Микротестсистема для биохимической идентификации коринебактерий дифтерии

Инструкция по применению набора реагентов «Микротестсистема для биохимической идентификации коринебактерий дифтерии (МТС-КД)»

по применению набора реагентов

«Микротестсистема для биохимической идентификации коринебактерий

1.1. Набор реагентов предназначен для биохимической идентификации коринебактерий дифтерии, выделенных в ходе бактериологического исследования.

1.2. Выпускается по 10 контейнеров во вкладыше. Один вкладыш с контейнерами в пачке. По 25 пачек в ящике.

Биохимическая идентификация коринебактерий дифтерии осуществляется микробиологическим методом.

Принцип метода – визуальное обнаружение исходного цвета субстратов при посеве исследуемых образцов.

Набор реагентов представляет собой контейнер из прозрачного полистирола с 12 изолированными пронумерованными ячейками с 4 субстратно-индикаторными средами (по три ячейки на каждую среду) в виде осадка (пленки) на дне ячеек контейнера.

Среда № 1 (тест на утилизацию глюкозы):

пептон ферментативный сухой для бактериологических целей 2,0

трис (оксиметил)-аминометан 1,0

Среда № 2 (тест на утилизацию сахарозы):

пептон ферментативный сухой для бактериологических целей 2,0

трис (оксиметил)-аминометан 1,0

Среда № 3 (тест на утилизацию крахмала):

пептон ферментативный сухой для бактериологических целей 2,0

трис (оксиметил)-аминометан 1,0

Среда № 4 (тест на наличие уреазы):

пептон ферментативный сухой для бактериологических целей 1,0

калий фосфорнокислый однозамещенный 0,2

3.АНАЛИТИЧЕСКАЯ И ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ

Идентификация культур, выделенных из нативных образцов, выращенные за 18-20 ч на плотной питательной среде при температуре (37±1) °С.

Соблюдение «Правил устройства, техники безопасности производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения» (Москва, 1981 г.).

5. ОБОРУДОВАНИЕ И РЕАГЕНТЫ

Термостат, обеспечивающий температуру (37±1) °С Пробирки стеклянные Чашки Петри Вода дистиллированная Спиртовка 0,9 % раствор натрия хлорида

Объекты исследований в санитарной и клинической микробиологии.

Идентификацию культур, выделяемых в ходе бактериологического исследования, производят со скошенного 20-% сывороточного агара. Через 18-20 ч при температуре (37±1) °С.

Если выделенная культура микроорганизма находилась какое-либо время на хранении при температуре (22±2) °С или в холодильнике при температуре (6±2) °С, производят предварительный посев ее на питательный бульон.

Посевы инкубируют в течение (3±1) ч при температуре (37±1) °С и осуществляют посев культуры на скошенный питательный агар, который инкубируют в течение 18-24 ч при температуре (37±1) °С.

Затем делают смыв культуры с поверхности скошенного агара 5 мл стерильной дистиллированной воды в обоих рассмотренных случаях посевов.

Извлекают контейнер из пачки.

Регистрируют на бумажной полоске на стенке контейнера номер засеваемого штамма.

Снимают полиэтиленовую ленту (не полностью) и располагают контейнер в чашке Петри.

Стерильной градуированной пипеткой вместимостью 1 мл 2-го класса точности вносят по 0,1 мл микробной суспензии во все ячейки контейнера.

Для создания анаэробных условий заполняют ячейки для выявления ферментации глюкозы, маннита, наличие уреазы и аргининдегидролазы (ячейки № 1,3,11,12) стерильным расплавленным парафином до верха.

Контейнер плотно закрывают той же полиэтиленовой лентой с липким слоем.

Выдерживают контейнер в термостате при температуре (37+1) °С в течение 18-24 ч.

8. РЕГИСТРАЦИЯ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ

Учет результатов проводят визуально в соответствии с таблицей 1.

Цветовой указатель субстратно-индикаторных сред

источник

В современных условиях для изучения биохимической активности микроорганизмов, наряду с классическими варинтами “пестрого ряда”, применяют системы индикаторных бумажек (СИБ) и наборы мультимикротестов (ММТ).

Система индикаторных бумажек (СИБ) позволяет выявлять самые разнообразные ферменты бактерий. Это бумажные диски, пропитанные различными субстратами (индикатором, углеводами, аминокислотами, цитратом, ацетатом, малонатом и др. ве­ществами). Утилизация вещества приводит к изменению рН среды, изме­нению цвета индикатора. Имеются наборы, которые содержат от десяти до тридцати тест-бумажек. Их можно непосредственно вносить в пробирки со взвесью бактерий либо предварительно поместить в лунки пластиковых планшетов, куда будут внесены исследуемые бактерии и уже через 3-4 часа инкубации в термостате можно судить о разложении реактивов по изменению цвета диска. Так, на практике применяют наборы Minitek Enterobacteriaceae lll и Minitek Neisseria для дифференциальной диагностики энтеробактерий (четырнадцать субстратов) и нейссерий (четыре субстрата), позволяющие получить результаты через 4 ч инкубации при 37 °С. Например, СИБы для идентификации вибрионов, энтеробактерий (Россия).

Микро-тест-системы для биохимической идентификации культур.В настоящее время, кроме классических биохимических тестов, для идентификации выделенных культур микробов применяют микро-тест-системы, которые повышают точность результатов за счет стандартизации и увеличения количества тестов (от 15 до 30), менее трудоемки и, следовательно, сокращают время исследования. Наборы мультитестов — это пластиковые планшеты, в лунки которых помещены различные субстраты и индикаторы. Стандартную взвесь исследуемой культуры вносят в лунки и инкубируют при 37°.

Тест-системы делятся на 2 группы в зависимости от содержания субстрата:

1. Системы, в которых субстрат и индикатор находится в питатель­ной среде;

2. Системы, где субстрат и индикатор содержатся в носителе-шаб­лоне, например в бумажных дисках или полимерном шаблоне-носителе.

Тест-системы первой группы представляют собой полистироло­вые пластины с микрообъемными лунками, содержащие обезвоженные дифференциально-диагностические среды. Количество тестов в таких системах составляет около 20 и более. Для небольших лабораторий выпускаются индивидуальные тест-системы, на которых идентифици­руют одну культуру. В лунки вносят суспензию испытуемой культуры в изотоническом растворе, учет проводят после 18-24 часовой инкубации. Примерами таких тест-систем являются ПБДЭ и ПБДС («Диагности­ческие системы», Г.Н.Новгород), семейство систем API (BioMerieux, Франция), Enterotube П (Becton Dickinson, США) и др. Для крупных лабораторий с большим количеством исследуемых культур имеются коммерческие тест-системы из многорядных планшетов на 8-12 культур, со­держащих до 96 лунок, например: ММТ F. 1 и ММТ Е2 («Аллерген», г. Ставрополь), ЭНТЕРО-тест 1 и 2 (Lachema, Чехия).

Инкубация тест-систем проводится в обычных термостатах или в специальных термостатируемых устройствах, входящих в комплект автоматизированных систем, где учет результатов и их интерпретация осуществляется автоматически с помощью компьютера (“Vitek”, BioMerieux, Франция).

Для тест-систем второй группы изучаемую культуру выращивают в жидких питательных средах, в которые по­мещают шаблон-носитель, содержащий субстрат и индикатор к изу­чаемому ферменту. Примером такой тест-системы является Micro-ID (Organon Teknika, США).

При необходимости ускоренной идентификации (когда лабо­ратории работают в круглосуточном режиме) можно использовать коммерческие рапид-системы, в которых тесты основаны не на изменении рН, а на использовании хромогенных или флюорогенных субстратов. Рапид-системы позволяют получить результаты после 4-6 часов инкубации. Примерами коммерческих рапид-систем являются API Rapid 20Е (BioMerieux, Франция), RapiD NF Plus и RapiD ANA П (IDS. США), а также RapID NH для идентификации нейссерий и гемофилов, RapID Е для энтеробактерий и др., позволяющие получить результаты не позднее 4-8 ч.

При идентификации выделенной культуры микроба определяют, чаще всего, ее видовую принадлежность, но иногда достаточно опреде­лить род или принадлежность к определенной группе. Учет результатов проводят визуально или с использованием специальных считывающих устройств — ридеров, которые повышают достоверность результатов и снижают субъективизм оценки. Каждый положительный результат оценивается знаком «+», а отрицательный — знаком. В некоторых случаях перед учетом результата теста в лунку необходимо добавить специальные проявляющие реактивы.

Фирмы, выпускающие микро-тест-системы, как правило, предла­гают к тестам и «Фирменные» программы для компьютерной обработки результатов.

III. План практической работы

1. Изучить схему идентификации чистых культур бактерий

2. Изучить макроскопически и микроскопически чистоту выделенной культуры, зарисовать

3. Выполнить посевы для определения гликолитических и протеолитических свойств выделенной чистой культуры бактерий

4. Учесть результаты определения гликолитических (на средах Гисса) и протеолитических (на МПБ с индикаторными бумажками) свойств выделенных чистых культур бактерий

5. Заполнить таблицу « Дифференциально-диагностические среды»

6. Дать заключение о видовой принадлежности выделенных чистых культур бактерий (используя дифференциально-диагностическую таблицу)

7. Решить ситуационные задачи

IV. Примеры ситуационных задач

Больной Р, 35 лет, поступил в инфекционное отделение городской больницы № 1 с гнойной ангиной, предположительно стафилококковой этиологии. Какая питательная среда должна быть использована в этом случае, обоснуйте свой выбор.

1. Среда Эндо
2. ЖСА
3. Является дифференциально-диагностической средой и позволяет изучить биохимические свойства микроорганизмов
4. Является элективной питательной средой и позволяет выявить наличие лецитиназы

Больная К, 42 лет, поступила в инфекционное отделение городской больницы № 2 с подозрением на дизентерию. После выделения чистой культуры предполагаемого инфекционного агента необходимо провести биохимическую идентификацию возбудителя, для этого необходимо использовать:

1. Среду Эндо
2. Среды Гисса
3. МПБ или пептонную воду
4. Среду Левенштейна-Йенсена,

которые позволяют изучить:

1. антигенные свойства выделенной чистой культуры
2. сахаролитические (гликолитические) свойства выделенной чистой культуры
3. протеолитические свойства выделенной чистой культуры
4. фибринолитические свойства выделенной чистой культуры

Теоретические вопросы для рубежного контроля знаний

1. Состав и требования, предъявляемые к питательным средам

2. Классификация питательных сред

4. Дезинфекция, методы и контроль эффективности дезинфекции

5. Стерилизация, методы, аппаратура и режимы стерилизации

6. Методы определения эффективности стерилизации

7. Вид, штамм, колония, чистая культура микроорганизмов

8. Методы выделения чистых культур микроорганизмов

9. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний. Цель и последовательность выполнения 1 этапа бактериологического метода выделения аэробов

10. Техника посева микроорганизмов на жидкие и плотные питательные среды

11. Особенности культивирования анаэробных микроорганизмов. Аппаратура и оборудование, используемая для культивирования анаэробных бактерий

12. Метаболизм микроорганизмов

13. Ферментные системы микроорганизмов

14. Классификация бактерий по типу питания. Источники углерода, азота, макро- и микроэлементов, ростовых факторов для микробов

15. Механизмы питания бактерий

16. Классификация микроорганизмов в зависимости от источника энергии

17. Классификация бактерий по типу дыхания — биологического окисления

19. Условия культивирования бактерий

20. Рост и размножение бактерий. Фазы размножения бактерий.

21. Бактериологический метод исследования. Проведение 2 этапа бактериологического метода выделения аэробов. Культуральные свойства бактерий

22. Проведение III этапа бактериологического метода выделения чистых культур микроорганизмов. Схема идентификации микроорганизмов

23. Определение чистоты выделенной культуры

24. Использование ферментативной активности бактерий для идентификации микроорганизмов

25. Методы определения гликолитической активности микроорганизмов

26. Методы определения протеолитической активности бактерий

27. Определение окислительно-восстановительных ферментов бактерий

28. Системы для биохимической идентификации бактерий

Общие условия выбора системы дренажа: Система дренажа выбирается в зависимости от характера защищаемого.

Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим.

Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций.

Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰).

источник

Род Corynebarteriurn (от лат. Сoryne- булава)– гр+ палочковидные бактерии, не образующие спор, не имеющие жгути­ков. Содержат зерна волютина, расположенные чаще всего на концах палочек, они часто превышают размеры попереч­ника бактерии и придают вид булавы. Также имеются включения липидов и крахмала, который откладывается при недостатке кислорода.

В состав клеточной стенки входят специфические только для бактерий рода Corynebacterium липиды: эфиры коринемиколовой и коринемиколиновой кислот, димикола, фосфатиды маннозы и инозита.

В организме человека обитают условно-патоген­ные: С.diphtheriae, С.pseudodiphtheriticiim (hofmanii), С.xerosis, С.ulcerans. С.diphtheriae вызывает у человека дифтерию, другие – возбудители вторичных инфекций.

КОРИНЕБАКТЕРИЙ ДИФТЕРИИ С.diphtheriae.

Морфология.Пря­мые или слегка изогнутые палочки. В препаратах располагаются под углом др к др в виде букв L, V или китайских иероглифов. Зерна волютина (на концах палочек) выявляются при окраске синькой Леффлера или по методу Нейссера. Факультативные анаэробы, хорошо размножаются при свободном доступе кислорода. К пит средам требовательны: не способны утилизировать азот из ам­монийных соединений, требу­ют наличия почти всех АК, солейMg, Zn, Cu, Fe; необходимы углеводыисп среды, полу­ченные на основе фермента­тивного расщепления белка (казеина, дрожжей) с добав­лением крови или сыворотки. На пов плотных сред с КТе дифтерийные палочки образуют ТЕМНО-СЕРЫЕ ИЛИ ЧЕРНЫЕ колонии (биовары гравис, способны расщеплять крахмал, или миттис). Рост на скошенном сывороточном агаре сравнивают с ШАГРЕНЕВОЙ КОЖЕЙ, колонии не сливаются.

Расщепляют глюк и др моно- и дисахариды с образованием КИСЛОТЫ БЕЗ ГАЗА, восстанавливают нитраты, расщепляют цистеин.

Лизируются спе­цифичны для отдельных видов вирулентными фагами, что позволяет устанавливать фаговары исследуемых культур.

АГ.Имеют белковую капсулу, которая содержит К-АГ. Опре­деление этого АГа позволяет установить серовар (их более 10). Группоспецифический ПС АГстенки дает перекрестные реакции с микобактериями, нокардиями.

Экология и распространение.Передается аэрозольным (воздушно-капель­ным) путем. В настоящее время часто регистрируется у ВЗРОС­ЛЫХ (тяж формы). Токсигенность связана ЛИЗОГЕНИЗАЦИЕЙ специфичес­ким профагом. Выделяясь в окр среду со слюной, пленками, дифтерийные палочки сохраняют жизнеспо­собность в течение нескольких дней. Хорошо переносят высушивание. Чувствительны к дез растворам, антибиоткам.

Патогенность и патогенез.Заболе­вание развивается у лиц, не имеющих антитоксического иммунитета. На месте внедрения (зев, гортань, трахея, реже – нос, ухо) развивается местный воспалительный процесс. Все па­тогенные виды обладают фимбриямиАДГЕЗИЯ к хозяина, они выявляют­ся в РА трипсинизированных бараньих эритроцитов.

ТОКСИГЕННОСТЬ – способность секретировать гистотоксин, что про­является в виде локальной воспалительной реакции и в общей интоксикации, особенно чувствительны к нему НАДПОЧЕЧНИКИ, МИОКАРД, НС. Токсин блокирует синтез белка, что приводит к гибели→ некроз и ле­тальный исход.

ФЕРМЕНТЫ (гиалуронидаза, нейраминидаза,фибринолизин) обеспечивают распространение в тканях, но бактериемия клинически не проявляется.

КОРД-ФАКТОР нарушает фосфорилирование и дыхание МК.

Иммунитет.Наиболее восприимчивы дети 1–4 лет. Вырабатывается не очень прочный антитоксичес­кий иммунитет, возможны повторные заболевания дифтерией. Невосприимчивость зависит главным образом от содержания в крови антитоксина и АТ (опсонины, преципитины, комплементсвязывающие). Уровень антитоксического иммунитета устанавливают, определяя в крови Ат вРНГА с эритроцитарным диагностикумом (эр-ты нагружены дифтерийным анатоксином). Титр 1:20 и вышеиммунность обследуемого. Т/же применяетсяреакция Шика(внутрикожно вводят дифтерийный токсин, у НЕИММУННЫХ людей – местная воспалительная реакция, при наличии антитоксина реакции нет).

Лаб диагностика.Исп бактериологический и бактериоскопический (ориентировочный) – в мазках обнаруживают палочки с ти­пичной морфологией. Посевы для выделения возбуди­теля делают на элективные среды, выделяют чистые культуры идентифицируют, принадлежность к роду устанавливают по мор­фологическим и культуральным признакам, вид С.diphtheriae определяют по БХ свойствам (способность продуци­роватьH₂Sна средах с цистеином и неспособности рас­щеплять мочевину). Биовары гравис и митис различают по фер­ментации крахмала и по морфологии колоний.

Профилактика и лечение.Основное значение имеет активная иммунизация, создание антиток­сического иммунитета. Иммунизируют детей начиная с 3-месячного возраста, по схеме вводят вакцину, содержащую как один из компонентов дифтерийный анатоксин (АКДС, АДС).

Лечение начинают сразу, вводят антитоксическую противодифтерийную сыворотку. СЕРОТЕРА­ПИЯ эффективна в ранний период болезни, пока токсин еще не фиксирован клетками и ткани существенно не повреж­дены. Кол-во антитоксической сыворотки зависит от тяжести инфекции, ее формы и прочих клинических дан­ных. Возможна антибактериальная терапия.

источник

Изобретение предназначено для внутривидовой идентификации коринебактерий дифтерии. Биомассу исследуемой культуры коринебактерий дифтерии высушивают с помощью ацетона. Извлекают внутриклеточные растворимые белки цитрат-фосфатным буфером (рН 7,4). Обработку проводят в течение 18-20 ч. Отделяют центрифугированием жидкую фракцию. Проводят электрофорез в ПААГ. Типируют культуры по спектрам внутриклеточных растворимых белков. Изобретение позволяет получить белковый спектр каждой культуры, являющийся стойкой штаммовой характеристикой, что приводит к повышению точности внутривидовой идентификации.

Изобретение относится к микробиологии и касается способа внутривидовой идентификации коринебактерий дифтерии. Внутривидовая дифференциация на уровне штамма имеет теоретическое значение при физиолого-биохимическом изучении основ жизнедеятельности микроорганизмов, а также может использоваться в микробиологии, иммунологии, эпидемиологии для совершенствования организации эпиднадзора, стандартизации лечебно-профилактических и диагностических биологических препаратов, стандартизации исследований.

Известно несколько способов внутривидовой дифференциации Corynebacterium diphtheriae, характерных и для других видов разных таксономических групп, это: биотипирование, фаготипирование, серотипирование, колицинотипирование. Эти способы имеют общий недостаток — нестабильность признаков, по которым ведется дифференциация. Кроме того, колицинотипирование редко применяется из-за громоздких схем (Н.А. Кравченко, О.Д. Трофимова. 1980, 1981).

Фаготипирование не нашло широкого применения из-за отсутствия коммерческих препаратов — диагностических фагов и использовалось в основном для исследовательской работы в эпидемиологических целях (С.С. Маркина. Автореферат дис. канд. М., 1971; С.С. Маркина, И.П. Линева, А.В. Солодовникова, Л. Н. Поликарпова. Сб. науч. тр. «Острые детские инфекции». М., 1978. т. XIX, с. 54; Г.Г. Ломоносова, Г.П. Сальникова, И.И. Водорацкая, Т.М. Упорова. Сб. науч. тр. «Острые детские инфекции». М., 1978, т. XIX, с. 57).

Серотипирование дифтерийной палочки в России было предложено в 1961 г. В. С. Сусловой и М.В. Пелевиной (Ж. Микроб., эпид., иммун. М., 1961, N 8, с. 15-19).

В результате перекрестной реакции агглютинации и адсорбции была принята единая рабочая схема серологической классификации дифтерийных микробов. Она имела недостатки из-за отсутствия в наборе эталонных культур штаммов, относящихся к нетоксигенным бактериям типа gravis, циркулирующим в 60-е годы. В связи с этим предлагались дополнительные сыворотки, приготовленные к наиболее распространенным штаммам (Ю.Г. Казьмина с соавт. В кн.: Труды Московского института эпидемиологии и микробиологии, т. XIII. М., 1969, с. 90-96; Н.Н. Костюкова с соавт. Ж. Микроб., 1971, N 6, с. 60-65; М.Д. Крылова с соавт. Ж. Микроб. , 1973, N 11, с. 3-8; В.В. Черкасова с соавт. В. сб.: Острые детские инфекции. М. , 1975, т. XVI, с. 45-48). Позднее появился коммерческий набор сывороток диагностических дифтерийных неадсорбированных сухих для реакции агглютинации (РА), который выпускается Предприятием по производству бактерийных препаратов Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского.

Сущность серотипирования заключается в обнаружении с помощью соответствующего антитела специфических антигенов. Однако поверхностные антигены, определяющие серотип, подвержены изменчивости. Изменение антигенного состава приводит к появлению культур неагглютинирующихся или полиагглютинабельных, так как для них не разработаны типовые сыворотки.

Для серотипирования коринебактерий дифтерии применяются реакция агглютинации на стекле и пробирочная реакция. Реакция на стекле ставится следующим образом. Пастеровской пипеткой на обезжиренное спиртом предметное стекло наносят каплю сыворотки в нужных разведениях, вблизи капли — петлю испытуемой культуры, выращенной на плотных питательных средах (свернутая сыворотка, агар Мартена или мясо-пептонный с сывороткой, агар фосфатный). Обе капли смешивают и тщательно растирают. Для контроля культуры в каплю 3% раствора натрия хлористого вносят одну петлю культуры и тщательно растирают. Учет реакции производят в течение 2-3 мин. Положительный результат — появление хлопьев агглютината при полном просветлении жидкости. Отрицательный результат — гомогенная мутная жидкость (контроль).

Для постановки пробирочной РА готовят нужные разведения сыворотки и переносят каждое в отдельные пробирки по 0,5 мл. Культуру, выращенную на плотных питательных средах, смывают 3% раствором натрия хлористого, эмульгируют быстрым вращением пробирки. Устанавливают густоту взвеси, равную 10 ед. , определяя ее по стандартному образцу для определения мутности бактерийных взвесей, и вносят по 0,5 мл взвеси в пробирки с разведенной сывороткой. Контролями служат две пробирки: в одну вносят 1,0 мл исходного разведения сыворотки (1: 100) — контроль сыворотки, в другую — 0,5 мл 3%-ного раствора натрия хлористого и 0,5 мл микробной взвеси — контроль культуры.

Пробирки встряхивают и помещают в термостат на 18-24 ч. Учет результатов реакции производят невооруженным глазом по характеру выпавшего агглютината и степени просветления надосадочной жидкости по четырехкрестной системе.

Целью предлагаемого изобретения является повышение точности способа внутривидовой идентификации коринебактерий дифтерии.

Поставленная цель достигается сопоставлением качественных характеристик спектров внутриклеточных растворимых белков сравниваемых культур, по «рисункам» которых судят о принадлежности культур к одному или разным штаммам.

Коринебактерии дифтерии, выделенные от больных, носителей или хранящиеся в ампулах в лиофилизированном состоянии (после растворения физиологическим раствором), высевают на мясо-пептонный агар с добавлением 5% гемолизированной донорской крови на чашки Петри.

Культуру смывают через 24 часа физиологическим раствором (pH 7,4) с мертиолятом в концентрации 1:10000. Клетки трижды отмывают физиологическим раствором при 9000 g в течение 30 мин. Затем проводят дважды обработку клеток ацетоном и однократно эфиром.

Клеточную массу высушивают на воздухе интенсивным перемешиванием до образования сыпучего порошка. Высушенные клетки хранят при +4 o C неограниченно долго. Белковые экстракты получают путем вытяжки белков из ацетонового порошка цитратно-фосфатным буфером (pH 7,4) в течение 18-24 ч при температуре +4 o C. Осадок отделяют центрифугированием при 9000 g в течение 30 мин. Количество белка определяют по Лоури или спектрофотометрически.

Электрофорез в полиакриламидном геле проводят общепринятым методом (Davis, Ornstein, 1964), используя в качестве образца 0,03 мл вытяжки внутриклеточных растворимых белков. Полученные электрофореграммы сравнивают.

Было изучено 82 культуры коринебактерий дифтерии. В работу были взяты варианты gravis и mitis токсигенные и нетоксигенные. Это были как музейные культуры, хранящиеся во Всесоюзном музее патогенных культур ГИСК им. Л.А. Тарасевича, так и свежевыделенные штаммы в 1993-94 гг. от больных и носителей. При изучении различных белковых систем (внеклеточные белки, мембранные белки, внутриклеточные растворимые белки) было показано, что только спектры внутриклеточных растворимых белков были индивидуальными для каждого штамма, т.е. «рисунки» спектров отличались друг от друга. Кроме того, были взяты три группы культур при трех различных эпидемических ситуациях в разных детских учреждениях Нижнего Новгорода. Эпидемиологически было показано, что внутри каждой группы культуры связаны между собой и предположительно являются одним штаммом. Спектры внутриклеточных растворимых белков показали идентичные культуры внутри групп. Спектры белков разных групп были различны.

Предлагаемый метод позволяет идентифицировать культуры коринебактерий дифтерии на уровне штамма, исключив трудоемкий этап изготовления высокоспецифических сывороток и подготовку культур, содержащих специфический антиген. С помощью данного метода повышается точность анализа, так как можно получить белковый спектр каждой культуры.

Набор белков, содержащийся внутри клетки коринебактерий, является стойкой характеристикой.

Данное изобретение может быть использовано при диагностике дифтерийной инфекции, при расследовании различных эпидситуаций, при массовом обследовании населения. Способ может использоваться при идентификации коринебактерий дифтерии от больных и носителей спонтанно полиагглютинабельных или инагглютинабельных штаммов, когда применение серологических методов не эффективно.

Способ внутривидовой идентификации Corynebacterium diphtheriae путем выращивания исследуемой культуры на плотной питательной среде с последующим типированием коринебактерий дифтерии, отличающийся тем, что выросшую культуру высушивают с помощью ацетона, извлекают внутриклеточные растворимые белки цитрат-фосфатным буфером, pH 7,4 в течение 18 — 20 ч, центрифугированием отделяют жидкую фракцию, проводят электрофорез в ПААГ и типируют культуру по спектрам внутриклеточных растворимых белков.

источник

Определение родовой, видовой и таловой принадлежности микроорганизмов на основании изучения морфологических, тинкториальных, культуральных, ферментативных и антигенных свойств — наиболее ответственная часть микробиологического исследования.

Большое количество патогенов, принимающих участие в возникновении инфекционного процесса, обусловливает применение различных тестов по определению ферментативных свойств путем постановки большого количества биохимических реакций, что позволяет в комплексе с другими данными определить вид микроорганизма. Этот наиболее трудоемкий процесс выполняется в несколько этапов, требует большого количества дифференциально-диагностических сред, реактивов, посуды, что значительно удорожает стоимость анализа и удлиняет сроки его проведения. Результаты удается получить через 4…7 сут. Поэтому для идентификации микроорганизмов наиболее перспективны микрообъемные коммерческие тест-системы (МТС). Они избавляют практических бактериологов от трудоемких и дорогостоящих процедур и позволяют получать стандартные, сопоставимые, воспроизводимые данные, экономят реактивы, ускоряют выдачу результата анализа.

Коммерческие тест-системы для биохимической идентификации микроорганизмов различных групп представляют собой готовые к использованию полистироловые планшеты и панели с сухими дифференцирующими средами или субстратами, которые выпускаются разными производителями.

Коммерческие тест-системы на основе полистироловых планшетов. В Российской Федерации наибольшее распространение получили следующие тест-системы.

1. Микротест-системы (ФГУП НПО «Питательные среды», г. Махачкала) для идентификации микробов. Они представляют собой контейнер из прозрачного полистирола, состоящий из 12 одинаковых ячеек, которые содержат сухие питательные среды с различными углеводами, многоатомными спиртами, аминокислотами, солями неорганических кислот и индикатором pH, стабилизированные поливиниловым спиртом. Перечень выпускаемых МТС для идентификации микроорганизмов, имеющих ветеринарное назначение, включает в себя МТС-М-12Е (биохимическая идентификация энтеробактерий), МТС-5У (определение ферментативной активности энтеробактерий), МТС-С (биохимическая идентификация стафилококков), МТС-Стреп (биохимическая идентификация стрептококков), МТС-Л (биохимическая идентификация листерий), МТС-Сальм (биохимическая идентификация сальмонелл).

2. МТС («Плива-Лахема», Чехия) для биохимической идентификации энтеробактерий (ЭНТЕРО-тест 16; ЭНТЕРО-тест 24; ЭНТЕРО-скрин; ЭНТЕРО-Рапид 24), для энтерококков (ЭН-коккус-тест), стафилококков (СТАФИ-тест 16), стрептококков (СТРЕПТО-тест 16), анаэробов, выделенных из пищевых продуктов и кишечника (АНАЭРО-тест 23), бактериальной бета-лактамазной активности (бета-ЛАКТАМ-тест).

3. Одноразовые диагностические пластины (НПО «Диагностические системы», НИИЭМ, г. Нижний Новгород) ПБДБ (для идентификации энтеробактерий) и ПБДС (для идентификации стафилококков).

4. Системы на основе стандартных 96-луночных микротитровальных планшетов для идентификации энтеробактерий (ММТ-Е1 и ММТ-Е2) (Ставропольская государственная медицинская академия).

5. Наборы для ускоренной (в течение 5 ч) идентификации энтеробактерий РапидЭнтеро 200 и РапидЭнтеро 750 (НИИЭМ им. Пастера, г. Санкт-Петербург).

Помимо вышеперечисленных используют и зарубежные диагностические системы для идентификации различных микроорганизмов в течение 3…48 ч: API, ID (Bio Merieux, Франция), BBL Crystal (Becton Dikinson), «MicroScan» (Dade, США), MicroTax (Sy-Lab, Австрия).

Диагностические полоски и диски для биохимической идентификации микроорганизмов. Системы индикаторные бумажные (СИБ) представляют собой полоски или диски из хроматографической бумаги, пропитанные соответствующим субстратом и индикатором и покрытые для стабилизации водным раствором поливинилового спирта.

Реакцию ставят, как правило, пробирочным методом. В пробирку помещают 0,3 мл физиологического раствора или мясопептонного бульона, затем туда вносят петлей колонию изучаемого микроба и соответствующий диск. Учет реакции через 4…5 ч по изменению цвета бумажного диска. Срок годности СИБ составляет 1 год. СИБ для идентификации энтеробактерий производит НПО «Диагностические системы» (НИИЭМ, г. Нижний Новгород), коммерческие наборы СИБ для ускоренного определения колититра воды — ФГУП НПО «Питательные среды» (г. Махачкала). СИБ по сравнению с МТС гораздо дешевле, зато работа с ними требует больше труда и времени.

Могут быть использованы как дополнительные к планшетным, так и самостоятельно в качестве идентификационных диагностические полоски («Плива-Лахема» производит семь типов). Диагностические полоски представляют собой пластмассовые полоски, на одном конце которых наклеена полоска индикации из фильтровальной бумаги, содержащей субстрат для выявления бактериального фермента или метаболита. В зависимости от типа полосок бактериальную культуру или наносят непосредственно на зону индикации полоски, или ее опускают в пробирку с исследуемой бактериальной суспензией и выращивают в течение определенного времени. Перечень выпускаемых диагностических полосок включает в себя: 1) ОКСИ-тест (для выявления бактериальной цитохромоксидазы); 2) ОНР-тест (для обнаружения β-галактозидазы); 3) ГИППУРАТ-тест (для обнаружения способности бактерий гидролизовать гиппурат натрия, а также для предварительной идентификации стрептококков группы B и Campylobacter jejuni); 4) ПИРА-тест (для быстрого выявления активности фермента пирролидонилариламидазы), а также для дифференциации энтерококков (тест положительный) от стрептококков (за исключением S. pyogenes); 5) ВП-тест (для постановки реакции Фогэс—Проскауэра за 2…4 ч).

Помимо диагностических полосок можно использовать также диагностические диски («Плива-Лахема»), позволяющие проводить простую селективную изоляцию и дифференциацию бактерий прямо на питательной среде. Диски из фильтровальной бумаги содержат определенные концентрации высушенных реагентов для выявления специфической бактериальной активности.

1. Диски с бацитрацином (10 ЕД). Применяют для селективной изоляции Haemophilus spp. при первичном культивировании. Тест основан на устойчивости Haemophilus spp. к высоким концентрациям бацитрацина по сравнению с сопутствующей флорой и саттелитного роста микроорганизмов этого рода в зоне диффузии экзогенных факторов роста из культуры S. aureus.

2. Диски с бацитрацином S. Предназначены для предварительной индикации β-гемолитических стрептококков группы А (S. pyogenes). Тест основан на высокой чувствительности S. pyogenes к незначительным концентрациям бацитрацина (0,04 ЕД), обеспечивающей образование зон задержки роста вокруг диска. Другие β-гемолитические стрептококки резистентны к таким дозам или образуют незначительные зоны ингибиции роста.

3. Диски с оптохином. Предназначены для рутинной первичной индикации S. pneumoniae и дифференциации их от других зеленящих стрептококков. Принцип теста основан на избирательной чувствительности пневмококков к оптохину и резистентности к нему других зеленящих стрептококков.

Общие правила работы с МТС. Методика проведения микробиологических исследований с использованием МТС должна полностью соответствовать прилагаемой инструкции. Общая схема работы с тест-системами состоит из следующих этапов.

1. Выделение культуры. Для работы с МТС используют только чистые культуры. При их выделении особое внимание следует уделять качеству питательных сред. От этого зависит видовой состав изолированных микроорганизмов, их количество в исследуемом материале и успех идентификации. По результатам первичного посева и микроскопии проводят дифференциацию культур на грамположительные и грамотрицательные кокки и палочки.

2. Приготовление бактериальной суспензии. Суспензию готовят в рекомендованной суспензионной среде из чистой 18…24-часовой культуры определенной степени мутности согласно инструкции. Использование слишком густой или жидкой суспензии может привести к ложным результатам. Параллельно делают контрольный высев взвеси культуры на кровяной агар для проверки ее чистоты, ростовых свойств и (или) для постановки дополнительных тестов.

3. Инокуляция. Суспензию тщательно встряхивают; необходимый объем вносят в каждую лунку соответствующего ряда. После этого в определенные лунки для создания анаэробных условий добавляют по 2 капли стерильного вазелинового или парафинового масла.

4. Инкубация. Планшеты в полиэтиленовых пакетах или закрытые крышками инкубируют при 30…37 °С в течение 4…48 ч.

5. Оценка результатов. По окончании выращивания проверяют чистоту культуры по контрольному посеву. При отсутствии роста увеличивают время инкубации. Затем добавляют в определенные лунки необходимые реактивы, позволяющие визуализировать или усилить цветные реакции. Учет проводят визуально с помощью специальных таблиц, цветовых шкал и (или) цветных реакций контрольных штаммов и заносят их в бланки.

6. Идентификация. Проводят с помощью таблиц биохимической активности, индексов профилей, книг-кодов или компьютерных программ.

При окончательной идентификации учитывают дополнительную информацию (микроскопия, характер колоний, наличие гемолиза, пигментообразование, подвижность и т. д.).

При работе с тест-системами следует придерживаться следующих рекомендаций.

1. Строго соблюдать правила работы с инфицированным материалом.

2. После употребления МТС необходимо обезвреживать автоклавированием при (120+2) °С в течение 1 ч.

3. Строго соблюдать условия и сроки хранения в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к тест-системам.

4. Если культуру не удается идентифицировать, следует проверить ее чистоту и повторить исследование.

5. При отсутствии роста на контрольной чашке необходимо увеличить время инкубации.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

источник

Глава 17 СОВРЕМЕННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В КЛИНИЧЕСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ 17.1. Микрометоды для идентификации микроорганизмов различных групп и определения их антибиотикочувствительности

Дифференциация и идентификация возбудителей (опреде­ление родовой, видовой и типовой принадлежности микроор­ганизмов) – наиболее ответственный этап микробиологичес­кого исследования. Он осуществляется на основании изучения целого комплекса свойств микроорганизмов: морфологичес­ких, тинкториальных, культуральных, ферментативных и анти­генных.

Широкий спектр микроорганизмов, играющих роль в воз­никновении инфекционного процесса, требует изучения фер­ментативной активности выделенных микроорганизмов путем постановки большого количества различных биохимических реакций, позволяющих по сочетанию полученных результатов в комплексе с другими данными определить вид микроорга­низма. Этот раздел работы наиболее трудоемкий, проводится в несколько этапов, требует приготовления большого количе­ства питательных сред, дефицитных реактивов, посуды и т.д. При переходе от классических методов к современным ориен­тир следует смещать от многоступенчатых исследований к уни­фицированной процедуре с приданием большего значения стандартизации, ускорению, воспроизводимости, миниатюри­зации и автоматизации.

Коммерческие микротест-системы или слайды для биохими­ческой идентификации микроорганизмов различных групп – это готовые к использованию полистироловые панели (или планшеты) с сухими дифференциальными средами. В нашей стране такие тест-системы производят в Ставрополе (ФГУП «Аллерген»), Махачкале (НПО «Питательные среды»), Ниж­нем Новгороде (НПО «Диагностические системы»), Санкт-Пе­тербурге (НИИЭМ им.Л.Пастера). Достаточно известны в на­шей стране диагностические панели API (фирма «bioMerieux», Франция), BBL Crystal (фирма «Becton Dickinson», США), тест-панели «Bio-Rad» (Франция), MICRO-LA-TEST (фирма «PLIVA-Lachema», Чехия) и др. для идентификации различных микроорганизмов.

Для работы широкого круга микробиологических лаборато­рий с практической точки зрения наилучшим образом себя зарекомендовали тест-системы мультимикротестов для биохи­мической идентификации энтеробактерий (ММТ El и ММТ Е2) и коринебактерий (ММТ D) производства ФГУП «Ал­лерген», а также диагностикумы MICRO-LA-TEST фирмы «PLIVA-Lachema» для идентификации широкого спектра воз­будителей, ответственных за возникновение гнойно-воспали­тельных и инфекционных заболеваний (энтеробактерий и виб­рионы, стафилококки, стрептококки, энтерококки, нефермен-тирующие грамотрицательные бактерии, анаэробы, нейссерии). Данные микротест-системы представляют собой цельнолитую или стрипованную (разделенную на 8-луночные стрипы) пластмас­совую пластинку-планшет размером 8,5 х 12,5 см с 96 лунками. В лунках содержатся высушенные питательные среды и суб­страты для биохимических реакций, которые растворяются по­сле добавления суспензии микроорганизмов (инокулята испы­туемых штаммов). Дифференциальные биохимические тесты-ре­акции в тест-системах подобраны таким образом, чтобы про­вести идентификацию наибольшего количества таксонов за один этап. В течение времени инкубации во время размноже ния микроорганизмов происходят биохимические реакции, ре­зультаты которых можно зарегистрировать либо визуально, либо при помощи приборов-фотометров по изменению цвета индика­тора (рис. 17.1). В дальнейшем техника работы с тест-системами будет рассмотрена на примере указанных тест-систем.

Рис. 17.1. Микротест-система для идентификации микроорганизмов.

17.1.1. Общие правила работы с микротест-системами для идентификации микроорганизмов

Методика проведения микробиологических исследований с использованием микротест-систем должна полностью соответ­ствовать инструкциям, прилагаемым к каждому виду тест-сис­тем. Качество тест-систем контролируют с помощью контроль­ных референтных бактериальных культур, перечень которых приводится в инструкциях к тест-системам. Тем не менее суще­ствует общий унифицированный подход к идентификации мик­роорганизмов при помощи микротест-систем, техника работы с которыми достаточно проста и состоит из следующих этапов.

При идентификации микроорганизмов необходимо работать только с чистой культурой, поскольку присутствие посторон­них микроорганизмов может исказить результаты исследова­ния и послужить поводом для ошибочного заключения. Выде­ляют чистые культуры общепринятыми в микробиологии ме­тодами. Особое внимание следует уделять качеству питатель­ных сред, используемых для выделения возбудителей инфек­ционного процесса. От этого зависят и количество идентифи­цируемых видов, и успех идентификации.

По результатам первичного посева и данных микроскопии проводится дифференциация культур на грамположительные и грамотрицательные кокки и палочки.

1. Приготовление бактериальной суспензии:

• бактериальную суспензию готовят в суспензионной среде (прилагается к тест-системе или указывается в инструк­ции) из чистой 18–24-часовой культуры бактерий опре­деленной степени мутности по стандарту МсFarland (для отечественных тест-систем – стандарт ОСО). Тщательно гомогенизируют суспензию. Слишком густая или жидкая суспензия может привести к ложным результатам;
• параллельно делают контрольный высев суспензии куль­туры на кровяной агар для проверки чистоты культуры, ее ростовых свойств и(или) для постановки дополнитель­ных тестов;
• эту же суспензию используют для постановки дополни­тельных тестов с диагностическими полосками. 1

1. Инокуляция:

• суспензию бактерий тщательно встряхивают и в необхо­димом объеме (указывается в инструкции) инокулируют в ячейки в соответствии с инструкцией к тест-системе;
• после инокуляции в определенные лунки для создания анаэробных условий добавляют стерильное вазелиновое (или парафиновое) масло.

1. Инкубация:

• инокулированные тест-системы в полиэтиленовых паке­тах или прикрытые крышками инкубируют в термостате при температуре 30–37 °С в течение 4–48 ч (в зависи­мости от вида тест-системы).

1. Оценка результатов:

• по окончании инкубации проверяют чистоту культуры по контрольному посеву;
• при отсутствии роста в лунках следует увеличить время (продолжительность) инкубации;
• добавляют в определенные лунки необходимые реактивы;
• учитывают результаты биохимических реакций визуально с помощью таблиц «Интерпретация реакций» и(или) цветовых шкал и заносят их в бланки.

1. Идентификация:

– идентификацию проводят с помощью таблиц биохими­ческой активности, профильных индексов, диагностичес­ких регистров (книг кодов) или компьютерной про­граммы.

При окончательной идентификации следует учитывать всю дополнительную информацию о культуре микроорганизма (микроскопию, характер роста колоний, наличие пигмента, подвижность, источник выделения и т. д.). При идентифика­ции с помощью таблиц биохимической активности проводят поиск вида культуры с аналогичными результатами реакций. Такой метод пригоден и достаточно достоверен для групп с малым количеством тестов и таксонов. Идентификацию с ис­пользованием профильных индексов применяют для определе­ния вида бактерий путем вычисления их цифрового профиля. Это позволяет проводить интерпретацию результатов по стан­дартной процедуре. В профильные индексы включено боль­шинство возможных комбинаций тестов, с их использованием возможна идентификация типичных культур, включенных в «Идентификационную таблицу» тест-системы.

Методика расчета профиля культуры. Результаты срабатыва­ния биохимических реакций переводят в цифровой код – про­филь. Для этого всю последовательность тестов в тест-системе (от первого до последнего) разбивают на триады. В каждой из триад положительно сработавшим тестам присваивают число­вые значения: первый тест в триаде –»1″, второй тест в триаде – «2», третий тест в триаде – «4». Всем отрицательным результатам присваивается «0».

Суммируют числовые значения в триадах. Полученный чис­ловой код соответствует профилю исследуемого микроорганизма.

Фер­мента­ция глю­козы

Аце­тоин (VРТ)

Индол (IND)

Саха­роза (SUC)

Уреаза (URE)

Лизин (LYS)

(ORN)

Био­хими­ческий ряд

В книге кодов полученный профиль (код) 361 соответствует культуре вида Klebsiella pneumoniae/pneumoniae.

На практике аналогично рассчитанный профиль использу­ется при идентификации с помощью книг кодов, при этом для каждого таксона определяются два следующих показателя:

▲ процент идентификации (%id) – показывает, насколько по­лученный профиль соответствует идентифицируемому мик­робу по сравнению с другими таксонами, включенными в банк данных (%id – критерий отличия микроба от других таксонов);

▲ Т-индеке (Tin) – показывает соответствие профиля полу­ченной культуры большинству типичных реакций для иден­тифицированного таксона. Значение этого показателя ва­рьирует от 0 до 1 и обратно пропорционально количеству атипичных для таксона тестов.

Книги кодов позволяют получать достоверную идентифика­цию и в случае выявления 1–2 атипичных для исследуемого таксона результатов (тестов).

Идентификация микроорганизмов семейства Enterobacteriaсеае. Идентификацию микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae следует проводить с использованием микротест-систем: ММТ El и ММТ Е2 (ФГУП «Аллерген»), ENTEROtest 24, ENTEROtest 16, ENTERO-Rapid 24, ENTERO-Screen, а также диагностических полосок COLItest и SALMtest («PLIVA-La­chema») и других диагностикумов.

Применение систем мультимикротестов ММТ El и ММТ Е2. Системы мультимикротестов ММТ El и ММТ Е2 предназна­чены для определения биохимической активности и последую­щей идентификации наиболее распространенных представите­лей семейства энтеробактерий и дифференциации их от неко­торых бактерий из семейства вибрионов в течение 18–24 ч. ММТ El позволяет определить 12 ключевых тестов: образова­ние сероводорода, индола, наличие лизиндекарбоксилазы, ор-нитиндекарбоксилазы, уреазы, фенилаланиндезаминазы, ути­лизация цитрата натрия, малоната натрия, маннитола, сахаро­зы, лактозы и сорбита. ММТ Е2 позволяет определить 12 дополнительных биохимических свойств, которые в сочетании с 12 ключевыми тестами, определяемыми в ММТ El, служат для видовой идентификации энтеробактерий: наличие арги-ниндегидролазы, бета-галактозидазы, нитратредуктазы, утили­зация инозитола, дульцита, арабинозы, рамнозы, мальтозы, адонита, раффинозы, салицина, глюкозы.

Для идентификации используют чистую культуру со среды Эндо или кровяного агара. Ставят тест на ферментацию глю­козы (O/F-тест) на среде Хью–Лейфсона для установления принадлежности выделенной культуры к группе ферментирующих микроорганизмов и тест на оксидазу для дифференциа­ции энтеробактерий от вибрионов и других оксидазоположи-тельных культур.

Применение микротест-системы ENTEROtest 24. ENTERO­test 24 предназначен для определения биохимической актив­ности и идентификации наиболее важных для патологии чело­века микроорганизмов семейства энтеробактерий и дифферен­циации их от некоторых представителей семейства вибрионов в течение 18–24 ч. ENTEROtest 24 позволяет провести для каждой культуры 24 биохимических теста, размещенных в трех­рядных стрипах (3×8 лунок): индол, сероводород, лизин, орнитин, уреаза, аргинин, цитрат Симмонса, малонат натрия, фенилаланин, бета-галактозидаза (ONPG), инозит, адонит, цел-лобиоза, сахароза, трегалоза, маннитол, ацетоин (Фогес– Про-скауэр), эскулин, рамноза, сорбитол, мелибиоза, раффиноза, дульцит, глюкоза.

Для идентификации используют чистую культуру со среды Эндо или кровяного агара. Ставят тест на ферментацию глю­козы (O/F-тест) на среде Хью–Лейфсона для установления принадлежности выделенной культуры к группе ферментиру­ющих микроорганизмов и тест на оксидазу для дифференциа­ции энтеробактерий от вибрионов и других оксидазоположи-тельных культур.

Применение микротест-системы ENTEROtest 16. ENTEROtest 16 предназначен для определения биохимической активности и последующей идентификации наиболее важных для патоло­гии человека микроорганизмов семейства энтеробактерий в течение 18–24 ч. Система представляет собой двухрядный стрип (2×8 лунок) с высушенными питательными средами и реагентами для определения 16 ключевых тестов: сероводород, лизин, индол, орнитин, уреаза, фенилаланин, эскулин, цитрат Симмонса, малонат, инозит, адонит, целлобиоза, сахароза, сор­битол, трегалоза и маннитол. Идентификация должна быть дополнена тестами на бумажных полосках для определения цитохромоксидазы, бета-галактозидазы и продукции ацетоина (VP-тест).

Для идентификации используют чистую культуру со среды Эндо, кровяного агара или агара MacConkey. Следует также поставить тест на ферментацию глюкозы для установления факта принадлежности выделенной культуры к группе фермен­тирующих микроорганизмов. Ставят тест на выявление цито­хромоксидазы с помощью полосок OXI-тест для выявления оксидазоположительных микроорганизмов из родов Aeromonas, Plesiomonas и Vibrio. Биохимическую идентификацию сальмо­нелл, шигелл и кишечной палочки, выделенной у больных с гастроэнтеритами, подтверждают серологически.

Ускоренные методы идентификации некоторых энтеробактерий

Применение микротест-системы ENTERO-Screen. ENTERO-Screen предназначен для ускоренной (в течение 4 ч) иденти­фикации энтеробактерий, наиболее часто встречающихся при мочевых и других инфекциях, а также для выявления сальмо­нелл и кишечной палочки в санитарно-эпидемиологических исследованиях. Система представляет собой стрип (8 лунок) с субстратами для определения 8 ключевых тестов: глюкоза в анаэробных условиях, ацетоин, фенилаланин, индол, сахароза, уреаза, лизин, орнитин. Идентификация должна быть допол­нена тестами на бумажных полосках: OXI-тест, PYR-тест на выявление пиразы, SALMtest для обнаружения присутствия сальмонелл и COLItest для обнаружения присутствия E.coli.

Для идентификации используют чистую культуру со среды Эндо, агара MacConkey, кровяного агара, ставят тест на цито-хромоксидазу (OXI-тест).

Следует обращать внимание на то, что некоторые культуры сальмонелл могут показывать отрицательную или замедленную реакцию в тестах на лизин или орнитин. В случае подозрения на принадлежность к роду сальмонелл выполняют расширен­ную идентификацию при помощи набора ENTEROtest 16 или ENTEROtest 24. Аналогично поступают с культурами, которые не удалось идентифицировать при помощи ENTERO-Screen. При окончательной идентификации учитывают всю дополни­тельную информацию (характер роста колоний, микроскопию, утилизацию лактозы, подвижность, источник выделения и т.д.). При отрицательном тесте ферментации глюкозы в анаэ­робных условиях можно предположить отнесение данной куль­туры к неферментирующим бактериям.

Применение микротест-системы ENTERO-Rapid 24. Набор ENTERO-Rapid 24 предназначен для быстрой идентификации наиболее важных для патологии человека энтеробактерий за 4 ч при помощи 24 тестов, размещенных в трехрядных стрипах (3×8 лунок): индол, лизин, орнитин, уреаза, сахароза, сорбитол, трегалоза, глюкоза, пираза, эскулин, целлобиоза, мелибиоза, салицин, манноза, мальтоза, раффиноза, ацетоин (Фогес– Проскауэр), фенилаланин, малонат натрия, бета-галактозидаза (ONPG), бета-глюкуронидаза, альфа-галактозидаза, бета-кси-лозидаза, ^ацетил-бета-О-глюкозаминидаза.

Использование диагностических полосок для ускоренной ори­ентировочной идентификации сальмонелл и кишечной палочки (SALMtest, COLItest). Диагностическая полоска SALMtest пред­назначена для обнаружения типичного для рода сальмонелл признака – активности фермента С8-эстеразы. Высокая чувст­вительность теста по отношению к роду сальмонелл вместе с несложной методикой выполнения и быстротой получения результатов реакции позволяют применить SALMtest в скринин-говых исследованиях для обнаружения сальмонелл не только в клинике, но и в пищевой промышленности и т.п.

Принцип действия SALMtest фермент С8-эстераза гидро-лизирует 4-метилумбеллиферил каприлат, содержащийся в тес­товой зоне полоски. Освобожденный 4-метилумбеллиферрон под воздействием ультрафиолетовых лучей (применяется УФ-лампа с длиной волны испускаемого света около 360 нм) флюоресцирует синим светом, что регистрируется как положи­тельная реакция.

Методика постановки SALMtest:

∆ для тестирования используют 24-часовую культуру, подо­зрительную на сальмонеллы, со среды Эндо, агара с брил­лиантовым зеленым, агара МасСоnкеу, агара с эозин-метиленовым синим1;

∆ добавляют на тестовую зону полоски приблизительно 10 мкл специального реактива для SALMtest;

∆ при помощи микробиологической петли распределяют про­веряемую культуру по зоне; в случае чистой культуры (или же достаточно хорошо изолированных друг от друга коло­ний на агаровой среде) можно снимать культуру с поверх­ности агара, приложив к ней непосредственно полоску;

∆ полоску инкубируют 10–15 мин при комнатной температуре;

∆ по истечении упомянутого времени учитывают реакцию под УФ-лампой; положительная реакция проявляется возникно­вением синей флюоресценции в зоне полоски;

∆ штаммы с положительной реакцией в последующем иден­тифицируют, например, при помощи набора ENTERO-Screen.

Примечания к методике постановки SALMtest:

∆ при проведении теста всегда используют отрицательный контроль: реактив добавляют на зону полоски и инкубируют без нанесения бактериальной культуры;

∆ считывание реакции под УФ-лампой выполняют в темноте, лучше всего в специальной установке, предназначенной для оценки флюоресценции (например, шкаф Гансена);

∆ несмотря на то, что SALMtest дает ложноположительные реакции у некоторых микроорганизмов, он дает положи­тельный результат у 100 % сальмонелл.

Диагностические полоски СОLItest предназначены для бы­строй идентификации кишечных палочек и дифференциации их от других грамотрицательных оксидазоотрицательных бактерий, выделенных из клинического материала, пищевых про­дуктов, воды и т.д. Идентификация основана на определении глюкуронидазной активности и образования индола. Результа­ты анализов учитываются через 4 ч инкубации в термостате.

Принцип метода: фермент бета-глюкуронидаза расщепляет 4-метилумбеллиферил-D-глюкуронид с высвобождением при этом 4-метилумбеллиферона, который в ультрафиолетовых лу­чах флюоресцирует голубым светом. Продукция индола из L-триптофана определяется по появлению красного окраши­вания после добавления специфического реагента на индол (р-диметиламинобензальдегид).

Методика постановки СОLItest:

∆ для проведения исследования используют культуру коли-формных бактерий и(или) грамотрицательных оксидазоот-рицательных палочек;

∆ готовят 0,5–1,0 мл суспензии тестируемого микроорганизма в стерильном физиологическом растворе, мутность суспен­зии должна соответствовать номеру 3 по шкале McFarland;

∆ помещают полоску СОLItest в пробирку с суспензией (бу­мажная зона полоски должна быть полностью погружена в суспензию);

∆ инкубируют пробирки с полосками при температуре 37°С в течение 4 ч (предварительный результат теста на глюку-ронидазную активность может быть получен через 1 ч).

∆ сначала учитывают результаты глюкуронидазной реакции в темном месте с использованием УФ-лампы (длина волны 360 нм);

∆ затем в пробирку с суспензией добавляют 4–5 капель реак­тива на индол.

у типичных штаммов кишечной палочки – глюкуронидаза (+), индол (+). У некоторых штаммов кишечной палочки мо­жет быть глюкуронидаза (–), индол (+) или глюкуронидаза (+), индол (–). Такие штаммы подлежат дальнейшей идентифика­ции при помощи микротест-систем1.

Идентификация неферментирующих микроорганизмов при по­мощи микротест-системы при помощи микротест-системы NEFERMtest 24. NEFERMtest 24 предназначен для биохимической идентификации грамотрицатель­ных неферментирующих бактерий, прежде всего из клиничес­кого материала. При помощи этой тест-системы можно также выполнить идентификацию встречающихся в клинической практике представителей ферментирующих оксидазоположи-тельных грамотрицательных палочек. Тест-система представля­ет собой трехрядный стрип (3×8 лунок) с субстратами для проведения 24 тестов: индол, аргинин, уреаза, лизин, глюкоза, фруктоза, инозитол, сахароза, фосфатаза, бета-галактозидаза, бета-глюкозидаза, М-ацетил-бета-Б-глюкозаминидаза, манни-тол, ксилоза, целлобиоза, галактоза, нитраты, нитриты, эскулин, гамма-глутамилтрансфераза, лактоза, мальтоза, трегалоза и цитрат Симмонса.

Чистую культуру следует выделять на кровяном агаре (агар с кровью барана). С чистой 24-часовой культурой ставят тест на выявление цитохромоксидазы (полоска OXI-тест). При окон­чательной идентификации следует учитывать всю дополнитель­ную информацию (источник выделения бактерий, характер роста колоний, микроскопию и другие характеристики: нали­чие пигмента или флюоресценции, рост при температуре 42 °С, гемолиз, рост на агаре MacConkey, наличие каталазной ак­тивности, подвижности, гидролиза желатина, результаты O/F-теста).

Идентификация стафилококков при помощи микротест-систе­мы STAPHYtest 16. STAPHYtest 16 предназначен для быстрого и надежного отличения стафилококков от других грамположительных кокков (Micrococcus, Stomatococcus и Aerococcus), про­стой и быстрой идентификации клинически важных видов стафилококков. Тест-система представляет собой двухрядный вертикальный стрип (2×8 лунок) с субстратами для проведе­ния 16 тестов: уреаза, аргинин, орнитин, бета-галактозидаза, бета-глюкуронидаза, нитраты, фосфатаза, пирролидониларила-мидаза, эскулин, сахароза, трегалоза, маннитол, ксилоза, маль­тоза, манноза, глюкоза/новобиоцин. Дополнительно следует использовать бумажные полоски для определения ацетоина (VP-тест) и определения цитохромоксидазы (OXI-тест).

Выделяют чистую культуру на кровяном агаре в соответст­вии с инструкцией к тест-системе.

Идентификация стрептококков при помощи микротест-систе­мы STREPTOtest 16. STREPTOtest 16 предназначен для опре­деления биохимической активности и идентификации стреп­тококков по 16 биохимическим тестам, расположенным в двух­рядном стрипе (2×8 лунок): гиппурат, фосфатаза, лейцинами-нопептидаза, бета-глюкуронидаза, альфа-галактозидаза, эску­лин, аргинин, уреаза, маннитол, сорбитол, трегалоза, лактоза, раффиноза, инулин, мелибиоза и рибоза. Идентификацию сле­дует дополнить тестами на бумажных полосках для выявления пирролидонилариламидазы и образования ацетоина.

Чистую культуру выделяют на агаре с кровью барана. Ин­кубацию посевов производят в атмосфере с содержанием 5 % углекислого газа. Для выявления каталазной активности мик­роорганизмов ставят тест на предметном стекле с 3 % раство­ром перекиси водорода.

При окончательной идентификации следует учитывать всю дополнительную информацию о культуре (микроскопию, ха­рактер роста колоний, наличие пигментообразования, гемолиз, источник выделения и т.д.).

Идентификация энтерококков при помощи микротест-системы EN-COCCUStest. EN-COCCUStest позволяет идентифициро­вать клинически значимые виды энтерококков при помощи восьми биохимических тестов (стрип из 8 лунок): аргинин, сорбоза, арабиноза, маннитол, сорбитол, мелибиоза, раффино­за и мелецитоза. Для выявления типичного для энтерококков теста – активности пирролидонилариламидазы – следует ис­пользовать тест-полоску PYR-тест.

Для идентификации используют чистую культуру, выращен­ную на агаре с кровью барана. Ставят другие тесты для под­тверждения принадлежности изолята к роду энтерококков. При окончательной идентификации следует учитывать всю допол­нительную информацию (источник выделения, микроскопию, характер роста колоний и т.д.). Образование желтого пигмента и подвижность являются важными признаками при идентифи­кации энтерококков.

Идентификация нейссерий при помощи микротест-системы NEISSERIAtest. Тест-система NEISSERIAtest предназначена для определения биохимической активности оксидазоположи-тельных, грамотрицательных кокков и коккобацилл, позволяет идентифицировать патогенные нейссерий (N.gonorrhoeae, N.me­ningitidis) и Moraxella (Branhamella) catarrhalis и дифференциро­вать их от сапрофитирующих нейссерий. Тест-система содер­жит субстраты для определения 7 ключевых биохимических тестов (один стрип из 8 лунок): глюкоза, мальтоза, фруктоза, сахароза, гамма-глутамилтрансфераза, трибутирин, синтез по­лисахаридов. 8-я лунка стрипа содержит высушенную пита­тельную среду для постановки контроля. Дополнительно сле­дует провести тест на наличие бета-галактозидазы (при помо­щи полоски ONP-тест).

Чистую культуру следует выделять на шоколадном агаре или сывороточном агаре. Чашки с агаром перед посевом нагревают до 35–37 °С. Чашки после посева инкубируют при повышен­ном содержании углекислого газа и в атмосфере повышенной влажности воздуха при температуре 35–37°С в течение 18–24 ч. Из чистой культуры делают мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют, ставят тесты на наличие оксидазы и ката-лазы. Грамотрицательные кокки и диплококки с положитель­ной реакцией на оксидазу и каталазу следует идентифицировать с помощью NESSERIAtest (исключение составляет N.elongata, представляющая собой каталазоотрицательную па­лочку).

При окончательной идентификации следует учитывать всю дополнительную информацию (микроскопию, характер роста колоний, гемолиз, пигментацию и т.д.).

Идентификация коринебактерий при помощи микротест-сис­темы ММТ D. Тест-система предназначена для определения биохимической активности и определения токсигенности ко­ринебактерий дифтерии и дифференциации их от других ко­ринебактерий, встречающихся в клиническом материале. Тест-система содержит субстраты для определения 5 ключевых био­химических тестов: глюкоза, сахароза, крахмал, уреаза, нит­раты – и диагностические бумажные диски для определения токсигенности.

Чистую культуру выделяют на среде мартеновский агар или питательный агар с добавлением 20 % сыворотки крупного рогатого скота или нормальной лошадиной сыворотки.

Учитывают результаты планшетных тестов и теста на ток-сигенность. Идентификацию следует проводить с учетом дан­ных по характеру роста, морфологии колоний, микроскопии, наличия цистиназы (проба Пизу), источников изоляции и др.

Идентификация анаэробов при помощи микротест-системы ANAEROtest 23. ANAEROtest 23 предназначен для биохимичес­кой идентификации анаэробных бактерий, прежде всего из клинического материала и из пищевых продуктов. Тест-систе­ма представляет собой тройной стрип (3×8 лунок) с реагентами для проведения 23 тестов: индол, глюкоза, мальтоза, фруктоза, галактоза, лактоза, мелецитоза, уреаза, нитраты, сахароза, са­лицин, трегалоза, маннитол, рамноза, N-ацетил-бета-D-глюко-заминидаза, бета-глюкозидаза, эскулин, манноза, раффиноза, целлобиоза, ксилоза, арабиноза и сорбитол.

Выделяют чистую культуру с использованием сред, реко­мендованных для изоляции и культивирования анаэробных бактерий, например агар Wilkins-Chalgren. Из чистой культу­ры готовят мазок и окрашивают по Граму, учитывают морфо­логию (форму и агрегацию клеток, наличие спорообразования). Окраску по Граму в сомнительных случаях можно дополнить тестом со щелочью (3 % раствор КОН). Грамположительные палочки следует проверить на терморезистентность (выдержи­вание в течение 15 мин при температуре 80 °С). Для контроля проводят культивирование каждого штамма в аэробных усло­виях.

Особенности приготовления бактериальной суспензии и инокуляции планшета:

• • в соответствии с инструкцией к тест-системе из чистой 48-часовой культуры следует приготовить суспензию в суспензионной среде для ANAEROtest 23. Мутность суспензии должна соответствовать номеру 3 по стандарту мутности Мсrland. При гомогенизации ампулу с суспензионной средой держат в вертикальном положении и двигают петлей по ее внутренней поверхности, предупреждая попадание воздуха в суспензионную среду. Инокулирование тест-сис­темы не должно превышать 20 мин.

ANAEROtest 23 следует инкубировать с индикатором анаэ­робной атмосферы.

Идентификация. По микроскопии относят идентифицируе­мую анаэробную культуру к одной из четырех групп:

∆грамположительные спорообразующие палочки;

∆ грамположительные неспорообразующие палочки;

При окончательной идентификации анаэробных бактерий следует учитывать всю дополнительную информацию (источ­ник выделения, характер роста колоний, результаты тестов на патогенность и токсигенность, а также другие характеристики).

Наиболее частые причины неудач при идентификации мик­роорганизмов с использованием коммерческих микротест-сис­тем следующие:

∆ наличие смешанной культуры;

∆использование суспензий микроорганизмов с недостаточ­ной мутностью или в недостаточном объеме;

∆ перекрестная контаминация суспензий в расположенных рядом лунках;

∆ соответствующие лунки не заполнены парафиновым мас­лом;

∆ попадание реактивов в лунки соседнего ряда; Д нарушение инструкции к тест-системе при проведении ис­следования;

∆ недостижение анаэробной атмосферы при культивировании

∆ возможно выделение штамма с нетипичными свойствами или

его данные не заложены в идентификационные таблицы.

17.1.2. Применение микротест-систем для оценки антибиотикочувствительности

Оценка антибиотикочувствительности микроорганизмов требует тщательной стандартизации всех этапов исследования, наличия качественных питательных сред и антибиотиков (это относится как к методу серийных разведений, так и к диско-диффузионному методу). Одним из удобных и достаточно эко­номичных путей преодоления описанных проблем является использование готовых мик­ротест-систем, действие кото­рых основано на принципе метода серийных микроразве­дений в варианте погранич­ных концентраций (тест по­граничных концентраций – ТПК). Их применение избав­ляет от проведения наиболее трудоемких подготовительных этапов исследования (приготовления и стандартизации пита­тельных сред с растворами антибиотиков), врач получает воз­можность сконцентрировать свое внимание на получении чис­той культуры микроорганизма и стандартизации суспензии. В Государственном научном центре по антибиотикам (ГНЦА, Москва) выпускаются тест-системы ТПКтест, которые разра­ботаны на основе стандартных 96-луночных планшетов, что позволяет проводить как визуальный учет результатов, так и автоматизированный с использованием планшетных фото­метров.

Рис. 17.2. Микротест-система ТПК-тест для определения анти­биотикочувствительности мик­роорганизмов.

ТПК-тест – это микротест-система однократного примене­ния, позволяющая определить чувствительность четырех ис­следуемых микроорганизмов одновременно к 11 или 12 анти­биотикам Или шести микроорганизмов к 8 антибиотикам. В на­стоящее время выпускаются 5 типов тест-систем с оптималь­ными наборами антибиотиков для групп микроорганизмов: энтеробактерий, грамположительных бактерий, псевдомонад, возбудителей уроинфекций, стафилококков. ТПКтест (рис. 17.2) представляет собой полистироловый планшет (8×12 лу­нок), в котором содержатся 4 или 6 аналогичных наборов высушенных растворов антибиотиков в питательной среде. Каждый антибиотик представлен двумя пограничными кон­центрациями, позволяющими дифференцировать микроорга­низмы по степени чувствительности на три категории: «чувст­вительные», «умеренно-устойчивые» и «устойчивые». Большая концентрация соответствует минимальному значению МПК (минимальная подавляющая рост микроба концентрация) для устойчивых штаммов, малая концентрация соответствует мак­симальному значению МПК для чувствительных штаммов. Пример расположения и концентрации антибиотиков в лунках планшета ТПКтест на 4 культуры и 11 антибиотиков приведен на схеме-таблице.

Пример расположения антибиотиков на планшете ТПК-тест

источник