Инструкция вакцина против энтерита гусей инструкция

Юрко Полина Сергеевна, м.н.с.; Белецкая Анна Васильевна, к.б.н.; Безрукавая Инна Юрьевна, к.в.н.; Грибкова Нина Павловна, зоотехник Институт птицеводства НААНУ, Украина

Разработана технология изготовления инактивированной вакцины против вирусного энтерита гусей (ВЭГ) и проведено сравнительное испытание двух схем вакцинации взрослых гусей инактивированной вакциной против вирусного энтерита Комбинированная иммунизация живой и инактивированной вакцинами родительского стада за 45 дней перед началом яйценоскости обеспечивает получение от них устойчивого к заболеванию потомства в течение 6 месяцев продуктивного периода. Лучшие результаты сероконверсии были получены при вакцинации живой и инактивированной вакцинами по сравнению с однократной иммунизацией инактивированной вакциной. Ключевые слова. Вирусный энтерит гусей, инактивированная вакцина, вакцинация, титры антител, гусята.

Вирусный энтерит гусей (ВЭГ, болезнь Держи, Enteritis viralis anserculorum) – острая контагиозная болезнь молодняка гусей и мускусных уток, которая характеризуется поражением печени, легких, катарально-геморрагическим воспалением кишечника и высокой летальностью гусят первых дней жизни [2].

Наиболее эффективным методом борьбы с вирусным энтеритом является вакцинация родительских стад, которая позволяет получать иммунный молодняк в течение продуктивного периода [5, 12].

В странах с развитым гусеводством созданы живые и инактивированные вакцины. Такие биопрепараты есть в Польше, Франции, Дании, Японии, России [3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11].

Несмотря на то, что во многих странах мира разработаны средства профилактики, вопрос контроля парвовирусной инфекции остается актуальным [12].

В Украине для профилактики вирусного энтерита до 1999 года применялись живые вакцины российского производства. В связи с усложнением эпизоотической ситуации по этому заболеванию с 1999 по 2001 гг. в Институте птицеводства НААНУ разработана живая вакцина против вирусного энтерита гусей из отечественного штамма BBS-99. После проведения испытаний в лабораторных и производственных условиях в 2003 году была утверждена научно-техническая документация ТУ У 24.4.00497169.694-2003. Вакцина прошла широкую производственную проверку в 38 хозяйствах 16 областей Украины на поголовье 1200 тыс. гусей. Двухразовая вакцинация живыми вакцинами обеспечивает получение устойчивых к вирусному энтериту гусят 3 – 3,5 месяца продуктивного периода [1]. Во многих хозяйствах разных форм собственности продуктивный период продолжается 5 – 6 месяцев, поэтому гусята последних выводов не защищены от инфекции. Известно, что более продолжительный иммунитет создают инактивированные вакцины. Разработка инактивированной вакцины позволит решить проблему получения устойчивого к вирусному энтериту молодняка гусей в течение 5 – 6 месяцев продуктивного периода родительского стада.

Ц ЕЛЬ ИСЛЕДОВАНИЙ
Разработка технологии изготовления инактивированной вакцины и схемы иммунизации родительского стада гусей.

М АТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали культуру клеток фибробластов эмбрионов гусей; вирулентный штамм ХМ-99, который депонирован в Государственном научно-контрольном институте биотехнологии и штаммов микроорганизмов и запатентован на территории Украины (патент № 84222); инактивант этиленимин (медный комплекс) производства института химической физики (г. Москва); адъювант «Монтанид ISA-70» фирмы SEPPIC производства Франции.

Для изготовления инактивированной вакцины использовали культуральную вируссодержащую жидкость, инактивированную 0,2% этиленимином при температуре + 370С в течение 24 часов. Инактивированный антиген объединяли с адъювантом в соотношении 30х70, согласно разработанному регламенту.

Контроль полноты инактивации вируса осуществляли путем проведения пяти последовательных пассажей на культуре клеток фибробластов эмбрионов гусей.

Контроль стерильности проводили согласно ГОСТ 4483-2005. Контроль безвредности — на клинически здоровых интактных гусятах суточного возраста, которым вводили по 1,0 см3 препарата внутримышечно.

Для определения эффективности инактивированной вакцины взрослых гусей иммунизировали перед началом продуктивного периода 2-мя разными схемами (табл.1). Уровень антител исследовали в реакции нейтрализации.

Табл. 1.Схемы вакцинации родительского стада гусей

За 45 суток до начала продуктивного периода

живая вакцина в дозе 105 ТЦД50 в
1 см3 внутримышечно

инактивированная вакцина в дозе
1 см3 внутримышечно

Через 14-21 суток после первой вакцинации

инактивированная вакцина в дозе
1 см3 внутримышечно

Гусят, полученных от вакцинированных родителей в течение продуктивного периода, инфицировали контрольным штаммом в дозе 1000 ЛД50 в 1 см3 в возрасте 5, 10, 15, 20 и 25 суток для установления коррелятивной связи между уровнем антител и устойчивостью к инфицированию.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИСЛЕДОВАНИЙ
Изготовлено 3 лабораторных серии инактивированной вакцины против вирусного энтерита гусей, которые прошли проверку в лабораторных условиях.

Две группы гусей были вакцинированы согласно указанных выше схем, с использованием одного из лабораторных образцов.

Согласно результатам, приведенным в таблице 2, применение инактивированной вакцины в двух схемах вакцинации позволяло поддерживать защитные титры антител (АТ) на уровне 6 log2 в течение 6 месяцев. Однако гуси, привитые комбинированной схемой, имели уровень антител более чем на 3 log2 выше, в отличие от гусей, вакцинированных только инактивированной вакциной.

Табл. 2 Титры АТ у гусей, вакцинированных двумя схемами.

источник

МИХАЙЛОВ АЛЕКСАНДР ОЛЕГОВИЧ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВИРУСНОГО ЭНТЕРИТА ГУСЕЙ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Работа выполнена в Государственном научном учреждении «Всероссийский научно исследовательский ветеринарный институт птицеводства» Российской сельскохозяйственной академии.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор ветеринарных наук, главный научный сотрудник Трефилов Борис Борисович ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор ветеринарных наук, профессор Придыбайло Николай Дмитриевич доктор ветеринарных наук Авилов Вячеслав Михайлович ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: ГНУ «Всероссийский научно исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.

Защита диссертации состоится «27» мая 2010 года в 11.00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.059.03 при ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» по адресу: 196084, Санкт-Петербург, ул.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины».

Автореферат разослан «27» апреля 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Белова Лариса Михайловна 1.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Одним из основных направлений национального проекта «Развитие АПК» является ускоренное развитие гусеводства, цель которого – увеличение производства мяса на 7%. «Отраслевая целевая программа развития птицеводства в Российской Федерации на 2005-2007 гг. и на период до 2010 года» предусматривает произвести к 2010 году 2,2 млн.т. мяса птицы, в том числе гусиного мяса до 5 тыс.т.

Серьезным препятствием на пути развития промышленного гусеводства наряду с факторами нарушения технологического режима выращивания являются различные инфекционные болезни молодняка, среди которых особое место занимает вирусный энтерит (парвовирусная инфекция) гусей. Это заболевание до настоящего времени имеет широкое распространение среди молодняка 1-30-суточного возраста, протекает остро и характеризуется высокой смертностью,достигая до 90-100% (В.В. Малушко, 1982;

С профилактической и терапевтической целью при вирусном энтерите гусей применяют цитратную кровь и сыворотку крови гусей – реконвалесцентов (Л.М.

Coudert M. et al, 1973), гипериммунную сыворотку млекопитающих ( В.В. Малушко с соавт., 1980;

А.Ф. Бондаренко, 1982) и гипериммунную гусиную сыворотку крови ( Б.Б. Трефилов, 2008;

Однако в комплексе мероприятий по предупреждению и ликвидации вирусного энтерита гусей (ВЭГ) важная роль отведена вакцинопрофилактике.

Несмотря на широкое применение вирусвакцины ВНИВИП сухой культуральной против ВЭГ в Российской Федерации и странах СНГ, проблема борьбы с этой болезнью остается весьма актуальной.

Исходя из изложенного, разработка высокоэффективной и технологичной инактивированной вакцины против ВЭГ, применяемой в условиях промышленного гусеводства, фермерских хозяйств и личного подворья – остается востребованной в связи с:

— отсутствием отечественного инактивированного вакцинного препарата против вирусного энтерита гусей;

— недостаточно длительным напряженным иммунитетом при применении живых вакцин против вирусного энтерита гусей;

— сокращением количества вакцинаций с целью уменьшения стрессов и нагрузки на иммунную систему;

— потребностью в вакцинном препарате, не содержащем живого вируса.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась разработка технологии изготовления инактивированной вакцины против вирусного энтерита гусей и изучение ее иммунобиологических характеристик.

Для достижения ее было необходимо решить следующие задачи:

— подобрать производственный штамм вируса энтерита гусей и изучить его биологические характеристики;

— изучить оптимальные системы культивирования вируса и его инактивацию;

— разработать компонентный состав инактивированной вакцины против вирусного энтерита гусей;

— изучить физические параметры и иммунобиологические свойства инактивированной вакцины;

— изучить динамику формирования поствакционального иммунитета у вакцинированных гусей.

Научная новизна. Впервые разработана отечественная инактивированная эмульсионная вакцина против вирусного энтерита гусей.

Отработана оптимальная схема получения вируссодержащего сырья из вакцинного производственного «клона 6» вируса энтерита гусей, депонированного в ФГУ ВГНКИ №71, патент РФ №1499917 «Штамм Goosa parvovirus для приготовления вакцинных препаратов против вирусного энтерита гусей», с использованием культуры клеток эмбрионов гусей.

Обоснованы режимы инактивации вируса энтерита гусей формальдегидом и димерэтиленимином. Изучена кинетика инактивации вируса.

Научно обоснован компонентный состав инактивированной сорбированной и эмульсионной вакцины, определены оптимальные соотношения антигена и адъювантов.

Доказана ее безвредность и высокая антигенность и способность индуцировать длительный поствакцинальный иммунитет у гусынь по сравнению с вирусвакциной ВНИВИП.

Практическая значимость работы. Полученные результаты исследований послужили основанием для разработки технологии изготовления инактивированной вакцины и подготовки нормативной документации на вакцину против вирусного энтерита гусей:

— «Стандарт организации на вакцину против вирусного энтерита гусей инактивированную эмульсионную» (проект).

— «Инструкция по применению вакцины против вирусного энтерита гусей инактивированной эмульсионной», временная утверждена директором ГНУ «ВНИВИП» Россельхозакадемии, 2010 года.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

Характеристика производственного вакцинного «клона 6» вируса энтерита гусей;

• Схема получения вируссодержащего сырья для изготовления инактивированной • вакцины;

Инактивация вируса энтерита гусей димерэтиленимином;

• Компонентный состав инактивированной сорбированной и эмульсионной вакцины;

• Физические и иммуногенные характеристики инактивированной вакцины против • вирусного энтерита гусей.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Методического совета отдела вирусологии, опухолевых болезней птиц и иммунофармакологии и Ученого совета ГНУ «ВНИВИП» (2006-2009), на Международных агропромышленных конгрессах (СПб, 2007,2009), Международных конференциях ВНАП (2009), науно-практической конференции 3-4 июня 2008 (СПб, г.Ломоносов, 2008).

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы выполнены совместно с ведущим научным сотрудником Никитиной Н.В., за что автор выражает ей сердечную благодарность.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных статей, в том числе одна работа в издании, рекомендованном ВАК РФ, уведомление о поступлении и регистрации заявки №2010100456 от 12.01.2010 г.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 109 страницах компьютерного текста и состоит из следующих разделов: обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения и список литературы, приложения. Диссертация иллюстрирована 12 таблицами, 6 рисунками.

Список использованной литературы включает 243 источника, из них 121 зарубежный.

2. Собственные исследования 2.1. Материалы и методы Работа выполнена в 2006-2009 гг. в соответствии с отраслевым планом НИР ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии по заданию 08.07.06.

В работе использовали следующие материалы:

Вирус, вакцина и диагностикум:

— производственный вакцинный «клон 6» парвовируса гусей, получен в ГНУ ВНИВИП (Штамм Goosa parvovirus для приготовления вакцинных препаратов против вирусного энтерита гусей, патент РФ №1499917.-1993).

Хранение матровой расплодки вируса осуществляли во флаконах при температуре минус 20°С и поддерживали в культуре клеток гусиных эмбрионов.

— вирусвакцина сухая культуральная ВНИВИП против вирусного энтерита гусей (СТО 00495674-0008-2008).

— набор для выявления антител к вирусу энтерита гусей иммуноферментным методом (ГНУ ВНИВИП), [ патент РФ №2323743 от 10.12.2007, RU].

Постановку ИФА и обработку результатов проводили согласно инструкции по применению и «Методическим указаниям для лабораторной диагностики вирусного энтерита (парвовирусной инфекции) гусей методом ИФА», 2005.

— яйца инкубационные гусиные 200 штук, ООО «Утиный бройлер»;

— гуси взрослые 100 голов ОАО «Утиный бройлер»;

— гуси родительское стадо ООО «Катайский гусекомплекс».

Культура клеток. Для проведения исследований была выбрана первично трипсинизированная культура клеток гусиных эмбрионов (КЭГ), которую готовили из кожно-мышечной ткани 14-15 – суточных гусиных эмбрионов по методике Dulbecco R. & Vogt M. (1954) в модификации Youngner J.S. (1954). В качестве ростовой питательной среды использовали среду Игла МЕМ и №199 в соотношении 2:1 с добавлением 10% нормальной сыворотки крупного рогатого скота, а также антибиотиков: пенициллина – 100 ЕД/см и стрептомицина – 100 мкг/см.

Раствор, использованный для диспергирования ткани, состоял из 0,25%-ного раствора трипсина, 0,02%-ного раствора версена и раствора Хенкса в соотношении 1:2:2.

Клеточную суспензию разливали в пробирки, матрасы и роллерные сосуды по 2, 250 и 500 см соответственно и инкубировали в термостате под углом

5 (пробирки) при температуре 37С, а баллоны на роллере. В течение 24-48 часов на поверхности стекла формировался клеточный монослой, пригодный для инфицирования.

Титрование вируса на культуре клеток по цитопатогенному действию (ЦПД) проводили в чувствительной культуре КЭГ методом десятикратных разведений и с соответствующими контролями. Из культуральной вируссодержащей жидкости готовили 10 кратные разведения 101108 на поддерживающей среде без добавления сыворотки.

Каждым разведением вируса заражали 4 пробирки с культурой КЭГ. Время контакта вируса с клеточным монослоем составляло 30 минут при комнатной температуре. Затем во все пробирки добавляли по 1,8 см3 поддерживающей среды Игла МЕМ. Зараженные и контрольные культуры инкубировали при температуре 37С. Ежедневно в течение 5-7 суток проводили учет ЦПД, выражая его по 4-крестовой системе.

Величину титра вычисляли по методу Reed L.J. & Muench (1938) и выражали в lg ТЦД50 в 1,0 см (тканевая цитопатогенная доза).

Проведение серологических исследований.

Реакция нейтрализации (РН). В основу РН брали стандартный, классический метод, описанный в руководствах по вирусологии.

РН ставили в культуре клеток со специфическими сыворотками, полученными от вакцинированных гусей.

1. Прямая РН с постоянной дозой гомологичной сыворотки и десятикратным разведением вируса (-вариант);

2. Прямая РН с постоянной дозой вируса 100 или 1000 ТЦД50 с двукратными разведениями гомологичной сыворотки (-вариант).

Для выявления в сыворотке крови специфических антител к ВЭГ и при оценке динамики поствакционального иммунитета, применяли иммуноферментный анализ (ИФА).

В исследованиях использовали диагностический набор производства ВНИВИП.

Постановку реакции осуществляли согласно инструкции по применению. Результаты реакции учитывали на иммуноферментном анализаторе «УНИПЛАН – 2000» при длине волны – 450 нм.

Культивирование вируса энтерита гусей. Процесс культивирования ВЭГ включал следующие этапы:

— выращивание культуры клеток гусиных эмбрионов в 1,5-литровых матрасах или 5 литровых роллерных сосудах;

— инфицирование культуры КЭГ вирусом энтерита;

— культивирование инфицированной культуры в стационарных условиях или на роллерах;

— микроскопия инфицированной культуры клеток;

— снятие матрасов или роллерных сосудов для замораживания при температуре минус (20±2)°С;

— трехкратное замораживание и оттаивание вируссодержащего материала (ВСМ);

— отбор проб для контроля на стерильность и инфекционную активность.

Из роллерных сосудов (матрасов) с плотным монослоем культуры КЭГ сливали ростовую среду и вносили ВСМ в поддерживающей среде pH 7,2-7,3 с множественностью заражения 0,1-1,0 ТЦД50/клетку. Инфицированную культуру культивировали в течение 3- суток при температуре (37±0,5)°С. При микроскопировании учитывали интенсивность проявления цитопатогенного действия вируса на клетки. При полной деструкции клеточного монослоя сосуды переносили в низкотемпературный холодильник (минус 20±2С°). Перед инактивацией ВСМ подвергали трехкратному замораживанию и оттаиванию.

Определение стирильности проводили в соответствии с ГОСТом 28085-90 «Препараты биологические. Методы бактериологического контроля стерильности» и согласно «Руководству МЭБ по стандартам для диагностических тестов и вакцин» на бактериальное загрязнение, исключение контаминации грибами и микоплазмами (Manual of Diagnostic Tests and Vaccine for Terrestrial Animals, 2004).

Проверку материалов на бактериальную контаминацию проводили путем высевов на питательные среды МПА, МПБ, Китт-Тароцци, а грибковую – на агар или бульон Сабуро.

О стерильности материалов судили по отсутствии роста микроорганизмов на этих питательных средах.

Инактивацию ВЭГ осуществляли путем добавления в ВСМ раствора формальдегида или димерэтиленимина в различных концентрациях при постоянном перемешивании на магнитной мешалке инкубированием при температуре (37,0±0,5)°С в течение 24 часов. Через каждые 6 часов инкубирования отбирали пробы для определения снижения титра и полноты инактивации вируса.

Полноту инактивации проверяли методом трехкратных «слепых» пассажей ВСМ в культуре КЭГ на питательной среде Игла МЕМ с 2% сывороткой крупного рогатого скота.

Отсутствие цитопатических изменений в культуре клеток в течение 5-7 суток подтверждает полноту инактивации ВЭГ.

Изготовление сорбированной формы инактивированной вакцины. Лабораторные образцы сорбированной вакцины против ВЭГ готовили с использованием 6% геля гидроокиси алюминия (ГОА), конечная концентрация составляла 0,2 и 0,3% в инактивированной вируссодержащей суспензии. ГОА добавляли при постоянном перемешивании на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 30 минут.

Изготовление эмульсионной формы инактивированной вакцины. При изготовлении лабораторных образцов инактивированной эмульсионной вакцины использовали масляный адъювант Montanide ISA 70 производства фирмы «SEPPIC», образующий эмульсию обратного типа. Инактивированный ВСМ и масло смешивали, в соотношении рекомендованном производителем адъюванта, на гомогенизаторе в течение 5-10 минут при скорости вращения винта 3000 оборотов/минуту и температуре 10С.

Готовые образцы инактивированной вакцины хранили при температуре +(2 – 8)С.

Контроль инактивированной вакцины против ВЭГ. Контроль сорбированной и эмульсионной форм инактивированной вакцины против ВЭГ осуществляли определением физических (кинетическая вязкость, стабильность эмульсии) и иммунобиологических свойств (стерильность, безвредность, антигенная и иммуногенная активность).

Определение типа вакцинной эмульсии осуществляли «капельным методом» (Stone H.D., 1997).

Стабильность эмульсии определяли центрифугированием при 3000 оборотов/минуту в течение 30 минут, методом «быстрого старения» в течение 14-суточной выдержки при температуре (37,5±0,5)С и экспресс-методом, при котором эмульсии выдерживали при температуре минус 20С в течение 1 часа, а затем при температуре (37,5±0,5)С в течение часа с последующей визуальной оценкой на предмет расслоения эмульсии.

Эмульсию считали стабильной, если после выше перечисленных испытаний в процессе визуального контроля не обнаружено никаких изменений содержимого во флаконе или высота столба прозрачной фракции, сформировавшейся в верхней части флакона, не превышала 10% от общей высоты столба эмульсии.

Кинематическую вязкость измеряли капиллярным вискозиметорм ВПЖ-2 и выражали в мм/сек. Определение вязкости проводили при температуре вакцины +20С, измеряя время истечения вакцины от первого до второго мениска с точностью 0,2 сек. Кинематическую вязкость вычисляли по формуле В = С·Г, где В – кинематическая вязкость, мм/сек;

С – постоянная вискозиметра;

Г – средняя арифметическая времени истечения вакцины, сек.

Гранулометрический состав вакцины определяли методом световой микроскопии.

Вакцину перед микроскопией разбавляли масляным адъювантом в соотношении 1:3, затем мкл препарата помещали под покровное стекло и исследовали под микроскопом.

Эмульсию считали хорошего качества, если в поле зрения микроскопа наблюдали равномерную мелкозернистую структуру.

Определение безвредности вакцины. Визуальную оценку степени поражения тканей в месте введения эмульсионной вакцины проводили через 28 и 42 сут после иммунизации в прививочной и пятикратной дозе вакцины по критериям, предложенным Stone H.D. (1991).

Определение антигенной и иммуногенной активности вакцины. Сущность метода заключалась в изучении способности вакцины индуцировать у вакцинированных гусей выработку специфических антител к инактивированному антигену, уровень которых определяли в PH или ИФА с применением диагностического набора ВНИВИП согласно «Методическим указаниям для лабораторной диагностики вирусного энтерита (парвовирусной инфекции) гусей методом иммуноферментного анализа», а иммуногенную активность — по результатам контрольного заражения гусят эпизоотическим штаммом П- вируса энтерита гусей.

Статистическая обработка результатов исследований.. При анализе и обобщении результатов исследований использовали статистические методы, описанные И.П.

Ашмариным с соавт. (1975) и компьютерную программу Microsoft Excel.

2.2. Результаты собственных исследований 2.2.1 Характеристика производственного вакцинного «клона 6» вируса энтерита гусей В разработке технологии изготовления инактивированной вакцины важное место занимает получение вирусного сырья, что, в свою очередь, зависит от выбора штамма вируса, обеспечивающего выработку напряженного и продолжительного иммунитета у вакцинированной птицы.

На первом этапе исследований нами проведена работа по изучению некоторых иммунобиологических параметров «клона 6», характеризующих как парвовирус гусей, и определению его стабильности в процессе лабораторных пассажей при изготовлении живой вирусвакцины.

На различных биологических моделях нами установлено, что вакцинный «клон 6» ДНК содержащий вирус, размер вирусной частицы составлял 19-22 nm, апатогенный для гусиных эмбрионов и суточных гусят, ареверсибельный, резистентный к воздействию эфира, хлороформа и нагреванию при температуре 60°С, генетически однородный (сформировывал мелкие однотипные бляшки под агаром), в культурах клеток вызывал острую форму вирусной инфекции и накапливался в высоких титрах (7,5±0,5) lg ТЦД50/см3. У гусей вызывал формирование напряженного иммунитета, обеспечивающего невосприимчивость гусят к заражению.

На основании полученных данных в качестве производственного штамма вируса энтерита гусей (ВЭГ) был выбран вакцинный «клон 6», депонированный во ФГУ ВГНКИ №71, который предложен для изготовления вирусвакцины против вирусного энтерита гусей (Б.Б.

Трефилов, 2000) 2.2.2 Разработка оптимальной схемы получения вирусного сырья Успех производства вакцины во многом обусловлен качеством исходного биологического сырья. Поэтому культивирование вируса является одним из основных этапов в технологии изготовления биопрепарата.

Главной задачей данного этапа работы было изыскание оптимального метода культивирования вируса, множественности инфицирования культуры КЭГ и времени накопления вируса.

С целью максимального накопления антигена были определены оптимальные условия репродукции вируса в стандартных, суспензионных и роллерных культурах при различных концентрациях клеток 1106 – 1,5106 см и множественности инокуляции. Результаты опытов представлены в табл. 2.2.2.

Данные, приведенные в табл. 2.2.2.1 показывают, что при роллерном способе культивирования, множественности заражения 1,0 ТЦД50/кл и концентрация 1,510 6 клеток в 1,0 см вирус накапливался в наибольшем титре (7,5±0,5 lg ТЦД50/см при P0,05).

Таблица 2.2.2. Результаты культивирования вируса при различной множественности инфицирования культуры и посевной концентрации клеток (время культивирования 96 часов) Метод Множественность Активность вируса, lg ТЦД50/см (M±m) культивирования заражения, При концентрации клеток в 1 см ТЦД50/клетку 1106 1, 0,01 2,5±0,25 3,75±0, Стационарный 0,1 4,3±0,5 4,5±0, 1,0 6,0±0,2 6,75±0, 0,01 4,75±0,3 5,3±0, Суспензионный 0,1 5,3±0,5 5,5±0, 1,0 6,1±0,1 6,8±0, 0,01 5,25±0,1 5,75±0, Роллерный 0,1 5,75±0,5 6,25±0, 1,0 6,75±0,75* 7,5±0,5* * Примечание: P0, Таким образом, для репродукции вакцинного «клона 6» ВЭГ, которого можно использовать для наработки вирусного сырья в больших количествах, культуру КЭГ культивировали в роллерных сосудах объемом 5,0 дм. В качестве ростовой среды использовали питательные среды Игла МЕМ или ДМЕМ и №199 в соотношении 2:1 с 10% сыворотки крупного рогатого скота (КРС).

Сосуды помещали в роллерный аппарат стеллажного типа при скорости вращения оборотов/час. Культуру клеток выращивали при температуре (37,5±0,5)С в течение 2-3 суток до формирования сплошного монослоя. Затем вносили вируссодержащий материал с множественностью инфицирования 0,1-1,0 ТЦД50/клетку и культивировали в тех же условиях до полной дегенерации клеточного монослоя (72-96 часов). Вируссодержащую суспензию трехкратно замораживали и оттаивали и определяли биологическую активность методом титрования в пробирочных культурах КЭГ.

На основании проведенных исследований определена оптимальная схема наработки вирусного сырья в культуре КЭГ с биологической активностью 7,5±0,5 lg ТЦД50/см, пригодного для изготовления инактивированной вакцины против ВЭГ.

2.2.3 Инактивация вируса энтерита гусей с использованием различных инактивантов После разработки оптимальной схемы получения высокоактивной вирусной биомассы проведена работа по выбору эффективного инактивирующего средства, его концентрации и оптимальных параметров инактивации, обеспечивающих полное подавление инфекционных свойств вируса при максимальном сохранении антигенных структур вирионов.

В опытах изучали инактивирующее действие формальдегида и димерэтиленимина (ДЭИ) на вирус энтерита гусей.

В экспериментах по инактивации вируса энтерита использовали вируссодержащую культуральную суспензию «клона 6» с инфекционным титром (7,5±0,5) lg ТЦД50/см.

Изучали воздействие формальдегида в конечных концентрациях 0,02;

Инактивацию проводили при температуре 37С в течение 24 часов при pH 7,4-7,6 в режиме постоянного перемешивания.

В процессе инактивации через 6, 12, 18 и 24 часов отбирали пробы вируссодержащей суспензии параллельно с контролем для определения биологической активности вируса в культуре КЭГ. По окончании времени инактивации остаточный формальдегид нейтрализовали 2М раствором тиосульфата натрия до конечной его концентрации 0,01-0, М/дм.

Снижение титра вируса после обработки выражали отношением Vt lg V, где o Vo – титр вируса до обработки;

V t – титр вируса после обработки в течение определенного времени. Константу скорости инактивации (lg К ин ) в соответствии с уравнением:

Vt kt lg V = 2,3, где o 2,3 – основание натуральных логарифмов;

t – время обработки вируса.

Полноту инактивации вируса определяли путем 3-кратных последовательных пассажей в культуре КЭГ.

Известно, что от правильного выбора режима инактивации зависит антигенная активность получаемого препарата. Поэтому при проведении опытов учитывали концентрацию инактиванта в ВСМ, pH суспензии, температуру и время экспозиции.

Полученные результаты представлены в табл. 2.2.3.2 и 2.2.3.3.

Таблица 2.2.3. Данные кинетики инактивации ВЭГ формальдегидом Значения V t /V 0, lg Концентрация Время экспозиции, ч инактиванта 6 12 18 0,02 0,81 0,72 0,49 0, 0,05 0,67 0,56 0,33 0, 0,1 0,55 0,49 0,16 0,2 0,32 0,26 0 Данные, приведенные в табл. 2.2.3.2. показывают, что формальдегид в зависимости от концентрации в вируссодержащей суспензии обладал различной степенью инактивирующим действием на вирус.

Так, инактивант в концентрации 0,1% инактивировал вирус через 24 часа, в то время как при содержании 0,2% препарата потеря его инфекционной активности наступала уже через 18 часов.

Vt Значения снижения активности вируса (lg V ) и константы его скорости инактивации o (lg K и н ) пропорционально уменьшались в зависимости от концентрации формальдегида и времени инактивации. При 24-часовой экспозиции они равнялись нулю, что подтверждает полную потерю инфекционной активности вирусом.

Таблица 2.2.3. Данные кинетики инактивации ВЭГ димерэтиленимином Vt Концентрация Значения V инактивации, lg ДЭИ,% o Время экспозиции, ч 6 12 18 0,02 0,9 0,8 0,62 0, 0,05 0,74 0,69 0,46 0, 0,1 0,55 0,5 0,39 0,2 0,46 0,33 0,23 Данные, приведенные в табл. 2.2.3.3 свидетельствуют о том, что скорость икативации вируса энтерита димерэтиленимином находилась в прямой зависимости от концентрации препарата и времени воздействия. При обработке инактивантом в 0,1%-ной концентрации вирус инактивировался через 24 часа.

Таким образом, полученные данные кинетики инактивации вируса энтерита гусей, обработанного формальдегидом и ДЭИ в различных концентрациях при температуре 37С, показали, что скорость инактивации вируса повышалась по мере увеличения концентрации препаратов в вируссодержащей суспензии и времени их воздействия.

Исследованиями ряда авторов показано, что производные класса азиридинов минимально изменяли, ответственные за антигенность, белковую структуру вириона, а антигены продолжительное время сохраняли свои свойства при хранении (А.Н. Куриленко с соавт.,1990;

Исходя из вышесказанного, в качестве инактиванта при изготовлении инактивированной вакцины против ВЭГ был использован димерэтиленимин в 0,1% концентрации при температуре 37С и экспозиции в течение 24 часа.

2.2.4. Выбор оптимального компонентного состава инактивированной вакцины против вирусного энтерита гусей Иммуногенная активность инактивированных противовирусных вакцин зависит от качества и количества основных компонентов препарата: антигенов и адъювантов.

Инактивированные антигены в сочетании с адъювантами обладают более выраженной иммуногенной активностью по сравнению с их водными растворами. В ветеринарной практике птицеводческой отрасли применяют две формы инактивированных вакцин:

сорбированную и эмульсионную. Для изготовления сорбированной формы использовали широко применяемый в производстве вакцин гель гидроокиси алюминия.

Многими исследованиями (В.А. Ирза, 2000;

И.А. Борисова, 2008) при испытании широкого спектра масляных адъювантов и эмульсий различных типов было показано, что вакцины против вирусных болезней птиц на основе масляного адъюванта Montanide ISA 70, образующего эмульсию обратного типа, имели наиболее оптимальные физические показатели и высокие иммунобиологические свойства.

Для изготовления эмульсионных вакцин в РФ используют масляные адъюванты, которые образуют с водными суспензиями антигена эмульсию обратного типа «вода/масло», которая вызывает у привитых птиц образование напряженного и продолжительного иммунитета.

В связи с этим при конструировании эмульсионной формы вакцины против вирусного энтерита гусей использовали масляный адъювант Montanide ISA 70 производства фирмы «SEPPIC» Франция.

При изготовлении обеих форм вакцины против ВЭГ использовали инактивированное ДЭИ вирусное сырье с биологической активностью 7,0-8,0 lg ТЦД 50 /см 3.

Сорбированную форму ГОА вакцины готовили при постоянном перемешивании инактивированного антигена и 0,2 и 0,3% конечной концентрации адъюванта на магнитной мешалке в течение 30 минут при комнатной температуре.

Эмульсионную форму вакцины готовили на гомогенизаторе в течение 5-10 минут при скорости вращения винта 3000 оборотов/минуту и температуре +100С. Соотношение антигена и адъюванта составило 30:70 соответственно (табл. 2.2.4.4).

Таблица 2.2.4. Компонентный состав сорбированной и эмульсионной форм инактивированной вакцины против ВЭГ.

Наименование форм Титр вируса до Соотношение, % вакцины инактивации, антигена адъюванта lg ТЦД50/см Сорбированная 7,5±0,5 остальное 0,2 и 0,3% ГОА вакцина Эмульсионная 7,5±0,5 20 вакцина 30 70* 40 * примечание : маслянный адьювант Montanide ISA 70.

Таким образом, установлено, что наиболее оптимальным процентным соотношением антигена к адъюванту в водной фазе эмульсионной вакцины должно быть 30 к 70 при активности вируса до инактивации 7,5±0,5 lg ТЦД50/см3. Инактивированные препараты, изготовленные в приведенных соотношениях, сохраняли антигенные и иммуногенные свойства.

2.2.5. Изучение физических свойств инактивированной эмульсионной вакцины в зависимости от продолжительности ее хранения Существенное значение в контроле эмульсионных вакцин имеют их физические свойства, такие как стабильность эмульсии, гранулометрический состав и кинематическая вязкость.

Нами были изучены физические свойства эмульсионной вакцины против ВЭГ после изготовления и в процессе хранения (6 месяцев) при указанной температуре: тип вакцинной эмульсии, ее стабильность, гранулометрический состав и кинематическая вязкость (табл.

Таблица 2.2.5. Физические свойства инактивированной эмульсионной вакцины против ВЭГ Срок хранения Вязкость, Стабильность эмульсии,% мм2/с цетрифугирование Экспресс Быстрое метод старение Свежеизготовленная 52,2 100 100 6 месяцев хранения 55,2 98,5 98,5 98, Данные, приведенные в табл. 2.2.5.5, показывают, что параметры физических свойств свежеприготовленной вакцины и через 6 месяцев хранения при температуре +(2 – 8) 0С существенно не изменились, что свидетельствует о высокой стабильности эмульсии в вакцине.

Результаты изучения гранулометрического состава вакцинной эмульсии до и после хранения в течение 6 месяцев с помощью световой микроскопии показали мелкозернистую равномерную структуру эмульсии (индекс гомогенности составил 0,94).

«Капельный метод» показал, что вакцинная эмульсия как до, так и после 6-месячного хранения представляла собой «обратный» тип, т.е. «вода-масло».

Таким образом, результаты исследований физических свойств образцов эмульсионной вакцины показали высокую стабильность и гомогенность вакцинной эмульсии.

При определении безвредности визуально оценивали степень поражения тканей в месте введения вакцины в 5-кратной вакцинальной дозе (2,5 см) по критериям, предложенным Stone H.D. (1997) для инактивированной вакцины против ньюкаслской болезни.

В наших опытах экспериментальные образцы вакцины не вызывали воспалительных реакций в месте введения препарата, что подтверждало его безвредность.

2.2.6. Изучение антигенных свойств инактивированной сорбированной и эмульсионной вакцины в зависимости от продолжительности ее хранения Важным показателем вакцин является их антигенная и протективная активность.

Оценку антигенных свойств обеих форм вакцины проводили на гусях 12 – и 24 – месячного возраста, которым подкожно в нижнюю треть шеи вводили в объеме 0,5 см свежеприготовленную и хранившуюся в течение 6 месяцев при температуре +(2-8)°С вакцину.

Через 28 и 42 суток после иммунизации от вакцинированных и контрольных гусей брали кровь с целью определения уровня антител в сыворотке крови в реакции нейтрализации и ИФА. Полученные результаты представлены в табл. 2.2.6.6.

Таблица 2.2.6. Уровень специфических антител в сыворотке крови вакцинированных против вирусного энтерита гусей инактивированной сорбированной и эмульсионной вакциной (n=5) Сроки после вакцинации, сутки №№ Наименование групп 28 п/п Уровень антител в сыворотки крови. (M±m) 9454 ±231 6136 ± 1 Гуси, привитые 7,3 7, сорбированной 0,2% ГОА вакциной 10789±72 6107± 2 Гуси, привитые 7,3 7, сорбированной 0,3% ГОА вакциной 14120±125 12060± 3 Гуси, привитые эмульсионной вакциной 9,0* 9,0* 5591±221 2089 ± 4 Гуси, привитые 6,3 6, инактивированным вирусом + физ.раствор (30:70) 1579±151 2884 ± 5 Гуси, привитые вирусвакциной 6,5 8, сухой культуральной ВНИВИП против ВЭГ 6 Невакцинированные гуси 248 ± 54 214 ± 3,0 3, Примечание: в числителе – титры антител в ИФА (значения обратные);

в знаменателе – титры вируснейтрализующих антител в РH, log 2 (P0,05)*.

Данные, приведенные в табл. 2.2.6.6, показывают, что сорбированная и эмульсионная формы инактивированной вакцины индуцируют образование специфических антител в высоких титрах. Однако эмульсионная вакцина вызывает образование антител в 1,5-2,0 раза больших титрах по сравнению сорбированной вакциной. Результаты реакции нейтрализации и ИФА значимо коррелировали.

Результаты изучения антигенной активности сорбированной и эмульсионной форм вакцины через 6 месяцев хранения представлены в табл. 2.2.6.7.

Таблица 2.2.6. Титр специфических антител в сыворотке крови гусей, вакцинированных сорбированной и эмульсионной вакциной после 6-месячного хранения Сроки после вакцинации Наименование групп 10 20 30 Уровень антител в ИФА, значения обратные (M ±m) Гуси, привитые ГОА — 0.3% 5483±127 6107±231 4894±187 3517± вакциной Гуси, привитые эмульсионной 2700±83 2810±172 3222±121 3775± вакциной Невакцинированные гуси 300±25 300±25 300±25 300± Данные серологических исследований сыворотки крови вакцинированных гусей, приведенные в табл. 2.2.6.7, свидетельствуют о том, что хранение обеих форм инактивированной вакцины против ВЭГ в течение 6 месяцев при температуре +(2-8)°С не привело к существенному снижению антигенной активности препаратов. Отмечено, что сорбированная ГОА вакцина индуцирует выработку антител в максимальных титрах в течение 10-20 сут после иммунизации, а затем они уменьшаются. Эмульсионная вакцина инициирует нарастание титров антител в течение 30-60 сут, оставаясь на этом уровне продолжительное время.

2.2.7. Изучение динамики формирования поствакционального иммунитета у гусей, иммунизированных сорбированной и эмульсионной вакциной против вирусного энтерита О времени появления специфических антител в крови вакцинированной птицы инактивированными вакцинами мнения исследователей разноречивы.

Формирование поствакционального иммунитета у гусей родительского стада изучали после однократного применения инактивированной сорбированной и эмульсионной вакцины в объеме 0,5 см в условиях вивария института. Опыты показали, что обе вакцины в испытанных дозах не вызывали местных воспалительных и общих реакций. Данные сероконверсии у гусей представлены в табл.2.2.7.8.

Данные, приведенные в табл. 2.2.7.8 свидетельствуют о том, что в организме вакцинированных гусей наступала выраженная сероконверсия. Так, у гусей, иммунизированных сорбированной ГОА вакциной она была регистрирована к 10 сут в 2 раза выше, чем у птицы, вакцинированной эмульсионной вакциной (табл. 2.2.6.7). Титры антител достигали максимальной величины на 30 сут у привитых гусей. После этого уровень антител в сыворотке крови вакцинированных сорбированной вакциной гусей, начиная с 30 сут по сут снижался на 15-18%, хотя он оставался высоким в течение 7 месяцев (срок наблюдения).

У гусей, привитых инактивированной эмульсионной вакциной, титры антител были максимальными в течение 5 месяцев, а через 6 месяцев после иммунизации они уменьшались на 23%. В то же время уровень специфических антител превышал в 2,5-3,0 раза уровня антител в сыворотке крови гусей, привитых как сорбированной, так и аттенуированной вирусвакциной ВНИВИП против вирусного энтерита гусей в течение месяцев (срок наблюдения).

От вакцинированных гусынь получали инкубационные яйца, в их желтке и в сыворотке крови суточных гусят определяли уровень материнских антител в реакции нейтрализации.

Опыты показали, что титры антител в желтке были в пределах 7,0 и 9,0 log2, а в сыворотке крови суточных гусят — 7,0 и 8,0 log2 через 30 и 90 сут после иммунизации гусынь соответственно.

При контрольном заражении 2-суточных гусят полученных от вакцинированных гусей через 30 и 180 сут после иммунизации, эпизоотическим штаммом П-75 в дозе 1000 ЛД гусята не заболели, коэффициент корреляции равнялся r = — 1,0, что указывает на хорошую их защиту и свидетельствует о том, что инактивированная вакцина вызывает иммунологическую перестройку в организме гусынь, а материнские антитела передаются трансовариально потомству, обеспечивая устойчивость гусят к инфицированию полевым вирусом энтерита гусей.

Таким образом, испытанные инактивированные как сорбированная, так и эмульсионная формы вакцины против вирусного энтерита индуцировали напряженный поствакцинальный иммунитет у вакцинированных гусей продолжительностью в течение репродуктивного периода.

Таблица 2.2.7. Титр специфических антител у вакцинированных против вирусного энтерита гусей инактивированной сорбированной и эмульсионной формами вакцины Титры антител в ИФА, значения обратные (M±m) Наименование групп Сроки после вакцинации, сут 30 60 90 120 150 180 Гуси, привитые ГОА – 0,2% вакциной 7550±342 3905±115 3064±107 3025±105 2569±47 2492±136 2309± Гуси, привитые ГОА – 0,3% вакциной 8448±276 4894±225 3652±152 3500±121 2990±85 3325±145 4076± Гуси, привитые эмульсионной вакциной 12710±321 13028±325 14016±243 11799±136 11105±124 8539±137 8519± Гуси, привитые вирусвакциной сухой 1579±127 2175±253 2325±178 2852±175 2808±127 512±38 128± культуральной ВНИВИП против ВЭГ Гуси, привитые инактивированным 4501±223 1936±56 1774±96 1425±101 1357±104 1100±57 679± вирусом + физ. раствор (30:70) Невакцинированные гуси 247±27 247±27 247±27 247±27 297±53 247±27 247± 3. Выводы 1. Разработана технология изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против вирусного энтерита гусей. Вакцина предназначена для специфической профилактики болезни в стационарно неблагополучных гусеводческих комплексах и фермерских хозяйствах.

2. В качестве производственного штамма предложен вакцинный «клон 6», который по основным генетическим маркерам (морфологической и антигенной структуре и биологическим свойствам) соответствует эталонным штаммам парвовируса гусей, он апатогенен для гусят, ареверсибелен и обладает выраженной антигенной и иммуногенной активностью.

3. Вакцинный «клон 6» способен к репродукции в культуре клеток гусиных эмбрионов и при крупномасштабном культивировании накапливается в высоких титрах (7,5 8,0 lg ТЦД50/см3), необходимых для изготовления инактивированной вакцины.

4. Изучена кинетика полной инактивации вируса энтерита гусей формальдегидом и ДЭИ и определены оптимальные параметры процесса инактивации (конечная концентрация инактиванта в ВСМ 0,1%, время экспозиции 24 часа при температуре 37±0,5°С).

5. Изготовлены и испытаны сорбированная и эмульсионная формы инактивированной вакцины. Показана их высокая антигенность и иммуногенная активность.

Эмульсионная вакцина по иммунобиологическим показателям и продолжительности иммунитета признана наиболее перспективной.

6. Установлено оптимальное соотношение антигена в водной фазе вакцины с маслянным адъювантом Montanide ISA 70 (30:70) с биологической активностью вируса до инактивации не ниже 7,5 log ТЦД50/см3.

7. Экспериментально показано, что эмульсионная инактивированная вакцина по антигенной и иммуногенной активности и продолжительности иммунитета значительно превосходит вирусвакцину сухую культуральную ВНИВИП против вирусного энтерита гусей.

8. Инактивированная эмульсионная вакцина против вирусного энтерита гусей безвредна при однократном парэнтеральном применении и индуцирует формирование поствакционального напряженного иммунитета у гусей, вызывая иммунологическую перестройку на весь репродуктивный период.

4. Практические предложения 1. Результаты научных исследований по разработке технологии изготовления инактивированной вакцины и ее лабораторных испытаний войдут в нормативную документацию на новый вакцинный препарат:

— СТО на инактивированную эмульсионную вакцину против вирусного энтерита гусей (проект);

— инструкция по применению инактивированной вакцины против вирусного энтерита гусей, рассмотрена на Ученом совете ГНУ «ВНИВИП» Россельхозакадемии и утверждена директором.

2. Материалы, изложенные в диссертации, используются в учебном процессе на курсах повышения квалификации ветеринарных специалистов, работающих в области промышленного птицеводства.

5. Список опубликованных работ по теме диссертации Статья в журнале, рекомендованном ВАК Минобразования и науки РФ:

1. Чувствительность парвовируса гусей к формальдегиду и димерэтиленимину / Михайлов А.О. // Вопр. нормативно-правового регулирования в ветеринарии. СПб,2009.-№4.-С.104-106.

Статьи, опубликованные в сборниках материалов различных конференций:

2. Вирусный энтерит гусей (диагностика и профилактика) / Трефилов Б.Б., Михайлов А.О., Никитина Н.В. // Актуал. пробл. вет. мед.: научно-практич. конгресс 24- августа.-СПб, 2007.-С.211-213.

3. Основы профилактики вирусного энтерита (парвовирусной инфекции) гусей / Трефилов Б.Б., Никитина Н.В., Михайлов А.О. // Новое в диагн. и профил. болезней птиц:

матер. Научно-практ. конф. 3-4 июня 2008.-СПб, г.Ломоносов, 2008.-С.87-93.

4. Генетические маркеры вакцинного клона парвовируса гусей / Трефилов Б.Б., Михайлов А.О. // Достиж. в соврем. птицеводстве: исследования и инновации: матер. XVI конф.-Сергиев Посад, 2009.-С.400-402.

5. Усовершенствование средств специфической профилактики парвовирусной инфекции гусей / Трефилов Б.Б., Никитина Н.В., Михайлов А.О. //Матер. Междунар.

источник

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к производству вакцин для специфической профилактики вирусного энтерита гусей, а также к способу профилактики этого заболевания. Вакцина содержит культуральную жидкость, штамм вируса Goosa parvovirus ВГНКИ N71 с биологической активностью 10 6,0 -10 7,0 ТЦД 50 и защитную среду высушивания при соотношении культуральной жидкости и защитной среды 1:1 — 1,0:1,5. Способ профилактики заболевания предусматривает введение предлагаемой вакцины гусятам 1 — 2-суточного возраста в дозе 50 — 70 тыс. ТЦД 50 в 0,50 — 0,75 см 3 или взрослым гусям двукратно, за 50 — 30 сут до начала яйцекладки в дозе 75 — 100 тыс. ТЦД 50 в 0,75 — 1,00 см 3 . 2 с. и 5 з.п. ф-лы, 6 табл.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к производству вакцин для специфической профилактики вирусного энтерита гусей, а также к профилактике и лечению этого заболевания.

Вирусный энтерит — острая контагиозная болезнь молодняка гусей, характеризующаяся поражением желудочно-кишечного тракта, печени, сердца, поджелудочной железы и других паренхиматозных органов и сопровождается высокой смертностью (от 30 до 100%). Возбудителем болезни является парвовирус гусей. Болезнь широко распространена в европейских странах (ФРГ, Франция, Англия, Венгрия, Чехословакия, Нидерланды) и на других континентах. В РФ она зарегистрирована во многих хозяйствах различных зон. Экономический ущерб достигает от 25 до 100 тыс. руб. и более из расчета на одно хозяйство. Наиболее эффективным способом борьбы против вирусного энтерита гусей является вакцинопрофилактика.

Известна вакцина для иммунизации птиц против гусиного гепатита (1), однако она содержит патогенный вирус и вводят ее малочувствительной птице в возрасте старше 4 недель.

Известна вакцина против вирусного заболевания гусят, вызываемого парвовирусом, и способ ее получения (2), однако использование в ее составе инактивированного бета-пропиолактоном патогенного вируса не исключает возможности реактивации.

Известна вакцина против парвовирусного заболевания гусей, изготовленная из ослабленного живого вируса, полученного путем аттенуации в культуре клеток гусиных эмбрионов (3). Недостатками этой вакцины являются применение ее гусятам не моложе 20-суточного возраста и недостаточно высокий для создания надежного иммунитета титр в логарифмах ТЦД 50 . Кроме того, используемый штамм недостаточно полно соответствует в антигенном отношении штаммам вирусного энтерита гусей, циркулирующим в птицехозяйствах нашей страны.

Целью изобретения является повышение эффективности профилактики, безвредности, антигенной активности, длительности хранения и технологичности вакцины и, в результате этого, — повышение выводимости и сохранности гусят.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве антигена используют живую культуру Goosa parvovirus клон 6 с биологической активностью 10 5,5 — 10 6,5 ТЦД 50 в культуральной жидкости из сыворотки крови крупного рогатого скота (5,0 — 10,0%) и среды N 199 (остальное) защитной среды высушивания при соотношении компонентов 1: 1-1: 1,5, в качестве стерилизующей добавки используют антибиотики в количестве на 1 мл вакцины:
пенициллин — 100 — 150 ед/мл
стрептомицин — 100 — 150 мкг/мл
При этом в качестве среды высушивания используют сухое обезжиренное молоко или композицию следующего состава, вес.ч.:
пептон — 1,5 — 4,5
желатина — 0,5 — 2,5
сахароза — 0,5 — 2,5
вода — остальное.

Применяют вакцину гусятам 1 — 2-суточного возраста в дозе 50 тыс. ТЦД 50 в 0,5-0,75 см 3 , взрослым гусятам — двукратно, за 50 и 30 суток до начала яйцекладки в дозе 75 — 100 тыс. ТЦД 50 в 0,75-1,0 см 3 .

Вакцинный клон 6 получен из эпизоотического штамма П-75 парвовируса гусей путем клонирования в культуре клеток гусиных эмбрионов под агаровым покрытием при температуре 37,0 — 37,5 o C. Клон 6 депонирован в коллекции ВГНКИ ветпрепаратов (рег. N авт. св. N 1499917.

Клон 6 относится по основным классификационным физико-химическим свойствам к семейству Parvoviridae, рода Parvovirus, т.е. обладает следующими маркерами:
Морфологические признаки: содержит в своем составе ДНК, имеет кубическую форму, его величина — 202 нм.

Физико-химические свойства: устойчив к хлороформу, эфиру, нагреванию при температуре 60 o C в течение 1 часа. Срок хранения составляет более 2 лет при температуре — 20 — +4 o C в виде лиофилизированной в ампулах вируссодержащей суспензии на среде N 199 со средой защиты.

Биологические свойства: культивируется в первичной культуре клеток эмбрионов гусей, мускусных уток, требует освежения один раз в двенадцать месяцев, апатогенен для млекопитающих и птиц.

Антигенные свойства: на введение гусятам, цыплятам, кроликам и козам синтезируются вируснейтрализующие антитела в титрах 7,0 — 10,0 loga.

Иммуногенные свойства: иммунизирующая доза клона равна 10 3 -10 5 ТЦД 50 .

Реактогенные свойства: при введении гусятам 1 — 6-суточного возраста вируса клона 6 в дозах 10 6 -310 6 ТЦД 50 клинических проявлений заболевания не отмечается.

Контаминация: лиофилизированная культуральная вируссодержащая жидкость не содержит бактерий, грибов, микоплазм и чужеродных вирусов.

Данные по обработке оптимальных технологических параметров вакцины приведены в таблицах 1 — 4.

Из приведенных в таблице 1 данных следует, что наиболее приемлемыми уровнями активности антигенной составляющей вакцины являются уровни от 10 6 ТЦД 50 до 10 7,0 ТЦД 5 . При этом расход эмбрионов сравнительно невелик, срок хранения вакцины — 1 — 2 года, количество доз в 1 см 3 — от 10 до 100, однако уровень активности 10 7,0 трудно и редко достижим.

Активность антигена ниже 10 6,0 вызывает резкое, в 1,5 — 10,0 раз увеличение расхода эмбрионов при низкой активности конечного продукта (1 — 3 дозы в 1 мл).

Из данных таблицы 2 следует, что оптимальными пределами концентрации сыворотки крови крупного рогатого скота являются 5 — 10%, т.к. при меньшей концентрации не формируется качественный монослой клеточной культуры, а при большей концентрации наблюдается его дегенерация за счет токсического воздействия продуктов жизнедеятельности избыточного количества клеток.

Данные таблицы 3 свидетельствуют о том, что приемлемыми дозировками антибиотиков в вакцине являются дозы 100 — 150 ЕД/мл пенициллина и 100 — 150 мкг/мл стрептомицина, причем оптимальным является нижний предел, дающий надежную защиту от контаминации, а верхний — избыточен и влечет неоправданный перерасход антибиотиков.

Из данных таблицы 4 следует, что оптимальными соотношениями вируса и защитной среды в вакцине являются 1:1 — 1:1,5, т.к. при большем содержании защитной среды снижается активность вакцины и вырабатывается недостаточный для защиты от заболевания иммунитет. Изменение соотношения вируса и защитной среды в сторону увеличения количества вируса влечет за собой сокращение срока хранения вакцины, перерасход вируса и поствакцинальные осложнения у привитой птицы.

Содержание и количественное соотношение ингредиентов в защитной среде диктуется ее функциональными особенностями. Снижение значений ингредиентов ниже минимальных ухудшает защитные свойства среды — снижает срок хранения, а увеличение свыше максимальных — удлиняет срок сушки и тем самым снижает иммуногенность вакцины.

Повышение содержания в композиции свыше 2,5 вес.ч. вызывает повышение вязкости композиции и в результате — плохую растворимость.

Увеличение в композиции количества сахарозы и желатины свыше предельных значений влечет за собой неоднородность среды, расслоение и, как результат, снижение срока годности вакцины.

Применение вакцины в практике птицеводства.

Вакцину разводят стерильным физиологическим раствором с таким расчетом, чтобы одна вакцинальная доза равнялась 10 5 ТЦД 50 в объеме 1,0 см 3 . Вакцинируют гусей родительского стада за 50 сут до начала яйцекладки двукратно с интервалом в 20 сут в объеме 1,0 см 3 , гусят 1-2-суточного возраста — в объеме 0,5 см 3 , а гусят 10-15-суточного возраста — в объеме 1,0 см 3 внутримышечно.

Испытание иммуногенности культуральной вирусвакцины против вирусного энтерита гусей методом прямого заражения патогенным штаммом парвовируса в лабораторных условиях показало, что через 10 сут после вакцинации при заражении патогенным штаммом 10 вакцинированных в 2-суточном возрасте гусят не заболело, а из 10 невакцинированных гусят заболело 10/100%/ и пало 4/40%/. Все невакцинированные и незараженные гусята /чистый контроль/ оставались клинически здоровыми.

У вакцинированных гусей в стационарно неблагополучном хозяйстве значительно повышается уровень вируснейтрализующих антител, выводимость, сохранность и устойчивость гусят к заражению /таблица 5/.

Результаты испытания вирусвакцины в неблагополучном хозяйстве, при острой вспышке вирусного энтерита гусей, представлены в таблице 6.

Предложенная вакцина имеет следующие преимущества перед прототипом:
— основана на живом аттенуированном штамме вирусного энтерита гусей П-75, клон 6 и, в силу этого, безвредна для гусят любого возраста, обладает высокой 5,5 ТЦД 50 антигенной активностью и соответствует в антигенном отношении штаммам вирусного энтерита, циркулирующим в птицехозяйствах страны;
— вакцина создает напряженный иммунитет у гусят и гусей родительского стада, определяемый повышением уровня вируснейтрализующих антител до 10 log 2 и устойчивостью к прямому заражению вирулентным вирусом вакцинированных гусят и гусят, полученных от вакцинированных гусей родительского стада;
— выводимость гусят из яиц вакцинированных гусей выше на 6 — 8%, чем от невакцинированных птиц;
— сохранность вакцинированных гусят и гусят, полученных от иммунизированных гусей, значительно повышается и зависит от эпизоотической ситуации хозяйства.

Предложенная вакцина апробирована с положительным результатом в лабораторных условиях и в широком производственном опыте в хозяйствах с различной эпизоотической ситуацией на 25 тыс. птицах в период с 1990 по 1989 г.г.

Применение вакцины увеличивает сохранность гусят, полученных от вакцинированных гусей, на 14 — 46% и более.

1. Патент Франции N 2143588.

2. Патент Франции N 7406981.

3. Патент Венгрии N 171519, кл. C 12 K 9/00, 1981.

4. Parvovirus diasease or Derzy»s gosling and wild duck disease living virus vaccine, Hockstra»s derivat.

Вакцина против вирусного энтерита гусей, содержащая культуральную жидкость с антигеном живой культуры Goosa parvovirus и защитную среду высушивания, отличающаяся тем, что в качестве антигена она содержит штамм вируса Goosa parvovirus ВГНКИ N 71 с биологической активностью 10 6,0 — 10 7,0 ТЦД 50 , а в качестве культуральной жидкости — сыворотку крови крупного рогатого скота и среду N 199 при следующем соотношении компонентов, мас.%
Сыворотка крови крупного рогатого скота — 5,0 — 10,0
Среда N 199 — Остальное
причем соотношение культуральной жидкости и защитной среды составляет 1 : 1 — 1,0 : 1,5.

2. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что в качестве защитной среды она содержит сухое обезжиренное молоко.

3. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что в качестве защитной среды она содержит, мас.%
Пептон — 1,5 — 4,5
Желатин — 0,5 — 2,5
Сахароза — 0,5 — 2,5
Вода — Остальное
4. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит антибиотики на 1 мл вакцины:
Пенициллин, ED — 100 — 150
Стрептомицин, мг — 100 — 150
5. Способ профилактики вирусного энтерита гусей, включающий введение гусям вакцины из культуральной жидкости с антигеном живой культуры Goosa parvovirus и защитной среды высушивания, отличающийся тем, что вакцину гусям вводят в дозе 50 — 100 тыс. ТЦД 50 в 0,50 — 1,00 см 3 , в качестве антигена используют штамм вируса Goosa parvovirus ВГНКИ N 71 с биологической активностью 10 6,0 — 10 7,0 ТЦД 50 , а в качестве культуральной жидкости — сыворотку крови крупного рогатого скота и среду N 199 при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Сыворотка крови крупного рогатого скота — 5,0 — 10,0
Среда N 199 — Остальное
причем соотношение культуральной жидкости и защитной среды составляет 1 : 1 — 1,0 : 1,5.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что вакцину вводят гусятам 1 — 2-суточного возраста.

7. Способ по п.5, отличающийся тем, что вакцину вводят взрослым гусям двукратно, за 50 и 30 суток до начала яйцекладки.

источник

Энтерит гусей — летальная болезнь гусят первых дней жизни, неоднородной этиологии, так как различают энтерит, вызванный парво — и реовирусами. Болезнь распространена во всех европейских странах, в том числе и бывшем СССР. Болезнь вызывает гибель 30—90 % заболевших гусят. Ее впервые описал Поланд в 1962 г. Шетлер (1971 г.) выделил вирус от гусят. Впоследствии достаточно подробно описали вирус и заболевание Держи и др. (1975 г.).

В настоящее время известно более 20 штаммов, которые по биологическим свойствам на КЭ и гусиных эмбрионах разделены на две группы. Физико-химические свойства штаммов изучены недостаточно, что затрудняет разработку средств специфической профилактики.

Основные признаки заболевания — отказ от корма, малоподвижность, водянистая диарея и быстрое истощение. Наблюдают слизистые истечения из ротовой полости и носа, дрожь, клинические судороги, конвульсии, поворачивание головы, паралич ног и респираторные явления, асцит, выпадение пуха. В начале энзоотии наблюдаются различные по степени застойные и дистрофические изменения печени, почек, миокарда и катарально-геморрагический или фибринозный энтерит.

При инфекции, вызванной парвовирусами, отмечена возрастная резистентность. Однодневные гусята высокочувствительны к вирусу. На 4-й день после заражения исчезает аппетит, многие перестают пить, слабеют и в течение нескольких дней (чаще на 6—7-й день после заражения) погибают. Восьмидневные гусята реагируют на заражение также. Четырех недельные гусята при внутримышечном или контактном заражении, как правило, не заболевают. У многих больных гусят на шее, крыльях и спине отмечают посинение кожи, выпадает пух. В дальнейшем развивается конъюнктивит, появляются истечения из носа. Фибринозный налет, образующийся в области хоан, закупоривает носовые отверстия. Такой же налет можно обнаружить на языке. Испражнения белые, слизистые.

При вскрытии отмечают резкое увеличение печени, в брюшной полости находят янтарно-желтую мутную жидкость, сильное поражение органов дыхания грибами: воздухоносные мешки и легкие усеяны темными узелками величиной с горошину. На поверхности печени находят небольшие геморрагии, вакуолизирующую дегенерацию гепатоцитов; ткань вокруг капиляров печени некротизирована, в ядрах клеток Купфера видно скопление хроматина, представляющее картину ядерных телец-включений.

Болезнь, вызванная вирусом beta из группы парвовирусов поражает молодняк и протекает в виде септицемии. У гусят в возрасте 1 —4 недели она характеризуется пе-ченочно-почечным синдромом. У гусят в возрасте от 4 недель до 3 месяцев болезнь протекает остро и подостро. Из печени гусят в культуре клеток гусиного эмбриона удается выделить вирус.

Вирион диаметром около 50 нм содержит однонитевую ДНК, резистентен к жиро-растворителям. Репродукция вируса подавляется 5-йод-дезоксиуридином. Размер вирионов вируса beta 30—50 нм, частицы имеют кубическую симметрию. Вирус beta отнесен к парвовирусам. В градиенте CsCi формировалось два пика. Первый пик располагался на верхней границе нижней трети градиента в зоне плотности 1,398 г/см3, а второй — у верхней границы средней трети градиента в зоне плотности 1,260 г/см3. Инфекционная активность вируса локализовалась в первом пике и достигала титра 6 lg. Во второй зоне и в средней зоне между пиками титр вируса был ниже 1 lg. При электронной микроскопии вируса в его популяции выявляются полные и пустые вирионы. Суперкапсидная оболочка у всех вирионов отсутствует. Очертания вируса круглые или 6-угольные, что свидетельствует о кубическом типе симметрии. Толщина капсомерного слоя пустых вирионов равна 2 нм. Диаметр вирионов 20±2 нм.

Вирус устойчив к эфиру, хлороформу, фреону 113, фенолу, гидроксиламину, трипсину, додецилсульфату натрия и пентану; инактивируется при 50 ° С в течение 30 мин. Влияние некоторых физико-химических факторов на выживание вируса энтенрита гусят представлено в табл. 15.2.

Преципитирующие AT обнаружить не удается. Зараженные птицы содержат вирусспецифические AT, определяемые в непрямом тесте ИФ. Вирус не имеет общего группоспецифическогоАГс вирусами инфекционного бронхита, НБ и другими вирусами и не нейтрализуется гипериммунными сыворотками к чуме уток. Сравнены неструктурные белки Rep78 зависящего от помощника аденоассоциированного вируса типа 2 и Repl родственного автономного парвовируса гусей. Белки Rep78 и Repl имеют несколько общих биохимических свойств: 1) с высоким сродством связываются с последовательностями, образующими минимальную область начала репликации ДНК on; 2) бладают НТФ-зависимой ДНК-геликазной активностью; 3) вызывают специфичную для оп репликацию линейной двунитевой ДНК Определена последовательность минимальной области оп парвовируса гусей длиной 38 н. В связывании с ДНК и в репликации Rep78 и Repl проявляют высокую специфичность в отношении собственных оп, хотя сайты связывания с ДНК у них очень похожи.

Таблица 15.2 Влияние Физико—Химических Факторов на выживание вируса энтерита гусят

Титр Вируса ТЦД5о/мл

До обработки после обработки

Прогревание при 56 °С 60 мин Обработка хлороформом 1 ч Обработка дезоксихолатом натрия

В экстракте клеток, не зараженных аденовирусом, репликация, зависящая от минимальной области оп, имеет низкую процессивность в случае Rep78 и очень процессивна в случае Repl.

Экспериментальная инфекция. Удается на гусятах 1—7-дневного возраста. Вирус хорошо размножается в гусиных эмбрионах, которые погибают при любом способе заражения (в желточный мешок, в аллантоисную полость) в течение 15 дней после заражения. Специфический АГ можно обнаружить прямым методом ИФ у ограниченного количества выживших эмбрионов. Эмбрионы, зараженные на ХАО, погибают через 5—7 дней. Изменений в оболочке не бывает. В утиных и куриных эмбрионах вирус не размножается. Культуральный вирус патогенен для гусят при внутримышечном способе заражения.

Вирус beta выделен от больной птицы в культуре гусиных фибробластов, где он на 4—5-й день вызывал появление гранулярных зон и детрита. Его удавалось пассировать в культуре эмбриональных клеток других домашних птиц. Для размножения и титрования вируса используют культуру клеток фибробластов гусиных эмбрионов (ГФ). Клеточный монослой состоит из фибробластоподобных клеток, которые имеют крупное ядро и многоугольную цитоплазму. ЦПД вируса энтерита гусей становится отчетливо выраженным через 72—120 ч после заражения. Оно воспроизводится как при пассировании вируса, так и при его титровании. Первые признаки ЦПД появляются через 48—72 ч после адсорбции вируса. Зараженные клетки становятся набухшими и как бы приподнимаются над монослоем. Постепенно этот эффект усиливается и еще через 12—24 ч клетки сильно преломляют свет, становятся звездчатыми, а затем округлыми. С этого момента клетки начинают отделяться в культуральную среду.

Вирус легко распространяется контактным путем. Доказана его вертикальная передача (Шетлер, 1972 г.). Заражение происходит, в основном, алиментарным или аэрогенным путями. Возможна трансовариальная передача вируса. Переболевшие птицы могут оставаться вирусоносителями в течение нескольких лет. В естественных условиях болеют гусята и мускусные утки в возрасте от 1 до 30 дней.

У реконвалесцентов ВНА обнаруживали в течение 80 месяцев. В желтке яиц, снесенных гусынями через 68—70 месяцев после переболевания, обнаруживали ВНА. Иммунизированные гусыни-матери сообщают потомству пассивный иммунитет продолжительностью до 15 дней. После этого наступает возрастная резистентность. Проводят серопрофилактику. Для этого гусятам 1—5-суточного возраста подкожно вводят кровь или сыворотку взрослых гипериммунных птиц в дозе 2—3 мл или сыворотку в желточный мешок 8-дневных гусиных эмбрионов. Иммунопрофилактика вирусного гепатита гусят впервые разработана в Болгарии. Для активной иммунизации разработаны живыми инактивированные вакцины. Аттенуированный штамм получен после 22 пассажей на 9 дневных утиных эмбрионах. Он оказался авирулентным для гусят, но создавал у них иммунитет. Вакцинный вирус выделяется с фекалиями вакцинированных гусят в течение 3 недель. Подкожная прививка гусят вирусом сообщала иммунитет уже через 48 ч. Вакцинный штамм способен передаваться трансовариально потомству.

Инактивированную вакцину готовят из тканей зараженных гусиных эмбрионов или гусят, либо культурального вируса, выращенного в культуре клеток гусиных или утиных эмбрионов. Вирус инактивировали р-пропиолактоном и в качестве адъюванта добавляли ГОА. В Венгрии разработана вакцина из аттенуированного штамма вируса энтерита гусей. В результате широкого применения данной вакцины штамм интенсивно циркулирует на поголовье гусей практически во всех хозяйствах. От взрослых гусынь вирус проникает в яйца и инфицирует эмбрионы, вызывая изменения дегенеративного характера в сердце и печени на 17—22-й день инкубации. У вылупившихся гусят имелись ВНА без каких-либо клинических признаков болезни в первые 2 недели жизни. Живыми и инактивированными вакцинами прививают взрослых гусей и мускусных уток перед началом каждого периода яйцекладки. Эти вакцины вызывают образование гуморальных AT у взрослых птиц и обеспечивают трансовариальную передачу потомству материнских AT, защищающих их от болезни в течение 3—4 недель. Молодняк от вакцинированных родителей иммунизируют в возрасте 21—28 дней.

источник

Классы МПК:	A61K39/12 вирусные антигены A61K39/00 Лекарственные препараты, содержащие антигены или антитела
Автор(ы):	Трефилов Б.Б.
Патентообладатель(и):	Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства
Приоритеты: