Конго крымская геморрагическая лихорадка лабораторная диагностика

Конго-крымская геморрагическая лихорадка (ККГЛ) — широко распространенная болезнь, которую вызывает передаваемый клещами вирус. Вирус ККГЛ вызывает вспышки тяжелой геморрагической лихорадки, при которой летальность достигает 40%.

Геморрагическая лихорадка Крым-Конго распространена в Африке, на Балканах, на Ближнем Востоке и в азиатских странах к югу от 50-й параллели северной широты, совпадая по ареалу с географической границей распространенности клещей рода Hyalomma, являющихся основными переносчиками.

Сезонность инфекции на юге России — с мая по август. Вспышки заболевания ежегодно бывают в Краснодарском и Ставропольском крае, Волгоградской, Астраханской и Ростовской областях, в республиках Калмыкия, Дагестан и Карачаево-Черкесии.

Переносчиками вируса ККГЛ являются дикие и домашние животные (крупный рогатый скот, овцы и козы). Животные инфицируются при укусе инфицированных клещей, и вирус остается в их кровотоке примерно в течение недели после заражения, что при последующих укусах клещей обеспечивает продолжение цикла «клещ-животное-клещ». Людям вирус ККГЛ передается при укусах клещей, при контакте с инфицированными кровью или тканями животных во время и непосредственно после забоя. Значительное число случаев заражения приходится на людей, занятых в промышленном животноводстве. Передача от человека человеку может происходить в результате тесного контакта с тканями и биологическими жидкостями инфицированных людей, возможны случаи внутрибольничной инфекции.

Возможности клинической диагностики ККГЛ ограничены, поскольку множество инфекций, включая трансмиссивные, протекают с развитием геморрагического и/или ДВС-синдрома. В современной практике чаще всего применяются три метода диагностики ККГЛ: вирусологический, серологический и молекулярно-биологический.

Вирусологический метод является «золотым стандартом» диагностики, но может применяться только в лабораториях, имеющих разрешение и возможность работы с микроорганизмами II группы патогенности; также этот метод характеризуется меньшей диагностической чувствительностью, нежели ПЦР.

Наиболее широко в практической диагностике используется выявление IgG- и/или IgM-антител в сыворотке крови методом ИФА. Принципиальным ограничением ИФА-диагностики ККГЛ является то, что IgM-антитела появляются на 5-7 день заболевания, а IgG-антитела — не ранее 2-ой недели болезни. Таким образом, серологические методы не могут обеспечить своевременную диагностику заболевания, что создает проблемы для выбора адекватной терапии, своевременного проведения противоэпидемических мероприятий, предотвращения внутрибольничного инфицирования больных и персонала. Серологический метод пригоден для постановки окончательного диагноза перед выпиской больного, то есть имеет в основном ретроспективное эпидемиологическое значение.

Молекулярно-биологические методы (в частности — ПЦР) направлены на обнаружение РНК вируса ККГЛ в различных биологических материалов от больных. Наиболее информативным биоматериалом для ПЦР-исследования является плазма крови; допускается использование сыворотки. Принципиальным преимуществом ПЦР-диагностики ККГЛ является то, что вирусная нагрузка в крови больного при госпитализации высока и сохраняется у большинства больных вплоть до 7-14 дня заболевания. Таким образом, диагностика возможна в ходе всего лечения, в том числе в критический момент поступления в стационар, когда сероконверсия (IgM) наблюдается лишь у 3-7% больных и метод ПЦР незаменим: чувствительность и специфичность ПЦР-диагностики в этот период превышает 95%. Метод ПЦР также используется в эпидемиологических исследованиях для выявления РНК вируса ККГЛ в популяции клещей. Поскольку вакцинация от ККГЛ для людей или животных не проводится, такие мероприятия очень важны для предотвращения заражения людей и возникновения вспышек.

Набор реагентов АмплиСенс® CCHFV-FL предназначен для выявления РНК вируса геморрагической лихорадки Крым-Конго в клиническом материале (плазма и сыворотка крови) и клещах методом ОТ-ПЦР. Реакции обратной транскрипции и ПЦР совмещены в одном этапе (one step), что обеспечивает простоту и высокую скорость анализа.

Рекомендации по пробоподготовке клещей рода Hyalomma:

Состояние клещей	Рекомендации по пулированию	Объем физ. раствора/PBS для гомогенизации	Объем клещевой суспензии для экстракции РНК	Набор реагентов для экстракции РНК
голодные	по 5-7 особей	700 мкл	50 мкл	АмплиПрайм РИБО-преп
полунапитавшиеся	по 2-3 особи	1000 мкл	50 мкл	АмплиПрайм РИБО-преп
полностью напитавшиеся	не пулировать, исследовать индивидуально	1000 мкл	100 мкл	РИБО-золь-В

Для экстракции РНК из плазмы и сыворотки крови рекомендуется использовать набор реагентов АмплиПрайм РИБО-преп.

Для гомогенизации клещей рекомендуется использовать гомогенизаторы TissueLyser LT или TissueLyser II.

МУК 4.2.3007-12 Порядок организации и проведения лабораторной диагностики Крымской геморрагической лихорадки для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней (Скачать)

МУ 3.1.1.2488-09 Организация и проведение профилактических и противоэпидемических мероприятий против Крымской геморрагической лихорадки (Скачать)

Крымская геморрагическая лихорадка в Евразии в XXI веке: клиника и диагностика (2012) (Читать статью на сайте CMD)

Главный офис г. Москва
+7 (495) 664-28-84

источник

Крымская-Конго геморрагическая лихорадка — природно-очаговая арбовирусная инфекция. Естественным резервуаром CCHFV служат дикие (зайцы, африканские ежи и др.) и домашние (коровы, овцы, козы) животные, а также клещи (более 20 видов из 8 родов), у которых происходит трансовариальная передача вирусов Основной, естественный механизм заражения человека — кровяной трансмиссивный, реализуется через укус вирусофорных клещей Hyalomma plumbeum (в Крыму), Н. anatohcum (в Центральной Азии и в Африке), а также Dermacentor spp. и Rhipicephalus spp. Возможно гемоконтактное заражение при контакте с кровью, тканями и содержащими кровь экскретами инфицированных животных, а также внутрибольничное заражение при контакте с кровью и содержащим кровь материалом от больных людей и иногда аэрозольное заражение (в лабораторных условиях).

В эндемических районах заболеваемость имеет сезонный характер и повышается летом в период сельскохозяйственных работ (май-август), нередко приобретая характер локальных вспышек. Восприимчивость высокая, контингентами высокого риска заражения являются сельские жители, занимающиеся уходом за животными, ветеринары, а также приезжие в эндемический очаг неиммунные лица.

Эндемические очаги конго-крымской лихорадки расположены в южный районах европейской части России, на Украине (Крымский п-ов), юге Западной Европы (Болгария, бывш. Югославия), в странах Ближнего Востока, Центральной Азии, в Китае, в Африке южнее Сахары (Кения, Конго, Нигерия, Уганда и др.).

После инокуляции вируса происходит его репликация в клетках СМФ с последующей виремией и полиорганной диссеминацией. Это обусловливает развитие неспецифического общетоксического синдрома и признаков поражения внутренних органов. В результате повреждения эндотелиоцитов, поражения костного мозга с угнетением лейкопоэза и образования тромбоцитов, а также вследствие развития тромбогеморрагического синдрома возникают множественные обширные кровоизлияния в кожу, слизистые оболочки, легкие и другие внутренние органы. Характерны дистрофические и некротические изменения в миокарде, гепато-цитах, нефроцитах, могут поражаться мозговые оболочки и ткань головного мозга.
У реконвалесцентов формируется гомологичный иммунитет.

Заболеванию свойственно тяжелое течение, летальность колеблется от 1-5% до 10-15%, при гемоконтактном заражении она может достигать 20-40% и более.

Конго-Крымскую геморрагическую лихорадку можно предполагать в случаях развития остролихорадочного заболевания с последующим возникновением после кратковременной температурной ремиссии прогрессирующего геморрагического синдрома у пациентов из групп высокого риска заражения или у лиц, имевших контакт с содержащим кровь материалом от больных из эндемических очагов. Дифференциальную диагностику проводят с другими ГЛ, лептоспирозом, вирусными энцефалитами, сепсисом, менингоккемией, сыпным тифом.

Специфическая диагностика осуществляется вирусологическими и серологическими методами. Изоляция CCHFV из крови больных в начальный период (1-я неделя) болезни проводится с использованием клеточных линий эмбрионов животных в лабораториях с IV уровнем безопасности. Возможно обнаружение вирусных антигенов в тканях погибших людей иммуногистохимическими методами. Разработаны методы выявления РНК CCHFV в крови больных с помощью PCR. Серодиагностика основана в ранние сроки болезни (после 5-6-го дня) на определении в сыворотке крови больных анти-ССHFV-IgM c помощью ИФА, в поздние сроки обнаруживают нарастание титра в РТГА, РСK, РН и МФА. При оценке результатов серологических исследований следует учиты-вать, что анти-CCHFV-IgM могут сохраняться в течение 4 мес, a acsm-CCHFV-IgG — на протяжении 5 лет после перенесенной ККГЛ.

Лечение. Больные конго-крымской лихорадкой получают лечение в стационарных условиях, а при тяжелом течении болезни в условиях ОРИТ с соблюдением правил профилактики гемоконтактного заражения. Проводится дезинтоксикационная и противошоковая терапия, назначаются трансфузии свежезамороженной плазмы крови. Описан положительный эффект от применения иммунной плазмы (метод предложен М.П. Чумаковым еще в 1944 г.). Установлен высокий лечебный эффект от внутривенного применения рибавирина (Ribavirin, Rebetol) как при Ласса лихорадке.

Профилактика. В очагах конго-крымской лихорадки проводится комплекс мероприятий по борьбе с клещами и защите людей от их нападения с помощью репеллентов (смазывание кожи препаратами диэтилметилтолуамида — ДЭТА, импрегнация одежды перметрином). Для предупреждения гемоконтактного заражения от животных или больных людей используют барьерные методы защиты (резиновые перчатки). В лабораториях осуществляются меры профилактики аэрогенного заражения персонала, содержащий кровь материал от больных перед биохимическим или микроскопическим исследованием обеззараживается (напр., Triton X-100). В России была разработана инактивированная вакцина из мозга инфицированных белых мышей-сосунков или крыс, применявшаяся по эпидемиологическим показаниям.
Реконвалесценты подлежат диспансерному наблюдению в течение 6 мес.

источник

Автореферат и диссертация по медицине (14.03.10) на тему: Лабораторная диагностика крымской-конго геморрагической лихорадки: оценка тяжести, эффективности лечения и прогнозирование исхода

Автореферат диссертации по медицине на тему Лабораторная диагностика крымской-конго геморрагической лихорадки: оценка тяжести, эффективности лечения и прогнозирование исхода

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА КРЫМСКОЙ — КОНГО ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ: ОЦЕНКА ТЯЖЕСТИ, ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОГНОЗИРОВАНИЕ ИСХОДА

14.03.10 — клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении Bt шего профессионального образования «Ставропольская государствен! медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и i циальному развитию».

Научный руководитель: кандидат медицинских наук профессор

ПЕРВУШИН Юрий Владиславович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук профессор

доктор биологических наук СУВОРОВА Татьяна Николаевна

Ведущая организация: ГОУ ВПО Санкт-Петербургский государстве ный медицинский университет имени академика И.П. Павлова Фед рального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Защита состоится «¿f » ¿i/O^J 2010 г. в ¿Г

часов на заседании ди сертационного совета Д 205.001.01 при Федеральном государственно учреждении здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и р; диационной медицины имени A.M. Никифорова» МЧС России по адрес; 194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 4/2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального гос) дарственного учреждения здравоохранения «Всероссийский центр экс тренной и радиационной медицины имени A.M. Никифорова» МЧС Рос сии.

Автореферат разослан « » Ш-Otff 2010 г.

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

На протяжении последних шести лет геморрагические лихорадки (ГЛ) приобретают все большее значение в инфекционной патологии человека (Сомов Г.П., Беседнова H.H., 1981; Онищенко Г.Г., 2000; Они-щенко Г.Г, и соавт., 2003). Это объясняется интенсивным проведением сельскохозяйственных работ на новых территориях, сопровождающимся проникновением человека в естественные биоценозы возбудителей болезней диких животных, в том числе и ГЛ. Кроме того, научно-технический прогресс, приводящий к существенному изменению окружающей среды, способствует серьезным сдвигам в сложившихся веками экологических системах. Это вызывает затухание или, наоборот, активизацию природных очагов болезней (Чумаков М.П.,1977; Сомов Г.П., Беседнова H.H., 1981; Клюшников Ю.И. и соавт., 2000). Периодические возобновления эпидемических вспышек происходят на фоне абсолютного или относительного эпидемического благополучия, что влечет за собой ослабление контроля со стороны органов здравоохранения (Мусамбаев И.К, 1986; Никифоров В.В., 1994; Фельдблюм И.В., Мапкова A.M., 1998). Природные условия в сочетании с хозяйственной деятельностью и малые объемы обработок с целью уничтожения насекомых и их природных хозяев создают благоприятные условия для существования популяции переносчиков и, следовательно, для циркуляции вирусов ГЛ (Василенко С.М. и соавт., 1971; Аристова В.А. и соавт., 2001). Само же обострение эпидемической ситуации связано с резкой активизацией эпизоотического процесса в природных очагах, изменившимся поведением людей и условий их проживания, а также уровнем организации и эффективности эпидемиологического надзора (Северина И.С., 1995; Санникова И.В. и соавт., 2002, 2007). Все вышеперечисленное произошло и в годы, предшествовавшие резкому обострению эпидемической ситуации с Крымской -Конго геморрагической лихорадкой (ККГЛ) на юге России: в Ростовской области и в Ставропольском крае (Перелатов В.Д. и соавт., 1965; Столбов Д.Н. и соавт., 1965; Мусамбаев И.К., 1986; Никифоров В.В., 1994; Аристова В.А. и соавт., 2001).

Из всех лихорадок ККГЛ наименее изучена и имеет наиболее тяжелое течение. Достаточно высоким остается при ККГЛ и процент смертельных исходов (Санникова И.В. и соавт., 2002,2007).

Первое достаточно полное описание лабораторных показателей при ККГЛ было выполнено в начале 2000 годов. Изучена динамика гематологических и гемостазиологических показателей в зависимости от тяжести, формы н периода заболевания ККГЛ (Ковалевич Н.И., 2002; Сан-

никова И.В., и соавт., 2002; Санникова И.В., Попов В.Н., Первушин Ю.В., 2002). Однако первые исследования были проведены на ограниченном количестве больных. Небольшое количество обследованных больных с неблагоприятным исходом не позволило составить алгоритм прогноза летального исхода на основании лабораторных показателей. Кроме того, в последние годы существенно изменились принципы лечения больных ККГЛ. Появление новых методов лечения, с использованием противовирусного препарата рибавирин и увеличившееся количество наблюдений существенно меняет взгляд на лабораторную диагностику ККГЛ. В связи с вышеизложенным представляется актуальным проведение динамического исследования ряда лабораторных показателей, тем более, что иммунологическая диагностика, основанная на определении уровня специфических иммуноглобулинов путем исследования парных сывороток мало помогает клиницисту в первые дни заболевания. Напротив, полученные отрицательные результаты ИФА, нередко требуют повторного исследования крови на более поздних сроках болезни для окончательной верификации диагноза.

Все вышесказанное послужило основанием для планирования и проведения исследования.

Цель исследования: обоснование комплекса информативных методов лабораторной диагностики Крымской — Конго геморрагической лихорадки для оценки тяжести заболевания, эффективности проводимой терапии и прогнозирования исхода болезни.

1. Оценить лабораторные показатели у больных Крымской — Конго геморрагической лихорадкой с различной тяжестью и различным исходом заболевания,

2. Выявить особенности изменений лабораторных показателей в динамике у больных Крымской — Конго геморрагической лихорадкой при различных схемах проводимого лечения.

3. Определить информативность различных лабораторных показателей при диагностике нарушений свертывающей системы крови и создать стандарт обследования больных Крымской — Конго геморрагической лихорадкой.

4. Обосновать использование конкретных лабораторных тестов оценки тяжести состояния пациента, эффективности проводимой терапии и прогнозирования исхода болезни.

Научная новизна исследования.

Впервые исследованы лабораторные показатели в динамике развития и лечения Крымской — Конго геморрагической лихорадки (с использованием противовирусной терапии рибавирином). В ходе проведенного исследования уточнен патогенез заболевания, который обусловлен взаимосвязью выявленных изменений лабораторных показателей. Показана диагностическая значимость разработанного алгоритма лабораторного обследования для оценки тяжести заболевания, эффективности терапии и прогнозирования течения ККГЛ. Выявлены наиболее информативные лабораторные тесты, что позволило сформировать новый стандарт обследования больных Крымской — Конго геморрагической лихорадкой, в том числе и получающих противовирусную терапию рибавирином.

Практическая значимость работы.

Разработана программа лабораторного обследования больных Крымской — Конго геморрагической лихорадкой, включающая: исследование параметров периферической крови с определением индексов интоксикации и системы гемостаза. Созданы алгоритмы прогнозирования исхода болезни. Выявлены критерии оценки тяжести заболевания и эффективности проводимой терапии. Представлены лабораторные критерии безопасности и эффективности использования рибавирина при Крымской — Конго геморрагической лихорадке.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Крымская — Конго геморрагическая лихорадка вызывает характерные существенные изменения параметров клинического анализа крови и показателей гемокоагуляции, которые адекватно отражают тяжесть заболевания.

2. Применение новых методов лечения с использованием противовирусного препарата рибавирин не ухудшает процессы гемопоэза и тромбоцитопоэза и способствует ускоренному восстановлению основных показателей крови и значительно повышает эффективность проводимой терапии.

3. Разработан новый стандарт обследования больных Крымской -Конго геморрагической лихорадкой, включающий наиболее информативные лабораторные тесты. Реализация стандарта обследования позволяет получить полноценную характеристику состояния пациента, прогнозировать развитие и исход заболевания, а также решать вопрос о применении рациональных методов терапии.

Внедрение результатов исследования.

Разработанная диагностическая программа лабораторного обследования больных Крымской — Конго геморрагической лихорадкой применяется при обследовании больных с подозрением на Крымской — Конго геморрагической лихорадку и с подтвержденным диагнозом в центральных районных больницах Ставропольского края, ГУЗ Ставропольском Краевом Клиническом Центре Специализированных Видов Медицинской Помощи, ГУЗ Краевой клинической инфекционной больнице г. Ставрополя.

Результаты работы используются при обучении врачей клинической лабораторной диагностики на кафедре клинической лабораторной диагностики факультета последипломного образования Ставропольской государственной медицинской академии.

Материалы работы докладывались на: 3 съезде научного общества специалистов клинической лабораторной диагностики «Национальные дни лабораторной медицины России» (Москва, 2005); XIII итоговой (межрегиональной) научной конференции студентов и молодых ученых (Ставрополь, 2005); конференции «Стандарты и протоколы лабораторной диагностики «Лабораторная диагностика — 2005», апрель, 2005, (Москва, НИЦ ММА им. И.И.Сеченова); научно-практической конференции специалистов клинической лабораторной диагностики «Клиническая лабораторная диагностика и современные медицинские технологии», (Ставрополь, 2005); научной конференции, посвященной 40-летию факультета последипломного образования СГМА (Ставрополь, 2005); научно-практическом симпозиуме «Объем, организация и экономика лабораторного обеспечения медицинской помощи в условиях модернизации здравоохранения» в рамках Национальных дней клинической лабораторной диагностики (Москва, 2005); всероссийской конференции с международным участием «Тромбозы в клинической практике; факторы риска, диагностика, терапия» (Санкт-Петербург, 2007); научно-практической конференции общества специалистов клинической лабораторной диагностики «Национальные дни лабораторной медицины России» (Москва, 2009); научно-практической конференции » Лабораторная медицина в свете Концепции развития здравоохранения России до 2020 года» (Москва, 2009); заседаниях Краевого научно-практического общества специалистов клинической лабораторной Диагностики (Ставрополь, 2005 — 2010).

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, 2 из них в

журналах по перечню ВАК Минобразования и науки РФ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 161 странице компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы исследований, трех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, приложений и практических рекомендаций. Диссертация иллюстрирована 20 рисунками и содержит 28 таблиц. Библиографический список литературы включает 298 наименований (211 отечественных и 87 иностранных источника).

Для выполнения поставленных в работе задач проводили обследование пациентов, находившихся на лечении в специализированных отделениях (реанимационных и инфекционных) ЦРБ Ставропольского края и краевой клинической инфекционной больницы г. Ставрополя, в период 1999-2006 гг. Всего обследовано 283 больных ККГЛ с диагнозом, подтвержденным иммунологическим или ПЦР — анализом, в возрасте от 12 до 72 лет и 30 здоровых лиц — доноров крови.

Из 283 пациентов тяжелая форма ККГЛ была установлена у 65 человек (39 мужчин и 26 женщин). У 202 человек диагностирована сред-нетяжелая форма ККГЛ — 120 мужчин и 82 женщины, у 16 человек была установлена легкая форма ККГЛ (11 мужчин и 5 женщин). Распределение больных по возрасту и полу представлены на рис. 1.

до 18 19-29 30-39 40-49 50 и лет Возраст старше

Рис.1. Распределение больных по возрасту и полу.

Распределение больных ККГЛ по исходам заболевания

Количество больных Леченные базисной терапией Леченные рибавирином Всего

мужчины женщины Всего мужчины женщины Всего

Всего больных 96 69 165 74 44 118 283

Выздоровление 90 59 149 74 44 118 267 (94,3%)

Летальный исход 6 10 16 0 0 — 16 (5,7%)

Из общего количества больных с ККГЛ выжили 267 человек, у 16 наступил летальный исход (5,7 % от общего числа пациентов). Оценку тяжести течения ККГЛ у пациентов проводили клиницисты по выраженности синдрома системного воспалительного ответа (ССВО), геморрагических проявлений и изменениям лабораторных показателей.

Все летальные исходы наблюдались только у больных с тяжелым течением ККГЛ. Распределение больных по исходам заболевания представлено в таблице 1.

Больные с тяжелым течением заболевания были разделены на 3 группы (Г). 1-я Г — больные с ККГЛ, находившиеся на базисной терапии, выжившие (п = 31). 2-я Г — больные с ККГЛ, получавшие противовирусную терапию рибавирином (п = 18). 3-я Г — больные с ККГЛ, находившиеся на базисной терапии, умершие (n = 16).

4-ю Г составили больные со среднетяжелым течением, находившиеся на базисной терапии (п = 105). В 5-ю Г были отнесены больные со среднетяжелым течением, получавшие противовирусную терапию рибавирином (п = 97).

В 6-й Г находились больные ККГЛ с легким течением, получавшие базисную терапию (п = 13). А 7-ю Г составили больные ККГЛ с легким течением, находившиеся на противовирусной терапии (п = 3).

Базисная терапия включала переливание, по показаниям, эритро-цитарной и/или тромбоцитарной массы и симптоматическое (детоксика-ционное) лечение. На этом лечении.находились 165 человек. 118 человек, наряду с базисной терапией, получали противовирусный препарат риба-вирин. Лечение рибавирином проводилось по схеме предложенной И.В. Санниковой в 2002году.

Распределение больных, в зависимости от тяжести ККГЛ, прово-

димой терапии и исхода заболевания представлено на рис. 2. Сроки поступления в инфекционный стационар у больных, леченных рибавири-ном и базисной терапией, с тяжелым течением, статистически значимо не отличались и составляли 2,85±0,13 и 2,99±0,13 дня (соответственно; р=0,46). Рибавирин назначали врачи-инфекционисты. Во 2-й Г рибави-рин, в зависимости от времени поступления пациента и установления диагноза, назначали в 1-8 сутки (в среднем, на 3,4±0,14 день от начала болезни). Продолжительность терапии рибавирином, в среднем, составила 5,51±0,14 дня.

В контрольную группу были отобраны 30 доноров в возрасте от 18 до 55 лет, добровольно согласившихся на участие в исследовании. У обследованных не было клинических проявлений заболеваний и сдвигов в рутинных лабораторных показателях, что давало основание признать их, на момент обследования, практически здоровыми. Некоторые различия в возрасте больных (12-72 года) и контрольной группы (18-55 лет) не являются принципиальными. Средний возраст больных составил 38,1 лет, а в контрольной группе — 37,9.

Рис. 2. Распределение больных ККГЛ в зависимости от тяжести, метода лечения и исхода заболевания.

Всем больным ККГЛ и здоровым добровольцам проводили исследование по схеме (рис. 3).

Рис. 3. Программа лабораторного обследования (ВСК — время свертывания крови; Тц- тромбоциты; АВР — активированное время рекальцифика-ции; ТПГ — толерантность плазмы к гепарину; OAK — общий анализ крови; Эр. — эритроциты; Л — лейкоциты; ЛИИ — лейкоцитарный индекс интоксикации; ГАИ — грануло-агранулоцитарный индекс интоксикации; АЧТВ — активированное частично тромбопластиновое время; ПТИ — про-тромбиновый индекс; РФМК — растворимые фибринмономерные комплексы; ФГ — фибриноген; ХП-ЭФ — фибринолиз, Хагеманн-зависимый; Ig — иммуноглобулины).

Программа включала комплекс лабораторных исследований для мониторинга состояния пациента, оценки состояния системы гемостаза, позволяла объективно оценивать тяжесть заболевания. Средние данные, полученные нами у лиц контрольной группы, полностью соответствуют нормальным значениям, приведенным в литературе по клинической лабораторной диагностике. Также проводилось исследование окрашенных мазков крови для подсчета тромбоцитов (Тц) и изучения их морфологии под микроскопом с цифровой фотокамерой для компьютерной визуализации изображения. Все исследования проводили унифицированными методами. Статистическую обработку данных в нашей работе проводили с использованием методов параметрического и непараметрического ана-

лиза. Достоверность различия средних определяли по критерию Стью-дента (t) для коэффициентов вариации, уровень значимости р выбран менее 0,05. В случае если распределение данных отличалось от нормального или дисперсии были разными, достоверность различия средних находили по критерию рангов. Для оценки степени взаимосвязи признаков проводили корреляционный анализ с вычислением парных коэффициентов корреляции Пирсона. Для прогнозирования вероятного исхода ККГЛ использовался многовариантный анализ взаимосвязи количественных факторов риска методом логистической регрессии (Dawson В., 2004). Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием программы Epi Info (версия 3.3.2) (Dean A.G., 1994).

Результаты исследований и их обсуждение.

У всех больных с тяжелым течением наблюдали разной степени выраженности геморрагический синдром (ГС), развивающийся, как правило, на 5-7 сутки, выраженную лихорадку и синдром ССВО. Продолжительность геморрагического периода у больных 1-й Г и 2-й Г длилась не более 5 дней.

Всем больным проводили исследования показателей периферической крови и системы гемостаза. Детальный анализ полученных результатов показал, что степень изменения лабораторных тестов зависит от тяжести течения заболевания. Достаточное количество больных позволило отобрать показатели, характеризующие тяжесть течения заболевания, различные исходы и эффективность проводимой терапии.

При поступлении, у 44 больных (67,7 %) отмечена лейкопения, у остальных (21 человек — 32,3 %) количество лейкоцитов (Л) было в пределах возрастных норм, р 2 норм.

При проведении многовариантного анализа факторов риска, связанных с исходом болезни, установлено, что самостоятельное или независимое значение имеют показатели АЛТ, ПТИ, АЧТВ и количество Тц.

источник

Крым-Конго геморрагическая лихорадка — острая зоонозная природно-очаговая вирусная инфекция с трансмиссивным механизмом передачи, характеризующаяся выраженным геморрагическим синдромом и двухволновой лихорадкой.

Крым-Конго геморрагическая лихорадка впервые описано на основании материалов вспышки в Крыму (Чумаков М.П., 1944-1947), поэтому было названо Крымской геморрагической лихорадкой (КГЛ). Позднее случаи аналогичного заболевания были зарегистрированы в Конго (1956), где в 1969 г. был выделен вирус, сходный по антигенным свойствам с вирусом Крымской геморрагической лихорадкой. К настоящему времени заболевание зарегистрировано в странах Европы, Средней Азии и Казахстане, Иране, Ираке, Объединенных Арабских Эмиратах, Индии, Пакистане, странах Африки (Заир, Нигерия, Уганда, Кения, Сенегал, ЮАР и др.).

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9]

Резервуар и источники инфекции — домашние и дикие животные (коровы, овцы, козы, зайцы и др.), а также более 20 видов иксодовых и аргасовых клещей, прежде всего, пастбищные клещи рода Hyalomma. Основной резервуар инфекции в природе составляют мелкие позвоночные животные, от них через клещей заражается домашний скот. Контагиозность животных определяется длительностью виремии, продолжающейся у них около недели. Клещи представляют собой более стойкий резервуар инфекции в связи с возможностью половой и трансовариальной передачи вируса. Отмечена высокая контагиозность больных людей. У животных и человека вирус обнаружен в крови при кишечных, носовых и маточных кровотечениях, а также в выделениях, содержащих кровь (рвотных массах, фекалиях).

Механизмы передачи — трансмиссивный (при укусах иксодовых клещей), а также контактный и аэрогенный. При заражении от человека или животных основным является контактный механизм передачи вследствие прямого контакта с кровью и тканями инфицированных животных и людей (внутривенные вливания, остановка кровотечения, проведение искусственного дыхания методом «рот в рот», взятие крови для исследования и т.п.). Аэрогенный механизм передачи инфекции описан при внутрилабораторном заражении персонала во время нештатных ситуаций при центрифугировании вируссодержащего материала, а также при других обстоятельствах, если вирус содержался в воздушной среде.

Естественная восприимчивость людей высокая. Постинфекционный иммунитет сохраняется в течение 1-2 лет после перенесенного заболевания.

Основные эпидемиологические признаки. Болезнь Крым-Конго геморрагическая лихорадка отличает выраженная природная очаговость. В странах с теплым климатом очаги инфекции в виде вспышек и спорадических случаев приурочены преимущественно к степным, лесостепным и полупустынным ландшафтам. Уровень заболеваемости связан с периодом активного нападения взрослых клещей (в тропиках — круглогодично). Чаще болеют мужчины 20-40 лет. Случаи заражения преобладают среди лиц определенных профессиональных групп — животноводов, сельскохозяйственных рабочих, ветеринарных и медицинские работников. Описаны внутрибольничные вспышки инфекции и внутрилабораторные заражения.

[10], [11], [12], [13], [14]

Патогенез Крым-Конго геморрагической лихорадки сходен с другими вирусными геморрагическими лихорадками. Характерны развитие интенсивной вирусемии, тромбоцитопении, лимфопении в острой стадии заболевания, а также увеличение ACT, как и при большинстве вирусных геморрагических лихорадок, менее выражено увеличение АЛТ. В терминальной стадии наблюдаются печеночная и почечная недостаточность, острая сердечно-сосудистая недостаточность. При аутопсии в печени выявляются эозинофильная инфильтрация без выраженной воспалительной реакции, некротические изменения в селезенке, лимфатических узлах. Возможно развитие массивных кровотечений. ДВС-синдром регистрируется в терминальной фазе, генез его не ясен. Как и при других вирусных геморрагических лихорадках, имеются дистрофические процессы в мышечной ткани, потеря в весе.

Инкубационный период Крым-Конго геморрагической лихорадки после укуса инфицированного клеща длится 1-3 дня, после контакта с кровью или зараженными тканями он может затягиваться максимально до 9-13 суток. Симптомы Крым-Конго геморрагической лихорадки варьируют от стертых форм до тяжелых.

Начальный период болезни продолжается 3-6 дней. Характерно острое начало заболевания, высокая температура с ознобом. Появляются следующие симптомы Крым-Конго геморрагической лихорадки: головная боль, боли в мышцах и суставах, в животе и в пояснице, сухость во рту, головокружение. Иногда бывают боли в горле, тошнота, рвота, диарея. Часто возникает возбуждение, а иногда и агрессивность больных, фотофобия, ригидность и болезненность затылочных мышц.

Через 2-4 дня от начала болезни возбуждение сменяется утомляемостью, депрессией, сонливостью. Появляются боли в правом подреберье, увеличивается печень. При осмотре больных отмечают гиперемию лица, шеи, плечевого пояса и слизистых оболочек полости рта, снижение артериального давления, склонность к брадикардии. На 3-5-й день болезни возможен «врез» на температурной кривой, что обычно совпадает с появлением кровотечений и кровоизлияний. В дальнейшем развивается вторая волна лихорадки.

Период разгара соответствует последующим 2-6 дням. Развиваются геморрагические реакции в разных сочетаниях, степень выраженности которых широко варьирует от петехиальной экзантемы до обильных полостных кровотечений и определяет тяжесть и исход заболевания. Состояние больных резко ухудшается. При их осмотре обращают на себя внимание бледность, акроцианоз, прогрессирующая тахикардия и артериальная гипотензия, подавленность настроения пациентов. Может появляться лимфаденопатия. Нередко находят увеличение печени, иногда возникает желтуха смешанного характера (как гемолитического, так и паренхиматозного). В 10-25% случаев развиваются судороги, бред, кома, появляются менингеальные симптомы.

Реконвалесценция начинается после 9-10 дней болезни и занимает длительное время, до 1-2 месяцев; астения может сохраняться до 1- 2 лет.

Осложнения Крым-Конго геморрагической лихорадки разнообразны: тромбофлебит, пневмонии, отек легких, тяжелые желудочно-кишечные кровотечения, острая печеночная и/или почечная недостаточность, инфекционно-токсический шок. Летальность варьирует от 4% до 15-30% и обычно наступает на второй неделе болезни.

Дифференциальная диагностика Крым-Конго геморрагической лихорадки в начальном периоде представляет большие сложности. В разгаре заболевания Крым-Конго геморрагическую лихорадку дифференцируют от других инфекций, протекающих с геморрагическим синдромом. Наиболее показательные клинические признаки болезни — лихорадка (часто двухволновая) и выраженные геморрагические проявления.

[15], [16], [17], [18], [19]

Лабораторная диагностика Крым-Конго геморрагической лихорадки проводится в специализированных лабораториях с повышенным уровнем биологической защиты. Характерные изменения гемограммы — выраженная лейкопения со сдвигом влево, тромбоцитопения, повышение СОЭ. В анализе мочи определяются гипоизостенурия, микрогематурия. Возможно выделение вируса из крови или тканей, однако на практике диагноз чаще подтверждается результатами проведенных серологических реакций (ИФА, РСК, РНГА, НРИФ). Антитела IgM класса в ИФА определяются в течение 4-х месяцев после заболевания, IgG-антитела — в течение 5 лет. Возможно определение антигенов вируса в ИФА. В последние годы разработана полимеразная цепная реакция (ПЦР) для определения генома вируса.

Госпитализация и изоляция больных обязательны. Лечение Крым-Конго геморрагической лихорадки проводят в соответствии с общими принципами терапии вирусных геморрагических лихорадок. В ряде случаев отмечен положительный эффект от введения 100-300 мл иммунной сыворотки реконвалесцентов или 5-7 мл гипериммунного лошадиного иммуноглобулина. В некоторых случаях хороший эффект может быть получен от применения рибавирина внутривенно и перорально (см. лихорадка Ласса).

При госпитализации больных следует строго выполнять требования по профилактике нозокомиальных инфекций и личной профилактике сотрудников, соблюдать осторожность при выполнении инвазивных процедур. Лицам, соприкасавшимся с кровью и выделениями больного, а также с секционным материалом в качестве экстренной профилактики, вводят специфический иммуноглобулин. Дератизационные и акарицидные мероприятия в природных очагах мало эффективны, поскольку переносчики многочисленны и широко распространены. Особое внимание уделяют защите людей от клещей. Меры личной профилактики — ношение защитной одежды, импрегнирование одежды, палаток и спальных мешков репеллентами. По эпидпоказаниям рекомендуют применять инактивированную формалином вакцину из мозга зараженных белых мышат или крысят-сосунков, однако надежной и эффективной вакцины против лихорадки Крым-Конго до настоящего времени не существует.

Медицинские работники, бывшие в контакте с больными или подозрительными на данное заболевание лицами, а также биоматериалом от них, должны находиться под наблюдением в течение трех недель с ежедневной термометрией и тщательной регистрацией возможных симптомов Крым-Конго геморрагической лихорадки. В очаге проводят дезинфекцию, контактных лиц не разобщают.

источник

Геморрагическая лихорадка Крым–Конго (синонимы: геморрагическая лихорадка Крым–Конго–Хазер, крымско-конголезская лихорадка, среднеазиатская геморрагическая лихорадка, карахалак; Crimean–Congo hemorrhagic fever, Crimean hemorrhagic fever — англ.) — острое вирусное заболевание, относящееся к зоонозам с природной очаговостью. Характеризуется двухволновой лихорадкой, общей интоксикацией и выраженным тромбогеморрагическим синдромом.

Этиология. Возбудитель открыт в 1945 г. М.П.Чумаковым. Является РНК-содержащим вирусом, относится к семейству Bunyaviridae, род Nairovirus. В 1956 г. идентичный по антигенному составу вирус был выделен из крови больного лихорадкой мальчика. Возбудитель получил название вирус Конго. Вирионы сферической формы 92–96 нм в диаметре. Наиболее чувствительны к вирусу клетки почек эмбриона свиней, сирийских хомячков и обезьян. В лиофилизированном состоянии сохраняется свыше 2 лет. Локализуется преимущественно в цитоплазме.

Эпидемиология. Резервуаром вируса являются дикие мелкие млекопитающие: лесная мышь, малый суслик, заяц-русак, ушастый еж. Переносчиком и хранителем являются клещи, преимущественно из рода Hyalomma. Заболеваемость характеризуется сезонностью с максимумом с мая по август (в нашей стране). Болезнь наблюдалась в Крыму, Астраханской, Ростовской областях, Краснодарском и Ставропольском краях, а также в Средней Азии, Китае, Болгарии, Югославии, в большинстве стран Африки к югу от Сахары (Конго, Кения, Уганда, Нигерия и др.). В 80% случаев заболевают лица в возрасте от 20 до 60 лет.

Патогенез. Воротами инфекции является кожа в месте укуса клеща или мелкие травмы при контакте с кровью больных людей (при внутрибольничном заражении). На месте ворот инфекции выраженных изменений не наблюдается. Вирус проникает в кровь и накапливается в клетках ретикулоэндотелиальной системы. При вторичной более массивной вирусемии появляются признаки общей интоксикации, поражение эндотелия сосудов и развивается разной выраженности тромбогеморрагический синдром. Патологоанатомические изменения характеризуются множественными геморрагиями в слизистые оболочки желудка и кишечника, наличием крови в просвете, однако воспалительные изменения отсутствуют. Головной мозг и его оболочки гиперемированы, в них обнаруживаются кровоизлияния диаметром 1–1,5 см с разрушением мозгового вещества. По всему веществу мозга выявляют мелкие кровоизлияния. Кровоизлияния также наблюдаются в легких, почках и др. Многие вопросы патогенеза лихорадки Крым–Конго остаются неизученными.

Симптомы и течение. Инкубационный период длится от 1 до 14 дней (чаще 2–7 дней). Продромальных явлений не бывает. Болезнь начинается внезапно, больные могут назвать даже час начала заболевания. Температура тела быстро повышается (иногда с потрясающим ознобом) и даже при легких формах болезни достигает 39–40°С. В начальном (предгеморрагическом) периоде отмечаются лишь признаки общей интоксикации, характерные для многих инфекционных болезней. Начальный период длится чаще 3–4 дня (от 1 до 7 дней). В этот период на фоне высокой лихорадки отмечают слабость, разбитость, головная боль, ломота во всем теле, сильная головная боль, боли в мышцах и суставах. К более редким проявлениям начального периода относится головокружение, нарушение сознания, сильные боли в икроножных мышцах, признаки воспаления верхних дыхательных путей. Лишь у некоторых больных еще до развития геморрагического периода появляются характерные для этой болезни симптомы — повторная рвота, не связанная с приемом пищи, боли в пояснице, боли в животе, преимущественно в эпигастральной области.

Постоянным симптомом является лихорадка, которая длится в среднем 7–8 дней, особенно типична для крымской геморрагической лихорадки температурная кривая. В частности, при появлении геморрагического синдрома отмечается снижение температуры тела до субфебрильной, через 1–2 дня температура тела вновь повышается, что обусловливает характерную для этой болезни “двугорбую” температурную кривую.

Геморрагический период соответствует периоду разгара заболевания. Выраженность тромбогеморрагического синдрома определяет тяжесть и исход болезни. У большинства больных на 2–4-й день болезни (реже на 5–7-й день) появляется геморрагическая сыпь на коже и слизистых оболочках, гематомы в местах инъекций, могут быть кровотечения (желудочные, кишечные и др.). Состояние больного резко ухудшается. Гиперемия лица сменяется бледностью, лицо становится одутловатым, появляются цианоз губ, акроцианоз. Сыпь на коже вначале петехиальная, в это время появляется энантема на слизистых оболочках ротоглотки, могут быть более крупные кровоизлияния в кожу. Возможны носовые, маточные кровотечения, кровохарканье, кровоточивость десен, языка, конъюнктив. Прогностически неблагоприятно появление массивных желудочных и кишечных кровотечений. Состояние больных становится еще более тяжелым, отмечаются нарушения сознания. Характерны боли в животе, рвота, понос; печень увеличена, болезненна при пальпации, симптом Пастернацкого положительный. Брадикардия сменяется тахикардией, АД снижено. У некоторых больных отмечается олигурия, нарастает остаточный азот. В периферической крови — лейкопения, гипохромная анемия, тромбоцитопения, СОЭ без существенных изменений. Лихорадка длится 10–12 дней. Нормализация температуры тела и прекращение кровотечений характеризует переход к периоду выздоровления. Длительно сохраняется астенизация (до 1–2 мес). У отдельных больных могут быть легкие формы болезни, протекающие без выраженного тромбогеморрагического синдрома, но они, как правило, остаются не выявленными.

Осложнения — сепсис, отек легкого, очаговая пневмония, острая почечная недостаточность, отит, тромбофлебиты.

Диагноз и дифференциальный диагноз. Учитываются эпидемиологические предпосылки (пребывание в эндемичных регионах, сезон, уровень заболеваемости и др.) и характерные клинические симптомы: острое начало, рано появляющийся и резко выраженный тромбогеморрагический синдром, двухволновая температурная кривая, лейкопения, анемизация и др.

Дифференцировать необходимо от сепсиса, лептоспироза, менингококцемии, других геморрагических лихорадок. Специфические лабораторные методы (выделение вируса и др.) в практической работе используются редко.

Лечение. Этиотропного лечения нет. Проводят терапию как при других вирусных геморрагических лихорадках.

Прогноз серьезный. Летальность достигает 30% и более.

Профилактика и мероприятия в очаге. Проводят мероприятия по борьбе с клещами и защите от них людей. Необходимо предупредить заражение от людей. Меры предосторожности должны соблюдаться на всех этапах обследования больного, взятия материала, при проведении лабораторных исследований и др. В очагах проводят заключительную дезинфекцию.

источник

Общие положения

1. Настоящие методические рекомендации «Совершенствование диагностики и профилактики Конго-Крымской геморрагической лихорадки населения» (далее – методические рекомендации) разработаны в целях улучшения лабораторной диагностики и совершенствования санитарно-противоэпидемических (профилактических) и противоклещевых мер, проводимых в эндемичных по Конго-Крымской геморрагической лихорадке (далее-ККГЛ) регионах республики и направленных на предупреждение этой инфекции.

2. В настоящих методических рекомендациях использованы следующие понятия:

1) ККГЛ – острое вирусное заболевание человека, характеризующееся двухволновой лихорадкой, общей интоксикацией и выраженным тромбогеморрагическим синдромом, с высокой летальностью.

Инфицирование человека происходит при укусе зараженных клещей, через кровь и кровянистые выделения больного, при попадании вируссодержащего материала на кожу и слизистые, в результате попадания содержимого клещей на открытые части тела во время стрижки и ручной очистки скота от клещей, при работе с вирусом ККГЛ в лабораторных условиях, при уходе и оказании медицинской помощи больным;

2) индекс обилия – среднее число особей клещей на одно осмотренное животное;

3) индекс встречаемости – процент заклещеванных животных из общего числа осмотренных;

4) индекс доминирования – выраженная в процентах доля особей учитываемого вида по отношению к суммарному объему сравниваемых видов особей в изучаемом материале;

5) индекс инфицированности – удельный вес клещей, зараженных вирусом к общему числу исследованных;

6) основной переносчик возбудителя – иксодовые клещи, которые являются хранителями вируса и основными переносчиками заболевания;

7) резервуар вируса – биологический организм (клещи, блохи и их естественные прокормители – дикие и домашние животные), который является

естественной средой жизнедеятельности вируса.

Лабораторная диагностика

40. Лабораторная диагностика ККГЛ осуществляется путем выделения вируса от больного, определения вирусного антигена и специфических антител с помощью иммунологических реакций, а также методом полимеразной цепной реакции (далее-ПЦР).

41. Изоляция вируса ККГЛ из материала взятого от больного и дальнейшая идентификация проводится в лаборатории, отвечающей требованиям работы с возбудителями II- группы патогенности. Для выделения возбудителя используется кровь больных в остром периоде болезни, внутренние органы (печень, селезенка) и сгустки крови умерших, а также иксодовые клещи, собранные в очагах заболевания.

42. Выявление вирусного антигена в реакции непрямой гемагглютинации (далее-РНГА). Принцип РНГА заключается во взаимодействии антител (далее – АТ), адсорбированных на поверхности эритроцитов, с гомологичным антигеном (далее – АГ), содержащемся в исследуемом материале, в результате чего происходит агглютинация сенсибилизированных эритроцитов.

43. РНГА используется для индикации вируса ККГЛ в различных источниках: в крови больных людей, в трупных материалах людей и животных, а также в членистоногих переносчиках. Для обнаружения АГ вируса ККГЛ в РНГА сыворотку крови больных необходимо исследовать в остром периоде болезни.

44. В реакции используются следующие ингредиенты: иммуноглобулиновый эритроцитарный диагностикум крымской геморрагической лихорадки, иммуноглобулиновый эритроцитарный диагностикум гетерологичный (клещевого энцефалита), исследуемый материал (сыворотка крови больного, кусочки органов, клещи) и физиологический раствор (далее – физ. р-р) со стабилизатором.

45. Обнаружение антигена вируса ККГЛ в исследуемом материале с помощью РНГА состоит из следующих этапов:

1) обработка исследуемого материала:

сыворотку крови больных разводят 1:5 физ. р-р (к 0,8 мл. физ.р-ра добавляют 0,2 мл сыворотки) и прогревают в течение 20 минут (далее – мин) при 56 °С. Затем добавляют 0,1 мл осадка отмытых эритроцитов барана (можно формалинизированных). Смесь встряхивают в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего центрифугируют при 1500 оборотов в минуту (далее – об/мин) (3-4 минуты). Надосадочную жидкость используют для постановки реакции.

Органы погибших людей, животных, отловленных в очагах инфекции (кусочки мозга, печени) тщательно растирают в ступке, добавляют физ.р-р в количестве необходимом для получения 10% суспензии (на 1 г ткани 1 мл физ. р-ра). Суспензию цинтрифугируют 10-15 мин. при 3-5 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость исследуют в РНГА.

Клещей объединяют в пулы, содержащие 10 особей одного вида и пола, тщательно растирают в ступке, добавляя необходимое количество физ. р-ра (1,0 мл), готовят 1% суспензию. Суспензии центрифугируют в течение 10 минут при 2-3 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость используют в РНГА;

2) Приготовление растворов:

физ р-р готовят растворяя 8,5 г хлористого натрия в дистиллированной воде.

Стабилизирующий раствор готовится следующим образом: к 100 мл физ.р-ра добавляют 10 миллиграмм (далее – мг) сухого бычьего сывороточного альбумина. Раствор хранению не подлежит и готовится перед каждым опытом;

3) Разведение исследуемого материала:

из обработанного материала готовят двукратные разведения в серологических пробирках или досках для гемагглютинации. Так, например, для разведения сыворотки больного готовят ряд из 8 пробирок. В каждую пробирку начиная со второй добавляют по 0,5 мл стабилизирующего раствора. Затем в первую и вторую пробирки вносят по 0,5 мл обработанной сыворотки. В последующем из второй пробирки переносят 0,5 мл смеси в третью пробирку и так далее по 0,5 мл. Таким образом, получаются следующие разведения сыворотки: в первой пробирке – 1:5, во второй – 1:10, в третьей – 1:20, в четвертой – 1:40 и так далее;

4) Техника постановки РНГА:

реакцию ставят в панелях микротитратора Такачи в объеме 0,075 мл (3 капли). В два параллельных ряда лунок панели, начиная с последнего разведения (1:640) добавляют по 1 капле исследуемой сыворотки. Затем во все лунки вносят по 1капле стабилизирующего раствора. После чего в 1 ряд лунок добавляют по 1 капле эритроцитарного диагностикума КГЛ, во второй ряд по 1 капле гетерологичного диагностикума (для контроля). Дополнительно ставят контроль эритроцитарного диагностикума КГЛ и гетерологичного на отсутствие спонтанной агглютинации. Для этого в лунки вносят по 2 капле стабилизирующего раствора и по 1 капле эритроцитарного диагностикума;

оценку результатов РНГА производят через 1,5-2 часа (далее – ч) экспозиции опыта при комнатной температуре по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов. Агглютинация эритроцитов представлена однородной пленкой эритроцитов на дне лунки. Отсутствие агглютинации – образование эритроцитов в виде компактной точки на дне лунки.

46. Титром АГ считается то его наивысшее разведение, которое вызывает агглютинацию сенсибилизированных эритроцитов. РНГА оценивают как положительную при условии, что 1) диагностикум не дает спонтанной агглютинации (диагностикум ККГЛ и гетерологичный); 2) отсутствие спонтанной агглютинации исследуемой сыворотки с гетерологичным диагностикумом.

47. Выявление специфических АТ в реакции связывание комплемента (далее-РСК) исследуют парные сыворотки крови: 1 пробу крови, взятую на 1-2 день обращения за медицинскую помощь, 2 пробу – на 2-3 недели от начала заболевания. В случае отсутствия АТ может быть проведено исследование 3 пробы крови через полтора-два месяца от начала болезни. Комплементсвязывающие антитела к вирусу ККГЛ появляются через 2 недели от начала заболевания и продолжительность сохранения их составляет свыше 3-5 лет. РСК ставит микрометодом согласно методических рекомендаций, выпущенных Научно-исследовательским институтом эпидемиологии и инфекционных болезней (Микрометод РСК в диагностике вирусных и риккетсиозных инфекций Алматы).

48. Необходимые реагенты для постановки иммуноферментного анализа (далее-ИФА):

1) планшет для ИФА, в лунках которого адсорбирован АГ к вирусу ККГЛ или АТ к вирусу ККГЛ;

2) положительная и отрицательная контрольные сыворотки;

3) инактивированный АГ ККГЛ;

4) моноклональные АТ к нуклеопротеину вируса, конъюгированные с ферментом;

5) субстрат, буферные растворы и разбавитель. Необходимые материалы, не включенные в набор;

6) автоматические пипетки объёмом 10, 100, 200 и 1000 микролитров (далее-мкл);

7) аппарат для промывки планшетов;

8) спектрофотометр для ИФА с длиной волны 450 нанометров (далее-нм);

9) калькулятор для количественной оценки результатов исследования.

49. На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцы инкубируют в лунках с иммобилизованным АГ (или АТ). Имеющиеся в сыворотке специфические АТ к вирусу связываются с иммобилизованным АГ (АТ). Несвязавшийся материал удаляют отмывкой. Связавшийся комплекс выявляют при инкубации с конъюгатом АТ к ККГЛ человека с пероксидазой хрена. После второй отмывки количество связавшегося конъюгата определяют цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы – перекиси водорода и хромогена – тетраметилбензидина. Реакцию останавливают добавлением стоп-реагента и измеряют оптическую плотность растворов в лунках при длине волны 450 нм.

50. Оценка результата: интенсивность окрашивания пропорциональна количеству содержащихся в исследуемом образце иммуноглобулинов к вирусу ККГЛ.

51. ИФА для выявления иммуноглобулинов (далее – Ig ) класса М (Ig M) к вирусу ККГЛ. Принцип метода заключается во взаимодействии Ig класса М из исследуемого материала с анти – IgM- АТ, иммобилизированными в лунках полистиролового планшета. Образовавшийся комплекс выявляют с помощью АГ ККГЛ и конъюгата поликлональных АТ к ККГЛ с пероксидазой хрена.

52. ИФА для выявления Ig класса G к вирусу ККГЛ. Имеющиеся в сыворотке специфические АТ к вирусу связываются с иммобилизованным АГ. Связавшиеся антитела выявляют конъюгатом АТ к IgG человека с пероксидазой хрена.

53. ИФА для выявления вируса ККГЛ в клещах и других вирусосодержащих материалах. Принцип метода заключается во взаимодействии АГ ККГЛ из исследуемого материала с АТ, иммобилизированными в лунках полистиролового планшета. Связавшийся АГ выявляют с помощью анти-ККГЛ-АТ, меченных пероксидазой хрена (конъюгат). По завершении постановки теста развивается окрашивание, свидетельствующее о присутствии АГ ККГЛ в образце (хромоген).

54. Молекулярно-биологические методы – ПЦР. Проведение лабораторной диагностики ККГЛ в первые дни заболевания необходимо как для своевременной и адекватной терапии больного, так и для экстренного проведения противоэпидемических мероприятий. В ряде случаев при ККГЛ наблюдается низкая АГ нагрузка вируса в крови (начальные стадии инфекции, инаппарантная форма, поздняя обращаемость), что делает невозможным проведение серологических методов исследования. Обнаружение рибонуклеиновой кислоты (далее-РНК) вируса ККГЛ в биологическом и клиническом материале с помощью ПЦР в последнее время находит все более широкое применение. Опубликованы ряд методик для ПЦР-диагностики ККГЛ (1,2,3), основанный на специфической амплификации участка гена, кодирующего нуклеопротеина и расположенного в области малого сегмента РНК вируса ККГЛ.

55. Для проведения анализа необходимо следующее оборудование:

2) центрифуга лабораторная;

3) ультрафиолетовая подсветка (трансиллюминатор) с фотоштативом, защитным экраном, в комплексе с фотоаппаратом;

4) прибор для электрофореза с зажимами и гребёнкой;

5) высоковольтный источник питания;

6) встряхиватель для пробирок типа;

7) снежная или льдо-водяная баня;

8) набор автоматических микропипеток с переменным объёмом;

9) наконечники с фильтрами к микропипеткам;

10) пробирки конические полипропиленовые, 1,5 и 0,5 мл и штативы к ним.

56. Тест-системы предназначены для выявления РНК вируса КГЛ в гомогенатах клещей, в крови заболевших людей, в секционном материале умерших (печень, селезёнка). Наборы рассчитаны на проведение 100 анализов, включая положительный и отрицательный контроли.

1) стандарт РНК возбудителя КГЛ – 300 мкл;

2) реакционная смесь (далее-РС) № 1– 600 мкл;

5) вода дистиллированная, очищенная от РНК-аз и ДНК-аз – 2 мл;

6) раствор хлористого марганца – 120 мкл;

8) буферный раствор обратной транскриптазы (далее-БФ-РТ) – 800 мкл;

9) масло минеральное – 5 мл;

10) раствор Tag-ДНК-полимеразы (2 x БФ) – 3,8 мл;

11) маркер длины фрагментов дезоксирибонуклеиновой кислоты (далее-ДНК) (100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 пар оснований) – 50 мкл.

58. В связи с высокой чувствительностью метода ПЦР возникает проблема взаимной контаминации исследуемых образцов и контаминации образцов и компонентов набора ранее полученным ампликоном.

59. Территориально разделять различные стадии анализа, размещая их в различных помещениях:

1) помещение для подготовки проб;

2) помещение для постановки ПЦР;

3) помещение для анализа результатов.

60. Для каждой стадии анализа должен быть свой комплект лабораторной одежды, автоматических пипеток, вспомогательных материалов и оборудования.

61. Работу на всех этапах проводить только с использованием одноразовых расходных материалов: пробирок, наконечников с фильтрами (для ПЦР-анализа) и других вспомогательных материалов.

62. Метод обратной транскриптазы (далее-ОТ) –ПЦР включает два этапа: на первом этапе при температуре 37°С происходит реакция ОТ: специфическое связывание олигонуклеотида-праймера с вирусной РНК и синтез вирусной к ДНК с помощью обратной транскриптазы (ревертазы). На втором этапе проводится ПЦР, включающая три стадии:

1) на первой стадии при температуре 94°С происходит денатурация гибридной двойной цепи РНК- к ДНК, образовавшейся на первом этапе;

2) на второй стадии ПЦР два олигонуклеотида-праймера, строго специфичные (гомологичные) к определённым участкам антипараллельных цепей вирусной РНК и к ДНК, связываются (образуют гибриды с помощью водородных связей) с этими участками нуклеиновой кислоты (далее-НК) (стадия отжига);

3) на третьей стадии при температуре 70-72 °С с участием термофильной ДНК-полимеразы и дезоксинуклеозид-5ў-трифосфатов происходит синтез новых цепей ДНК. Инициация синтеза ДНК происходит в местах связывания олигонуклеотидов-праймеров с вирусной к ДНК, матрицей для синтеза служат исходные цепи вирусной НК (стадия полимеризации).

63. Таким образом, за цикл (три стадии) происходит удвоение каждой из двух антипараллельных цепей вирусной НК. При проведении 20 таких циклов теоретически происходит увеличение количества исходной ДНК примерно в миллион раз.

64. Для увеличения чувствительности анализа этап ПЦР проводится в “nested”-варианте: первый раунд – с “внешней” парой олигонуклеотидов-праймеров, второй раунд – с “внутренней” парой олигонуклеотидов-праймеров и аликвотой реакционной смеси ПЦР первого раунда.

65. Перед выполнением анализа необходимо внимательно ознакомиться с настоящей инструкцией постановки ПЦР.

66. При подготовке смесей и всех операциях с РНК для лучшей сохранности РНК пробирки обязательно помещать в снежно-водяную баню.

67. Подготовка образцов – в качестве образцов можно использовать клещей, цельную кровь, взятую с антикоагулянтом, сыворотку крови.

68. Анализ проводится непосредственно после забора проб. В ином случае забранные пробы до проведения анализа должны хранить при температуре 2-4°С не более 24 ч, либо при температуре минус 30 °С не более 1 месяца.

69. Подготовку проб проводить в соответствии с инструкцией по применению к набору реагентов для выделения РНК.

70. Подготовка стандартного раствора РНК вируса КГЛ – из пробирки с водно-спиртовой суспензией РНК после перемешивания на встряхивателе отобрать 50 мкл суспензии, перемешать, выдержать 5 минут (далее – мин), отцентрифугировать при 8000-10000 об./мин 5 мин, супернатант отобрать, осадок подсушить и добавить к нему 50 мкл воды из набора, растворить при встряхивании.

71. Во многих случаях осадок выделенной РНК визуально неразличим, поэтому все операции по осаждению РНК и промывке осадка проводить аккуратно.

72. Проведение ОТ – пробирки для проведения ОТ пронумеровать и расположить в штативе во льду, включая две пробирки для положительного и отрицательного контрольных образцов (далее-К+, К–).

73. В чистую пробирку внести необходимые компоненты реакционной смеси:

1) раствор ДТТ – 2,0 х n мкл;

2) раствор хлористого марганца – 1,0 х n мкл;

где n – число исследуемых проб, включая контроли.

74. Смесь перемешать пипетированием и разнести по 15 мкл в пробирки для ОТ, на льду.

75. В пробирку № 1 внести 5 мкл К– (дистиллированной воды, очищенной от РНК-аз и ДНК-аз). В остальные пробирки внести по 5 мкл раствора РНК исследуемых образцов. В последнюю пробирку внести 5 мкл К+.

76. Пробирки инкубировать 1 ч при температуре 42°С.

77. Проведение первого раунда ПЦР – пробирки для проведения ПЦР (вместимостью 0,5 мл) пронумеровать и расположить в штативе, включая пробирки для контрольных образцов, во льду.

78. В чистую пробирку объемом 0,5 мл добавить реактивы в следующих количествах:

где n – число исследуемых проб, включая контроли.

79. Смесь перемешать пипетированием и разнести по 25 мкл в пробирки для ПЦР. В пробирку № 1 добавить 5 мкл раствора из реакционной смеси К–. В остальные пробирки внести по 5 мкл ОТ-продуктов исследуемых проб. В последнюю пробирку внести 5 мкл ОТ-продуктов К+. Содержимое пробирок перемешать, добавить по 20 мкл (каплю) минерального масла.

80. Пробирки поместить в амплификатор и провести амплификацию по следующей программе:

2) 94°С – 20 секунд (далее – сек), 55°С – 20 сек, 72°С – 20 сек– 35 циклов;

81. Проведение второго раунда ПЦР– пробирки для проведения ПЦР пронумеровать как для стадии первого раунда ПЦР. Расположить в штативе во льду, включая пробирки для положительного и отрицательного контрольных образцов (К+, К–).

82. В отдельной пробирке объемом 0,5 мл смешать:

где n – число исследуемых проб, включая контроли.

83. Полученную смесь тщательно перемешать и разнести по 25 мкл в пробирки для ПЦР. Внести во все пробирки по 5 мкл растворов из пробирок 1-го раунда ПЦР.

84. Материал из пробирки, содержащий К+, перед проведением второго раунда ПЦР следует развести в 50 раз дистиллированной водой, затем внести 5 мкл в РС.

85. Содержимое пробирок перемешать, добавить по 20 мкл (каплю) минерального масла, поместить пробирки в амплификатор и провести амплификацию по следующей программе:

2) 94° С – 20 сек, 55°С – 20 сек, 72°С – 20 сек – 35 циклов;

86. Детекцию амплифицированной ДНК после ПЦР проводить методом гель-электрофореза в 1,5% агарозе. В один из карманов геля внести раствор маркера длины фрагментов ДНК. Материалы, необходимые для проведения электрофореза:

2) раствор бромистого этидия, 1 %;

3) 50-кратный ТАЕ-буфер – 50 xТАЕ-2М Трис-ацетат рН 8,2, 0,05 М ЭДТА;

4) 10-кратный буфер для нанесения образцов (50%-ный глицерин, 0,25%-ный бромфеноловый синий, 0,25%-й ксиленцианол).

87. Проведение электрофореза. Залить в аппарат для электрофореза 1хТАЕ-буфер, приготовленный из 50хТАЕ разбавлением водой. К 100 мл 1х ТАЕ-буфера добавить 1,5 г агарозы, расплавить агарозу на электрической плите, добавить 100 мкл раствора бромистого этидия, перемешать. Залить агарозный гель согласно инструкции к аппарату для горизонтального электрофореза. Для заливки геля можно использовать крышки от иммунологических планшет подходящего размера. Для получения карманов в агарозном геле установить гребёнку на крышку для планшет с помощью зажимов типа “бульдог”. Охладить агарозу до температуры 50-60 °С и налить на планшет. Внести в карманы геля по 10-15 мкл амплификата. В один карман внести 5 мкл маркера длин фрагментов ДНК. Подключить электрофоретическую камеру к источнику питания и задать напряжение 10-15 В/см геля. Провести электрофорез продуктов амплификации в направлении от катода (–) к аноду (+). Оптимальная длина пробега 5-7 см. Вынуть гель из формы и перенести его на стекло трансиллюминатора.

88. С гелем агарозы работать в перчатках, так как бромистый этидий является сильным мутагеном.

89. Фрагменты анализируемой ДНК проявляются в виде светящихся оранжево-красных полос. Проводить электрофоретический анализ продуктов ПЦР как после I раунда, так и после II раунда. При высокой вирусной нагрузке детекция ПЦР-продукта возможна уже после I раунда ПЦР, в этом случае после II раунда ПЦР в геле может отсутствовать специфическая полоса.

90. Тест-системы хранятся при температуре 2-10 °С. Транспортирование осуществляются всеми видами крытого транспорта в термоконтейнерах с термопакетами с хладагентом. Срок годности тест-систем — 4 месяца со дня выпуска.

Общие положения

2. В настоящих методических рекомендациях использованы следующие понятия:

2) индекс обилия – среднее число особей клещей на одно осмотренное животное;

3) индекс встречаемости – процент заклещеванных животных из общего числа осмотренных;

5) индекс инфицированности – удельный вес клещей, зараженных вирусом к общему числу исследованных;

естественной средой жизнедеятельности вируса.

Эпидемиология Конго-Крымской геморрагической лихорадки

3. Возбудителем ККГЛ является вирус, принадлежащий к семейству Bunyaviridae, род Nairovirus.

4. Основным резервуаром вируса в природе и источником инфекции являются около 27 различных видов и подвидов иксодовых клещей (преимущественно из рода Hyalomma), передающих вирус своему потомству трансовариально или по ходу метаморфоза. Временным резервуаром вируса служат животные (крупный рогатый скот, овцы, козы).

5. Основными переносчиками возбудителя ККГЛ являются клещи Hyalomma asiaticum. Существенную роль в эпидемиологии ККГЛ играют клещи Dermacentor niveus, обитающие на юге Казахстана.

6. Очаги болезни приурочены преимущественно к пустынным, полупустынным и степным ландшафтам с теплым климатом и физико-географическим особенностям эндемичных очагов и определяются типами землепользования в этих районах.

7. Вирус передается клещами трансоварильно и по ходу метаморфоза, что благоприятствует сохранению популяции возбудителя в очаге. Заболевание имеет строгую весенне-летнюю (апрель, август) сезонность, которое с некоторым опозданием повторяет активность переносчика.

8. Пути передачи возбудителя трансмиссивный и контактный.

9. Инфицирование человека происходит:

1) через укус клеща в результате присасывания иксодовых клещей;

2) через кровь и кровянистые выделения больного;

3) при попадании вируссодержащего материала на кожу и слизистые;

4) в результате попадания содержимого клещей на открытые части тела во время ручной очистки от клещей, состригания их со скота;

5) через инфицированную кровь животного при забое и разделке туш.

10. Больные ККГЛ наиболее опасны для окружающих в течение первых дней болезни, особенно с момента появления кровотечений. Члены семьи больных ККГЛ и медицинские работники заражаются в процессе оказания первой медицинской помощи больным и при уходе за ними. Контактные случаи ККГЛ имеют тяжелое течение. При работе с вирусом ККГЛ в лабораторных условиях возможен капельно-респираторный путь заражения.

11. При ККГЛ низкий уровень коллективного гуморального иммунитета у здоровых людей. У переболевших антитела сохраняются свыше 3-5 лет после перенесенного заболевания.

12. При высокой численности переносчиков и увеличении численности животных-доноров эпизоотологический потенциал очагов возрастает. В это время происходит эпидемическое проявление очага в форме единичных и групповых заражений людей.

13. Эпидемиология заболеваний приурочена к сельской местности, характеризуется спорадичностью случаев, ярко выраженным профессиональным составом заболевших (чабаны, доярки, рабочие животноводческих хозяйств и другие). Люди восприимчивы к ККГЛ независимо от возраста, болезнь в основном поражает людей активного рабочего возраста (от 20 до 50 лет).

Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰).

Опора деревянной одностоечной и способы укрепление угловых опор: Опоры ВЛ — конструкции, предназначенные для поддерживания проводов на необходимой высоте над землей, водой.

источник