это время 20% клеток Vero были округлившимися и 80% клеток были лизированы. Спустя три дня после инфекции титр вируса был всегда около 10 7,75 KID 50 /мл. После пятнадцатого пассажа вирусы всегда собирали после двух-трех дней после инфекции и только 1 MOI вместо 10 MOI использовали для инфицирования этих клеток (таблица 2). В следующих дополнительных пассажах характеристики MVA изменялись лишь в слабой степени. Следует отметить, что оптимальный титр вируса дополнительно увеличивался и достигал 10 10 KID 50 /мл при пассаже 200.

Таким образом, вирус растет воспроизводимо экспоненциальным образом в клетках Vero. Указанная характеристика роста удивительным образом отличается от характеристик MVA дикого типа. Таким образом, посредством серийного разведения был получен новый штамм MVA. Указанный новый штамм был назван «Vero-MVA», а после пассажа 200 в клетках Vero — «Vero-MVA-200».

Vero-MVA и Vero-MVA-200 культивировали в более высоких количествах. Для хранения Vero-MVA концентрировали центрифугированием, ресуспендировали в 2,5% полигелине и лиофилизировали во флаконах на 2 мл. Титр после лиофилизации был все еще по меньшей мере 10 8,5 KID 50 /мл. Лиофилизированные Vero-MVA и Vero-MVA-200 проверяли на загрязнение и токсичность и хранили при +4°С.

2. Характеристика биологических свойств Vero-MVA

Биологические характеристики Vero-MVA (пассажа 100) и Vero-MVA-200 (пассажа 200) сравнивали с характеристиками MVA дикого типа (таблица 3 и таблица 5). При этом использовали способы, известные квалифицированному практику. Авторы изобретения показали, что не изменились ни круг хозяев этого вируса, за исключением клеток Vero, ни вирулентность в отношении людей или животных. Vero-MVA все еще характеризуется абортивным размножением в непермиссивных клетках-хозяевах.

Принципиальная идентичность этих вирусных частиц Vero-MVA в сравнении с вирусными частицами штамма Elstree вируса коровьей оспы была показана перекрестной реактивностью антител, индуцированных против штамма Elstree. Штамм Elstree является штаммом вируса коровьей оспы, рекомендованным Всемирной организацией здравоохранения для вакцинации против натуральной оспы. Поликлональную гипериммунную сыворотку кроликов, индуцированную против штамма Elstree, добавляли к Vero-MVA. 100 KID 50 /мл Vero-MVA были полностью нейтрализованы при разведении сыворотки 1:512. Вдвое большее разведение этой сыворотки было необходимо для нейтрализации того же самого количества штамма коровьей оспы Elstree (1:256). Таким образом, Vero-MVA все еще мог эффективно нейтрализоваться иммунной сывороткой коровьей оспы.

Vero-MVA, Vero-MVA-200 и MVA дикого типа сравнивали с использованием ряда дополнительных тестов, как показано в таблице 3, 4 и 5. Авторы изобретения показали, что вирулентность Vero-MVA и Vero-MVA-200 для млекопитающих, в том числе для человека, не увеличивалась в сравнении с MVA дикого типа. Было также показано, что Vero-MVA и Vero-MVA-200 не были контагиозными или токсичными для млекопитающих, в том числе для человека. Неожиданно, клеточная специфичность Vero-MVA была более или менее идентичной специфичности MVA дикого типа, за исключением клеток Vero: Vero-MVA размножается почти так же неэффективно в клетках клеточных линий человека (см. таблицу 4: клетки HL, НЕР-2 и HeLa), как и MVA дикого типа. Таким образом, хотя клетки человека и клетки Африканской зеленой мартышки являются филогенетически близкородственными, Vero-MVA не приобрел способности размножаться в клетках человека. В других тестах также не наблюдали значимого различия.

Кроме того, сравнивали физические, химические и биологические характеристики MVA дикого типа и Vero-MVA-200 (таблица 5). В то время как MVA дикого типа, растущий в культурах фибробластных клеток куриных эмбрионов, имеет три делеции в левом инвертированном концевом районе, Vero-MVA-200 имеет четыре делеции в левом концевом районе в сравнении с геномом поксвируса, исходно выделенного в Ankara. Таким образом, пассирование MVA дикого типа в клетках Vero привело к дополнительной делеции.

Vero-MVA использовали для иммунизации домашних животных против инфекций ортопоксвируса. Сыворотку этих животных собирали и выполняли тест нейтрализации. Авторы изобретения показали, что эти животные продуцировали антитела в высоких титрах. Титры антител были стабильными на протяжении периода по меньшей мере 111 дней. Было также показано, что эти антитела были способны нейтрализовать in vitro вирусные частицы MVA в тесте уменьшения бляшкообразования. В заключение можно сказать, что Vero-MVA может быть использован в качестве вакцины против инфекций ортопоксвируса в домашних животных и в людях.

1. Способ получения модифицированного вируса коровьей оспы Ankara (MVA), предназначенного для роста в клетках непрерывной линии клеток млекопитающего, включающий стадии:

a) инфицирование клеток непрерывной линии клеток млекопитающего вирусами коровьей оспы Ankara (MVA) дикого типа,

b) культивирование вирусов,

d) инфицирование свежих клеток той же самой клеточной линии новообразованными вирусами и

e) повторение а)-d), пока вирус не будет адаптирован к росту в клетках указанной клеточной линии, определяемому по показателю превышения титра вируса на стадии с) титра исходного вируса, используемого при инфицировании на стадии а).

2. Способ по п.1, где клеточная линия представляет собой линию клеток Vero.

3. Способ по п.2, где клеточная линия представляет собой линию клеток Vero ATCC №CCL-81.

4. Способ по п.3, где для инфицирования на стадии а) используют MVA, депонированный в ЕСАСС под депозитарным номером V 94012707.

5. Способ по п.4, в результате которого получают MVA, депонированный в ЕСАСС под депозитарным номером 99101431.

6. Способ по п.4, в результате которого получают MVA, депонированный в ЕСАСС под депозитарным номером 01021411.

7. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию d), предусматривающую введение в геном MVA по меньшей мере одной гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты.

8. Способ по п.7, где гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой ген, кодирующий терапевтический белок и/или антигенную детерминанту.

9. Штамм модифицированного вируса коровьей оспы Ankara (MVA), предназначенный для введения в макроорганизм, депонированный в ЕСАСС под депозитарным номером 99101431.

10. Штамм модифицированного вируса коровьей оспы Ankara (MVA), предназначенный для введения в макроорганизм, депонированный в ЕСАСС под депозитарным номером 01021411.

11. Способ получения клетки-хозяина, инфицированной вирусом MVA, включающий стадии:

a) получение вируса MVA способом по любому из пп.1-8,

b) инфицирование клеток-хозяев вирусом, полученным на стадии а) или вирусом по любому из пп.9-10,

с) сбор клеток-хозяев, инфицированных вирусом MVA.

12. Фармацевтическая композиция для введения в макроорганизм, содержащая в качестве действующего вещества вирус MVA, полученный способом по любому из пп.1-8, или вирус MVA по любому из пп.9-10, или ДИК указанных вирусов.

13. Способ размножения MVA, включающий стадии:

a) культивирование клеток клеточной линии, в которой MVA может воспроизводиться при подходящих условиях,

b) инфицирование указанной клеточной линии MVA, полученных способом по любому из пп.1-8, или вирусом по любому из пп.9-10, и

c) сбор вирусных частиц, продуцируемых указанной клеточной линией.

14. Способ иммунизации млекопитающего, в том числе человека, предусматривающий введение лицу, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества композиции по п.12.

15. Способ модификации вируса коровьей оспы Ankara (MVA) с целью адаптации к росту в клетках непрерывной линии клеток млекопитающего, включающий следующие стадии:

a) инфицирование клеток непрерывной линии клеток млекопитающего, которая является одобренной для получения лекарственного вещества, вирусом коровьей оспы Ankara (MVA),

b) сбор вирусных частиц, продуцируемых указанными клеточными линиями, и, необязательно,

c) повторение вышеуказанных стадий, пока не будут получены желаемые характеристики роста указанного MVA в указанных клетках.

16. Способ активации, супрессии и/или стабилизации неспецифической иммунной системы живого организма животного, в том числе человека, предусматривающий введение фармацевтической композиции по п.12.

17. Способ усиления специфической иммунной реакции против антигенной детерминанты в вакцине, предусматривающий введение MVA, полученных способом по любому из пп.1-8, или вирусом по любому из пп.9-10, в качестве адъюванта в живой организм животного, в том числе в человека.

18. Способ введения гомологичной и/или гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в клетку-мишень, предусматривающий инфицирование клетки-мишени вирусом MVA, полученным способом по п.7 или 8, или ДНК указанных вирусов.

19. Способ экспрессии терапевтического белка в макроорганизме, включающий стадии:

a) выделение клеток из макроорганизма для обработки;

b) трансформирование выделенных клеток при помощи MVA полученным способом по п.7 или 8 и

c) введение обработанных клеток макроорганизма согласно стадиям (а) и (b) обратно в макроорганизм.

20. Способ экспрессии терапевтического белка в макроорганизме, включающий стадии непосредственного введения в макроорганизм MVA полученным способом по п.7 или 8, или ДНК указанных вирусов.

источник

Рекомбинантный модифицированный вирус осповакцины ankara, содержащий ati-промотор вируса коровьей оспы, и способы применения вируса и промотора

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

1. Рекомбинантный модифицированный вирус осповакцины Ankara (MVA), содержащий в своем геноме экспрессионную кассету, содержащую ATI-промотор вируса коровьей оспы или его производное, и кодирующую последовательность, где экспрессия кодирующей последовательности находится под контролем указанного промотора.

2. Рекомбинантный MVA по п.1, в котором ATI-промотор имеет последовательность SEQ ID NO:1.

3. Рекомбинантный MVA по п.1, в котором производное ATI-промотора выбрано из:

(i) фрагментов последовательности SEQ ID NO:1 и

(ii) последовательностей с одной или несколькими нуклеотидными заменами, делециями и/или инсерциями в SEQ ID NO:1 или ее фрагменте,

где указанные фрагменты и последовательности соответственно сохраняют активность промотора в MVA.

4. Рекомбинантный MVA по любому из пп.1-3, представляющий собой штамм MVA-BN ECACC V00083008, или производный от указанного штамм, или штамм MVA 575 ECACC V00120707.

5. Рекомбинантный MVA по любому из пп.1-4, в котором экспрессионная кассета встроена в природный сайт с делецией генома MVA по сравнению с геномом штамма Copenhagen вируса осповакцины или в межгенную область генома MVA.

6. Рекомбинантный MVA по любому из пп.1-5, где последовательность кодирует по меньшей мере один антиген, антигенный эпитоп и/или терапевтическое соединение, такое как интерлейкин, интерферон, рибозим или фермент.

7. Фармацевтическая композиция, в частности вакцина, содержащая рекомбинантный MVA по любому из пп.1-6.

8. Применение рекомбинантного MVA по любому из пп.1-6 для получения вакцины или лекарственного средства против агента, из которого получен антиген или антигенный эпитоп.

9. Применение по п.8, где терапевтически эффективные количества вакцины или лекарственного средства вводят при первой иммунизации («первичная вакцинация») и при второй иммунизации («ревакцинация»).

10. Способ введения кодирующей последовательности в клетки-мишени, который предусматривает инфицирование клеток-мишеней вирусом по любому из пп.1-6.

11. Способ получения пептида и белка, где пептид/белок кодируется вирусом, и/или амплификации вируса, который предусматривает:

а) инфицирование клетки-хозяина вирусом по любому из пп.1-6,

б) культивирование инфицированной клетки-хозяина в подходящих условиях и

с) выделение и/или обогащение пептида, белка и/или вируса, продуцируемого или амплифицируемого указанной клеткой-хозяином.

12. Способ индукции иммунного ответа в организме животного, в том числе в организме человека, предусматривающий введение вируса по любому из пп.1-6 или композиции, в частности вакцины, по п.7 указанному животному, в том числе человеку.

13. Способ по п.12, предусматривающий введение по меньшей мере 10 2 TCID₅₀ вируса.

14. Способ по любому из пп.12 или 13, согласно которому вирус, композицию, в частности вакцину, вводят в терапевтически эффективных количествах при первой иммунизации («первичная вакцинация») и при второй иммунизации («ревакцинация»).

15. Эукариотическая клетка, содержащая вирус по пп.1-6.

16. Применение ATI-промотора вируса коровьей оспы или его производного для экспрессии кодирующих последовательностей в MVA, где производное ATI-промотора выбрано из:

(i) фрагментов последовательности SEQ ID NO:1 и

(ii) последовательностей с одной или несколькими нуклеотидными заменами, делециями и/или инсерциями в SEQ ID NO:1 или ее фрагменте,

где указанные фрагменты и последовательности соответственно сохраняют активность промотора в MVA.

17. Применение ATI-промотора вируса коровьей оспы или его производного для экспрессии кодирующих последовательностей в MVA, где ATI-промотор имеет последовательность SEQ ID NO:1.

18. Способ получения рекомбинантного MVA по любому из пп.1-6, предусматривающий встраивание экспрессионной кассеты в геном MVA, где экспрессионная кассета содержит промотор ATI или его производное и кодирующую последовательность и где экспрессия кодирующей последовательности находится под контролем указанного промотора.

009525 Настоящее изобретение относится к рекомбинантному модифицированному вирусу осповакциныAnkara, включающему в своем гене экспрессионную кассету, включающую ATI-промотор вируса коровьей оспы или его производное, и кодирующую последовательность, где экспрессия данной кодирующей последовательности регулируется с помощью указанного промотора. Данный вирус можно использовать в качестве вакцины или в рамках фармацевтической композиции. Характеристика известного уровня техники Рекомбинантные поксвирусы широко используют для экспрессии чужеродных антигенов в инфицированных клетках. Кроме того, рекомбинантные поксвирусы в настоящее время испытывают в качестве весьма многообещающих вакцин, которые вызывают иммунный ответ против чужеродного антигена,экспрессируемого из поксвирусного вектора. Самыми известными являются, с одной стороны, авипоксвирусы, а с другой — вирусы осповакцины. В патенте США 5736368 и в патенте США 6051410 описан рекомбинантный вирус осповакцины, штамм Wyeth, который экспрессирует антигены и белки ВИЧ. В патенте США 5747324 описан рекомбинантный вирус осповакцины, штамм NYCBH, экспрессирующий гены лентивируса. В ЕР 0243029 описан рекомбинантный вирус осповакцины, штамм WesternReserve, экспрессирующий ретровирусные гены человека. Для экспрессии гетерологичных генов в поксвирусах специалистам в данной области техники известны несколько промоторов, такие как промоторы 30K и 40K (см., например, патент США 5747324),сильный синтетический ранний/поздний промотор (см., например, Sutter и соавт., Vaccine (1994) 12,1032-40), промотор Р 7.5 (см., например, Endo и соавт., J. Gen. Virol. (1991) 72, 699-703) и промотор, полученный из гена ATI (белка включения А-типа) вируса коровьей оспы, (Li и соавт., J. Gen. Virol. (1998) 79, 613). Все эти промоторы используют в рекомбинантных вирусах осповакцины для экспрессии гетерологичных генов и, как показано, очень эффективно экспрессируют указанные гены с образованием относительно высокого количества белка, кодируемого данным гетерологичным геном. Для многих способов вакцинации весьма желательно, чтобы определенный антиген, против которого индуцируется иммунный ответ, экспрессировался в больших количествах. Однако это не всегда происходит. Описано, что разные типы цитотоксических Т-клеток (CTL) индуцируются иммунной системой в зависимости от концентрации данного антигена. CTL низкой авидности индуцируются высокими концентрациями антигена, a CTL высокой авидности индуцируются низкими концентрациями антигена. Было показано, что CTL высокой авидности являются гораздо более эффективными для очистки от заражающего вируса в животных тест-системах по сравнению с CTL низкой авидности. Кроме того, было продемонстрировано, что высокие концентрации антигена могут ингибировать или даже уничтожитьCTL высокой авидности. В итоге показано, что иногда желательно использовать скорее низкие концентрации антигена, чтобы индуцировать большее количество CTL высокой авидности и, тем самым, стимулировать эффективный иммунный ответ (Berzofsky и соавт., Immunological Reviews (1999) 170, 151172). Цель изобретения Цель настоящего изобретения заключается в создании вируса осповакцины на основе системы, позволяющей экспрессировать гетерологичные гены, включенные в геном вируса осповакцины в сравнительно низких количествах, после введения животному, в том числе и человеку, которые могут являться предпосылкой для индукции высоких количеств высокоавидных CTL. Подробное описание настоящего изобретения Данная цель достигается с помощью рекомбинантного модифицированного вируса осповакциныAnkara (MVA), включающего в своем геноме экспрессионную кассету, включающую ATI-промотор вируса коровьей оспы или его производное, и кодирующую последовательность, где экспрессия данной кодирующей последовательности регулируется с помощью указанного промотора. Неожиданно оказалось, что ATI-промотор обладает в MVA сравнительно низкой активностью, хотя в других поксвирусных системах указанный промотор является очень активным (например, Li и соавт., J. Gen. Virol. (1998) 79,613). В противоположность этому, в разделе примеров настоящего описания показано, что ATI-промотор в два-четыре раза менее активен в системах, основанных на MVA, чем в системах, основанных на иных штаммах вируса осповакцины, таких как Western Reserve, Elstree или Copenhagen. Таким образом, данный ATI-промотор в MVA является хорошим промотором для экспрессии генов, кодирующих белки,против которых индуцируются CTL высокой авидности. Модифицированный вирус осповакцины Ankara (MVA) родственен вирусу осповакцины, представителю рода Orthopoxvirus в семействе Poxvir >

источник

Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и медицины. Предложен ослабленный вирус, который происходит от модифицированного вируса коровьей оспы Ankara. Вирус характеризуется потерей способности к своей репродукции путем репликации в клеточных линиях человека. Кроме того, описаны применение вируса или его рекомбинантных вариантов в качестве лекарства или вакцины. Дополнительно предлагается способ индукции иммунного ответа даже у больных с нарушенным иммунитетом, у больных с исходно существующим иммунитетом к вирусу вакцины или у больных в процессе проведения противовирусной терапии. Изобретение может быть использовано в медицине и ветеринарии. 14 н. и 72 з.п. ф-лы, 11 ил., 1 табл.

В настоящем изобретении предлагается ослабленный вирус, который происходит от модифицированного вируса коровьей оспы Ankara и который характеризуется потерей способности к своей репродукции путем репликации в клеточных линиях человека. В нем дополнительно описываются рекомбинантные вирусы, которые происходят от данного вируса, и применение вируса или его рекомбинантных вариантов в качестве лекарства или вакцины. Дополнительно предлагается способ индукции иммунного ответа даже у больных с нарушенным иммунитетом, больных с исходно существующим иммунитетом к вирусу вакцины или больных в процессе проведения противовирусной терапии.

ИЗВЕСТНЫЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Модифицированный вирус коровьей оспы Ankara (MVA) относится к вирусу коровьей оспы, члену рода Orthopoxvirus семейства Poxiviridae. MVA был создан в результате 516 серийных пассажей вируса коровьей оспы (CVA) в эмбриональных фибробластах цыплят линии Ankara (в качестве обзора смотри Mayr, A., et al. Infection 3, 6-14 [1975]). Вследствие данных многочисленных пассажей полученный вирус MVA потерял приблизительно 31 тысячу оснований своей геномной последовательности и, следовательно, был описан как вирус с крайне ограниченными клетками-хозяевами, относящимися к клеткам птиц (Meyer, H. et al., J. Gen. Virol. 72, 1031-1038 [1991]). На различных животных моделях было показано, что полученный MVA был практически авирулентным (Mayr, A. & Danner, K. [1978], Dev. Biol. Stand. 41:225-34). Кроме того, данный штамм MVA был протестирован при клинических испытаниях в качестве вакцины для иммунизации против оспы человека (Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 [1987], Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 [19974]). В данное исследование было вовлечено более 120000 людей, включая пациентов с высоким риском заболевания, и было доказано, что по сравнению с вакцинами, основанными на вирусе коровьей оспы, MVA имеет ослабленную вирулентность или инфекционность, сохраняя в то же время хорошую иммуногенность.

В последующие десятилетия были созданы генно-инженерные конструкции MVA для применения их в качестве вирусного вектора для экспрессии рекомбинантных генов или в качестве рекомбинантной вакцины (Sutter, G. et al. [1994], Vaccine 12:1032-40).

В данном отношении наиболее удивительным является то, что даже несмотря на то, что Mayr et al. в 1970-е годы показали, что MVA является крайне ослабленным и авирулентным у человека и млекопитающих, в настоящее время в некоторых представленных работах (Blandchard et al., 1998, J Gen Virol 79, 1159-1167; Carroll & Moss, 1997, Virology 238, 198-211; Altenberger, патент США 5185146; Ambrosini et al., 1999, J Neurosci Res 55(5), 569) показано, что в клеточных линиях человека и млекопитающих MVA не является полностью ослабленным, так как в данных клетках может происходить остаточная репликация. Предполагается, что результаты, представленные в данных публикациях, получены с различными штаммами MVA, так как использованные вирусы существенно различаются по своим свойствам, особенно по характеру своего роста в различных клеточных линиях. Характер роста рассматривается в качестве индикатора ослабленности вируса. Обычно штамм вируса считается ослабленным, если он потерял свою способность или только снизил свою способность к своей репродукции путем репликации в клетках-хозяевах. Указанный выше факт, что MVA не является полностью не способным к репликации в клетках человека и млекопитающих, ставит вопрос о том, насколько абсолютна безопасность MVA как вакцины для человека или вектора для рекомбинантных вакцин.

Особенно для вакцины, а также для рекомбинантной вакцины баланс между эффективностью и безопасностью вирусного вектора вакцины является крайне важным.

Таким образом, целью изобретения является обеспечение новыми штаммами, характеризуемыми повышенной безопасностью, для разработки более безопасных продуктов, таких как вакцины или лекарства. Более того, дополнительной целью является обеспечение средствами для улучшения существующего режима вакцинации.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для достижения перечисленных выше целей в соответствии с предпочтительным осуществлением настоящего изобретения предлагаются новые вирусы коровьей оспы, которые способны к репродукции путем репликации в клетках и в клеточных линиях животных, не являющихся человеком, особенно в фибробластах эмбрионов цыплят (CEF) и в линии клеток почки детенышей хомячка BHK (ECACC 85011433), но не способны к репродукции путем репликации в клеточных линиях человека.

Известные штаммы вирусов коровьей оспы способны к репродукции путем репликации в, по меньшей мере, некоторых клеточных линиях человека, в частности в клеточной линии кератиноцитов человека HaCat (Boukamp et al. 1988, J Cell Biol 106(3): 761-71). Репликация в клеточной линии HaCat предполагает репликацию in vivo, в частности репликацию in vivo у человека. Конечно, в разделе примеров показано, что все протестированные известные штаммы вируса коровьей оспы, которые проявляют способность к остаточному воспроизведению путем репликации в HaCat, также реплицируются in vivo. Таким образом, изобретение предпочтительно относится к вирусам коровьей оспы, которые не способны к репродукции путем репликации в клеточной линии HaCat человека. Наиболее предпочтительно изобретение касается штаммов вируса коровьей оспы, которые не способны к репродукции путем репликации в любой из следующих клеточных линий человека: клеточной линии аденокарциномы шейки матки человека HeLa (ATCC № CCL-2), линии клеток почки эмбриона человека 293 (ECACC № 85120602), клеточной линии остеосаркомы кости человека 143B (ECACC № 91112502) и клеточной линии HaCat.

Характер роста или амплификации/репликации вируса обычно выражается отношением количества вирусов, продуцируемых инфицированной клеткой (выход), к количеству, первоначально используемому для исходного инфицирования клеток (вход) («амплификационное отношение»). Отношением между выходом и входом, равным «1», определяется такой амплификационный статус, при котором количество вируса, продуцируемого инфицированными клетками, является тем же самым, что и количество, исходно используемое для инфицирования клеток. Данный статус указывает на тот факт, что инфицированные клетки являются пермиссивными для вирусной инфекции и репродукции вируса. Амплификационное отношение, составляющее менее 1, т.е. снижение амплификации ниже уровня входа является индикатором недостаточности репликации и, таким образом, индикатором ослабленности вируса. Следовательно, для изобретателей особый интерес представляет идентификация и, в конечном итоге, выделение штамма, который характеризуется амплификационным отношением менее 1 в нескольких клеточных линиях человека, в частности во всех клеточных линиях человека 143B, HeLa, 293 и HaCat.

Таким образом, термин «не способный к репродукции путем репликации» обозначает, что вирус в соответствии с изобретением характеризуется амплификационным отношением менее 1 в клеточных линиях человека, таких как клеточные линии 293 (ECACC № 85120602), 143B (ECACC № 91112502), HeLa (ATCC № CCL-2) и HaCat (Boukamp et al. 1988, J Cell Biol 106(3): 761-71), в условиях, описанных в примере 1 настоящего описания, для некоторых конкретных штаммов MVA. Предпочтительно, чтобы амплификационное отношение для вируса в соответствии с изобретением составляла 0,8 или менее в каждой из перечисленных выше линиях HeLa, HaCat и 143B.

В примере 1 и в таблице 1 показано, что вирусы в соответствии с настоящим изобретением не способны к репродукции путем репликации ни в одной из клеточных линий 143B, HeLa и HaCat. Особый штамм в соответствии с настоящим изобретением, который был использован в примерах, был положен на хранение в Европейскую коллекцию клеточных культур под номером V00083008. Данный штамм обозначается во всем описании как «MVA-BN».

Известные штаммы MVA проявляют способность к остаточной репликации в, по меньшей мере, одной из протестированных клеточных линий человека (фиг.1, пример 1). Все известные штаммы вирусов коровьей оспы проявляют способность к, по меньшей мере, некоторой репликации в клеточной линии HaCat, в то время как штаммы MVA в соответствии с настоящим изобретением, в частности MVA-BN, не проявляют способности к воспроизведению путем репликации в клетках HaCat. В более подробном изложении MVA-BN характеризуются амплификационным отношением от 0,05 до 0,2 в линии клеток почки эмбриона человека 293 (ECACC № 85120602). В клеточной линии остеосаркомы кости человека 143B (ECACC № 91112502) отношение находится в диапазоне от 0,0 до 0,6. Для клеточной линии аденокарциномы шейки матки человека HeLa (ATCC № CCL-2) и клеточной линии кератиноцитов человека HaCat (Boukamp et al. 1988, J Cell Biol 106(3): 761-71) амплификационное отношение находится в диапазоне от 0,04 до 0,8 и от 0,02 до 0,8, соответственно. MVA-BN характеризуется амплификационным отношением от 0,01 до 0,06 в клетках почки африканской зеленой мартышки (CV1: ATCC № CCL-70). Таким образом, MVA-BN, который является образцом штамма в соответствии с настоящем изобретением, не способен к воспроизведению путем репликации ни в одной из протестированных клеточных линий.

Амплификационное отношение MVA-BN равняется величине, несомненно, выше 1 в фибробластах эмбрионов цыплят (CEF: первичные культуры) или в линии клеток почки детенышей хомячка BHK (ATCC № CRL-1632). Как отмечалось выше, отношение, составляющее более «1», указывает на репродукцию путем репликации, так как количество вирусов, продуцируемых инфицированными клетками, увеличивается по сравнению с количеством вирусов, которое использовалось для инфицирования клеток. Следовательно, вирус может легко размножаться и амплифицироваться в первичных культурах CEF с отношением выше 500 или в клетках BHK с отношением выше 50.

В конкретном осуществлении настоящего изобретения изобретение касается производных вируса, депонированного под № ECACC V0083008. «Производные» вирусов, депонированных под № ECACC V00083008, обозначают вирусы, проявляющие по существу те же самые репликационные характеристики, что и депонированный штамм, но имеющие отличия в одной или более частей своего генома. Вирусы, имеющие те же самые «репликационные характеристики», что и депонированный вирус, представляют собой вирусы, которые реплицируются со сходными амплификационными отношениями, что и депонированный штамм, в клетках CEF и клеточных линиях BHK, HeLa, HaCat и 143B, и которые проявляют сходную репликацию in vivo при определении на модели трансгенной мыши AGR129 (смотри ниже).

В предпочтительном осуществлении штаммы вируса коровьей оспы в соответствии с настоящим изобретением, в частности MVA-BN и его производные, характеризуются отсутствием способности реплицироваться in vivo. В контексте настоящего изобретения «отсутствие способности реплицироваться in vivo» относится к вирусам, которые не реплицируются в клетках человека и мышиной модели, описанной ниже. «Отсутствие способности реплицироваться in vivo» может быть определено предпочтительно на мышах, которые не способны продуцировать зрелые B- и T-клетки. Примером таких мышей являются трансгенные мыши модели AGR129 (полученные от Mark Sutter, Institute of Virology, University of Zurich, Швейцария). Данная линия мышей характеризуется направленными генетическими повреждениями в генах рецептора IFN типа I (IFN-α/β) и типа II (IFN-γ) и в RAG. Из-за данных повреждений мыши не имеют системы IFN и не способны продуцировать зрелые B- и T-клетки и в результате этого характеризуются существенно нарушенным иммунитетом и высокой восприимчивостью к репликации вирусов. Вместо мышей AGR129 может быть использована любая другая линия мышей, которая не способна продуцировать зрелые B- и T-клетки и в результате этого характеризуется существенно нарушенным иммунитетом и высокой восприимчивостью к репликации вирусов. В частности, вирусы в соответствии с настоящим изобретением не убивают мышей AGR129 в течение периода времени, по меньшей мере, 45 дней, более предпочтительно в течение, по меньшей мере, 60 дней, наиболее предпочтительно в течение 90 дней после инфицирования мышей путем внутрибрюшинного введения 10 7 БОЕ вируса. Предпочтительно, чтобы вирусы, которые проявляют «отсутствие способности реплицироваться in vivo», дополнительно характеризовались тем, что ни одного вируса не могло выявляться в органах или тканях мышей AGR129 через 45 дней, предпочтительно через 60 дней и наиболее предпочтительно через 90 дней после инфицирования мышей путем внутрибрюшинного введения 10 7 БОЕ вируса. Подробная информация об испытаниях по инфицированию мышей AGR129 и тестах, которые применяются для определения того, может ли вирус выявляться в органах или тканях инфицированных мышей, может быть найдена в разделе примеров.

В предпочтительном осуществлении штаммы вируса коровьей оспы в соответствии с настоящим изобретением, в частности MVA-BN и его производные, характеризуются более высокой иммуногенностью по сравнению с известным штаммом MVA-575 при определении на модели мышей с летальным инфицированием. Подробности данного эксперимента описаны в примере 2, представленном ниже. Вкратце, в такой модели невакцинированные мыши умирают после инфицирования репликативными компонентами штаммов вирусов коровьей оспы, такими как штамм L929 TK+ Western Reserve или IHD-J. В контексте описания модели с летальным заражением, «заражением» обозначается инфицирование репликативными компонентами вирусов коровьей оспы. Через четыре дня после заражения мышей обычно забивают и определяют титр вирусов в яичниках с помощью стандартных тестов образования бляшек с применением клеток VERO (для более подробного описания смотри раздел примеров). Титр вирусов определяют у невакцинированных мышей и у мышей, вакцинированных вирусной вакциной в соответствии с настоящим изобретением. Более конкретно, вирусы в соответствии с настоящим изобретением характеризуются тем, что в данном тесте после вакцинации 10 2 TCID₅₀/мл вирусами в соответствии с настоящим изобретением титры вирусов в яичнике снижены, по меньшей мере, на 70%, предпочтительно, по меньшей мере, на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 90% по сравнению с невакцинированными мышами.

В предпочтительном осуществлении вирусы коровьей оспы в соответствии с настоящим изобретением, в частности MVA-BN и его производные, пригодны для иммунизации путем первичного/повторного введения вакцины. Существуют многочисленные сообщения, предполагающие, что режимы первичной/повторной иммунизации с применением MVA в качестве вектора для доставки индуцируют слабые иммунные ответы и уступают режиму первичной иммунизации с помощью ДНК и повторной иммунизации MVA (Schneider et al., 1998, Nat. Med. 4; 397-402). Во всех данных исследованиях применялись штаммы MVA, которые отличаются от вирусов коровьей оспы в соответствии с настоящим изобретением. Для объяснения слабого иммунного ответа при применении MVA для первичного и повторного введения была выдвинута гипотеза о том, что антитела, выработанные против MVA при первичном введении, нейтрализуют MVA, вводимые при повторной иммунизации, предотвращая эффективное повышение иммунного ответа. В противоположность этому режимы с первичной иммунизацией ДНК и повторной иммунизацией MVA, как сообщается, являются прекрасными в плане генерации антител с высокой авидностью, потому что при данном режиме способность ДНК эффективно примировать иммунный ответ сочетается со свойствами MVA усиливать данный ответ при повторной иммунизации в отсутствие ранее существующего иммунитета по отношению к MVA. Ясно, что, если ранее существующий иммунитет к MVA и/или вирусу коровьей оспы предотвращает усиление иммунного ответа после повторной иммунизации, то применение MVA в качестве вакцины или лекарства должно иметь ограниченную силу, особенно у больных, которые были вакцинированы против оспы. Однако в соответствии с дополнительным осуществлением вирус коровьей оспы в соответствии с настоящим изобретением, в частности MVA-BN и его производные, также как соответствующие рекомбинантные вирусы, включающие гетерологичные последовательности, могут быть использованы для эффективных первичного примированного и последующего усиливающего иммунных ответов у интактных животных, а также у животных с предсуществующим иммунитетом по отношению к вирусам оспы. Таким образом, вирус коровьей оспы в соответствии с настоящим изобретением индуцирует, по меньшей мере, по существу тот же уровень иммунитета при режимах первичной иммунизации вирусом коровьей оспы/повторной иммунизации вирусом коровьей оспы по сравнению с режимами первичной иммунизации ДНК/повторной иммунизации вирусом коровьей оспы.

Вирус коровьей оспы рассматривается как индуцирующий, по меньшей мере, по существу тот же уровень иммунитета при режимах первичной иммунизации вирусом коровьей оспы/повторной иммунизации вирусом коровьей оспы по сравнению с режимами первичной иммунизации ДНК/повторной иммунизации вирусом коровьей оспы, если CTL (ЦТЛ) ответ при измерении в одном из следующих двух тестов («тест 1» и «тест 2»), предпочтительно в обоих тестах, является, по меньшей мере, по существу тем же самым при режимах первичной иммунизации вирусом коровьей оспы/повторной иммунизации вирусом коровьей оспы по сравнению с режимами первичной иммунизации ДНК/повторной иммунизации вирусом коровьей оспы. Более предпочтительно, чтобы CTL ответ после первичной иммунизации вирусом коровьей оспы/повторной иммунизации вирусом коровьей оспы был выше, по меньшей мере, в одном из тестов по сравнению с режимами первичной иммунизации ДНК/повторной иммунизации вирусом коровьей оспы. Наиболее предпочтительно, чтобы CTL ответ был выше в обоих из последующих тестов.

Тест 1: для первичного введения вируса коровьей оспы/повторного введения вируса коровьей оспы проводят первичную иммунизацию 6-8 недельных мышей BALB/c (H-2d) путем внутривенного введения 10 7 TCID₅₀ вируса коровьей оспы в соответствии с настоящим изобретением, экспрессирующего мышиный политоп, как описано в Thomson et al., 1988, J. Immunol. 160, 1717, и повторно иммунизируют тем же количеством того же вируса, вводимого тем же путем через три недели. Для данной цели необходимо создать конструкцию рекомбинантного вируса коровьей оспы, экспрессирующий указанный политоп. Способы создания конструкций таких рекомбинантных вирусов известны специалисту в данной области техники и описываются более подробно ниже. В случае режимов первичной иммунизации ДНК/повторной иммунизации вирусом коровьей оспы первичную вакцинацию проводят путем внутримышечного введения мышам 50 мкг ДНК, экспрессирующей тот же самый антиген, что и вирус коровьей оспы; при повторном введении вводят вирус коровьей оспы точно тем же путем, что и в случае первичной иммунизации вирусом коровьей оспы/повторной иммунизации вирусом коровьей оспы. Плазмидная ДНК, экспрессирующая политоп, описана также в указанной выше публикации Thomson et al. В случае обоих режимов развитие CTL ответа против эпитопов SYIPSAEKI, RPQASGVYM и/или YPHFMPTNL определяют через две недели после повторного введения. Определение CTL ответа предпочтительно осуществляют путем использования анализа ELISPOT, как описано Schneider et al., 1998, Nat. Med. 4, 397-402, и представлено в разделе примеров ниже для одного конкретного вируса в соответствии с настоящим изобретением. Вирус в соответствии с настоящим изобретением характеризуется в данном эксперименте тем, что иммунный CTL ответ против указанных выше эпитопов, который индуцируется первичным введением вируса коровьей оспы/повторным введением вируса коровьей оспы, является по существу тем же самым, предпочтительно, по меньшей мере, тем же самым, что и индуцируемый первичным введением ДНК/повторным введением вируса коровьей оспы при оценке по числу клеток, продуцирующих IFN-γ/10 6 клеток селезенки (смотри также экспериментальный раздел).

Тест 2: данный тест в основном соответствует тесту 1. Однако вместо использования в/в введения 10 7 TCID₅₀ вируса коровьей оспы, как в случае теста 1, в данном тесте 10 8 TCID₅₀ вируса коровьей оспы в соответствии с настоящим изобретением вводят подкожно для первичной иммунизации и для повторной иммунизации. Вирус в соответствии с настоящим изобретением характеризуется в данном эксперименте тем, что иммунный CTL ответ против эпитопов, указанных выше, который индуцируется первичным введением вируса коровьей оспы/повторным введением вируса коровьей оспы, является по существу тем же самым, предпочтительно, по меньшей мере, тем же самым, что и индуцируемый первичным введением ДНК/повторным введением вируса коровьей оспы при оценке по числу клеток, продуцирующих IFN-γ/10 6 клеток селезенки (смотри также экспериментальный раздел).

Сила CTL ответа, измеренная в одном из тестов, представленных выше, соответствует уровню защиты.

Таким образом, вирусы в соответствии с настоящим изобретением особенно подходят для целей вакцинации.

В целом вирус в соответствии с настоящим изобретением характеризуется наличием, по меньшей мере, одного из следующих свойств:

(i) способностью к репродукции путем репликации в фибробластах эмбрионов цыплят (CEF) и в клеточной линии BHK, но отсутствием способности к репродукции путем репликации в клеточной линии HaCat человека,(ii) отсутствием способности к репликации in vivo,

(iii) индукцией более высокого иммунитета по сравнению с известным штаммом MVA-575 (ECACC V00120707) в модели летального заражения и/или

(iv) индукцией, по меньшей мере, по существу того же самого уровня иммунитета при режимах первичной иммунизации вирусом коровьей оспы/повторной иммунизации вирусом коровьей оспы по сравнению с режимами первичной иммунизации ДНК/повторной иммунизации вирусом коровьей оспы.

Предпочтительно вирус коровьей оспы в соответствии с настоящим изобретением имеет, по меньшей мере, два из указанных выше свойств, более предпочтительно, по меньшей мере, три из указанных выше свойств. Наиболее предпочтительными являются вирусы коровьей оспы, имеющие все указанные выше свойства.

В дополнительном осуществлении изобретение касается набора для вакцинации, включающего вирус в соответствии с настоящим изобретением для первичной вакцинации («примирования») в одном флаконе/контейнере и для повторной вакцинации («бустинга») во втором флаконе/контейнере. Вирус может представлять собой нерекомбинантный вирус коровьей оспы, т.е. вирус коровьей оспы, который не содержит гетерологичных нуклеотидных последовательностей. Примером такого вируса коровьей оспы является MVA-BN и его производные. В альтернативном варианте вирус может представлять собой рекомбинантный вирус коровьей оспы, который содержит дополнительные нуклеотидные последовательности, которые являются гетерологичными по отношению к вирусу коровьей оспы. Как указано в других разделах описания, гетерологичные последовательности могут кодировать эпитопы, которые индуцируют ответ иммунной системы. Таким образом, можно применять рекомбинантный вирус коровьей оспы для вакцинации против белков или агентов, включающих указанный эпитоп. Вирусы могут быть включены в составы, как более подробно показано ниже. Количество вируса, которое может быть использовано для каждой вакцинации, указано выше.

Специалисту в данной области техники известно как можно получить вирусы коровьей оспы, имеющие, по меньшей мере, одно из следующих свойств:

— способность к репродукции путем репликации в фибробластах эмбрионов цыплят (CEF) и в линии клеток почек детенышей хомячка BHK, но отсутствие способности к репродукции путем репликации в клеточной линии кератиноцитов человека HaCat,

— отсутствие способности к репликации in vivo,

— индукция более высокого иммунитета по сравнению с известным штаммом MVA-575 в модели летального заражения и/или

— индукция, по меньшей мере, по существу того же самого уровня иммунитета при режимах первичной иммунизации вирусом коровьей оспы/повторной иммунизации вирусом коровьей оспы по сравнению с режимами первичной иммунизации ДНК/повторной иммунизации вирусом коровьей оспы.

Способ получения такого вируса может включать следующие стадии:

(i) введение известного штамма вируса коровьей оспы, предпочтительно MVA-574 или MVA-575 (ECACC V00120707) в клетки, отличные от клеток человека, в которых вирус способен к репродукции путем репликации, где клетки, отличные от клеток человека, предпочтительно выбраны из клеток CEF и клеточной линии BHK,

(ii) выделение/повышение концентрации вирусных частиц из данных клеток и

(iii) анализ того, будет ли полученный вирус иметь, по меньшей мере, одно из желаемых биологических свойств, как указано выше,

где указанные выше стадии могут необязательно повторяться до тех пор, пока не будет получен вирус с желаемыми репликативными характеристиками. Изобретение дополнительно относится к вирусам, полученным данным способом в соответствии с настоящим изобретением. Способы того, как могут быть определены желаемые биологические свойства, объяснены в других частях настоящего описания.

Применяя данный способ, изобретатели идентифицировали и выделили в результате нескольких циклов очистки клона штамм в соответствии с настоящим изобретением, начиная с пассажа 575 изолята MVA (MVA-575). Данный новый штамм соответствует штамму с депонентным номером ECACC V00883008, указанным выше.

Характер роста вирусов коровьей оспы в соответствии с настоящим изобретением, в частности характер роста MVA-BN, указывает на то, что штаммы в соответствии с настоящим изобретением существенно опережают любой другой охарактеризованный к настоящему времени изолят MVA в отношении ослабленности действия в клеточных линиях человека и отсутствия способности к репликации in vivo. Штаммы в соответствии с настоящим изобретением являются, следовательно, идеальными кандидатами для разработки более безопасных продуктов, таких как вакцины или лекарства, как будет описано ниже.

В одном осуществлении вирус в соответствии с настоящим изобретением, в частности MVA-BN и его производные, применяют в качестве вакцины против вирусных заболеваний человека, сопровождающихся сыпью, таких как оспа. В дополнительном осуществлении вирус в соответствии с настоящим изобретением может быть рекомбинантным, т.е. может экспрессировать гетерологичные гены, такие как, например, антигены или эпитопы, гетерологичные по отношению к вирусу, и может, таким образом, быть пригодным в качестве вакцины для индукции иммунного ответа против гетерологичных антигенов или эпитопов.

Термин «иммунный ответ» обозначает реакцию иммунной системы при поступлении в организм чужеродного вещества или микроорганизма. По определению иммунный ответ подразделяют на специфическую и неспецифическую реакции, хотя обе они тесно переплетаются. Неспецифический иммунный ответ представляет собой немедленную защиту от широкого разнообразия чужеродных веществ и инфекционных агентов. Специфический иммунный ответ представляет собой защиту, возникающую после лаг-периода после первого заражения организма веществом. Специфический иммунный ответ является высокоэффективным и определяет тот факт, что индивидуум, который переболел конкретной инфекцией, становится защищенным против данной конкретной инфекции. Таким образом, повторное инфицирование тем же самым или очень близким инфекционным агентом вызывает намного более сглаженные симптомы или совсем не вызывает симптомов, так как уже имеется «предсуществующий иммунитет» в отношении данного агента. Такой иммунитет и иммунологическая память, соответственно, сохраняется в течение длительного времени, в некоторых случаях даже в течение всей жизни. Соответственно, индукция иммунологической памяти может быть использована при вакцинации.

«Иммунная система» обозначает комплекс органов, вовлеченных в защиту организма от чужеродных веществ и микроорганизмов. Иммунная система включает клеточную составляющую, включающую несколько типов клеток, таких как, например, лимфоциты и другие клетки, происходящие от белых клеток крови, и гуморальную составляющую, включающую небольшие пептиды и факторы комплемента.

«Вакцинация» обозначает то, что организм нагружают инфекционным агентом, например, ослабленной или инактивированной формой указанного инфекционного агента, для индукции специфического иммунитета. Термин вакцинация также охватывает заражение организма рекомбинантными вирусами коровьей оспы в соответствии с настоящим изобретением, в частности, рекомбинантным MVA-BN и его производными, экспрессирующими антигены или эпитопы, которые являются гетерологичными по отношению к вирусу. Примеры таких эпитопов даются в других частях описания и охватывают, например, эпитопы белков, происходящих от других вирусов, таких как вирус Денге, вирус гепатита С, ВИЧ или эпитопы, происходящие от белков, которые ассоциированы с развитием опухолей и рака. После введения рекомбинантного вируса коровьей оспы в организм эпитопы экспрессируются и презентируются иммунной системе и может индуцироваться специфический иммунный ответ против данных эпитопов. Организм, таким образом, является иммунизированным против агента/белка, содержащего эпитоп, который кодируется рекомбинантным вирусом коровьей оспы.

«Иммунитет» обозначает частичную или полную защиту организма от заболеваний, вызываемых инфекционным агентом, обусловленную успешной ликвидацией предшествующего инфицирования указанным инфекционным агентом или его характерной частью. Иммунитет основан на существовании, индукции и активации специализированных клеток иммунной системы.

Как подчеркивалось выше, в одном осуществлении изобретения рекомбинантные вирусы в соответствии с настоящим изобретением, в частности, рекомбинантный MVA-BN и его производные, содержат, по меньшей мере, одну гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты. Термин «гетерологичная» применяют здесь далее для любого сочетания последовательностей нуклеиновой кислоты, которое в обычных условиях не находят в близкой связи с вирусом в природе, такой вирус называют также «рекомбинантный вирус».

В соответствии с дополнительным осуществлением настоящего изобретения гетерологичные последовательности представляют собой предпочтительно антигенные эпитопы, которые выбраны из любого источника, не являющегося вирусом коровьей оспы. Наиболее предпочтительно, чтобы указанный рекомбинантный вирус экспрессировал один или более антигенных эпитопов от Plasmodium falciparum, Mycobacteria, Influenza virus, от вирусов, выбранных из семейства Flaviviruses, Paramyxoviruses, вирусов гепатита, вирусов иммунодефицита человека, или от вирусов, вызывающих геморрагическую лихорадку, таких как Hantaviruses или Filoviruses, т.е. вируса Эбола или Марбург.

В соответствии с еще одним осуществлением, но также в дополнение к указанному выше выбору антигенных эпитопов, гетерологичные последовательности могут быть выбраны из других источников оспы и коровьей оспы. Данные вирусные последовательности могут быть применены для модификации спектра хозяев или иммуногенности вируса.

В дополнительном осуществлении вирус в соответствии с настоящим изобретением может кодировать гетерологичный ген/нуклеиновую кислоту, экспрессирующие терапевтическое соединение. «Терапевтическое соединение», кодируемое гетерологичной нуклеиновой кислотой в вирусе, может представлять собой, например, терапевтическую нуклеиновую кислоту, такую как антисмысловая нуклеиновая кислота, или пептид, или белок с желаемой биологической активностью.

В соответствии с дополнительным предпочтительным осуществлением экспрессия гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты находится предпочтительно, но не исключительно, под транскрипционным контролем промотора вируса оспы, более предпочтительно промотора вируса коровьей оспы.

В соответствии с еще одним осуществлением вставка гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты осуществляется в область вирусного генома, не являющуюся необходимой. В другом предпочтительном осуществлении изобретения гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты вставляют в природно существующий сайт делеции генома MVA (раскрытый в патенте PCT/EP96/02926). Методы вставки гетерологичных последовательностей в геном вируса оспы известны специалистам в данной области техники.

В соответствии с другим дополнительным предпочтительным осуществлением изобретение включает также геном вируса, его рекомбинантные варианты или его функциональные части. Такие вирусные последовательности могут быть использованы для идентификации или выделения вируса или его рекомбинантных вариантов, например, с применением ПЦР, методов гибридизации или с помощью традиционных тестов ELISA. Более того, такие вирусные последовательности могут экспрессироваться экспрессионным вектором с получением кодируемого белка или пептида, которые затем могут дополнять делеционные мутанты вируса, у которых отсутствует вирусная последовательность, содержащаяся в экспрессионном векторе.

«Функциональная часть» вирусного генома обозначает часть полной геномной последовательности, которая кодирует физический объект, такой как белок, домен белка, эпитоп белка. Функциональная часть вирусного генома также описывает части полной геномной последовательности, которые кодируют регуляторные элементы или части таких элементов с индивидуализированной активностью, такие как промотор, энхансер, цис- или транс-действующие элементы.

Рекомбинантный вирус в соответствии с настоящим изобретением может быть применен для введения гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в клетку-мишень, причем указанная последовательность является либо гомологичной, либо гетерологичной по отношению к клетке-мишени. Введение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в клетку-мишень может быть применено для получения in vitro гетерологичных пептидов или полипептидов и/или полных вирусов, кодируемых указанной последовательностью. Данный способ включает инфицирование клетки-хозяина рекомбинантным MVA, культивирование инфицированной клетки-хозяина в подходящих условиях и выделение и/или повышение концентрации пептида, белка и/или вируса, продуцируемых указанной клеткой-хозяином.

Более того, способ введения гомологичной или гетерологичной последовательности в клетки может быть применен для терапии in vitro и предпочтительно in vivo. Для терапии in vitro выделенные клетки, которые предварительно (ex vivo) инфицировали вирусом, вводят в организм живого животного для индукции иммунного ответа. Для терапии in vivo вирус или его рекомбинантные варианты прямо вводят в организм живого животного для индукции иммунного ответа. В данном случае клетки вокруг места инокуляции становятся инфицированными вирусом или его рекомбинантными вариантами непосредственно in vivo.

Так как вирус в соответствии с настоящим изобретением характеризуется крайне ограниченным ростом в клетках человека и обезьян и, таким образом, крайне ослабленным, он является идеальным средством для лечения широкого круга млекопитающих, включая человека. Следовательно, в настоящем изобретении предлагается также фармацевтическая композиция и вакцина, например, для индукции иммунного ответа в организме живого животного, включая человека. Вирус изобретения является также безопасным при любых других протоколах терапии.

Фармацевтическая композиция может обычно включать один или более фармацевтически приемлемых и/или допустимых носителей, добавок, антибиотиков, консервантов, адъювантов, разбавителей и/или стабилизаторов. Такими вспомогательными веществами могут быть вода, физиологический раствор, глицерин, этанол, увлажняющие или эмульгирующие агенты, вещества, буферирующие pH, или тому подобное. Подходящими носителями являются обычно большие, медленно метаболизирующиеся молекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот, агрегаты липидов или тому подобное.

Для получения вакцин вирус или его рекомбинантные варианты в соответствии с изобретением переводят в физиологически приемлемую форму. Это может быть сделано, основываясь на опыте работы с получением вакцин вируса оспы для вакцинации против натуральной оспы (как описано Stickl, H. et al. [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392). Например, очищенный вирус с титром 5х10 8 TCID₅₀/мл в приблизительно 10 мМ Трис, 140 мМ NaCl, pH 7,4 хранят при -80°С. Для приготовления вакцины для уколов, например, 10 2 -10 8 вирусных частиц лиофилизуют в 100 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) в присутствии 2% пептона и 1% альбумина человека в ампуле, предпочтительно в стекля

источник