Эфемерная лихорадка крупного рогатого скота

Эпизоотология. Болеет крупный рогатый скот, преимущественно взрослые животные, наиболее вероятные переносчики возбудителя болезни — кровососущие мошки родов Culicoides и Culex. Болезнь протекает в виде эпизоотии, носит выраженный сезонный характер, наибольшее её распространение и проявление наблюдаются летом и осенью в период высшей активности мошек. Возникновение и распространение эпизоотии Э. л. во многом определяются погодными условиями и направлениями господствующих ветров, а также периодическими сменами климатических условий. Э. л. свойственна выраженная природная очаговость. Основной резервуар вируса в природе в межэпизоотический период — крупный рогатый скот (включая буйволов). Переболевшие животные приобретают иммунитет сроком до 2 лет, а после иммунизации — до 6 месяцев.

Течение и симптомы, Э. л. проявляется внезапным повышением температуры до 40—41°C, обильными пенистыми слюнотечением и выделениями из носовой полости, сильным слезотечением, респираторными расстройствами (кашель, хрипы и др.), общим недомоганием, отсутствием аппетита, жвачки, сухостью передней части морды, ригидностью мышц конечностей и тела, значительным снижением лактации. В тяжёлых случаях возникают спазмы мышц глотки и гортани или параличи, эмфизема легких, хромота, неспособность стоять из-за болей в суставах. Клиническое проявление болезни продолжается 1—2, иногда 3—4-суток.

Паталогоанатомические изменения. При вскрытии отмечают гиперемию и кровоизлияния в слизистой оболочке носовой полости, гортани, глотки, трахеи, увеличение воздушной ёмкости лёгких с промежуточной эмфиземой и гепатизацией, катаральную пневмонию с десквамацией эпителия.

Диагноз ставят на основании клинической картины, эпизоотологических данных и лабораторных исследований. Выделение вируса производят из лейкоцитарной фракции крови в культуре клеток или на мышатах. В качестве серологических тестов используют реакцию защиты на крупном рогатом скоте, реакцию нейтрализации на мышатах и в культуре клеток, метод иммунофлюоресценции и РСК. Существенный фактор при анализе эпизоотической ситуации при Э. л. — индикация вируса в переносчиках (рис.). Э. л. дифференцируют от ящура, чумы крупного рогатого скота, злокачественные катаральные горячки, ринотрахеита, парагриппа, вирусной диареи, аденовирусных инфекций.

Профилактика и меры борьбы включают уничтожение переносчиков, дезинфекцию помещений, систематический ветеринарный осмотр и ограничение движения животных, активную и пассивную иммунизацию. В Японии готовят промышленным способом инактивированную культуральную формолвакцину.

Литература:
Макаров В. В., Современные данные об эфемерной лихорадке крупного рогатого скота, «Сельское хозяйство за рубежом», 1974, № 11, с. 34—36.

Ветеринарный энциклопедический словарь. — М.: «Советская Энциклопедия» . Главный редактор В.П. Шишков . 1981 .

ЛИХОРАДКА — Температурная кривая при гриппе лошадей. Температурная кривая при гриппе лошадей. лихорадка, защитно приспособительная реакция теплокровных животных, проявляющаяся повышением температуры тела независимо от колебания температуры внешней среды.… … Ветеринарный энциклопедический словарь

ТРЁХДНЕВНАЯ ЛИХОРАДКА — трёхдневная лихорадка, то же, что эфемерная лихорадка … Ветеринарный энциклопедический словарь

эпизоотическая лихорадка — эпизоотическая лихорадка, то же, что эфемерная лихорадка … Ветеринарный энциклопедический словарь

Диагностика важнейших инфекционных болезней крупного рогатого скота, овец и коз — Название болезни Возбудитель Источник возбудителя инфекции Пути передачи возбудителя инфекции Основные поражаемые группы животных Длительность инкубационного периода Носительство возбудителя Важнейшие клинические признаки Патологоанатомические… … Ветеринарный энциклопедический словарь

Распространение некоторых инфекционных болезней животных по континентам — (данные ФАО ВОЗ МЭБ, 1979)* Болезнь Европа Азия Африка Америка Австралия и Океания Северная Центральная и Южная Ящур + + + + Чума крупного рогатого скота + + Контагиозная плевропневмония крупного рогатого скота + + … Ветеринарный энциклопедический словарь

Ботсвана — (Botswana) Республика Ботсвана (Republic of Botswana), государство в Южной Африке. Член британского Содружества (до 1966 британский протекторат Бечуаналенд). Граничит на Ю. с ЮАР, на З. и С. с Намибией (Юго Западная Африка) и Замбией, на… … Большая советская энциклопедия

источник

[Bovine ephemeral fever, Three day sickness, Stiff sickness (англ.); Fievre de trois joursdu boeuf (франц.), Dreitagekrankheit des Rindes (нем.)]

Эфемерная лихорадка — трехдневная лихорадка, болезнь неподвижности, эпизоотическая лихорадка КРС — острая, быстропротекаюшая, лихорадочная болезнь КРС.

Эфемерную лихорадку (ЭЛ) в течение многих лет диагностируют в Южной Африке и Австралии. Вспышки остропротекающей фибрильной болезни КРС, так называемой «инфлюэнцы скота», регистрировали в Японии с 1949 по 1951 гг. В Австралии первая большая эпизоотия болезни началась в 1936 г. и до 1971 г. повторялась там неоднократно. Болезнь распространялась, в основном, потоком ветра. Наиболее вероятным переносчиком ее считают москитов Culex annulirostris и Anopheles annulipes. Болезнь широко распространена на Африканском, Европейско-Азиатском и Австралийском континентах, регистрируют ее и в сопредельных бывшему СССР странах. В 1976 г. отмечали эпизоотию ЭЛ, охватившую поголовье КРС северо-западных провинций Индии, северо-восточных провинций Китая и южные районы Монголии. Спорадические случаи болезни КРС наблюдали в 1946 и 1952 гг., в южных приграничных районах Таджикистана и Узбекистана (поймы рек Амударьи, Пяндж и Вахш). При этом, на основании эпизоотологических данных и клинических наблюдений за животными, вначале поставили диагноз — грипп, а затем — трехдневная болезнь КРС. Однако окончательный диагноз на ЭЛ не был установлен. Распространение болезни в 1988 г. на фермы характеризовалось распределением Пуассона и соответствовало эпидемической кривой модели Рида Фроста с вероятностью соответствующего контакта в 0,0226. Если популяция КРС на ферме составляет менее 5 голов, вероятность первоочередной вспышки практически равна нулю.

Клинические признаки и патологоанатомические изменения. Болезнь характеризуется внезапным повышением температуры тела до 41—42 «С. Через 1—2 дня она понижается до нормальной. В это время отмечается быстропроходящий лейкоцитоз и лейкопения, учащенное дыхание, что сопровождается появлением эмфиземы. Иногда вследствие удушья наступает смерть. У некоторых больных животных развивается подкожная эмфизема в задней части шеи, в передней части грудной клетки или в области лопатки. У отдельных животных отмечают насморк, слезо — и слюнотечение, одышку, болезненность в суставах, мышечный тремор и параличи конечностей. Наблюдается сухость передней части морды, общее недомогание, анорексия, прекращение жвачки, снижение (иногда полное прекращение) удоя, хромота, неспособность стоять из-за артрагии. При снижении температуры до нормальной эти симптомы исчезают. При гематологическом исследовании характерно наличие своеобразной формы ядер у лейкоцитов.

Патологоанатомические изменения чаще локализуются в легких; там находят кровоизлияния в слизистой оболочке верхних дыхательных путей, носовой полости, глотке, гортани, трахеи. В редких случаях легкие становятся похожими на большие воздушные шары, эмфизема распространяется на диафрагму, на внутримышечные и подкожные участки шеи и брюшной полости. В паренхеме легких нечетко выражены участки гепатизации. Типичными патологоанатомическими изменениями является серофибриоз, множественный артикулопериостит, периартрит, лимфаденит. У многоплодных коров, отелившихся нормально, изменялись показатели картины крови, макро — и микроминеральные изменения, а резкое снижение уровня Са в плазме крови часто сопровождалось внезапным параличом и другими признаками, характерными для острой формы ЭЛ.

Морфология и химический состав. Вирус открыт впервые японскими исследователями Цубаки и др. в 1951 г. Вирионы пулевидной формы, размер 140-70 нм, имеют полый осевой канал и сходны с вирусами везикулярного стоматита, фландерс, бешенства и Керн Каньон, относящихся к семейству рабдовирусов. В отличие от них вирус ЭЛ не имеет поперечной полосатости. Длина вириона 176 нм, диаметр у основания 88 нм. Вирионы южноазиатского штамма вируса конусовидной формы, австралийского и японского штаммов — пулевидной. На всех этапах развития вирионы имеют усеченные Т-частицы. Несмотря на определенное сходство вируса ЭЛ с другими рабдовирусами, он отличается от них тем, что внутренняя структура вирусной частицы представляет 6-гранную белковую массу, а нуклеиновая кислота 2-нитевая. Плавучая плотность 1,196 г/см3, вирионы устойчивы к РНК-зе. При ультрацентрифугировании в течение 2 ч при 4 °С большая часть вируса осаждается при 73000 g.

Вирус чувствителен к эфиру, хлороформу, дезоксихолату и трипсину. Частично инактивируется при рН 7,4 или 8,0, инактивация наступает при рН 6,1 (60 мин) и рН 9,1 (90 мин), полностью инактивируется при рН 3. Нагревание при 56 °С в течение 20 мин ведет к полной инактивации. В условиях 34 и 37 °С происходит постепенное снижение инфекционности, а при 30 °С она не снижается в течение 24 ч. При дальнейшем нагревании в тех же условиях инфекционность вируса понижается приблизительно на 10°.7 ТЦД50 B сутки. Вируссодержащая кровь при +2 -2 °С не снижает инфекционности 48 ч. Лиофилизированная вируссодержащая кровь при -40 °С остается патогенной даже после 958 дней хранения. Вируссодержащая культуральная жидкость (при выращивании в культуре ВНК-21) в условиях -80 °С сохраняла патогенность через 278 дней, а при -20 °С уже на 73-й день наблюдалось значительное снижение титра инфекционности. При 4 °С вируссодержащий материал можно сохранять не более 40 дней. Многократное замораживание и оттаивание не влияют на инфекционный титр вируссодержащего материала.

Антигенная структура. АГ структура не изучена, обнаружен лишь растворимый КС АГ. У крыс, зараженных в мозг, появляются ВНА. У зараженных кроликов, свиней и овец AT не обнаружены. КС АГ в более высоком титре накапливается в культуре клеток ВНК-21 к 5-му дню культивирования при 30 «С, далее титр его постепенно снижается.

ВНА у КРС появляются на 2-й, а КСА — на 3-й неделе после заражения. ВНА у животных-реконвалесцентов достигают своего пика через 2 месяца после заражения и сохраняются более 400 дней. Затем титр их резко снижается. Между наличием AT и восприимчивостью к инфекции имеется прямая связь. Материнские AT у телят обнаруживаются до 6—7-месячного возраста. Стандартным штаммом вируса ЭЛ является ВВ7721. Большинство исследователей считает, что этот вирус в АГ-отношении идентичен. Однако в литературе появились данные, указывающие на то, что в Австралии существует несколько серотипов вируса.

Гемагглютинирующие свойства не изучены. Локализация вируса, вирусоноситель-ство и вирусовыделение не изучены. Известно лишь, что самая высокая инфекцион-ность эритроцитов у больного животного совпадает с периодом виремии.

Экспериментальная инфекция. Вирус размножается в мозге мышей, хомячков и крысят-сосунов. Экспериментально болезнь можно воспроизвести у телят при внутривенном заражении кровью естественно больных животных. У молодняка КРС (1,5—2-летнего возраста) заболевание наблюдали на 4-й день; температурная реакция регистрировалась на протяжении 3 дней. Мышат-сосунов заражают интрацеребраль-но фракцией лейкоцитов крови больных животных. У зараженных мышат через 1—3 дня наблюдали недомогание, а на 10-й день и позже появлялись симптомы паралича задних конечностей. Исход летальный. Интрацеребральное заражение мышат-сосунов в 3-дневном возрасте и старше не вызывало их гибели. Мыши не являются адекватной моделью для изучения ЭЛ.

Вирус можно выделять на хомячках и однодневных крысятах-сосунах. После 3-х последовательных пассажей на мышатах-сосунах вирус удается адаптировать к мозгу крысят-сосунов и к культурам клеток. Однако он обычно утрачивает патоген-ность и АГ-активность в отношении КРС. Вирус ЭЛ шт. Юмагучи оказался более вирулентным для суточных мышей, тогда как шт. Ml976 КРС5 проявил низкую патоген-ность для этих животных. Односуточные морские свинки, взрослые нелинейные белые мыши, хомячки и крысы оказались нечувствительными к интрацеребральному заражению вирусом ЭЛ шт. Ml976 КРС5 и Юмагучи.

Культивирование. Кроме мозга мышат, крысят и хомячков-сосунов, вирус культивируется в клетках ВНК-21, Т, перевиваемой линии опухолевых клеток хомячка, индуцированных саркомой Рауса (шт. Шмидт-Руппин), в первичной культуре клеток почки хомячка, в перевиваемой линии клеток ВЕК-1, полученных из почки эмбриона КРС и прошедших в течение четырех лет 103 пассажа. В первичных культурах клеток эмбриона хомячка, почек и эмбриона крысы, почек и семенников телят вирус размножается, не вызывая ЦПИ. Вирус не размножается и не вызывает ЦПИ В культурах клеток почки и эмбриона мышей, почки морской свинки, цыплят, лейкоцитов, костного мозга, щитовидной, вилочковой железы и надпочечника телят. Различные штаммы после серийного пассирования в мозге мышат-сосунов или в клетках ВНК-21 сравнительно быстро теряют патогенность для КРС. Для выделения вируса используют культуру клеток Vero, где титр вируса достигает 10-3-4 ТЦД5о/мл.

Изучены оптимальные условия бляшкообразования в культуре этих клеток. Отмечен феномен аутоинтерференции, связанный с присутствием дефектных интерферирующих частиц в культуре клеток. Для культивирования вируса оптимальная температура 30—34 °С. Повышению титра инфекционности вируса способствует добавление в инфицированную культуру клеток кортизона. Вирус размножался в организме москитов Culex annulirostris при внутригрудной инъекции. Развитие вируса связано с клеточными мембранами. Характер размножения его в клетках ВНК-21 сходен с размножением вирусов везикулярного стоматита, Фландерс, Керн Каньон.

Источники и пути передачи инфекции. ЭЛ — трансмиссивная болезнь. Переносчиками вируса служат москиты Culex annulirostris и, вероятно, также Anopheles annulipes. Болезнь проявляется в теплое влажное время года, в период биологической активности кровососущих насекомых и протекает в виде энзоотии и эпизоотии. Инфекция наносит значительный экономический ущерб из-за больших потерь массы, молочной продуктивности, абортов, временного бесплодия и гибели тяжелобольных животных.

Вирус монопатогенен, в естественных условиях поражается только КРС. Овцы, козы, свиньи и лошади невосприимчивы.

Иммунитет и специфическая профилактика. Иммунитет не изучен. В Японии удовлетворительные результаты получены при применении аттенуированной вакцины. Оптимальный интервал между введениями составлял 1—5 недель. Из вируссодержа-щей крови, обработанной кристаллвиолетом, удалось получить инактивированную вакцину, которую вводят двухкратно подкожно по 10 мл с интервалом 3—7 дней. В крови привитых животных образуются ВНА, Выявляемые более 2 лет. Кроме того, предложена ГОА-формолвакцина с использованием вируса, репродуцированного в культуре HmLu-1. При 4 °С вакцина сохраняет активность в течение 9 месяцев. Она безвредна для стельных коров. Рекомендуется двукратная иммунизация с последующей ревакцинацией через год поздней осенью или ранней весной. Для получения гипериммунной сыворотки КРС иммунизируют вируссодержашей дефибринирован-ной кровью, суспензией селезенки и лимфоузлов, взятых во время лихорадки. Гипериммунная сыворотка в дозе 250 мл предохраняет животное от прямого заражения. Перспективна и живая вакцина, но это связано с большими трудностями, так как в гетерогенной биологической системе вирус быстро теряет свою патогенность и иммунизирующие свойства.

Серийное пассирование вируса ЭЛ в линии клеток HmLu-1 ведет к быстрой аттенуации его в отношении КРС. Аттенуированный вирус не вызывает у животных образования ВНА. Однако максимальное накопление их и устойчивость к заражению у КРС происходит после подкожного введения аттенуированного вируса (около 105 ТЦД 5о/мл) и затем через 2—4 недели после внутримышечной инъекции фор-молвакцины. Иммунизация КРС по такой схеме безвредна даже для стельных коров.

В 1982—1984 гг. в Клинсвенде проведена оценка иммунных реакций 24 стад КРС после различных схем вакцинации против ЭЛ. Использовали вакцину, приготовленную на основе шт. 919, аттенуированного на телятах и клетках Vero, в сочетании с адъювантом QuilA и гелем ГОА. Две последовательных инокуляции вакцины, смешанной непосредственно перед введением с адъювантом QuilA, индуцировали самый высокий титр ВНА и обеспечивали высокую защиту от естественного контрольного заражения вирулентным вирусом, по крайней мере, в течение 12 месяцев. В то же время, после однократного введения вакцины с этим адъювантом и двухкратного введения титр AT был значительный, но не обеспечивал напряженной защиты от вирулентного вируса. Отмечена четкая взаимосвязь титра ВНА и уровня иммунозащиты. При перемежающемся пассировании культуры клеток ВНК-21 получен аттенуированный вариант вируса ЭЛ, который утратил вирулентность для КРС, но сохранил иммуногенные свойства. Минимальная иммунизирующая доза равна 100 ТЦД50, а прививочная — 10000 ТЦД 5о. После однократной подкожной вакцинации иммунитету КРС наступает через 21 день и длится не менее 6 месяцев.

источник

Штамм вируса эфемерной лихорадки крупного рогатого скота ephemerovirus bovinum для изготовления биопрепаратов для диагностики эфемерной лихорадки крупного рогатого скота

Владельцы патента RU 2461391:

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается штамма вируса эфемерной лихорадки крупного рогатого скота (ВЭЛ КРС). Описанный штамм выделен от коров, больных эфемерной лихорадкой КРС, и депонирован в коллекцию микроорганизмов ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером — «ВНИИЗЖ-М» — ДЕП. Штамм репродуцируется в культуре клеток ВНК-21 в течение 2-3 суток и накапливается в титре от 5,5 до 6,0 Ig ТЦД₅₀/см 3 , сохраняет исходные характеристики при пассировании в культуре клеток ВНК-21 в течение 14 пассажей, на его основе получен антиген для серологических реакций и гипериммунные сыворотки крови к ВЭЛ КРС с активностью в реакции нейтрализации 1:8-1:16. Представленный штамм обладает высокой биологической и антигенной активностью в нативном виде и может быть использован для изготовления чувствительных и высокоспецифичных биопрепаратов для диагностики эфемерной лихорадки КРС. 2 ил., 11 табл., 7 пр.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к новому штамму вируса эфемерной лихорадки (ВЭЛ) крупного рогатого скота (КРС), который может быть использован при разработке и производстве средств диагностики эфемерной лихорадки КРС.

Эфемерная лихорадка (трехдневная эпизоотическая лихорадка, болезнь тугоподвижности) — остро протекающая вирусная трансмиссивная болезнь КРС, клинически проявляющаяся внезапным повышением температуры тела до (+41°C)÷(+42°C), непродолжительной (1÷5 сут) лихорадкой, воспалением слизистых оболочек, ригидностью и хромотой (1, 2).

Возбудитель — РНК-содержащий вирус из группы рабдовирусов, в естественных условиях передается различного вида кровососущими насекомыми. Болезнь проявляется в теплое влажное время года, в период биологической активности кровососущих насекомых, быстро распространяется и протекает в виде энзоотии и эпизоотии.

В соответствии с классификацией, установленной Международной комиссией по таксономии вирусов (International Committee on Taxonomy of Viruses — ICTV), ВЭЛ КРС относится к роду 01.062.0.03. Ephemerovirus, принадлежащему к семейству 01.062. Rhabdoviridae (3).

ВЭЛ КРС имеет пулевидную форму, размер 140×70 нм, полый осевой канал и сходен с вирусами везикулярного стоматита, фландерс, бешентсва и Керн Каньон, также относящихся к семейству рабдовирусов. В отличие от них ВЭЛ не имеет поперечной полосатости и внутренняя структура его вирусной частицы представлена 6-гранной белковой массой, а нуклеиновая кислота 2-нитевая. ВЭЛ содержит в своем составе пять структурных белков: L (180 кДа), G (81 кДа), N (52 кДа), М1 (43 кДа) и М2 (29 кДа). Гликопротеин G может быть удален из вириона при обработке неионными детергентами, что применяется при изготовлении вакцинных препаратов (4÷6).

Эфемерная лихорадка КРС регистрируется ежегодно в основном в тропических и субтропических зонах (Израиле, Иране, Ираке, Сирии, Индии, Пакистане, Бангладеш, Китае, Японии, Австралии, Африке). Имеются сообщения о заболевании ею в Монголии и Средней Азии (4, 7, 8).

Эфемерная лихорадка КРС наносит значительный ущерб животноводству, обусловленный снижением привесов и молочной продуктивности.

Российская Федерация имеет общие границы с некоторыми из вышеуказанных стран, поэтому не исключена опасность возникновения этого заболевания в южных регионах страны. В связи с этим необходимо иметь высокоэффективные диагностические препараты, которые позволили бы идентифицировать возбудителя эфемерной лихорадки КРС и впоследствии быстро купировать распространение инфекции. Это обстоятельство вынуждает вести постоянный поиск новых штаммов ВЭЛ КРС, пригодных для изготовления средств диагностики и специфической профилактики эфемерной лихорадки КРС.

Известен ряд штаммов ВЭЛ КРС, используемых для изготовления средств диагностики и специфической профилактики эфемерной лихорадки КРС.

Известен штамм YHL ВЭЛ, репродуцированный в культуре клеток ВНК-21 и HmLu-1 с титром инфекционной активности 5,0÷6,5 Ig ТЦД₅₀/см 3 и используемый для изготовления средств диагностики эфемерной лихорадки (9).

Известен штамм TLRI ВЭЛ, репродуцированный в культуре клеток ВНК-21 и используемый для изготовления средств диагностики эфемерной лихорадки КРС (9).

Известен штамм Liu Yin ВЭЛ КРС, репродуцированный в культуре клеток ВНК-21 с инфекционной активностью 5,6÷6,5 Ig ТЦД₅₀/см 3 и используемый для изготовления средств диагностики эфемерной лихорадки КРС (9).

Известен штамм ВВ7721 ВЭЛ КРС, выделенный в 1968 г. из крови коровы с клиническими признаками эфемерной лихорадки, репродуцированный в культуре клеток ВНК-21 и Vero и используемый для изготовления средств диагностики эфемерной лихорадки КРС (10-12).

Известен штамм 919 ВЭЛ КРС для изготовления средств диагностики и специфической профилактики эфемерной лихорадки КРС, полученный из полевого изолята в 1978 г. в Квинсленде (Австралия) и репродуцированный в культуре клеток Vero с титром инфекционности 5,3÷5,8 Ig ТЦД₅₀/см 3 (13).

Известен штамм «Монгольский» ВЭЛ КРС, репродуцированный в культуре клеток ВНК-21 с инфекционной активностью 6,0÷6,5 Ig ТЦД₅₀/см 3 и используемый для изготовления биопрепаратов для диагностики эфемерной лихорадки КРС (14).

Известен штамм РТ-1 ВЭЛ КРС для изготовления средств диагностики эфемерной лихорадки, изолированный в 1990 г. из крови инфицированных коров и адаптированный к культурам клеток ВНК-21 и Vero (15).

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в расширении арсенала штаммов ВЭЛ КРС, обладающих высокой биологической и антигенной активностью в нативном виде и пригодных для изготовления чувствительных и высокоспецифичных биопрепаратов для диагностики эфемерной лихорадки КРС.

Указанная задача решена получением штамма «ВНИИЗЖ-М» (авторское наименование) ВЭЛ КРС, используемого для изготовления биопрепаратов для диагностики эфемерной лихорадки КРС.

Штамм «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС выделен в 1993 г. от коров, больных эфемерной лихорадкой КРС.

Для получения ВЭЛ КРС, обладающего оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали монослойную перевиваемую линию клеток ВНК-21, как высокочувствительную к ВЭЛ КРС. В результате проведения 9 последовательных пассажей изолята на культуре клеток ВНК-21 был получен штамм «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС, имеющий стабильные биотехнологические, антигенные и иммуногенные свойства и пригодный для изготовления сывороток и антигенов для диагностики эфемерной лихорадки КРС.

Накопление вируса штамма «ВНИИЗЖ-М» в культуре клеток ВНК-21 обеспечивалось на уровне от 5,5 до 6,0 Ig ТЦД₅₀/см 3 .

Штамм «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС депонирован 21 июня 2007 г. во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») под регистрационным номером (ссылкой) — производственный штамм «ВНИИЗЖ-М» — ДЕП ВЭЛ КРС.

Сущность изобретения пояснена на графических материалах, на которых на:

фиг.1 представлена хроматограмма результатов электрофореза продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР) фрагмента генома ВЭЛ КРС в 2% агарозном геле после окрашивания бромистым этидием, на которой:

1, 3 дорожка — маркер pUC 19 DNA/Mspl (Hpall) (стрелками указаны длины фрагментов п.н.);

2 дорожка — штамм «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС (специфический фрагмент ДНК длиной 460 п.н.);

фиг.2 — электронная микрофотография вирионов производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС (фото получено д.б.н. А.П.Пономаревым), увеличение ×50000.

Штамм «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС характеризуется следующими признаками и свойствами.

При электронной микроскопии штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС были выявлены вирусные частицы, структура и размеры которых характерны для семейства Rabdoviridae, рода Ephemerovirus.

Вирионы эфемерной лихорадки имеют пулевидную и конусовидную формы, диаметром 80÷110 нм, длиной 100÷170 нм и состоят из нуклеокапсида спиральной симметрии, окруженного липопротеиновой оболочкой, на поверхности которой имеются выступы длиной 5÷10 нм и диаметром 3 нм.

По своим антигенным свойствам штамм «ВНИИЗЖ-М» относится к ВЭЛ КРС.

Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой в реакции нейтрализации (РН) на культуре клеток Vero.

Введение вацинного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ коровам сопровождается образованием у них вируснейтрализующих антител в крови в титре 1:4÷1:16.

Штамм «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС проявляет высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность в лиофилизированном виде и в виде культуральной вируссодержащей суспензии. Штамм предназначен для изготовления диагностических и вакцинных препаратов. Вирус штамма «ВНИИЗЖ-М» репродуцируется в монослойных культурах клеток: Vero и перевиваемой культуре клеток ВНК-21, в которых в течение 2-3 суток инкубирования накапливается в титре не менее 5,5 Ig ТЦД₅₀/см 3 . Сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 14 пассажей.

Геном ВЭЛ КРС не обладает инфекционностью и представлен молекулой двухнитевой РНК. ВЭЛ содержит в своем составе пять структурных белков: L (180 кДа), G (81 кДа), N (52 кДа), М1 (43 кДа) и М2 (29 кДа).

Плавучая плотность в CsCl 1,19 г/см 3 . Наиболее стабилен при рН 7,2÷7,6. При ультрацентрифугировании в течение 2 ч при 4°С большая часть вируса осаждается при 73000 g.

Устойчивость к внешним факторам

ВЭЛ КРС штамм «ВНИИЗЖ-М» не стоек к воздействию высокой температуры, различных химических веществ, например хлороформу (5%), этиловому спирту (20%), трипсину (0,5÷1%). Вирус чувствителен к кислой и щелочной среде, действию ультрафиолетовых лучей. Многократное замораживание и оттаивание не влияют на инфекционный титр вируссодержащего материала.

Дополнительные признаки и свойства

Безвредность — при подкожном введении крупному рогатому скоту 5,0 и 20,0 см 3 вируссодержащего материала заболевания не вызывает.

Вирулентность — авирулентен для крупного рогатого скота при подкожном введении.

Стабильность биологических свойств. Сохраняет исходные характеристики при пассировании на культуре клеток ВНК-21 в течение 14 серийных пассажей. Штамм нереверсибелен в течение 3 пассажей на быках.

Сущность предложенного изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма «ВНИИЗЖ-М», был выделен в 1993 г. от коров, больных эфемерной лихорадкой КРС. Подготовку материала проводили общепринятыми методами.

Биологические и вирусологические методы включали адаптацию вируса, выделенного от больных коров, к культуре клеток ВНК-21. В процессе адаптации было установлено, что перевиваемая линия клеток ВНК-21 высокочувствительна к ВЭЛ и оказалась оптимальной культурой для получения расплодки штамма для изготовления антигена.

В дальнейшем для получения расплодки вирусную суспензию вносили на освобожденный от ростовой среды монослой культуры клеток и экспонировали в течение часа в термостате при температуре 37±0,5°С. После этого вносили поддерживающую среду Игла с добавлением 1÷2% сыворотки крови КРС. Инфицированную культуру инкубировали при 37±0,5°С до появления цитопатического действия (ЦПД) вируса, которое характеризовалось округлением клеток, скоплением их в виде групп по 10÷20 клеток и в дальнейшем тотальной деструкцией монослоя клеток. При поражении площади монослоя не менее 70÷80% (округление и появление светопреломляющего эффекта, отслоение от стекла) культуральные матрасы промораживали при минус 30°С и после оттаивания при комнатной температуре производили сбор вируса с последующим отбором проб для исключения микробной контаминации и определения инфекционной активности вируса титрованием в культуре клеток Vero, выращенной во флаконах в виде 2-суточного монослоя. Для этого содержимое 3 ампул растворяли стерильной средой ПСП до исходного объема (1 см 3 ), тщательно перемешивали и объединяли. Готовили десятикратные разведения вируса на среде ПСП с содержанием 1% сыворотки КРС, начиная с 10 -1 до 10 -7 . Затем в четыре флакона с монослоем клеток после удаления ростовой среды вносили по 1 см 3 каждого разведения вируса, начиная с 10 -1 по 10 -7 . Во флаконах с контрольной культурой клеток проводили только смену среды.

Флаконы инкубировали при 37±0,5°С, ежедневно просматривая их, начиная с 3 суток, под микроскопом на наличие специфической дегенерации клеток (ЦПД). Смену среды проводили через каждые 3 суток. Окончательный учет результатов проводили через 7 суток после заражения культуры клеток. Результаты титрования считали достоверными при сохранении монослоя в контроле. Расчет вели по методу Рида и Менча.

Титр производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС 8 пассажа составил в среднем 4,6 Ig ТЦД₅₀/см 3 в трех повторностях (4,5 Ig ТЦД₅₀/см 3 ; 4,66 Ig ТЦД₅₀/см 3 ; 4,66 Ig ТЦД₅₀/см 3 ), 9 пассажа составил в среднем 5,66 Ig ТЦД₅₀/см 3 (5,5 Ig ТЦД₅₀/см 3 ; 5,5 Ig ТЦД₅₀/см 3 ; 6,0 Ig ТЦД₅₀/см 3 ), 14 пассажа — 5,88 Ig ТЦД₅₀/см 3 (6,0 Ig ТЦД₅₀/см 3 ; 5,66 Ig ТЦД₅₀/см 3 ; 6,0 Ig ТЦД₅₀/см 3 ). Данные титрования представлены в таблицах 1, 2 и 3.

Для проведения испытаний на стерильность использовали 20 ампул лиофилизированного производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС.

Контроль на отсутствие контаминации бактериальной и грибковой флорой проводили в соответствии с ГОСТ 28085-89 «Препараты биологические. Методы контроля стерильности».

Содержимое ампул разводили водой для инъекций и объединяли по три ампулы. Из каждой пробы препарата по 1 см 3 вносили в 3 пробирки, содержащие тиогликолевую среду, и пробирки инкубировали в течение 14 суток, при этом пробирки №№1 и 2 при 21±1°С, а пробирку №3 при 37±0,5°С. Затем из пробирки №3 делали пересевы:

1. По 0,5 см 3 на следующие среды: скошенный казеиновый питательный агар, казеиновый питательный бульон, среда Сабуро (жидкая).

2. По 1,0 см 3 на следующие среды: казеиновый питательный бульон под вазелиновым маслом с кусочками мяса или печени, казеиновый агар, мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), мясопептонный печеночный бульон под вазелиновым маслом (МППБ), среда Сабуро при 21±1°С.

При испытании производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС проводили контроль стерильности сред: три пробирки с каждой средой выдерживали в течение 14 суток при 37±0,5°С, со средой Сабуро при 21±1°С.

Для исключения контаминации штамма микоплазмами были сделаны высевы по 0,5 см 3 в 3 пробирки, содержащие по 4,5 см 3 стандартного PPLO-бульона (20% лошадиной сыворотки; 1,47% PPLO-основы; 2,5% аутолизата дрожжей; 0,5% глюкозы; 0,25% аргинина; по 0,01% никотинамида динуклеотида и L-цистеина; 0,05% ацетата таллия; индикатор — феноловый красный). При отсутствии роста микоплазм на жидкой среде в течение 72 ч (сохранение цвета индикатора) проводили два «слепых» пассажа в течение 72 часов каждый, а затем делали высев на среду Каган. Пробирки просматривали визуально в течение 10 дней. При отсутствии специфических для микоплазм колоний, врастающих в толщу агара, делали заключение о чистоте исследуемого материала.

В результате проведенных исследований установлено, что производственный штамм «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС свободен от грибов, анаэробных, аэробных, мезофильных бактерий и микоплазм.

Определение авирулентности, безвредности, реверсибельности производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС.

Содержимое 15 ампул растворяли стерильным физиологическим раствором в объеме, равном объему препарата до лиофилизации, и объединяли. Для определения авирулентности, безвредности и реверсибельности вирус вводили подкожно по 5 см 3 трем быкам.

Для определения реверсибельности проводили 3 пассажа на КРС. От первого животного через 5 дней после введения вируса отбирали кровь и в объеме 10 см 3 ее вводили четвертому. От четвертого еще через 5 дней отбирали кровь и в таком же объеме вводили пятому. Ежедневно за животными вели наблюдение и проводили термометрию.

Через 21 день после введения вируса у животных брали пробы крови для определения наличия антител к ВЭЛ КРС.

Результаты исследований представлены в таблице 4.

Таким образом, производственный штамм «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС не вызывает заболевание и гибель животных, является авирулентным, безвредным и нереверсибельным.

Определение специфичности, антигенной и иммуногенной активности производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС.

Антигенную активность вакцинного штамма определяли на четырех быках. Вирус вводили подкожно в область шеи в объеме 5 см 3 в дозе 5,5 Ig ТЦД₅₀/см 3 .

До введения вируса (нулевые пробы) и через 21 день после введения вакцинного штамма у животных брали кровь для определения в сыворотке крови титра вируснейтрализующих и комплементсвязывающих антител. За животными вели ежедневное клиническое наблюдение в течение 21 суток с измерением температуры тела.

Вируснейтрализующую активность антител сывороток крови определяли в РН. С этой целью готовили двукратные разведения испытуемых сывороток. К полученным разведениям сывороток добавляли равные объемы вируссодержащего культурального материала с активностью 2,0 Ig ТЦД₅₀/см 3 . Смеси вируса с сывороткой выдерживали в течение 1 часа при температуре 37,0°С, после чего ими инфицировали клеточную культуру Vero (по 4 флакона с культурой клеток на каждое разведение сыворотки). Флаконы с культурой клеток инкубировали при температуре 37±1°С в стационарном положении в течение 7 суток со сменой среды через 3-4 суток. За титр антител в сыворотке принимали наибольшее ее разведение, в котором подавлялось развитие ЦПД не менее чем в половине зараженных пробирок с культурой клеток.

При постановке РН использовали контроли на токсичность сывороток, контроли культуры клеток и дозы вируса.

Результаты проведенных исследований представлены в таблице 5. Титр вируснейтрализующих антител находился в пределах 1:8÷1:16.

Комплементсвязывающую активность сывороток крови животных определяли в реакции длительного связывания комплемента (РДСК) общепринятым методом. С этой целью готовили двукратные разведения сыворотки крови КРС на физиологическом растворе рН 7,6.

Специфичность вируса подтвердили в РН и РДСК с типоспецифической сывороткой крови на ВЭЛ КРС, а также с использованием гетерогенных сывороток крови против вируса бешенства, чумы КРС и оспы овец.

Методом контрольного заражения КРС, иммунизированного вакциной из штамма ЭЛ «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС в дозах 1,0; 5,0 и 20,0 подкожно, через 21 день после вакцинации установлено, что вакцина защищала животных от заболевания при введении в дозах 5,0 и 20,0 см 3 . Титры антител в крови животных были в РН 1:4÷1:16, а в РДСК 1:10, а после заражения 1:20 (таблицы 6 и 7).

Контроль производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС на специфичность и отсутствие контаминации чужеродными вирусами

Для исследования была использована вируссодержащая суспензия с инфекционным титром 6,0 Ig ТЦД₅₀/см 3 .

Специфичность исследуемого вируса подтверждали с помощью метода ПЦР. В работе использовали праймеры F1, 460R (Hsieh Y.-C. 2006), позволяющие амплифицировать фрагмент гена поверхностного гликопротеина G (1÷460 п.н.) ВЭЛ КРС. Анализ продуктов реакции осуществляли после 40 циклов (денатурация 94°С 30 с, отжиг праймеров 55°С 30 с и элонгация 72°С 1 мин). Результаты исследований представлены на фиг.1.

В результате проведения ПЦР с праймерами F1, 460R фрагмента гена поверхностного гликопротеина G (1÷460 п.н.) ВЭЛ КРС получен фрагмент размером около 460 п.н., что соответствует расчетному размеру.

С использованием метода ПЦР были проведены исследования по выявлению в исследуемом материале вируса инфекционного ринотрахеита, вируса парагриппа-3, вируса диареи и ротавируса КРС.

Последовательностей, специфичных для указанных вирусов, не обнаружено.

Сыворотки крови КРС, зараженного ВЭЛ КРС, были исследованы с помощью метода иммуноферментного анализа (набор для выявления антител к вирусу болезни Ауески фирмы IDEXX Pseudorabies Virus gB Antibody Test Kit) на наличие антител к вирусу болезни Ауески до и через 21 день после заражения. Сыворотки крови КРС не содержали антител к гетерологичному вирусу.

ВЭЛ КРС штамма «ВНИИЗЖ-М», негативно контрастированный при помощи 4% фосфорно-вольфрамовой кислоты (ФВК) с рН=6,8, представлен вирионами сложного строения, состоящими из нуклеокапсида, окруженного гликопротеиновой оболочкой пулевидной и конусовидной формы диаметром 80÷110 нм и длиной 100÷170 нм. Кроме указанных форм частиц в препарате содержались частицы неправильной формы.

Электронно-микроскопическим методом подтверждена принадлежность штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС к семейству Rabdoviridae, роду Ephemerovirus. Наличие контаминации штамма вируса ЭЛ КРС чужеродными агентами (вирусами, микоплазмами и др. микроорганизмами) не установлено. Результаты исследований представлены на фиг.2.

Полученный штамм депонирован 21 июня 2007 года во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером (ссылкой) — производственный штамм «ВНИИЗЖ-М» — ДЕП ВЭЛ КРС.

Получение антигена ВЭЛ КРС.

Для приготовления антигена для диагностических целей содержимое 3-х ампул ВЭЛ штамма «ВНИИЗЖ-М» растворяют стерильной средой ПСП до исходного объема (1 см 3 ), тщательно перемешивают и объединяют. Трехсуточную культуру клеток ВНК-21 монослойной (шведской) линии, выращенную в 1,5-литровых клинских матрасах, предварительно слив с них ростовую среду, заражают в дозе 0,1÷1,0 Ig ТЦД₅₀/см 3 . Матрасы помещают на 1 час в термостат для контакта клеток культуры с вирусом. После этого вносят поддерживающую среду ПСП с добавлением 1÷2% сыворотки крови КРС. Инфицированную культуру инкубируют при 37±0,5°С до появления ЦПД вируса, которое характеризуется округлением клеток, их скоплением и в дальнейшем разрушением монослоя клеток. При поражении площади монослоя не менее 70÷80% культуральные матрасы подвергают двукратному промораживанию при температуре минус 20°С и оттаиванию.

Полученную вирусную суспензию используют в качестве матровой расплодки, которой заражают клинские матрасы с культурой клеток ВНК-21, и, как описано выше, получают 11÷12 пассаж вируса. При появлении ЦПД на 70÷80% площади монослоя, сливают ростовую среду, оставляя около 20 см 3 , и стерильным резиновым шпателем отделяют инфицированный слой клеток от стекла в культуральную жидкость.

Концентрирование антигена ВЭЛ осуществляют отделением клеточной фракции путем центрифугирования при 2000 об/мин в течение 20 мин. Осадок ресуспендируют физиологическим раствором из расчета 1 см 3 на каждый матрас, что соответствует двухсоткратной концентрации вируса. Полученный концентрат подвергают двукратному промораживанию при минус 20°С и оттаиванию.

Полученный данным способом антиген используют в серологических реакциях для определения уровня антител к ВЭЛ, а также для изготовления диагностических сывороток.

Результаты исследований, приведенные в таблице 8, свидетельствуют о том, что способом, описанным в примере 6, получен антиген, который является специфичным, что подтверждено их тестированием с гомологичными и гетерологичными сыворотками.

Получение гипериммунной сыворотки.

Для приготовления диагностических сывороток крови используют очищенный и концентрированный препарат антигена ВЭЛ КРС из штамма «ВНИИЗЖ-М».

Очистку антигена проводят в два этапа: на первом этапе используют 20%-ный раствор сахарозы, на втором — градиент плотности сахарозы (5%, 10%, 15%, 20% и 25% растворы). В обоих случаях соотношение вирусного материала и сахарозы должно составлять 3:1 соответственно. Первоначально вирусный материал очищают центрифугированием через 20% раствор сахарозы в течение 1,5 часов при 20000 об/мин. Полученный осадок растворяют в физиологическом растворе до первоначального объема исходного материала и центрифугируют в градиенте плотности сахарозы при 20000 об/мин в течение 2 ч. Образовавшийся осадок ресуспендируют в минимальном объеме физиологического раствора и используют в дальнейшем в качестве антигена для иммунизации животных.

Получение гипериммунной сыворотки КРС.

Иммунизируют животных четырехкратно. После первого введения антигена иммунизацию проводят на 21, 28 и 35 дни с интервалом в 7 дней между инъекциями. Для иммунизации используют 2 см 3 антигена с адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1 внутримышечно либо 1 см 3 антигена с содержанием 0,25 мг сапонина подкожно. Через 7 дней после последней иммунизации отбирают кровь для получения сыворотки. Проверку проб сыворотки крови проводят на активность и специфичность в РДСК с набором специфических и гетерологичных антигенов. Результаты исследований приведены в таблице 9. Для составления серийного перпарата используют сыворотки крови, активность которых со специфическим антигеном в РДСК не ниже 1:20, а с гетерологичным антигеном они должны быть неактивны. Сыворотки, проверенные на специфичность и активность, фасуют в стерильные флаконы, этикетируют и хранят до использования при минус 20÷40°С.

Получение гипериммунной сыворотки на кроликах.

Для получения специфической сыворотки ВЭЛ КРС на кроликах используют клинически здоровых животных средней упитанности массой 2,5-3,0 кг. Животных иммунизируют четырехкратно с интервалом в 7 дней.

При первой иммунизации очищенный и концентрированный антиген вводят в объеме 1,0 см 3 в подушечки задних лап, при второй — 2,0 см 3 в область подколенных лимфоузлов, при третьей — внутримышечно в бедро задней ноги 0,5 см 3 антигена и 0,5 см 3 полного адъюванта Фрейнда, при четвертой — 0,5 см 3 антигена и 0,5 см 3 неполного адъюванта Фрейнда подкожно в область спины в несколько точек.

Возможна и следующая схема иммунизации: кроликам аналогичным способом вводят при первой иммунизации 0,5 см 3 антигена и 0,5 см 3 полного адъюванта Фрейнда, при второй — 1,0 см 3 антигена и 1,0 см 3 неполного адъюванта Фрейнда, при третьей и четвертой — 0,5 см 3 антигена и 0,5 см 3 неполного адъюванта Фрейнда.

Через 7 дней после последней иммунизации кроликов тотально обескровливают и получают сыворотку крови. Сыворотки крови фасуют в ампулы по 1,0 см 3 , лиофильно высушивают. Препараты сыворотки, проверенные на специфичность и активность, фасуют в стерильные флаконы, этикетируют и хранят до использования при минус 20÷40°С.

Данные, представленные в таблицах 9, 10 и 11, свидетельствуют, что способом, описанным в примере 7, получены диагностические сыворотки со специфической активностью.

Полученные гипериммунные сыворотки крови КРС и кроликов были использованы для определения в РДСК специфической активности культурального производственного штамма ВЭЛ «ВНИИЗЖ-М» и для ретроспективной диагностики: определения уровня антител в крови животных, переболевших эфемерной лихорадкой, титр антител в крови которых был в пределах 1:5÷1:40.

При гипериммунизации крупного рогатого скота и кроликов концентрированным и очищенным антигеном вируса эфемерной лихорадки крупного рогатого скота с адъювантом Фрейнда получена специфическая сыворотка крови с активностью 1:80 и 1:160 соответственно, которая может быть использована в РДСК для определения активности специфического антигена и ретроспективной диагностики заболевания КРС эфемерной лихорадкой.

1. Курченко Ф.П., Гононов Ю.М., Хлыбова Т.В., Зайцев В.Л., Кекух И.Г., Пасечников Л.Н., Алехин А.Ф. и Вяткина Н.В. Выделение и идентификация вируса эфемерной лихорадки крупного рогатого скота. Ветеринария, 1991, 2,26÷28.

2. OIE. Bovine ephemeral fever. Ames. Jowa State Univ., 2005.

3. http://www.ictvdb.org/lctv/fs rhabd.htm.

4. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В. и Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. — М.: ВНИТИБП, 1998. — с.319÷323.

5. Nandi S., Negi B.S. Bovine ephemeral fever: a review // Comparative Immunol., Microbiol. and Infectious Diseases. — 1999. — N 22. — P.81÷91.

6. Walker P.J. Bovine ephemeral fever virus // Encyclopedia of Virology, Third ed. — 2008. — P.354÷362.

7. Диев В.И., Назаров А.С. и Соколов Л.Н. Клинические признаки эфемерной лихорадки крупного рогатого скота при экспериментальном заражении // Тез. докл. 4-ой Межгосуд. конф. по научн. и приклад. проблемам 21÷23.10.1993 г., Киев, 1993.

8. George T.D. Studies on the pathogenesis of bovine ephemeral fever in sentinel cattle. Vet Microbiol., 1985, 10, 6, 493÷504.

9. Chiu S.Y., Lu Y.S. The serological study on bovine ephemeral fever in Taiwan in 1984 // Journal of the Chinese Society Veterinary Science. — 1986. — Vol.12. — P.289÷296.

10. Walker P.J. et al. Proteins of bovine ephemeral fever virus // J. Gen. Virol. — 1991. N 72. — P.67÷74.

11. Walker P.J. et al. The genome of ephemeral fever Rhabdovirus contains two related Glycoprotein genes // J. Virol. — 1992. — N 191. — P.49÷61.

12. Zakrzewsky H., Cybinski D.H., Walker P.J. A blocking ELISA for the detection of specific antibodies to bovine ephemeral fever virus // J. Immunol. Methodes. — 1992. — N 151. — P.289÷297.

13. Vanselow B.A., Walthall J.C., Abetz I. Field trials of ephemeral fever vaccines//Vet. Microbiol. — 1995. — N 46. — P.117÷130.

14. Диев В.И., Назаров А.С., Захаров В.М. и соавт. Экспериментальные исследования по изучению клиники эфемерной лихорадки крупного рогатого скота и получению диагностических препаратов // Вирусные и микробные болезни сельскохозяйственных животных: сб. научн. труд. — Владимир, 1995. — С.128÷131.

15. Chang C.J. et al. Apoptosis induced by bovine ephemeral fever virus // J. Virol. Methodes. — 2004. — Vol.122, №2. — P.165÷170.

Штамм вируса эфемерной лихорадки крупного рогатого скота (ВЭЛ КРС) Ephemerovirus bovinum сем. Rabdoviridae, депонированный в коллекцию ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером «ВНИИЗЖ-М» — ДЕП, для приготовления биопрепаратов для диагностики эфемерной лихорадки КРС.

источник

Эфемерная лихорадка КРС (трехдневная эпизоотическая лихорадка, грипп, болезнь тугоподвижиости; Febris aefemera — лат., Bovine ephemeral fever — англ.) — остро протекающая в виде эпизоотии или отдельных вспышек вирусная болезнь крупного рогатого скота, проявляющаяся кратковременной лихорадкой, воспалением слизистых оболочек носа, ротовой полости, пищевода, глаз, ригидностью мышц, тугоподвижностыо и хромотой.

Распространенность. Болезнь регистрировали под разными названиями в различное время в Африке, в странах Азии, Японии, Индии, Индонезии, Пакистане, Австралии и др. Диагностировали ее (как грипп) также в Финляндии, ФРГ, Чехословакии, Нидерландах, Дании, случаи болезни выявлены в Китае.

В последнее время ее регистрировали в Японии (I. Inaba, 1973), Африке (Davles el tl., 1975), Австралии (F. Parsonson, 1978, G. Combs, 1978), Индии (II. Malvlya, 1977).
Экономический ущерб при эфемерной лихорадке обусловливается снижением продуктивности мясного и молочного скота и качества получаемой от него продукции, работоспособности и гибелью до 10% заболевших животных.

Возбудитель — РНК-содержащий вирус, форма вирионов в виде пули или конуса (I. Ito et al., 1969, G. Lecatsas et al., 1969), размер его 70—80х140—170 нм, по морфологии сходен с возбудителем везикулярного стоматита, но его геном представлен двуспиральной РНК. Плотность вируса 1,196 г/мл, чувствителен к эфиру, хлороформу, трипсину, не стабилизируется двухвалентными катионами, к прогреванию при 50 °С устойчив, но при 56 °С разрушается за 10—30 мин, быстро погибает под действием ультрафиолетовых лучей, полностью за 10 мин инактивируется при рН ниже 2,5 и выше 12. Оптимальная зона рН 7,2—7,6 (W. Heusche, 1970). Нативный вируссодержащий материал инактивируется при 25 °С в течение 5 суток, при 37 °С—1—2 суток, при 4°С за 1—1,5 недели, при —20° С не рекомендуется сохранять его более 40 дней. Хорошо сохраняется вирус при температуре —70—80 °С и при +4 °С в лиофилизированном состоянии. Термостабильность вируса повышается при хранении в защитных средах: 0,5%-ном растворе гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса, растворе Хенкса, фосфатио-буферном растворе, содержащих 10% сыворотки крови и в пропорции 1 : 1 к вируссодержащей суспензии.

Вирус эфемерной лихорадки имеет антигены, вызывающие образование вируснейтрализующих, комплементсвязывающих антител, обнаруживаемых в сыворотке крови животных на 2—3-й неделе после заражения. Вируснейтрализующие антитела достигают пика у реконвалесцентов через 1—2 месяца после заражения и сохраняются более 400 дней (В. Н. Сюрин, 1979). Большинство исследователей считают, что вирус эфемерной лихорадки идентичен в антигенном отношении. Однако имеются сведения (Н. Standfast et al., 1973) о наличии в Австралии нескольких серотипов этого вируса. По данным японских исследователей, вирус антигенно родствен возбудителю катаральной лихорадки овец, способен размножаться в культурах клеток ВНК-21, HmLu-1, Hmt, Vero, а также в клетках БЭП. Оптимальная температура инкубации 30—34 °С. Вирус 2—3 пассажа на мышах-сосунах по сравнению с полевым быстрее адаптируется к культуре клеток (S. Tzipori, P. Spradbrow, 1974). ЦПД в культуре обычно проявляется на 3—5-й день инкубации на 2—3-м пассаже, а при последующих пассажах ЦПД обнаруживается через 36 ч. Полная деструкция клеток наступает на 4—5-е сутки при накоплении вируса до 106 ТЦДбо/мл- Иммунофлуоресценцией и электронной микроскопией вирус в культуре можно обнаружить через 24 ч после заражения.

При заражении в мозг 1—3-дневных мышат, крысят и хомячков вирус эфемерной лихорадки вызывает параличи, гибель их в 1-м пассаже (в 17% случаев) в среднем на 12-е сутки, на 3—8-м пассаже гибнут все животные в течение 3—5 суток после заражения. Имеются разноречивые данные и о восприимчивости молодых кроликов при заражении в мозг. Вирус поражает крупный рогатый скот, буйволов, яков, особенно восприимчив к нему хорошо упитанный скот в возрасте старше года. Заболевание неконтагиозное в отсутствии насекомых, его можно воспроизвести внутривенным заражением (Н. Standfast et al., 1973). Имеются сообщения о восприимчивости (без клинического проявления бо-лезни) к вирусу овец (W. Hall et al., 1975).

Эпизоотологические данные. В естественных условиях возбудитель болезни передается кровососущими насекомыми. Наиболее вероятным переносчиком считают комаров Culex annulirostis, Anopheles annulipes. Широта распространения болезни зависит от миграции животных, наличия и плотности переносчиков. Проявляется она в теплое влажное время года, в период биологической активности кровососущих насекомых. Так, в 1967—1968 гг. в Австралии болезнь распространилась за 6 недель на 2 тыс. км фронтом 500—800 км, следуя направлению господствующих ветров. Количество пораженных животных в стаде и стад в зонах может варьировать от 1—2 до 80% (Т. St. George et al., 1973), в отдельных случаях — до 100%, при этом следует учитывать, что определенная часть животных (до 50—75%) может переболевать инаппарантно.

Патогенез. Наиболее вероятное место размножения вируса в организме — эндотелий сосудов. Высокая концентрация его выявлена в лейкоцитах. Изменения в сосудах являются причиной воспалительных процессов, отеков, перерождения мышц, хромоты и парезов. У зараженных животных происходит иммунобиологическая перестройка организма, в сыворотке крови появляются противовирусные антитела. Нейтрализующие антитела в течение 6—7 месяцев обнаруживаются у телят, родившихся от иммунных коров. Длительность иммунитета варьирует у переболевших животных от нескольких месяцев до 1,5—2 лет.

Клинические признаки. Инкубационный период болезни 2—11 дней. Характеризуется она внезапным повышением температуры до 41—42 °С. Через 1—5 дней (чаще через 3) она понижается до нормальной, иногда через 1—5—7 дней возможны ремиссии. Болезнь проявляется угнетением, отсутствием аппетита, истечениями из глаз, носа и рта, чаще всего серозно-слизистого характера, сухостью зеркальца, помутнением роговицы (признак наблюдается редко), кашлем, учащенным дыханием, эмфиземой, иногда удушьем, вследствие чего животное чаще всего и гибнет, болезненностью связок, тугоподвижностью, перемежающейся хромотой, тремором мышц, прекращением жвачки, атонией и реже тимпанией, снижением удоя, иногда до полного прекращения, явлениями пареза и паралича мышц конечностей, туловища. Клинические признаки через 1—5 дней (чаще через 3) проходят. Болезнь протекает обычно остро, реже подостро, иногда и инаппарантно. Все клинические признаки (за исключением лихорадки) редко встречаются у одного животного, обычно они характерны в целом для стада.

Патологоанатомические изменения чаще локализуются в легких— кровоизлияния в слизистой оболочке верхних дыхательных путей, носовой полости, глотки, гортани, трахеи, губ, десен, иногда с образованием эрозий. Отмечают случаи пневмонии, серофибриноза, лимфаденита, полиартрита, тендовагинита, фасцита. Гистологическим исследованием устанавливают гиалиновое перерождение мышц пищевода, реже языка, в тканях легких — признаки эмфиземы, пневмонии; в лимфоузлах и селезенке — отложение гемосидерина.

Диагноз ставят с учетом клинических, эпизоотологических и патологоанатомических данных, результатов биопробы (при внутривенном введении) на иммунных и неиммунных животных (метод перекрестной иммунизации) или серологических исследовании по выявлению антител в РН и РСК. Вируснейтрализующие антитела обнаруживаются через 1—2 недели после заражения и сохраняются до 50 недель, максимальный титр их 1 : 1024. Комплементсвязывающие антитела выявляются через 2—3 недели, сохраняются до 9 недель, максимальный титр их 1 : 16. Используют также метод флуоресцирующих антител для обнаружения вируса в лейкоцитах больного скота, методы выделения возбудителя при внутримозговом заражении новорожденных мышей, хомяков, инокуляции культур клеток ВНК-21, Vero и др., и идентификации с использованием методов серологического анализа (МФА, РН,. РСК) и электронной микроскопии. Антигены для РСК получают экстракцией из мозга мышат с применением сахарозы, ацетона,, эфира, или из вируссодержащей культуральной жидкости, используя современные методы концентрирования. РН ставят с выделенным вирусом в культуре клеток или на 1—3-дневных мышатах. В качестве положительной используют сыворотку реконвалесцентов, полученную через 3—4 недели после переболевания, или сыворотку гипериммунизированных животных (G. Gombs, 1978).

Лучшим материалом для воспроизведения болезни является дефибринированная (встряхиванием) кровь, суспензия лейкоцитов; в качестве вируссодержащего материала может использоваться и 10%-ная суспензия тканей лимфоузлов и селезенки, взятых в период лихорадки.

При анализе эпизоотической ситуации проводят индикацию вируса в суспензии кровососущих насекомых посредством заражения новорожденных мышей, культур клеток или крупного рогатого скота, с последующей идентификацией возбудителя, однако индикация может быть успешной только при отлове значительного количества насекомых.

Эфемерную лихорадку следует дифференцировать от чумы крупного рогатого скота, ящура, злокачественной катаральной горячки, катаральной лихорадки овец и болезни Ибараки, вирусной диареи и комплекса респираторных инфекций крупного рогатого скота, вызываемых рино-, адено-, рото-, герпес-вирусами и другими возбудителями.

Профилактика и меры борьбы. Для специфической профилактики применяют сыворотки реконвалесцентов или гипериммунные сыворотки животных. Сыворотка в дозе 250 мл предохраняет животное от заражения. Имеющиеся живые культуральные вирус-вакцины и инактивированные, изготовленные из вируссодержащей крови, или из культуральной жидкости, обеспечивают иммунитет у вакцинированных животных в течение нескольких месяцев. Живые и убитые вакцины имеют свои преимущества и недостатки, которые детально обсуждены в специальной литературе (A. Del-la-Porta, W. Snowdori, 1979; S. Tzipori, P. Spardbrow, 1978; J. Fra-cis, 1977). В Японии наиболее удовлетворительные результаты получены при последовательном применении аттенуированной и инактивированной вакцин (J. Inaba et al., 1974).

К мерам профилактики и борьбы относятся также строгое соблюдение ветеринарно-санитарных правил содержания скота, своевременное проведение карантинно-ограничительных мероприятий и экспрессной диагностики, изоляция больных, ограничение ИХ миграции, профилактическая дезинсекция, уничтожение переносчиков в период эпизоотии и другие меры, препятствующие контакту восприимчивых животных с кровососущими насекомыми.

источник