Реакция преципитации в геле при дифтерии

В основе метода определения токсигенности коринебактерий дифтерии (тест Элека) лежит процесс встречной иммунодиффузии токсина и антитоксических антител в плотной питательной среде. В местах оптимального количественного соотношения между токсином, продуцируемым коринебактериями, и антитоксином, нанесенным на фильтровальную бумагу, происходит их взаимодействие с образованием преципитата в виде белой линии или «усов».

Токсигенность коринебактерий дифтерии определяют, как правило, в чистой культуре (отдельные колонии или культура со скошенного агара, или с пробы Пизу). Смесь колоний или культуры, загрязненные посторонней микрофлорой, также могут быть испытаны на токсигенность. При отсутствии, в этом случае, преципитатов в агаровом геле, опыт следует повторить с выделенными чистыми культурами.

Культуру засевают в виде «бляшек» диаметром 0,6-0,7 см на расстоянии 0,7-0,8 см друг от друга и 0,5 см от края полоски фильтровальной бумаги. На одну чашку следует засевать не более 10 «бляшек». Из них 6 «бляшек» испытуемой культуры, 4-контрольного штамма. При небольшом количестве испытуемого материала засевают 6 контрольных «бляшек» и 4 — испытуемых. Чашки с посевом помещают в термостат при 37 град. C.

Результат учитывают через 18-24 часа и 48 часов роста. Следует иметь в виду, что препарат антитоксической противодифтерийной сыворотки, помимо антител к дифтерийному антитоксину, содержит антитела к антигенам микробной клетки. Поэтому при постановке пробы на токсигенность с использованием данного препарата преципитаты могут образовываться не только в результате связывания токсина с антитоксином (специфические преципитаты), но и при взаимодействии антибактериальных антител с компонентами клетки коринебактерий дифтерии (неспецифические преципитаты). Последние могут формироваться как у токсигенных, в том числе и у контрольного штамма, так и у нетоксигенных коринебактерий дифтерии. Иногда отмечается появление множественных линий преципитации. Неспецифические преципитаты, как правило, слабо выражены, имеют нечеткие контуры, появляются чаще через 48-72 часа, в редких случаях могут появляться и на первые сутки. Критерием оценки специфичности преципитатов является слияние линий преципитации испытуемого штамма со специфическими линиями контрольного токсигенного штамма. В тех случаях, когда у контрольного штамма формируется несколько линий преципитации, специфическими следует считать более четкие и рано появляющиеся преципитаты. Поэтому просмотр чашек с пробой на токсигенность осуществляют через 18-24 часа от момента ее постановки. Если в течение данного времени у контрольного штамма линии преципитации не обнаруживаются, это свидетельствует о нарушении условий постановки реакции.

Варианты оценки результатов реакции:

1. Испытуемые культуры коринебактерий дифтерии являются токсигенными, если образуемые ими линии преципитации сливаются или имеют тенденцию к слиянию с соответствующими специфическими линиями контрольного токсигенного штамма.
2. Испытуемые культуры коринебактерий дифтерии являются нетоксигенными, если:
- а) линии преципитации, образуемые испытуемой культурой, отсутствуют, при наличии специфических линий преципитации у контрольного штамма;
- б) линии преципитации не могут слиться со специфическими линиями преципитации контрольного штамма, а скрещиваются или имеют тенденцию к скрещиванию с ними (неидентичные, неспецифические линии);
- в) линии преципитации испытуемой культуры сливаются с неспецифическими линиями контрольного штамма;
- г) линии преципитации испытуемой культуры перекрещиваются со специфическими линиями и сливаются с неспецифическими линиями контрольного штамма.

Очищенный ферментолизом и специфической сорбцией антитоксин не содержит антител к компонентам микробной клетки. При использовании этого препарата неспецифические линии преципитации не образуются.

источник

Особенность этой реакции в том, что взаимодействие антигена с антителом происходит в полутвёрдой среде — геле, чаще агаровом, иногда используют крахмальный гель, полиакриламидный и т. п.

Реакцию преципитации в геле ставят в чашках Петри или на предметных стёклах. Ингредиенты реакции — антиген и антитела — помещают в лунки (колодцы), которые вырезают в агаре.

Различают два метода постановки диффузионной преципитации в агаре: метод простой (или радиальной) иммунодиффузии, когда одно из реагирующих веществ из лунки диффундирует в агар, содержащий постоянную концентрацию другого реагирующего компонента, и метод двойной иммунодиффузии, когда и антиген, и антитело, помещённые в лунки, диффундируют навстречу друг другу в слое агарового геля. На месте встречи антигена и антитела образуются зоны преципитации (кольцо из преципитата при простой иммунодиффузии и линии из преципитата — при двойной иммунодиффузии). В зависимости от сложности системы антиген — антитело может появляться одна или несколько линий преципитации. Чтобы установить титр преципитирующей сыворотки ставят реакции преципитации с различными разведениями антигена. То максимальное разведение антигена, дающее преципитацию с сывороткой, и является титром данной преципитирующей сыворотки.

Примером реакции преципитации в геле может служить реакция между дифтерийным токсином и противодифтерийной сывороткой, которая носит название реакции двойной иммунодиффузии по Оухтерлони.

Токсигенные культуры дифтерийных палочек, посеянные бляшками.

Нетоксигенные культуры, посеянные бляшками.

Фильтровальная бумага, пропитанная противодифтерийной сывороткой.

Иммуноэлектрофорез сочетает метод электрофореза и реакции преципитации. Смесь антигенов разделяется в геле с помощью электрофореза, затем в канавку параллельно зонам электрофореза вносится иммунная сыворотка, антитела которой диффундируют в гель и образуют в месте встречи с антигеном линии из преципитата.

С его помощью успешно анализируются белки сыворотки крови, цереброспинальной жидкости, мочи, молока, экстрактов из органов, а также белки растительного и бактериального происхождения.

Реакции лизиса.

Иммунный лизис — это растворение клеток под при обязательном участии воздействием антител комплемента.

1. Антиген — микробы, эритроциты или другие клетки.

2. Антитело — иммунная сыворотка, реже сыворотка больного.

Иммунную сыворотку получают гипериммунизацией кролика соответствующим корпускулярным антигеном (микробные клетки, эритроциты и др.). Например, в реакции гемолиза и реакции связывания комплемента (см. ниже) используется гемолитическая сыворотка, которую получают гипериммунизацией кролика эритроцитами барана; полученная таким образом сыворотка крови кролика содержит антитела (гемолизины) к эритроцитам барана. Таким образом получают и бактериолитические сыворотки, содержащие антитела, участвующие в лизисе бактерий.

3. Комплемент — термолабильный сложный комплекс белков сыворотки крови, при активации реагирующих между собой в определённой последовательности и образующих мембраноатакующий литический комплекс. В сыворотке комплемент находится в неактивном состоянии и активируется в момент образования комплекса антиген — антитело (адсорбируется на комплексе антиген — антитело). Комплемента много в свежей сыворотке морских свинок.

Из реакции лизиса чаще других применяется реакция гемолиза и реже бактериолиза (главным образом, для дифференциации холерных и холероподобных вибрионов).

Постановка реакции гемолиза.

Для постановки реакции гемолиза необходимы:

— 3 % взвесь эритроцитов барана на изотоническом растворе;

— стандартная гемолитическая сыворотка, приготовленная в производственных условиях и разведённая изотоническим раствором в 2 — 3 раза меньше, чем её титр (титр гемолитической сыворотки — то наибольшее разведение её, при котором происходит полный гемолиз 3 % взвеси эритроцитов барана в присутствии комплемента);

— комплемент, разведённый изотоническим раствором 1:10.

Если в пробирку поместить в определенных количественных соотношениях эритроциты барана (антиген), гемолитическую сыворотку (антитело) и комплемент, то в течение нескольких минут произойдет изменение смеси: из темно-красной она становится розовой (лаковой) вследствие разрушения эритроцитов и выхода гемоглобина.

Реакция гемолиза обладает строго выраженной специфичностью. Ее используют в качестве индикатора для постановки реакции связывания комплемента.

Дата добавления: 2017-01-08 ; просмотров: 2807 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

источник

Реакция Райта

Развернутая РА для определении АТ при бруцеллезе

1. Сыворотка, разведенная в физрастворе двукратно (АТ)

2. Единый бруцеллезный диагностикум (АГ) (голубой, единственный подкрашенный)

Механизм: при наличии АТ образуются хлопья агглютинации, оседающие на дно.

Титр АТ – наибольшее разведение, при котором еще есть агглютинация.

Реакция Манчини

Реакция преципитации в геле для определения уровня Ig – метод радиальной иммунодиффузии

Образцы исследуемых сывороток помещают в лунки агарового геля, который содержит АТ против IgG, IgM или IgA в известной концентрации. Диффундирующие в агар Ig образуют кольца преципитации с антиглобулиновыми антителами, размер которых зависит от содержания в сыворотке Ig соответствующего класса. . По разведениям стандартной сыворотки строится калибровочная кривая, по которой определяется уровень Ig в исслед.сыворотке. Уровень сывороточных Ig отражает функциональное состояние B-системы организма.

Постановка ориентировочной РА для определения неизвестного микроба

Компоненты: 1. Взвесь неизвестной культуры в физ.р-ре (АГ в электролите)

2. Диагностические аггл. сыворотки (АТ): н-р, 1) поливалентная эшерихиозная 2) типовые О-26, О-55, О-111.

Механизм: при соответствии антигена антителу – хлопья агглютинации.

Окраска по Граму (чистая культура)

Позволяет выявить особенности строения КС бактерий

Стекло обезжирить мылом. Капля 0,9% NaCl. Культуру бакпетлей в каплю. Сушим. Фиксируем (3 раза провести над пламенем горелки). Генцианвиолет (бумажки по Синеву) смочить водой 1-2 мин. Р-р Люголя – 1-2 мин. Стряхиваем и краситель, и Люголь. Этиловый спирт – 30-60 с, до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя (опустить 3 раза). Промывание водой. Фуксин Пфейффера – 3-5 мин. промыть водой. Грам(+) не обесцвечиваются спиртом и сохраняют окраску певрого красителя (многослойный пептидогликан КС взаимодействует с краской и задерживает её в комплексе с йодом), грам(-) обеспечиваются спиртом и окрашиваются вторым красителем.

Окраска по Гинса-Бури

Позволяет выявить капсулу бактерий (называется негативным, так как капсула не прокрашивается)

В каплю черной туши внести культуру, смешать и 2 стеклом со шлифованным краем приготовить мазок, как из крови. Высушить. Зафиксировать на воздухе. Фуксин Пфейффера – 1-2 мин. Капсула не воспринимает красители, поэтому окрашиваем бактерии и окружающий фон. Фон окрашивается тушью в черный цвет, а возбудитель фуксином в розовый цвет, при этом капсула видна в виде светлого ободка вокруг бактерий.

Окраска по Ожешко

Позволяет окрасить споры бактерий.

На нефиусированный мазок 0,5% HCl – 3 мин с прогреванием (протрава). промывание водой (осторожно). Фиксация в пламени спиртовки. Окраска по Цилю-Нильсену. Спора, как кислотоустойчивая структура красится в красный цвет, а цитоплазма клетки, как кислотонеустойчивая структура – в синий цвет.

Окраска по Цилю-Нильсену

Позволяет определить кислотоустойчивые бактерии.

Карболвый фуксин Циля 3-5 мин. Промывание водой. 5% H2SO4 1-2 мин (для обесцвечивания). промывание водой. Метиленовая синь 3-5 мин. Промывание водой. Кислотоустойчивые бактерии не обесцвечиваются после первого красителя, так как содержат больше липидов, воска, окислителей, поэтому окрашиваются в красный цвет. Кислотонеустойичвые бактерии и структуры обесцвечиваются после первого красителя, поэтому красятся в голубой цвет.

Тельца Бабеша-Негри

Цитоплазматические включения в нейронах (срезы аммонова рога и мозжечка), клетках слюнных желез при бешенстве – индикация вируса. Красные на голубом фоне.

Среда Эндо (диф.-диагн.) (МПА + 1% лактоза + осн.фуксин, обесцвеч. тиосульфитом натрия), Lac(+) – темно-красные колонии с металлич.блеском; для выявления энтеробактерий (сахаролитические свойства).

Среда Левина(диф.-диагн.) (МПА + 1% лактоза + метилен.синь и эозин), Lac (+) – насыщ. синего цвета; для выявления энтеробактерий (сахаролитические свойства).

Среда Плоскирева (диф.-электив.) (МПА + 1% лактоза + нейтр.красный + соли желч.к-т + бриллиант.зелен.) (для шигелл и сальмонелл); Lac (+) – красные.

Среда Раппопорта (желтая) (электив.-диф. для сальмонелл и шигелл) (МПБ + 1% желчь (электив.ф-р) + глю(диф.ф-р) + инд-р Андреде(кислый фуксин + NaOH): S.typhi –до кислоты (красный), S.paratyphi A,B – до кислоты и газа. Разливается в бутылки и колбы, т.к. в начале болезни сальмонеллы находятся в крови. Берут 5 мл крови и разбавляют в 10 раз (до 50 мл).

ЩПВ — щелочно-пептонная вода (селектив) (1% пептонная вода + 0,5% NaCl + KNO3 + Nа2CO3; pH = 9,0). Щелочь – селективный фактер для холерного вибриона.

Сахарный бульон (универсальная) (триптоза + мясной экстракт + глю + NaCl )

КА (диф-диаг) (агар+эритроцитарная масса). Для определения гемолизирующих свойств бактерий. Гемолиз: α – Hb превращается в гемосидерин (зеленый), β – просветы вокруг колоний, γ – отсутствие гемолиза.

ЖСА (элективн)(МПА + желточная взвесь + 10% NaCl). Для выявления фермента патогенности лецитовиттелазы (лецитиназы). (+) помутнение вокруг колоний.

МПБ (универсальная)(мясная вода + пептон + 0,5% NaCl).

Китта-Тароцци (для анаэробов) (сахарный бульон + кусочки паренхиматозных органов (для адсорбции О2) + высокий столбик + слой вазелинового масла (для изоляции от атмосферного воздуха). Перед посевом среду прогревают на кипящей водяной бане в теч 10-15 мин для удаления воздуха

Вильсона-Блера (железосульфитный агар) (3% МПА + 1% глю + 20% сульфит натрия + 8% FeCl3) Разливают высоким столбиком, сверху – вазелиновое масло (для изоляции от атмосферного воздуха). Позволяет выявить сероводородную активность. Анаэробы образуют колонии черного цвета за счет восстановления сульфита натрия, который, соединяясь с FeCl3 дает осадок сульфата железа черного цвета.

Игла –синтетическая (13 АМК, 7 витаминов, на основе сбалансированного солевого раствора Эрла). Питательный раствор для культур клеток, используемых для культивирования вирусов.

199 – синтетическая(20 АМК, 17 витаминов, глюкоза, минеральные соли, пурины и пиримидины – всего 199 компонентов, на основе сбалансированного солевого р-ра Хенкса). Питательный раствор для культур клеток, используемых для культивирования вирусов.

· хроническая гонорея – кровь / серологическое

· острая гонорея — гной / бактериоскопическое, бактериологическое

· дизентерия – испражнения / бактериологическое

· холера – испражнения / бактериологическое

· брюшной тиф – кровь, испражнения / бактериологическое, серологическое

· коклюш – отделения из носоглотки / бактериологическое

· дифтерия – пленки / бактериологическое

· сибирская язва – содержимое карбункулов / бактериологическое

· корь – кровь / серологическое

· полиомиелит – кровь, ликвор / серологическое

Определение токсигенности дифтерийной палочки реакцией преципитации в геле

В чашку Петри с питат.агаром кладут полоску фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой. Засевают исследуемые культуры, в качестве контроля используют заведомо токсигенную культуру. При размножении токисгенной культуры в месте соединения токсина с антитоксином в плотной питательной среде образуется преципитат в виде белых линий – «усов».

Дата добавления: 2017-02-25 ; просмотров: 1603 | Нарушение авторских прав

источник

Эпидемиология. Источником инфекции является больной человек, реконвалесцент и носитель токсигенных штаммов коринебактерий дифтерии. Наибольшее количество возбудителей выделяют больные с ярко выраженной клиникой.Опасными источниками инфекции являются также больные с атипичными формами, не распознанные и поэтому не госпитализированные.

Возбудитель дифтерии выделяется от больного с капельками слизи при кашле и чиханье, поэтому основной механизм передачи — воздушно-капельный, также возможно заражение через предметы, используемые больным, и инфицированные пищевые продукты (обычно молоко).

Восприимчивость неиммунных людей к возбудителю дифтерии всеобщая. Однако возможность развития не только тяжелых, но и легких форм болезни, а также носительства (бессимптомные формы инфекции) свидетельствует об определенной роли неспецифических факторов защиты организма, вирулентности и степени токсигенности возбудителя, но особенно — инфицирующих доз при заражении.

Общеизвестно, что чем теснее общение с источником дифтерии, тем более вероятно развитие манифестной формы инфекции, и наоборот, с увеличением расстояния между источником и реципиентом (восприимчивым человеком) растет вероятность развития бессимптомных форм инфекции.

Наблюдения в условиях естественно складывающегося обычного общения в достаточно крупных популяциях (города, страны и т. п.) показали, что в допрививочные времена болело дифтерией примерно 20% населения, остальные приобретали иммунитет за счет перенесения бессимптомных форм.

Масштабные наблюдения, таким образом, показывают сложившуюся вероятность получения дозы, приводящей к развитию манифестных форм дифтерии. Необходимо подчеркнуть, что остальное, незаболевшее, население (80%) — это тоже восприимчивые люди, но они заражались небольшими дозами и постепенно приобретали устойчивый иммунитет. Этот иммунитет в основном носит антитоксический характер, именно поэтому возможно вторичное (иммунное) носительство.

В недавнем прошлом дифтерия была одной из ведущих социальных проблем не только вследствие высокой заболеваемости, но и в связи с высокой последующей инвалидностью, летальностью и смертностью. В настоящее время за счет внедрения в широкую практику специфической профилактики заболеваемость либо исчезла вовсе (там, где прививки проводятся в строгом соответствии с современными требованиями науки и практики), либо — где имеются нарушения в принятой системе специфической профилактики — наблюдается заболеваемость, как правило, не достигающая уровня допрививочного времени.

В допрививочный период отмечалась высокая заболеваемость дифтерией, которая в наиболее неблагоприятные годы достигала в России показателя 150-170 на 100 тыс. населения в год. В 2001-2003 гг. в России показатели заболеваемости составили 0,2—0,4 на 100 тыс. населения.

Для дифтерии характерна своеобразная многолетняя динамика: подъемы заболеваемости чередовались без особой закономерности с интервалом 8, 10, 12 и даже 20 лет.

С введением специфической профилактики заболеваемость резко снизилась, и в некоторых странах и городах упала до нуля. Однако в связи с нарушениями в системе специфической профилактики, которые имели место в 90-х гг. XX в., произошел подъем заболеваемости. Таким образом, в современных условиях подъем заболеваемости происходит не в результате угасания естественно формируемого популяционного иммунитета, а вследствие нарушений в системе специфической профилактики.

Сезонность заболеваемости дифтерией также имеет определенное своеобразие: подъем начинается осенью с формированием детских коллективов, достигает максимума в конце осени — зимой (декабрь), затем наблюдается постепенное снижение заболеваемости. Весеннего подъема обычно не бывает.

Структура заболеваемости дифтерией.

В допрививочное время дифтерия справедливо включалась в группу «детских инфекций», поскольку страдали от этой нозоформы главным образом дети. Группой риска считались дети примерно 4-7 лет, хотя и в более старшем возрасте дети заболевали достаточно часто.

Такое возрастное распределение связано с постепенным после рождения угасанием иммунитета к дифтерии, полученного от матери, а также более активным включением в общественную жизнь (посещение детских учреждений, массовых зрелищ и т. д.).

С введением прививок, из-за нарушений при реализации специфической профилактики (необоснованные медицинские отводы и т. д.) заболеваемость среди детей сохраняет доминирующее положение, однако в ряде случаев взрослые болеют с той же частотой, что и дети: это также определяется характером нарушений в системе прививок.

источник

Данный вариант реакции преципитации применяется для обнаружения, например, токсина, вырабатываемого возбудителем при росте на агаре. Таким способом мы выявляем токсигенность коринебактерии дифтерии.

Для постановки данной реакции необходимо взять чашку с агаром, положить на ее середину полоску фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой, после чего провести перпендикулярно к полоске посев изучаемой культуры. Необходимо помнить, что на этой же чашке должен присутствовать посев заведомо токсигенной культуры, чтобы иметь положительный контроль.

При росте культуры токсин пропитывает агар, одновременно из фильтровальной бумаги противотоксические антитела пропитывают агар, и на месте их соединения образуется комплекс антиген-антитело, что становится видимым, как «усы» преципитации. Результат реакции представлен на рис. 13.

Рис. 13 Реакция преципитации в агаре.

РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ В ГЕЛЕ.

Этот метод еще имеет название иммунодиффузии в геле. Известны простая иммунодиффузия (по Удену), радиальная иммунодиффузия (по Манчини) и двойная (встречная) радиальная иммунодиффузия (по Оухтерлони).

Методы простой диффузии основаны на способности антигена, внесенного в лунки, диффундировать в гель. При постановке двойной диффузии антитела и антиген вносят в отдельные лунки. Обычно данные методы используют для выявления белковых антигенов в различных жидкостях и тканевых экстрактах.

Схема постановки и результаты реакции представлены на рис.

Диффузионный метод преципитации в геле. Принцип метода: вещества (антиген, антитела), диффундирующие в геле навстречу друг другу, реагируя между собой, образуют преципитат беловатого цвета разной конфигурации. В контроле он не наблюдается.

Ингредиенты и техника постановки реакции:

— Готовят 1 — 1,5 % голодный агар — агар, разливают его в горячем расплавленном виде в любые стеклянные объекты: в чашки, на отмытые фотопластины, на предметные стекла (для микрометода). Дают застыть.

— Под объекты подкладывают бумажные расчерченные ориентиры и специальным пробойником делают на равном расстоянии друг от друга лунки. Дно их заливают 1 каплей жидкого агара для избегания затекания реагентов под агар.

— Вносят в лунки 0,1 — 0,5 мл испытуемого вещества (антигена) и напротив специфические преципитирующие сыворотки с антителами.

Рис.14 Реакция преципитации в геле.

— Выдержать в термостате 18 — 24 часа, накрыв реагенты крышкой или стеклом для предохранения от испарения.

— Учет результатов ведут по появлению линии преципитата между содержимым лунок.

— Метка позволяет дифференцировать родство между антигенами (рис. справа). Концевое слияние полос свидетельствует о полной идентичности антигенов; (а) при стыке полос — неполное родство (б) перекрест — разные антигены, но есть групповые антигены (в).

Капиллярная реакция преципитации подобна первым методам, но ставится в капиллярах из комплекта для определения СРБ (С реактивного белка).

Методика: В отличие от пробирочного метода первым набирают лёгкий по массе АГ, затем сюда же – сыворотку с тяжелым АТ. После этого оба капилляра вертикально фиксируют в пластине.

Учёт результата производят в опытной пробе по кольцу преципитации на границе АГ и АТ.

Рис. 15. Капиллярная реакция преципитации.

ИММУННОЭЛЕКТРОФОРЕЗ.

Метод объединяет реакцию преципитации в геле с электрофорезом. Для этого слой агара наносят на предметное стекло, на его разных краях вырезают две лунки, а в центре – разделяющую канавку. В лунки вносят смесь антигенов и проводят электрофорез в течение 1-2 часов. Различные антигены с разной скоростью перемещаются между катодом и анодом. Затем в канавку вносят преципитирующую сыворотку и через 5-7 суток в геле образуются зоны преципитации. Для лучшей визуализации агар окрашивают красителями (например, амидо черным).

Рис.16. Схема постановки иммуноэлектрофореза.

источник

Реакция преципитации (РП) – это осаждение растворимого антигена при действии антител в присутствии электролита. Видимый эффект реакции (феномен преципитации) – помутнение (образование мутного кольца или осадка – преципитата).

РП применяют для обнаружения неизвестного антигена при ряде инфекционных заболеваний: при сибирской язве, туляремии, менингите, оспе. В судебной медицине ее используют для определения видовой принадлежности крови, спермы; в санитарно-гигиенических исследованиях – для установления фальсификации пищевых продуктов. РП отличается очень высокой чувствительностью и позволяет обнаружить антиген в разведении 1:1 000 000 и 1: 10 000 000.

Компоненты реакции преципитации.

1. Антиген (преципитиноген) — это антиген молекулярной природы, находящийся в мелкодисперсном (растворимом) состоянии. Преципитиногены – это различные лизаты или экстракты тканей и др. Преципитиноген отличается от агглютиногена размером частиц антигена. Агглютиноген имеет размеры клеток (это не разрушенные целые клетки), а размеры преципитиногена соизмеримы с размерами молекул (это белки и их комплексы с углеводами или липидами). Раствор преципитиногена прозрачный.

2. Антитела (преципитины) находятся в сыворотке крови человека или в иммунных диагностических преципитирующих сыворотках, которые содержат известные антитела.

3. Электролит – изотонический раствор хлорида натрия.

Получают путем измельчения материала и извлечения из него белковых антигенов кипячением или другими способами.

Примеры преципитиногенов: лизаты или экстракты различных органов и тканей, чужеродная сыворотка крови (сыворотка — это раствор, в первую очередь, различных белков), фильтраты бульонных культур микробов, солевые экстракты микробов, аутолизаты и др.

Получение преципитирующих сывороток.

Получают путем гипериммунизации кроликов соответствующими преципитиногенами. Такие сыворотки содержат антитела к тем преципитиногенам, которыми иммунизировали кроликов.

Примеры преципитирующих сывороток: преципитирующая сибиреязвенная сыворотка (содержит антитела к антигенам возбудителя сибирской язвы), преципитирующая противоменингококковая сыворотка (содержит антитела против антигенов возбудителя менингита) и др.

Титр преципитирующей сыворотки – это наибольшее разведение преципитиногена, при котором сыворотка еще дает реакцию преципитации.

1. Реакция кольцепреципитации – проводится в специальных преципитационных пробирках (диаметр – 0,4-0,5 см, высота – 7-8 см). В пробирку вносят 0,2 – 0,3 мл преципитирующей сыворотки и по стенке длинным носиком пастеровской пипетки осторожно наслаивают такое же количество преципитиногена. Затем осторожно из горизонтального положения пробирки ставят вертикально.

Учет результатов реакции проводят по появлению белого кольца на границе антиген-антитело. При положительной реакции наблюдается образование такого кольца. В этом случае антиген соответствует антителу и происходит их связывание.

Если в качестве преципитиногена используют прокипяченные и профильтрованные водные экстракты органов и тканей, то реакция называется реакцией термокольцепреципитации (например, при диагностике сибирской язвы).

2. Реакция преципитации в геле – проводится в чашках Петри или на предметных стеклах, куда помещают слой агарового геля. При застывании геля в нем вырезают лунки, в которые помещают антигены или антитела, или и то и другое. Различают 2 метода РП в геле:

Читайте также: Санпин 2013г по дифтерии

а) метод простой (радиальной) иммунодиффузии: один из компонентов реакции иммунитета (антиген или антитело) помещают в лунку, а другой компонент – смешивают с агаром; при положительном результате (антиген соответствует антителу) вокруг лунки образуется кольцо преципитата;

б) метод двойной иммунодиффузии: и антитело и антиген помещают в отдельные лунки, они диффундируют в агаровом геле навстречу друг другу; при положительном результате на месте встрече антитела и антигена образуются линии преципитации.

Примером РП в геле является реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони при диагностике дифтерии

Иммуноэлектрофорез – это метод, который сочетает метод электрофореза и реакцию преципитации. Смесь антигенов (например, белков сыворотки крови) разделяется в геле при помощи электрофореза. Затем, чтобы найти и определить нужный белок (неизвестный антиген), используют диагностическую преципитирующую сыворотку, которая содержит антитела к этому белку (известное антитело). Для этого в канавку параллельно белкам вносится диагностическая сыворотка. Если среди белков имеется тот, который соответствует антителу, находящемуся в сыворотке, то вокруг него образуются линии преципитации.

источник

Микробиология, вирусология, иммунология: Методические указания для самостоятельной работы и к практическим занятиям для студентов лечебного, педиатрического и стоматологического факультетов. Часть III , страница 9

Цель занятия: Изучить сущность и методы постановки peакции преципитации, диагностические возможности, оценку, информативность

1. Реакция преципитации, характеристика компонентов

2. Механизм реакции преципитации. Методы постановки

3. Практическое использование реакции преципитации

Методические указания к демонстрации

Реакция преципитации в геле

Реакция преципитации в геле использована для определения токсигенности у дифтерийных бактерий. Для этого в чашку Петри на поверхность питательной среды помещена полоска фильтровальной бумаги, пропитанная антитоксической противодифтерийной сывороткой. На расстоянии 0,6-0,8 см от края бумажки засеяны в виде бляшек с каждой стороны по 2-3 испытуемые культуры и заведомо токсигенные (для контроля). Посев инкубирован 37°С в течение суток. Контрольные культуры выделяют токсин, который диффундирует в агар и взаимодействует с антителами, которые тоже диффундируют в агар из фильтровальной бумажки, в месте их соединения в среде образуется преципитат в виде белых линий – «усов». Такие же линии образовались около испытуемой культуры, следовательно, она образует токсин.

Методические указания к практической работе

Реакция преципитации основана на осаждении коллоидного раствора антигена антителами иммунной сыворотки в присутствии электролита.

Антиген, участвующий в реакции преципитации, получил название преципитиногена. Он представляет собой вещества (белки, липиды, полисахариды, липополисахариды и др.), извлеченные из микробных клеток, тканей животных и человека, исследуемого материала, находящиеся в коллоидном состоянии, в виде прозрачного или слегка опалесцирующего раствора. Получают преципитиноген, используя различные методы экстракции веществ из клеток и тканей: растирание с песком или стеклянным порошком с последующей фильтрацией для освобождения от обломков и целых клеток: разрушение путем встряхивания, замораживания и оттаивания, разрушение ультразвуком, химическими, биологическими воздействиями, путем электролиза.

Антитела называют преципитинами. Получат преципитины путем гипериммунизации животных (кроликов, коз, баранов и др.) полноценными антигенами, живыми или убитыми микробными клетками, токсинами, анатоксинами, животными и растительными белками. У полученной сыворотки определяют титр. Под титром преципитирующей сыворотки понимают то наибольшее разведение антигена, которое при взаимодействии с иммунной сывороткой вызывает образование осадка, который называют преципитатом (комплекс антиген + антитело).

Реакция преципитации протекает в две фазы. В первой происходит соединение коллоидного антигена с антителами, во второй фазе осаждение (преципитация) образовавшихся комплексов в виде помутнения в присутствии электролита.

Реакция преципитации применяется для:

1) определения видовой принадлежности антигена: а) бактерии и других микроорганизмов — индикация и идентификация неизвестных микроорганизмов в объектах внешней среды, патологическом материале или чистой культуре; б) животных и человека – определение видовой принадлежности продуктов, белковых пятен и тому подобное в судебно-медицинской практике, санитарии; 2) для обнаружения специфических антител с исследуемой сыворотке с помощью известного преципитиногена.

Реакция преципитации характеризуется высокой чувствительностью, так как позволяет обнаружить очень малые количества антигена.

Реакцию можно поставить разными методами.

1) Преципитация в растворах – это наиболее простой метод постановки. В целом он служит для определения антигена. Растворимый антиген в разных разведениях добавляют к преципитирующей сыворотке, цельной или разведенной в два раза, смесь помещают в термостат для инкубирования до суток. Реакцию оценивают макроскопически по появлению мути. Более точен учет с помощью нефелометрии.

Особую форму преципитации в растворе представляет метод кольцепреципитации, при котором на преципитирующую сыворотку, налитую в пробирку, осторожно, так чтобы жидкости не перемешивались, наслаивают равный объем преципитиногена. При соответствии антигена антителу на границе жидкостей появляется тонкое кольцо преципитата. Степень положительной реакции определяют по выраженности кольца и времени его появления.

Преципитация в геле основана на способности растворимых антигенов и антител диффундировать в агар (гель), образующиеся же иммунные комплексы (преципитат) в виду их большой величины не диффундируют, а остаются на месте образования в виде линий или полос. Если диффундирует один компонент (антиген или антитело), то иммунодиффузия называется простой, если оба (и антиген и антитело) – то двойной. Если диффузия происходит по одной оси, то она называется линейной. Если вещества диффундируют во все стороны (из резервуара в среду) радиально – радиальной.

Реакция преципитации

Компоненты Антиген Антитело- Дополнительный

растворимый- преципитин фактор-электролит

Белки Иммунная Физиологический

Гаптены сыворотка раствор

Сыворотка

Вирусы

Экстракты тканей

Экстракты из микробных клеток

Сыворотки

Способы Кольцепреципитация Преципитация в геле

постановки

реакции Простая Двойная Простая Двойная

линейная линейная радиальная радиальная

диффузия диффузия диффузия диффузия

АлтГТУ 419
АлтГУ 113
АмПГУ 296
АГТУ 266
БИТТУ 794
БГТУ «Военмех» 1191
БГМУ 172
БГТУ 602
БГУ 153
БГУИР 391
БелГУТ 4908
БГЭУ 962
БНТУ 1070
БТЭУ ПК 689
БрГУ 179
ВНТУ 119
ВГУЭС 426
ВлГУ 645
ВМедА 611
ВолгГТУ 235
ВНУ им. Даля 166
ВЗФЭИ 245
ВятГСХА 101
ВятГГУ 139
ВятГУ 559
ГГДСК 171
ГомГМК 501
ГГМУ 1967
ГГТУ им. Сухого 4467
ГГУ им. Скорины 1590
ГМА им. Макарова 300
ДГПУ 159
ДальГАУ 279
ДВГГУ 134
ДВГМУ 409
ДВГТУ 936
ДВГУПС 305
ДВФУ 949
ДонГТУ 497
ДИТМ МНТУ 109
ИвГМА 488
ИГХТУ 130
ИжГТУ 143
КемГППК 171
КемГУ 507
КГМТУ 269
КировАТ 147
КГКСЭП 407
КГТА им. Дегтярева 174
КнАГТУ 2909
КрасГАУ 370
КрасГМУ 630
КГПУ им. Астафьева 133
КГТУ (СФУ) 567
КГТЭИ (СФУ) 112
КПК №2 177
КубГТУ 139
КубГУ 107
КузГПА 182
КузГТУ 789
МГТУ им. Носова 367
МГЭУ им. Сахарова 232
МГЭК 249
МГПУ 165
МАИ 144
МАДИ 151
МГИУ 1179
МГОУ 121
МГСУ 330
МГУ 273
МГУКИ 101
МГУПИ 225
МГУПС (МИИТ) 636
МГУТУ 122
МТУСИ 179
ХАИ 656
ТПУ 454
НИУ МЭИ 641
НМСУ «Горный» 1701
ХПИ 1534
НТУУ «КПИ» 212
НУК им. Макарова 542
НВ 777
НГАВТ 362
НГАУ 411
НГАСУ 817
НГМУ 665
НГПУ 214
НГТУ 4610
НГУ 1992
НГУЭУ 499
НИИ 201
ОмГТУ 301
ОмГУПС 230
СПбПК №4 115
ПГУПС 2489
ПГПУ им. Короленко 296
ПНТУ им. Кондратюка 119
РАНХиГС 186
РОАТ МИИТ 608
РТА 243
РГГМУ 118
РГПУ им. Герцена 124
РГППУ 142
РГСУ 162
«МАТИ» — РГТУ 121
РГУНиГ 260
РЭУ им. Плеханова 122
РГАТУ им. Соловьёва 219
РязГМУ 125
РГРТУ 666
СамГТУ 130
СПбГАСУ 318
ИНЖЭКОН 328
СПбГИПСР 136
СПбГЛТУ им. Кирова 227
СПбГМТУ 143
СПбГПМУ 147
СПбГПУ 1598
СПбГТИ (ТУ) 292
СПбГТУРП 235
СПбГУ 582
ГУАП 524
СПбГУНиПТ 291
СПбГУПТД 438
СПбГУСЭ 226
СПбГУТ 193
СПГУТД 151
СПбГУЭФ 145
СПбГЭТУ «ЛЭТИ» 380
ПИМаш 247
НИУ ИТМО 531
СГТУ им. Гагарина 114
СахГУ 278
СЗТУ 484
СибАГС 249
СибГАУ 462
СибГИУ 1655
СибГТУ 946
СГУПС 1513
СибГУТИ 2083
СибУПК 377
СФУ 2423
СНАУ 567
СумГУ 768
ТРТУ 149
ТОГУ 551
ТГЭУ 325
ТГУ (Томск) 276
ТГПУ 181
ТулГУ 553
УкрГАЖТ 234
УлГТУ 536
УИПКПРО 123
УрГПУ 195
УГТУ-УПИ 758
УГНТУ 570
УГТУ 134
ХГАЭП 138
ХГАФК 110
ХНАГХ 407
ХНУВД 512
ХНУ им. Каразина 305
ХНУРЭ 324
ХНЭУ 495
ЦПУ 157
ЧитГУ 220
ЮУрГУ 306

Полный список ВУЗов

Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).

источник

Реакция преципитации и ее варианты

Реакции агглютинации и преципитации очень близки по своей сути. Различия между ними зависят главным образом от величины частиц антигена. Преципитацией называют процесс, когда происходит агрегация антител с растворимыми антигенами; если же антиген представлен корпускулами, специфическая агрегация таких антигенов описывается как агглютинация.

Появление преципитата при реакции антиген – антитело определяется не только возникновением решетки, образуемой ее участниками, но и особой ролью Fc-фрагмента иммуноглобулина, изменение конформации которого приводит к утрате этим комплексом растворимости в солевых растворах. В связи с этим в реакции преципитации используют неразведенную или слабо разведенную сыворотку.

Рис. 73 . Схема определения токсигенности Corynebacterium diphtheriae

Объяснение см. в разделе «Микробиология дифтерии»

Для постановки реакции преципитации необходимы: антитела – испытуемая сыворотка больного или иммунная диагностическая сыворотка (при идентификации выделенных микробов); антиген – экстрагированный гаптен или полный гаптен соответствующих микроорганизмов; физиологический раствор как источник электролитов. Существует множество модификаций этой реакции, которые подразделяют на две группы: преципитация в жидкой среде (реакция флоккуляции и реакция кольцепреципитации) и преципитация в геле.

Реакция флоккуляции представляет собой преципитацию, при которой растворы антигенов и антител смешивают в пробирке. Учет реакции производят с помощью измерения на фотоэлектроколориметре мутности получаемой системы, что позволяет определить концентрацию исследуемого антигена.

Значительно чаще применяется качественная реакция кольцепреципитации. Для ее постановки в тонкие преципитационные пробирки наливают сначала неразведенную преципитирующую сыворотку и сверху на нее наслаивают, не допуская перемешивания, раствор антигена. В случае гомологичности антител и антигена на границе между этими растворами быстро, через 3 – 10 мин, появляется кольцо преципитата. В отличие от реакции агглютинации, титр преципитирующей сыворотки определяют с помощью разведения не сыворотки, а антигена.

Реакция преципитации в геле является одним из наиболее эффективных методов анализа растворимых антигенов. Она позволяет выявить число индивидуальных антигенов в исследуемой жидкости и провести анализ их антигенного родства. В 1946 г. Дж. Оудин предложил метод простой диффузии, по которому один из компонентов реакции преципитации, обычно сыворотка, находится в геле, а другой – антиген – наслаивается на первый в виде раствора. Антиген, диффундируя в гель, образует в нем с антителами белые линии преципитации, хорошо видимые при боковом освещении. В 1948 г. Ё. Оухтерлоню разработал еще более простой и удобный метод встречной двумерной диффузии, позволяющий проводить прямое сравнение различных антигенов и сывороток. Этот метод также является весьма ценным при исследовании перекрестных реакций (рис. 73).

Для постановки реакции по Оухтерлоню используют 1 %-ный агар, приготовленный на физиологическом растворе, который разливают в чашки Петри слоем 0,5 см. После застывания в пластинке агара вырезают луночки диаметром 5 – 6 мм – одна в центре чашки, 4 – 5 – по окружности на расстоянии 1 – 2 см от центральной. В центральную луночку наливают диагностическую преципитирующую сыворотку, а в периферические – раствор гомологичного и сравниваемых с ним антигенов. Учет результатов проводят через 24, 48 и 72 ч инкубации при комнатной температуре. Антитела и антигены диффундируют навстречу друг другу, и в участках, где создаются их эквивалентные концентрации, образуются дугообразные полосы преципитации. Если полосы преципитации, идущие от двух соседних луночек, сливаются, это указывает на наличие нескольких антигенных компонентов в исследуемой жидкости. Реакцию встречной диффузии по Оухтерлоню часто применяют для определения токсигенности бактерий, например дифтерийных (см. рис. 73).

Читайте также: Дифтерия у детей рвота

Дальнейшим развитием метода преципитации в геле является иммуноэлектрофорез. Этим термином обозначают метод, объединяющий электрофоретическое разделение смеси антигенов и встречную диффузию по Оухтерлоню на одной и той же пластинке агарового геля. Преципитирующую сыворотку при этом наливают в канавку, вырезанную в геле параллельно направлению электрофоретического разделения. Образующиеся в результате реакции линии преципитации имеют вид дуг, вытянутых в направлении электрофоретического движения фракций антигенов. Иммуноэлектрофорез позволяет определять состав сложных смесей растворимых антигенов, содержащих до 30 компонентов, и является поэтому ценным диагностическим методом.

источник

Под РПА понимают реакцию, в которой АТ-а взаимодействуют с высокодисперсными АГ (гаптенами), предварительно адсорбированными на корпускулярных носителях, которые при этом склеиваются.

В качестве корпускулярных носителей применяют эритроциты животных, частицы латекса (полимерные микрошарики), бентонита, сефарозы, клетки St. aureus (штам Cowan-1, содержащий протеин А).

1) различные варианты РПГА (реакции пассивной гемагглютинации);

1. РПГА – реакция пассивной гемагглютинации

В основе лежит агглютинация сенсибилизированных эритроцитов. РПГА, как правило, подразумевает использование эритроцитов, сенсибилизированных АТ-ми.

Эритроциты используются нативные и фиксированные (формальдегидом, глутаровым альдегидом, хлоридом хрома и др.).

1) растворимый (высокодисперсный) АГ (белки, полисахариды и др.);

3) АТ (испытуемая сыворотка или диагностическая иммунная сыворотка; обычно разводят в соотношении от 1:10 до 1:20480).

4) Изотонический раствор хлорида натрия.

Реакцию инкубируют сначала при 37 0 С в течение 2 часов, затем при комнатной температуре в течении 18-24 часов.

При положительной реакции, в результате образования комплекса (АГ-АТ) на поверхности эритроцитов, последние склеиваются и равномерно покрывают все дно пробирки или всю лунку пластинки в виде зонтика с неровными краями. При отрицательной реакции скопление эритроцитов имеет вид меленького диска с ровными краями («пуговки») (см. прилож. 3, рис.3).

Ставят контроли специфичности реакции с иммунной антисывороткой (положительная реакция) и нормальной сывороткой (отрицательная реакция).

Контролем спонтанной агглютинации эритроцитов служат реакции со взвесью сенсибилизированных и несенсибилизированных эритроцитов в разведенной нормальной сыворотке.

Недостатки: трудность стандартизации эритроцитов при изготовлении диагностикумов и небольшой срок хранения диагностикумов.

Достоинства: простота и дешевизна.

Эти СР широко применяются. Например, состояние иммунитета против дифтерии у детей и подростков проверяют с помощью РПГА с дифтерийным эритроцитарным диагностикумом (анатоксином). Неиммунными считаются лица с титром антитоксина менее 0,03 МЕ/мл. (1:20).

2) диагностикум дифтерийный эритроцитарный;

3) физиологический раствор;

4) противодифтерийная контрольная сыворотка с активностью 10МЕ/мл;

5) полистероловые пластины (при их отсутствии – пробирки).

Испытуемую сыворотку разводят физ. раствором от 1:10 до 1:20480 в 12 лунках. Реакция ставится в объеме 0,8мл.

Вносят по 1 капле диагностикума в каждую лунку.

Противодифтерийную контольную сыворотку (с активностью 10МЕ/мл) разводят от 1:10 до 1:20480 и вносят также по 1 капле диагностикума.

Оставляют при комнатной температуре на 3 часа (максимум на 15-20 часов) и читают реакцию.

Учет реакции проводят по степени агглютинации эритроцитов, которую оценивают по 4-х кратной системе:

++++ — агглютинировавшие эритроциты ровным слоем выстилают все дно лунки, образуя по форме перевернутый купол; края купола иногда заворачиваются;

+++ — в верхней части агглютината отмечается узкое более широкое плотное кольцо;

++ — в верхней части аглютината более широкое плотное кольцо из эритроцитов, но меньшее по диаметру;

+ — на дне лунки образуется широкое плотное кольцо из эритроцитов, но меньшее по диаметру;

— — на дне лунки имеются плотный диск или плотное широкое кольцо, но уменьшенного диаметра по сравнению с реакцией в +.

Титром антитоксина в исследуемом матариале считают последнее максимальное разведение, которое еще вызывает агглютинацию эритроцитов.

Расчет активности испытуемой сыворотки производят по формуле: Х=(10А)/В, где:

Х – активность испытуемой сыворотки в МЕ/мл.;

10 – титр контрольной сыворотки в МЕ/мл.;

А – максимальное разведение испытуемой сыворотки с полож. Результатом;

В – максимальное разведение контрольной сыворотки с полож. результатом.

2.Реакция коагглютинации, латексаглютинации

Диагностикум представлен стафилококками для коагглютинации и частицыами латекса — для латексреакции, на поверхности которых находятся АТ-ла (см. раздел 3, рис.4).

В случае с фиксированными клетками стафилококка связывание АТ происходит за счет взаимодействия Fс-участками IgС с молекулами протеина А. (раздел 3, рис.4). При получении латексных диагностикумов используют химическое связывание АТ или АГ с полимерной основой частиц или взаимодействие, основанное на гидрофобных силах.

Достоинства: простота постановки.

Недостаток: возможность неспецифической агглютинации.

РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ

Преципитация и агглютинация — это довольно сходные реакции, которые различаются главным образом на основании физических свойств АГ. В первом случае он представлен в растворимой, во втором – в корпускулярной формах. В основе РП лежит образование преципитата в процессе реакции АГ — АТ.

РП высоко специфична и чувствительна.

1. растворимый АГ или гаптен (преципититоген);

2. АТ – преципитины (иммунная преципитирующая сыворотка; получают иммунизацией кроликов соответствующими АГ-ми);

3. изотонический раствор хлорида натрия или агаровый гель.

1) РП в растворах – р. кольцепреципитации; 2) РП в геле

Реакцию кольцепреципитации ставят в узких преципитационных пробирках, в которые разливают преципитирующие сыворотки. Затем наливают раствор преципитиногена. При положительной реакции на границе соприкосновения ингредиентов появляется мутное кольцо преципитации. Если в качестве антигенов в реакции кольцепреципитации используют прокипяченые и профильтрованные водные экстракты органов и тканей, то реакция носит название реакции термопреципитации по Асколи,применяемая для обнаружения термостабильных гаптенов возбудителей сибирской язвы и чумы (см. прилож. 3, рис.6).

Одна из разновидностей РП в геле (реакция Оухтерлони) позволяет определять токсигенность дифтерийной палочки с помощью антитоксической сыворотки. В чашку Петри с питательной средой помещают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной антитоксической противодифтерийной сывороткой и засевают исследуемыми культурами в виде штрихов, перпендикулярных к полоске бумаги. Инкубируют при 37 0 С в течение суток. При наличии токсигенной культуры в месте взаимодействия токсина с антитоксином образуются линии преципитации (см. раздел 3, рис.5).

Реакция преципитации в геле носит название иммунодиффузии. Часто форезом в геле – иммуноэлектрофорез. Принцип метода: исследуемый антиген фракционируют электрофоретически, полученные фракции анализируют методом двойной диффузии при помощи антисыворотки.

Постановка РП по Асколи с целью обнаружения антигена сибиреязвенных бацилл. Для постановки реакции преципитации необходимо иметь:преципитиноген — гаптен B. anthracis (экстракт из тканей), преципитин (преципитирующая сибиреязвенная сыворотка) и физиологический раствор.

1. В колбочку, содержащую 1 г измельчённой кожи или 1 мл культуры B. anthracis налить 10 мл физиологического раствора.

2. Колбу поместить в кипящую баню на 30-45 минут.

3. Профильтровать через асбестную вату. Фильтрат должен быть совершенно прозрачен.

Для реакции преципитации фильтрат разводится в 100 раз и более.

Постановка реакции кольцепреципитации.

1) В преципитационную пробирку наливается 0,3 мл преципитирующей сыворотки цельной или в разведении 1:5, 1:10.

2) По стенке пробирки осторожно наслаивается преципитиноген.

Реакция считается положительной, если на границе двух жидкостей образуется мутное кольцо выпадающего белка не позднее 5-15 минут (см. прилож. 3, рис.6).

При постановке реакции преципитации применяют следующие контроли:

а) антиген и физиологический раствор;

б) специфическая сыворотка и физ. раствор;

в) антиген и неспецифическая сыворотка.

Во всех контрольных пробирках помутнения не должно быть. Для реакции преципитации пользуются специальными преципитационными пробирками высотой 40-60 мм и диаметром 4-5 мм, преципитация в узких пробирках наступает значительно скорее и проявляется более чётко, чем в обычных пробирках, их тщательно моют и высушивают, чтобы стекло их было совершенно прозрачным и сухим.

источник

Способность осаждать антигены путем преципитации или агглютинации основана на особом свойстве антител. Антигены же часто поливалентны и могут связываться с несколькими молекулами антитела. [31]

Этих недостатков лишена реакция преципитации в геле. [33]

На первом этапе реакции преципитации происходит связывание молекул антигена с антителами, но видимых преципитатов не образуется. На втором этапе реакции происходит агрегация возникших ранее комплексов антиген — антитело с образованием больших нерастворимых частиц, видимых невооруженным глазом. Первый этап реакции протекает быстрее, более обратим и специфичен, чем второй. [34]

Для экспресс-диагностики используют реакцию иммунной преципитации с окрашиванием преципитатов флюоресцирующими антителами. Готовят 2 % — ю суспензию фекалий, центрифугируют и пропускают ее через фильтр с диаметром пор 1 2 мкм. Суспензию ( 0 2 мл) смешивают с 0 2 мл разведенной иммунной сыворотки, выдерживают смесь 1 ч при 37 С и центрифугируют 1 ч при 12000 об / мин. Осадок ресуспензируют в 0 2 мл фосфатного буфера и добавляют 0 2 мл флюоресцирующего иммуноглобулина. После инкубации в течение 10 мин смесь центрифугируют 10 мин при 2000 об / мин, осадок ресуспензируют в фосфатном буфере, наносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и исследуют под иммерсионным объективом в люминесцентном микроскопе. [35]

К недостаткам, свойственным электрической преципитации , относятся: а) высокие капитальные затраты; б) большие размеры сооружения; в) существование опасности взрыва. [36]

Известная методика количественного определения преципитации антигена антителом была распространена и на взаимодействие конканавалина А с полисахаридами. Определение проводится следующим образом. Углеводы окисляют, добавляя к смеси 30 % — ную перекись водорода. [37]

Для таких частиц применяется описанная выше электрическая преципитация со взвешиванием осадка на микровесах. В некоторых случаях применяют фильтры из растворимого вещества, например коллодия, сахара и пр. [38]

В результате в образовании полос преципитации принимают участие только те антигены исследуемого образца, которые отличаются от контрольных. [39]

Таким образом, в основе преципитации и агглютинации лежит образование химических связей. [41]

В методе иммунодиффузии Наблюдается полоса преципитации при диффузии препарата в гель, содержащий антитела. Каждая система антиген-антитело образует свою полосу. Диффузия может быть проведена в тонкой пленке геля или в вертикальных трубках. [42]

При достаточно высокой концентрации реагентов полоса преципитации достигает соседнего сектора агаровой пластинки, в котором аналогично формируются полосы преципитации с участием другой антигенной системы. Характер взаимодействия полос преципитации двух сравниваемых систем различен, и как показал Оухтер-лони, определяется степенью сходства антигенов. На основании сравнительного анализа антигенов в РДП в агаровом геле выделяют три вида реакции. Реакция идентичности — полосы преципитации, образованные АГ и AT, плавно сливаются, что указывает на серологическое тождество сравниваемых антигенов. Реакция неидентичности — полосы преципитации, образованные антигенами и антисывороткой к ним, перекрещиваются, что свидетельствует о серологическом различии сравниваемых антигенов. Реакция частичной идентичности — полосы преципитации, образованные антигенами и анти-сывороткой к ним, сливаются, но полоса преципитации, образованная одной из этих систем АГ — — AT, дает отросток — шпору, являющийся непосредственным продолжением одной из полос преципитации. Этот тип реакции рассматривают как случай частичной идентичности антигенов, указывающий на то, что в одной из систем АП несет на себе два различных типа детерминантов, а АГ2, присутствующий в другой системе, имеет детерминанты только одной специфичности. [43]

Иммунохимические методы, основанные на реакции преципитации , очень удобны для качественного и количественного анализа белков, для определения гомогенности белковых препаратов и наличия в них примесей, а также для идентификации компонентов белковых смесей. Как вспомогательный метод реакция преципитации применяется для изучения структуры белка. Преимущество этого метода по сравнению с другими состоит в том, что он может быть использован тогда, когда нельзя провести количественный химический анализ, например при определении данного компонента в смеси белков. Именно в этих случаях результаты, полученные с помощью иммунохимических реакций, могут быть очень полезны. [44]

Центрифугируя реакционную смесь при положительной реакции преципитации , можно удалить образовавшийся преципитат и определить, какой из вух компонентов системы, антиген или антитело, остался в надосадочной жидкости. Тем самым удается выяснить, в избытке какого компонента проходила реакция. Образование преципитата в первом случае свидетельствует об избытке антигена, во втором — об избытке антител. Подобным образом можно определить оптимальное соотношение антиген — антитело для положительной реакции преципитации. [45]

источник