Коринобактерии дифтерии микробиологическая диагностика

Материалом для исследования при дифтерии могут быть пленки и слизь из зева и носа, а при редких локализациях дифтеритических воспалений — из глаза, уха, с поверхности раны и кожи. Отделяемое забирают сухим ватным тампоном или смоченным 5% раствором глицерина в физиологическом растворе с рН-8.

До этого уровня его доводят 20% раствором однозамещенного фосфорно-кислого натрия (Na₂HPO₄).

Исследование осуществляют не позднее 3-4 часов после забора, с поэтапной выдачей ответов о подтверждении диагноза.

Морфологические и тинкториальные признаки дифтерийных бактерий настолько своеобразны, что микроскопический метод может примениться как самостоятельный или предварительный к бактериологическому анализу. Кроме того, он дает представление и о сопутствующей микрофлоре.

Для выявления дифтерийных палочек могут быть использованы три метода окраски: Грама, Леффлера, Нейccера.

МЕТОД ГPAМA позволяет выявить способность дифтерийных бактерий вступить во взаимодействие с генцианвиолетом. Дифтерийные бактерии грампозитивиы, но это свойство непостоянно. При контакте с антибиотиками, при длительном пребывании в голодной среде резко изменяется обмен веществ и грамположительность микробов теряется. Поэтому ориентироваться на этот признак нельзя.

МЕТОД НЕЙССЕРА — наиболее ценный дифференциально-диагностический способ, позволяющий не только окрасить микроорганизмы, но и выявить полярно вкрапленные зерна волютина и характерное расположение бактериальных особей под углом.

РЕАКТИВЫ

• УКСУСНОКИСЛАЯ СИНЬКА НЕЙСЕРА: метиленовая синька -0,1 г, спирт 96° -2 мл; 5% раствор ледяной уксусной кислоты в дистиллированной воде — 50 мл.
• РАСТВОР ЛЮГОЛЯ: 2 г йодистого калия растворить в 10 г дистиллированной воды. Затем к этому раствору прибавить; 1 г кристаллического йода и добавить воды до 300 мл.
• РАСТВОР ХРИЗОИДИНА: 2 г хризоидина на 300 мл горячей дистиллированной воды.

Вместо раствора хризоидина можно использовать раствор везувина (краситель бисмаркбраун): везувин-1 г; 96° cпирт-10 мл; кипящая дистиллированная вода-100 мл.

ТЕХНИКА ОКРАСКИ

1. Синька Нейссора- 1 минута
2. Раствор Люголя — 30 секунд.
3. Ополаскивание дистиллированной водой.
4. Докраска расвором хризоидина или везувина — 10-15 секунд.

Тело микробной клетки окрашивается в желтый или желто-коричневый цвет, зерна волютина — коричнево-черного цвета.

ОКРАСКА ПО СПОСОБУ ЛЕФФЛЕРА

Метод Леффлера прост, но по своим дифференциально-диагностическим возможностям он не уступает сложному способу Нейссера. Поэтому он применяется значительно чаще.

Для окраски нужен один реактив — щелочная метиленовая синька Леффлера следующего состава: Дистиллированная вода — 99 мл; 1% раствор едкого калия (КОН) — 1 мл; профильтрованный спиртовой раствор метиленовой синьки (0,5 г синьки на 30 мл спирта) — 30 мл.

Окраска осуществляется 1-2 минуты. При этом тело бактерий приобретает бледно-голубой цвет, зерна волютина — синий или cине-черный.

При выполнении микроскопического исследования важно отличить истинные дифтерийные бактерии от дифтериеподобных палочек Гоффмана и бактерий ксерозис.

II. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД

Дифтерийные бактерии требовательны к питательным средам. Для их выделения и накопления используется комплекс специальных элективных и дифференциально-диагностических сред.

СВЕРНУТАЯ СЫВОРОТКА РУ: 3 мл стерилыной сыворотки лошади (быка или человека) вносят в пробирку, укладывают с наклоном в 45-50° в свертывателе Коха, предварительно нагретом до +50 °C. Затем температуру доводят до 80° и прогревают в течение 1 часа. Готовую среду охлаждают, ставят в термостат для проверки стерильности. В случае прорастания среды последнюю повторно прогревают при + 80 °C в течение 2 часов.

На этой среде бактерии дают шероховатые R-формы, напоминающие в комплексе шагреневую кожу.

ТЕЛЛУРИТОВЫЕ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Дифтерийные бактерии обладают выраженной способностью восстанавливать теллуровокислый калий до металлического теллурита. Для выявления этой способности в среды добавляется дифференцирующий компонент-2% раствор теллурита калия следующего состава: дистиллированная вода-100 мл; теллурит калия (K₂FeO₄)-2 г. Раствор стерилизуют кипячением 30 минут. Для приготовления сред можно использовать также готовый 2% раствор теллурита калия в 40% глицерине, выпускаемый в ампулах для клинических теллуритовых проб.

СЫВОРОТОЧНО-ТЕЛЛУРИТОВЫИ АГАР: к 80 мл расплавленного и охлажденного до +50 °C 2% МПА добавляют 20 мл лошадиной или 30 мл бычьей сыворотки и 1 мл 2% раствора теллурита калия. Готовую среду разливают в стерильные чашки.

КРОВЯНО-ТЕЛЛУРИТОВЫЙ АГАР: к 100 мл расплавленного и охлажденного до +50 °C 2-3% МПА добавляют 5-10% дефибринированной крови человека (донорской, плацентарной) или животного (крупного рогатого окота, кролика, барана, морской свинки) и 1 мл 2% теллурита калия, смешивают и разливают в чашки.

СРЕДА КЛАУБЕРГА: 100 мл 3% МПА расплавляют, добавляют 3 мл 2% теллурита калия, 10 мл глицериновой смеси и 50 мл лаковой крови. Последнюю готовят следующим образом: к 34 мл дистиллированной стерильной воды добавляют 16 мл дефибринированной крови (любой). Состав глицериновой смеси: к 40 мл дефибринироваиной крови крупного рогатого скота или человека добавляют 20 мл химически чистого стерильного глицерина и выдерживают до употребления в холодильнике 3-6 недель.

По характеру роста на теллуритовых средах удается отдифференцировать дифтерийные бактерии как внутри вида, так и от других микроорганизмов.

ХИНОЗОЛЬНУЮ СРЕДУ БУЧИНА готовят по следующей прописи: на 100 мл воды добавляют 3 г хлористого натрия, 1,5 г, глюкозы, 1 мл 3% раствора цистина в 1% растворе соды, 2 мл водного раствора хинозола (1:1000), 0,08 г индикатора водноголубого, 4,0 сухого питательного агара. Смесь растворяют при нагревании. Устанавливают pH = 7,4-7,6. Охлаждают до +50 °C, добавляют 5 мл дефибринированной крови и, соблюдая стерильность, разливают в чашки Петри.

СРЕДА ТИНСДАЛЯ-САДЫКОВОЙ является селективной средой для дифтерийных бактерий. Посторонняя микрофлора на ней не растет или развивается очень скудно. Другим преимуществом среды является то, что она не нуждается в добавлении крови. Ее состав следующий: 100 мл мартеновского или обычного мясопептонного агара, 15-20 мл нормальной лошадиной сыворотки, 12 мл 1% раствора цистина (сначала растворить в 0,1 N р-ре NaOH, потом в воде), 11-12 мл 0,1N HCl (для нейтрализации NaOH); 1,8 мл 2% раствора теллуристого калия и 1,8 мл 2,5% раствора гипосульфита натрия.

Дифтерийные бактерии обладают рядом характерных биохимических признаков. Они хорошо ферментируют глюкозу и крахмал, высвобождают значительные количества активной цистиназы, выявляемой в пробе Пизу. Вместе с тем, названные микроорганизмы инертны в отношении сахарозы и не имеют фермента уреазы, обнаруживая отрицательную пробу Закса. Очень важным видовым признаком этих микробов является токсигенность. С эпидемиологической точки зрения, весьма существенное значение имеет серологическая неоднородность дифтерийных бактерий и наиболее широкое участие в распространении инфекции I и VI серологических типов. Это необходимо учитывать при диагностике дифтерии.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ УГЛЕВОДОЛИТИЧЕСКОИ АКТИВНОСТИ дифтерийных бактерий производится на комплексе углеводных сред, состоящих из 1% пептонной воды с pH-7,6, в которую добавляют различные углеводы: 0,5% сахарозы, 0,5% глюкозы, 0,2% крахмала. В качестве индикатора используется реактив Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью).

Среды разливают по 2 мл и стерилизуют текучим паром 3 дня подряд :по 30 минут. До работы они бесцветны, при ферментации углеводов — краснеют.

На углеводных сывороточно-водных средах, основа которых состоит из дистиллированной воды (80 мл) и сыворотки (20 мл), углеводолитические свойства культур проявляются плохо и ферментация углеводов идет очень медленно.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

ПРОБА ПИЗУ — ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТА ЦИСТИНАЗЫ

К 90 мл расплавленного 2% МПА с pH -7,6 добавляют 2 мл раствора цистина (1% раствор цистина в 0,1N растворе NaOH). Среду стерилизуют при +112 °C 30 минут. K расплавленной и охлажденной до +50 °C среде добавляют 1 мл 10% уксуснокислого свинца (простерилизованного дважды текучим паром) перемешивают и добавляют 9 мл нормальной лошадиной сыворотки. Среду стерильно разливают в маленькие пробирки по 2 мл. Посев производится уколом.

Вместо МПА с цистином можно использовать 2% МПА, приготовленный на переваре Хоттингера, с содержанием аминного азота в 250 мг%.

Дифтерийные бактерии активно перерабатывают белки и цистин с высвобождением сероводорода, который, соединяясь с уксусным свинцом, переходит в сернистый свинец коричнево-черного цвета. Дифтероиды подобных изменений не дают.

ПРОБА ЗАКСА — ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТА УРЕAЗЫ

Проба Закса служит для отличия дифтериеподобных бактерий, обладающих уреазной активностью, от истинных дифтерийных палочек, не имеющих этого фермента.

• 1. ВАРИАНТ СРЕДЫ: к 100 мл МПБ или Хоттингеровского бульона добавляют 1 г мочевины и 0,2 мл 1,6% спиртового раствора крезолрот, разливают по 2-3 млв пробирки и стерилизуют текучим паром 10 минут. Результаты учитывают через 20-24 часа после посева. Покраснение среды свидетельствует о наличии уреазы.
• 2. ВАРИАНТ СРЕДЫ: готовят два реактива: А и В.

Реактив А: мочевина — 1 г, спирт 96°- 2 мл, дистиллированная вода — 4 мл.

Реактив В: 0,2% раствор фенолрота-1 мл, однозамещенный фосфат калия (КН₂Р0₄)-0,1 г, двузамещенный фосфат калия (К₂НРО₄)-0,1 г, хлористый натрий — 0,5 г, дистиллированная вода — 100 мл.

Реактив А стерилизуют фильтрованием и хранят при + 4 °C, реактив В — в автоклаве текучим паром.

Перед работой оба реактива смешивают ex tempore из расчета 1 часть раствора А и 19 частей раствора В, смесь разливают по 0,1 мл в узкие пробирки. Испытуемые культуры вносят в количестве 2-6 капель, помещают в термостат на 30 минут. При положительной реакции смесь краснеет.

Дифференциация дифтерийных бактерий и дифтероидов по биохимическим признакам приведена ниже.

В отдельных случаях после определения биохимических свойств дифтерийных бактерий выясняется серотип штамма. Для этой цели используется ориентировочная агглютинация. Последнюю проводят на стекле с чистыми культурами, которые смывают со среды 1 мл солевого раствора и осторожно набирают стерильной пастеровской пипеткой. Агглютинирующие монотииовые сыворотки (I, II, III, IV, VI серотипы) разводят 1:25 солевым раствором с pH-7,6 (к 100 мл дистиллированной воды прибавляют 3,0 NaOH и устанавливают pH-7,6, доливая 5% раствор Na₂HPO₄). Для контроля испытуемой культуры ставят реакцию с выше указанным солевым раствором без сыворотки.

Положительная реакция характеризуется быстрым появлением хлопьев агглютината (2-3 минуты), особенно заметных при учете реакции над вотеутым зеркалом.

Неиспользованную сыворотку запаивают в ампулу или переливают в стерильную пробирку.

Агглютинирующие сыворотки хранятся в сухом месте при температуре от +4° до +10 °C.

При использовании высушенных сывороток последние перед употреблением растворяют в стерильной дистиллированной воде (1 мл на ампулу). Срок годности сухой сыворотки не ограничен.

УСКОРЕННЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ

ТЕЛЛУРНТОВАЯ ПРОБА — КЛИНИЧЕСКАЯ

Тампоном, смоченным 2% раствором теллуровокислого калия в 40% глицерине (выпускается в ампулах), смазывают пораженные миндалины и слизистую. При наличии дифтерийных бактерий тампон чернеет сразу или после 2-4-часовой инкубации в термостате.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОКСИГЕННОСТИ ДИФТЕРИЙНЫХ БАКТЕРИИ

Определение токсигенности дифтерийных бактерий осуществляется биологическим (в специализированных лабораториях) и диффузионным (на плотных средах) методами.

Рекомендуемая литература:

1. Профилактика дифтерии. Методические материалы для практических работников. М., 1961, стр. 37.
2. Сборник официальных материалов по лабораторному делу. Книга первая. Медгиз, 1961, стр. 331-337.
3. Сборник схем бактериологического исследования при некоторых инфекционных заболеваниях. Методическое пособие для врачей-курсантов заочников, под ред. проф. П. Н. Кашкина, Л., 1965, стр. 17-20.
4. Дяченко С. С. Микробиологические методы диагностики инфекционных заболеваний. Киев, 1962, стр. 224,
5. Пяткин К. Д., Трофимова Н. Д., Маркова Н. С. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии, 1962, стр. 219.
6. Руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных заболеваний, 1964, т. VI, стр. 375.
7. Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней под ред. Матвеева К. И. и Соколова М. И. 1964, стр. 422-430.

Источник: Мотавкина Н.С., Пьянова Р.Е. Микробиологическая диагностика некоторых капельных инфекций и токсоплазмоза. Методическая разработка для студентов. ВГМУ, 1973

источник

Возбудитель дифтерии относится к роду Corynebacterium (от лат. coryna — булава, diphthera — пленка). Бактерии имеют булавовидные утолщения на концах. К этому роду относятся патогенные для человека дифтерийные палочки и непатогенные виды — ложнодифтерийные палочки и дифтероиды, обнаруживаемые на слизистых оболочках и кожных покровах.

Возбудители дифтерии — Corynebacterium diphtheriae — были обнаружены Т. Клебсом (1883) и выделены в чистом виде Ф. Леффлером (1884).

Морфология. Возбудители дифтерии слегка изогнутые, тонкие палочки, размером 3-6 × 0,3-0,5 мкм, на концах которых имеются утолщения. В этих утолщениях имеются зерна волютина (зерна Бабеша — Эрнста). Бактерии дифтерии неподвижны, не имеют спор и капсул. Грамположительны. Они хорошо окрашиваются основными анилиновыми красителями, при этом волютиновые зерна окрашиваются интенсивнее. Для окраски обычно применяют щелочной метиленовый синий или кристаллический фиолетовый. Особенностью коринебактерий дифтерии является их полиморфность; в одной кулатуре встречаются различные по форме и размерам палочки: изогнутые, прямые, длинные, короткие, толстые, иногда коккобактерии. Характерно расположение бактерий в мазках — они обычно располагаются попарно под острым или тупым углом, в виде растопыренных пальцев и т. д. Расположение в мазках и наличие зерен волютина является дифференциально-диагностическим признаком при микроскопическом исследовании. Непатогенные представители рода коринебактерий — ложнодифтерийные палочки и дифтериоды чаще располагаются в виде частокола, зерна волютина у них могут отсутствовать либо быть на одном конце (см. рис. 4).

Культивирование. Коринебактерий дифтерии — факультативные анаэробы. Растут при температуре 35-37° С, рН среды 7,4-7,8. Они не размножаются на обычных питательных средах. Культивируют их на средах, содержащих кровь или сыворотку.

В конце XIX века французский ученый Э. Ру для культивирования бактерий дифтерии предложил использовать свернутую бычью или лошадиную сыворотку, а Ф. Леффлер рекомендовал добавлять к ней бульон (25%) и 1% глюкозу. На этих средах коринебактерий растут быстро, в течение 14-18 ч образуют несливающиеся выпуклые колонии кремового цвета (рост на скошенной среде напоминает шагреневую кожу). Однако отдифференцировать на этих средах дифтерийные палочки от ложнодифтерийных невозможно.

В настоящее время основными средами для выращивания являются среда Клауберга (содержащая сыворотку крови и теллурит калия), хинозольная среда Бунина, среда Тинсдаля и др. На основании культуральных и ферментативных свойств коринебактерий дифтерии делят на три биовара: гравис (gravis), ми тис (mitis), интермедиус (intermedins). Биовар гравис обычно находится в R-форме. На среде Клауберга бактерии этого биовара растут в виде крупных колоний 2-3 мм, серовато-черного цвета (так как восстанавливают теллурит в теллур), имеют изрезанные края, что придает им вид розетки. При прикосновении к колонии петлей она как бы рассыпается. На бульоне бактерии этого биовара образуют крошащуюся пленку и зернистый осадок.

Коринебактерии биовара митис (mitis) на среде Клауберга растут в виде небольших, гладких колоний (S-форма) черного цвета. На бульоне они дают равномерное помутнение.

Коринебактерии биовара интермедиус (intermedins) являются промежуточными. На среде Клауберга бактерии этого биовара чаще растут в виде блестящих, мелких, черных колоний (этот биовар встречается редко).

Ферментативные свойства. Все три биовара дифтерийных бактерий обладают ферментом цистиназой, расщепляющим цистин с образованием сероводорода. Эти свойства используются для дифференциации возбудителей дифтерии от непатогенных представителей этого рода (табл. 49).

Таблица 49. Свойства возбудителей дифтерии и близких к ним коринебактерий

Примечание. + положительная реакция (расщепляет); — отрицательная реакция (не расщепляет).

Возбудители всех трех биоваров расщепляют глюкозу и мальтозу до образования кислоты. С. gravis расщепляют крахмал. Это свойство отличает его от двух других биоваров. Коринебактерий дифтерии восстанавливают нитраты в нитриты, не образуют индол, не разлагают мочевину.

Коринебактерии дифтерии образуют нейраминидазу, гиалуронидазу и другие ферменты патогенности.

Токсинообразование. Вирулентные штаммы возбудителей дифтерии продуцируют экзотоксин. Химически он представляет собой термолабильный белок, состоящий из Двух фракций. Фракция В фиксирует токсин на чувствительных к нему тканях организма. Фракция А ответственна за токсическое действие. Силу токсина дифтерийных культур можно устанавливать «in vivo» на чувствительных к этому токсину морских свинках. Dim дифтерийного экзотоксина — минимальная смертельная доза, это минимальное количество яда, убивающее морскую свинку массой 250 г на 4-й день.

Наличие экзотоксина можно обнаружить также «in vitro» — на плотной питательной среде. Этот метод широко используется в практической работе. Дифтерийный экзотоксин малоустойчив. Он быстро разрушается под влиянием температуры, света и кислорода воздуха. После добавления к токсину формалина (0,3-0,4%) и выдерживания его при температуре 37-38° С в течение нескольких недель он переходит в анатоксин, который теряет ядовитость, но сохраняет антигенные свойства токсина. Токсины, образуемые различными штаммами, не различаются между собой и могут быть нейтрализованы дифтерийным антитоксином * .

* ( В настоящее время установлено, что все биовары коринебактерий могут быть токсигенными и нетоксигенными.)

Антигенная структура. У бактерий дифтерии имеется поверхностный термолабильный белковый антиген и типоспецифический полисахаридный О-антиген. Кроме этого, среди коринебактерий различают 19 фаговаров, которые учитываются при идентификации культур. С помощью фаговаров выявляют источник заболевания.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Возбудители дифтериии сравнительно устойчивы. Температура 60° С убивает их через 10-15 мин, 100° С — через минуту. В пленке они выдерживают нагревание до 90° С. На свернутой сыворотке при комнатной температуре сохраняются до 2 мес, на детских игрушках — несколько суток. Низкие температуры коринебактерий переносят хорошо. К высушиванию возбудители дифтерии довольно устойчивы. Дезинфицирующие вещества (3% раствор фенола, 1% раствор сулемы, 10% раствор перекиси водорода) убивают эти бактерии в течение нескольких минут.

Восприимчивость животных. В естественных условиях животные дифтерией не болеют. Из экспериментальных животных наиболее восприимчивы морские свинки и кролики. При внутрикожном или подкожном заражении у них развивается картина токсикоинфекции с образованием на месте введения воспаления, отека, некроза. В надпочечниках наблюдаются кровоизлияния.

Источники заболевания. Больные люди и бактерионосители.

Пути передачи. Воздушно-капельный путь, контактно-бытовой (через посуду, игрушки, книги, полотенца и т. д.).

Заболевание у человека: 1) дифтерия зева; 2) дифтерия носа.

Реже возникает дифтерия трахеи, бронхов, глаз, уха, влагалища и дифтерия поврежденной кожи.

Патогенез. Входными воротами являются слизистые оболочки дыхательных путей и поврежденная кожа. Попав на слизистую оболочку, возбудители дифтерии размножаются в месте внедрения и вызывают некроз ткани. Образуется пленка, тесно связанная с подлежащими тканями. На поверхности слизистой появляются грязно-серые или желтоватые налеты, состоящие из разрушенного эпителия, фибрина, лейкоцитов и коринебактерий дифтерии. При снятии пленки ватным тампоном или шпателем поверхность слизистой может кровоточить.

В процессе размножения коринебактерий дифтерии в некротических участках накапливается экзотоксин, который может привести к отеку слизистой оболочки и клетчатки. Со слизистой оболочки отек может распространяться на гортань, бронхи и вызвать явления асфиксии. Токсин, циркулирующий в крови, избирательно поражает сердечную мышцу, надпочечники и клетки нервной ткани.

Дифтерия — это токсикоинфекция. Тяжесть процесса зависит от степени токсигенности штамма и от защитных сил организма.

Иммунитет. Невосприимчивость обусловливается антитоксическим и антибактериальным иммунитетом. Грудные дети не болеют, так как у них имеется пассивный иммунитет, переданный от матери.

О наличии антитоксического иммунитета судят по реакции Шика. Для постановки реакции 1 /₄₀ Dlm (летальной дозы токсина для морской свинки), содержащегося в 0,2 мл изотонического раствора натрия хлорида, вводят внутрикожно в области предплечья. При отсутствии в крови антитоксина в месте введения через 24-48 ч появляется краснота и припухлость (до 2 см в диаметре). При наличии антитоксина припухлости и красноты нет (имеющийся в крови антитоксин нейтрализовал введенный токсин).

Перенесенное заболевание оставляет иммунитет. Однако в 6-7% случаев наблюдаются повторные заболевания.

Профилактика. Ранняя диагностика. Изоляция. Дезинфекция. Выявление носителей токсигенной дифтерийной палочки.

Специфическая профилактика осуществляется введением анатоксина. В СССР проводят обязательную вакцинацию детей вакциной АКДС — это комплексная вакцина, в которую входят дифтерийный и столбнячный анатоксин и взвесь убитых коклюшных палочек. Вакцинируют детей с 5-6 месяцев с последующей ревакцинацией. Для ревакцинации вводят вакцину без коклюшных палочек.

Специфическое лечение. Применяют противодифтерийную антитоксическую сыворотку. Доза и кратность определяется лечащим врачом, вводят также антимикробные препараты.

1. Какова морфология коринебактерий дифтерии и какие имеются биовары?

2. На каких средах выращивают бактерии дифтерии и каков характер роста?

3. Отношение к какому углеводу позволяет отличить биовар gravis от других биоваров дифтерии?

4. Каков путь передачи и где чаще локализуется возбудитель дифтерии у больного?

5. Каковы специфическая профилактика и специфическое лечение дифтерии?

Цель исследования: выделение возбудителя для постановки диагноза. Выявление бактерионосителей дифтерии по эпидемиологическим показаниям. Выявление экзотоксина у выделенной культуры.

1. Отделяемое слизистой оболочки зева.

2. Отделяемое слизистой оболочки носа.

3. Отделяемое слизистой оболочки глаза.

5. Отделяемое слизистой оболочки влагалища.

Материал для исследования зависит от локализации процесса.

Способы сбора материала

При любой локализации процесса обязательно исследует слизистую зева и носа. Материал собирают ватным тампоном, для чего используют металлическую проволоку, желательно алюминиевую, на один конец которой плотно накручивают вату, затем тампон монтируют в корковую пробку, помещают в пробирку и стерилизуют в печи Пастера при температуре 160° С 1 тампон течение часа или в автоклаве при температуре 112° С.

Примечания. 1. Материал собирают натощак либо не раньше чем через 2 ч после еды и не ранее чем через 4 дня после лечения антибиотиками или другими антибактериальными средствами. 2. Если материал берут из зева и носа, то пробирки с обоими тампонами надписывают и связывают вместе. Посевы делают раздельно и исследование материала из каждого тампона ведут как самостоятельную работу. 3 Материал, собранный сухим тампоном, должен быть посеян не позднее чем через 2-3 ч после забора. При необходимости транспортировки собранного материала тампон предварительно смачивают 5% раствором глицерина в изотоническом растворе натрия хлорида.

Первый день исследования

Чашки вынимают из термостата и просматривают. Рост бактерий на среде Клауберга может быть замедлен из-за наличия ингибиторов в среде. В этом случае чашки ставят в термостат еще на 24 ч.

Чашки вынимают из термостата, просматривают их с помощью лупы или стереоскопического микроскопа. При наличии подозрительных колоний часть их под контролем стереоскопического микроскопа выделяют на агар с 25% сывороткой и на столбик со средой Пизу для определения фермента цистиназы. Из другой части колоний ставят пробу на токсигенность.

При микроскопическом исследовании колоний, снятых со среды Клауберга, коринебактерии дифтерии теряют свою специфичность: отсутствует зернистость, изменяется величина, расположение сохраняется. При посеве их на среды с сывороткой морфологическая специфичность возбудителей дифтерии восстанавливается.

Проба на наличие фермента цистиназы и определение токсигенности являются обязательными при идентификации возбудителей дифтерии. Если результат этих опытов, проведенных с частью колоний со среды Клауберга, недостаточно четкий или отрицательный, то опыт повторяют, используя выделенную чистую культуру.

Проба на цистиназу. Проводят посев исследуемой культуры уколом в центр столбика среды Пизу. При положительной реакции через 18-24 ч по ходу укола наблюдается почернение, а вокруг черного стержня образуется темное облачко; почернение происходит в результате того, что фермент цистиназа расщепляет цистин, входящий в состав среды Пизу, и освободившаяся сера вступает в реакцию с ацетатом свинца — образуется сульфит свинца черного цвета. Дифтероиды и ложнодифтерийные палочки не содержат фермент цистиназу, поэтому при росте их на среде Пизу цвет среды не изменяется.

Определение экзотоксина. Проводят методом диффузной преципитации в геле. Метод основан на взаимодействии токсина с антитоксином. В тех участках агара, где эти компоненты взаимодействуют, образуется преципитат в виде закругленных линий.

Методика определения: в чашки Петри разливают растопленный и охлажденный до 50° С агар Мартена рН 7,8 (на агаре Мартена лучше продуцируется экзотоксин). Количество агара в чашке должно быть не более 12-15 мл, чтобы сохранить прозрачность, — в толстом слое линии преципитации плохо видны. После застывания агара накладывают полоску стерильной фильтровальной бумаги, смоченной противодифтерийной антитоксической сывороткой.

Испытуемую культуру засевают «бляшками». Посев производят петлей. Диаметр бляшек 0,8-1,0 см. Расстояние бляшек от края полосок бумаги 0,5-0,7 см, между двумя бляшками испытуемой культуры засевают бляшки заведомо токсигенного штамма. Испытуемую культуру считают токсигенной, если линии преципитации четки и сливаются с линиями преципитации контрольного (токсигенного) штамма. Если линии преципитации перекрещиваются с линиями контрольного штамма или отсутствуют, выделенную культуру считают нетоксигенной (рис. 50).

Рис. 50. Выявление экзотоксина C.Diphtheriae методом диффузной преципитации в агаре. 1 — бляшки нетоксигенного штамма (линии преципитации перекрещиваются); 2 — бляшки токсигенного штамма (линии преципитации соединяются)

Приготовление полосок бумаги. Из фильтровальной бумаги нарезают полоски размером 1,5×8 см, заворачивают по несколько штук в бумагу и стерилизуют в автоклаве при температуре 120° С в течение 30 мин. Перед постановкой опыта стерильным пинцетом вынимают одну полоску, укладывают ее в стерильную чашку Петри и смачивают противодифтерийной антитоксической сывороткой. Предварительно сыворотку разводят так, чтобы в 1 мл содержалось 500 АЕ (антитоксических единиц). Бумажку смачивают 0,25 мл сыворотки (125 АЕ) и помещают на поверхность среды. Затем делают посевы указанным выше способом. Все посевы ставят в термостат. Учет результатов производят через 18-24 и 48 ч.

Вынимают посевы из термостата, учитывают результат. Делают мазки из культуры, выросшей на среде с сывороткой, и окрашивают их синим Леффлера.

Наличие в мазках характерных по морфологии палочек, черного с облачком стержня в среде Пизу и линий преципитации в агаре позволяет дать предварительный ответ: «Обнаружены коринебактерии дифтерии». Исследование продолжают. При отсутствии линий преципитации в агаре или их недостаточной четкости исследование на токсигенность обязательно повторяют с выделенной чистой культурой.

Для окончательной идентификации выделенной культуры и определения биовара возбудителя производят посев на глюкозу, сахарозу, крахмал и бульон с мочевиной (для выявления фермента уреазы). Посев на среды делают обычным способом.

Проба на уреазу. Выделенную культуру засевают на бульон с мочевиной и индикатором (крезоловый красный) и ставят в термостат. Уже через 30-40 мин можно учитывать результат: при посеве истинных возбудителей дифтерии цвет среды не изменяется, так как они не содержат уреазу. Псевдодифтерийные палочки расщепляют мочевину и изменяют индикатор — среда приобретает малиново-красный цвет.

Производят учет результатов (табл. 50).

Таблица 50. Ферментативные свойства выделенных возбудителей

1. Какой материал исследуют для выявления возбудителя дифтерии?

2. Как собирают материал для исследования на дифтерию из зева и носа?

3. Что нужно сделать с тампоном, если собранный материал необходимо транспортировать?

4. При помощи какого прибора изучают колонии на среде Клауберга?

5. Какие исследования проводят для окончательной идентификации выделенной культуры?

6. Какими методами определяют токсигенность коринебактерий дифтерии?

1. Возьмите у преподавателя проволоку и вату и приготовьте 10 тампонов, вмонтируйте их в корковую пробку, вставьте в пробирку и простерилизуйте.

Внимание! Перед стерилизацией проверьте, достаточно ли плотно накручен тампон.

2. Возьмите у преподавателя стерильные тампоны и произведите забор материала друг у друга из зева и носа (разными тампонами).

3. Изучите по табл. 49 свойства возбудителей дифтерии и близких к ним коринебактерий.

4. Поставьте пробу на токсигенность. Бляшки сделайте петлей без культуры.

5. Зарисуйте ход исследования и положительный и отрицательный результат пробы на токсигенность.

Теллуровая среда Клауберга: первая смесь — предварительно за 1,5 мес готовят смесь из 20 мл бараньей или лошадиной крови и 10 мл глицерина. В день приготовления среды готовят две другие смеси; вторая смесь — 50 мл МПА рН 7,5 растапливают и охлаждают до температуры 50° С, после чего прибавляют 2,5 мл первой смеси; третья смесь — смешивают 17 мл бараньей крови и 33 мл дистиллированной воды (смесь приготавливают стерильно), подогревают на водяной бане до температуры 50° С. Соединяют вторую и третью смеси, прибавляют 4 мл 1% раствора теллурита калия К₂ТеО₃, быстро все перемешивают и разливают в чашки. Среда прозрачная, имеет цвет красного вина.

Среда Пизу. К 90 мл расплавленного 2% МПА (рН 7,6) добавляют 2 мл раствора цистина (1% раствор цистина в 0,1 н. растворе гидроксида натрия), тщательно перемешивают и добавляют такой же объем 0,1 н. раствора серной кислоты. Среду стерилизуют 30 мин при температуре 112° С. К расплавленной и охлажденной до 50° С среде добавляют 1 мл 10% раствора ацетата свинца, стерилизованного двукратно текучим паром, перемешивают и добавляют 9 мл нормальной лошадиной сыворотки. Среду стерильно разливают в маленькие пробирки по 2 мл. Посев производят уколом.

Среда Бунина. Сухую хинозольную среду добавляют к 100 мл холодной воды (рН 7,6-7,8), размешивают и нагревают на слабом огне до расплавления агара (по прописи на этикетке). Затем среду кипятят 2-3 мин до образования пены, после чего среду остужают до 50° С и добавляют 5-10 мл стерильной дефибринированной крови. Среду перемешивают и разливают в чашки Петри. Готовую среду можно сохранять 3-4 дня при температуре 4-10°.

Среда Тинсдаля. К 100 мл 2% питательного агара, расплавленного и охлажденного до 50° С, добавляют: 1) 12 мл 1% раствора цистина на 0,1 н. растворе серной кислоты; 2) 12 мл 1% раствора гидроксида натрия; 3) 1,8 мл 2% раствора теллурита калия; 4) 1,8 мл 2,5% раствора гипосульфита натрия, 20 мл нормальной лошадиной или бычьей сыворотки. После добавления каждого ингредиента среду тщательно перемешивают. Чашки со средой хранят 3-4 дня при 10° С.

источник

Возбудитель дифтерии. Таксономия. Характеристика. Микробиологическая диагностика. Выявление антитоксического иммунитета. Специфическая профилактика и лечение

Дифтерия — острая инфекционная болезнь, харак­теризующаяся фибринозным воспалением в зеве, гортани, реже в других органах и явлениями ин­токсикации. Возбудителем ее является Corynebacterium diphtheriae.

Таксономия. Corynebacterium относится к отделу Firmicutes, роду Corynebacterium.

Морфологические и тинкториальные свойства. Возбудитель дифтерии характеризуется полиморфизмом: тонкие, слегка изогнутые палочки (наиб. распространенные) встречаются кокковидные и вет­вящиеся формы. Бактерии нередко располагаются под углом друг к другу. Они не образуют спор, не имеют жгутиков, у многих штаммов выявляют микрокапсулу. Характерная особенность — наличие на концах палочки зерен волютина (обусловливает булавовидную форму). Возбудитель дифтерии по Граму окрашивается положи­тельно.

Культуральные свойства. Факульта­тивный анаэроб, оптим. темпе­ратура. Микроб растет на специальных питатель­ных средах, например на среде Клауберга (кровяно-теллуритовый агар), на которой дифтерийная палочка даёт колонии 3 типов: а) крупные, серые, с неровными краями, радиальной исчерченностью, напоминающие маргаритки; б) мелкие, чер­ные, выпуклые, с ровными краями; в) похожие на первые и вторые.

В зависимости от культуральных и ферментативных свойств различают 3 биологических варианта C.diphtheriae: gravis, mitis и промежуточный intermedius.

Ферментативная ак­тивность. Высокая. Ферментируют глк и мальтозу в образованием кислоты, не разлагают сахарозу, лактозу и маннит. Не продуцируют уреазу и не образуют индол. Продуцирует фермент цистиназу, рпсщепляющую цистеин до H₂S. Образует каталазу, сукцинатдегидрогеназу.

Антигенные свой­ства. О-антигены – термостабильные полисахаридные, расположены в глубине клеточной стенки. К-антигены – поверхностные, термолабильные, сероватоспецифические. С помошью сывороток к К-антигену С.diph. разделяют на серовары(58).

Факторы патогенности. Экзотоксин, нарушающий синтез белка и пора­жающий в связи с этим клетки миокарда, надпочечников, почек, нервных ганглиев. Способность вырабатывать экзотоксин обус­ловлена наличием в клетке профага, несущего tох-ген, ответ­ственный за образование токсина. Фер­менты агрессии — гиалуронидазу, нейраминидазу. К фак­торам патогенности относится также микрокапсула.

Резистентность. Устойчив к высушиванию, действию низких температур, поэто­му в течение нескольких дней может сохраняться на предметах, в воде.

Эпидемиология. Источник дифтерии — больные люди Заражение происходит чаще через дыхательные пути. Основной путь передачи воздушно-капельный, возможен и контактный путь — через белье, посуду.

Патогенез. Входные ворота инфекции — слизистые обо­лочки зева, носа, дыхательных путей, глаз, половых органов, раневая поверхность. На месте входных ворот наблюдается фибринозное воспаление, образуется характерная пленка, кото­рая с трудом отделяется от подлежащих тканей. Бактерии вы­деляют экзотоксин, попадающий в кровь, — развивается токсинемия. Токсин поражает миокард, почки, надпочечники, нервную систему.

Клиника. Существуют различные по локализации формы дифтерии: дифтерия зева, которая наблюдается в 85—90 % случаев, дифтерия носа, гортани, глаз, наружных половых ор­ганов, кожи, ран. Инкубационный период составляет от 2 до 10 дней. Заболевание начинается с повышения температуры тела, боли при глотании, появления пленки на миндалинах, увеличения лимфатических узлов. Отека гортани, разви­вается дифтерийный круп, который может привести к асфик­сии и смерти. Другими тяжелыми осложнениями, которые так­же могут явиться причиной смерти, являются токсический миокардит, паралич дыхательных мышц.

Иммунитет. После заболевания — стойкий, напряженный антитоксичный иммунитет. Особое значение – образование АТ к фрагменту В. Они нейтрализуют дифтерийный гистотоксин, предупреждая прикрепление последнего к клетке. Антибактериальный иммунитет – ненажняженный, сероватоспецифичен

Микробиологическая диагностика. С помощью тампона у больного берут пленку и слизь из зева и носа. Для постановки предварительного диагноза возможно применение бактериоскопического метода. Основной метод диагностики — бактериологический: посев на среду Клаубера II (кровяно-теллуритовый агар), на плотную сывороточную среду для выявления продукции цистиназы, на среды Гисса, на среду для определения токсигенности возбудителя. Внутривидовая идентификация заключается в определении био- и серовара. Для ускоренного обнаружения дифтерийного токсина применяют: РНГА (реакция непрямой геммаглютинации) с антительным эритроцитарным диагностикумом, реакцию нейтрализации антител (о наличии токсина судят по эффекту предотвращения гемаггютинации); РИА (радиоиммунный) и ИФА(имунноферментный анализ).

Лечение. Основной метод терапии — немедленное введение специфической антитоксической противодифтерийной лошадиной жидкой сыворотки. Иммуноглобулин человека противодифтерийный для в/в введения.

Ассоциированные вакцины: АКДС (абсорбированная коклюшно – столбнячная вакцина), АДС (абсорбированный дифтерийно — столбнячный анатоксин).

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

Род Corynebarteriurn (от лат. Сoryne- булава)– гр+ палочковидные бактерии, не образующие спор, не имеющие жгути­ков. Содержат зерна волютина, расположенные чаще всего на концах палочек, они часто превышают размеры попереч­ника бактерии и придают вид булавы. Также имеются включения липидов и крахмала, который откладывается при недостатке кислорода.

В состав клеточной стенки входят специфические только для бактерий рода Corynebacterium липиды: эфиры коринемиколовой и коринемиколиновой кислот, димикола, фосфатиды маннозы и инозита.

В организме человека обитают условно-патоген­ные: С.diphtheriae, С.pseudodiphtheriticiim (hofmanii), С.xerosis, С.ulcerans. С.diphtheriae вызывает у человека дифтерию, другие – возбудители вторичных инфекций.

КОРИНЕБАКТЕРИЙ ДИФТЕРИИ С.diphtheriae.

Морфология.Пря­мые или слегка изогнутые палочки. В препаратах располагаются под углом др к др в виде букв L, V или китайских иероглифов. Зерна волютина (на концах палочек) выявляются при окраске синькой Леффлера или по методу Нейссера. Факультативные анаэробы, хорошо размножаются при свободном доступе кислорода. К пит средам требовательны: не способны утилизировать азот из ам­монийных соединений, требу­ют наличия почти всех АК, солейMg, Zn, Cu, Fe; необходимы углеводыисп среды, полу­ченные на основе фермента­тивного расщепления белка (казеина, дрожжей) с добав­лением крови или сыворотки. На пов плотных сред с КТе дифтерийные палочки образуют ТЕМНО-СЕРЫЕ ИЛИ ЧЕРНЫЕ колонии (биовары гравис, способны расщеплять крахмал, или миттис). Рост на скошенном сывороточном агаре сравнивают с ШАГРЕНЕВОЙ КОЖЕЙ, колонии не сливаются.

Расщепляют глюк и др моно- и дисахариды с образованием КИСЛОТЫ БЕЗ ГАЗА, восстанавливают нитраты, расщепляют цистеин.

Лизируются спе­цифичны для отдельных видов вирулентными фагами, что позволяет устанавливать фаговары исследуемых культур.

АГ.Имеют белковую капсулу, которая содержит К-АГ. Опре­деление этого АГа позволяет установить серовар (их более 10). Группоспецифический ПС АГстенки дает перекрестные реакции с микобактериями, нокардиями.

Экология и распространение.Передается аэрозольным (воздушно-капель­ным) путем. В настоящее время часто регистрируется у ВЗРОС­ЛЫХ (тяж формы). Токсигенность связана ЛИЗОГЕНИЗАЦИЕЙ специфичес­ким профагом. Выделяясь в окр среду со слюной, пленками, дифтерийные палочки сохраняют жизнеспо­собность в течение нескольких дней. Хорошо переносят высушивание. Чувствительны к дез растворам, антибиоткам.

Патогенность и патогенез.Заболе­вание развивается у лиц, не имеющих антитоксического иммунитета. На месте внедрения (зев, гортань, трахея, реже – нос, ухо) развивается местный воспалительный процесс. Все па­тогенные виды обладают фимбриямиАДГЕЗИЯ к хозяина, они выявляют­ся в РА трипсинизированных бараньих эритроцитов.

ТОКСИГЕННОСТЬ – способность секретировать гистотоксин, что про­является в виде локальной воспалительной реакции и в общей интоксикации, особенно чувствительны к нему НАДПОЧЕЧНИКИ, МИОКАРД, НС. Токсин блокирует синтез белка, что приводит к гибели→ некроз и ле­тальный исход.

ФЕРМЕНТЫ (гиалуронидаза, нейраминидаза,фибринолизин) обеспечивают распространение в тканях, но бактериемия клинически не проявляется.

КОРД-ФАКТОР нарушает фосфорилирование и дыхание МК.

Иммунитет.Наиболее восприимчивы дети 1–4 лет. Вырабатывается не очень прочный антитоксичес­кий иммунитет, возможны повторные заболевания дифтерией. Невосприимчивость зависит главным образом от содержания в крови антитоксина и АТ (опсонины, преципитины, комплементсвязывающие). Уровень антитоксического иммунитета устанавливают, определяя в крови Ат вРНГА с эритроцитарным диагностикумом (эр-ты нагружены дифтерийным анатоксином). Титр 1:20 и вышеиммунность обследуемого. Т/же применяетсяреакция Шика(внутрикожно вводят дифтерийный токсин, у НЕИММУННЫХ людей – местная воспалительная реакция, при наличии антитоксина реакции нет).

Лаб диагностика.Исп бактериологический и бактериоскопический (ориентировочный) – в мазках обнаруживают палочки с ти­пичной морфологией. Посевы для выделения возбуди­теля делают на элективные среды, выделяют чистые культуры идентифицируют, принадлежность к роду устанавливают по мор­фологическим и культуральным признакам, вид С.diphtheriae определяют по БХ свойствам (способность продуци­роватьH₂Sна средах с цистеином и неспособности рас­щеплять мочевину). Биовары гравис и митис различают по фер­ментации крахмала и по морфологии колоний.

Профилактика и лечение.Основное значение имеет активная иммунизация, создание антиток­сического иммунитета. Иммунизируют детей начиная с 3-месячного возраста, по схеме вводят вакцину, содержащую как один из компонентов дифтерийный анатоксин (АКДС, АДС).

Лечение начинают сразу, вводят антитоксическую противодифтерийную сыворотку. СЕРОТЕРА­ПИЯ эффективна в ранний период болезни, пока токсин еще не фиксирован клетками и ткани существенно не повреж­дены. Кол-во антитоксической сыворотки зависит от тяжести инфекции, ее формы и прочих клинических дан­ных. Возможна антибактериальная терапия.

источник

Дифтерийная палочка – возбудители дифтерии.

Дифтерия – острое инфекционное заболевание, характеризующееся токсическим поражением сердечно-сосудистой и нервной систем, а также специфическим фибринозным (дифтеритическим) воспалением в месте входных ворот.

Возбудитель был открыт в 1883 г. Клебсом, в 1884 г. Ф. Леффлер выделил его в чистой культуре. В 1888 г. Ру и Йерсен получили дифтерийный токсин, а в 1895 г. Беринг и Ру независимо друг от друга получили противодифтерийную сыворотку. В 1923 г. Рамон разработали технологию получения дифтерийного анатоксина, а позднее получил противодифтерийную сыворотку. Н.Г. Габричевский применил противодифтерийную сыворотку с лечебной целью и организовал ее производство в России.

В род Corynebacterium входят около 60 видов. Согласно Международной классификации Берджи этот род разделен на 3 секции:

1) патогенные для человека и животных;

2) патогенные для растений;

Прямые или слегка изогнутые палочки размером 0,3 — 0,6 х 4 — 8 мкм, спор не образуют, имеют микрокапсулу, неподвижны.

Особенностями дифтерийной палочки является наличие булавовидных утолщениях на концах; палочки отличаются также полиморфизмом; характерно взаимного расположения бактерий в мазках – в виде цифр V,X, L (не полное расхождение при делении);

В толстых мазках располагаются в виде «пучка булавок». Булавовидные утолщения на концах связаны с наличием зерен волютина (тельца Бабеша-Эрнста) – производные нуклеиновых кислот, метахроматиновые гранулы полиметафосфата. Бактерии могут образовывать фильтрующиеся и L-формы.

Грамположительные микроорганизмы. При окраске по методу Нейссера тело клетки окрашивается в синий цвет, а зерна волютина — в желтый. Метод Леффлера окрашивает цитоплазму в голубой цвет, а зерна волютина – в темно-синий.

Культуральные свойства.

Возбудители дифтерии — факультативные анаэробы, отимальная температура их культивирования 37 о С, рН 7,3-8,0. Требовательны к питательной среде, для роста необходимо наличие цистина, гистидина, фенилаланина, метионина и т.д. Факторами роста являются Са 2+ , Mg 2+ , Fe 2+ , Zn 2+ , Mn 2+ , Cu 2+ . Для культивирования применяют сывороточные (среда Леффлера), среды с добавлением крови, хинозальную среду Бучина. Дифференциально-диагностические среды: теллуритовая среда (Конради, Трох, 1913г.), глицериновокровяная среда с теллуритом (среда Клауберг ΙΙ), сывороточно-теллуритовый агар с цистином (Тиндаль), теллурит-шоколадный агар Маклеода.

На среде Леффлера бактерии растут в виде серовато-кремовых колоний, по типу «шагреневой кожи».

На теллуритовых средах возбудитель образует серовато-черные колонии, что обусловлено восстановлением теллурита до металлического теллура, имеющего черный цвет и аккумулирующегося бактериями.

Биохимическая активность.

Дифтерийные палочки малоактивны, сбраживают с образованием кислоты глюкозу, мальтозу, галактозу, декстрин, не разлагают сахарозу, лактозу, маннит, восстанавливают нитраты в нитриты. Не гидролизуют мочевину (проба Закса отрицательная), не образуют индол. Разлагают цистеин (проба Пизу положительная).

По культуральным, биохимическим, патогенетическим и некоторым другим свойствам дифтерийные палочки разделяются на 3 биовара.

1) биовар митис, характеризуется свойствами:

• ферментирует глюкозу, крахмал, мальтозу, не сбраживает сахарозу, гликоген, декстрин;
• обладает цистиназной активностью;
• восстанавливает нитраты;
• уреазная проба отрицательная;
• на средах с теллуритом образует мелкие гладкие блестящие черные колонии с ровным краем;
• на жидкой среде дает равномерное помутнение и порошкообразный осадок;
• дает зоны гемолиза на кровяных средах;
• малотоксичен;
• возбудители вызывают легкую спорадическую заболеваемость.

2) биовар гравис, характеризуется свойствами:

• ферментирует глюкозу, крахмал,декстрин, мальтозу,
• обладает цистиназной активностью;
• восстанавливает нитраты;
• уреазная проба отрицательная;
• на средах с теллуритом формирует крупные, сухие, матовые, плоские, серо-черные колонии, приподнятые в центре, с радиальной исчерченностью и неровным краем (напоминают маргаритку);
• на жидкой среде образуется пленка, помутнение, крошковидный или крупнозернистый осадок;
• дает гемолиз на кровяных средах;

· обладает выраженными токсигенными свойствами;

· выделяется от больных с тяжелой формой дифтерии, вызывает групповые вспышки.

3) биовар интермедиус, характеризуется свойствами:

· на средах с теллуритом образует мелкие сухие матовые серо-черные колонии с прозрачной периферией и неровным краем;

· на жидкой среде дает помутнение с последующим просветлением и образованием мелкозернистого осадка;

· гемолиз на кровяных средах отсутствует.

Антигенная структура.

Дифтерийная палочка имеет 2 антигена

1. О – антиген (групповой), полисахарид клеточной стенки, термостабильный, дает перекрестные реакции с микобактериями и нокардиями;

2. К – антиген (типовой), капсульный, термолабильный, иммуногенный, видоспецифичный.

На практике серотипирование не применяется, однако выпускаются диагностические сыворотки для РА, РПГА.

Для идентификации используют фаготипирование (22 фага) и бактериоцинотипирование (25 бактериоцинов).

Факторы патогенности.

Токсины. Палочка выделяет токсин – дифтерийный экзотоксин. По силе он занимает 3-е место после ботулинического и столбнячного. Термолабильный, высокотоксичный, иммуногенный, протективный, обладает анестезирующим действием. Гистотоксин обладает дермонекротическими, гемолитическими свойствами. Синтезируется в виде неактивного предшественника — единой полипептидной цепи с молекулярной массой 61 кД. Активируется под действием собственной протеазы, которая разрезает полипептид на 2 связанные между собой дисульфидными связями пептида: А (21 кД) и В (39 кД). Пептид В выполняет акцепторную функцию – распознает рецептор, связывается с ним, формирует внутримембранный канал, через который проникает в клетку пептид А. Пептид А – это фермент, который обеспечивает перенос аденозиндифосфатрибозы из НАД на один из аминокислотных остатков (гистидина) белкового фактора элонгации EF-2. В результате модификации EF-2 утрачивает свою активность, что приводит к подавлению синтеза белка рибосомами на стадии транслокации. Токсин синтезируют только С. diphtheriae, лизогенные умеренным конвертирующим tox-профагом, интегрирующимся с помощью сайт-специфической рекомбинации. Оперон, кодирующий синтез токсина имеет промотор tox Р и 3 участка: tox S, tox А, tox В. Тox S – обеспечивает выход токсина через мембрану в периплазматическое пространство бактериальной клетки. Утрата клеткой профага или мутации в tox-опероне делают клетку малотоксичной.

Ферменты патогенности: гиалуронидаза, нейраминидаза, фибринолизин, каталаза – факторы инвазии, лейкоцидин – обеспечивает устойчивость к фагоцитозу;

Структурные и химические компоненты клетки – пили (способствуют адгезии на чувствительных клетках), микрокапсула (обеспечивает устойчивость к фагоцитозу), корд-фактор (6-6-дифосфоэфир трегалозы, коринемиколовая и коринемиколиновая кислоты, обладающие нарушает фосфорилирование в митохондриях), бактериоцины (корицины) кодирование синтеза которых передается плазмидами.

Резистентность.

При нагревании до 60 о С палочки погибают за 10 мин, при 100 о С наступает мгновенная гибель. 5% раствор карболовой кислоты обеспечивает инактивацию через – 1 мин. Под действием прямого солнечного света палочка выживает несколько часов, в высохших пленках и кале – 3-4 мес., на предметах обихода и одежде сохраняется до 15 дней, на мягких игрушках – 3 мес., в воде и молоке – до 20 дней, в пыли – до 5 мес. Дифтерийные палочки чувствительны к пенициллину, тетрациклину, эритромицину.

Эпидемиология.

Источник инфекции – больной человек, носитель или реконвалесцент.

Механизмы передачи инфекции:

– аэрогенный (пути — воздушно-капельный и воздушно-пылевой);

– контактный (путь — непрямой контактный).

Больной опасен (в смысле заражения) с последних дней инкубационного периода.

Входные ворота – слизистые оболочки носа, зева, гортани, трахеи, бронхов, конъюнктивы глаз, наружных половых органов; раневая поверхность, пупочная рана.

Инкубационный период – 2-14-20 дней.

Возбудители адсорбируются на чувствительных клетках, колонизируют эпителий. Секретируют гистотоксин, который инициирует развитие местного фибринозного воспаления, некроз эпителия, паретическое расширение сосудов с нарушением их проницаемости, отек тканей и выход фибриногена из сосудов. Фибриноген под влиянием тканевого тромбопластина, некротизированных тканей и атмосферным кислородом свертывается. На поверхности образуется фибринозная пленка. На многослойном плоском эпителии — плотная, спаянная с прилежащими тканями; на однослойном – тонкая, легко снимается. Разрастание пленок в воздухоносных путях может привести к асфиксии (истинный круп). Процесс сопровождают регионарные лимфадениты. Системное действие токсина приводит к гемодинамическим нарушениям. Развивается токсический миокардит и ранний паралич сердца. Возможно поражение канальцевого аппарата почек, некроз коркового слоя. В нервной системе – цитолиз нервных клеток с развитием поздних параличей мягкого неба, диафрагмы, сердца, блуждающего нерва. Смерть при дифтерии может наступить от раннего или позднего паралича сердца и диафрагмы, а также в результате истинного крупа (закупорки дыхательных путей оторвавшимися пленками).

У детей грудного возраста чаще развивается дифтерия зева (насмокр, слабая выраженность общих проявлений). Необходимо осматривать пупочную ранку для исключения местного процесса.

После перенесенного заболевания развивается стойкий напряженный антитоксический и мало выраженный антимикробный иммунитет. Возможно развитие носительства (10%) и повторное заражение (6-8%). Уровень иммунитета можно установить в РПГА. Диагностические – титры — 1:200 и выше. С той же целью применяется реакция Шика – внутрикожное введение микродоз дифтерийного токсина (1/40 Dlm 0,2 мл) внутрикожно. Через 48 ч появляется покраснение и инфильтрат, что свидетельствует об отсутствии антитоксических антител; при их наличии реакция не возникает. Из-за опасности сенсибилизации организма эту пробу проводят редко.

Микробиологическая диагностика.

Исследуемый материал – слизь из зева, носа, пленки с миндалин, раневое отделяемое, кровь

1. Бактериоскопический метод – микроскопия мазков из исследуемого материала (окраска по Граму, Нейссеру, Леффлеру).

2. Бактериологический метод – выделение чистой культуры возбудителя и ее идентификация. Необходимо не только выделить из исследуемого материала дифтерийную палочку, но и определить ее токсигенность.

Определение токсигенности С. dphtheriae:

а) биологическая проба на животных – внутрикожное заражение морских свинок фильтратом культуры дифтерийных бактерий – вызывает некроз в месте введения. Минимальная смертельная доза (20-30 нг) убивает морскую свинку на 4-5 день;

б) заражение куриных эмбрионов (наблюдается гибель под действием токсина);

в) внесение в культуру клеток ( выявление ЦПД);

г) метод твердофазного ИФА с меченными пероксидазой антителами;

д) использование ДНК-зонда для обнаружения tox-оперона в геноме;

е) тест Илека и Оухтерлони (1948 г.) – основу составляет способность токсина и антитоксина диффундировать в агар и образовывать преципитаты (усы, стрелы) по ходу диффузии – метод двойной преципитации в геле, предварительный ответ может быть выдан через 48 часов, через 72 часа – заключение о наличии токсигенных коринебактерий, через 96 часов – окончательный ответ.

3. Серодиагностика – РПГА, ИФА, РИА, реакция ко-агглютинации, реакция Шика.

4. Экспресс – диагностика – РИФ, ИФА, РПГА, реакция ко-агглютинации.

5. Биохимический и молекулярно-биологический метод – ПЦР (обнаружение tox-гена).

источник

Возбудители капельных инфекций.

Микробиология дифтерии.

Дифтерия — острое инфекционное заболевание преимущественно детского возраста, которое проявляется глубокой интоксикацией организма дифтерийным токсином и характерным фибринозным воспалением в месте локализации возбудителя. Название болезни происходит от греческого слова diphthera — кожа, пленка, так как в месте размножения возбудителя образуется плотная, серовато-белого цвета пленка.

Возбудитель дифтерии — Corynebacterium diphtheriae — был обнаружен впервые в 1883г. Э. Клебсом в срезах из пленки, получен в чистой культуре в 1884г. Ф. Леффлером. В 1888г. Э. Ру и А. Иерсен обнаружили его способность продуцировать экзотоксин, играющий главную роль в этиологии и патогенезе дифтерии. Получение в 1892г. антитоксической сыворотки Э. Берингом и использование ее с 1894г. для лечения дифтерии позволило значительно снизить летальность. Успешное наступление на эту болезнь началось после 1923г. в связи с разработкой Г. Районом метода получения дифтерийного анатоксина.

Возбудитель дифтерии относится к широко распространенной в природе группе так называемых коринеформных бактерий, к роду Corynebacterium. В морфологическом отношении эти бактерии характеризуются тем, что клетки булавовидно утолщены на концах (от греч. согуnе — булава), образуют ветвление, особенно в старых культурах, и имеют зернистые включения.

Род Corynebacterium включает в себя большое количество видов, которые делят на 3 группы:

1. Коринебактерии — паразиты человека и животных и патогенные для них.

2. Коринебактерии, патогенные для растений.

3. Непатогенные коринебактерии. Многие виды коринебактерий являются нормальными обитателя­ми кожи, слизистых зева, носоглотки, глаз, дыхательных путей, уретры и половых органов.

С.diphtheriae — прямые или слегка изогнутые неподвижные палочки длиной 1,0-8,0мкм и диаметром 0,3-0,8мкм, спор и капсул не образуют. Очень часто они имеют вздутия на одном или обоих концах, часто содержат метахроматические гранулы — зерна волютина (полиметафосфаты), которые при окрашивании метиленовым синим приобретают голубовато-пурпурный цвет. Для их обнаружения предложен особый метод окрашивания по Нейссеру. При этом палочки окрашиваются в соломенно-желтый, а зерна волютина — в темно-коричневый цвет, и располагаются обычно по полюсам. C.diphtheriae хорошо окрашивается анилиновыми красите­лями, грамположительна, но в старых культурах нередко обесцвечивается и имеет отрицательную окраску по Граму. Для нее характерен выраженный полиморфизм, особенно в старых культурах и под влиянием антибиотиков.

Дифтерийная палочка является аэробом или факультативным анаэробом, температурный оптимум для роста 35-37 °С (границы роста 15-40 °С), оптимальная рН 7,6-7,8. К питательным средам не очень требовательна, но лучше растет на средах, содержащих сыворотку или кровь. Избирательными для дифтерийных бактерий являются свернутые сывороточные среды Ру или Леффлера, рост на них появляется через 8-12 ч в виде выпуклых, величиной с булавочную головку колоний серовато-бело­го или желтовато-кремового цвета. Поверхность их гладкая или слегка зернистая, на периферии колонии несколько более прозрачные, чем в центре. Колонии не сливаются, вследствие чего культу­ра приобретает вид шагреневой кожи. На бульоне рост проявляется в виде равномерного помутне­ния, либо бульон остается прозрачным, а на его поверхности образуется нежная пленка, которая постепенно утолщается, крошится и хлопьями оседает на дно.

Особенностью дифтерийных бактерий является их хороший рост на кровяных и сывороточных средах, содержащих такие концентрации теллурита калия, которые подавляют рост других видов бакте­рий. Это связано с тем, что C.diphtheriae восстанавливают теллурит калия до металлического теллура, который, откладываясь в микробных клетках, придает колониям характерный темно-серый или черный цвет. Применение таких сред повышает процент высеваемости дифтерийных бактерий.

C.diphtheriae разлагают глюкозу, мальтозу, галактозу с образованием кислоты без газа, но не ферментируют (как правило) сахарозу, имеют цистиназу, не имеют уреазы и не образуют индола. По этим признакам они отличаются от тех коринебактерий, которые часто встречаются на слизистой оболочке глаза (C.xerosis), носоглотки (C.pseudodiphtheriticum).Деление дифтерийных бактерий на биотипы было произведено с учетом того, при каких формах течения дифтерии у больных они выделяются с наибольшей частотой. Тип gravis чаще выделяется от больных с тяжелой формой дифтерии и вызывает групповые вспышки. Тип mitis вызывает более легкие и спорадические случаи заболеваний, а тип intermedius занимает промежуточное положение между ними. Некоторые штаммы имеют настолько смешанные характеристики, что их трудно отнес­ти к какому-то определенному типу. Существенно, однако, что токсигенные штаммы всех трех биотипов продуцируют идентичный токсин, большинство нетоксигенных или слаботоксигенных штам­мов соответствует типу mitis.

Антигенная структуракоринебактерий очень гетерогенна и мозаична. У возбудителей дифтерии всех трех типов обнаружено несколько десятков соматических антигенов, по которым их делят на серотипы. В России принята серологическая классификация, по которой различают 11 серотипов дифтерийных бактерий, из них 7основных (1-7) и 4 дополнительных, редко встречающихся сероти­пов (8-11). Шесть серотипов (1, 2, 3, 4, 5, 7) относятся к типу gravis, а пять (6, 8, 9, 10, 11) -— к типу mitis. Недостатком метода серотипирования является то, что многие штаммы, особенно нетоксигенные. обладают спонтанной агглютинацией или полиагглютинабельностью.

ФаготипированиеC.diphtheriae. Для дифференциации дифтерийных бактерий предложены раз­личные схемы фаготипирования. По схеме М. Д. Крыловой с помощью набора из 9 фагов (А, В, С, D, F, G, Н, I, К) удается типировать большинство токсигенных и нетоксигенных штаммов типа gravis. С учетом чувствительности к указанным фагам, а также культуральных, антигенных свойств и способности синтезировать корицины (бактерицидные белки) М. Д. Крылова выделила 3 самостоя­тельные группы коринебактерий типа gravis (I-III). В каждой из них имеются подгруппы токсигенных и их нетоксигенных аналогов возбудителей дифтерии.

Резистентность возбудителей дифтерии.C.diphtheriae проявляет большую устойчивость к низ­ким температурам, но быстро погибает при высокой температуре: при 60 °С — в течение 15-20 мин, при кипячении — через 2-3 мин. Все дезинфицирующие вещества (лизол, фенол, хлорамин и другие) в обычно применяемой концентрации уничтожают ее за 5-10 мин. Однако возбудитель дифтерии хорошо переносит высушивание и может долго сохранять жизнеспособность в высохшей слизи, слюне, в частичках пыли. В мелкодисперсном аэрозоле дифтерийные бактерии сохраняют жизнеспособность в течение 24-48 ч.

В связи с тем, что дифтерийный токсин в организме больных оказывает избирательное и специфическое воздействие на определенные системы(поражаются в основном симпатико-адреналовая система, сердце, сосуды и периферические нервы), то очевидно, он не только угнетает биосинтез белка в клетках, но и вызывает другие нарушения их метаболизма.

Для обнаружения токсигенности дифтерийных бактерий можно использовать следующие способы:

1. Биологические пробы на животных. Внутрикожное заражение морских свинок фильтратом бульонной культуры дифтерийных бактерий вызывает у них некроз в месте введения. Одна минимальная смертельная доза токсина (20-30 нг.) убивает морскую свинку весом 250 г. при подкожном введении на 4-5 день. Наиболее характерным проявлением действия токсина является поражение надпочечников – они увеличены и резко гиперемированы.

2. Заражение куриных эмбрионов – дифтерийный токсин вызывает их гибель.

3. Заражение культур клеток – дифтерийный токсин вызывает отчетливый цитопатический эффект.

4. Метод твердофазного иммуноферментного анализа с использованием меченных пероксидазой антитоксинов.

5. Использование ДНК-зонда для непосредственного обнаружения tox-оперона в хромосоме дифтерийных бактерий.

Однако наиболее простым и распространенным способом определения токсигенности дифтерийных бактерий является серологический – метод преципитации в геле. Суть его состоит в следующем. Полоску стерильной фильтрованной бумаги размером 1,5*8см смачивают антитоксической противодифтерийной сывороткой, содержащей 500АЕ в 1 мл, и наносят на поверхность питательной среды в чашке Петри. Чашку подсушивают в термостате 15-20 мин. Испытуемые культуры засевают бляшками по обе стороны от бумажки. На одну чашку засевают несколько штаммов, один из которых, заведомо токсигенный, служит контролем. Чашки с посевами инкубируют при 37 С, результаты учитывают через 24-48 ч. Вследствие встречной диффузии в геле антитоксина и токсина в месте их контрольного токсигенного штампа. Полоски неспецифической преципитации (они образуются, если в сыворотке кроме антитоксина присутствуют в небольшом количестве другие антимикробные антитела) проявляются поздно, выражены слабо и никогда не сливаются с полоской преципитации контрольного штампа.

Эпидемиология. Единственным источником заражения является человек – больной, выздоравливающий или здоровый бактерионоситель. Заражение происходит воздушно-капельным, воздушно-пылевым путём, а также через различные предметы, бывшие в употреблении у больных или здоровых бактерионосителей: посуда, книги, бельё, игрушки и т.п. В случае инфицирования пищевых продуктов (молоко, кремы и т.п.) возможно заражение алиментарным путем. Наиболее массивное выделение возбудителя имеет место при острой форме заболевания. Однако наибольшее эпидемиологическое значение имеют лица со стертыми, нетипичными формами заболевания, так как они часто не госпитализируются и выявляются далеко не сразу. Больной дифтерий заразен в течение всего периода болезни и части периода выздоровления. Средний срок бактерионосительства у выздоравливающих варьирует от 2 до 7 нед, но может продолжаться и до 3 мес.

Особую роль в эпидемиологии дифтерии играют здоровые бактерионосители. В условиях спорадической заболеваемости именно они являются основными распространителями дифтерии, способствуют и сохранению возбудителя в природе. Средняя продолжительность носительства токсигенных штаммов несколько меньше (около 2 мес.), чем нетоксигенных (около 2-3 мес.).

Причина формирования здорового носительства токсигенных и нетоксигенных дифтерийных бактерий раскрыта не до конца, так как даже высокий уровень антитоксического иммунитета не всегда обеспечивает полное освобождение организма от возбудителя. Возможно, определенное значение имеет уровень антибактериального иммунитета. Первостепенное эпидемиологическое значение имеет носительство токсигенных штаммов дифтерийных бактерий.

Особенности патогенеза и клиники.К дифтерии восприимчивы люди любого возраста. Возбудитель может проникнуть в организм человека через слизистые оболочки различных органов или через поврежденную кожу. В зависимости от локализации процесса различают дифтерию зева, носа, гортани, уха, глаза, половых органов и кожи. Возможны смешанные формы, например, дифтерия зева и кожи и т. п. Инкубационный период — 2-10 дней. При клинически выраженной форме дифтерии месте локализации возбудителя развивается характерное фибринозное воспаление слизистой оболочки. Токсин, вырабатываемый возбудителем, сначала поражает эпителиальные клетки, а затем — близлежащие кровеносные сосуды, повышая их проницаемость. В выходящем экссудате содержите фибриноген, свертывание которого приводит к образованию на поверхности слизистой оболочки серовато-белого цвета пленчатых налетов, которые плотно спаяны с подлежащей тканью и при отрыве от нее вызывают кровотечение. Следствием поражения кровеносных сосудов может быть развитие местного отека. Особенно опасной является дифтерия зева, так как она может стать причиной дифтерийного крупа вследствие отека слизистой оболочки гортани и голосовых связок, от которого раньше погибало в результате асфиксии 50-60% больных дифтерией детей. Дифтерийный токсин, поступая в кровь, вызывает общую глубокую интоксикацию. Он поражает преимущественно сердечно-сосудистую, симпатико-адреналовую системы и периферические нервы. Таким образом, клиника дифтерии складывается из сочетания местных симптомов, зависящих от локализации входных ворот, и общих симптомов, обусловленных отравлением токсином и проявляющихся в виде адинамии, вялости, бледности кожных покровов, понижения кровяного давления, миокардита, паралича периферических нервов и других нарушений. Дифтерия у привитых детей, если и наблюдаетеся, то протекает, как правило, в легкой форме и без осложнений. Летальность в период до применения серотерапии и антибиотиков составляла 50-60%, ныне — 3-6%.

Постинфекционный иммунитетпрочный, стойкий, фактически пожизненный, повторные случаи заболевания наблюдаются редко — у 5-7% переболевших. Иммунитет носит главным образом антитоксический характер, меньшее значение имеют антимикробные антитела.

Лабораторная диагностика.Единственным методом микробиологической диагностики дифтерии является бактериологический, с обязательной проверкой выделенной культуры коринебактерий на токсигенность. Бактериологические исследования на дифтерию проводят в трех случаях:

1) для диагностики дифтерии у детей и взрослых с острыми воспалительными процессами в области зева, носа, носоглотки;

2) по эпидемическим показаниям лиц, находившихся в контакте с источником возбудителя дифтерии;

3) лиц, вновь поступающих в детские дома, ясли, школы-интернаты, другие специальные учреждения для детей и взрослых, с целью выявления среди них возможных бактерионосителей дифтерийной палочки.

Материалом для исследования служат слизь из зева и носа, пленка с миндалин или других слизистых оболочек, являющихся местом входных ворот возбудителя. Посевы производят на теллуриновые сывороточные или кровяные среды и одновременно на свернутые сывороточные среды Ру (свернутая лошадиная сыворотка) или Леффлера (3 части бычьей сыворотки + 1 часть сахарного бульона), на которых рост коринебактерий появляется уже через 8-12 ч. Выделенную культуру идентифицируют по совокупности морфологических, культуральных и биохимических свойств, по возможности используют методы серо- и фаготипирования. Во всех случаях обязательна проверка на токсигенность одним из указанных выше методов. Морфологические особенности коринебактерий лучше изучать, используя три метода окрашивания препарата-мазка: по Граму, Нейссеру и метиленовым синим (или толуидиновым синим).

Лечение.Специфическим средством лечения дифтерии является применение противодифтерийной антитоксической сыворотки, содержащей не менее 2000 ME в 1 мл. Сыворотку вводят внутримышечную в дозах от 10 000 до 400 000 ME в зависимости от тяжести течения болезни. Эффективным методом лечения является применение антибиотиков (пенициллины, тетрациклины, эритромицин и р.) и сульфаниламидных препаратов. С целью стимулирования выработки собственных антитоксинов мжно использовать анатоксин. Для освобождения от бактерионосительства следует использовать те антибиотики, к которым данный штамм коринебактерий высокочувствителен.

Специфическая профилактика.Основным методом борьбы с дифтерией является массовая плановая вакцинация населения. Для этой цели используются различные варианты вакцин, содержа­щих дифтерийный анатоксин: АКДС, АДС, АДС-М, АД и АД-М. АКДС — адсорбированная (на гидроокиси алюминия) взвесь коклюшных бактерий, убитых формалином или мертиолятом (20 млрд. в мл), 30 флоккулирующих единиц дифтерийного и 10 единиц связывания столбнячного анатоксина 1 мл. Этой вакциной прививают детей с 3-месячного возраста. Курс вакцинации состоит из трех внутримышечных инъекций по 0,5 мл с интервалом в 1,5мес. Первую ревакцинацию АКДС-вакциной проводят через 1,5-2 года после законченной вакцинации однократно в дозе 0,5 мл. Последующие ревакцинации проводят вакциной АДС-М однократно в дозе 0,5 мл в 9 и в 16 лет, а затем через каждые 10 лет — в возрасте 26, 36, 46, 56 лет.

Вакцина АДС-М содержит уменьшенное количество антигенов — 10 флоккулирующих единиц дифтерийногои 10 единиц столбнячного анатоксинов в 1 мл, адсорбированных на гидроокиси алюминия.

Вакцина АДС содержит только дифтерийный и столбнячный анатоксины (60 и 20 единиц соответственно в 1 мл) и применяется для прививок детей, переболевших коклюшем, а также возрасте старше 3 лет.

Вакцина АД — очищенный, концентрированный и адсорбированный на гидроокиси алюминия дифтерийный анатоксин (в 1 мл — 60 флоккулирующих единиц). АД применяют по эпидемическим показаниям к детям, переболевшим дифтерией, с положительной реакцией Шика или с низким титром антитоксических антител, выявленных в РПГА.

АД-М — содержит уменьшенное количество дифтерийного анатоксина (в 1 мл — 10 единиц). применяется по эпидемическим и иным показаниям лицам старше 12 лет. Максимальный эффект вакцинация дает, когда прививками охвачены не менее 95% детей.

источник