Бактериоскопический метод диагностики дифтерии

Материалом для исследования при дифтерии могут быть пленки и слизь из зева и носа, а при редких локализациях дифтеритических воспалений — из глаза, уха, с поверхности раны и кожи. Отделяемое забирают сухим ватным тампоном или смоченным 5% раствором глицерина в физиологическом растворе с рН-8.

До этого уровня его доводят 20% раствором однозамещенного фосфорно-кислого натрия (Na₂HPO₄).

Исследование осуществляют не позднее 3-4 часов после забора, с поэтапной выдачей ответов о подтверждении диагноза.

Морфологические и тинкториальные признаки дифтерийных бактерий настолько своеобразны, что микроскопический метод может примениться как самостоятельный или предварительный к бактериологическому анализу. Кроме того, он дает представление и о сопутствующей микрофлоре.

Для выявления дифтерийных палочек могут быть использованы три метода окраски: Грама, Леффлера, Нейccера.

МЕТОД ГPAМA позволяет выявить способность дифтерийных бактерий вступить во взаимодействие с генцианвиолетом. Дифтерийные бактерии грампозитивиы, но это свойство непостоянно. При контакте с антибиотиками, при длительном пребывании в голодной среде резко изменяется обмен веществ и грамположительность микробов теряется. Поэтому ориентироваться на этот признак нельзя.

МЕТОД НЕЙССЕРА — наиболее ценный дифференциально-диагностический способ, позволяющий не только окрасить микроорганизмы, но и выявить полярно вкрапленные зерна волютина и характерное расположение бактериальных особей под углом.

РЕАКТИВЫ

• УКСУСНОКИСЛАЯ СИНЬКА НЕЙСЕРА: метиленовая синька -0,1 г, спирт 96° -2 мл; 5% раствор ледяной уксусной кислоты в дистиллированной воде — 50 мл.
• РАСТВОР ЛЮГОЛЯ: 2 г йодистого калия растворить в 10 г дистиллированной воды. Затем к этому раствору прибавить; 1 г кристаллического йода и добавить воды до 300 мл.
• РАСТВОР ХРИЗОИДИНА: 2 г хризоидина на 300 мл горячей дистиллированной воды.

Вместо раствора хризоидина можно использовать раствор везувина (краситель бисмаркбраун): везувин-1 г; 96° cпирт-10 мл; кипящая дистиллированная вода-100 мл.

ТЕХНИКА ОКРАСКИ

1. Синька Нейссора- 1 минута
2. Раствор Люголя — 30 секунд.
3. Ополаскивание дистиллированной водой.
4. Докраска расвором хризоидина или везувина — 10-15 секунд.

Тело микробной клетки окрашивается в желтый или желто-коричневый цвет, зерна волютина — коричнево-черного цвета.

ОКРАСКА ПО СПОСОБУ ЛЕФФЛЕРА

Метод Леффлера прост, но по своим дифференциально-диагностическим возможностям он не уступает сложному способу Нейссера. Поэтому он применяется значительно чаще.

Для окраски нужен один реактив — щелочная метиленовая синька Леффлера следующего состава: Дистиллированная вода — 99 мл; 1% раствор едкого калия (КОН) — 1 мл; профильтрованный спиртовой раствор метиленовой синьки (0,5 г синьки на 30 мл спирта) — 30 мл.

Окраска осуществляется 1-2 минуты. При этом тело бактерий приобретает бледно-голубой цвет, зерна волютина — синий или cине-черный.

При выполнении микроскопического исследования важно отличить истинные дифтерийные бактерии от дифтериеподобных палочек Гоффмана и бактерий ксерозис.

II. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД

Дифтерийные бактерии требовательны к питательным средам. Для их выделения и накопления используется комплекс специальных элективных и дифференциально-диагностических сред.

СВЕРНУТАЯ СЫВОРОТКА РУ: 3 мл стерилыной сыворотки лошади (быка или человека) вносят в пробирку, укладывают с наклоном в 45-50° в свертывателе Коха, предварительно нагретом до +50 °C. Затем температуру доводят до 80° и прогревают в течение 1 часа. Готовую среду охлаждают, ставят в термостат для проверки стерильности. В случае прорастания среды последнюю повторно прогревают при + 80 °C в течение 2 часов.

На этой среде бактерии дают шероховатые R-формы, напоминающие в комплексе шагреневую кожу.

ТЕЛЛУРИТОВЫЕ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Дифтерийные бактерии обладают выраженной способностью восстанавливать теллуровокислый калий до металлического теллурита. Для выявления этой способности в среды добавляется дифференцирующий компонент-2% раствор теллурита калия следующего состава: дистиллированная вода-100 мл; теллурит калия (K₂FeO₄)-2 г. Раствор стерилизуют кипячением 30 минут. Для приготовления сред можно использовать также готовый 2% раствор теллурита калия в 40% глицерине, выпускаемый в ампулах для клинических теллуритовых проб.

СЫВОРОТОЧНО-ТЕЛЛУРИТОВЫИ АГАР: к 80 мл расплавленного и охлажденного до +50 °C 2% МПА добавляют 20 мл лошадиной или 30 мл бычьей сыворотки и 1 мл 2% раствора теллурита калия. Готовую среду разливают в стерильные чашки.

КРОВЯНО-ТЕЛЛУРИТОВЫЙ АГАР: к 100 мл расплавленного и охлажденного до +50 °C 2-3% МПА добавляют 5-10% дефибринированной крови человека (донорской, плацентарной) или животного (крупного рогатого окота, кролика, барана, морской свинки) и 1 мл 2% теллурита калия, смешивают и разливают в чашки.

СРЕДА КЛАУБЕРГА: 100 мл 3% МПА расплавляют, добавляют 3 мл 2% теллурита калия, 10 мл глицериновой смеси и 50 мл лаковой крови. Последнюю готовят следующим образом: к 34 мл дистиллированной стерильной воды добавляют 16 мл дефибринированной крови (любой). Состав глицериновой смеси: к 40 мл дефибринироваиной крови крупного рогатого скота или человека добавляют 20 мл химически чистого стерильного глицерина и выдерживают до употребления в холодильнике 3-6 недель.

По характеру роста на теллуритовых средах удается отдифференцировать дифтерийные бактерии как внутри вида, так и от других микроорганизмов.

ХИНОЗОЛЬНУЮ СРЕДУ БУЧИНА готовят по следующей прописи: на 100 мл воды добавляют 3 г хлористого натрия, 1,5 г, глюкозы, 1 мл 3% раствора цистина в 1% растворе соды, 2 мл водного раствора хинозола (1:1000), 0,08 г индикатора водноголубого, 4,0 сухого питательного агара. Смесь растворяют при нагревании. Устанавливают pH = 7,4-7,6. Охлаждают до +50 °C, добавляют 5 мл дефибринированной крови и, соблюдая стерильность, разливают в чашки Петри.

СРЕДА ТИНСДАЛЯ-САДЫКОВОЙ является селективной средой для дифтерийных бактерий. Посторонняя микрофлора на ней не растет или развивается очень скудно. Другим преимуществом среды является то, что она не нуждается в добавлении крови. Ее состав следующий: 100 мл мартеновского или обычного мясопептонного агара, 15-20 мл нормальной лошадиной сыворотки, 12 мл 1% раствора цистина (сначала растворить в 0,1 N р-ре NaOH, потом в воде), 11-12 мл 0,1N HCl (для нейтрализации NaOH); 1,8 мл 2% раствора теллуристого калия и 1,8 мл 2,5% раствора гипосульфита натрия.

Дифтерийные бактерии обладают рядом характерных биохимических признаков. Они хорошо ферментируют глюкозу и крахмал, высвобождают значительные количества активной цистиназы, выявляемой в пробе Пизу. Вместе с тем, названные микроорганизмы инертны в отношении сахарозы и не имеют фермента уреазы, обнаруживая отрицательную пробу Закса. Очень важным видовым признаком этих микробов является токсигенность. С эпидемиологической точки зрения, весьма существенное значение имеет серологическая неоднородность дифтерийных бактерий и наиболее широкое участие в распространении инфекции I и VI серологических типов. Это необходимо учитывать при диагностике дифтерии.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ УГЛЕВОДОЛИТИЧЕСКОИ АКТИВНОСТИ дифтерийных бактерий производится на комплексе углеводных сред, состоящих из 1% пептонной воды с pH-7,6, в которую добавляют различные углеводы: 0,5% сахарозы, 0,5% глюкозы, 0,2% крахмала. В качестве индикатора используется реактив Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью).

Среды разливают по 2 мл и стерилизуют текучим паром 3 дня подряд :по 30 минут. До работы они бесцветны, при ферментации углеводов — краснеют.

На углеводных сывороточно-водных средах, основа которых состоит из дистиллированной воды (80 мл) и сыворотки (20 мл), углеводолитические свойства культур проявляются плохо и ферментация углеводов идет очень медленно.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

ПРОБА ПИЗУ — ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТА ЦИСТИНАЗЫ

К 90 мл расплавленного 2% МПА с pH -7,6 добавляют 2 мл раствора цистина (1% раствор цистина в 0,1N растворе NaOH). Среду стерилизуют при +112 °C 30 минут. K расплавленной и охлажденной до +50 °C среде добавляют 1 мл 10% уксуснокислого свинца (простерилизованного дважды текучим паром) перемешивают и добавляют 9 мл нормальной лошадиной сыворотки. Среду стерильно разливают в маленькие пробирки по 2 мл. Посев производится уколом.

Вместо МПА с цистином можно использовать 2% МПА, приготовленный на переваре Хоттингера, с содержанием аминного азота в 250 мг%.

Дифтерийные бактерии активно перерабатывают белки и цистин с высвобождением сероводорода, который, соединяясь с уксусным свинцом, переходит в сернистый свинец коричнево-черного цвета. Дифтероиды подобных изменений не дают.

ПРОБА ЗАКСА — ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТА УРЕAЗЫ

Проба Закса служит для отличия дифтериеподобных бактерий, обладающих уреазной активностью, от истинных дифтерийных палочек, не имеющих этого фермента.

• 1. ВАРИАНТ СРЕДЫ: к 100 мл МПБ или Хоттингеровского бульона добавляют 1 г мочевины и 0,2 мл 1,6% спиртового раствора крезолрот, разливают по 2-3 млв пробирки и стерилизуют текучим паром 10 минут. Результаты учитывают через 20-24 часа после посева. Покраснение среды свидетельствует о наличии уреазы.
• 2. ВАРИАНТ СРЕДЫ: готовят два реактива: А и В.

Реактив А: мочевина — 1 г, спирт 96°- 2 мл, дистиллированная вода — 4 мл.

Реактив В: 0,2% раствор фенолрота-1 мл, однозамещенный фосфат калия (КН₂Р0₄)-0,1 г, двузамещенный фосфат калия (К₂НРО₄)-0,1 г, хлористый натрий — 0,5 г, дистиллированная вода — 100 мл.

Реактив А стерилизуют фильтрованием и хранят при + 4 °C, реактив В — в автоклаве текучим паром.

Перед работой оба реактива смешивают ex tempore из расчета 1 часть раствора А и 19 частей раствора В, смесь разливают по 0,1 мл в узкие пробирки. Испытуемые культуры вносят в количестве 2-6 капель, помещают в термостат на 30 минут. При положительной реакции смесь краснеет.

Дифференциация дифтерийных бактерий и дифтероидов по биохимическим признакам приведена ниже.

В отдельных случаях после определения биохимических свойств дифтерийных бактерий выясняется серотип штамма. Для этой цели используется ориентировочная агглютинация. Последнюю проводят на стекле с чистыми культурами, которые смывают со среды 1 мл солевого раствора и осторожно набирают стерильной пастеровской пипеткой. Агглютинирующие монотииовые сыворотки (I, II, III, IV, VI серотипы) разводят 1:25 солевым раствором с pH-7,6 (к 100 мл дистиллированной воды прибавляют 3,0 NaOH и устанавливают pH-7,6, доливая 5% раствор Na₂HPO₄). Для контроля испытуемой культуры ставят реакцию с выше указанным солевым раствором без сыворотки.

Положительная реакция характеризуется быстрым появлением хлопьев агглютината (2-3 минуты), особенно заметных при учете реакции над вотеутым зеркалом.

Неиспользованную сыворотку запаивают в ампулу или переливают в стерильную пробирку.

Агглютинирующие сыворотки хранятся в сухом месте при температуре от +4° до +10 °C.

При использовании высушенных сывороток последние перед употреблением растворяют в стерильной дистиллированной воде (1 мл на ампулу). Срок годности сухой сыворотки не ограничен.

УСКОРЕННЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ

ТЕЛЛУРНТОВАЯ ПРОБА — КЛИНИЧЕСКАЯ

Тампоном, смоченным 2% раствором теллуровокислого калия в 40% глицерине (выпускается в ампулах), смазывают пораженные миндалины и слизистую. При наличии дифтерийных бактерий тампон чернеет сразу или после 2-4-часовой инкубации в термостате.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОКСИГЕННОСТИ ДИФТЕРИЙНЫХ БАКТЕРИИ

Определение токсигенности дифтерийных бактерий осуществляется биологическим (в специализированных лабораториях) и диффузионным (на плотных средах) методами.

Рекомендуемая литература:

1. Профилактика дифтерии. Методические материалы для практических работников. М., 1961, стр. 37.
2. Сборник официальных материалов по лабораторному делу. Книга первая. Медгиз, 1961, стр. 331-337.
3. Сборник схем бактериологического исследования при некоторых инфекционных заболеваниях. Методическое пособие для врачей-курсантов заочников, под ред. проф. П. Н. Кашкина, Л., 1965, стр. 17-20.
4. Дяченко С. С. Микробиологические методы диагностики инфекционных заболеваний. Киев, 1962, стр. 224,
5. Пяткин К. Д., Трофимова Н. Д., Маркова Н. С. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии, 1962, стр. 219.
6. Руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных заболеваний, 1964, т. VI, стр. 375.
7. Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней под ред. Матвеева К. И. и Соколова М. И. 1964, стр. 422-430.

Источник: Мотавкина Н.С., Пьянова Р.Е. Микробиологическая диагностика некоторых капельных инфекций и токсоплазмоза. Методическая разработка для студентов. ВГМУ, 1973

источник

Диагностика дифтерии основана на клинических данных с последующим подтверждением диагноза бактериологическим исследованием. Лабораторная диагностика дифтерии включает в себя ряд исследований, основным из которых является микробиологическое.

• Зачастую для постановки диагноза бывает достаточно тщательно собранного анамнеза заболевания и осмотра ротоглотки. Всякая задержка при установлении диагноза и назначения адекватного лечения увеличивает вероятность неблагоприятного исхода заболевания.
• Выделение культуры возбудителей с последующим определением у выделенных возбудителей токсикогенности является основным и единственным методом микробиологической диагностики дифтерии. Предварительный результат получается через 24 часа, через 48 часов получается результат исследования дифтерийных палочек на токсикогенность, через 72 часа определяется биовар возбудителя.
• Микроскопическое исследование при дифтерии нерационально.
• Серологическая диагностика основана на определении роста титра антибактериальных антител. Результаты получаются на 2-й неделе заболевания.
• При диагностике дифтерии применяется генетический метод (ПЦР), позволяющий определить ДНК бактерий.
• Реакция латекс агглютинации относится к экспресс-методам. Результат получается уже через два часа.
• Иммунофлуоресцентный анализ результативен. Однако его проведение должно осуществляться только высококвалифицированным персоналом.

Рис. 1. Пленка грязно-белого цвета и выраженный отек подкожной жировой клетчатки шеи — «бычья шея» — классические признаки дифтерии.

Микробиологическое исследование является основным методом лабораторной диагностики дифтерии.

Бактериологическое исследование проводится в следующих случаях:

• с целью диагностики дифтерии зева, носа и глотки у взрослых и детей,
• с целью выявления возможного бактерионосительства у лиц, которые поступают в детские дошкольные учреждения и специализированные учреждения для взрослых,
• с целью выявления заболевания среди контактирующих лиц.

Материал для исследования (мазок на дифтерию) собирается натощак или спустя 2 часа после еды. Для исследования используются дифтерийные пленки или кусочки тканей, расположенных по соседству, отделяемое из мест поражения и носоглоточная слизь.

Забор материала (мазок на дифтерию) осуществляется ватным тампоном. Корень языка прижимается шпателем. Ватным тампоном необходимо коснуться слизистой оболочки миндалин на границе пленки, дужек и задней стенки глотки. Далее тампон опускается в стерильную пробирку, не касаясь ее стенок.

В течение первых 3-х часов должен быть отправлен в лабораторию. При невозможности произвести посев в ближайшие 3 — 4 часа, забор материала осуществляется стерильным ватным тампоном, который смачивают в 5% растворе глицерина в изотоническом растворе хлорида натрия или 2% растворе теллурита калия.

Забор материала (мазок на дифтерию) осуществляется двумя ватными тампонами, один из которых используется для посева, другой — для микроскопии.

При подозрении на дифтерию необходимо оповестить сотрудников лаборатории, чтобы собранный материал был посеян на соответствующие среды (кровяной агар, среда Леффлера или теллуритовая среда).

Посев осуществляется на питательные среды (кровяной агар, среда Леффлера или теллуритовая среда). Теллурит в большой концентрации подавляет рост сопутствующей микрофлоры.

Рис. 2. На фото рост колоний палочки дифтерии на разных средах — кровяном агаре и теллуритовой среде.

При росте бактерий на кровяном агаре колонии приобретают беловатую окраску, они непрозрачные, округлые, выпуклой формы, 1 — 2 мм в диаметре, чаще маслянистой консистенции.

При росте бактерий на теллуритовых средах колонии серого цвета, выпуклые, края ровные. Через двое суток колонии приобретают темно-серый или черный цвет, они имеют металлический блеск, ровные или фестончатые края, поверхность гладкая или радиально исчерчена.

Идентификации разновидностей штаммов возбудителей дифтерии основана на способности бактерий расщеплять гликоген и крахмал. Для этих целей используется методика «длинного» ряда углеводов.

Принимая во внимание ферментативные признаки возбудителей и структуру колоний при росте на теллуритовых средах, выделяют 4 биотипа коринебактерий дифтерии: Corynebacterium diphtheriae gravis, Corynebacterium diphtheriae mittis, Corynebacterium diphtheriae intermedius и Corynebacterium diphtheriae belfanti.

Рис. 3. На фото слева колонии коринебактерий дифтерии гравис (Corynebacterium diphtheriae gravis). Они имеют большой размер, выпуклые по центру, радиально исчерчены, с неровными краями. На фото справа Corynebacterium diphtheriae mittis. Они небольшого размера, темной окраски, гладкие и блестящие, с ровными краями.

Токсикогенность возбудителей дифтерии определяется после выделения культуры бактерий. Для этих целей используется методика диффузной преципитации в геле и методика определения токсикогенности бактерий в живом организме (на морских свинках).

Лабораторная диагностика с применением микроскопии является второстепенным по значимости. Ввиду того, что возбудители дифтерии плохо впитывают красители, окраска по Граму считается не специфичной, однако она позволяет косвенно определить непатогенные коринебактерии, которые в мазке располагаются параллельно друг другу.

При окраске по Нейссеру выявляются характерные для дифтерийных палочек зерна Бабеша-Эрнста, которые располагаются на полюсах клеток, придавая им вид булавы.

В мазках патогенные дифтерийные палочки располагаются под углом друг к другу.

Для выявления зерен Бабеша-Эрнста применяется методика люминесцентной микроскопии. При окрашивании мазков корифосфином в микроскопе можно увидеть желто-зеленые тела бактериальных клеток с оранжево красными зернами волютина.

Рис. 4. Дифтерийные палочки под микроскопом. Окраска по Граму.

Рис. 5. На фото слева ложнодифтерийные палочки Гоффмана. Они часто обнаруживаются в носоглотке. Они толстые, короткие, располагаются в мазках параллельно друг другу. На фото справа патогенные бактерии. В мазке располагаются под углом друг к другу.

Серологические исследования позволяют обнаружить антибактериальные и антитоксические антитела. Значимым является обнаружение антибактериальных антител, так как содержание антитоксина изменяется в связи с применением с первых дней антитоксической сыворотки. Наиболее распространенными в настоящее время является реакция пассивной гемагглютинации (РНГА и РПГА).

Иммуноглобулины G и M говорят об остроте инфекционного процесса.

Иммуноглобулины G говорят о недавно перенесенном заболевании.

Иммуноглобулины М говорят об остропротекающей дифтерии.

При дифтерии титр антител со временем повышается. Понижение концентрации антител свидетельствует о выздоровлении больного.

Противодифтерийные антитела образуются после вакцинации. В крови привитого человека они циркулируют многие годы.

Благодаря применению методики флуоресцирующих антител стало возможным проведение качественного и количественного анализа внутриклеточных и поверхностных антигенов в образцах клеточных суспензий. Антигены визуализируются с помощью специфических антител с флуоресцентными маркерами. Использование данной методики доверяется только высококвалифицированному персоналу.

Методика ПЦР применяется для раннего выявления дифтерийных палочек, подтверждения диагноза и в случаях атипичной ангины. Обнаружение гена токсикогенности методом ПЦР является наиболее быстрым и надежным методом лабораторной диагностики дифтерии.

Рис. 6. ПЦР является наиболее быстрым и надежным методом лабораторной диагностики дифтерии.

• При токсическом поражении сердечной мышцы отмечаются изменения на электрокардиограмме, фонокардиограмме и УЗИ сердца. Исследуется активность целого ряда ферментов (лактатдегодрогиназа, креатинфосфокиназа, аспартатаминотрансфераза).
• Поражение почек при дифтерии проявляется в виде токсического нефроза. При подозрении на это осложнение производится общий анализ крови и мочи, биохимические исследования (определение креатинина, мочевины, остаточного азота), производится УЗИ почек.
• Токсическое поражение печени протекает с явлениями гипогликемии (снижение уровня глюкозы в крови) и глюкозурии (наличие глюкозы в моче).
• Развитие анемии связано с гемолизом эритроцитов.

к содержанию ↑

Наличие или отсутствие противодифтерийного иммунитета устанавливается при помощи внутрикожной пробы Шика, которая проводится с дифтерийным токсином.

В случае отрицательной реакции говорят о невосприимчивости к дифтерии. Реакцию Шика сегодня используют только по эпидпоказаниям. На ее проведение уходит несколько дней. Однако несмотря на это она помогает определить степень восприимчивости к дифтерии лиц, находившихся в контакте с больным и уточнить их иммунный статус.

Рис. 7. Реакция Шика проводится с дифтерийным токсином. Стандартный дифтерийный токсин в дозе 0,2 мл вводится внутрикожно в среднюю треть предплечья туберкулиновым шприцом.

источник

Менингококковых заболеваний

Для диагностики менингококковых инфекций помимо классического бактериологического способа используют также различные серологические реакции, позволяющие обнаружить антигены возбудителя в спинномозговой жидкости и в крови. С этой целью применяют реакции коагглютинации, латекс-агглютинации, встречного иммуноэлектрофореза, реакцию пассивной гемагглютинации и эритроиммуноадсорбцию. Последний метод предложен, в частности, для обнаружения полисахаридного антигена серогруппы А (наиболее частого возбудителя менингита). Суть метода заключается в том, что луночки полистиролового планшета сенсибилизируют противоменингококковыми антителами, затем в них добавляют исследуемый материал, содержащий искомый антиген. Смесь инкубируют при 37°C в течение 30-60 мин для связывания антигена антителами. После отмывания в луночки добавляют эритроцитарный диагностикум (эритроциты, несущие антитела к менингококку группы А). В качестве положительного контроля в одну из луночек добавляют полисахарид группы А, отрицательного — эритроциты без антител. Реакцию учитывают через 20 мин седиментации при 22°C визуально и оценивают по 4-х крестной системе. В случае положительной реакции комплекс антитело-антиген взаимодействует с сенсибилизированными эритроцитами, в результате образуется гомогенный слой эритроцитов, фиксированных на стенках луночек. При отрицательной реакции эритроциты скатываются на дно, образуя компактный осадок.

МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ

А. Бактериоскопический

Б. Бактериологический

В. Серологический –РСК, РНГА со стандартным гонококковым антигеном.

Г. Экспресс диагностика:1) иммуно-люминесцентная микроскопия

2) ПЦР; мультиплексная ПЦР – комбинированный тест на выявление Neisseria gonorrhoeae, Chlamidia trachomatis и Trichomonas vaginalis.

МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ

А. Бактериоскопический

Ввиду полиморфизма возбудителей вактериоскопический метод носит второстепенный (ориентировочный характер).

Б. Бактериологический

В. Серологический.

В связи с широким распространением носительства микоплазм результат бактериологического метода подтверждают серологическим. Для серологической диагностики ставят РСК, РНГА, ИФА, реация ингибиции метаболизма с использованием метода парных сывороток (диагностическое значение имеет увеличение титра поздней сыворотки в 4 и более раз).

Г. Экспресс диагностика:1) иммуно-люминесцентная микроскопия;

3) метод гибридизации на основе ДНК-зондов.

Тема: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ИНФЕКЦИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ КОРИНЕБАКТЕРИЯМИ, АКТИНОМИЦЕТАМИ, ЛИСТЕРИЯМИ

План занятия

1. Изучение морфологии и культуральных свойств дифтерийной палочки. Макро- и микроскопия культур бактерий.

2. Типы дифтерийных бактерий. Разбор особенностей роста культур соответствующих типов на теллуритовых средах.

3. Биохимические свойства коринебактерий. Дифференциация истинных дифтерийных бактерий от псевдодифтерийных и дифтероидов по биохимическим свойствам. Демонстрация и разбор.

4. Правила взятия и пересылки материала от больного дифтерией для бактериологического исследования. Разбор.

5. Бактериологическая диагностика дифтерии. Разбор схемы исследования дифтеритической пленки (или материала от бактерионосителя).

6. Определение токсигенности дифтерийных бактерий реакцией преципитации в агаре и биопробой на морской свинке. Разбор и демонстрация.

7. Изучение морфологии и культуральных свойств Listeria monocytogenes.

8. Изучить морфологию возбудителя актиномикоза на демонстрационных препаратах. Познакомиться с культуральными особенностями возбудителя актиномикоза.

9. Разобрать схему бактериологической диагностики актиномикозов

Методические указания

1. Изучение морфологии и культуральных свойств дифтерийной палочки. Макро- и микроскопия культур бактерий

Готовые фиксированные мазки из чистой культуры дифтерийной палочки окрасить синькой Леффлера и по Нейссеру. Дифтерийные бактерии окрашиваются неравномерно, более интенсивно окрашиваются зерна волютина. При окраске синькой Леффлера зерна валютина (зерна Бабеша-Эрнста) красятьс в более темный цвет чем тело, это явление назваеться метахромазией. По способу Нейссера зерна окрашиваются в темно-синий, почти черный цвет, а тело бактерий — желтый. Дифтерийные палочки располагаются под углом друг к другу в виде римской цифры V. Препараты промикроскопировать и зарисовать.

Знакомство с характером роста возбудителя дифтерии на свернутой сыворотке, на теллуритовых средах.

2. Типы дифтерийных бактерий. Разбор особенностей роста культур соответствующих типов на теллуритовых средах

Разбор особенностей колоний различных типов дифтерийной палочки на теллуритовой среде – форма, размеры, цвет, блеск. Характер их роста на жидких средах — помутнение, осадок, пленка.

3. Биохимические свойства коринебактерий. Дифференциация истинных дифтерийных бактерий от псевдодифтерийных и дифтероидов по биохимическим свойствам. Демонстрация и разбор

Знакомство с биохимическими свойствами дифтерийной палочки по биохимическим наборам. Демонстрация и разбор. Заполнить таблицу.

Таблица 1. Свойства дифтерийной палочки и близких к ней

Знак + означает наличие признака. Знак – означает отсутствие признака.

4. Правила взятия и пересылки материала от больного дифтерией для бактериологического исследования. Разбор

Исследованию подвергаются слизь или пленка из зева, носа, носоглотки, миндалин. Реже исследуется материал с конъюнктивы глаза, со слизистой оболочки половых органов или с поверхности ран. Материал берут двумя стерильным тампоном. Один используют для приготовления препарата- мазка. Другой для бактериологического исследования, его погружают в стерильную пробирку с этикеткой, на которой указаны фамилия, имя, отчество, возраст больного и из какого места (полости) взят материал. Пробирки с материалом помещают в металлические пеналы и с нарочным отправляют в лабораторию для доследования. Разбор методики взятия материала из зева, носа и других мест и посева его при дифтерии.

5. Бактериологическая диагностика дифтерии. Разбор схемы исследования дифтеритической пленки (или материала от бактерионосителя)

С помощью стерильного ватного тампона произвести друг у друга забор материала со слизистой зева или носа и сделать посев на сывороточную среду с теллуритом.

Произвести макро- и микроскопическое изучение выросших подозрительных колоний. Препараты окрасить синькой Леффлера, по Граму и по Нейссеру. Результаты зарегистрировать в тетради. При обнаружении коринебактерий сделать посев на среды с глюкозой, сахарозой, цистином и мочевиной. Одновременно сделать посев для определения токсигенности бактерий.

6. Определение токсигенности дифтерийных бактерий реакцией преципитации в агаре и биопробой на морской свинке. Разбор и демонстрация.

Методика определения токсигенных свойств возбудителя дифтерии преципитацией в агаре заключается в следующем. Полоски фильтровальной бумаги размером 1,5×8 см, простерилизованные в автоклаве, смачивают антитоксической противодифтерийной сывороткой, разведенной стерильным физиологическим раствором до содержания 500 АЕ в 1 мл. Смоченную сывороткой бумажку стерильным пинцетом переносят на поверхность питательной среды в чашку Петри. Чашку подсушивают в термостате 15-20 минут. Испытуемые культуры засевают бляшками по обе стороны от фильтровальной бумажки. На одну чашку засевают несколько штаммов, один из которых заведомо токсигенный и служит контролем. Чашки с посевом помещают в термостат при температуре 37°С. Результат учитывают в течение 48 часов. В месте взаимодействия антитоксина с токсином образуется линия преципитации. Если исследуемая культура образует токсин, то ее линия преципитации сливается с линией преципитации контрольного штамма, образуя сплошную белую полоску. При неспецифической преципитации линия, образуемая исследуемым штаммом, пересекает или имеет тенденцию к пересечению с линией контрольного штамма.

Демонстрация чашек с культурами токсигенной и нетоксигенной дифтерийной палочки. Зарисовать схему определения токсигенных свойств возбудителя дифтерии.

Определить токсигенные свойства дифтерийной палочки можно также методом биопробы. Для опыта берут двух морских свинок, накануне одной из них вводят 500-1000 АЕ антитоксической противодифтерийной сыворотки. Затем свинкам вводят подкожно (0,2 мл) или внутрикожно (0,1 мл) исследуемую культуру. Если испытуемая культура токсигенна, то при подкожном введении опытная свинка через 2-5 дней погибает. При вскрытии обнаруживается отек в месте введения культуры, экссудат в брюшной и грудной полостях и в перикарде. Особенно характерным симптомом является увеличение и гиперемия надпочечников. Контрольная свинка остается живой. При внутрикожном введении токсигенной культуры у опытной свинки в месте инъекции наблюдается покраснение, отечность, а в дальнейшем — некроз. У контрольной морской свинки никаких изменений не отмечается.

7.Изучение морфологии и культуральных свойств Listeria monocytogenes

Промикроскопировать готовый препарат-мазок из культуры листерий, окршенный по Граму и зарисовать.

Знакомство с характером роста возбудителя листериоза на сывороточном МПА, сахарном МПБ.

8. Изучить морфологию возбудителя актиномикоза на демонстрационных препаратах. Познакомиться с культуральными особенностями возбудителя актиномикоза.

Промикроскопировать готовый препарат-мазок из чистой культуры актиномицетов и друзу актиномицета, окршенный по Граму и зарисовать.

Знакомство с характером роста возбудителя актиномикоза на среде Сабуро.

Контрольные вопросы

1. Какие микробиологические методы применяются для диагностики дифтерии?

2. Какой материал берется для исследования при подозрении на дифтерию и при обследовании на бактерионосительство?

3. Какие морфологические признаки присущи дифтерийной палочке?

4. Каковы тинкториальные особенности возбудителя дифтерии?

5. По каким признакам дифференцируют типы гравис, митис и интермедиус?

6. По каким биохимическим признакам отличают дифтерийную палочку от дифтероидов?

7. В чем заключается сущность пробы Пизу?

8. Какими методами и как определяют токсигенность возбудителя дифтерии?

9. Каковы пути и способы заражения дифтерией?

10. Какова роль дифтерийного батерионосительства в эпидемиологии дифтерии?

11. Как используют РПГА для обнаружения в сыворотке детей антитоксина?

12. Почему для микробиологической диагностики дифтерии необходимо выделение чистой культуры возбудителя и изучение его свойств?

13. Каковы морфологические, тинкториальные, кулътуральные и биохимические признаки листерий?

14. Какие методы микробиологической диагностики применяют при листериозе?

15. Как проводится бактериологическая и серологическая диагностика листериоза?

16. Какими факторами патогенности обладает возбудитель дифтерии?

17. Каковы способы и пути передачи возбудителя дифтерии?

18. Что поражает (какие органы и системы органов) дифтерийный токсин?

19. Каковы особенности генетического контроля синтеза токсина у возбудителя дифтерии?

20. Каковы природа и структура дифтерийного токсина?

21. Каков молекулярный механизм действия дифтерийного токсина и какой процесс в клетке он блокирует?

22. Каким образом осуществляется активация дифтерийного токсина?

23. Каким образом возможно превращение нетоксигенной дифтерийной бактерии и токсигенную?

24. Каковы особенности современной классификации дифтерийных бактерий, и какие критерии с этой целью используются?

25. Каковы морфологические, тинкториальные и кулътуральные признаки актиномицетов?

26. Какие методы микробиологической диагностики применяют при актиномикозов?

27. Как проводится бактериоскопический, бактериологическая и серологическая диагностика актиномикоза?

28. Какими факторами патогенности обладает возбудитель актиномикоза?

МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ДИФТЕРИИ

МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ЛИСТЕРИОЗА

Имеет второстепенное значение, в связи с отсутствием морфологических особенностей. Применяют для изучения органов павших животных, а также новорожденных, погибших от листериоза. Готовят мазки-отпечатки, фиксируют смесью Никифорова, окрашивают по Романовскому-Гимзе или по Граму. Листерии имеют вид грамположительных коротких, умеренно толстых палочек, иногда нитей или кокков, расположенных одиночно или в форме частокола.

Б. Бактериологический (на ранних стадиях заболевания).

Материал для исследования на листерии — кровь, СМЖ, слизь из зева, пунктаты увеличенных лимфатических узлов, у новорождённых дополнительно — меконий, пупочная кровь; секционный материал (кусочки мозга, печени, селезёнки, лимфатические узлы). Посевы рекомендуют делать в первые 7-10 сут. болезни. Кровь и СМЖ засевают на плотные среды (глюкозный, глюкозо-печёночный или КА с глюкозой), в 100-200 мл глюкозного, глюкозно-печеночного или глюкозно-глицеринового бульона. Материал плотной консистенции эмульгируют в изотоническом растворе хлорида натрия и сеют на глицериновый или кровяной агар с теллурита калия или полимиксина (1-5 мкг / мл). Если изучаемый материал очень загрязнен посторонней микрофлорой, лучше сначала ввести его белым мышам или гвинейским свинкам и после их гибели печени и селезенки сделать мазки-отпечатки и посевы. Засеяны среды инкубируют при 37 ° С в течение 7 суток, ежедневно контролируя наличие роста путем бактериоскопии. Выросшие колонии отбирают для дальнейших исследований по наличию гемолитической активности (на средах с кровью) либо по способности приобретать сине-зелёную окраску при косом освещении. Идентификацию выделенных культур осуществляют по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, антигенным свойствам. Листерии каталазоположительны, ферментируют до кислоты глюкозу, мальтозу, салицин, не разлагаются маннит и глицерин. Свежие культуры дают положительную конъюнктивальную пробу в гвинейских свинок. Через 2 часа после внесения капли бульонной культуры листерий в конъюнктивальный мешок развивается гнойное воспаление конъюнктивы.

Проводят со второй недели заболевания. С сывороткой крови больного и стандартным антигеном ставят РСК (диагностический титр 1:5 и выше). Применяют РНГА (для выявления хронического листериоза). AT сохраняются не менее 1 — 2лет после выздоровления (реакция может быть использована для ретроспективного анализа).

Для биологической диагностики листериоза лучше всего использовать белых мышей, иммуносупрессированных введением кортизона (4-5 мг в/м за 4 ч до заражения). После гибели животного (обычно на 2-6-е сутки) проводят посев материала из различных органов. Следует помнить, что листе-рии размножаются в мёртвых тканях, и для избежания диагностических ошибок часть патологического материала следует поместить в стерильные пробирки и хранить в течение 5 — 10 сут при температуре 4-6° С, а затем подвергнуть повторному исследованию.

ПЦР. Применяют тест-ситемы для определения вирулентных Listeria monocytogenes в клинических образцах, молоке и других пищевых продуктах. В качестве праймера ичпользуют последовательность генов листериолизина О. Чувствительность метода – 5-50 клеток в пробе.

МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ

Бактериоскопию проводят для выявления друз. Наиболее распространённый метод лабораторной диагностики актиномицетов — обнаружение друз A. israelii в экссудате или гнойном отделяемом из очагов поражения. Последние могут достигать значительных размеров, образуя так называемые серные гранулы или тельца Боллингера размером в среднем 0,3-2 мм. Для поиска более мелких друз исследуемый материал (гнойное отделяемое, мокрота, биоптаты и СМЖ) помещают на предметное стекло в каплю 10-20% раствора КОН или NaOH, подогревают, покрывают покровным стеклом и микроскопируют. Друзы актиномицетов имеют плотную, каменистую консистенцию и скрипят как песок при надавливании на покровное стекло. Друзы актиномицетов также можно исследовать методом «раздавленной» капли либо в препаратах, окрашенных по Романовскому-Гимзе или Граму. Они образованы агрегатами мицелия, имеющими вид округлых или овальных базофильных масс с эозинофильными включениями (очевидно, что это AT) на поверхности.

Патологический материал от больных, как правило, загрязнен посторонней микрофлорой. Для избавления от нее материал центрифугируют в растворе пенициллина и стрептомицина, затем отмывают от антибиотиков 0,85% раствором NaCl. Для освобождения от сопутствующей флоры можно внести в пробирку 50% раствор глицерина и выдержать 2-3 суток при 37 ° С. Для выделения чистых культур актиномицетов проводят посев на кровяной и сывороточный агары, среды Сабуро или Чапека, тиогликолевую среду, сердечно-мозговой МПА. Посевы актиномицетов инкубируют в аэробных и анаэробных условиях в течение 1 -2 нед. По периферии образующихся микроколоний имеются многочисленные ветвящиеся нити. Через 1-2 недели формируются плоские морщинистые или бугристые зрелые колонии_. Идентификация выделенной культуры проводится по совокупности биологических свойств.

Серологическая диагностика проводится редко. Используют реакции связывания комплемента и непрямой гемагглютинации. Антигеном служит актинолизат. Но обе реакции могут давать положительные результаты и при других заболеваниях (рак легких, тяжелые гнойные процессы). Несколько большее диагностическое значение имеют иммунологические тесты: реакция торможения миграции лейкоцитов и аллергическая проба с актинолизатом, а также количественное определение иммунокомпетентных клеток. Внутрикожная проба при висцеральном актиномикозе часто бывает отрицательный.

Аллергическую пробу со стандартным корпускулярным антигеном, или антигеном, полученным путем кислотного гидролиза культуры листерий, ставят на 6-9-й день заболевания. Его вводят внутрикожно в объеме 0,1 мл. Результат учитывают через 24-48 часов. Пробу считают положительной, если возникает гиперемия кожи и инфильтрат диаметром 1-2 см.

Тема: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА, МИКОБАКТЕРИОЗОВ, ЛЕПРЫ

План занятия

1. Правила взятия и пересылки в лабораторию патологического материала от больного туберкулезом.

2. Морфология туберкулезных бактерий — микроскопия готовых препаратов.

3. Культуральные свойства туберкулезных бактерий. Рост туберкулезной палочки на жидких и твердых питательных средах (демонстрация).

4. Бактериоскопическая диагностика туберкулеза. Микроскопия материала с окраской по Цилю-Нильсену. Методы обогащения.

5. Бактериологическая диагностика туберкулеза. Применение метода микрокультур (метод Прайса) для ускоренной диагностики туберкулеза (разбор и демонстрация).

6. Палочка проказы — микроскопия готовых препаратов.

7. Изучение иммунопрепаратов, применяемых для диагностики и профилактики туберкулеза.

Методические указания

1. Правила взятия и пересылки в лабораторию патологического материала от больного туберкулезом

Материалом для исследования чаще служит мокрота. Реже используются моча, гной, спинномозговая жидкость, испражнения. Материал собирают в стерильную баночку, закрывают пробкой. К присылаемому на анализ материалу прилагается бланк лечебного учреждения, в котором четко указывается название материала, цель исследования и предполагаемый диагноз. Кроме того, указывается фамилия, имя, отчество и возраст больного.

2. Морфология туберкулезных бактерий — микроскопия готовых препаратов

Промикроскопировать готовые препараты-мазки туберкулезных бактерий, окрашенных по Цилю-Нильсену. Препараты зарисовать.

3. Культуральные свойства туберкулезных бактерий. Рост туберкулезной палочки на жидких и твердых питательных средах (демонстрация)

Демонстрация роста туберкулезных бактерий на глицериновом бульоне, яичной среде Петраньяни и других средах.

4. Бактериоскопическая диагностика туберкулеза. Микроскопия материала с окраской по Цилю-Нильсену. Методы обогащения

Перед исследованием мокроту выливают в чашку Петри, поставленную на темном фоне. Из мокроты необходимо выбрать гнойные комочки, приготовить препарат-мазок, окрасить по Цилю-Нильсену. Промикроскопировать, обратив внимание на наличие прямых или слегка изогнутых тонких палочек, часто зернистых, расположенных одиночно или группами. Палочки окрашены в красный цвет, а лейкоциты, посторонние бактерии и слизь — в синий. Препарат зарисовать.

Если содержание туберкулезных бактерий настолько мало, что их не удается обнаружить в мазках, поэтому ранее широко пользовались одним из методов обогащения — методом осаждения или методом флотации.

Метод осаждения. К мокроте добавляют равное по объему количество однопроцентного едкого натра, плотно закрывают склянку и встряхивают ее в течение 5-15 минут до полного растворения мокроты, центрифугируют, сливают жидкость, осадок нейтрализуют 1-2 каплями десятипроцентного раствора соляной кислоты. Из осадка, в котором сконцентрированы туберкулезные бактерии, приготовляют мазки, окрашивают по Цилю-Нильсену и микроскопируют.

Метод флотации. Мокроту помещают во флакон или колбу с резиновой пробкой емкостью в 250 мл, добавляют равное количество 0,5-1% едкого натра, встряхивают 5-10 минут до полной гомогенизации. Колбу помещают в водяную баню и прогревают при 55°С в течение 30 минут, затем добавляют около 100 мл дистиллированной воды и 1-2 мл ксилола, бензина или газолина. Смесь встряхивают в течение 5-10 минут, еще вливают в колбу около 100 мл дистиллированной воды (до установления уровня жидкости в узкой части горловины) и оставляют при комнатной температуре на 20-30 минут. Образовавшийся сливкообразный слой переносят пипеткой на предметное стекло, которое кладут на крышку водяной бани, нагретой до 60°С. На высохший мазок наносят новые порции материала до тех пор, пока весь флотационный экстракт не будет перенесен на предметное стекло. Сухой препарат промывают эфиром для удаления ксилола или бензина, фиксируют на пламени, красят по Цилю-Нилъсену и микроскопируют.

5. Бактериологическая диагностика туберкулеза. Применение метода микрокультур (метод Прайса) для ускоренной диагностики туберкулеза (разбор и демонстрация)

Знакомство с методом микрокультур (метод Прайса) для ускоренной диагностики туберкулеза. Демонстрационный препарат микрокультуры туберкулезной палочки промикроскопировать и зарисовать. Микрокультура возбудителя туберкулеза выглядит в виде тяжей или скоплений, похожих на канат или косу и состоящих из туберкулезных палочек.

6. Палочка проказы — микроскопия готовых препаратов

Промикроскопировать и зарисовать готовые препараты палочки проказы. В отличие от туберкулезной палочки возбудитель проказы располагается параллельными рядами (в виде пачек сигар), преимущественно внутри клеток.

7. Ознакомление с составом и назначением следующих иммунопрепаратов: туберкулин Коха, очищенный туберкулин РРD-L, вакцина БЦЖ.

Методы микробиологической диагностики туберкулеза

Г. Аллергический–Проба Манту, Пирке.

Контрольные вопросы

1. Каковы морфологические особенности туберкулезной палочки?

2. Каковы тинкториальные свойства возбудителя туберкулеза?

3. Как растут туберкулезные палочки на жидких и твердых питательных средах?

4. Какие существуют типы туберкулезной палочки, и какова их роль в патологии человека?

5. По каким свойствам различают патогенные типы туберкулезных палочек?

6. Как классифицируют микобактерии по скорости роста и фотоактивации пигментообразования?

7. Почему возбудители туберкулеза относительно устойчивы к воздействию внешних факторов?

8. Какие лабораторные животные чувствительны к туберкулезной палочке?

9. Как происходит заражение человека туберкулезом?

10. Каков характер фагоцитоза при туберкулезе?

11. Какова природа иммунитета при туберкулезе?

12. Какую роль играют лимфоциты в реакции повышенной чувствительности замедленного типа при туберкулезе?

13. Какова природа туберкулина, его назначение и применение?

14. Каковы факторы патогенности туберкулезной палочки?

15. Какие микробиологические методы применяются для диагностики туберкулеза?

16. Как осуществляется бактериоскопическая диагностика туберкулеза?

17. Какие методы используют для обогащения материала при бактериоскопической диагностике туберкулеза?

18. Как ставится биологическая проба для диагностики туберкулеза?

19. Как осуществляется ускоренная диагностика туберкулеза (метод микрокультур)?

20. Каково значение туберкулиновых проб в диагностике туберкулеза?

21. Какие препараты применяются для диагностики и специфической профилактики туберкулеза?

22. Что такое микобактериозы? Их возбудители?

23. Каковы морфологические свойства возбудителя проказы?

24. Какие микробиологические методы используются для диагностики проказы?

25. Какие методы применяются для дифференциации палочки Гансена от туберкулезной палочки?

26. Какие иммунологические реакции используются для диагностики проказы?

27. По каким признакам отличают истинные туберкулезные бактерии от потенциально патогенных и сапрофитных микобактерий?

28. Почему необходимо определять чувствительность туберкулезных бактерий к антибиотикам?

ПРИЛОЖЕНИЕ К ЗАНЯТИЮ 5

А. Микобактерии, потенциально патогенные для человека:

M. africanum M. intracellulare M. paratuberculosis

M. asiaticum M. kansasii M. scrofulaceum

M. avium M. leprae M. senegalense

M. bovis M. lepraemurium M. szulgai

M. chelonei M. malmoense M. tuberculosis

M. farcinogenes M. marinum M. ulcerans

M. fortuitum M. microti M. xenopi

M. haemophilium M.porcinum M. vaccae

Б. Схема идентификации микобактерий

источник

Род Corynebarteriurn (от лат. Сoryne- булава)– гр+ палочковидные бактерии, не образующие спор, не имеющие жгути­ков. Содержат зерна волютина, расположенные чаще всего на концах палочек, они часто превышают размеры попереч­ника бактерии и придают вид булавы. Также имеются включения липидов и крахмала, который откладывается при недостатке кислорода.

В состав клеточной стенки входят специфические только для бактерий рода Corynebacterium липиды: эфиры коринемиколовой и коринемиколиновой кислот, димикола, фосфатиды маннозы и инозита.

В организме человека обитают условно-патоген­ные: С.diphtheriae, С.pseudodiphtheriticiim (hofmanii), С.xerosis, С.ulcerans. С.diphtheriae вызывает у человека дифтерию, другие – возбудители вторичных инфекций.

КОРИНЕБАКТЕРИЙ ДИФТЕРИИ С.diphtheriae.

Морфология.Пря­мые или слегка изогнутые палочки. В препаратах располагаются под углом др к др в виде букв L, V или китайских иероглифов. Зерна волютина (на концах палочек) выявляются при окраске синькой Леффлера или по методу Нейссера. Факультативные анаэробы, хорошо размножаются при свободном доступе кислорода. К пит средам требовательны: не способны утилизировать азот из ам­монийных соединений, требу­ют наличия почти всех АК, солейMg, Zn, Cu, Fe; необходимы углеводыисп среды, полу­ченные на основе фермента­тивного расщепления белка (казеина, дрожжей) с добав­лением крови или сыворотки. На пов плотных сред с КТе дифтерийные палочки образуют ТЕМНО-СЕРЫЕ ИЛИ ЧЕРНЫЕ колонии (биовары гравис, способны расщеплять крахмал, или миттис). Рост на скошенном сывороточном агаре сравнивают с ШАГРЕНЕВОЙ КОЖЕЙ, колонии не сливаются.

Расщепляют глюк и др моно- и дисахариды с образованием КИСЛОТЫ БЕЗ ГАЗА, восстанавливают нитраты, расщепляют цистеин.

Лизируются спе­цифичны для отдельных видов вирулентными фагами, что позволяет устанавливать фаговары исследуемых культур.

АГ.Имеют белковую капсулу, которая содержит К-АГ. Опре­деление этого АГа позволяет установить серовар (их более 10). Группоспецифический ПС АГстенки дает перекрестные реакции с микобактериями, нокардиями.

Экология и распространение.Передается аэрозольным (воздушно-капель­ным) путем. В настоящее время часто регистрируется у ВЗРОС­ЛЫХ (тяж формы). Токсигенность связана ЛИЗОГЕНИЗАЦИЕЙ специфичес­ким профагом. Выделяясь в окр среду со слюной, пленками, дифтерийные палочки сохраняют жизнеспо­собность в течение нескольких дней. Хорошо переносят высушивание. Чувствительны к дез растворам, антибиоткам.

Патогенность и патогенез.Заболе­вание развивается у лиц, не имеющих антитоксического иммунитета. На месте внедрения (зев, гортань, трахея, реже – нос, ухо) развивается местный воспалительный процесс. Все па­тогенные виды обладают фимбриямиАДГЕЗИЯ к хозяина, они выявляют­ся в РА трипсинизированных бараньих эритроцитов.

ТОКСИГЕННОСТЬ – способность секретировать гистотоксин, что про­является в виде локальной воспалительной реакции и в общей интоксикации, особенно чувствительны к нему НАДПОЧЕЧНИКИ, МИОКАРД, НС. Токсин блокирует синтез белка, что приводит к гибели→ некроз и ле­тальный исход.

ФЕРМЕНТЫ (гиалуронидаза, нейраминидаза,фибринолизин) обеспечивают распространение в тканях, но бактериемия клинически не проявляется.

КОРД-ФАКТОР нарушает фосфорилирование и дыхание МК.

Иммунитет.Наиболее восприимчивы дети 1–4 лет. Вырабатывается не очень прочный антитоксичес­кий иммунитет, возможны повторные заболевания дифтерией. Невосприимчивость зависит главным образом от содержания в крови антитоксина и АТ (опсонины, преципитины, комплементсвязывающие). Уровень антитоксического иммунитета устанавливают, определяя в крови Ат вРНГА с эритроцитарным диагностикумом (эр-ты нагружены дифтерийным анатоксином). Титр 1:20 и вышеиммунность обследуемого. Т/же применяетсяреакция Шика(внутрикожно вводят дифтерийный токсин, у НЕИММУННЫХ людей – местная воспалительная реакция, при наличии антитоксина реакции нет).

Лаб диагностика.Исп бактериологический и бактериоскопический (ориентировочный) – в мазках обнаруживают палочки с ти­пичной морфологией. Посевы для выделения возбуди­теля делают на элективные среды, выделяют чистые культуры идентифицируют, принадлежность к роду устанавливают по мор­фологическим и культуральным признакам, вид С.diphtheriae определяют по БХ свойствам (способность продуци­роватьH₂Sна средах с цистеином и неспособности рас­щеплять мочевину). Биовары гравис и митис различают по фер­ментации крахмала и по морфологии колоний.

Профилактика и лечение.Основное значение имеет активная иммунизация, создание антиток­сического иммунитета. Иммунизируют детей начиная с 3-месячного возраста, по схеме вводят вакцину, содержащую как один из компонентов дифтерийный анатоксин (АКДС, АДС).

Лечение начинают сразу, вводят антитоксическую противодифтерийную сыворотку. СЕРОТЕРА­ПИЯ эффективна в ранний период болезни, пока токсин еще не фиксирован клетками и ткани существенно не повреж­дены. Кол-во антитоксической сыворотки зависит от тяжести инфекции, ее формы и прочих клинических дан­ных. Возможна антибактериальная терапия.

источник