Серологическая диагностика бруцеллеза животных

Бруцеллы (род Brucella) – возбудители бруцеллеза человека и животных. В. melitensis, В. abortus и В. suis – вызывают заболевание у человека; B. ovis, B. canis, B. neotomae заболевания человека не вызывают.

Морфология, физиология. Мелкие Гр– коккобактерии размером 0,5-0,7х0,6-1,5 мкм. Также могут быть палочковидной формы; в мазках обычно расположены беспорядочно. Жгутиков не имеют. Спор не образуют. Свежевыделенные штаммы могут образовывать нежную капсулу при культивировании на средах, содержащих 10% иммунной сыворотки барана или лошади, а также при выращивании на куриных эмбрионах.

Требовательны к питательным средам. Для выращивания обычно применяют триптозный, триптозо-казеиново-соевый и кровяной (5% овечьей крови) агары; оптимальная среда для культивирования — печёночный агар Хеддльсона. Выделяемые из организма больных они размножаются очень медленно, рост может быть обнаружен только через 1–3 недели после посева исходного материала. Многократное пересевание в лабораторных условиях делает культуры способными расти в течение 1–2 дней. На плотных питательных средах образуют мелкие, выпуклые, бесцветные с перламутровым блеском колонии S-формы (жемчужины), легко переходят в мукоидную и шероховатую. В жидких средах возникает равномерное помутнение. Под влиянием антибиотиков образуют L-формы.

Бруцеллы строгие аэробы, а В. abortus в первых поколениях требует увеличенной концентрации (5–10%) СО₂.

БХ: расщепляют глюкозу и некоторые другие углеводы, разлагать мочевину и аспарагин, гидролизовать белок, пептоны, аминокислоты, выделять каталазу, гиалуронидазу, пероксидазу, липазу, фосфатазу и другие ферменты. Внутри видов бруцелл различают биовары. Их дифференциация основана как на биохимических различиях, так и на способности расти на средах с фуксином и тионином, лизабельности фагом Т6, агглютинабельности моноспецифическими сыворотками.

АГ. Содержат поверхностно расположенный Vi-АГ и соматические видоспецифические АГ А и М, количественное соотношение которых различно у разных видов. У В.melitensis преобладают М-АГы. у В. abortus и В. suis – А-АГ. Для идентификации бруцелл по антигенным свойствам используют реакцию адсорбции агглютининов или монорецепторные сыворотки.

Экология и распространение. Зоонозная инфекция. Возбудители разных видов циркулируют среди животных, от которых заражаются и люди. В.melitensis вызывает заболевания мелкого рогатого скота, В. abortus – КРС, В.suis – свиней. Непатогенные для человека

Бруцеллы устойчивы к действию факторов окружающей среды. Они длительно сохраняют жизнеспособность при низкой температуре. В почве, моче, испражнениях животных, больных бруцеллезом, в навозе, сенной трухе возбудители выживают 4–5 мес., в шерсти– 3– 4 мес., в пыли – 1 мес., в замороженном мясе – до 5 мес. К высокой температуре и дезинфицирующим веществам бруцеллы высокочувствительны: при 60°С погибают за 30 мин, при кипячении – мгновенно. Все дезинфектанты губят бруцелл в течение нескольких минут.

Патогенность и патогенез. Проникновение – алиментарным, контактным и воздушно-капельным путями. Алиментарный путь заражения связан с употреблением в пищу продуктов животноводства (масла, молока, мяса), полученных от больных животных. Контактным путем заражаются чаще ветеринары, зоотехники, работники мясокомбинатов при уходе за больными животными, обработке сырья. Заражение возможно при работе с инфицированной шерстью, ветошью, когда имеет место распыление, попадание бруцелл в воздух. Для человека наиболее патогенными являются В.melitensis – возбудитель болезни мелкого рогатого скота (овец, коз).

Выраженные инвазивные и агрессивные свойства бруцелл обусловливают способность возбудителя проникать в организм через неповрежденные слизистые оболочки. После проникновения в организм распространяются лимфогенным путем, попадают в кровь, а из крови – в селезенку, костный мозг, лимфоузлы, где, локализуясь внутриклеточно, могут длительно сохраняться.

Болезнетворность бруцелл определяется действием эндотоксина. Выделяющиеся ферменты (гиалуронидаза и др.) способствуют распространению микробов в тканях. В патогенезе бруцеллеза имеет значение способность возбудителя размножаться в клетках лимфоидно-макрофагальной системы.

С первых дней болезни возникает реакций ГЗТ, которая сохраняется в течение всей болезни и длительное время после выздоровления.

Иммунитет. В основе иммунитета при бруцеллезе лежит активность системы Т-лимфоцитов. Важную роль играет фагоцитоз и состояние аллергии. Обезвреживание бруцелл происходит при участии антител – опсонинов, агглютининов.

Лабораторная диагностика. Проводится бактериологическим и серологическим методами. Материалом для бактериологического исследования служат кровь, испражнения и моча больных, иногда – спинномозговая жидкость. Выделением возбудителя занимается специальная режимная лаборатория.

Образцы инкубируют в МПБ или бульоне Мартена (можно использовать соевый бульон) при 37°С. При проведении исследования засевают 2 порции среды и в одной создают повышенную концентрацию СО. Через 4-5 сут наблюдают рост бруцелл, нередко в виде мелких колоний, вкрапленных в тяжи фибрина; среда остаётся слегка мутной или прозрачной. После пересева на твёрдые среды отмечают характерный рост колоний, из которых отвивают чистые культуры с последующими идентификацией биохимических свойств, определением способности расти на средах с добавлением некоторых анилиновых красителей (бактериостатический метод Хеддльсона) и определением биотипа реакциями агглютинации.

Серологические исследования. Реакция агглютинации (реакция Райта) — один из основных методов диагностики бруцеллёза. Динамика реакции может быть различной, для неё характерно колебание титров в течение суток; положительная реакция с первого дня заболевания; наиболее высокие титры отмечают через 1-2 мес. Для получения адекватных результатов необходимо использовать негемолизированную сыворотку и Аг, приготовленный из S-форм бруцелл (применять Аг диссоциированных форм нельзя); в эндемичных очагах, вызванных Brucella melitensis, рекомендуют применять гомологичный Аг. Следует помнить, что для реакции Райта характерны проагглютинационные зоны, или прозоны (отсутствие агглютинации в первых разведениях и чёткое её проявление в более высоких разведениях сыворотки). Часто применяют микрометод реакции агглютинации на стекле (реакция Хеддльсона). В острой фазе заболевания диагностическую ценность имеет иммуноферментный метод, выявляющий IgM в сыворотке больного. Выявление неполных AT (реакция Кумбса) с применением антиглобулиновой сыворотки. Для диагностики, особенно при отрицательных результатах бактериологических и серологических исследований, используют аллергические кожные пробы (проба Бюрне), обычно положительные у 70-85% пациентов к концу 1 мес заболевания. В качестве Аг применяют бруцеллин (мелитин, абортин) — протеиновый экстракт культуры бруцелл. Пробу также применяют для проведения эпидемиологических обследований; бывает положительной после вакцинации.

Для выявления возбудителя в молоке широко применяется кольцевая проба Банга.

Профилактика и лечение. Общие и специфические мероприятия ветеринарной службы. Выявляют и ликвидируют бруцеллез среди сельскохозяйственных животных, обезвреживают продукты и сырье животного происхождения. Людей, подвергающихся опасности заражения, вакцинируют живой бруцеллезной вакциной. Лечение бруцеллёза затруднено внутриклеточным паразитизмом бруцелл, что защищает их от действия антимикробных препаратов и AT. Препаратами выбора считают тетрациклин и стрептомицин. В тяжёлых и упорных случаях можно назначить рифампин (рифамицин). Смертность без лечения может достигать 5-10%.

источник

4.1. Серологическая диагностика бруцеллеза заключается в обнаружении специфических

антител в сыворотке крови животных с помощью реакции агглютинации в пробирках (РА), реакции

связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента на холоде (РДСК),

пластинчатой реакции агглютинации с роз бенгал антигеном (роз бенгал проба — РБП) и в молоке

коров — кольцевой реакции (КР).

4.2. Постановка и учет результатов реакции агглютинации в пробирках (РА).

4.2.1. Реакцию агглютинации в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при

диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота, овец, коз, лошадей, буйволов, верблюдов, оленей,

собак, пушных зверей и животных других видов.

4.2.2. Компоненты реакции агглютинации:

испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);

позитивная бруцеллезная сыворотка, изготовленная биопредприятием или полученная от

больного бруцеллезом животного. На этикетке флакона с такими сыворотками указывают титры в РА

и РСК и дату изготовления;

негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных), изготовленная биопредприятием

или полученная в лаборатории;

антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК (см. Приложение N 2, п. 6);

раствор хлорида натрия. При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, лошадей,

верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок для разведения испытуемых сывороток и

антигена используют фенолизированный (0,5-процентный) физиологический раствор хлорида

натрия (0,85-процентный), при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов — 5-процентный

и оленей — 10-процентный фенолизированный раствор хлорида натрия (см. Приложение N 2, п. 1).

4.2.3. Постановка реакции агглютинации.

Реакцию агглютинации проводят в объеме 1 мл в четырех разведениях:

при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов, оленей и собак — 1:25, 1:50, 1:100 и

крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов — 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

пушных зверей и морских свинок — 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

При массовых исследованиях допускается постановка реакции в первых двух разведениях.

Разлив компонентов реакции проводят индивидуальными мерными пипетками или

групповыми дозаторами Флоринского.

Для исследования каждой испытуемой сыворотки крови требуется 5 пробирок. В пробирках

первого ряда делают основное разведение. Для этого сыворотку крови крупного рогатого скота,

лошадей и верблюдов берут в дозе 0,1 мл, вносят в пробирки и добавляют к ней 2,4 мл

соответствующего раствора хлорида натрия, получают разведение сыворотки 1:25. Сыворотку крови

овец, коз, буйволов, оленей и собак берут в дозе 0,2 мл и добавляют 2,3 мл соответствующего

раствора хлорида натрия (разведение 1:12,5), а сыворотку крови пушных зверей и морских свинок

берут в дозе 0,3 мл и добавляют 1,2 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:5).

Таким образом делают основное разведение испытуемых сывороток в пробирках первого ряда

штатива (по 10 проб в ряду).

После приготовления основного разведения сывороток в первом ряду в пробирки третьего,

четвертого и пятого рядов вливают по 0,5 мл соответствующего раствора хлорида натрия. Затем из

пробирок первого ряда при помощи группового дозатора Флоринского переносят в пробирки второго

и третьего рядов по 0,5 мл основного разведения сывороток (1:25, 1:12,5 или 1:5). В пробирках

третьего ряда сыворотки смешивают с раствором хлорида натрия, по 0,5 мл этого разбавления

переносят в пробирки четвертого ряда и так же из пробирок четвертого ряда — в пятый. Из пробирок

пятого ряда по 0,5 мл жидкости удаляют. Таким образом делают последовательные двукратные

разведения одновременно 10 сывороток.

После этого в каждую пробирку второго, третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными

сыворотками вносят при помощи группового дозатора Флоринского или другого дозирующего

устройства по 0,5 мл антигена, предварительно разбавленного в соотношении 1:10 соответствующим

раствором хлорида натрия. После добавления антигена разведение сывороток в каждой пробирке

удваивается и в зависимости от вида исследуемых животных будет составлять соотношения: 1:50,

1:100, 1:200 и 1:400; 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200 или 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

В пробирки первого ряда бруцеллезный антиген не вносят, и они служат контролем качества

сыворотки. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты

реакции агглютинации не учитывают.

При массовых исследованиях сыворотки разливают индивидуальной микропипеткой (с грушей)

или групповыми дозаторами Флоринского в две пробирки в дозах 0,02 и 0,01 мл (сыворотки

крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов) или 0,04 и 0,02 мл (при исследовании сывороток

овец, коз, буйволов, оленей и собак). Затем в каждую пробирку добавляют по 1,0 мл антигена,

разведенного соответствующим раствором хлорида натрия в соотношении 1:20. При этом разведения

сывороток будут соответствовать соотношениям 1:50 и 1:100 или 1:25 и 1:50.

При постановке реакции агглютинации одновременно с испытуемыми сыворотками ставят

с негативной сывороткой в тех же разведениях, как с испытуемыми;

с позитивной бруцеллезной сывороткой в разведениях до ее предельного титра.

После добавления к испытуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками

осторожно встряхивают и помещают в термостат при 37 — 38 °С на 16 — 20 часов, затем выдерживают

при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего проводят учет реакции.

4.2.4. Учет реакции агглютинации. Результаты реакции учитывают визуально и определяют в

крестах по следующей схеме:

++++ (4 креста) — полное просветление жидкости, микробные тела

осели на дно пробирки в виде «зонтика», при легком

встряхивании «зонтик» разбивается на хлопья и

а жидкость остается прозрачной (100% агглютинации);

+++ (3 креста) — неполное просветление жидкости и хорошо выраженный

++ (2 креста) — просветление жидкости, «зонтик» умеренно выражен

+ (1 крест) — едва заметное просветление жидкости, «зонтик»

слабо, при встряхивании заметно небольшое

хлопьев или комочков (25% агглютинации);

— (знак минус) — просветления жидкости и образования «зонтика» не

наступило, на дне пробирки виден «пунктик» осевших

микробов антигена, при легком встряхивании

За титр антител принимают последнее разведение сыворотки, в котором произошла

агглютинация не менее чем на 2 креста (++), что соответствует количеству международных единиц

(ME) антител в 1 мл сыворотки (например, сыворотка с конечным титром РА 1:100 содержит 100 ME,

Для более объективной оценки результатов РА в крестах готовят стандарты мутности,

соответствующие 0 (нулю), 25, 50 и 75% просветления жидкости.

В четыре пробирки последовательно наливают 1, 2, 3 и 4 мл антигена, разведенного 1:10. Затем

в том же порядке в три первые пробирки добавляют 3, 2 и 1 мл фенолизированного

физиологического раствора. В четвертую пробирку раствор не добавляют. После встряхивания

пробирок жидкость из каждой из них переносят по 0,5 мл в серологические пробирки и добавляют по

0,5 мл фенолизированного физиологического раствора. Полученные стандарты соответствуют 75, 50

и 25% просветления жидкости. В последней, четвертой пробирке просветление отсутствует.

Стандарты мутности готовят каждый раз при постановке РА и выдерживают в термостате

одновременно с основной реакцией.

Степень просветления в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют визуально путем

сравнения со стандартами и результаты реакции выражают в крестах.

При массовых исследованиях сывороток в двух разведениях все сыворотки, давшие

агглютинацию с оценкой не менее чем на 2 креста (++) в каком-либо из указанных разведений,

исследуют повторно в четырех разведениях.

4.2.5. Диагностическая оценка реакции агглютинации.

Реакцию считают положительной при наличии агглютинации с сыворотками крови крупного

рогатого скота, лошадей и верблюдов начиная с разведения 1:100 (100 ME — международных единиц

антител), коз, овец, буйволов, оленей и собак — с разведения 1:50 (50 ME), пушных зверей и морских

свинок — с разведения 1:10 (10 ME) с оценкой не менее чем на 2 креста.

Реакцию считают сомнительной при наличии агглютинации только в разведении 1:50 (50 ME) с

сыворотками крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов и в разведении 1:25 (25 ME) с

сыворотками овец, коз, буйволов, оленей и собак с оценкой не менее чем на 2 креста.

При получении сомнительного результата реакции сыворотку крови данного животного

исследуют повторно через 3 — 4 недели.

На неблагополучных по бруцеллезу фермах животных, при исследовании которых будет

получена дважды сомнительная РА, относят к положительно реагирующим.

В заключении лаборатории о результатах исследования должна быть сообщена диагностическая

оценка каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр)

сыворотки, в котором получен соответствующий результат, выраженное в международных единицах

(например: конечный титр сыворотки крови крупного рогатого скота 1:100 с оценкой 2 креста или

более — «положительная 100 ME»; конечный титр сыворотки 1:50 с оценкой 2 креста или более —

Суммарные результаты исследования испытуемых сывороток, серию антигена, срок его

годности, а также предельный титр позитивной сыворотки записывают в журнал серологических

4.3. Постановка и учет реакции связывания комплемента (РСК) и реакция длительного

связывания комплемента на холоде (РДСК).

4.3.1. Реакцию связывания комплемента применяют при диагностике бруцеллеза у крупного

рогатого скота, овец, коз, свиней, лошадей, оленей, собак, пушных зверей и животных других видов.

Реакцию длительного связывания комплемента, как более чувствительную, применяют вместо

РСК при исследовании на бруцеллез сывороток животных указанных видов, а также при диагностике

инфекционного эпидидимита баранов.

4.3.2. Компоненты реакций и их подготовка к работе:

испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);

позитивная бруцеллезная или овисная сыворотка, изготовленная на биофабрике или полученная

от больного животного. На этикетках флаконов с сыворотками указывают титр в РСК (РДСК) и дату

негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных), изготовленная на биофабрике

или полученная в лаборатории.

Испытуемые и контрольные (позитивную и негативную) сыворотки инактивируют в водяной

бане в день постановки реакции: для РСК — при 60 — 62 °С в течение 30 мин. (сыворотки крови ослов

и мулов — при 64 — 65 °С, буйволов — при 62 — 64 °С в течение 30 мин., свиней — при 60 — 62° в течение

50 мин.); для РДСК сыворотки крови животных всех видов — при 63 — 64 °С в течение 30 мин.;

антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК или овисный для РДСК в рабочем титре,

указанном предприятием, его изготовившим (см. Приложение N 2, п. 6);

комплемент — сыворотка крови морской свинки (свежая, консервированная добавлением 4%

борной кислоты или лиофильно высушенная). При использовании в качестве комплемента свежей

или консервированной сыворотки и при получении каждой новой серии сухого комплемента

проводят титрование его в гемолитической системе для определения активности (см. Приложение N

Сухой биофабричный комплемент растворяют в физиологическом растворе, как указано на

этикетке. Берут такое количество ампул (флаконов), в которых содержится необходимое для

проведения всего опыта количество комплемента. Содержимое ампул (флаконов) сливают в одну

пробирку, осторожно смешивают, берут 0,5 мл и разводят физиологическим раствором 1:20 для

титрования. Остальное количество комплемента хранят в холодильнике при плюс 2 — 4 °С;

гемолитическая сыворотка (гемолизин) — для РСК в удвоенном титре, для РДСК — в утроенном.

Титрование гемолизина проводят периодически один раз в 3 месяца и при использовании каждой

новой серии (см. Приложение N 2, п. 5);

эритроциты барана — 2,5-процентная от осадка взвесь эритроцитов в физиологическом растворе

для РСК и 3-процентная для РДСК (см. Приложение N 2, п. 3).

Для приготовления гемолитической системы соответствующую взвесь эритроцитов и

гемолитическую сыворотку в рабочем разведении смешивают в равных объемах и выдерживают в

термостате при 37 °С в течение 15 — 20 мин. При смешивании гемолизин вливают во взвесь

физиологический раствор — 0,85-процентный раствор химически чистого хлорида натрия в

дистиллированной воде рН = 7,3 — 7,4 или физиологический раствор, содержащий ионы магния и

кальция (см. Приложение N 2, п. 2).

Рабочие разведения всех компонентов для РСК или РДСК готовят перед постановкой реакции

и проверяют их на антикомплементарность и гемотоксичность по следующей схеме:

¦ Комплемент в разведении ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ — ¦ — ¦ —

¦ Гемолизин в рабочем титре ¦ 0,2 ¦ — ¦ 0,2 ¦ — ¦ —

¦ Антиген в рабочем титре ¦ 0,4 ¦ — ¦ — ¦ 0,4 ¦ —

¦ Эритроциты (2,5% или 3%) ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2

¦ Физиологический раствор ¦ — ¦ 0,6 ¦ 0,6 ¦ 0,2

¦ водяная баня 10 минут при 37 —

¦ Результат: гемолиз полная задержка

В реакциях используют компоненты, не обладающие антикомплементарными и

4.3.3. Постановка реакции связывания комплемента.

Реакцию проводят в водяной бане при 37 — 38 °С в объеме 1 мл (по 0,2 мл каждого компонента —

сыворотки, антигена, комплемента, гемолизина и эритроцитов).

Перед постановкой главного опыта проводят титрование комплемента в бактериолитической

системе на позитивной (бруцеллезной) сыворотке, негативной сыворотке крови того вида животных,

которых исследуют, и одной сыворотке, взятой из исследуемой партии.

Каждую сыворотку разводят 1:5 физиологическим раствором (1 мл сыворотки + 4 мл

физиологического раствора), инактивируют, как указано в подпункте 4.3.2, и разливают по 0,2 мл в

два ряда по 10 пробирок. Затем в пробирки каждого ряда вносят комплемент (разведенный 1:20) в

возрастающих дозах от 0,02 мл до 0,2 мл с интервалом 0,02 мл и недостающее до 0,2 мл (в каждой

пробирке) количество физиологического раствора.

После разлива комплемента в первый ряд пробирок с каждой сывороткой вносят по 0,2 мл

антигена в рабочем разведении, а во второй ряд — по 0,2 мл физиологического раствора. Пробирки

ставят в водяную баню при 37 — 38 °С на 20 мин. Затем во все пробирки добавляют по 0,4 мл

гемолитической системы, встряхивают их и вновь ставят в водяную баню на 20 мин., после чего

Схема титрования комплемента в бактериолитической системе (на примере негативной

источник

Основными тестами при массовых диагностических исследованиях являются пробирочная РА, РА на стекле (Роз-бенгал проба), РСК и РДСК, кольцевая реакция с молоком, реакция диффузионной преципитации.

Пробирочная реакция агглютинации.Используют при диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота, шец, коз, лошадей, буйволов, верблюдов, оленей, собак, пушных зверей И т.д. Реакцию проводят в объеме
1 мл. Сыворотки крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов исследуют в разведениях 1:50-1:400; онец, коз, свиней, буйволов, оленей и собак — 1:25 -1:200; пушных зверей и морских свинок — 1:10-1:80. При массовых исследованиях допускается постановка РА в двух первых разведениях, но при этом надо иметь в виду возможность феномена «прозоны». Сыворотки крови крупного рогатого скота, лошадей, собак, пушных зверей, верблюдов разводят 0,85%-ным раствором натрия хлорида с 0,5% фенола; сыворотки крови овец, коз и буйволов разводят 5%-ным, а сыворотки крови оленей — 10%-ным фенолизированным раствором натрия хлорида. Разведения сыворотки крови делают в объеме 0,5 мл, затем в каждую пробирку вносят 0,5 мл единого бруцеллезного антигена, разведенного 1:10, при этом разведения сыворотки крови удваиваются. Компоненты перемешивают Встряхиванием и штатив с пробирками помещают в термостат при 37-38° С на 18-20 часов, затем выдерживают несколько часов при комнатной температуре и учитывают результат общепринятым способом (технику постановки и учета результатов РА см. в разделе «Серологические реакции»). В качестве контролей параллельно исследуют заведомо положительную и отрицательную сыворотки. РА при бруцеллезе крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов считают положительной при титре 1:100 и более (1:50 — сомнительный результат), у овец, коз, оленей, буйволов и собак — 1:50 (1:25 — сомнительный результат). При получении сомнительных результатов сыворотки крови от этих животных исследуют через три-четыре недели повторно.

Помимо титра результаты пробирочной РА выражают в международных единицах (ME). В разных странах готовят антигены, различающиеся по агглютинабилыюсти, что приводит к несопоставимости титров РА. Поэтому была предложена международная стандартная бруцеллезная сыворотка, по отношению к которой определяют активность национальных антигенов. Активность стандартной сыворотки определена в 1000 МЕ/мл. Например, при исследовании этой сыворотки с определенным национальным антигеном она показывает в РА титр 1:500. Следовательно, если в РА с этим антигеном исследуют сыворотку крови от животного из хозяйства и получают титр РА 1:500, то она также содержит 1000 ME бруцеллезных антител, а вторая сыворотка, давшая титр 1:400, содержит 1000 х 400 : 500 = 800 ME и т.д. В настоящее время в странах разработаны национальные стандартные бруцеллезные сыворотки, соответствующие по активности международной сыворотке. В РФ в соответствии с «Наставлением по диагностике бруцеллеза животных» (2000) приняты следующие критери оценки РА в ME. Реакцию считают положительной у невакцинироваппого крупного рогатого скота, верблюдов, лошадей, а также иммунизированных неаг-глютиногенными вакцинами при наличии 200 ME антител (сомнительной — 50-100 ME); у овец и коз — 100 ME; оленей и собак — 50 ME; пушных зверей и морских свинок —10 ME. PA считают сомнительной у овец, коз, оленей, собак этой группы на уровне 25-50 ME. При сомнительных показаниях РА животных повторно исследуют через 15-30 суток. В случае повышения уровня антител животных признают больными, при отсутствии динамики — здоровыми. Выявление в стадах крупного рогатого скота, иммунизированного ранее агглютиногенными вакцинами, животных с уровнем антител не более 200 ME предполагает через 15-30 суток их повторное исследование. Если при повторном исследовании наблюдают повышение уровня антител, то животных признают больными. При отсутствии повышения дополнительными методами уточняют специфичность результатов РА.

При обнаружении в неблагополучных по бруцеллезу стадах крупного рогатого скота (ранее иммунизированного или не иммунизированного) животных с уровнем антител 100 ME и более их признают больными,
50 ME — результат РА сомнительный. В случае сомнительной РА животных исследуют через 15-30 суток повторно и при вторичном сомнительном результате животных признают больными.

При исследовании в РА невакцинированных баранов-производителей, пробников, ярок, козлов, содержащихся в благополучных отарах, где проводилась иммунизация, РА оценивают как положительную при уровне антител 100 ME и более, сомнительной — 50 ME. В последнем случае животных через 15-30 суток исследуют повторно, и, если содержание антител не увеличилось, их признают здоровыми.

Роз-бенгал проба (РБП).РА на стекле с корпускулярным антигеном, окрашенным розовым бенгальским, используют для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота, овец, коз, лошадей, свиней, буйволов, верблюдов и северных оленей. Реакцию проводят на чистых, сухих эмалированных пластинках с лунками при температуре не ниже 18°С. Исследуемые сыворотки в дозе 0,03 мл вносят на дно лунки, затем в лунку рядом с сывороткой помещают при исследовании крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов и свиней 0,03 мл антигена, сывороток овец, коз, буйволов и северных оленей — 0,015 мл антигена. Компоненты должны иметь температуру не ниже 18°С.

Затем компоненты перемешивают в течение 4 минут, одновременно учитывая результат. В положительных случаях в течение указанного времени появляются розовые хлопья агглютината. В РБП исследуют неразведен-ные сыворотки, влияние нормальных антител нивелируется использованием кислого антигена со значениями рН, при которых нормальные антитела с низкой авидностыо не реагируют с антигеном, что обеспечивает специфичность результата реакции. Перед началом исследований антиген проверяют в РБП на активность, специфичность и на спонтанную агглютинацию соответственно с позитивной, негативной сыворотками и в последнем случае — с физиологическим раствором. В соответствии с «Наставлением по диагностике бруцеллеза животных» в РФ результат РБП считают положительным при наличии четко выраженной агглютинации. В благополучных по бруцеллезу хозяйствах в случае позитивной РБП сыворотки крови исследуют в РА и РСК (РДСК) или РА и РИД. Если при этом получают отрицательные результаты, то животных с позитивной РБП повторно исследуют через 15-30 дней в этих же серологических реакциях. В неблагополучном по бруцеллезу хозяйствах овец, коз, северных оленей с позитивной РБП признают больными. Сыворотку крови крупного рогатого скота, верблюдов и лошадей дополнительно исследуют в РА, РСК (РДСК) или РА и РИД, животных с положительными результатами этих серологических реакций признают больными, сомнительно реагирующих исследуют повторно через 15-30 суток в РА, РСК (РДСК) или РА и РИД. При получении положительных или сомнительных результатов животных признают больными бруцеллезом.

Кольцевая реакция с молоком (КР).Реакцию применяют для проверки благополучных по бруцеллезу стад крупного рогатого скота и молока на рынках.

В РФ, в соответствии с «Наставлением по диагностике бруцеллеза животных», реакцию и оценку результатов проводят следующим образом. В уленгутовские пробирки наливают 0,05 мл антигена (клетки бруцелл, окрашенные гематоксилином) и 1 мл исследуемого молока. Если используют пробирки Флоринского — 2 мл молока и 0,1 мл антигена, компоненты перемешивают, пробирки помещают в водяную баню (37-38° С) на 1 час, затем учитывают результат по нижеследующим критериям:

«+++»	Четко выраженное синее кольцо в верхней части столбика молока в слое сливок, молоко белое	Результат положительный
«++»	Достаточно выраженное синее кольцо в слое сливок, остальная часть молока имеет синеватый цвет	Результат положительный
«+»	Синее кольцо в слое сливок выражено слабо, столбик молока имеет синий цвет	Результат сомнительный
«-»	Столбик молока равномерно окрашен в синий цвет, слой сливок белого или желтоватого цвета	Результат отрицательный

КР на 2-3 креста считают положительной, 1 крест — сомнительной. При положительной КР от всех животных стада берут кровь для исследования в РА или РСК (РДСК) или РА и РИД. Если получают их отрицательный результат, то независимо от позитивной КР животных признают здоровыми.

Реакция связывания комплемента (РСК, РДСК). Данную серологическую реакцию применяют для диагностики бруцеллеза практически у всех видов животных. Согласно «Наставлению по диагностике бруцеллеза животных» исследуемые сыворотки крови крупного рогатого скота для РСК инактивируют разведенными 1:5 в водяной бане в течение 30 минут при 60-62°С; сыворотки крови ослов, мулов при 64-65°С; буйволов — 62-64° С; свиней — 60-62° С 50 минут; при постановке РДСК 30 минут при 62-64° С. Используют единый бруцеллезный антиген в рабочем титре, гемолизин для РСК в удвоеном титре, для РДСК — в утроенном, 2,5%-ную взвесь эритроцитов барана для РСК и 3%-ную для РДСК. Комплемент в количестве 1,2 единицы (титр комплемента принимается за 1 единицу). Реакцию проводят в объеме 1 мл с сыворотками, разведенными 1:5 или 1:10 (технику постановки и учета результатов см. в разделе «Серологические реакции»).

При исследовании сывороток в одном разведении (1:5) и задержке гемолиза на один крест эти сыворотки повторно исследуют в двух разведениях (1:5, 1:10). В случае сомнительной РСК животных повторно исследуют через 15-30 суток. Если при повторном исследовании животных из благополучного по бруцеллезу хозяйства вновь получена сомнительная РСК — животных признают здоровыми. Если аналогичный результат получен у животных неблагополучного хозяйства, их рассматривают как больных. Получение только позитивной РСК в разведении 1:10 в благополучных по бруцеллезу стадах ранее вакцинированного крупного рогатого скота предполагает повторное исследование через 15-30 суток. При нарастании титров РСК диагноз на бруцеллез считают установленным, в обратном случае результат исследования считают отрицательным («Наставление по диагностике бруцеллеза животных», 2000).

Реакция иммунодиффузии (РИД). Согласно «Наставлению по диагностике бруцеллеза животных» (2000) в РФ РИД используют при плановых исследованиях в благополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота хозяйствах, где не применяются вакцины, одновременно с РА, а также при проверке сомнительно реагирующих в РА или РСК (РДСК) животных для дифференциации неспецифических реакций; в благополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота хозяйствах, где проводится иммунизация крупного рогатого скота аг-глютиногенными вакцинами при контроле эпизоотического состояния (не ранее 1,5 месяца после вакцинации); для дифференциации реакций, полученных в РА (не более
200 ME) или РСК (РДСК) в разведениях не выше 1:10; при плановых исследованиях животных одновременно с РА; в неблагополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота хозяйствах через 1,5 месяца после иммунизации; среди телок и нетелей в течение первых шести месяцев после иммунизации (реиммунизации) 2-4-кратно; через месяцев после иммунизации (реиммунизации) животных для оздоровления стада от бруцеллеза в комплексе предусмотренных реакций; при постановке хозяйства на контроль и снятии ограничений одновременно с РА и РСК (РДСК).

При диагностике бруцеллеза северных оленей для оценки эпизоотического состояния стад, благополучных по бруцеллезу, вакцинированных против бруцеллеза; для исследования на бруцеллез не ранее чем через два месяца после применения вакцин; для дифференциации неспецифических реакций.

Техника проведения РИД. Расплавленный агар разливают по 2,5 мл на предметные стекла, пластинки размером 6×9 см —12 мл, стандартные чашки Петри слоем не менее 2 мм, которые предварительно размещают на строго горизонтальной поверхности. В застывшем агаровом геле штампом делают лунки: центральную диаметром 5 мм и шесть переферических по 3 мм.

В центральную лунку вносят 20 мкл О-полисахаридного антигена, в периферические — 40 мкл исследуемых сывороток крови. Одновременно на каждой пластинке (чашке Петри) ставят контроль с позитивной сывороткой крови. Затем стекла (чашки Петри) выдерживают во влажной камере при температуре не ниже 18° С и учитывают результат в косопроходящем свете через 24 и 48 часов. Как положительный результат оценивают наличие линии преципитации, появившейся через 24 часа. Сыворотки крови, давшие реакцию преципитации через 48 часов, исследуют повторно и при получении линии преципитации через 24 или 48 часов результат реакции признают положительным.

Печеночно-сывороточный или печеночно-аминопептидный агар.Готовят печеночный отвар: 500 г свежего фарша говяжьей печени смешивают с 500 мл воды, кипятят 1 час, фильтруют через ватный фильтр, стерилизуют в автоклаве, смешивают равные объемы печеночного отвара и водопроводной воды, добавляют 1% пептона, 0,5% натрия хлорида, 2% агар-агара. На 1000 мл смеси вносят 17 мл 10%-ной двууглекислой соды, автоклавируют 20-25 минут при 115° С, фильтруют через ватный фильтр, устанавливают рН 7,0-7,2, добавляют 1% глюкозы и 2% глицерина, разливают по колбам и стерилизуют 20-25 минут при 110° С. Перед использованием агар расплавляют, остужают до 50° С, добавляют 10-20% сыворотки крови лошади или крупного рогатого скота (печеночно-сывороточ-иый агар) или 10-15% аминопептида (печеночно-аминопептидный агар) и разливают по чашкам или пробиркам. Также готовят полужидкие агары, внося 0,15-0,2% агар-агара. Рекомендуют среды данного типа для культивирования В. ovis.

Печеночный агар Хеддльсона.В 500 мл воды вносят 10 г пентона,
5 г натрия хлорида, 20 г агар-агара, автоклавируют 30 минут, добавляют 500 мл печеночного отвара, охлаждают до 60° С, устанавливают рН 7,0. К 1 л среды добавляют один яичный белок, автоклавируют 30 минут при 120° С, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают рН 7,0, разливают по емкостям и стерилизуют 30 минут при 115° С.

Плотный печеночно-глюкозо-глицериновый агар (ППГГА). 400 г свежей говяжьей печени освобождают от жира и пленок, измельчают, добавляют 500 мл водопроводной воды, кипятят 1 час, фильтруют через ватный фильтр. Полученный печеночный отвар разводят водопроводной водой 1:1, добавляют 1% пептона, 0,5% натрия хлорида, 2,5% агара и
17 мл 10%-ного раствора гидрокарбоната натрия на 1000 мл. Среду автоклавируют 20 минут при 115° С, отстаивают в автоклаве 3-4 часа, фильтруют через ватный фильтр, устанавливают рН 7,2. Затем в среду вносят 1% глюкозы и 2-3% глицерина, разливают по пробиркам, колбам, стерилизуют 20-25 минут при 110° С. Данную среду рекомендуется применять для культивирования В. abortus, В. melitensis и В. suis, при бактериостатическом методе дифференциации бруцелл. ППГГБ готовят так же, но агар не добавляют.

Сывороточно-декстрозиый агар.К 835 мл дистиллированной воды добавляют 15г агар-агара, 10г пептона, 5 г химически чистого натрия хлорида и 165 мл мягкой воды. Прогревают 1 час текучим паром, устанавливают рН 7,8, автоклавируют 30 мин при 127° С, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 7,4. Среду разливают по сосудам и стерилизуют при 116° С 15 минут. Перед использованием среду расплавляют, охлаждают до 50° С, добавляют стерилизованные фильтрованием сыворотку крови лошади или крупного рогатого скота до концентрации 5% и раствор декстрозы до уровня 1%. Среда рекомендуется для первичного выделения бруцелл.

Сывороточно-декстрозный бульон.Готовят так же, как сывороточно-декстрозный агар, но без добавления агар-агара.

Альбими-агар.В 1000 мл дистиллированной воды добавляют 20 г сухого пептона, 20 мл дрожжевой воды, 5 г натрия хлорида, 20 г агар-агара. Устанавливают рН 7,3, все компоненты растворяют в аппарате Коха, фильтруют через ватный фильтр. Вносят 1 г глюкозы, 0,2 г бисульфита натрия, устанавливают рН 7,2 0-7,3, разливают по колбам и стерилизуют 40 минут текучим паром, затем 20 минут в автоклаве при 110° С. Дрожжевую воду получают путем кипячения 1 кг хлебных дрожжей в 1000 мл дистиллированной воды, затем фильтруют через полотно и хранят под флороформом в темноте (не более 15 дней).

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ ло межгосударственной стан* дартизации установлены в ГОСТ 1.0—2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2—2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные. правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия. обновления и отмены»

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 7 июня 2017 г. N» 99-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны no MK 3 по ГОСТ 29230:

• колбы мерные по ГОСТ 1770 исполнения 2 различной вместимости 1-го класса точности:

• центрифуга лабораторная со скоростью вращения ротора 2000—3000 об/мин;

• термостат, обеспечивающий поддержание температуры от 20 ®С до 50 в С;

— баня водяная с терморегулятором с температурой нагрева до 100 *С;

• холодильник бытовой, обеспечивающий поддержание температуры от 0 *С до 10 *С по ГОСТ 16317:

• штамп для формирования лунок в агаре;

• осветитель настольный с пределом поворота фонаря вокруг горизонтальной и вертикальной осей 0—360 и источником света — лампой в/Ватт-8/20:

• чашки биологические (Петри) с крышками ЧБН 2 по ГОСТ 25336;

• чашка и ступка фарфоровые по ГОСТ 9147:

— комплект инструментов и приспособлений для серологических исследований крови животных на бруцеллез, в который входят:

1) шприц-полуавтомат (капельница) для дозирования сыворотки;

2) пипетка-капельница для дозирования антигена:

3) ручной смеситель на 25 лунок диагностической пластины:

4) аппарат для автоматического покачивания диагностических пластин;

• Группу патогенности устанавливают 8 соответствии с нормативными правовыми актами, действующими на территории государства, принявшего стандарт.

• пластины с лунками 72-гнездные полистироловые (планшеты);

— штативы 100-гнездные для пробирок Флоринского:

• групповые дозаторы Флоринского;

• пробирки серологические Флоринского;

• микропилетки вместимостью от 0.1 до 0.5 см 3 ;

• дозаторы одноканальные пипеточные переменного объема;

• наконечники для дозаторов вместимостью 0.2; 0.5; 1,0 см 3 ;

• фильтры бумажные из бумаги фильтровальной ло ГОСТ 12026;

• бумага фильтровальная по ГОСТ 12026;

• спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962;

— вода дистиллированная ло ГОСТ 6709;

• кислота соляная по ГОСТ 3118 х. ч;

• фенол по ГОСТ 23519 — 5 %-ный раствор;

• формалин по ГОСТ 1625 — 1 %-ный и 10 %-ный растворы;

• натрий хлористый по ГОСТ 4233;

• кислота борная по ГОСТ 18704 — 3 %-ный раствор.

• натрия бихромат по ГОСТ 2651;

• калий двухромовокислый по ГОСТ 4220:

• кислота серная по ГОСТ 4204;

• натрия гидроокись по ГОСТ 4328;

• сыворотка гемолитическая по ГОСТ 16445:

— комплемент сухой для РСК по ГОСТ 16446:

• свинки морские массой 300—400 г;

• набор для ИФА. содержащий в своем составе:

1) планшет полистироловый 96-луночный с адсорбированной в лунках планшета смесью специфических антигенов Brucella;

2) флакон № 1 — ФСБ-Т объемом 26 см 3 ;

3) флакон № 2 — РБР-С объемом 12 см 3 ;

4) флакон Ns 3 — PKr-G объемом 12 см 3 :

5) флакон Ns 4 — К+ объемом 1.5 см 3 :

6) флакон Ns 5 — К- объемом 2.5 см 3 :

7) флакон Ns 6 — ТМБ-субстрат;

8) флакон Ns 7 — стоп-реагент объемом 6 см 3 ;

• тест-система для определения антител к ЛПС антигену в. abortus и в. melitensis в сыворотке крови крупного рогатого скота и овец методом ИФА. содержащая в своем составе компоненты:

1) К, — иммунохроматографичесхие тест-полоски, нитроцеллюлозные мембраны на полимерной основе белого цвета, ламинированные защитными этикетками с обозначениями разного цвета: в нижней части — стрелки, указывающие направления погружения полоски в тестируемую пробу; в верхней части — название рода и вида возбудителя исключаемой болезни;

2) Kj — буферный раствор для разведения проб объемом 0.8 см 3 :

• негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных);

— антиген бруцеллезный для РА и РСК (РДСК):

• роз бенгал антиген для РБП;

• антиген бруцеллезный для КР с молоком;

— 0.65 %-ный раствор хлористого натрия;

• 0.85 %-ный раствор хлористого натрия с 0.5 % фенола;

— 5 %-ный раствор хлористого натрия с 0.5 % фенола;

— 10 %-ный раствор хлористого натрия с 0.5 % фенола;

• взвесь формалинизированных несенсибилизированных эритроцитов;

• молоко от здоровой коровы (буйволицы);

• набор для РИД. содержащий в своем составе:

1) О-ПС бруцеллезный антиген;

2) натрий хлористый по ГОСТ 4233;

3) микробиологический агар-агар по ГОСТ 17206;

• набор для серологической диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота, содержащий в своем составе:

1> антиген бруцеллезный эритроцитарный для РНГА;

2) взвесь формалинизироеанных неоенсибилизированных эритроцитов:

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов, дезинфицирующих средств и материалов по качеству не ниже указанных. Допускается использование посуды одноразового применения.

6.1 Забор крови у животных для получения сыворотки проводят:

• из яремной, ушной или хвостовой вены у свиней;

• головной вены, еены предплечья или латеральной подколенной вены голени у собак;

— из бедренной вены у лисиц и песцов:

• путем отсечения подушечки среднего пальца задней лапы или кончика хвоста у норок.

Кровь берут в стерильные пробирки по 5—7 см 3 (от пушных зверей — по 1—2 см 3 ). Пробирки нумеруют и составляют опись проб.

6.1.1 Сыворотку крови получают методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают в термостате при 30 *С—38 *С в течение 1 ч или при комнатной температуре в течение 8—10 ч. сгусток крови от стенок отделяют стальной спицей, а затем пробирки выдерживают при 4 *С—10 *С. Через 20—24 ч после взятия крови отстоявшуюся сыворотку сливают в сухие стерильные пробирки и направляют для исследования в лабораторию в сеежем или консервированном виде (сыворотку крови собак сливают через 3—4 ч и повторно через 10—12 ч).

6.1.2 Консервирование сывороток проводят.

• добавлением 0,05 см 3 (1 капля) 5 %-ного раствора фенола на 1 см 3 сыворотки при тщательном перемешивании;

• сухой борной кислотой (3—4 % к объему сыворотки) до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка;

• путем однократного замораживания.

Неконсервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 сут со дня взятия крови при условии хранения их при температуре от 2 *С до 8 «С.

Сыворотки, консервированные фенолом или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 сут, замороженные сыворотки — в течение 3 сут после однократного оттаивания. Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки к исследованию на бруцеллез не пригодны.

6.2 Для исследования молока на бруцеллез в кольцевой реакции пробу цельного свежего молока от коровы (буйволицы) берут из каждой доли вымени одного удоя в одну бактериологическую пробирку в количестве 10—15 см 3 . При этом если молоко берут перед дойкой, то первые порции молока сдаивают. Пробы молока на рынках берут из каждой отдельной посуды (бидон, фляга и др.) после тщательного его перемешивания. Пробирки нумеруют и составляют опись проб.

6.2.1 Молоко исследуют свежее или консервированное добавлением в каждую пробу одной капли 10 %-ного раствора формалина на 5 см 3 молока. Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 2—3 сут. Перед исследованием молоко тщательно перемешивают для равномерного распределения сливок.

6.2.2 При массовом исследовании молока работу по отбору проб и постановке кольцевой реакции можно проводить непосредственно на ферме в специально отведенном помещении.

6.2.3 Не разрешается исследовать в кольцевой реакции молоко от коров (буйволиц), больных маститом или болезнями, сопровождающимися повышением температуры тела, а также молоко животных в первые две недели после родов. Молоко, имеющее повышенную кислотность (30* по Тернеру и выше), исследованию не подлежит, т. к. антиген обесцвечивается.

6.3 На направляемый в лабораторию материал заполняют сопроводительный документ.

7.1 Сущность методов заключается е выявлении в сыворотке крови животных специфических антител к бруцеллезным антигенам.

7.2 Пластинчатая реакция агглютинации с бруцеллезным роз бенгал антигеном (РБП)

Сущность метода заключается в выявлении специфических антител в сыворотке крови животных, основанном на способности антител сыворотки агглютинировать бруцеллезный антиген, результатом чего является формирование выраженной агглютинации окрашенных бруцелл антигена в виде крупных или мелких хлопьев розовою цвета.

7.2.2 Подготовка к исследованию

7.2.2.1 Приготовление 5 %-ного раствора хлорамина

Для приготовления 5 %-ного раствора хлорамина 5 г хлорамина растворяют в 100 см 3 водопроводной воды. Раствор используют свежеприготовленным.

Примечание — Могут применяться другие растворы дезинфицирующих средств, эффективные в отношении бактерий рода Brucella, которые готовят в соответствии с инструкциями к ним.

7.2.2.2 Для массовых диагностических исследований используют комплект инструментов и приспособлений для серологических исследований крови животных на бруцеллез в соответствии с разделом 5.

Перед постановкой реакции роз бенгал антиген и исследуемые сыворотки выдерживают 30—40 мин при комнатной температуре и встряхивают для получения однородной смеси.

Реакцию проводят на чистых, сухих эмалированных диагностических пластинах с лунками при температуре не ниже 18 *С. На бортиках пластинки против каждой лунки записывают номер исследуемой сыворотки.

7.2.3 Проведение исследования

7.2.3.1 РБП применяют как экспресс-метод диагностики бруцеллеза у не иммунизированного про-тивобруцеллеэными вакцинами крупного рогатого скота, овец. коз. верблюдов, лошадей, северных оленей (маралов), свиней и собак.

Для исследования применяют тест-системы, используемые для диагностики бруцеллеза животных в РБП.

Исследуемые сыворотки крови в дозе 0,03 см 3 (две капли) вносят на дно лунки при помощи шприца-полуавтомата. или микропипетки, или одноканального дозатора с наконечником.

7.2.3.2 После внесения каждой сыворотки шприц-полуавтомат (микролипвтку) трижды промывают фенолизированным 0.85 %-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2 и кончик подсушивают фильтровальной бумагой. При исследовании сыворотки крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов в каждую лунку рядом с сывороткой при помощи пипетки-капельницы для антигена, или микропипетки, или одноканального дозатора с наконечником вносят 0.03 см 3 антигена (две капли), а при исследовании сывороток крови овец, коз и северных оленей (маралов), свиней и собак — 0,01 S см 3 антигена (одну каплю). Затем антиген в каждой лунке тщательно смешивают с сывороткой активными движениями ручного смесителя до получения однородной жидкости, распределяя ее при этом по всей поверхности лунки. После смешивания сывороток во всех лунках пластинки смеситель ополаскивают 0,85 %-ным фенолизированным раствором хлористого натрия по 7.4.2 и просушивают марлевой салфеткой или фильтровальной бумагой.

Пластинку с сыворотками и антигеном покачивают в течение 4 мин осторожными вращательными движениями вручную или при помощи аппарата, предназначенного для этой цели. При положительной реакции в течение 4 мин появляются мелкие или крупные хлопья агглютиката розового цвета.

В начале работы ставят контроль антигена с негативной и бруцеллезной сыворотками в тех же дозах, а также антигена на спонтанную агглютинацию (к 0.03 см 3 0,85 %-ного фенолизированного раствора хлористого натрия добавляют 0,03 см 3 роз бенгал антигена).

По окончании работы диагностические пластинки дезинфицируют погружением на 5 мин в 5 %-ный раствор хлорамина либо другого дезинфицирующего средства в концентрации и экспозиции, определенной для возбудителя данного вида, затем обрабатывают любым моющим средством, промывают водопроводной, затем дистиллированной водой, высушивают на воздухе или в термостате при температуре 37 в С—38 в С и используют повторно.

7.2.4 Обработка результатов

Учет результатов реакции проводят визуально в течение 4 мин после смешивания сывороток с антигеном при слегка наклонном положении пластинки.

Реакцию считают положительной при наличии агглютината в виде мелких или крупных хлопьев розового цвета.

Реакцию считают отрицательной при отсутствии агглютинации (смесь гомогенная и равномерно окрашенная).

При не четко выраженной агглютинации проводят повторное исследование сыворотки и по его результатам дают окончательную оценку реакции (положительная или отрицательная).

При получении отрицательных результатов РБП по всему стаду его считают благополучным по бруцеллезу.

Сыворотки крови животных стада (фермы, населенного пункта), положительно реагирующие в РБП. исследуют на бруцеллез в РА и РСК (РДСК). или в РА и РИД. или в РНГА. или в ИФА. или в ИХА.

7.3 Кольцевая реакция (КР) с молоком

Сущность метода состоит в выявлении антигеном специфических антител в молоке больных бруцеллезом или иммунизированных агглютиногенными противобруцеллеэными вакцинами коров. Положительная реакция проявляется в образовании синего кольца в верхнем слое сливок.

КР с молоком применяют с целью определения благополучия стад (ферм) по бруцеллезу крупного рогатого скота (буйволов) и для проверки молока при продаже его на рынках.

Исследование молока на бруцеллез в КР можно проводить в лабораториях или непосредственно в хозяйствах.

7.3.1 Подготовка к исследованию

Для постановки КР с молоком применяют тест-системы или наборы для диагностики бруцеллеза в кольцевой реакции (КР). используемые на территории государств, принявших стандарт, в состав которых входят антиген бруцеллезный для КР с молоком и сыворотка бруцеллезная. Реакцию ставят в серологических пробирках Флоринского, которые нумеруют е соответствии с описью проб молока, пробы которого отбирают по 6.1.

7.3.2 Проведение исследования

В пробирки вносят по 2 см 3 молока пипеткой или дозатором. После каждой пробы пипетку двукратно промывают теппой водопроводной водой. Антиген вносят по 0,1 см 3 в каждую пробирку с пробой молока. После внесения антигена в пробирки одного ряда штатив энергично встряхивают и т. д. После внесения антигена во все пробирки штатив встряхивают дополнительно.

При исследовании каждой партии молока ставят контрольные пробы:

— молоко от заведомо здоровой коровы (буйволицы):

• смесь молока здоровой короеы (буйволицы) с бруцеллезной сывороткой (0,1 см 3 сыворотки на 2 см 3 молока).

Штативы с исследуемыми контрольными пробами молока выдерживают на водяной бане при температуре 37 *С— 38 *С в течение 1 ч или в термостате в течение 2 ч.

Результаты реакции учитывают визуально через 30—40 мин после извлечения штативов из водяной бани (термостата) и оценивают в крестах по следующей схеме:

«♦+♦# (три креста) — четко выраженное синее кольцо в верхней части столбика молока в слое сливок, остальная часть молока остается белой:

«♦+» (два креста) — четко выраженное синее кольцо в верхней части столбика молока в слое сливок, остальная часть молока имеет синеватый цвет;

«+» (один крест) — синее кольцо в слое сливок выражено слабо, и весь столбик молока имеет синий цвет;

(минус) — столбик молока остается равномерно окрашенным в первоначальный синий цвет, который был получен сразу после смешивания с антигеном, а слой сливок — белого или слегка желтоватого цвета.

7.3.3 Обработка результатов

Все пробы молока с оценкой в «+++» (три креста) и «♦+» (два креста) считают положительными. «+» (один крест) — сомнительными.

При получении отрицательных результатов КР по всему стаду его считают благополучным по бруцеллезу.

Сыворотку крови животных стада (группы, населенного пункта), в котором выявлены особи, сомнительно или положительно реагирующие в КР. исследуют на бруцеллез в РЕП. или в РА и РСК (РДСК). или в РА и РИД. или в РНГА. или в ИФА. При этом проводят клинический осмотр животных и исключают их заболевание маститами.

7.4 Реакция агглютинации (РА) в пробирках

7.4.1 РА в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота (буйволов, яков. зебу), овец, коз. лошадей, верблюдов, оленей (маралов), собак, пушных зверей и морских свинок.

7.4.2 Приготовление фенолизированных растворов хлористого натрия с содержанием фенола 0,5 %

В 1 дм 3 дистиллированной воды растворяют соответственно 8.5, 50 и 100 г хлористого натрия и добавляют к каждому раствору по 5 г фенола. Растворы фильтруют дважды через бумажный фильтр. Растворы хранят в стеклянных бутылях, укупоренных резиновыми пробками при температуре от 2 *С до 20 ‘С, и используют в течение 1 мес.

7.4.3 Проведение исследования

7.4.3.1 При исследовании в РА сыворотки крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок и антиген разводят фенолизированным 0.85 %-кым раствором хлористого натрия по 7.4.2; овец и коз — фенолизированным 5 %-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2; оленей (маралов) — фенолизированным 10 %-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2.

7.4.3.2 Сыворотки крови иоследуют в четырех разведениях в пробирках Флоринского в объеме 1 см 3 ;

* для крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов — в разведениях 1:50.1:100.1:200 и 1:400:

— для овец, коз, оленей (маралов) и собак — в разведениях 1:25.1:50.1:100 и 1:200;

— для собаке /^-бруцеллезным антигеном (в.сал/s) — в разведениях 1:50.1:100,1:200и1:400;

* для пушных зверей и морских свинок — в разведениях 1:10.1:20.1:40 и 1:80.

Исследование каждой сыворотки проводят в пяти пробирках.

7.4.3.3 Получение исходного разведения проб сыворотки:

* сыворотки крови крупного рогатого скота (лошадей, верблюдов) по 0.1 см 3 вносят в пробирки первого ряда, содержащие по 2.4 см 3 фенолизированного 0,85 %-ного раствора хлористого натрия по

— сыворотки крови овец, коз и собак по 0,2 см 3 вносят в пробирки первого ряда, содержащие по 2,3 см 3 фенолизированного 5 %-ного раствора хлористою натрия по 7.4.2 (разведение 1:12.5);

— сыворотку крови оленей и маралов по 0,2 см 3 вносят в пробирки первого ряда, содержащие по

2.3 см 3 фенолизированного 10 %-ного раствора хлористого натрия по 7.4.2 (разведение 1:12.5);

— сыворотку крови пушных зверей и морских свинок по 0.3 см 3 вносят в пробирки первого ряда, содержащие по 12 см 3 фенолизированного 0.85 %-ного раствора хлористого натрия по 7.4.2 (разведение 1:5);

* при исследовании с Я-бруцеллезным антигеном (B.canis) сыворотку крови собак по 0.1 см 3 вносят в пробирки, содержащие по 2.4 см 3 фенолизированного 0.85 %-ного раствора хлористого натрия по

В пробирки второго ряда раствор хлористого натрия не вносят.

В пробирки третьего, четвертого и пятого рядов вносят по 0.5 см 3 соответствующего фенолизированного раствора хлористого натрия по 7.4.2.

Затем в пробирки второго и третьего рядов вносят по 0.5 см 3 исходного разведения сыворотки.

После пипетирования (не менее трех раз) разведение сыворотки из третьего ряда по 0,5 см 3 переносят в пробирки четвертого ряда и после пипетирования из четвертого — в пятый. Из пробирок пятого ряда 0,5 см 3 жидкости удаляют. Таким образом, получают последовательные двукратные разведения образцов сыворотки.

7.4.3.4 8 пробирки второго, третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными сыворотками вносят при помощи группового дозатора Флоринского или другого дозирующего устройства по 0.5 см 3 антигена в рабочем разведении 1:10 (1.0 * 9.0 см 3 ) соответствующим фенолизированным раствором хлористого натрия по 7.4.2.

После внесения антигена разведение сыворотки в каждой пробирке удваивается.

В пробирки первого ряда антиген не вносят, они служат контролем сыворотки на самоагглюгина-цию. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты реакции агглютинации не учитывают.

После добавления к исследуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками интенсивно встряхивают для смешивания компонентов и помещают в термостат при температуре 37 °С—38 °С на 16—20 ч. затем выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч и проводят учет реакции.

7.4.3.5 На территориях, угрожаемых или неблагополучных по бруцеллезу, проводят массовые серологические исследования. При этом допускается проведение исследований в двух разведениях. Сыворотки разливают индивидуальной микропипеткой (с резиновой грушей), или групповыми дозаторами Флоринского. или одноканальными липеточкыми дозаторами в две серологические пробирки Флоринского в дозах 0,02 и 0.01 см 3 (сыворотки крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов) или 0.04 и 0.02 см 3 при исследовании сывороток овец. коз. оленей (маралов) и собак. Затем в каждую пробирку вносят по 1,0 см 3 антигена, разведенного соответствующим фенолиэиро ванным раствором хлористого натрия по 7.4.2 в соотношении 1:20. При этом сыворотки крови будут разведены соответственно 1:50 и 1:100 или 1:25 и 1:50.

При получении положительных или сомнительных результатов РА при массовом исследовании эти сыворотки исследуют в четырех разведениях.

Массовые исследования пушных зверей и морских свинок не проводят.

7.4.4 Обработка результатов

Результаты реакции учитывают визуально, определяя степень просветления жидкости, внешний вид агглютината (при его наличии) или антигена на дне пробирки до и затем, после легкого встряхивания. оценивают в крестах по следующей схеме:

«++♦+»(четыре креста) — полное просветление жидкости, микробные клетки антигена осели на дно пробирки в виде «зонтика», при легком встряхивании «зонтик» разбивается на хлопья и комочки, а жидкость остается прозрачной (100 % агглютинации):

■♦++» (три креста) — неполное просветление жидкости и хорошо выраженный «зонтик» агглютината (75 % агглютинации):

«♦+» (два креста) — неполное просветление жидкости, «зонтик» агглютината умеренно выражен (50 % агглютинации);

«+»(один крест) — едва заметное просветление жидкости, «зонтик» агглютината выражен слабо, при встряхивании заметно небольшое количество хлопьев или комочков (25 % агглютинации);

«•» (минус) — просветления жидкости и образования «зонтика» агглютината не наступило, на дне пробирки по центру образуется небольшой осадок микробов антигена в виде точки или пятна. При встряхивании осадок легко разбивается, поднимается вверх в виде косички и равномерно распределяется в жидкости, которая при этом приобретает первоначальную мутность.

За титр антител принимают наибольшее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация на два креста («+♦»), что соответствует количеству международных единиц (ME) антител в 1 см 3 сыворотки (например, сыворотка с титром 1:100 содержит 100 ME. 1:200 — 200 ME и т. д.).

Для более объективной оценки результатов РА готовят образцы сравнения мутности, соответствующие 75 %. 50 %. 25 % и 0 % просветления жидкости.

В четыре пробирки последовательно вносят 0.5; 1.0; 1.5 и 2,0 см 3 антигена, разведенного 0.85 %-ным фенолизированным раствором хлористого натрия в соотношении 1:10. Затем в том же порядке в три первые пробирки добавляют 1.5:1.0 и 0.5 см 3 соответствующего фенолизированного раствора хлористого натрия по 7.4.2. После перемешивания содержимого пробирок из каждой из них переносят по 1.0 см 3 в серологические пробирки. Полученные образцы сравнения мутности соответствуют 75 %, 50 % и 25 % просветления жидкости. 8 четвертой пробирке просветление отсутствует. Образцы сравнения мутности готовят каждый раз при постановке РА и выдерживают в термостате одновременно с основной реакцией.

При массовых исследованиях в двух разведениях все сыворотки, давшие агглютинацию с оценкой не менее чем на два креста («♦+») в каком-либо из указанных разведений, исследуют повторно в четырех разведениях.

В заключении лаборатории о результатах исследования должны быть отражены диагностическая оценка каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр) сыворотки. в котором получен соответствующий результат, выраженный в международных единицах (например: титр сыворотки крови крупного рогатого скота 1:200 с оценкой два — четыре креста — «положительная» 200 МЕ/см 3 ; титр сыворотки 1:100 с оценкой два — четыре креста — «сомнительная» 100 МЕ/см 3 ).

Результаты исследования исследуемой и контрольных сывороток, серию антигена, срок его годности записывают в журнал серологических исследований.

7.5 Реакция связывания комплемента (РСК) и реакция длительного связывания

комплемента на холоде (РДСК)

7.5.1 РСК применяют при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), овец. коз. свиней, верблюдов, лошадей, оленей (маралов), собак и пушных зверей.

Сущность реакции состоит в том. что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент, т. е. происходит связывание комплемента комплексом антиген — антитело.

7.5.2 РДСК применяют вместо РСК. в том числе для исследования сывороток, обладающих анти-комплементарными свойствами.

Сущность реакции состоит в образовании иммунного комплекса антиген — антитело в присутствии комплемента на холоде в течение нескольких часов.

7.5.3 Подготовка к исследованию

7.5.3.1 Приготовление 0.85 %-ного раствора хлористого натрия

Для приготовления 1 дм 3 раствора 8.5 г хлористого натрия растворяют в дистиллированной воде, устанавливают pH 6,8—7,2 ед. pH 5 %*ным раствором натрия гидроокиси и дважды фильтруют через бумажный фильтр. 0.85 %-ный раствор хлористого натрия хранят в стеклянной бутыли, закрытой резиновой или корковой пробкой, и используют в течение 1 мес.

7.5.3.2 Приготовление 5 %-ного раствора натрия гидроокиси

Для приготовления 5 %-ного раствора натрия гидроокиси 5 г натрия гидроокиси растворяют в 100 см 3 . Раствор хранят при комнатной температуре в течение месяца.

7.5.3.3 Образцы сыворотки крови и компоненты РСК и РДСК разводят 0.85 %-ным раствором хлористого натрия no 7.5.3.1. Сухой комплемент регидратируют и титруют по ГОСТ 16446.

Берут такое количество флаконов (ампул), в которых содержится необходимое для проведения всего опыта количество комплемента. 6 каждый флакон (ампулу) вносят 0,85 %-ный раствор хлористого натрия в объеме, указанном на этикетке, и. не встряхивая, помещают в холодильник на 20—30 мин. Растворившийся комплемент осторожно перемешивают путем легкого встряхивания флаконов (ампул), сливают в одну пробирку, смешивают и помещают в холодильник при температуре от 4 *С до 10 ®С. Непосредственно перед внесением в пробирки для титрования дегидратированный комплемент разводят 0.85 %-ным раствором хлористого натрия в соотношении 1:20. а остальной — хранят в холодильнике. Рабочее разведение комплемента также готовят непосредственно перед внесением в пробирки при постановке реакции. Рабочий титр комплемента должен быть на два интервала больше его титра.

Количество комплемента X. см 3 , необходимого для проведения опыта, рассчитывают по формуле

Гак как количество комплемента в рабочем разведении, требующемся для всей реакции (на 100 пробирок), равно 20 см 3 (0,2 • 100), то к 0,6 см 3 регидратированного комплемента добавляют 19,4 см 3 0,85 %-ноао раствора хлористого натрия.

Гемолитическую сыворотку титруют по ГОСТ 16445 при использовании каждой новой серии и по истечении срока годности.

Рабочий титр гемолитической сыворотки для РСК и РДСК составляет удвоенную дозу от титра. Так. если титр сыворотки равен 1:1500. то рабочий титр в РСК и РДСК будет 1:750.

Эритроциты барана — 2.5 %-ную взвесь эритроцитов барана в 0.85 %-ном растворе хлористого натрия для РСК и РДСК готовят из свежей или консервированной крови барана по ГОСТ 16446. Дефи-бринироеанкую кровь фильтруют через марлю и консервируют стрептомицином из расчета 1 г препарата. растворенного в 10—20 см 3 стерильного 0.85 %-ного раствора хлористого натрия, на 100 см 3 крови.

где А — рабочий титр комплемента, см 3 :

В — количество пробирок в опыте, шт:

20 — исходное разведение комплемента (1:20).

Консервированная кровь при хранении в холодильнике пригодна для использования, как правило, в течение 10—14 сут.

Гемолитическую систему готовят перед каждой постановкой РСК. Для этого 2.5 %-ную взвесь отмытых эритроцитов и раствор гемолитической сыворотки в рабочем разведении смешивают в равных объемах и при постановке РСК выдерживают в водяной бане при 37 *С—38 *С в течение 15—35 мин (в зависимости от объема и толщины стенок сосуда) при периодическом перемешивании, а при по» становке РДСК — в холодильнике. При смешивании компонентов раствор гемолитической сыворотки вносят во взвесь эритроцитов.

Исследуемые и контрольные (бруцеллезная и негативная) сыворотки крови крупного рогатого скота в исходном разведении 1:5 инактивируют в день постановки реакции в водяной бане: для РСК — при 60 °С—62 °С в течение 30 мин (сыворотки крови ослов и мулов — 64 °С—65 ®С. буйволов — 62 е С—64 в С. свиней — 58 в С—60 ’С); для РДСК — сыворотки крови животных всех видов — при 63 5 С—64 °С в течение 30 мин.

Рабочие разведения всех компонентов для РСК (РДСК) готовят перед постановкой реакции и проверяют их на антикомплементарные и гемотоксические свойства по следующей схеме, представленной в таблице 1.

Таблица 1 — Проверка ангикомплементарных и гемотоксических свойств компонентов реакций

Наименование и объем компонентов реакции, см 3

0.8S Ч-ным раствор хлористою натрия

Комплемент в разведении 1:20

Гемолитическая сыворотка в рабочем разведении

Антиген в рабочем разведении

0.85 %-ный раствор хлористого натрия

Водяная баня 10 мин при 37 *С—38 «С

Полная задержка гемолиза эритроцитов

В реакциях используют компоненты, не обладающие антикомплементарными и гемотоксическими свойствами.

7.5.4 Проведение исследования в РСК

При массовом исследовании постановку реакции проводят в одной пробирке е разведении сыворотки 1:5 с антигеном, при постановке в трех пробирках исследуемые сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (контроль на антикомплементарность сывороток), (таблица 2).

Необходимые разведения сывороток готовят следующим образом:

• при массовом исследовании в одной пробирке к 0.05 см 3 исследуемой сыворотки добавляют 0,2 см 3 0,65 %-ного раствора хлористого натрия (разведение 1:5);

• при постановке реакции в трех пробирках в первую вносят 0.1 см 3 исследуемой сыворотки, добавляют 0.4 см 3 0,85 %-ного раствора хлористого натрия (разведение сыворотки крови 1:5 в объеме 0,5 см 3 ) и смешивают. Из первой пробирки переносят 0,2 см 3 во вторую пробирку и 0.1 см 3 — в третью. В третью пробирку добавляют 0.1 см 3 0,85 %-ного раствора хлористого натрия (разведение 1:10).

Инактивироеание разведенных сывороток проводят в порядке, указанном е 7.5.3.3.

Сыворотку, 0,85%-ный раствор хлористого натрия и другие компоненты реакции вносят при помощи индивидуальных пипеток, (дозаторов), групповых дозаторов Флоринского или одноканальных пи-неточных дозаторов с наконечником.

Постановку реакции проводят по схеме, представленной в таблице 2.

При массовом исследовании

При исследовании о двух разведениях

пробирки с исследуемыми сыворотками (разведение)

пробирки для каждой исследуемом сыворотки (разведение)

Исследуемая сыворсгтка. см 3

0.65 %-ный раствор хлористого натрия, см 3

Водяная баня 30 мин при 58 ‘С—65 *С

0.85 %-ный раствор хлористого натрия, см 3

Антиген в рабочем разведении, см 3

Комплемент в рабочем разведении, см 3

Водяная баня 20 мин при 37 *С—38 *С

Гемолитическая система, см 3

Водяная баня 20 мин при 37 *С — 38 «С

Примечание — Допускается смешивание равных объемов рабочих разведений антигена и комплемента непосредственно перед внесением в пробирки.

При постановке реакции ставят следующие контроля:

• негативной и бруцеллезной сывороток в разведении 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (по схеме реакции);

• гемолитической системы (0,4 см 3 гемолитической системы и 0.6 см 3 0,85 %-ного раствора хлористого натрия) — полная задержка гемолиза;

— комплемента (0.2 см 3 комплемента в рабочем разведении. 0,4 см 3 0.85 %-ного раствора хлористого натрия и 0.4 см 3 гемолитической системы) — полный гемолиз;

• антигена (0.2 см 3 антигена в рабочем разведении. 0.2 см 3 комплемента в рабочем разведении. 0.2 см 3 0.85 %-ный раствор хлористого натрия и 0.4 см 3 гемолитической системы) — полный гемолиз.

При необходимости определения титра исследуемых проб сыворотки, разведения готовят следующим образом: в пробирки первого ряда (разведение 1:5) вносят по 0.8 см 3 0.85 %-ного раствора хлористого натрия. 0.2 см 3 пробы сыворотки и смешивают пилотированием. В пробирки третьего, четвертого. пятого и шестого рядов вносят по 0.2 см 3 0.85 %-ного раствора хлористого натрия. Пробы сыворотки из первого ряда пробирок вносят по 0.2 см 3 в пробирки второго и третьего рядов. 8 пробирках третьего ряда сыворотку смешивают, получая разведение 1:10; 0.2 см 3 разведения сыворотки вносят в пробирки четвертого ряда, смешивают, получая разведение 1:20. и так далее до шестого разведения 1:80. Из пробирок последнего ряда по 0.2 см 3 разведений сыворотки удаляют. В пробирки второго ряда вносят по 0.2 см 3 0.85 %-ного раствора хлористого натрия (ряд без внесения антигена — контроль антикомпле-ментарных свойств сыворотки). Постановку реакции проводят по схеме, представленной в таблице 2.

7.5.5 Реакция длительного связывания комплемента на холоде (РДСК)

7.5.5.1 Подготовка к исследованию

Сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и в разведении 1:5 без антигена (контроль на антикомплемектарность сыворотки), при массовом исследовании реакцию проводят в одной пробирке в разведении сыворотки 1:5 с антигеном. Инактиеироеание разведенных сывороток крови и приготовление гемолитической системы проводят по 7.5.3.3.

Комплемент применяют в рабочем разведении 1:25 или 1:20 при титре 0.06—0.1 или в разведении 1:20—1:15 при титре 0,1—0.14.

Одновременно определяют титр гемолитической системы с использованием свежей или консервированной сыворотки по схеме, приведенной в таблице 3.

Учет результатов титрования проводят немедленно после выемки штатива из водяной бани.

Сыворотка в разведении 1:5,см 3

Водяная баня 30 ыин при 63 *С—64 ’С

0.85 %-ный раствор хлористого натрия.

Антиген а рабочем разведении, см 3

Комплемент в рабочем разведении, см 3

Холодильник 16—18 ч при 2 *С—6 *С

Гемолитическая система, см 3

Водяная баня 20 мин при 37 *С—38 ‘С

Титром гемолитической системы считают наибольшее ее количество, в котором произошел пол* ный гемолиз в обоих рядах пробирок с негативной сывороткой или в безактигенном ряду, если исследуемая сыворотка оказалась позитивной. Рабочая доза на один интервал ниже (например, при титре гемолитической системы 0,7 см 3 , рабочая доза — 0.6 см 3 ).

7.5.S.2 Проведение исследования

внесение компонентов и последовательность постановки реакции проводят по схеме, приведенной в таблице 4.

При массовом исследовании

При исследоввнии в трех пробирках

пробирки с исследуемыми сыворотками (разведение)

пробирки для каждой исследуемой сыворотки (разведение)

0,85 %-ный раствор хлористого натрия

Водяная баня 30 мин при 63 *С—64 *С

0.85 %-ный раствор хлористого натрия

Антиген в рабочем раведении

Комплемент в рабочем разведении

Холодильник 2—6 *С 16—18 ч и 20 мин при комнатной температуре

Гемолитическая система в рабочей дозе

Водяная баня 20 мин при 37 *С—38 *С

При постановке реакции ставят контроли:

• негативная и бруцеллезная сыворотки в разведении 1:5 и 1:10 с антигеном и в разведении 1:5 без антигена;

• гемолитическая система в рабочей дозе без сыворотки, антигена и комплемента (0.6 см 3 гемо* литической системы и 0.6 см 3 0,85%-ного раствора хлористого натрия) — полная задержка гемолиза;

— антиген с 0,85 %-ным раствором хлористого натрия и гемолитической системой (0.2 см 3 анти* гена в рабочем разведении: 0.4 см 3 0.85 %-ного раствора хлористого натрия и 0.6 см 3 гемолитической системы) — полная задержка гемолиза.

7.5.6 Обработка результатов РСК и РДСК

Реакцию связывания комплемента и реакцию длительного связывания комплемента учитывают визуально. При постановке реакции в одной пробирке (при массовом исследовании) учет проводят один раз — сразу после извлечения штативов из водяной бани. При исследовании в трех пробирках — через 3—4 ч. когда в контрольных пробах с бруцеллезной сывороткой эритроциты осядут на дно пробирки. или на следующий день (в этом случае штативы с пробирками оставляют в холодильнике).

Результаты реакции оценивают в крестах по следующей схеме:

«+♦++» (четыре креста) — отсутствие гемолиза, надосадочкая жидкость прозрачная и бесцветная. осадок 100 % эритроцитов на дне пробирки;

«4+4» (три креста) — гемолиз 25 % эритроцитов, осадок 75 % эритроцитов:

«44» (два креста) — гемолиз 50 % эритроцитов, осадок 50 % эритроцитов:

«4» (один крест) — гемолиз 75 % эритроцитов, осадок 25 % эритроцитов;

«-» (минус) — гемолиз 100 % эритроцитов, осадок эритроцитов отсутствует, жидкость интенсивно окрашена гемоглобином.

Степень гемолиза эритроцитов при необходимости определяют по шкапе, которую готовят перед учетом реакции. Для этого из штатива выбирают пять пробирок с полным гемолизом, сливают их содержимое в одну и разводят по схеме, представленной в таблице 5.

Гемолизированная жидкость, см 3

0.85 %-ный раствор хлористого натрия, см 3

Процент гемолиза эритроцитов в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют путем сравнения со шкалой.

* положительной — при задержке гемолиза на два—четыре креста в одном или в двух разведениях сыворотки (1:5 или 1:10) и полном гемолизе эритроцитов в контрольной пробирке (без антигена);

— сомнительной — при задержке гемолиза с оценкой в один крест в одном или двух разведениях сыворотки и полном гемолизе эритроцитов в контрольной пробирке (без антигена);

— отрицательной — при полном гемолизе эритроцитов в двух или трех пробирках.

7.6 Реакция иммунодиффузии (РИД) с О-лолисахаридкым антигеном (О-ПС)

7.6.1 Сущность метода состоит в выявлении бруцеллезных антител, основанном на способности антитеп и антигена диффундировать в агаровом геле и при взаимодействии образовывать комплекс антиген-антитело, наблюдаемый в виде линии преципитации.

7.6.2 Приготовление 0,8 %-ного агар-агара и подготовка чашек Петри

Для приготовления 200 см 3 агара 17 г хлористого натрия и 1.6 г микробиологического агар-агара переносят в стеклянную колбу вместимостью 500 см 3 , добавляют 200 см 3 дистиллированной воды.

Колбу закрывают непромокаемым материалом (пергаментной бумагой, фольгой и т. л.) и помещают на водяную баню, которую также накрывают для предотвращения испарения воды при кипении водяной бани. Для полного расплавления агара колбу выдерживают в водяной бане в течение 35—45 мин с момента закипания воды. В чашки Петри, помещенные на горизонтальную поверхность, вносят по 14—18 см 3 расплавленного агара. Чашки оставляют в течение 1 ч с приоткрытыми крышками. После застывания агара чашки Петри закрывают крышками и помещают в холодильник при температуре от 2 *С до 8 ®С. хранят не более 5 сут.

При помощи штампа в геле агара делают отверстия (лунки). В каждой чашке прорезают не менее шести семилуночных розеток, каждая из которых состоит из семи лунок: одна лунка в центре диаметром 3 мм. остальные шесть лунок диаметром 5 мм по окружности, расстояние между центральной и периферическими лунками — 3 мм. Образовавшиеся диски геля удаляют из лунок канюлей, соединенной с вакуумным или водоструйным насосом (или любым другим способом).

7.6.3 Проведение исследования

7.6.3.1 В РИД с О-ПС антигеном исследуют на бруцеллез сыворотку крови крупного и мелкого рогатого скота и северных оленей с целью дифференциации животных, инфицированных от вакцинированных: для дифференциации неспецифических реакций, обусловленных родственной с бруцеллами микрофлорой, в том числе иерсиниями.

Для исследования используют сыворотки крови животных неконсервированные и консервированные. Не консервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 сут со дня взятия крови при условии хранения их при температуре от 4 *С до 8 *С. Сыворотки, консервированные фенолом или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 сут; замороженные сыворотки — в течение 3 сут после однократного оттаивания. Мутные, проросшие, гемолизировакные сыворотки исследованию на бруцеллез не подлежат.

7.6.3.2 Реакцию иммунодиффузии проводят в чашках Петри. В центральную лунку вносят 0.02 см 3 О-ПС антигена, а в периферические — по 0.04 cm j исследуемых сывороток крови.

На каждой чашке Петри ставят контроль с положительной бруцеллезной сывороткой (лреципити-рующей).

После внесения компонентов чашки Петри закрывают крышками и помещают во влажную камеру (эксикатор) и выдерживают при температуре от 18 *С до 26 *С.

7.6.4 Обработка результатов

7.6.4.1 Учет результатов проводят визуально в косом проходящем свете с помощью осветителя через 24 и 48 ч после постановки реакции.

Линии преципитации между лунками с антигеном и исследуемой сывороткой, сформировавшиеся через 24 ч. свидетельствует о положительной реакции.

Сыворотки крови, давшие линию преципитации через 48 ч. подлежат повторному исследованию.

Линии преципитации, сформировавшиеся через 24 или 48 ч при повторном исследовании, свидетельствуют о положительной реакции.

При получении положительного результата в реакции иммунодиффузии, животное признают больным бруцеллезом.

7.6.4.2 Применение РИД с О-ПС антигеном при диагностике бруцеллеза

а) крупного рогатого скота в случаях:

1) в благополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых не применяли вакцины против бруцеллеза. исследуют сыворотки крови животных, сомнительно или положительно реагирующие в РА и (или) РСК (РДСК);

2) в благополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых животных вакцинируют против бруцеллеза агглютиногенными вакцинами:

• для контроля эпизоотического состояния по бруцеллезу животных не ранее чем через 1,5 мес после вакцинации;

— для дифференциации положительных реакций, полученных в РА (не выше 200 ME) или (и) РСК (РДСК) не выше чем в разведении 1:10 по истечении 6 мес после введения вакцины;

3) в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых животных вакцинируют против бруцеллеза агглютиногенными вакцинами:

• через 1.5 мес и далее един раз е месяц в течение 6 мес после иммунизации или реиммунизации с целью раннего выявления больных бруцеллезом животных:

• через 6 мес после иммунизации (реиммунизации) для оздоровления стада от бруцеллеза в ком* плексе мероприятий, предусмотренных по профилактике и борьбе с бруцеллезом;

б) северных оленей в случаях:

1) в благополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых противобруцеллеэные вакцины не при* меняют. Исследуют сыворотки крови животных, сомнительно или положительно реагирующие в РА и (или) РСК (РДСК);

2) в благополучных по бруцеллезу хозяйствах, где животных иммунизируют против бруцеллеза агглютиногенными вакцинами:

• для контроля эпизоотического состояния по бруцеллезу животных не ранее чем через 1,5 мес после вакцинации:

• для дифференциации положительных реакций, полученных в РА не выше 50 МЕ/см 3 и (или) в РСК (РДСК) не выше чем в разведении 1:5 по истечении 6 мес после введения вакцины;

3) в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых вакцинируют против бруцеллеза агглю-тиногенными вакцинами:

• через 1.5 мес и далее один раз в месяц в течение 6 мес после иммунизации или реиммунизации с целью раннего выявления больных бруцеллезом животных;

— через 6 мес после иммунизации (реиммунизации) для оздоровления стада от бруцеллеза в комплексе мероприятий, предусмотренных по профилактике и борьбе с бруцеллезом;

1) в благополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота хозяйствах, где противобруцеллезные вакцины не применяют:

• при исследовании сыворотки крови животных, сомнительно и положительно реагирующих в РА или (и) РСК (РДСК):

2) в благополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота хозяйствах, где проводится иммунизация животных противобруцеллезными агглютиногенными вакцинами:

— для дифференциальной диагностики бруцеллеза овец и коз не ранее чем через 5 мес. только после однократной их иммунизации противобруцеллезными агглютиногенными вакцинами:

— для дифференциации неспецифических реакций, обусловленных родственной с бруцеллами микрофлорой, в том числе и иерсиниями:

3) в неблагополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота хозяйствах:

• с целью более раннего выявления больных бруцеллезом животных не ранее чем через 5 мес. только после однократной иммунизации противобруцеллезными агглютиногенными вакцинами;

• при снятии ограничений с неблагополучных по бруцеллезу хозяйств одновременно с РБП или РА. РСК (РДСК).

7.7 Реакция иммунодиффузии (РИД) с /^-бруцеллезным антигеном при диагностике

бруцеллеза собак, вызываемым B.canis

7.7.1 Подготовка к исследованию

7.7.1.1 Приготовление 0.85 %-ного раствора хлористого натрия

В 1 дм 3 дистиллированной воды растворяют соответственно 8.5 г хлористого натрия. Растворы фильтруют дважды через бумажный фильтр. Растворы хранят в стеклянных бутылях, укупоренных резиновыми пробками при температуре от 2 *С до 20 в С и используют в течение 1 мес.

7.7.1.2 Приготовление 0,8 %-ного геля агара по 7.6.2

7.7.1.3 Пробы сыворотки крови от собак исследуют в РИД в свежем или консервированном виде.

7.7.2 Проведение исследования

Для постановки реакции иммунодиффузии используют биологические чашки Петри разного диаметра. Для исследования до четырех проб — диаметром 40 мм. для исследования 6—40 проб — диаметром 90 мм.

В центральную лунку геля вносят 0.02 см 3 антигена, в периферические — по 0,04 см 3 исследуемых проб сыворотки крови.

В каждой чашке ставят контроль антигена с негативной и Я-бруцеллвзной сывороткой для РИД.

Внутрь крышки каждой чашки вкладывают фильтровальной бумагу, вырезанную по размеру ее наружного диаметра, которую увлажняют фенолизированным 0.85 %-ным раствором хлористого натрия. Чашку плотно прикрывают крышкой и оставляют при температуре от 18 4 С до 26 *С.

7.7.3 Обработка результатов — по 7.6.4.

7.8 Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

Метод основан на выявлении бруцеллезным эритроцитарным антигеном специфических антител в сыворотке крови больных бруцеллезом животных или иммунизированных вакцинами против бруцеллеза животных.

7.8.2 Подготовка к исследованию

7.8.2.1 Приготовление 1 %-ного раствора хлорамина

Для приготовления 1 %-ного раствора хлорамина 1 г хлорамина растворяют в 100 см 3 водопроводной воды. Раствор используют свежеприготовленным.

7.8.2.2 Приготовление хромовой смеси

8 фарфоровую чашку вместимостью 300—500 см 3 помещают 5 г тонкоизмельченного в фарфоровой ступке двухромоеокислого калия или 6 г бихромата натрия, добавляют 100 см 3 концентрированной технической серной кислоты и осторожно нагревают на водяной бане до полного растворения двухромоеокислого калия (бихромата натрия). Хромоеую смесь хранят при комнатной температуре до момента изменения цвета с темно-оранжевого до темно-зеленого.

7.8.2.3 Подготовка планшетов

Планшеты подготавливают к работе следующим образом: новые, погружают на 20—30 мин в теплый раствор с моющим средством и каждую лунку моют в этом растворе вращательным движением ватной или ватно-марлевой пробки. Ершом не пользуются, во избежание повреждения поверхности лунки. Затем планшеты не менее 6 раз промывают проточной водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и сушат при комнатной температуре или в термостате.

Допускается обработка планшетов хромовой смесью в течение одних суток, затем их промывают проточной водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и сушат.

При работе лицо. руки, одежду защищают от попадания хромовой смеси.

Реакцию ставят на 0,85 %-ном растворе хлористого натрия. Сыворотку бруцеллезную сухую реги-дратируют дистиллированной водой или 0,85 %-ным раствором хлористого натрия.

7.8.3 Проведение исследования

Крупный рогатый скот, иммунизированный против бруцеллеза, исследуют в сроки, предусмотренные инструкциями по применению вакцин.

Мелкий рогатый скот, иммунизированный против бруцеллеза, в РНГА не исследуют.

Реакцию ставят с использованием набора для серологической диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота для РНГА.

Реакцию проводят в объеме 0,55 см 3 (0.5 см 3 разведения сыворотки и 0,05 см 3 антигена) в пробирках Флоринского.

При массовых исследованиях постановку реакции можно проводить с использованием исследуемых сывороток в одном (исходном) разведении. После прогревания исследуемые и контрольные сыворотки по 0,25 см 3 вносят е лунки планшетов и добавляют в них по 0.25 см 3 0.85 %-ного раствора хлористого натрия.

8 каждую лунку с разведением сыворотки вносят по 0,05 см 3 антигена в рабочем разведении.

Содержимое лунок перемешивают до получения равномерной взвеси антигена в сыворотке, выдерживают при температуре от 18 в С до 26 *С в течение 3—4 ч и проводят учет реакции.

Сыворотки от неиммунизировакного или иммунизированного неагглютиногенными противобру-целлезными вакцинами крупного рогатого скота исследуют с разведения 1:50. Исходное разведение 1:25 готовят путем внесения 0.1 см 3 сыворотки в пробирки, содержащие 2.4 см 3 0.85 %-ного раствора хлористого натрия.

Сыворотки от крупного рогатого скота, иммунизированного агглютиногенными протиеобруцеплезкыми вакцинами, исследуют с разведения 1:100. Исходное разведение 1:50 готовят путем внесения 0.1 см 3 сыворотки в пробирку с 4.9 см 3 0.85 %-ного раствора хлористого натрия или по 0.05 см 3 сыворотки и 2.45 см 3 0,85 %-ного раствора хлористого натрия, если используются пробирки вместимостью до 5 см 3 .

Сыворотки от мелкого рогатого скота исследуют с разведения 1:25. Исходное разведение 1:12.5 готовят путем внесения 0.2 см 3 сыворотки в пробирки, содержащие 2.3 см 3 0.85 %-ного раствора хлористого натрия.

Одновременно с исследуемыми сыворотками аналогично готовят разведения контрольных сывороток: бруцеллезной и негативной.

Исследуемые и контрольные сыворотки в исходных разведениях в пробирках выдерживают в водяной бане, нагретой до вО в С —62 *С в течение 30 мин.

При получении положительного результата исследования сыворотки крови животных в одном разведении. для определения титра гемагглютининов в РНГА постановку реакции проводят в четырех разведениях. при атом исходное разведение каждой сыворотки готовят заново.

Все сыворотки (исследуемые и контрольные> проверяют на отсутствие гемагглютинирующих свойств.

В лунки первого, второго, третьего и четвертого рядов планшета вносят по 0.5 см 3 и пятого ряда по 0,25 см 3 0,85 %-ного раствора хлористого натрия.

В лунки первою ряда добавляют по 0.5 см 3 , а в лунки пятого ряда по 0.25 см 3 исследуемых и контрольных сывороток в исходном разведении. После смешивания путем пипетирования по 0.5 см 3 разведенных сывороток из лунок первого ряда переносят в лунки второго ряда, из лунок второго — в лунки третьего, из лунок третьего — в лунки четвертого, из лунок четвертого ряда по 0.5 см 3 разведенных сывороток удаляют.

Во все лунки первых четырех рядов с разведенными сыворотками добавляют по 0.05 см э антигена в рабочем разведении, которое готовят путем смешивания равных объемов антигена и 0.85 %-ного раствора хлористого натрия. В лунки пятого ряда вносят 0,05 см 3 взвеси несенсибилиэированных эритроцитов в рабочем разведении (один объем несенсибилизированных эритроцитов ♦ один объем 0.85 %-ного раствора хлористого натрия).

Содержимое лунок перемешивают путем легкого постукивания по краю планшета до получения равномерной взвеси антигена в сыворотке, выдерживают при температуре от 18 *С до 24 °С в течение 3—4 ч и проводят учет реакции.

Результат контроля на самоагглютинирующие свойства исследуемых и контрольных сывороток должен быть отрицательным.

Допускается постановка реакции в два этапа: накануне готовят исходные разведения исследуемых и контрольных сывороток крови, прогревают при указанном выше режиме, хранят при температуре от 2 *С до 8 в С и на следующий день исследуют.

После постановки реакции планшеты выдерживают в 1 %-ном растворе хлорамина или другом антисептическом растворе 1.5—2,0 ч. Впоследствии их моют, как указано выше.

7.8.4 Обработка результатов

Реакции учитывают визуально и оценивают в крестах по следующей схеме:

«++♦+» (четыре креста)— 100 %-ная агглютинация эритроцитов, агглютинат в виде хорошо выраженного «зонтика» покрывает все дно лунки, возможно сползание и заворачивание краев агглютината в виде «зонтика»:

«+♦♦» (три креста) — 75 %-ная агглютинация эритроцитов, агглютинат а виде хорошо выраженного «зонтика» меньшего диаметра, чем при оценке реакции на четыре креста. 8 центре лунки возможно образование с трудом различаемого кольца из осевших неагглютинировакных эритроцитов:

«++» (два креста) — 50 %-ная агглютинация эритроцитов, осевшие неагглютинированные эритроциты образуют на дне лунки ровное кольцо с зернистостью вокруг него:

«+» (один крест) — на дне лунки кольцо коричнево-красного цвета:

«-» (минус) — эритроциты оседают в виде компактной «пуговки» или колечка.

За титр антител принимают наибольшее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация эритроцитов с оценкой четыре или три креста. Реакции с оценкой два креста («++»). один крест («♦») и минус («-») считают отрицательными.

7.9 Иммукоферментный анализ (ИФА)

Сущность метода заключается в выявлении а образце сыворотки крови животных иммуноглобулинов класса G к бактериям рода Brucella.

7.9.1 Подготовка к исследованию

7.9.1.1 Приготовление растворов кислоты серной концентрацией 1 моль/дм 3 и кислоты соляной концентрацией 1 моль/дм 3 по ГОСТ 25794.1 (пункт 2.1).

7.9.1.2 Приготовление рабочего раствора ФСБ-Т

ФСБ-Т — концентрированный раствор буфера (флакон No 1) разводят в 25 раз дистиллированной водой и тщательно перемешивают. Для этого содержимое одного флакона концентрата в объеме 26 см 3

переносят в мерную колбу и доводят объем до 650 см 3 дистиллированной водой. Если в концентрате присутствуют кристаллы, то его перед разведением нагревают и тщательно взбалтывают. 6 случае использования одного или нескольких стрипов планшета в чистый флакон отбирают необходимое для данного исследования количество составных частей ФСБ-Т в соответствии с таблицей 6.

Таблица б — Разведения ФСБ-Т

Количество используемых стрипов

Вола дистиллированная, см 3

Допускается хранить неиспользованный рабочий раствор ФСБ-Т в течение 5 сут в холодильнике при температуре от 2 в С до 8 в С.

Все остальные компоненты набора для ИФА по 5.3 готовы к употреблению.

Окисляющие агенты, ионы металлов, моющие средства на посуде могут разлагать ТМБ-субстрат. Во избежание ложных результатов необходимо тщательно отмывать посуду раствором кислоты серкой концентрацией 1 моль/дм 3 или кислоты соляной концентрацией 1 моль/дм 3 с последующей тщательной отмывкой водой дистиллированной.

7.9.2 Проведение исследования

7.9.2.1 Для исследования сывороток крови в ИФА отбирают необходимое количество стрипов. нумеруют их в соответствии с описью исследуемых проб водостойким маркером из-за возможного выпадения из рамки-держателя во время тестирования. Оставшиеся стрилы хранят в полиэтиленовом пакете с влагопоглотителем, при температуре от 2 *С до 8 °С.

7 9.2.2 Для внесения контрольных сывороток можно использовать любые лунки планшета. Для этого в лунку вносят по 100 мм 3 К+ (флакон № 4). в две другие лунки планшета — по 100 мм 3 К- (флакон No 5). 6 остальные лунки планшета вносят по 60 мм 3 РБР-С (флакон No 2). При постановке ИФА на одном стрипе допускается использовать для К- и К+ по одной лунке.

7.9.2.3 В остальные лунки планшета с РБР-С вносят по 20 мм 3 исследуемых сывороток. Раствор перемешивают пять раз пилотированием, не касаясь дна лунки, цвет РБР-С должен измениться: происходит незначительное просветление раствора.

7.9.2.4 После внесения проб сывороток планшет помещают в пластиковый пакет или накрывают крышкой и инкубируют 30 мин при температуре 37 ‘’С. После инкубации лунки освобождают от содержимого резким встряхиванием и пять раз промывают рабочим раствором ФСБ-Т. добавляя каждый раз по 300 мм 3 раствора в лунку, и выждав определенное время (от 30 с до 1 мин), вытряхивают содержимое. Во время обработки большого количества планшетов можно оставлять их с промывочным раствором до 20 мин. Затем планшет подсушивают постукиванием по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге. Во все используемые лунки планшета вносят по 100 мм 3 раствора конъюгата (флакон N9 3); планшет помещают в пластиковый пакет или накрывают крышкой и выдерживают 30 мин при температуре 37 *С.

После повторной инкубации проводят процедуру промывания лунок рабочим раствором ФСБ-Т по описанной выше методике. После промывки во все используемые лунки планшета вносят по 100 мм 3 раствора ТМБ-субстрата (флакон № 6) и выдерживают 15 мин при температуре 37 *С в темноте. По истечении указанного времени реакцию останавливают добавлением в каждую используемую лунку по 50 мм 3 стоп-реагента (флакон № 7).

7.9.3 Обработка результатов

Результаты ИФА регистрируют на спектрофотометре. Оптическую плотность измеряют при длине волны 450 нм. Нулевой уровень задают по воздуху. Результаты учитывают только в том случае, если в лунках с К- среднее значение оптической плотности (К-) не более 0,2 ед. о. п.. а разница средних значений оптической плотности между (К+) и (К-) превышает 0.35 ед. оптической плотности.

Если значение оптической плотности исследуемого образца не превышает 0.3 ед. о. п.. то результат анализа считают отрицательным (/g G к бактерии рода Brucella не определены).

Если значение оптической плотности исследуемого образца сыворотки попадает в интервал от 0.3 до 0.9 ед. о. п.. то результат анализа сомнительный. Рекомендуется повторить исследование такой

сыворотки, а в случае повторного сомнительного результата — провести исследование сыворотки, полученной из крови, взятой от данного животного повторно через 15—30 сут.

Если значение оптической плотности исследуемого образца превышает 0.9 ед. о. л., то результат анализа положительный.

Примечание —Для проведения ИФА могут применяться коммерческие тест-системы, использование которых проводится по инструкции производителя после валидации методики в лаборатории.

7.10 Иммунохроматографический анализ (ИХА)

Сущность метода заключается в выявлении специфических антител к липололисахаридному антигену Brucella abortus и Brucella melitensis. содержащихся е сыворотке крови крупного рогатого скота и овец.

7.10.2 Подготовка к исследованию

Перед началом работы компоненты набора и анализируемые пробы сыворотки крови выдерживают в течение 30 мин при температуре от 18 ‘С до 25 *С.

7.10.3 Проведение исследования

7.10.3.1 Метод ИХА применяют для серологического исследоваютя невакцинироеованного крупного и мелкого рогатого скота: крупного рогатого скота, вакцинированного неагглютиногенными (из штамма В. aborus КВ17/100 или аналогичными) или слабоагглютиногенными бруцеллезными вакцинами (из штаммов в. abortus 82.75/79-АВ или аналогичными), но не ранее чем через 8 мес после введения вакцины.

7.10.3.2 Для исследования используют пробы сыворотки крови животных с4-месячного возраста без признаков гемолиза и бактериальной контаминации, объемом не менее 0.5 см 3 .

7.10.3.3 Пробы сыворотки крови животных исследуют в разведении 1:5 с использованием компонента К2. Для этого во флаконы с компонентом К2. пронумерованные е соответствии с количеством исследуемых проб, добавляют по 0.2 см 3 каждой исследуемой пробы сыворотки крови и перемешивают.

7.10.3.4 Компонент К1 извлекают из пакета и каждую тест-полоску в вертикальном положении (по стрелкам, направленным вниз) погружают до уровня ограничительной линии в подготовленную по

Через 10 мин тест-полоски извлекают из флаконов и помещают в горизонтальном положении маркированной стороной вверх на чистую сухую, не поглощающую влагу поверхность (эмалированный или металлический кювет).

Через 30 мин после начала анализа (но не позднее 40 мин) визуально учитывают результаты реакции.

источник