Мазок на дифтерию документ

Забор материала на коклюш

( метод кашлевых пластинок)

Цель:собрать материал для бактериологического исследования

—чашка Петри с питательной средой КУА;

—стерильный шпатель в лотке;

— бланк — направление в баклабораторию;

Обязательное условие: забор материала производится натощак или через 2-3 часа после еды.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Как то на паре, один преподаватель сказал, когда лекция заканчивалась — это был конец пары: «Что-то тут концом пахнет». 8181 — | 7872 — или читать все.

195.133.146.119 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно

источник

ЦЕЛЬ СЕСТРИНСКОГО ДЕЛА:

Забор материала для уточнения диагноза.

здоровые дети перед оформлением в ДДУ, дети- больные ангиной, скарлатиной, дифтерией, дети контактные с инфекционными заболеваниями, с заболеваниями органов дыхания, ЦНС.

Стерильные пробирки («зев», «нос») с сухими тампонами, штатив, шпатель, направление, перчатки, дез. раствор.

Подготовка: Забор материала проводится натощак, до орошения или полоскания горла; ребенка усадить или уложить перед источником света.

Подготовка к процедуре:

объяснить цель и ход предстоящей процедуры ,получить информированное согласие на ее проведение.

Пробирки маркируют (из зева, из носа). Пишут направление с указанием: Ф. И. ребенка, возраст, место жительства или палата, название посылаемого материала, цель исследования и дата.

Обработать руки гигиеническим способом, осушить их, надеть перчатки, маску.

Забор производят, как правило, из зева и носа.

Пациента просят откинуть голову назад и закрыть глаза.

При хорошем освещении осматривают, пользуясь шпателем, горло.

Медсестра берет в левую руку шпатель, прижимает им корень языка ребенка, а правой рукой извлекает из пробирки («зев») тампон, и очень осторожно (чтобы не коснуться щек, языка), касается слизистой миндалин на границе налета, дужек, задней стенки глотки. Опускает тампон в пробирку, стараясь не касаться наружной стенки пробирки

Для взятия мазка из носа берут из пробирки «нос» стерильный тампон правой рукой, первым пальцем левой руки слегка приподнимают кончик носа. Осторожно, не касаясь наружной поверхности носа, вводят тампон сначала в один, а потом в другой носовой ход. Взятый материал опускают в пробирку.

Не следует касаться тампоном языка, щек или зубов.

При заборе материала используется предварительно прогретая угольная транспортная среда Эймса, срок доставки в лабораторию не более 48 часов при температуре 20-25 °С.

На бланке направления указывают противомикробные препараты, которые пациент недавно получал. На маркировке указывают, откуда взят материал, фамилии пациента дату и время взятия материала, подозреваемую инфекцию, особенно вызываемую С. diphtheriae (необходимы два тампона — зев и нос).

Окончание процедуры:

Обработать руки в перчатках дез. раствором.

Снять перчатки и маску, обработать руки гигиеническим способом, осушить их.

Сделать запись о манипуляции в медицинской документации.

Отправить материал и направление в бактериологическую лабораторию.

Осложнения: Повреждение слизистой оболочки.

При дифтерии в атипичных (т.е. редких локализаций)формах забор материалов

Дифтерия носа протекала в атипичной,(катаральной и катарально-язвенной)- отечность, гиперемию, кровоточивость слизистой. На слизистой носовой перегородки наблюдали эрозии, афты или корочки. На границе перехода слизистой носа в кожу наружного отверстия носа определяли инфильтрацию, гиперемию,эрозии или корочки

Дифтерия кожи .-Атипичная форма протекала в виде экземы,импетиго, гнойничковых сыпей

Дифтерия кожи.-Это крайне редкая локализация

Брать надо аккуратно не повреждая лишний раз язвы и не вызывая кровоточивости.

Как проводится процедура

Бояться ее совсем не стоит. Все, что требуется от пациента – это подставить свой нос и открыть рот, чтобы медсестра взяла образцы инструментом, напоминающим ватную палочку. В носовой ход эта палочка погружается не более, чем на 2 см, так что никаких повреждений она вызвать не способна, мазок из зева тоже берется очень осторожно, поэтому особенно неприятных ощущений ожидать не стоит: ну, может, будет легкий дискомфорт, но никак не рефлекторная рвота или что-то подобное.

После взятия материала «палочка» будет помещена в специальную транспортную среду и отправлена в лабораторию, а пациенту только и останется, что дождаться результатов.

Правила взятия и доставки крови для проведения лабораторных исследований методом ИФА на ВИЧ-инфекцию и СПИД-индикаторные заболевания.

Взятие крови производится из локтевой вены в чистую сухую пробирку в количестве 3-5 мл. У новорожденных можно брать пуповинную кровь с указанием об этом в направлении. Полученный материал не рекомендуется хранить более 12 часов при комнатной температуре и более 1 суток в холодильнике при +4-8 0С. Наступающий гемолиз может повлиять на результаты анализа. В случае невозможности доставки материала в течение суток следует сразу после взятия крови отобрать из нее сыворотку. Сыворотка отделяется центрифугированием. Отделенная сыворотка переносится в чистую (лучше стерильную) пробирку, флакон или пластиковый контейнер, и в таком виде она может храниться до 7 дней при температуре +4-8 0С. На пробирке следует указать порядковый номер, фамилию и инициалы пациента, в строгом соответствии с направлением. Для транспортировки в КДЛ диагностики ВИЧ штативы с пробирками помещают в термоконтейнер, легко подвергающийся дезинфекции. Полученный материал в КДЛ диагностики ВИЧ доставляет медицинский персонал, прошедший специальный инструктаж в установленном порядке.

Обменный журнал и направление оформляются строго по форме №264/у-88 разборчивым почерком, с четким указанием на какие виды исследований направляется материал; зачеркивать, вносить в направление изменения, поправки категорически запрещено! Обменный журнал и направление помещают в полиэтиленовый пакет и доставляют вместе с образцами крови. При доставке сыворотки по запросу и ИЗв сопроводительных документах необходимо выделять такие образцы пометкой «ПОВТОР», при невозможности взятия второй порции сообщить письменно (!).

источник

Микробиологическое исследование, позволяющее выявить возбудителя дифтерии (C. diphtheriae) в исследуемом биоматериале.

Посев на бациллы Леффлера, посев на BL, посев на дифтерийную палочку.

Corynebacterium diphtheriae сulture, Diphtheria сulture.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

• За 3-4 часа до взятия мазков из ротоглотки (зева) не употреблять пищу, не пить, не чистить зубы, не полоскать рот/горло, не жевать жевательную резинку, не курить. За 3-4 часа до взятия мазков из носа не закапывать капли/спреи и не промывать нос. Взятие мазков оптимально выполнять утром, сразу после ночного сна.

Общая информация об исследовании

Corynebacterium diphtheriae (бациллы Леффлера) – это грамположительные бактерии рода Corynebacterium, являющиеся возбудителями дифтерии и способные к выработке дифтерийного токсина. Заболевание передается воздушно-капельным путем, источником инфекции являются больные люди или бактерионосители.

Инкубационный период составляет в среднем 2-5 дней. Происходит фибринозное воспаление слизистых оболочек ротоглотки и дыхательных путей с формированием псевдомембран и с симптомами общей интоксикации.

При токсической форме дифтерии также может поражаться сердце и нервная система. В некоторых случаях возможно бессимптомное носительство.

Диагноз «дифтерия» основывается на клинических данных, посев на дифтерию проводится для подтверждения.

Для чего используется исследование?

• Для подтверждения диагноза «дифтерия».
• Для дифференциальной диагностики заболеваний, протекающих со сходными симптомами, таких как ангины различного происхождения, паратонзиллярный абсцесс, инфекционный мононуклеоз, острый ларинготрахеит, эпиглоттит, бронхиальная астма.
• Чтобы оценить эффективность проводимой антибактерильной терапии.

Когда назначается исследование?

• При подозрении на дифтерию.
• Когда известно, что пациент контактировал с больными дифтерией.
• После проведения антибактериальной терапии – не менее чем через 2 недели после окончания курса антибиотиков.
• В некоторых случаях перед госпитализацией в стационар (с профилактической целью).

Референсные значения: нет роста.

Выявление возбудителя дифтерии подтверждает диагноз «дифтерия» или, если симптомы заболевания отсутствуют, свидетельствует о бактерионосительстве. При отрицательном результате посева у больного с подозрением на дифтерию диагноз может быть подтвержден в том случае, когда у контактных лиц результат посева положительный, то есть выделяется возбудитель дифтерии.

Причины положительного результата

• Дифтерия или бессимптомное носительство C. diphtheriae.

Причины отрицательного результата

• Отсутствие дифтерии. Исключение составляют случаи, когда на момент исследования проводилось лечение антибиотиками.

Что может влиять на результат?

• Предшествующая антибактериальная терапия.



Диагноз «дифтерия» основывается на клинической картине заболевания, поэтому лечение должно быть начато до получения лабораторного подтверждения заболевания. При положительном результате посева необходимо исследовать выделенный штамм С. diphtheriae на токсигенность.

Кто назначает исследование?

Инфекционист, терапевт, врач общей практики, педиатр, ЛОР.

источник

Злоупотребление антибиотиками расшатывает психику

Сон и его влияние на здоровье

Сон играет значительную роль в жизнедеятельности человека. По времени он занимает 6-10 часов в сутки. Потребность в количестве сна разная на разных этапах жизни человека.

Психологическая готовность женщины к родам

Природа дифтерии. -Дифтерия — одно из самых распространенных заболеваний, с которыми приходится иметь дело с офицером здравоохранения. Его природа и способ ее распространения были установлены с большой степенью точности. Методы его профилактики и контроля были стандартизированы и могут легко применяться каждым сотрудником здравоохранения и врачом.

Дифтерия — это заболевание горла, носа или трахеи, вызванное бактерией, называемой палочкой Клебса-Леклера. Бациллы производят белую или желтую мембрану, которая обычно хорошо видна, когда она находится на миндалинах и окружающих ее частях, но может быть настолько тонкой, что она едва ли может быть заметной. Если он находится в носу или трахее, его расположение предотвращает его видимость. Другие бактерии часто растут с дифтерийными бациллами и производят вздутия и абсцессы. Болезнь, как правило, развивается в течение нескольких часов или дней после заражения микробами.

У нас в стране большинство женщин ходят под впечатлением «страшных» историй подруг, родственников, знакомых и знакомых их знакомых о тяжелых родах. Недомолвки, вздохи и слова: «Какой кошмар!» — помогают будущей маме нарисовать непонятную, но ужасную картину того, что происходит с женщиной во время родов.

Опасность дифтерии состоит в двух причинах: 1 — отравление токсинами бацилл; и 2, препятствие трахеи, препятствующее дыханию. Токсин дифтерии вызывает быстрое и общее отравление клеток организма и особенно сердца. Также может произойти отравление нервов, что приведет к параличу, особенно двигательным нервам горла.

Признание дифтерии. -Дифтерия может быть заподозрена, если есть какие-либо проблемы с горлом; или если дыхание затруднено; или если есть признаки паралича горла, такие как затруднение при глотании. Обычно наблюдается лихорадка и большая слабость тела. Может быть больное горло, хотя худшие случаи часто безболезненны из-за паралича нервов. Если нет никакой болезненности, не может быть никаких особых признаков, чтобы привлечь внимание к горлу, и болезнь может достичь опасной стадии, прежде чем ее существование будет заподозрено.

Еще в прошлом веке беременность всегда была сюрпризом, а сейчас женщины стараются планировать ее наступление. Внезапная беременность может резко изменить планы на жизнь, а желанная доставляет много радости. Если определить благоприятные дни для зачатия ребенка, то к беременности можно тщательно подготовиться, решить все важные дела и устранить проблемы со здоровьем. К тому же планирование беременности настраивает психоэмоциональный фон и готовит женщину к встрече долгожданного ребенка.

Существует два метода распознавания дифтерии: 1, глядя в горло для мембраны; и 2, взяв культуру из горла или носа. Когда врача зовут к больному ребенку, неизменным правилом должно быть то, что он заглядывает в горло ребенка. Врачи иногда уступают желаниям ребенка или его родителей и не рассматривают горло, и поэтому они часто не распознают дифтерию на ранних стадиях, в то время как ее можно легко вылечить. Наличие пятен или мембраны на миндалинах или в другой ситуации в задней части горла сильно указывает на дифтерию, но это не всегда является доказательством болезнь, поскольку они могут быть вызваны другими причинами, такими как простой тонзиллит или септическая ангина, или стенокардия Винсента.

При любом остро возникшем воспалении горла врачами-инфекционистами рекомендуется мазок на дифтерию. Чрезмерная осторожность предупреждает весьма плачевные последствия заболевания. У детей, особенно не привитых по календарю, иногда встречается серьезная интоксикация, есть риск развития массивного отека горла и даже смерти.

Культуры. Единственное верное указание на дифтерию — найти дифтерийные бациллы в культуре из горла или носа. Департамент здравоохранения штата Нью-Йорк требует, чтобы каждый случай имел мембрану в горле, независимо от того, является ли мембрана характерной или подозрительной. Отдел предоставляет каждому офицеру здравоохранения одежду для взятия культур, а также бесплатно изучает культуры. Изучение культур иногда показывает отсутствие дифтерии из горла, в которой присутствует мембрана, и часто обнаруживает микробы, когда не видно никакой мембраны.

Дифтерия развивается в случаях инфицирования человека микроорганизмом коринебактерией дифтерии, другое название — бацилла Лефлера. Отсюда исследования называют — мазок на БЛ (бациллу Лефлера).

Мазки на дифтерию обычно осуществляют из таких локализаций как зев и нос. Лаборант сначала забирает мазок из зева на дифтерию, подписывает образец, а потом осуществляется мазок из носа. В редких случаях появляется необходимость отбирать пробы из нетипичных локализаций. Тогда мазки на БЛ берут из раневой поверхности, глаз, ушей и даже влагалища. Мазки отбирают стерильными шпателями в стерильные пробирки. Образцы подписывают.

Как принять культуру. — Наряд для принятия дифтерийной культуры состоит из стерильного ватного тампона и культуральной трубки, содержащей культуральную среду коагулированной сыворотки крови. Когда нужно осмотреть горло или культивировать, уложите свет в горло. Попросите ребенка широко открыть рот. Надавите языком на ручку ложки или с помощью депрессора языка, чтобы получить хороший вид на миндалины и заднюю часть горла.

Если ребенок отказывается оставаться неподвижным или открывает рот, попросите сильного человека держать его в следующем порядке: расположите ребенка на левом колене лица, удерживающего его, и положите правую ногу на ноги ребенка. левую руку вокруг лба ребенка и крепко прижать голову к плечу. Держите ребенка руками за правую руку. Теперь ребёнка можно крепко держать на месте. Если ребенок не откроет рот, нажмите ручку ложки между зубами и в тыльную сторону горла. Это вызовет рвота или затыкание. Во время действия хлид будет держать свой рот открытым.

Важно знать, что мазки при данной инфекции отбираются утром натощак. Нельзя полоскать рот антибактериальными ополаскивателями перед сдачей анализа.

Существует целый протокол, который прописывает правила отбора проб и проведения посева на определение возбудителя дифтерии. Только профессиональные лаборанты могут качественно высеять возбудителя и определить достоверный результат анализа.

Процедура не вызывает боли или дискомфорта и является гораздо более добросовестной процедурой, чем продление необоснованных опасений ребенка в отношении обследования. Способ создания культуры из горла заключается в следующем. Нажмите на язычок левой рукой.

Держите тампон в правой руке и протрите его через мембрану, или миндалины, или назад в горло. Держите культуральную трубку в левой руке и выньте пробку из ее рта, схватив ее мизинцем правой руки. Протрите тампон слегка над поверхностью культуральной среды и замените вилку.

Бросьте тампон в огонь или замените его в контейнере, если он предусмотрен. Поместите трубку в контейнер, который снабжен снаряжением, и отправьте его в лабораторию. Чтобы взять культуру из носа, проведите тампон в ноздрю горизонтально назад вдоль носового пола, пока он не коснется задней стенки глотки, и сразу же вытащите ее. Вращение рукоятки тампона между пальцем и пальцем поможет в его прохождении.

Бывают случаи переноса возбудителя дифтерии без клинического развития заболевания. Часто бактерионосительство выявляется случайно, высеивая мазок на флору при профилактических обследованиях. Носительство также негативно отражается на здоровье и требует проведения соответствующего лечения.

Мазок на дифтерию — одна из популярнейших лабораторных диагностик для выявления этого инфекционного заболевания. Характерная картина при дифтерии — образование серо-белой пленки на миндалинах, повышенная температура тела и увеличение шейных лимфоузлов. Чаще всего инфекция поражает ротовую полость, носоглотку, реже глаза и ушные проходы. Чтобы выявить возбудителей — палочки Леффлера — врач назначает взять мазок из зева на дифтерию. Делается это и для исключения других похожих заболеваний со схожими симптомами.

Не используйте культуральную трубку, которая является сухой или плесневой. Убедитесь, что тампон протер в мембране. Не позволяйте тампону прикасаться к чему угодно, кроме горла и культуральной трубки. Опасность состоит в том, что она может подбирать обычные бактерии рта и может загрязнять другие объекты бактериями дифтерии.

Не отправляйте культуральную трубку в любой другой контейнер, кроме той, которая предоставляется лабораторией, поскольку почтовые законы запрещают использование любого другого контейнера. Изложите отчет о деле на пробел, который сопровождает каждый наряд, и отправьте его в лабораторию с образцом.

Медсестра с помощью ватного тампончика берет пробу из носового прохода и ротоглотки. Процедура забора происходит быстро и безболезненно. Далее лаборант помещает бакпосев в питательную среду и через нескольких дней проверяет результат. Важно на всех этапах соблюсти нормы забора и транспортировки. Тогда данные будут достоверными, и врач сможет назначить корректное лечение.

Если случай, как представляется, является дифтерией, не ждите отчета, но начинайте лечение сразу. Когда культура достигнет лаборатории, она будет помещена в инкубатор. Зародыши растут быстрее, чем большинство других бактерий, и в двенадцать-двадцать четыре часа рост будет достаточным для обследования и отчета. Эта быстрота роста заставляет ростки дифтерии перерастать другие бактерии, а рост, который получается в положительных случаях, обычно является чистой культурой бактерий дифтерии.

Заболеваниями, за которые часто ошибочно принимают дифтерию, являются тонзиллит, септическая болячка и стенокардия Винсента. Никто не может всегда говорить об этих трех заболеваниях от дифтерии без культуры. Способ распространения. — Почти единственным источником бактерий дифтерии является горло человека. Очень редко можно обнаружить ростки дифтерии, растущие в язвах на коже или в глазах. Едва возможно, что кошка или другое домашнее животное может иметь заболевание.

Как мы уже отметили, четкое следование алгоритму действий при взятии анализа обеспечивает правильные результаты посева на дифтерию, от которых зависит дальнейшая терапия и успешное выздоровление. Однако необходимо также подготовиться и самому больному. Когда требуется мазок из горла на дифтерию, нужно:

Большинство случаев дифтерии приобретаются при контакте с человеком, у которого есть микробы дифтерии в горле, или с чем-то, что недавно коснулось его рта или носа, например, чашки для питья или полотенца. Некоторые случаи приобретаются из молока, которое содержит бактерии дифтерии, но сами микробы происходят от инфицированного человека, который обрабатывает молоко. Если молоко является причиной дифтерии, то, вероятно, будет распространено несколько случаев вдоль молочного пути. Несколько бактерий дифтерии, вводимых в молоко перевозчиком, могут умножаться на достаточное количество, чтобы заразить восприимчивых людей на протяжении всего маршрута доставки.

• за несколько дней до анализа прекратить прием антибиотиков, так как они угнетают размножение бактерий, что может исказить результаты и дать ложноотрицательный ответ;
• также следует избегать за пару дней до процедуры полоскать рот растворами, в состав которых входят антисептики;
• в день взятия анализа не следует чистить зубы;
• рекомендуется сдать посев из носа на дифтерию натощак.

Обычно доктору нужны результаты мазка из носа на дифтерию для постановки диагноза и составления плана лечения. Но есть и другие случаи, когда может понадобиться посев на дифтерию:

Зародыши дифтерии недолговечны, но вскоре умирают, когда они подвергаются воздействию света или высыханию, или воздействию бактерий ферментации и гниения, как они находятся в обычных выгребных ямах. Дифтерия не распространяется по канализационному газу, как это было раньше.

Изоляция. -Когда сообщается о случае дифтерии, первая обязанность сотрудника здравоохранения состоит в том, чтобы предотвратить распространение болезни у других лиц. Поэтому он будет изолировать случай; 2, разместите в доме плакат, в котором говорится, что в доме есть заразная болезнь; и 3, дать людям в доме определенные указания относительно метода сохранения изоляции, ухода за одеждой, блюдами и другими вещами в больничной койке, а также удаления всех выделений у больных. Он также предоставит родителям или медсестре копию брошюры о дифтерии, например, предоставленную Департаментом здравоохранения штата Нью-Йорк.

1. после контактирования с больным, у которого уже стоит такой диагноз;
2. перед поступлением в детские учебные заведения ;
3. для оформления справки для трудоустройства на должности в пищевой, здравоохранительной отрасли и детские учреждения;

Стоит отметить, что многим в детстве делается прививка от дифтерии, справка о которой потом предъявляется во многие инстанции. К сожалению, вакцинация не гарантирует того, что человек никогда не заразится этой инфекцией, но она существенно снижает тяжесть протекания заболевания.

Меры изоляции и карантина не являются строго законными до тех пор, пока существование дифтерии не будет доказано. Однако было бы неправильно откладывать изоляцию или карантин, пока не будет получен отчет о культуре. Сотрудник здравоохранения будет оставлен в силе судами, если он начнет изоляцию или карантин, как только у него возникнет серьезное подозрение, что это случай дифтерии. Даже если случай оказывается тонзиллитом или септической болью в горле, меры по его изоляции оправданы, поскольку обе эти болезни являются заразными и часто опасны для жизни.

В большинстве случаев бакпосев берется для установления наличия инфекции, когда у больного есть соответствующие жалобы. Однако когда процедура назначается чисто для формальности, бывает проще купить результаты анализа на дифтерию из зева и носа. Причин для этого может быть несколько. Во-первых, взрослым процесс забора может быть не очень приятен. Во-вторых, для его сдачи необходимо тщательно подготовиться, чтобы результат был корректным. В-третьих, нужно заранее записываться к врачу, чтобы он дал направление, затем записаться на сдачу анализа, и только через несколько дней получить готовый результат мазка из зева на дифтерию. Всё это требует значительного количества свободного времени, чем может похвастаться далеко не каждый житель мегаполиса. Поэтому мы и предлагаем столь удобное решение проблемы — купить результат мазка на дифтерию. Однако только в том случае, если вы уверены, что проблем со здоровьем нет, а требуется лишь соблюдение формальности.

Люди в сообществе иногда игнорируют карантин от невежества или предрассудков или переполненных условий. Если работник здравоохранения не может обеспечить строгий карантин во время эпидемии, самое лучшее, что ему нужно сделать, это заставить его совет по охране здоровья создать изолированную больницу. Если совет делает это, он должен также разрешить сотруднику здравоохранения удалять в больницу все случаи, которые нельзя надлежащим образом изолировать или лечить дома. Если этот орган не предоставлен, медицинский работник не может юридически принудить человека пойти в больницу.

В раннем возрасте дети сдают большое количество всевозможных анализов, связано это и с тем, что малыши часто болеют, и с профилактическими мерами, эффективность которых выше именно в этот период. Поэтому не стоит лишний раз подвергать ребенка стрессу, если нет сомнений в том, что он здоров. Например, для поступления в ясли или детский сад можно купить результаты посева на дифтерию. Вы не только сбережете нервы ребенка, но и свое время, которое лучше потратить на более приятные вещи. Кроме того у нас вы можете купить результаты детских анализов любого назначения без прохождения.

Конец периода выделения в дифтерии определяется отсутствием микробов из горла. Горло может показаться хорошо, и все же оно может продолжать содержать вирулентные микробы в течение нескольких дней и недель. Правило заключается не в том, чтобы освободить человека от изоляции до тех пор, пока не будут получены по меньшей мере две отрицательные культуры в последующие дни. Если зародыши сохраняются через четыре недели, врач должен попросить, чтобы был проведен тест на вирулентность, и если бактерии оказались не вирулентными, он может отклонить это дело.

Если вам нужно купить результаты анализа на дифтерию, то просто оставьте заявку на нашем сайте. Далее мы возьмем все заботы на себя. После того как менеджер уточнит необходимые сведения, готовый мазок из зева и носа на дифтерию будет у вас на руках в этот же день при заказе в первой половине дня. Согласитесь, это весьма удобно. К тому же у нас действует курьерская доставка до метро или до адерса. Оплата осуществляется на месте.

источник

Простудные заболевания часто сопровождаются покраснением горла, отеком, болью и пр. симптомами, характерными для инфекционных заболеваний, поэтому врач может назначить мазок на дифтерию – специальный анализ, который позволит обнаружить наличие опасных бацилл Леффлера.

Эти бактерии передаются от человека к человеку воздушно-капельным путем и являются возбудителями опасного инфекционного заболевания, дифтерии, которое без должного лечения может привести к серьезным отклонениям в работе различных органов и даже летальному исходу.

Мазок на дифтерию – самый быстрый и безопасный способ диагностировать заболевание и начать правильную антибактериальную терапию.

Биоматериал для проведения лабораторных исследований берет врач, хотя процедура забора мазка достаточно проста и безболезненна.

Мазок берут из зева и носа. Для обеих процедур используются специальные петли из проволоки, обмотанные стерильной ватой, или тонкие деревянные палочки со стерильной ватой на конце.

Для забора мазка из носа врач вводит палочку или петлю на 1-2 см в каждую ноздрю поочередно и аккуратно проводит ватой по слизистой.

Для забора мазка из зева врач сначала фиксирует язык пациента одноразовым шпателем, а затем аккуратно проводит палочкой по небным дужкам, гортани, миндалинам.

Наиболее достоверные результаты дает мазок, взятый ближе к воспаленным тканям, рядом с пленками или в области наибольшей гиперемии. Важно, чтобы в процессе забора материала вата не касалась слизистой ротовой полости, языка или неба.

Палочку с биоматериалом помещают в сухую стерильную пробирку, маркируют фамилией и именем пациента, областью, из которой был взят мазок (нос или ротоглотка).

Сохраненный таким образом материал должен быть доставлен в лабораторию в течение трех часов, а затем храниться в холодильнике.

Если врач считает, что в ближайшие часы не сможет доставить материалы в лабораторию, то мазок помещают в специальный консервант, раствор глицерина. Результаты лабораторных исследований в последнем случае придется ждать немного дольше (3-4 дня).

Чтобы мазок из зева на дифтерию показал максимально точные и достоверные результаты, к процедуре необходимо подготовиться.

Мазок из носовой области берут после того, как пациент прочистит пазухи (высморкается), и особых требований к соблюдению режима перед анализом нет.

Хотя врачи рекомендуют избегать применения капель и спреев против насморка в течение 2-3 часов перед процедурой.

Для получения достоверных результатов анализа мазка из зева важно, чтобы пациент не находился на антибактериальном лечении, не принимал антибиотики. За 2-3 часа до проведения процедуры рекомендуется воздержаться от еды и питья, не принимать антибактериальных пастилок, спреев и других медикаментов, не полоскать горло.

Наиболее достоверными считаются мазки, взятые у пациента натощак. Если по каким-либо причинам пациент не соблюдал перечисленных рекомендаций, то важно сообщить об этом врачу, чтобы в лаборатории мазок исследовали с учетом возможных искажений.

Мазок на дифтерию исследует наличие бацилл Леффлера на слизистой пациента, поэтому результаты анализа достаточно очевидны: бактерии либо обнаружены, либо нет.

Если у пациента диагностируют дифтерию, то его необходимо срочно изолировать, а всех членов семьи, имевших контакт с больным, осмотреть на наличие признаков заболевания.

Если дифтерию обнаруживают у ребенка, посещавшего детский сад или школу, то рекомендуется сообщить об этом в учреждение, чтобы родители других детей могли проявить бдительность к состоянию здоровья своих малышей.

Анализ на дифтерию может дать положительный результат и у внешне здоровых людей. В таком случае решение о проведении дальнейших исследований или назначении терапии принимает врач.

Положительный результат на дифтерийную палочку без других симптомов может свидетельствовать о том, что заболевание протекает скрыто, или о том, что человек является носителем бактерий, но сам не подвержен заболеванию.

Такой результат нередко бывает у взрослых, ухаживающих за больными дифтерией: бактерии присутствуют, но иммунная система предотвращает развитие болезни.

Отрицательный результат анализа («нет роста») в большинстве случаев означает, что пациент дифтерией не болеет, а воспаление в горле вызвано другими микроорганизмами.

Исключение составляют отрицательные результаты мазка на дифтерию, взятые у человека, находящегося на или недавно завершившего бактериальную терапию. В таком случае мазок придется дать повторно через 1 – 3 недели.

Если у пациента присутствуют все признаки развития заболевания, но мазок дает отрицательный результат, то диагноз «дифтерия» все равно считается подтвержденным, поскольку вывод о наличии заболевания врач выносит в первую очередь по внешним признакам.

В таких случаях может быть назначена повторная сдача анализа с соблюдением всех правил подготовки к мазку либо сразу назначено соответствующее лечение.

Дифтерия – это острое инфекционное заболевание. Несмотря на то, что заболевание провоцируют особого рода бактерии, основные негативные последствия вызывают не сами микроорганизмы, а токсичные продукты их жизнедеятельности.

Дифтерия передается от человека к человеку воздушно-капельным путем, т. е. при разговоре, чихании, поцелуе и пр.

В некоторых случаях заболевание может передаваться через третьих лиц, посуду, предметы обихода.

Поэтому при вспышке заболевания в детских учреждениях могут объявить дифтерийный карантин, чтобы продезинфицировать помещение и игрушки.

Чаще всего дифтерия проявляется схожими с ангиной симптомами: болью в горле, покраснением, отеком, появлением белых или зеленоватых гнойных пятен или пленок, повышением температуры.

Но существуют и скрытые формы заболевания, когда заподозрить заболевание по внешним признакам сможет только врач.

Вопреки распространенному мнению дифтерия поражает не только ротоглотку и носовую полость: заболеванию подвержены кожные покровы, глаза, уши, половые органы.

источник

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции

1. РАЗРАБОТАНЫ Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Е.Б.Ежлова, А.А.Мельникова, Н.А.Кошкина); ФБУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора (М.В.Зароченцев, И.В.Новокшонова); ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского» Роспотребнадзора (И.К.Мазурова, О.Ю.Борисова, С.Ю.Комбарова, В.Г.Мельников, Н.М.Максимова, Т.Н.Якимова); ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в г.Москве» Роспотребнадзора (Н.Я.Салова, И.П.Требунских).

2. РЕКОМЕНДОВАНЫ К УТВЕРЖДЕНИЮ Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 года N 1).

3. УТВЕРЖДЕНЫ Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 14 июля 2013 г.

Методические указания (далее — МУ) предназначены для специалистов бактериологических лабораторий санитарно-эпидемиологической службы, лечебно-профилактических организаций независимо от их организационно-правовой формы и формы собственности и научно-исследовательских институтов, осуществляющих лабораторную диагностику дифтерийной инфекции.

Бактериологическое исследование проводят с целью лабораторной диагностики дифтерийной инфекции, выявления источников инфекции, подтверждения эпидемиологических связей и наблюдения за распространением токсигенных коринебактерий дифтерии. Цель бактериологического исследования — выявление возбудителя дифтерии с помощью минимального количества диагностических тестов, необходимых, достаточных и специфичных для получения достоверного ответа в максимально сжатые сроки: не менее трёх суток — отрицательный ответ, трёх-четырёх суток — ответ о выделении токсигенных коринебактерий дифтерии (возбудителя дифтерии), четырёх-пяти суток — ответ о выделении нетоксигенных коринебактерий дифтерии или других представителей этого рода.

Возбудитель дифтерии — коринебактерии дифтерии (Corynebacterium diphtheriae), продуцирующие дифтерийный токсин (экзотоксин). Источником инфекции является больной или бактерионоситель токсигенных С.diphtheriae.

Нетоксигенные С.diphtheriae не вызывают дифтерийную инфекцию. «Этиологическая» значимость этих микроорганизмов при фарингите, артрите, эндокардите и др. гнойно-септических заболеваниях требует специальных доказательств. При выделении нетоксигенных штаммов C.diphtheriae от больных с подозрением на дифтерийную инфекцию следует обратить внимание на правильность проведения бактериологического исследования и оценку токсигенных свойств.

Способность С.diphtheriae вырабатывать экзотоксин опосредован феноменом фаговой (или лизогенной) конверсии. Конверсию нетоксигенных штаммов С.diphtheriae в токсигенные и наоборот можно воспроизвести в особых экспериментальных (лабораторных) условиях. В тех случаях, когда при первичном посеве исследуемого материала от больных дифтерией или бактерионосителей выделяют токсигенные, а при повторных обследованиях после лечения антибиотиками — нетоксигенные коринебактерии дифтерии, можно предположить, что токсигенные и нетоксигенные С.diphtheriae колонизировали слизистые ротоглотки и носа одновременно. При лечении антибиотиками в первую очередь исчезают токсигенные штаммы, как более чувствительные к их действию, а нетоксигенные штаммы продолжают выделяться. Обнаружение только нетоксигенных штаммов у бактерионосителей при повторных обследованиях после лечения нельзя трактовать как утрату способности токсигенных штаммов продуцировать экзотоксин.

Таксономически близкими к виду C.diphtheriae являются Corynebacterium ulcerans и Corynebacterium pseudotuberculosis — природные патогены крупного и мелкого рогатого скота, лошадей, домашних животных, способные вырабатывать дифтериеподобный экзотоксин, в редких случаях могут вызывать заболевания у человека.

Известны случаи выделения токсигенных C.ulcerans при клинической картине заболевания, сходной с дифтерией, а также токсигенных C.pseudotuberculosis, вызывающих лимфадениты. Инфекции, вызванные этими микроорганизмами, у человека встречаются крайне редко, не имеют эпидемического распространения, а, следовательно, значение этих случаев в медицине невелико.

На слизистых оболочках ротоглотки и носа в норме часто встречается Corynebacterium pseudodiphtheriticum (ложнодифтерийная палочка Гофмана). Умение выделять и идентифицировать данные микроорганизмы, а также нетоксигенные C.diphtheriae служит критерием оценки качества работы бактериологов, особенно в период снижения и спорадической заболеваемости дифтерией.

C.diphthereiae растут на питательных средах, сбалансированных по своему составу, и не растут на простых питательных средах. Требуется кровь любого животного или человека (донора), как источник аминокислот, ростовых факторов, железа и пр. Не всегда коммерческие среды удовлетворяют этим требованиям, поэтому контроль качества питательных сред и всех ингредиентов в лабораториях обязателен.

Кровяные теллуритовые среды (КТА, Клауберг II) остаются лучшими селективными дифференциально-диагностическими средами, обеспечивающими рост колоний через 24 ч, что на одни сутки сокращает сроки выдачи окончательного бактериологического ответа. КТА прост в приготовлении: основой этой среды является коммерческий сухой питательный агар (СПА), в качестве кровяных добавок используют кровь, однако не исключены любые гемолизированные кровяные добавки.

Трудоемкость бактериологического метода и стоимость анализа сокращается при использовании двух половин одной чашки с селективной дифференциально-диагностической питательной средой (далее плотная питательная среда) для посева материала из зева и носа от одного обследуемого. Использование чашки для посева таких образцов на плотной питательной среде недопустимо, так как не позволяет, в большинстве случаев, получить рост изолированных колоний и провести исследование в установленные сроки.

Посев материала из зева и носа на кровяной агар производить нецелесообразно, так как очень сложно получить рост изолированных колоний C.diphtheriae на данной среде из-за обильного роста другой сопутствующей микрофлоры.

Колонии, морфология которых характерна для микроорганизмов рода Corynebacterium, в подавляющем большинстве не подлежат микроскопии и должны быть изучены по всем необходимым идентификационным тестам. «Сомнительные» колонии с нехарактерными морфологическими свойствами подвергают микроскопии. Если в мазках обнаруживают коринеформные микроорганизмы, исследование следует продолжить по всем необходимым идентификационным тестам.

Окрашивание мазков осуществляют по Лёффлеру (щелочной метиленовый синий) или с использованием других синих красителей. Окраску по Граму не применяют, т.к. в процессе окраски клетки грамположительных C.diphtheriae легко обесцвечиваются спиртом и могут выглядеть грамотрицательными (розовый оттенок). Чаще всего это явление наблюдают при окрашивании токсигенных C.diphtheriae (клеточная стенка токсигенных C.diphtheriae ближе по организации и структуре к грамотрицательным микроорганизмам).

В бактериологической практике опираться только на морфологические свойства микробной клетки или колоний при идентификации C.diphtheriae недостаточно. Описаны случаи бактериологической гипо- и гипердиагностики (в 55,0 и 14,5% случаев соответственно), когда использовали учет только морфологических признаков.

При идентификации C.diphtheriae необходим комплекс идентификационных тестов. Основной специфический тест для выявления возбудителя дифтерии, правильная постановка которого является залогом успешной диагностики дифтерийной инфекции, — определение у выделенной культуры способности к продукции дифтерийного токсина. Определять продукцию токсина следует начинать уже в первый день появления роста изолированных колоний на чашках с плотной питательной средой, исключая этап накопления чистой культуры. Несоблюдение этого правила увеличивает сроки исследования на одни сутки.

Во избежание ошибок при определении токсигенных свойств коринебактерий необходимо изучать данный признак у максимального числа выросших колоний (двадцать и более) с чашек первичного посева. При множественном росте подозрительных колоний нельзя ограничиться формированием только одной-двух бляшек. Кроме того, необходимо изучать токсигенные свойства отдельных изолированных колоний, чтобы не потерять нетоксигенные штаммы C.diphtheriae, присутствие которых также возможно при наличии токсигенных C.diphtheriae в патологическом материале.

Используют два способа постановки пробы на токсигенность:

1) модифицированная проба Элека с бумажными полосками, утверждённая для бактериологической практики в нашей стране в 1961 г.;

2) проба Фельдмана Ю.Г. и соавторов с бумажными дисками, разработанная в нашей стране и утвержденная в 1988 г., получившая одобрение Международной рабочей группы ВОЗ по лабораторной диагностике дифтерийной инфекции к применению в зарубежных лабораториях.

В пробе на токсигенность следует использовать только антитоксин — противодифтерийные антитоксические антитела, очищенные методом специфической сорбции, что позволяет избежать появления неспецифических линий преципитации микробного происхождения. В исключительных случаях при отсутствии антитоксина допускается использование лечебной противодифтерийной антитоксической лошадиной сыворотки. В таком случае возможно появление неспецифических линий преципитации микробного происхождения, которые необходимо отличить от специфических линий токсического происхождения.

Обязательными являются биохимические тесты — на цистиназу, уреазу, расщепление глюкозы, сахарозы и крахмала. Тест на нитраты проводят только при положительной уреазной реакции. Использование других тестов, применяемых в некоторых зарубежных странах, необоснованно увеличивает продолжительность, трудоемкость, стоимость исследования и не всегда приводит к точной идентификации «недифтерийных» микроорганизмов (других представителей рода Corynebacterium). При лабораторной диагностике дифтерии не является обязательным определение видовой принадлежности «недифтерийных» коринебактерий рода Corynebacterium, тем более что их идентификация требует отдельных хемотаксономических и молекулярно-генетических методов исследования.

C.diphtheriae подразделяют на культурально-биохимические варианты (биовары) gravis, mitis, intermedius, belfanti. В бактериологической практике определению подлежат биовар gravis и объединенная группа «митисных форм» — mitis, intermedius, belfanti, т.е. группа микроорганизмов C.diphtheriae, которая не обладает амилазной активностью (не разлагает крахмал). Биовар belfanti не подлежит отдельному определению, так как этот микроорганизм не способен продуцировать экзотоксин. В бактериологической диагностике отдельного выделения биовара intermedius так же не требуется, так как относительно условными дифференцирующими признаками от биовара mitis являются только размер колоний и наличие липофильности. Таким образом, в бактериологической диагностике определяются токсигенные и биохимические свойства C.diphtheriae биовара gravis и группы микроорганизмов, у которых отсутствует амилазная активность, объединённые в группу C.diphtheriae биовар mitis.

Молекулярно-генетические методы для лабораторного выявления C.diphtheriae находятся в стадии разработки. Имеющиеся тест-системы для метода ПЦР не могут различить ген дифтерийного токсина токсигенных штаммов от «молчащего» гена дифтерийного токсина нетоксигенных токснесущих штаммов C.diphtheriae, не способных продуцировать токсин из-за мутаций в этом гене. Это может привести к гипердиагностике. Поэтому их использование в лабораторной диагностике дифтерии может иметь только вспомогательное значение — поиск нетоксигенных токснесущих штаммов C.diphtheriae среди нетоксигенных штаммов.

Род Corynebacterium гетерогенный, как и группа, условно объединившая его и другие роды грамположительных палочек, не образующих споры размером 0,3-0,8 1,5-8,0 мкм, неподвижных, обладающих различной степенью полиморфизма и плеоморфизма. C.diphtheriae имеют размер 0,2-0,6 1,0-7,0 мкм. Арабиногалактановый полимер клеточной стенки C.diphtheriae отличает этот вид от всех других видов рода Corynebacterium. Клеточная стенка С. diphtheriae имеет от 3-5 до 7-9 слоёв. Известно, что клеточная стенка токсигенных C.diphtheriae лучше дифференцирована и более тонкая по сравнению с клеточной стенкой нетоксигенных C.diphtheriae и других коринеформных микроорганизмов этого рода, что определяет их отношение к антибиотикам — токсигенные более чувствительны, чем нетоксигенные к пенициллину, эритромицину, тетрациклину и макролидам. Однако появляются штаммы C.diphtheriae устойчивые к некоторым антибиотикам, преимущественно выделенные от бактерионосителей.

Патогенные для животных Corynebacterium ulcerans и Corynebacterium pseudotuberculosis, некоторые комменсалы кожи со слизистых оболочек человека, например, Corynebacterium pseudodiphtheriticum (ложнодифтерийная палочка Гофмана), Corynebacterium xerosis, Corynebacterium striatum таксономически близки к виду C.diphtheriae.

Большинство видов лучше растет в аэробных условиях, в том числе и микроорганизмы вида C.diphtheriae. Вместе с тем, C.diphtheriae являются факультативными анаэробами (генерируют энергию, используя как молекулярный О , так и органические соединения), что крайне важно учитывать при изучении их ферментативной активности.

Все коринебактерии, в т.ч. и C.diphtheriae, являются мезофилами и растут при 36-37 °С.

Устойчивость к факторам внешней среды

C.diphtheriae устойчивы к низкой и чувствительны к высокой температуре (низкие температуры не убивают дифтерийные палочки длительное время, под действием прямого солнечного света палочки дифтерии гибнут в течение нескольких дней); значительно устойчивы во внешней среде и длительно сохраняют жизнеспособность в дифтерийной плёнке, в капельках слюны, на ручках дверей, детских игрушках до 15 дней; в пыли, на полу, на предметах в окружении больного до 18-40 дней; в сухой дифтерийной плёнке до 7 недель; в воде выживают в течение 6-20 дней. Коринебактерии дифтерии не устойчивы к действию физических и химических обеззараживающих средств и разрушаются под действием обычных дезинфектантов в обычных концентрациях (3-5%) при экспозиции 30 мин; погибают при нагревании до 60 °С в течение 10 мин, кипячение убивает их моментально.

Культурально-морфологические свойства

Обычно колонии микроорганизмов из рода Corynebacterium на плотных питательных средах (например, на кровяном агаре) имеют серовато-белую или желтую окраску, непрозрачные или полупрозрачные, приподнятые, округлой формы, диаметром 1-3 мм. Чаще всего они бывают мягкой, маслянистой консистенции, хотя некоторые виды рода Corynebacterium могут образовывать шероховатые R-колонии и крошиться при прикосновении. На питательных средах, сбалансированных по своему составу и удовлетворяющих требованиям культивирования C.diphtheriae, через 24-48 ч роста вариант mitis образует колонии S-типа — приподнятые, гладкие, диаметром 1-2 мм; S-R-колонии варианта gravis обычно выпуклые, с приподнятым центром, диаметром 2-3 мм; колонии варианта intermedius — S-типа, мелкие, плоские, гладкие, с ровным краем, диаметром 0,5-1 мм.

На селективных дифференциально-диагностических средах — кровяной теллуритовый агар (КТА) и Клауберг II через 24-48 ч роста колонии C.diphtheriae варианта gravis имеют серо-черную или черную окраску с металлическим оттенком («цвет мокрого асфальта»), непрозрачные, матовые, приподнятые с выпуклым центром, округлой формы, диаметром 1-3 мм, имеют радиальную исчерченность (форма «маргаритки») или выраженную краевую изрезанность, часто крошатся при прикосновении; колонии C.diphtheriae варианта mitis имеют серо-черную или черную окраску («цвет мокрого асфальта»), непрозрачные, матовые, приподнятые с выпуклым центром, иногда плоские, округлой формы, диаметром 1-2 мм, чаще всего бывают мягкой, маслянистой консистенции или могут крошиться при прикосновении; колонии C.diphtheriae варианта intermedius имеют серо-черную окраску, мелкие, плоские, гладкие, с ровным краем, диаметром 0,5-1,0 мм, мягкой, маслянистой консистенции.

Морфология колоний C.ulcerans и C.pseudotuberculosis на КТА через 24-48 ч роста идентична морфологии колоний С.diphtheriae варианта gravis, серо-черной или черной окраски («цвет мокрого асфальта»), иногда с коричневым оттенком, колонии непрозрачные, матовые, приподнятые с выпуклым центром, округлой формы с радиальной исчерченностью (или без неё), диаметром 1-2 мм. Колонии C.pseudodiphtheriticum — серого цвета с характерным светлым ободком, непрозрачные, приподнятые, матовые, округлой формы, диаметром 1-2 мм.

На теллуритовой среде без крови (коринебакагар) колонии C.diphtheriae через 24 ч роста мелкие (иногда 0,2-0,6 мм), через 48 ч роста размер колоний увеличивается до 1,0-1,2 мм, иногда наблюдаются «гигантские» колонии. Однако морфология колоний изменяется — исчезает исчерченность края, к 48 ч колонии меняют характерную для C.diphtheriae архитектонику — плоские, «расползающиеся» по поверхности агара, иногда меняется цвет колоний.

Помимо относительно условной оценки морфологии колоний на питательной среде первичного посева существует несколько других признаков, позволяющих различать биовары gravis, mitis, intermedius. Например, характерный рост на бульоне в пробирке: для биовара gravis — поверхностная пленка, бульон прозрачен, на дне пробирки через 24 ч организуется осадок; для биовара mitis — диффузное помутнение среды с образованием осадка, для биовара intermedius — тонкое гранулярное помутнение с последующим оседанием гранул на дно пробирки.

На кровяном агаре можно наблюдать гемолиз эритроцитов (кроличьих и крупного рогатого скота) при росте биовара mitis, гемолиз только кроличьих эритроцитов при росте биовара gravis и отсутствие гемолиза при росте биовара intermedius. Однако только биовар intermedius обладает липофильностыо — способностью усиливать рост на среде с 0,3% твина — 80.

Морфология клетки

Для C.diphtheriae характерен значительный полиморфизм — разнообразие размеров и формы клеток. Клетки имеют форму булавы, ракетки, палочки, овоида и т.п. Клетки C.ulcerans и C.pseudotuberculosis чаще всего имеют овоидную форму. На средах КТА овоидную форму часто приобретают токсигенные C.diphtheriae. Взаиморасположение клеток напоминает римские цифры X, V, иногда — «китайские иероглифы». Подобную форму клетки приобретают при делении. Возможно параллельное расположение клеток, что особенно характерно для C.pseudodiphtheriticum и C.pseudotuberculosis.

При окраске часто обнаруживается выраженная внутриклеточная исчерченность, что объясняется наличием зерен волютина (метахроматические гранулы, тельца Бабеша-Эрнста). Описано сродство волютина к метиленовому синему (окраска по Лёффлеру), поэтому при обработке этим красителем гранулы или полоски (скопления гранул) прокрашиваются в синий цвет, а протоплазма в отдельных случаях может приобрести розовый оттенок. В бактериологической практике окраску по Граму не используют, поскольку клетки C.diphtheriae легко обесцвечиваются спиртом и могут выглядеть в мазке как грамотрицательные микроорганизмы. При окраске по Нейссеру, которую также редко используют, клетки C.diphtheriae окрашиваются в желтый цвет с зернами волютина (на концах клетки) темно-коричневого цвета, иногда с синим оттенком.

Ферментативная активность

Ферментативная активность коринебактерий изучается путем определения ферментов цистиназы, уреазы, способности расщеплять до кислоты глюкозу, сахарозу и крахмал (табл.1). C.diphtheriae продуцируют фермент цистиназу, отсутствует продукция фермента уреазы, разлагают глюкозу, крахмал (биовар gravis), не разлагают сахарозу. Биовар mitis не разлагает крахмал. C.diphtheriae способны восстанавливать соли азотной кислоты (нитраты) в соли азотистой кислоты (нитриты).

Токсигенные свойства

C.diphtheriae, вызывающие заболевание дифтерией, обладают токсигенными свойствами. Основными генами патогенности C.diphtheriae, отвечающими за токсинообразование, являются ген дифтерийного токсина — tox и регуляторный ген — dtxR. 55-65% токсигенных C.diphtheriae, циркулирующих в период спорадической заболеваемости дифтерией, имеют изменения (мутации) в этих генах, некоторые из них приводят к повышению уровня токсинообразования. Подобные изменения характеризовали большинство штаммов C.diphtheriae, распространенных в 90-е годы во время эпидемии дифтерии в России и вызвавшие тяжелые формы клинического течения заболевания.

Уровень токсинообразования штаммов C.diphtheriae биовара gravis в два-четыре раза превышал уровень токсинообразования биовара mitis, вызывая более тяжелое клиническое течение дифтерии в период последней эпидемии. Также, начиная с 90-х годов прошлого столетия, биовар gravis имеет доминирующее распространение среди токсигенных C.diphtheriae, в то время как среди нетоксигенных C.diphtheriae доминирующее распространение имеет биовар mitis. От 2,0 до 20,0% этой группы в различные периоды эпидпроцесса составляли штаммы, несущие «молчащий» ген дифтерийного токсина (tох-ген), не способный к экспрессии дифтерийного токсина, так называемые нетоксигенные токснесущие штаммы C.diphtheriae биовара mitis, эпидемиологическое значение которых до конца не изучено. Для циркуляции C.diphtheriae характерна периодическая смена доминирующего биовара, которая, как правило, совпадает с началом интенсификации эпидпроцесса.

В период спорадической заболеваемости сокращена циркуляция токсигенных C.diphtheriae, вместе с тем циркуляция нетоксигенных остаётся на высоком уровне.

Несвоевременное выявление носителей токсигенных C.diphtheriae бактериологическим методом приводит к «скрытому» распространению возбудителя дифтерии и возникновению новых очагов дифтерийной инфекции.

Эффективность проведения бактериологического исследования в значительной степени зависит от своевременного правильного взятия материала и соблюдения сроков доставки его в бактериологическую лабораторию.

Для взятия материала используют коммерческие стерильные сухие ватные (или дакроновые) тампоны, также возможно их приготовление в лабораторных условиях с учетом требований нормативно-методической документации. Тампоны должны иметь форму «капли», а не «веретена».

Материал из ротоглотки и носа берут отдельными тампонами, натощак или не ранее чем через 2 ч после еды, а также до применения полоскания или других видов лечения. Взятие материала осуществляют при хорошем освещении, с использованием шпателя, не касаясь тампоном языка и внутренних поверхностей щек и зубов. Одним тампоном собирают материал с участков ротоглотки — миндалин, дужек мягкого неба, небного язычка, при необходимости — с задней стенки глотки. При наличии налетов патологический материал следует брать с границы пораженных и здоровых тканей, слегка нажимая на них тампоном. Для взятия материала из носа используют другой тампон, который вводят глубоко сначала в один, а потом в другой носовой ход, собирая материал со стенок и перегородки носа, при этом не касаясь крыльев носа снаружи.

При дифтерии других локализаций (глаза, уши, кожа, раны, гениталии и пр.) помимо материала из пораженных участков забирают материал из ротоглотки и носа. При показаниях к обследованию на дифтерию и одновременном наличии пораженных слизистых и кожи в углу рта («заеды») обследование этих участков проводят отдельным тампоном и параллельно берут материал из ротоглотки и носа.

При прямой ларингоскопии материал (слизь, пленка) собирают непосредственно из гортани. В случаях оперативного вмешательства для бактериологического исследования следует брать слизь из интубационной трахеотомической трубки.

При взятии материала с пораженного участка кожи необходимо протереть его поверхность промокательными движениями стерильной марлевой салфеткой или тампоном, смоченными стерильным физиологическим раствором, осторожно приподнять или отодвинуть струпы и корочки. После этого тампоном, предназначенным для взятия материала на дифтерию, взять секрет с пораженного участка. Одновременно забирают материал из ротоглотки и носа.

При постмортальном исследовании для выявления возбудителя дифтерии материал следует брать с миндалин, гортани и полости носа (слизь, пленки), при редких локализациях — со слизистой пищевода и желудка. Учитывая, что дифтерия является токсикоинфекцией, другие органы (сердце, печень и пр.) обследуют только для выявления токсических поражений.

Тампоны должны быть доставлены в лабораторию не позднее чем через 3 ч после взятия материала. В холодное время года для предотвращения замерзания исследуемый материал доставляют в бактериологическую лабораторию в сумках-термосах.

При невозможности доставки исследуемого материала в баклабораторию в установленные сроки (не позднее 3 ч) или проведения обследования в ЛПО во второй половине дня материал из ротоглотки (зева) и носа засевают «площадкой» с последующим рассевом на одну чашку Петри с питательной средой, разделенной пополам («чашечный метод»). После этого посевы помещают в термостат при 37 °С до утра следующего дня, после чего доставляют в сумках-термосах в баклабораторию (с указанием времени посева материала). При редких локализациях посев материала из каждого пораженного участка осуществляют на отдельную чашку Петри с питательной средой.

Медицинский персонал ЛПО должен проходить инструктаж в баклаборатории о правилах взятия и посева материала на питательные среды.

При невозможности организовать посев материала «чашечным методом» допускается засевать материал в пробирки с транспортной средой для сохранения и подращивания возбудителя дифтерии, которая готовится в лабораторных условиях согласно нормативно-методической документации. Не допускается использование коммерческих транспортных сред, предназначенных для исследования на микрофлору ротоглотки и носа, в связи с тем, что состав этих сред не удовлетворяет условиям культивирования возбудителя дифтерийной инфекции, что приводит к потере патологического материала.

В случае использования транспортной среды, приготовленной в лабораторных условиях, согласно нормативной документации, материал собирают сухим тампоном, опускают в пробирку со средой и следят за тем, чтобы пробка тампона не намокала. Следует учитывать, что применение транспортной среды увеличивает срок выдачи окончательного ответа на одни сутки, так как после подращивания в термостате при 37 °С на утро следующего дня материал доставляется в баклабораторию для последующего посева на чашки Петри с селективной питательной средой.

Незасеянные (чистые) чашки Петри с питательной средой и пробирки с транспортной средой доставляются в ЛПО из баклабораторий. Хранение питательных сред в ЛПО осуществляется в холодильнике при 4-6 °С; чашки со средой — не более трех дней; пробирки с транспортной средой — не более 10 дней. Перед взятием и посевом материала их необходимо достать из холодильника и согреть до комнатной температуры. При невозможности доставки материала в баклабораторию круглосуточно ЛПО оснащаются термостатами. В стационаре взятие патологического материала проводят круглосуточно, используя «чашечный метод».

Исследуемый материал из ротоглотки и носа, собранный сухими ватными тампонами и помещенный в пробирки (не менее двух пробирок от одного лица, при редких локализациях добавляются дополнительные пробирки), или материал, засеянный в пробирки с транспортной средой (также не менее двух пробирок от одного лица), или материал из ротоглотки и носа, а также из редких мест локализации, засеянный «чашечным методом», должен быть четко пронумерован и иметь сопроводительную документацию. Пробирки с материалом от одного лица скреплены вместе.

В сопроводительном документе указывают: фамилию, имя, отчество, возраст, адрес обследуемого лица, название учреждения, направляющего материал, локализацию взятия материала (нос, зев, кожа и др.), дату и время взятия материала, цель обследования (диагностическая с указанием диагноза, по эпидпоказаниям, с профилактической целью).

1. Медицинским работникам лечебно-профилактических организаций (ЛПО), ответственным за взятие и транспортирование материала при обследовании на дифтерию, необходимо согласовывать методику взятия материала, условия транспортирования и возможности применения транспортной среды с врачами-бактериологами, проводящими эти исследования.

2. Медицинским работникам ЛПО, допущенным к взятию и посеву материала, следует проходить инструктаж не реже 1 раза в год в баклаборатории, проводящей исследования на дифтерию.

3. Врачам-бактериологам ЛПО и ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора в субъектах Российской Федерации следует повышать квалификацию на курсах тематического усовершенствования по лабораторной диагностике дифтерии не реже 1 раза в три года.

4. Методическую помощь по вопросам взятия, транспортирования и лабораторной диагностики дифтерии осуществляют региональные центры по мониторингу за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней II-IV групп патогенности (на базе ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора в субъектах Российской Федерации — далее Региональные центры по мониторингу) и Референс-центр по мониторингу за дифтерией (на базе ФБУН МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора — далее Референс-центр).

5. Бактериологические лаборатории ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора в субъектах Российской Федерации направляют все выделенные токсигенные и выборочно нетоксигенные штаммы C.diphtheriae, C.ulcerans, C.pseudotuberculosis, а также штаммы с атипичными свойствами в Референс-центр для реидентификации (верификации) по адресу: 125212, г.Москва, ул.Адмирала Макарова, 10.

6. Бактериологические лаборатории Региональных центров по мониторингу и Референс-центр осуществляют внешний контроль качества лабораторных исследований на дифтерию, проводимых в бактериологических лабораториях субъектов Российской Федерации.

Первый день. Посев материала

Материал для исследования из ротоглотки (зева), носа или других пораженных мест засевают раздельно на поверхность одной из рекомендуемых плотных питательных сред — КТА или Клауберг II, разлитых в чашки Петри («чашечный метод посева») (рис.1).

Посев от одного лица производят на одну чашку, используя при этом половину поверхности ( ) чашки среды для посева материала из ротоглотки (зева), а вторую — для посева материала из носа. При посеве материала с кожи или других пораженных мест добавляют еще одну чашку (все чашки маркируются). Не допускается посев материала от нескольких лиц на одну чашку.

При посеве материал тщательно втирают в среду со всех сторон тампона на участке площадью 2 1 см у края чашки, стараясь оставить весь патологический материал на поверхности формируемой «площадки». Формирование такой «площадки» является обязательным, что позволяет сохранить исследуемый материал, находящийся на тампоне. Дальнейший рассев исследуемого патологического материала осуществляют этим же тампоном, не отрывая тампон от поверхности питательной среды, засевая оставшуюся поверхность чашки, что позволяет получить изолированные колонии (чистую культуру) для дальнейшей идентификации непосредственно с чашки первичного посева. Такой метод сохраняет весь патологический материал на поверхности питательной среды и позволяет работать с отдельными изолированными колониями, исключая этап накопления на агаровом косяке чистой культуры, что сокращает длительность проведения исследования на одни сутки.

Засеянные чашки с плотной питательной средой или пробирки с транспортной средой помещают в термостат для инкубации при 37 °С.

Высев из транспортной среды производят описанным выше способом на следующие сутки, используя дифференциально-диагностическую плотную питательную среду, тампоном, отжатым о стенки пробирки, или петлей, забирая материал из осадка.

Чашки со средой предварительно согревают при комнатной температуре или в термостате при 37 °С (15-20 мин). Если на поверхности чашки со средой есть конденсат, то ее подсушивают на крышке, повернув чашку вверх дном. Нельзя использовать для посева материала «охлажденные» чашки с питательной средой.

Второй день

1. Колонии, выросшие на чашках, просматривают через 24 ч после посева материала (если материал засевали во второй половине дня, то просмотр осуществляется ровно через 24 ч, т.е. во второй половине дня) визуально или с помощью микроскопа бинокулярного стереоскопического (МБС).

2. Чашки с колониями, «подозрительными» на дифтерийные, отбирают для дальнейшей идентификации культуры по всем тестам. «Подозрительные» колонии на кровяно-теллуритовых средах (КТА) через 24 ч роста — темно-серого или серо-черного цвета, выпуклые, округлой формы, непрозрачные, с ровными краями или с легкой изрезанностью края или радиальной исчерченностью, мягкой, маслянистой консистенции; через 48 ч окончательно формируется типичная морфология (архитектоника) колоний — серо-черного или черного цвета с металлическим оттенком («цвет мокрого асфальта»), непрозрачные, матовые, приподнятые с выпуклым центром или выпуклые, округлой формы, гладкие с ровными краями и мягкой консистенции (S-форма) или шероховатые, с радиальной исчерченностью (напоминающие форму «маргаритки»), с приподнятым центром (R-форма). Иногда крошащиеся при прикосновении петлей.

3. Микроскопию препаратов — мазков из «подозрительных» колоний можно не проводить, так как все эти колонии подлежат обязательному изучению в пробе на токсигенность и в пробе Пизу.

4. Из «сомнительных» колоний готовят препараты — мазки. В препаратах-мазках, как «подозрительных», так и «сомнительных» колоний клетки C.diphtheriae из культуры, выросшей на средах первичного посева с ингибиторами роста (теллурит калия), могут быть укорочены, утолщены, однако присущее им расположение и полиморфизм сохраняются. Оценка морфологических признаков не позволяет установить видовую принадлежность микроорганизмов, но дает возможность при обнаружении коринеформных микроорганизмов предположительно отнести их к роду Corynebacterium и подвергнуть дальнейшей идентификации по всем тестам. В случае обнаружения других форм микроорганизмов (кокков, дрожжей, споровых палочек) дальнейшее изучение этих колоний прекращается.

5. В случае роста «подозрительных» по морфологии колоний, похожих на колонии коринебактерий, необходимо сразу через 24 ч роста приступить к изучению их токсигенных свойств. Токсигенные свойства изучают не менее чем у 2 изолированных колоний путем посева одной половины каждой колонии на среду для определения токсигенности и «необожженной» петлей — на среду Пизу, а другой половины колонии — в пробирку со скошенным сывороточным агаром для сохранения и накопления чистой культуры.

6. При невозможности снять колонии в первые 24 ч роста для посева на токсигенность и на среду Пизу используется материал целой колонии. Посев на скошенный агар исключается и в дальнейшем используется культура, выросшая через 24 ч в пробирке с пробой Пизу. Учитывая, что через 24 ч роста колонии имеют небольшие размеры и материала или 1 колонии может быть недостаточно для накопления дифтерийного токсина в пробе на токсигенность, а также то, что в исследуемом материале могут находиться одновременно токсигенные и нетоксигенные разновидности C.diphtheriae, крайне важно изучить токсигенные свойства, по возможности, у максимального числа выросших колоний (20 и более), смешивая по 5-7 однотипных колоний в одну бляшку. При невозможности постановки пробы на токсигенность классическим способом из-за недостаточного количества и малого размера колоний, выросших через 24 ч, изучают, смешивая однотипные по морфологии и размеру колонии в нескольких бляшках и, не прожигая петли, производят посев в среду Пизу. Чашки с пробами на токсигенность и Пизу помещают в термостат.

7. Чашки с первичным посевом исследуемого материала вновь помещают в термостат на 24 ч и просматривают их повторно через 48 ч роста первичного материала (на третьи сутки).

8. Предварительный ответ о выявлении C.diphtheriae может быть выдан при наличии множественного роста однотипных «подозрительных» колоний на чашках первичного посева после 24 ч инкубации. Выявляют наличие фермента цистиназы (через 3 ч) и определяют наличие фермента уреазы (через 30 мин) путем внесения в пробирки большого количества колоний (до 5-6).

Третий день

1. Через 24 ч, при появлении специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности, положительной пробе на цистиназу, изучаемую культуру идентифицируют как коринебактерии дифтерии токсигенные и выдают документированный ответ о выделении C.diphtheriae токсигенных. При отсутствии специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности чашки инкубируют еще 24 ч.

2. Культуру, выросшую на скошенном сывороточном агаре или с пробы Пизу (после оценки ее чистоты), засевают на среды для определения биохимического варианта (глюкоза, сахароза, крахмал) и фермента уреазы (гидролиз мочевины).

3. Чашки с первичным посевом исследуемого материала просматривают визуально или с помощью микроскопа бинокулярного стереоскопического (МБС) повторно через 36-48 ч инкубации в термостате. При наличии «подозрительных» колоний изучают их токсигенные свойства, цистиназную активность и выделяют чистую культуру на скошенном сывороточном агаре, если эти процедуры не были выполнены через 24 ч роста первичного материала.

4. Если вырастает только одна колония через 48 ч роста на чашках первичного посева, ее засевают на среду для определения токсигенности и, не обжигая петли, в столбик среды Пизу для определения цистиназы. Для дальнейшей идентификации можно использовать культуру из пробирки с пробой Пизу или с бляшки через 48 ч роста в пробе на токсигенность, или через 24 ч роста в случае выявления токсигенных свойств идентифицируемой культуры.

5. При отсутствии колоний, подозрительных на коринебактерии дифтерии, выдают окончательный ответ, что коринебактерии дифтерии не выявлены.

6. При отсутствии роста микроорганизмов на «площадках» в чашках первичного посева через 48 ч инкубации в ряде случаев требуется повторное взятие и исследование материала. Отсутствие роста чаще всего свидетельствует о нарушении правил проведения бактериологического исследования (взятия, транспортирования, посева и культивирования исследуемого материала и качества питательных сред для первичного посева).

Четвертый день (или пятый)

1. При появлении специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности (через 24 ч инкубации пробы на токсигенность 48-часового роста первичного посева), положительной пробе на цистиназу выдают документированный ответ о выделении токсигенных коринебактерий дифтерии.

2. Культуру, выросшую на скошенном сывороточном агаре или с пробы Пизу, после определения ее чистоты засевают на среды для изучения биохимических свойств (среды Гисса с сахарозой, глюкозой, крахмалом, проба Заксе или бульон с мочевиной), если эта процедура не была сделана ранее.

3. Повторно (через 48 ч) учитывают результаты пробы на токсигенность, поставленной во 2 день исследования. Одновременно производят учет сахаролитических свойств и уреазной активности в пробах, поставленных в 3 день исследования.

При отсутствии специфических линий преципитации через 48 ч после постановки пробы на токсигенность, но при положительных результатах проб на цистиназу, глюкозу, отрицательных результатах проб на уреазу и сахарозу, только на 4-5 сутки культуру идентифицируют как C.diphtheriae нетоксигенные, с указанием биохимического варианта.

4. При выделении токсигенных C.diphtheriae на 3-4 сутки от начала исследования дополнительно ответ о биохимических свойствах может быть выдан на 4-5 сутки (через 72 или 96 ч с момента первичного посева исследуемого материала).

1. Наличие специфических линий преципитации при определении токсигенных свойств, положительная проба на цистиназу, отрицательная проба на уреазу, характерные морфологические, культуральные и биохимические свойства (отсутствие ферментации сахарозы, ферментация глюкозы и крахмала или неферментация крахмала) позволяют заключить, что выделенная культура является C.diphtheriae, токсигенная, биохимического варианта гравис или митис.

2. Отсутствие специфических линий преципитации при определении токсигенных свойств, положительная проба на цистиназу, отрицательная проба на уреазу, характерные морфологические, культуральные и биохимические свойства (отсутствие ферментации сахарозы, ферментация глюкозы и крахмала или неферментация крахмала) позволяют заключить, что выделенная культура является C.diphtheriae, нетоксигенная, биохимического варианта гравис или митис.

3. При выделении C.pseudodiphtheriticum (ложнодифтерийной палочки Гофмана) или других дифтероидов, бактериологический ответ считают отрицательным.

4. При наличии линий преципитации (чаще «размытых» в виде «облачка»), идентичных специфическим линиям контрольного штамма коринебактерий дифтерии, положительных проб на уреазу, цистиназу, ферментации глюкозы и крахмала, отсутствии ферментации сахарозы, отсутствии редукции нитратов в нитриты, культуру относят к виду C.ulcerans, токсигенный вариант.

При отсутствии линий преципитации при определении токсигенных свойств и наличии всех других признаков, характерных для C.ulcerans, нетоксигенный вариант, бактериологический ответ считают отрицательным.

5. C.pseudotuberculosis идентифицируется по положительной реакции в пробе на уреазу. Тест восстановления нитратов в нитриты у этих микроорганизмов является вариабельным признаком, поэтому дифференциацию от C.ulcerans проводят по крахмалу (C.pseudotuberculosis не способны разлагать крахмал — отрицательный результат). Необязательный тест для практических бактериологов — для дифференциальной диагностики C.ulcerans и C.pseudotuberculosis вводят дополнительную пробу ферментации трегалозы и гидролиз желатина. Возможно выделение токсигенных С.pseudotuberculosis.

6. При выделении C.ulcerans и C.pseudotuberculosis необходимо подтверждение подобной идентификации в Референс-центре ФБУН МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора, чтобы исключить ошибки при возможном выделении C.diphtheriae.

7. Предварительный ответ при обследовании с диагностической целью и по эпидпоказаниям может быть выдан при наличии множественного роста однотипных «подозрительных» колоний на чашках первичного посева после 24 или 48 ч инкубации (на 2-3 сутки). Выявляют наличие фермента цистиназы и отсутствие фермента уреазы путем внесения в пробирки большого количества колоний. Предварительный ответ может быть изменен после окончания бактериологического исследования.

При нативной микроскопии (по просьбе инфекционистов) требуется дополнительный материал на тампонах из ротоглотки и носа. Однако чаше всего микроорганизмы в виде «палочек» не обнаруживают, что делает этот способ практически не пригодным.

1 день

Посев исследуемого материала на селективную дифференциально-диагностическую или, при необходимости, в транспортную среду. Инкубирование в термостате при 37 °С.

1. Изучение выросших колоний, при возможности — постановка пробы на токсигенность, цистиназу и посев культуры на скошенный сывороточный агар.

2. При использовании транспортной среды необходимо произвести пересев на селективную дифференциально-диагностическую среду.

3. При множественном росте, в случае необходимости, можно провести исследования для выдачи предварительного ответа — дополнительные пробы Пизу и Заксе.

1. Учет результатов проб на токсигенность и на цистиназу, поставленных во второй день исследования. В случае наличия специфических линий преципитации и при положительной пробе Пизу выдают документированный ответ о выделении токсигенных коринебактерий дифтерии.

2. Посев чистой культуры, выделенной во второй день исследования, на среды Гисса для изучения биохимических свойств (сахароза, глюкоза, крахмал, мочевина).

3. Повторный просмотр (через 48 ч) чашек первичного посева визуально или с помощью МБС. Постановка проб на токсигенность, цистиназу и отсев колоний на скошенный сывороточный агар.

4. В случае использования транспортной среды, ход исследования см. начиная с п.1 второго дня и далее по схеме.

5. Выдача бактериологического ответа об отсутствии коринебактерий дифтерии.

6. При обнаружении у исследуемой культуры фермента цистиназы, отсутствии фермента уреазы, можно выдать предварительный ответ о выделении дифтерийного микроба.

1. Учет токсигенных свойств культуры, выделенной в 3 день исследования (через 48 ч роста первичного посева), при обнаружении специфических линий преципитации выдают документированный ответ о выделении токсигенных коринебактерий дифтерии. Определяют биохимические свойства (сахароза, глюкоза, крахмал, мочевина).

2. Учет биохимических свойств культуры (токсигенной или нетоксигенной), выделенной во второй день исследования (через 24 ч инкубации первичного посева).

3. Выдача бактериологического ответа о выделении нетоксигенных коринебактерий дифтерии с указанием биохимического варианта и дополнительного ответа о биохимических свойствах токсигенных коринебактерий дифтерии, выделенных ранее.

1. Выдача бактериологического ответа о выделении токсигенных или нетоксигенных коринебактерий дифтерии с указанием биохимического варианта (в случае 48 ч инкубации первичного посева и 48 ч проявления или не проявления специфических линий преципитации в пробе на токсигенность).

В основе метода определения токсигенности коринебактерий дифтерии (модифицированный тест Элека с бумажными полосками и тест Фельдмана с соавт. с бумажными дисками) лежит процесс встречной иммунодиффузии токсина и антитоксических антител в плотной питательной среде. В местах оптимального количественного соотношения между токсином, продуцируемым коринебактериями, и антитоксином, нанесенным на фильтровальную бумагу, происходит их взаимодействие с образованием преципитата в виде белой линии.

Токсигенность коринебактерий дифтерии определяют, как правило, в чистой культуре (отдельные колонии со среды первичного посева или культура со скошенного агара, или с пробы Пизу). Смесь колоний или культуры, загрязненные посторонней микрофлорой, также могут быть испытаны на токсигенность. При отсутствии, в этом случае, преципитатов в агаровом геле, опыт следует повторить с выделенными на скошенной сывороточно-агаровой среде или после рассева на КТА чистыми культурами.

Для постановки пробы на токсигенность необходимо иметь: стерильные чашки Петри с ровным дном (стеклянные или одноразовые пластиковые), питательную среду — сухую коммерческую питательную среду для определения токсигенности или агар Мартена, нормальную сыворотку крови крупного рогатого скота (СКРС), стерильные полоски из фильтровальной бумаги размером 0,7 см 8,0 см, или бумажные диски диаметром 0,6 см, очищенный ферментолизом и специфической сорбцией дифтерийный антитоксин (в дальнейшем именуется антитоксин), при отсутствии которого в исключительных случаях можно использовать противодифтерийную антитоксическую сыворотку лошадиную, лечебную (в дальнейшем именуется антитоксическая сыворотка). Лучше использовать коммерческие или приготовленные в лаборатории бумажные диски, пропитанные антитоксином. Обязательным является использование контрольного токсигенного штамма коринебактерий дифтерии биовара gravis 24-48-часового роста.

7.1.1. Методика определения токсигенных свойств коринебактерий дифтерии с использованием бумажных дисков с антитоксином (по Фельдману с соавт.)

Приготовление чашек для постановки пробы на токсигенность

Питательный агар для определения токсигенности целесообразно разливать в пробирки по 10 мл (количество, необходимое для приготовления одной чашки). При большом объеме работы питательный агар разливают во флаконы по 70-80 мл (на 7-8 чашек пробы на токсигенность). Питательный агар следует расплавлять только 1 раз; многократное плавление ухудшает свойства среды. Питательный агар расплавляют в водяной бане при 90 °С, тотчас же вынимают из бани, охлаждают до 50 °С и добавляют 20% сыворотки крупного рогатого скота. Так, к 10 мл питательного агара добавляют 2 мл сыворотки крупного рогатого скота (СКРС), перемешивают и выливают, соблюдая правила асептики, в стерильную чашку Петри, распределяют среду по дну осторожным вращением чашки, не допуская «вспенивания» — появления неровностей на поверхности среды.

Чашку подсушивают в термостате при 37 °С в течение 15-20 мин, при открытой крышке, повернув ее вверх дном, до нанесения бумажных дисков с антитоксином на поверхность среды. Чашки с питательной средой недопустимо пересушивать.

В редких случаях, когда на чашках первичного посева вырастают единичные колонии (не более 8), токсигенные свойства которых надлежит изучить, возможно использование полистироловых чашек Петри диаметром 4,5 см. Количество питательного агара и СКРС уменьшается (3,2 мл питательного агара 1,8%+0,8 мл СКРС).

Чашки со средой для определения токсигенности хранить не рекомендуется.

Приготовление бумажных дисков с дифтерийным антитоксином

Диски из плотной фильтровальной бумаги нарезают диаметром 6 мм, стерилизуют автоклавированием при 2 атм. в течение 20-30 мин, высушивают и пропитывают антитоксином, разведенным в 1 мл дистиллированной воды (500 МЕ в 1 мл). Достаточно 1 мл антитоксина для приготовления 80-100 дисков, 1 диск содержит (5±1) МЕ дифтерийного антитоксина. Далее диски подсушивают в термостате (соблюдая асептические условия) в течение 18-24 ч. Готовые диски помещают в стерильный флакон иди пробирку с силикагелем или другим гигроскопическим веществом и сохраняют в холодильнике при 4-6 °С.

Постановка пробы на токсигенность

На поверхность чашки Петри со средой для определения токсигенности дифтерийных микробов помещают четыре бумажных диска с дифтерийным антитоксином. Вокруг каждого диска с антитоксином формируют 5 «бляшек»: две «бляшки» — контрольного штамма и три — испытуемые (из одного анализа с подозрительными колониями формируют минимум две «бляшки» из изолированных колоний и одну — из смеси 3-6 однотипных колоний; материалом из этого же анализа можно занять места вокруг других дисков с антитоксином). Все пять «бляшек» располагают симметрично вокруг диска на расстоянии 0,7 см от его края. Диаметр каждой «бляшки» 0,6-0,7 см. На одной чашке Петри можно разместить до четырех дисков с антитоксином и, соответственно, до 20 «бляшек» с культурами (8 «бляшек» контрольных и 12 «бляшек» испытуемых). Бумажные диски расставляют на поверхности сывороточно-агаровой среды на максимально удаленном расстоянии между дисками, чтобы не произошло перекрестных реакций (рис.3).

Чашки с посевами помещают в термостат при 37 °С.

Результат реакции учитывают через 18-24 часа, а также — через 48 ч. Наличие линий преципитации между диском с антитоксином и испытуемой культурой свидетельствует о ее токсигенности. Исследуемая культура считается токсигенной, если линия преципитации данной культуры сливается под углом с линией преципитации контрольного штамма. Отсутствие линий преципитации у испытуемых культур через 48 ч, при наличии их у контрольных штаммов, указывает на отсутствие токсигенности у изучаемых культур. Линии преципитации у контрольных штаммов должны появляться через 18-24 ч. Более позднее появление линий преципитации требует проверки качества питательной среды, проверки чистоты контрольного штамма, или улучшения его фенотипических свойств при выращивании на кровяном агаре, или замены контрольного штамма.

7.1.2. Методика определения токсигенных свойств коринебактерий дифтерии с использованием бумажных полосок (по модифицированному тесту Элека)

Чашки для постановки пробы на токсигенность этим методом готовят так же, как при работе с бумажными дисками (чашки диаметром 4,5 см не используют). В центр чашки на поверхность застывающего агара обожженным пинцетом помещают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксином (или в редких случаях при отсутствии антитоксина используют антитоксическую лечебную лошадиную сыворотку). Чашку с бумажной полоской с антитоксином подсушивают в термостате при 37 °С в течение 15-20 мин при открытой крышке, повернув ее вверх дном. Приготовленные таким способом чашки не подлежат хранению.

Приготовление бумажных полосок с антитоксином

Полоски фильтровальной бумаги нарезают размером (0,7х8,0) см, заворачивают по 2-4 штуки в пакетик и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм. в течение 30 мин. Пакетики с бумажными полосками хранят в стерильной чашке Петри до 3 недель. Важным является сохранение ровных краев полоски и отсутствие грифельной черты при рисовании их на фильтровальной бумаге.

Перед постановкой пробы на токсигенность содержимое ампулы с антитоксином растворяют в 1 мл стерильного физиологического раствора, переносят в стерильную пробирку и указывают на ней данные этикетки (растворенный антитоксин хранят при температуре 4-6 °С не более 10 дней). Фильтровальные бумажки обожженным пинцетом помещают в стерильную чашку Петри, где на каждую полоску наносят 0,125 мл антитоксина, содержащего 500 МЕ в 1 мл.

Постановка пробы на токсигенность с бумажными полосками с антитоксином

Культуру засевают в виде «бляшек» диаметром 0,6-0,7 см на расстоянии 0,7-0,8 см друг от друга и 0,5 см от края полоски фильтровальной бумаги. На одну чашку следует засевать не более 10 «бляшек» (по 5 «бляшек» с каждой стороны полоски). Из них 6 «бляшек» испытуемой культуры, 4 — контрольного штамма. При небольшом количестве испытуемого материала засевают 6 контрольных «бляшек» и 4 — испытуемых. Материал от одного анализа засевают параллельными «бляшками» по обе стороны полоски с антитоксином (рис.4А).

Чашки с посевом помещают в термостат при 37 °С.

Учет результатов

Результат учитывают через 18-24 ч и 48 ч от начала постановки пробы на токсигенность. Критерием оценки специфичности преципитатов является слияние линий преципитации испытуемого штамма со специфическими линиями контрольного токсигенного штамма, чаще всего это может произойти через 48 ч, через 24 ч намечается только тенденция к слиянию. В тех случаях, когда у контрольного штамма формируется несколько линий преципитации (рис.4Б), что практически не наблюдается при использовании антитоксина, специфическими следует считать более четкие и рано появляющиеся преципитаты. Если через 18-24 ч от момента постановки пробы на токсигенность у контрольного штамма линии преципитации не обнаруживаются, это свидетельствует о нарушении условий постановки реакции. Необходимо проверить качество питательной среды или улучшить фенотипические свойства контрольного штамма, пассируя его на кровяной агаровой среде, или заменить контрольный штамм.

Оценка результатов реакции пробы на токсигенность при использовании бумажных дисков или полосок с антитоксином

Ознакомиться с документом вы можете, заказав бесплатную демонстрацию систем «Кодекс» и «Техэксперт».

источник