Одним из наиболее распространенных заболеваний крупного рогатого скота является бруцеллез у коров. Бруцеллез может также диагностироваться у овец, коз и свиней, но среди домашней птицы не встречается. Что немаловажно, бруцеллез у КРС может быть источником опасности для человека, передаваясь в случае контакта последнего с болеющим животным либо посредством употребления в пищу молока и мяса от зараженного скота. Лечением бруцеллеза у коров заниматься не рекомендуется, так как оно не приносит желаемых результатов, а ухудшает симптомы и сложившуюся карантинную ситуацию.
Бруцеллез по-иному еще называют мальтийской лихорадкой (в некоторых случаях — козьей лихорадкой), а провоцируется эта болезнь посредством одноименной бактерии, природа которой в первый раз была обнаружена у мальтийского козла и описана в 1887 году врачом в военной области Д.Брюсом.
Устойчивая к окружающей среде бактерия способна быть активной на протяжении до 2-х месяцев с момента попадания в организм животного. В шерстяном покрове КРС она остается живучей не менее 4-х месяцев. При нахождении в почвенных слоях бруцелла остается жизнеспособной на протяжении до 3,5 месяцев.
Бактерия рода бруцелла инфицирует человеческий организм посредством проникновения через кожные и слизистые покровы, через дыхательные пути. Употребление в пищу зараженных продуктов приводит к заболеванию по причине того, что инфекция длительное время остается активной в воде и непастеризованном молочном продукте.
В группу риска заболевания бруцеллезом входят работники сельского хозяйства, напрямую контактирующие с животными, среди которых ветеринарные врачи, доярки, фермеры.
В организме коров бруцеллез начинает развиваться после попадания до 10 и большего количества микробов через микротрещины на коже и слизистых, в пищеварительные органы — через комбикорма и питьевую воду, в дыхательные органы — от тесного общения с болеющими особями. Попавший в организм посредством открытой раны возбудитель бруцеллеза проходит по лимфатической системе, впоследствии попадая в кровь теленка или коровы.
При повышенных температурах в пределах от 60 до 65°С бруцелла гибнет после 15 минут — получаса, при достижении температуры кипения гибель инфекции происходит моментально. При пониженных температурах способность к активности бруцелла может сохранять до 7 суток в молоке, в замороженных мясных продуктах она сохраняется на протяжении 5 месяцев. Губительное воздействие на инфекционный процесс оказывают прямые солнечные лучи и дезинфицирующая химобработка.
Бруцеллез у коров может протекать в одной из 3-х форм, в том числе:
- остро проявляющейся, которая продолжается от 1 до 2 месяцев, и ее течение зависит от состояния иммунной системы конкретного животного,
- подострая стадия заболевания проявляется в течение 3 месяцев,
- при хроническом состоянии возбудитель болезни в организме животного прогрессирует от 3 и более месяцев.
Патогенез бруцеллеза чаще всего имеет хроническую форму проявления болезни.
При возникновении бруцеллеза у коров наблюдается специфическая для болезни симптоматика:
- понижение у скота аппетита и активности, снижение продуктивных показателей.
- воспаление суставов на передних конечностях (бурсит), абсцессы на задних конечностях, вид которых можно видеть на фото,
- часто встречающиеся у телок выкидыши, насчитывающие в расчете на стадо до 50-90%, чаще происходящие на сроках около 7 месяцев,
- рождение мертвых либо нежизнеспособных телят, задержка в выходе плаценты при отеле,
- в редких случаях — повышенная температура тела у коров,
- у заболевших быков наблюдается орхит.
В процессе протекания бруцеллеза у коров отмечается потеря веса. Иногда инфекция приводит к сопутствующему появлению у животных эндометрита. При слишком пониженном иммунитете животных, сопровождающемся некачественными условиями содержания и питания, наличии других инфекций, теленок или корова по причине бруцеллеза может погибнуть.
Из-за того, что инфекция распространяется среди крупного рогатого скота быстрыми темпами, если появились первые симптомы, лечение не проводится: для предотвращения более тяжелых последствий прибегают к санитарному убою животных.
Симптомы у коров при наличии бруцеллеза довольно размытые, поэтому зачастую лишь по одним явным признакам диагностировать болезнь не представляется возможным. Для постановки точного диагноза проводятся лабораторные исследования.
Заподозрить недуг ветеринар либо сам хозяин может по участившимся случаям выкидышей у животных. Для точной постановки диагноза делают выбор в пользу лабораторных исследований, которые могут быть проведены:
- бактериологическим методом,
- серологическим методом,
- аллергическим методом.
В качестве материала для диагностики и проведения исследования берется абортированный зародыш либо молоко или кровь от коровы.
Реакция агглютинации Райта — наиболее доступный способ определить наличие бруцеллеза у животного, в процессе которого проводят контроль взятого на реакцию антигена.
Для выявления возбудителя болезни в организм животного вводится абортин, по реакции на который спустя сутки, иногда через 2, но не позднее 3 изучается и делается вывод о наличии или отсутствии недуга. В случае положительной реакции отмечается припухлость в месте ввода препарата. Однако при применении такого способа нельзя не забывать о том, что в случае перенесенного коровой бруцеллеза животное будет выдавать положительную реакцию на препарат и дальше.
Лечение коров от инфекции до сих пор не подтвердило своею эффективность, действенных препаратов против недуга не найдено. Наиболее действенным способом в борьбе с заболеванием бруцеллеза коров с целью сохранить здоровое поголовье является не стремление вылечить животных, а санитарный убой больных особей, если есть поставленный диагноз.
Снизить риск появления в хозяйстве болезни можно путем проведения профилактических мероприятий.
Вакцинация до сих пор является наиболее действенным способом избежать бруцеллеза по сравнению с попытками лечить животных. Вакцина прививается на добровольных началах ежегодно.
Содержание животных должно отвечать необходимым санитарно-гигиеническим требованиям, которые предполагают тщательную дезинфекцию коровников, где есть болеющие особи и своевременное отселение заболевших животных. При появившихся случаях выкидышей у коров здоровые особи переселяются в другие изолированные помещения, чтобы останки от абортированных трупов не попали в их организм с водой и кормами.
Характерный для КРС бруцеллез опасен для человека. В результате попадания инфекции при употреблении молока или мяса от заболевшего животного у человека под воздействием возбудителя болезни нарушается работа сердца, сосудов, пищеварительной системы, мочевыделительных органов.
В целях профилактики в отношении приобретаемых в эпидемиологически неблагоприятных условиях и районах по бруцеллезу молочных и мясных продуктов можно и нужно предпринимать ряд дополнительных мер, в том числе следующие методы обработки:
- подвергать мясо термической обработке на протяжении не менее 3-4 часов,
- доводить молоко до кипения и кипятить не менее 10 минут,
- изготавливать из молока продукты только после его пастеризации.
У человека симптомы болезни проявляются не ранее 2-3 недель после попадания возбудителя в организм. Иногда данный период проявления инфекции затягивается до месяца. Первыми признаками станут:
- слабость и недомогание,
- повышенная температура,
- появившиеся болевые ощущения в височной области,
- ломота в суставах,
- быстрая потеря веса,
- возникновение постоянного желания пить.
Протекание бруцеллеза у человека и характерные симптомы прослеживаются на протяжении до 4 месяцев, в течение которых проводится лечение. При этом можно наблюдать обострившийся период инфекции, какой проходит в виде повышения температуры до 40°С, усилении болей, нередко возникает потеря сознания вследствие нарушения работы нервной системы отмечаются галлюцинации.
Чаще всего бруцеллезом болеют мужчины в возрастной категории от 25 до 35 лет. Соотношение заболевшего мужского пола по отношению к женскому составляет приблизительно 6:2. Случаи заболевания у детей отмечаются редко: до 2%.
источник
Возбудитель бруцеллеза поражает опорно-двигательный аппарат коровы. Инфекция оказывает негативное влияние на репродуктивную функцию скота. Патогенные микроорганизмы могут передаваться от животных к человеку через мясо и молоко. Бруцеллез у коров называют также мальтийской лихорадкой. Вредоносные бактерии способны сохранять болезнетворные свойства в течение 2-4 месяцев.
Вредоносные бактерии могут присутствовать в воде и корме. Патогенные микроорганизмы попадают на слизистую животных через предметы ухода. Заводчику необходимо постоянно следить за чистотой инвентаря. Инфекция может присутствовать в фекалиях животных. Чаще всего бруцеллез поражает стадо в пастбищный период.
Важно! Инфекция передается при контакте с больными особями. Вспышки заболевания возникают после завоза новых животных.
В организм крс болезнетворные бактерии проникают через микротрещины на коже и слизистых. Животные заболевают после поедания комбикорма, содержащего возбудителей бруцеллеза. Патогенные микроорганизмы могут присутствовать в питьевой воде. Инфекция передается через органы дыхания. При подозрении на бруцеллез необходимо немедленно изолировать больных коров.
Существует риск заражения бруцеллезом специалистов, которые работают со скотом. Бактерии способны проникать в организм человека через кожу. Патогенные микроорганизмы могут попасть в дыхательную систему человека.
Различают 3 формы бруцеллеза:
- Острая стадия длится в течение 1-2 месяцев.
- Продолжительность подострой стадии составляет 3 месяца.
- При отсутствии лечения заболевание переходит в хроническую форму.
Бруцеллез можно распознать по следующим признакам:
- животное теряет аппетит;
- у него снижаются продуктивные показатели;
- у коровы воспаляются суставы на конечностях;
- инфекция проникает в половые органы и вызывает увеличение количества выкидышей;
- больное животное с трудом передвигается по пастбищу.
Вредоносные бактерии влияют на развитие плода. У коров рождаются нежизнеспособные телята. У некоторых особей повышается температура. Бруцеллез крс приводит к резкой потере веса. Снижение иммунитета увеличивает скорость распространения инфекции.
У коров, зараженных после покрытия, чаще всего рождается нормальный приплод. Выкидыши происходят на 5-8 месяц беременности. За несколько дней до родов у коров начинаются обильные гнойные выделения. После аборта можно заметить признаки эндометрита.
В семенниках быков начинается воспалительный процесс. Повреждение тканей половых органов приводит к бесплодию. Его можно распознать по снижению удоев и падению веса. Ветеринары просто не успевают вылечить больное животное.
Важно! Инфекция способна за короткое время поразить всё стадо. В особо тяжелых случаях владельцы вынуждены прибегать к санитарному убою.
Чтобы выявить возбудителя, специалисты применяют бактериологический метод. Исследование на бруцеллез заключается в проведении серологического анализа. В лабораторию направляют пробы крови, которые берут у больных животных. Для постановки диагноза используются также истечения из родовых путей.
В случае убоя специалисты изучают пораженные суставы и семенники. Инфекцию выявляют за счёт аллергической реакции Райта. При этом специалисты используют антиген, который вызывает у зараженного животного положительную реакцию.
В качестве материала используются ткани зародыша, молоко или кровь больного животного. В тело коровы вводится Абортин. По реакции на этот препарат можно с высокой точностью поставить диагноз.
Избавиться от инфекции можно за счёт антибактериальных препаратов. Ветеринары добиваются положительного эффекта за счет применения следующих средств:
- Рифампицин;
- Левомицетин;
- Стрептомицин;
- Тетрациклин.
Антибиотики препятствуют развитию инфекции на начальной стадии заболевания. При появлении первых признаков заражения необходимо провести вакцинацию всего стада.
Важно! Хроническая форма бруцеллеза практически не поддается лечению. Для предотвращения распространения инфекции в стаде используется вакцина против бруцеллеза.
Избежать инфицирования коров можно, если провести вакцинацию всего стада. Следите за поведением поголовья. При появлении первых признаков бруцеллеза необходимо отделить больное животное от основного стада.
Заболевание может быть связано с неправильным хранением кормовых запасов. Необходимо уделять внимание условиям содержания животных. Заводчик должен принимать меры для повышения иммунитета коров. Эти методы способны предотвратить заражение опасной инфекцией.
Важно! Особое внимание нужно уделить содержанию молодняка. После выкидышей необходимо провести дезинфекцию всех предметов. Стойло лучше всего сжечь. Пол и стены помещения обрабатывают хлорной известью.
Бактерии бруцеллеза проявляют высокую устойчивость во внешней среде. Заболевание передается не только через корм и воду. Возбудители проникают в организм коров через поврежденные слизистые во время контакта с больными особями. Чтобы предотвратить заражение опасной инфекцией, рекомендуется проводить вакцинацию всего стада.
источник
Тема нашего сегодняшнего разговора – бруцеллез у коров. Это острое инфекционное заболевание, вызванное особым родом бактерий – Brucella. Болезнь распространяется чрезвычайно быстро, поражая почти все стадо за короткий промежуток времени. Как правило, заражение происходит через общие водопои и кормушки, а также воздушно-капельным путем. Бруцеллезу подвержены не только коровы, но также козы, лошади, свиньи. Кроме того, способен заболеть и человек из числа тех, кто постоянно контактирует с животными или употребляет в пищу мясо и молоко от больного скота.
Другое название бруцеллеза – мальтийская лихорадка. Болезнь была обнаружена и описана британским военным врачом Брюсом в 1887 году. Среди бактерий Brucella существует четыре вида – melitensis, bovis, suis и canis, которые опасны для здоровья человека. По форме они относятся к палочковидным бактериям. Далее в тексте речь пойдет, в основном, о Brucella bovis – бычьей бруцелле.
Они особо опасны для коров и очень живучи, способны жить в почве в течение 110 дней, в навозе – примерно от одного до двух месяцев. Охлаждение и заморозка не убивает бруцелл, а позволяет успешно сохраняться в ожидании последующей разморозки. Нагревание, вплоть до 100 градусов Цельсия, способно убить эти бактерии мгновенно, до 60 градусов – за полчаса. Также они погибают под воздействием прямого солнечного света и при обработке дезинфицирующими средствами.
Как правило, бруцеллез у КРС возникает при попадании в организм коровы от 10 бактерий. Среди путей проникновения инфекции можно выделить различные микротравмы, слизистые оболочки, и, прежде всего, ротовую полость, дыхательные пути. Особо опасны коровы, пережившие выкидыш. Бруцеллы в огромных количествах содержатся в околоплодных водах и плаценте. Заражен также и мертворожденный теленок. Весьма вероятным является распространение через общие кормушки, водопои, подстилку и предметы ухода.
Бруцеллы содержатся в мясе и молоке больного животного, поэтому употребление их в пищу без предварительной обработки может быть опасно для человека. Также через мельчайшие порезы и ссадины на коже могут заразиться представители профессий, непосредственно контактирующие с крупным рогатым скотом. Например, доярки, пастухи, ветеринары, работники скотобоен, мясокомбинатов и молочных производств.
Бактерия не выживает на открытом воздухе, поэтому аэрогенное распространение исключено. Человек может заразиться бруцеллезом от человека при непосредственном контакте микротравмированных участков кожи (рукопожатия) или слизистых оболочек (поцелуи).
Бактерии бруцеллеза хорошо сопротивляются воздействию внешней среды. В непастеризованных молочных продуктах бактерии живут более 50 дней, в замороженном мясе больной коровы сохраняются в течении минимум 5 месяцев, в шкурах и мехе – около 3 месяцев.
Водоем способен очиститься от бруцелл в течение полугода, почва — за срок не менее 2 лет.
Избавиться от бруцеллезного заражения можно путем нагрева зараженной среды или обработкой дезинфицирующими веществами в течение 10 минут. Последний способ подходит только для инструментов и мест обитания животных.
Можно ли использовать в пищу мясо и молоко зараженных бруцеллезом коров? Ответ однозначен – можно, но с осторожностью. Для употребления в пищу мясо больной особи следует варить в течение 3-4 часов, а молоко кипятить 10-15 минут.
У крупного рогатого скота бруцеллез не может быть диагностирован с ориентацией только на симптомы, поскольку они недостаточно ярко выражены. Одним из признаков болезни могут быть частые выкидыши у всего стада. Однако такое происходит у каждой коровы, в основном, один раз. Очень редко — два раза и практически никогда — три раза или более. К тому же, если заражение произошло до случки коровы с быком, аборт не происходит.
Признаки заражения стада бруцеллезом:
- волна абортов или рождение слабых телят, быстро погибающих после рождения;
- задержка последа выкидыша, заболевания матки коров, гнойные выделения из родового отверстия;
- ухудшение аппетита, потеря массы, повышение температуры;
- гнойный мастит у коров;
- воспаление семенников у быков;
- опухоли передних и задних конечностей, артрит.
Важно отметить, что ни один из этих симптомов по отдельности не позволяет диагностировать наличие бруцеллеза у коров со 100% вероятностью.
Бруцеллез очень сходен по симптомам с туберкулезом, поэтому перед назначением лечения необходимо сдать специальные анализы для уточнения диагноза.
Для подтверждения или опровержения бруцеллезного заражения проводят серологическое исследование крови больного животного. Также после аборта собираются и исследуются образцы околоплодных вод, плаценты, фрагменты тканей органов мертвого плода, таких, как желудок и печень.
У павших животных при вскрытии проводят биопсию лимфоузлов, суставов и семенников.
Мясо и молоко больных коров перед отправлением в пищевое производство проверяют на наличие бруцелл. При взятии проб для анализа следует обезопаситься от проникновения инфекции в организм исследователя, используя защитные перчатки, маски и полностью закрывающую тело одежду.
Исследование на бруцеллез сыворотки крови животного производится на физиологическом растворе поваренной соли. Различают положительные, сомнительные и отрицательные реакции, различающиеся разведением. При этом наблюдается агглютинация – склеивание и выпадение осадка из однородной взвеси бактерий.
Для коров положительной проба считается при агглютинации в физиологическом растворе с разведением 1:100, сомнительной – с разведением 1:50, отрицательной – при еще более слабом разведении. В случае сомнительной пробы проводится повторная проверка. Если разведение не усилится и при отсутствия прочих симптомов бруцеллеза, проба принимается как отрицательная.
Теперь поговорим о реакции аллергии. Животных вакцинируют абортином и ожидают реакцию от 24 до 72 часов. Повод для беспокойства – припухлость размером не менее фасолины. В том случае, если она не пропадает спустя трое суток после ввода абортина, наблюдается ее покраснение и болезненность, у вакцинированных коров жар, то реакция определяется как положительная.
Если эти симптомы проявляются по отдельности или припухлость исчезает в течение первых 2 суток с момента ввода абортина, то эта реакция не считается положительной. Положительная реакция позволяет однозначно судить о зараженности коровы, однако такие же результаты дают и выздоровевшие животные, поэтому требуется дополнительное исследование.
При острой форме бруцеллеза у коров эффективным является применение антибиотиков. При хронической форме антибиотики не помогают. Тогда используют вакцину против бруцеллеза, чтобы снять симптомы. В Швейцарии применяют по инструкции препарат Каусит, однако в других странах он не сертифицирован. В США чаще всего из экономических соображений больных коров отправляют на убой. Это выходит дешевле, чем затраты на изоляцию, лечение и анализы.
В СССР неоднократно наблюдались случаи массового самопроизвольного выздоровления коров, что подтверждали многочисленные проверки. В изолированных хозяйствах выздоравливало до 80% зараженного бруцеллезом крупного рогатого скота.
Дать животному шанс на выздоровление или нет – решать хозяину.
Чтобы предупредить распространение заражения, больных коров либо забивают, либо изолируют, причем в отдельных карантинных хозяйствах. Опыт показал, что неполная изоляция, когда здоровые и больные животные содержатся в разных частях коровника либо просто на одной территории, результатов не дает.
Для предотвращения размножения бруцеллезных бактерий важно своевременно убирать навоз и дезинфицировать места содержания коров с телятами. Необходимо организовать отдельные помещения для родов и для животных, подозреваемых в заболевании бруцеллезом.
Рекомендуется проводить регулярную вакцинацию стада. Проведенная таким образом иммунизация сильно снижает риск заболевания.
Телят стоит выращивать отдельно от взрослых особей, чтобы не допустить заражения. Они должны есть из особых кормушек, пить из особых водоемов, к которым нет доступа у зараженных животных. Для телят также должна использоваться особая подстилка. Необходимо делать им прививки с культурой бруцеллеза во избежание будущего заражения.
Для профилактики бруцеллеза у человека рекомендуется пользоваться защитной одеждой, перчатками и высокими резиновыми сапогами. Чтобы без опаски пить молоко, его надо прокипятить, употреблять в пищу мясо коровы также лучше после длительной термообработки.
Инкубационный период болезни составляет от 2 до 3 недель. Бруцеллез поначалу почти не проявляется. Но незаметные симптомы со временем становятся невыносимыми. Ощущения нарастают постепенно от легкого недомогания до чрезвычайно сильных болей и ломоты во всем теле. Температура тела больного достигает 41 градуса по Цельсию. Наблюдается резкая потеря в весе, навязчивое желание пить.
Помимо физических симптомов больной ощущает и психологические. В конце концов на фоне постоянных ужасных болей наступает потеря связи с реальностью и шизофрения.
Болезнь редко протекает дольше 4 месяцев. Летальный исход маловероятен, но у трети переболевших наблюдаются тяжелые поражения организма и психики, приводящие к инвалидности.
Также встречается хроническая форма бруцеллеза, при которой чередуются острая фаза и ремиссия. Летальный исход остается маловероятным.
Если понравилась статья – пожалуйста, поставьте лайк и расскажите о нас друзьям.
Хотите поделиться своим опытом борьбы с болезнью? Напишите об этом в комментариях, нам будет интересно.
источник
1.1. Бруцеллез — инфекционная, хронически протекающая болезнь животных.
Возбудитель — бактерии из рода бруцелла, в который входят шесть самостоятельных видов: мелитензис (овец и коз), абортус (крупного рогатого скота), суис (свиней), канис (собак), овис (баранов и овец) и неотома (кустарниковых крыс).
Микроорганизмы первых четырех видов вызывают бруцеллез животных, а пятого вида — инфекционный эпидидимит баранов (ИЭ).
От животных, больных бруцеллезом, могут заражаться люди, для которых наиболее опасен возбудитель бруцеллеза овец и коз.
1.2. Диагноз на бруцеллез у животных ставят на основании результатов бактериологического, серологического, молекулярно-генетического и аллергического исследований с учетом эпизоотологических данных и клинических признаков болезни, руководствуясь при этом санитарными и ветеринарными правилами по профилактике и борьбе с заразными болезнями, общими для человека и животных.
1.2.1. При установлении диагноза на бруцеллез необходимо учитывать следующее:
— различные виды возбудителя являются патогенными, в основном, для животных соответствующего вида. Бруцеллы видов мелитензис, абортус и суис могут мигрировать на животных других видов;
— клинические признаки бруцеллеза у животных не характерны. Наиболее часто клиническое проявление болезни у маточного поголовья — аборт, у свиноматок наблюдается мумификация плодов.
При абортах отмечается утолщение плодовых оболочек, образование на них фибринозных или гнойных хлопьев. Бруцеллез сопровождается нередко поражением суставов (артриты), синовиальной системы (тендовагиниты, бурситы), половой системы (у самок — эндометрит, вагинит, у самцов — орхит, эпидидимит);
— патологоанатомическая картина при бруцеллезе не имеет характерных особенностей, позволяющих использовать их для диагностики этой болезни. Только у свиней на слизистой оболочке матки иногда находят желтовато-гнойные или казеозные узелки величиной с просяное зерно, так называемый «милиарный бруцеллез матки»;
— у баранов, больных бруцеллезом, в семенниках и придатках обнаруживают некротические или гнойные очаги различной величины; отмечают заполнение полости мошонки серозно-гнойным транссудатом, разрастание фиброзной ткани, сращение придатка с семенником и общей влагалищной оболочкой, иногда атрофию семенников.
1.3. Диагностика бруцеллеза включает лабораторные (бактериологическое, серологическое и молекулярно-генетическое) исследования материала и аллергическое исследование свиней в хозяйствах.
Плановые серологические исследования являются основным методом выявления больных и подозрительных по заболеванию животных.
Бактериологическую диагностику проводят в случае аборта или при появлении у животных других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты и прочие), вызывающих подозрение на данное заболевание. Одновременно проводят серологическое исследование сывороток крови этих животных.
Молекулярно-генетическое исследование (ПЦР) проводят в случае аборта и при появлении у животных других клинических признаков, вызывающих подозрение на бруцеллез, а также при получении положительных и сомнительных результатов серологического исследования на бруцеллез животных, не иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, из хозяйств, благополучных по данному заболеванию.
1.4. При взятии проб крови, молока и патологического материала, а также проведении лабораторных исследований необходимо соблюдать меры, предупреждающие заражение людей и обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями.
2.1. Материал для лабораторных исследований отбирают от каждого животного в отдельности.
2.2. Для бактериологического исследования на бруцеллез направляют абортированный плод с плодовыми оболочками (от свиноматок берут не менее трех плодов) или селезенку, печень, желудок плода с содержимым, перевязанный со стороны пищевода и двенадцатиперстной кишки, и околоплодную жидкость.
Для прижизненной диагностики бруцеллеза от животных берут кровь, молоко, содержимое гигром (бурситов) и абсцессов. При диагностическом убое — дополнительно селезенку, печень, подчелюстные, заглоточные, предлопаточные, надколенные, подколенные, надвыменные, парааортальные, тазовые лимфатические узлы и половые органы. Жидкий материал берут в стерильную посуду (пробирки, банки).
При взятии содержимого гигром, бурс в области поражения выстригают шерсть, кожный покров дезинфицируют 70%-ным спиртом и смазывают настойкой йода. Затем стерильным шприцем с иглой большого диаметра делают пункцию, отсасывают содержимое гигромы (бурсы) и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.
Перед взятием проб молока у коров вымя обмывают теплой водой, соски обрабатывают 70%-ным спиртом. Для исследования из каждой доли вымени берут последние порции молока в количестве 10 — 15 мл в отдельные стерильные пробирки с резиновыми пробками.
У овец и коз пробы молока берут путем пункции цистерны вымени. Для этого животное фиксируют в боковом положении, вымя у основания соска протирают 70%-ным спиртом и смазывают настойкой йода. Стерильным шприцем с иглой делают пункцию у основания соска и после попадания иглы в цистерну (о чем судят по свободному движению конца иглы) набирают в шприц молоко и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.
Молоко должно быть доставлено в лабораторию и исследовано в день взятия пробы. Если это невозможно, молоко консервируют сухой борной кислотой (0,1 г на 10 мл) или генцианвиолетом (0,4 мл 1%-ного спиртоводного раствора краски на 10 мл молока). Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 10 дней.
2.2.1. Отобранные для бактериологического исследования пробы упаковывают в целлофан или пергаментную бумагу, помещают в непроницаемую тару (ящик, банка, полиэтиленовый пакет) и в этот же день направляют в лабораторию. От абортировавшего животного одновременно с патологическим материалом направляют кровь (сыворотку крови) для серологического исследования на бруцеллез. Если в течение 24 — 30 ч взятый материал доставить в лабораторию не представляется возможным, его консервируют стерильным 30%-ным водным раствором химически чистого глицерина. Материал заливают консервирующей жидкостью в количестве, превышающем его объем в 4 — 5 раз. Крупные плоды направляют в неконсервированном виде.
2.3. Для серологического исследования в лабораторию направляют кровь (сыворотку крови) и молоко.
2.3.1. Кровь у животных берут из яремной вены (у свиней — из яремной, ушной или хвостовой; у собак — головной предплечья или латеральной подколенной голени; у лисиц и песцов — из бедренной вены; у норок — путем отсечения подушечки среднего пальца задней лапы или кончика хвоста в стерильные пробирки по 5 — 7 мл (от пушных зверей по 1 — 2 мл). Пробирки нумеруют и составляют опись проб.
Сыворотку крови получают методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают в термостате при 30 — 38 °С в течение 1 ч или при комнатной температуре 8 — 10 ч, сгусток крови от стенок отделяют стальной спицей, а затем пробирки выдерживают при 4 — 10 °С. Через 20 — 24 ч после взятия крови отстоявшуюся сыворотку сливают в сухие стерильные пробирки и направляют для исследования в лабораторию в свежем или консервированном виде (сыворотку крови собак сливают через 3 — 4 ч и повторно через 10 — 12 ч).
Консервирование сывороток проводят:
— добавлением 0,05 мл (1 капля) 5%-ного раствора фенола на каждый миллилитр сыворотки при тщательном перемешивании;
— сухой борной кислотой (2 — 4% к объему сыворотки) до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка;
— путем однократного замораживания.
Неконсервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 сут. со дня взятия крови при условии хранения их при 4 — 8 °С.
Сыворотки, консервированные фенолом или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 сут.; замороженные сыворотки — в течение 3 сут. после однократного оттаивания.
Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки исследованию на бруцеллез не подлежат.
2.3.2. Для исследования на бруцеллез в кольцевой реакции пробу цельного свежего молока от коровы (буйволицы) берут сборную из каждой доли вымени одного удоя в одну стерильную пробирку в количестве 10 — 15 мл. При этом, если молоко берут перед дойкой, то первые порции молока сдаивают. Пробы молока на рынках берут из каждой отдельной посуды (бидон, фляга и проч.) после тщательного его перемешивания. Пробирки нумеруют и составляют опись проб.
Молоко исследуют свежее (охлажденное до 4 — 10 °С или неохлажденное) или консервированное добавлением в каждую пробу одной капли 10%-ного раствора формалина на 5 мл молока. Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 2 — 3 сут. Перед исследованием молоко необходимо тщательно перемешать для равномерного распределения сливок.
При массовом исследовании молока работу по отбору проб и постановке кольцевой реакции можно проводить непосредственно на ферме в специально отведенном помещении.
Не разрешается исследовать в кольцевой реакции молоко от коров (буйволиц), больных маститом или болезнями, сопровождающимися повышением температуры тела, а также молоко животных в первые две недели после родов. Молоко, имеющее повышенную кислотность (30° по Тернеру и выше), исследованию не подлежит, т.к. антиген обесцвечивается.
2.4. На направляемый в лабораторию материал заполняют сопроводительный документ установленной формы.
3.1. Бактериологическую диагностику бруцеллеза проводят в случае аборта или при появлении у животных других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты и прочие), вызывающих подозрение на данное заболевание.
3.2. Бруцеллы обнаруживают бактериоскопией мазков из патологического материала, выделением культуры бруцелл на питательных средах и, при необходимости, путем постановки биологической пробы на морских свинках.
3.3. Бактериоскопическое исследование
Из доставленного на исследование патологического материала делают по два мазка из каждого объекта. При исследовании абортированных плодов мазки готовят из содержимого желудка, жидкости брюшной и грудной полостей, печени, селезенки, а также котиледонов плодовых оболочек. Из паренхиматозных органов, котиледонов и другого плотного материала делают мазки-отпечатки, жидкий материал наносят на предметные стекла пипеткой.
Мазки, фиксированные над пламенем горелки, окрашивают по Граму и одному из следующих специальных методов: по Стампу (модифицированный метод Циль-Нильсена), Козловскому или Шуляку-Шину (см. Прил. N 1, п. 1). При микроскопии мазков учитывают, что бруцеллы — мелкие, грамотрицательные, расположенные отдельно, попарно или кучно коккобактерии, окрашивающиеся по Стампу, Козловскому или Шуляку-Шину в красный цвет.
3.4. Бактериологическое исследование
3.4.1. Для культивирования бруцелл используют мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ), печеночный глюкозо-глицериновый бульон (ПГГБ), мясо-пептонный печеночно-глюкозо-глицериновый агар (МППГГА), печеночный глюкозо-глицериновый агар (ПГГА), картофельный агар, эритрит-агар, сывороточно-декстрозный агар, печеночно-сывороточный агар и печеночно-аминопептидный агар, (см. Прил. N 1, п. 2) и другие питательные среды, предназначенные для этой цели.
3.4.2. Перед посевом материала кожу абортированного плода с поверхности по белой линии протирают тампонами, смоченными 5%-ным раствором фенола. Стерильными ножницами вскрывают брюшную стенку и грудную клетку плода, содержимое грудной и брюшной полостей набирают пастеровскими пипетками и высевают в 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром, а содержимое желудка — в 2 пробирки с бульоном и не менее 5 пробирок с агаром.
Из печени и селезенки вырезают кусочки размером не менее 2,0 х 1,5 х 2,5 см, увлажняют их спиртом, обжигают с поверхности и растирают в стерильной ступке с песком. Затем в ступку добавляют равное количество стерильного физиологического раствора и вновь растирают. Полученную взвесь пастеровской пипеткой по 0,1 — 0,2 мл высевают на поверхность предварительно подсушенных плотных сред (в пробирках или чашках). Допускается высев материала пастеровской пипеткой из органов (место прокола органа предварительно прижигают раскаленным шпателем). Из каждого органа делают посев на 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром.
Если в лабораторию доставлен только желудок плода, высев проводят не менее чем на 10 пробирок агара.
При поступлении нескольких плодов от одного животного посевы делают из органов и тканей каждого плода отдельно.
Из плодовых оболочек и плаценты вырезают кусочки тканей с утолщенными ворсинками и стенками, наличием на поверхности фибрина или гнойного экссудата (выбирают менее загрязненные участки без некротических изменений).
Для уничтожения посторонней микрофлоры кусочки плаценты помещают в чашку Петри и заливают 3%-ным раствором гидроокиси калия на 30 мин. Затем их обмывают стерильным физиологическим раствором, готовят из этого материала суспензию в ступке со стерильным песком и делают посев пастеровской пипеткой на чашки со средой, содержащей бактериостатические препараты: генцианвиолет 1:200000 (0,1 мл 0,5%-ного спиртоводного раствора на 100 мл среды) или кристаллвиолет 1:100000, генцианвиолет и малахитовую зелень в концентрации каждой краски 1:200000, уксуснокислый натрий из расчета 12,5 мг на 100 мл среды и др.
Содержимое бурс, гигром высевают на 3 — 4 чашки с плотной питательной средой, содержащей бактериостатические препараты.
Пробы молока центрифугируют 30 мин. при 3000 об./мин. Верхний слой (сливки) и осадок набирают в пастеровскую пипетку и по 0,1 — 0,2 мл вносят на 3 — 4 чашки с агаром, содержащим бактериостатические препараты. Молоко, консервированное генцианвиолетом или другими консервантами, высевают на среды без бактериостатических веществ.
3.4.3. Для выращивания культур посевы помещают в термостат при 37 — 38 °С.
При исследовании материала от крупного рогатого скота половину
засеянных пробирок и чашек культивируют в обычных условиях, другую
— в атмосфере с повышенным содержанием углекислого газа (10 — 15%)
в СО -инкубаторе или эксикаторе (микроанаэростате). Аналогичные
условия можно создать в пробирках, закрытых резиновыми пробками
Перед парафинированием пробирки закрывают ватными пробками, пронося последние над пламенем горелки. Затем верхнюю часть пробки обрезают, а оставшуюся часть углубляют на 0,5 — 1,0 см внутрь пробирки и заливают расплавленным парафином.
Необходимое содержание углекислого газа в эксикаторе можно получить путем:
— заполнения части объема углекислым газом из баллона или аппарата Киппа;
— внесения бикарбоната натрия и серной или соляной кислоты (0,48 г бикарбоната натрия и 5 мл 25%-ного раствора кислоты или 0,4 г бикарбоната натрия и 0,35 мл концентрированной соляной кислоты на 1 л объема);
— сжигания ваты, смоченной спиртом. При этом пробирки и чашки с посевами должны занимать не более половины объема эксикатора. Для определения концентрации углекислого газа в эксикаторе можно использовать химический метод (см. Прил. N 1, п. 3).
3.4.4. Посевы выдерживают в термостате при 37 — 38 °С в течение 30 сут. Первичный осмотр посевов проводят через 24 — 48 ч. Пробирки с агаром и бульоном, заросшие посторонней микрофлорой, обезвреживают путем автоклавирования при 1,5 атм. в течение 1 ч.
В дальнейшем для обнаружения роста бруцелл посевы просматривают каждые 3 — 4 сут. визуально, при необходимости через лупу или малом увеличении микроскопа. При отсутствии роста часть поверхности агара орошают посевным материалом.
При значительном росте посторонней микрофлоры (80% и более засеянных пробирок) бактериологическое исследование прекращают.
При просмотре посевов обращают внимание на характер роста микробов. На поверхности агара бруцеллы образуют мелкие, блестящие, выпуклые, с ровными краями и гладкой поверхностью просвечивающиеся колонии, имеющие в отраженном свете голубоватый оттенок, в падающем свете — сероватый. С возрастом колонии мутнеют и приобретают более темную окраску, что связано с появлением пигмента.
В бульоне бруцеллы образуют равномерное помутнение и пристеночное кольцо, возвышающееся над уровнем бульона, а в дальнейшем небольшой осадок на дне пробирки. В отраженном свете пристеночное кольцо имеет голубоватый оттенок.
При обнаружении роста на жидких средах и отсутствии характерного роста на агаре из каждой пробирки готовят мазки, которые окрашивают одним из специальных методов, и делают пересев на чашки с плотной средой для выделения чистой культуры. Пересевы на чашках культивируют так же, как и высевы из патологического материала.
Выделенные культуры идентифицируют по тинкториальным (окраска мазков по Граму и одним из специальных методов — по Стампу, Козловскому или Шуляку-Шину), морфологическим, культуральным свойствам и в реакции агглютинации на стекле с использованием набора компонентов для серологической дифференциации бруцелл.
Для постановки пластинчатой реакции агглютинации на стекле необходимы следующие компоненты: испытуемая культура, набор для серологической дифференциации бруцелл (выпускается биопредприятием), 0,5%-ный фенолизированный физиологический раствор рН 7,0 — 7,2.
Для исследования берут двухсуточные агаровые культуры. R- и S-сыворотки бруцеллезные агглютинирующие разводят 0,5%-ным фенолизированным физиологическим раствором до рабочего разведения, указанного на этикетке коробки. Разведенные сыворотки допускается использовать в течение месяца. R-антиген бруцеллезный цветной для РА и антиген бруцеллезный для роз бенгал пробы в пластинчатой РА применяют неразведенными. Предметные стекла для реакции подготавливают общепринятым способом. Физиологический раствор, пробирки и пипетки должны быть стерильными.
Техника постановки реакции. На предметное стекло раздельно наносят по одной капле R- и S-сывороток бруцеллезных агглютинирующих и физиологического раствора. Испытуемую культуру бактериологической петлей отдельно эмульгируют в каплях R- и S-сывороток и в капле физиологического раствора для определения самоагглютинации культуры. Параллельно в каждом опыте ставят контроли: R- и S-сыворотки в разведении, указанном на этикетке, с цветным R-бруцеллезным антигеном и с роз бенгал антигеном.
Учет и оценка реакции. Реакцию учитывают невооруженным глазом или с помощью увеличительного стекла в течение 2 минут по следующей схеме:
++++ (4 креста) — полное просветление жидкости с образованием четко выраженного агглютината — положительная реакция;
+++ (3 креста) — неполное просветление жидкости с выраженным агглютинатом — положительная реакция;
++ (2 креста) — неполное просветление жидкости со слабо выраженным агглютинатом — положительная реакция;
+ (1 крест) — жидкость без просветления с едва заметным агглютинатом — сомнительная реакция;
— (минус) — просветление жидкости не наступило, смесь гомогенная — отрицательная реакция.
Следует иметь ввиду, что реакция с R-бруцеллезной сывороткой проходит замедленно; агглютинат, как правило, мелкозернистый. Результаты реакции с испытуемой культурой считают достоверными, если в контролях R- и S- бруцеллезных сывороток с гомологичными антигенами агглютинация четко выражена не менее чем 3 креста, а с гетерологичными — отсутствует.
Реакцию с испытуемой культурой считают положительной при наличии агглютинации на 2 креста и более. При отрицательной реакции ее проводят повторно с этой же культурой, взятой из трех-четырех мест посева.
Культуры, обладающие типичными для бруцелл морфологическими, культуральными и тинкториальными свойствами, а также дающие положительную реакцию агглютинации с R- и S- бруцеллезными сыворотками в отдельности или с обеими сыворотками одновременно при отсутствии самоагглютинации в физиологическом растворе, признают бруцеллами.
Культура возбудителя инфекционного эпидидимита баранов и бруцеллеза собак, вызванного B. canis, постоянно агглютинируется только R — бруцеллезной сывороткой.
3.5. Биологическое исследование
3.5.1. Биологическое исследование проводят на морских свинках (не менее двух) массой 350 — 400 г, предварительно проверенных на бруцеллез исследованием в РА сыворотки крови в разведении 1:5 с отрицательным результатом.
3.5.2. Для постановки биологической пробы используют тот же материал, что и для бактериологического исследования.
Из органов и содержимого желудка абортированного плода готовят суспензию на стерильном физиологическом растворе в соотношении 1:10 и вводят морской свинке подкожно с внутренней стороны бедра в объеме 1 мл.
Из плаценты и плодовых оболочек, предварительно обработанных тампонами, смоченными дезинфицирующим раствором, и подсушенных сухими стерильными тампонами, вырезают кусочки размером 0,5 х 0,5 см, фламбируют на пламени горелки, растирают в ступке со стерильным песком и заливают физиологическим раствором в соотношении 1:10. Полученную суспензию вводят морской свинке в объеме 1 мл.
Содержимое гигром, бурс вводят морской свинке подкожно в объеме 0,2 — 0,3 мл. При этом необходимо учитывать возможность гибели животного от сопутствующей микрофлоры, особенно стрептококков.
Пробы молока центрифугируют 30 мин. при 3000 об./мин. Морской свинке вводят подкожно 2 — 3 мл материала из верхнего слоя (сливки) и осадка молока после центрифугирования.
3.5.3. На 15, 25 и 40-е сут. после заражения у морских свинок берут кровь в количестве 1 — 2 мл из ушной вены путем надреза или из сердца — путем пункции. Сыворотку крови исследуют в пробирочной РА в разведениях от 1:10 до 1:80.
При положительной реакции агглютинации в разведении 1:10 и выше морских свинок убивают. В случае необходимости получения культуры возбудителя материал от них исследуют бактериологически. Высевы делают пастеровскими пипетками в одну пробирку бульона и две пробирки агара из паховых, парааортальных лимфатических узлов (правых и левых), селезенки (2 высева), печени и костного мозга. Посевы культивируют, как описано в подпунктах 3.4.3 и 3.4.4.
При отрицательной РА у морских свинок в указанные выше сроки биопробу считают отрицательной, подопытных животных убивают, бакисследование не проводят.
3.5.4. При выделении культуры бруцелл на питательных средах из исходного материала биологическое исследование по данной экспертизе прекращают, а ранее зараженных морских свинок убивают без бакисследования.
3.6. Результат исследования на бруцеллез считают положительным при выделении культуры возбудителя или при получении у морской свинки положительной РА в разведении сыворотки крови 1:10 и выше, если из исходного материала культура не выделена.
При положительных результатах бактериоскопии и отрицательных результатах бактериологического исследования и биопробы материал считают подозрительным на бруцеллез. При сохранении патматериала или возможности взятия нового (кровь, молоко, моча и др.) исследование проводят методом полимеразной цепной реакции. По ее результатам делают заключение о заболевании животных бруцеллезом.
— бактериологического — до 1 мес.;
3.8. В ветеринарных лабораториях все выделенные культуры бруцелл после их идентификации подлежат уничтожению путем автоклавирования при 1,5 атм. в течение 1 ч.
3.9. При необходимости определения вида бруцелл выделенные от животных культуры направляют в республиканские, краевые, областные ветеринарные лаборатории или ветеринарные научно-исследовательские учреждения, в которых имеются лаборатории или отделы, занимающиеся изучением бруцеллеза животных и имеющие разрешение органов здравоохранения на работу с микроорганизмами второй группы.
4.1. Серологическая диагностика бруцеллеза заключается в обнаружении специфических антител в сыворотке крови животных в реакции агглютинации (РА) в пробирках, реакции связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента на холоде (РДСК), реакции иммунодиффузии с 0-полисахаридным антигеном (РИД), пластинчатой реакции агглютинации с роз бенгал антигеном (роз бенгал проба — РБП) и в молоке коров — кольцевой реакции (КР) и других реакциях, утвержденных в установленном порядке.
4.2. Постановка и учет результатов реакции агглютинации (РА) в пробирках
4.2.1. Реакцию агглютинации в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), овец, коз, лошадей, верблюдов, оленей (маралов), собак, пушных зверей и морских свинок.
4.2.2. Компоненты реакции агглютинации:
— испытуемые сыворотки крови (см. п. 2.3.1);
— позитивная бруцеллезная сыворотка, изготовленная биопредприятием;
— негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных из опыта или консервированная), изготовленная биопредприятием или полученная в лаборатории;
— антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК (см. Прил. N 2, п. 6);
— 0,5%-ный фенолизированный раствор хлорида натрия. При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок для разведения испытуемых сывороток и антигена используют фенолизированный физиологический раствор хлорида натрия (0,85%-ный); при исследовании крови овец и коз — 5%-ный и оленей (маралов) — фенолизированный 10%-ный раствор хлорида натрия (см. Прил. N 2, п. 1).
4.2.3. Постановка реакции агглютинации
Реакцию агглютинации проводят в серологических пробирках в объеме 1 мл в четырех разведениях:
— при исследовании сывороток крови овец, коз, оленей (маралов) и собак — 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200;
— крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов — 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;
— пушных зверей и морских свинок — 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.
При массовых исследованиях допускается постановка реакции в первых двух разведениях.
Компоненты реакции вносят индивидуальными мерными пипетками (дозаторами) или групповыми дозаторами Флоринского.
Для исследования каждой испытуемой сыворотки крови требуется 5 пробирок. В пробирках первого ряда делают исходное разведение. Для этого сыворотку крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов берут в дозе 0,1 мл, вносят в пробирку, добавляют к ней 2,4 мл соответствующего раствора хлорида натрия, смешивают и получают разведение сыворотки 1:25. Сыворотку крови овец, коз, оленей (маралов) и собак берут в дозе 0,2 мл и добавляют 2,3 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:12,5), а сыворотку крови пушных зверей и морских свинок берут в дозе 0,3 мл и добавляют 1,2 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:5). Таким образом делают исходное разведение испытуемых сывороток в пробирках первого ряда штатива (по 10 проб в ряду).
После приготовления исходного разведения сывороток в первом ряду в пробирки третьего, четвертого и пятого рядов вносят по 0,5 мл соответствующего раствора хлорида натрия. Затем из пробирок первого ряда при помощи группового дозатора Флоринского или индивидуальных пипеток-дозаторов переносят в пробирки второго и третьего рядов по 0,5 мл исходного разведения сывороток (1:25; 1:12,5 или 1:5). В пробирках третьего ряда сыворотки смешивают, по 0,5 мл этого разведения переносят в пробирки четвертого ряда и так же из пробирок четвертого ряда — в пятый. Из пробирок пятого ряда 0,5 мл жидкости удаляют. Таким образом делают последовательные двукратные разведения сывороток.
После этого в каждую пробирку второго, третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными сыворотками вносят при помощи группового дозатора Флоринского или другого дозирующего устройства по 0,5 мл антигена, предварительно разведенного 1:10 соответствующим раствором хлорида натрия. После добавления антигена разведение сыворотки в каждой пробирке удваивается и, в зависимости от вида исследуемых животных, будет составлять 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400; 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200 или 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.
В пробирки первого ряда бруцеллезный антиген не вносят, они служат контролем качества сыворотки. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты реакции агглютинации не учитывают.
При массовых исследованиях сыворотки разливают индивидуальной микропипеткой (с грушей) или групповыми дозаторами Флоринского в две пробирки в дозах 0,02 и 0,01 мл (сыворотки крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов) или 0,04 и 0,02 мл при исследовании сывороток овец, коз, оленей (маралов) и собак. Затем в каждую пробирку добавляют по 1,0 мл антигена, разведенного соответствующим раствором хлорида натрия 1:20. При этом разведения сывороток будут соответственно 1:50 и 1:100 или 1:25 и 1:50.
При постановке реакции агглютинации одновременно с испытуемыми сыворотками ставят контроли с негативной и позитивной бруцеллезной сыворотками в таких же разведениях.
После добавления к испытуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками встряхивают для смешивания компонентов и помещают в термостат при 37 — 38 °С на 16 — 20 ч, затем выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч и проводят учет реакции.
4.2.4. Учет реакции агглютинации. Результаты реакции учитывают визуально, определяя степень просветления жидкости, внешний вид агглютината (при его наличии) или антигена на дне пробирки до и затем, после легкого встряхивания, оценивают в крестах по следующей схеме:
++++ (4 креста) — полное просветление жидкости, микробные клетки антигена осели на дно пробирки в виде «зонтика», при легком встряхивании «зонтик» разбивается на хлопья и комочки, а жидкость остается прозрачной (100% агглютинации);
+++ (3 креста) — неполное просветление жидкости и хорошо выраженный «зонтик» (75% агглютинации);
++ (2 креста) — неполное просветление жидкости, «зонтик» умеренно выражен (50% агглютинации);
+ (1 крест) — едва заметное просветление жидкости, «зонтик» выражен слабо, при встряхивании заметно небольшое количество хлопьев или комочков (25% агглютинации);
— (минус) — просветления жидкости и образования «зонтика» не наступило, на дне пробирки по центру образуется небольшой осадок микробов антигена в виде точки или пятна. При встряхивании осадок легко разбивается, поднимается вверх в виде косички и равномерно распределяется в жидкости, которая при этом приобретает первоначальную мутность.
За титр антител принимают наибольшее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация на 2 креста (++), что соответствует количеству международных единиц (МЕ) антител в 1 мл сыворотки (например, сыворотка с титром 1:100 содержит 100 МЕ, 1:200 — 200 МЕ и т.д.).
Для более объективной оценки результатов РА в крестах готовят стандарты мутности, соответствующие 75, 50, 25 и 0% просветления жидкости.
В четыре пробирки последовательно наливают 1, 2, 3 и 4 мл антигена, разведенного 1:10. Затем в том же порядке в три первые пробирки добавляют 3, 2 и 1 мл физиологического раствора. В четвертую пробирку раствор не добавляют. После встряхивания пробирок из каждой из них переносят по 0,5 мл в серологические пробирки и добавляют по 0,5 мл физиологического раствора. Полученные стандарты соответствуют 75, 50 и 25% просветления жидкости. В четвертой пробирке просветление отсутствует. Стандарты мутности готовят каждый раз при постановке РА и выдерживают в термостате одновременно с основной реакцией.
При массовых исследованиях в двух разведениях все сыворотки, давшие агглютинацию с оценкой не менее чем на 2 креста (++) в каком-либо из указанных разведений, исследуют повторно в четырех разведениях.
4.2.5. Диагностическая оценка реакции агглютинации
Реакцию считают положительной при наличии агглютинации с сывороткой крови крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), верблюдов и лошадей, не иммунизированных или иммунизированных неагглютиногенными противобруцеллезными вакцинами (см. Прил. N 2, п. 7), содержащей 200 МЕ антител и выше; овец и коз — 100 МЕ и выше; оленей (маралов) и собак — 50 МЕ и выше; пушных зверей и морских свинок — 10 МЕ и выше.
При выявлении среди не иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, а также иммунизированных неагглютиногенными вакцинами крупного рогатого скота, верблюдов и лошадей, животных, реагирующих только в РА с содержанием антител 50 — 100 МЕ, а среди овец, коз, оленей (маралов), собак — 25 МЕ, считают сомнительно реагирующими и исследуют повторно через 15 — 30 сут. При повышении титров заболевание считают установленным. При сохранении титров на прежнем уровне проводят дополнительные исследования по дифференциации, согласно утвержденным методам.
При выявлении в стадах крупного рогатого скота, ранее иммунизированного против бруцеллеза агглютиногенными вакцинами (см. Прил. N 2, п. 7), животных, реагирующих только в РА с содержанием не выше 200 МЕ антител и РСК в разведении сыворотки крови не выше 1:10, их повторно исследуют через 15 — 30 сут. в РА, РСК и РИД. При повышении содержания антител в исследуемых сыворотках в РА и (или) РСК или положительной РИД заболевание считают установленным.
При выявлении в неблагополучных по бруцеллезу стадах крупного рогатого скота, ранее не иммунизированных или иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, животных, положительно реагирующих в РА с содержанием 100 МЕ антител и выше, признают больными. Реакцию считают сомнительной при содержании 50 МЕ антител. Сыворотки крови от таких животных через 15 — 30 сут. исследуют повторно. При получении вновь сомнительного результата животных признают больными бруцеллезом.
При исследовании в РА неиммунизированных баранов-производителей, козлов, пробников и ярок, содержащихся в благополучных по бруцеллезу отарах, где овцы (козы) иммунизированы против бруцеллеза, реакцию считают положительной, а заболевание установленным при содержании в сыворотке крови животных 100 МЕ антител и выше. Реакцию считают сомнительной при наличии 50 МЕ антител. Сыворотки крови от таких животных через 15 — 30 сут. исследуют повторно. При получении вновь сомнительных результатов животных признают здоровыми, а отару — благополучной по бруцеллезу.
В заключении лаборатории о результатах исследования должна быть сообщена диагностическая оценка каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр) сыворотки, в котором получен соответствующий результат, выраженный в международных единицах (например: титр сыворотки крови крупного рогатого скота 1:200 с оценкой 2 — 4 креста — «положительная» 200 МЕ; титр сыворотки 1:100 с оценкой 2 — 4 креста — «сомнительная» 100 МЕ).
Суммарные результаты исследования испытуемых сывороток, серию антигена, срок его годности, а также титр позитивной сыворотки записывают в журнал серологических исследований.
4.3. Постановка и учет реакции связывания комплемента (РСК) и реакции длительного связывания комплемента (РДСК)
4.3.1. Реакцию связывания комплемента применяют при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), овец, коз, свиней, верблюдов, лошадей, оленей (маралов), собак и пушных зверей.
Реакцию длительного связывания комплемента, как более чувствительную, применяют вместо РСК при исследовании на бруцеллез сывороток крови животных.
4.3.2. Компоненты реакции и их подготовка к работе:
— испытуемые сыворотки крови (см. п. 2.3.1);
— позитивная бруцеллезная сыворотка, изготовленная биопредприятием или полученная от больного бруцеллезом животного;
— негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных из опыта или консервированная), изготовленная на биопредприятии или полученная в лаборатории.
Испытуемые и контрольные (позитивную и негативную) сыворотки инактивируют в водяной бане в день постановки реакции: для РСК — при 60 — 62 °С в течение 30 мин. (сыворотки крови ослов и мулов — 64 — 65, буйволов — 62 — 64, свиней — 58 — 60 °С); для РДСК — сыворотки крови животных всех видов — при 63 — 64 °С в течение 30 мин.;
— антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК в рабочем титре, указанном биопредприятием-изготовителем (см. Прил. N 2, п. 6);
— комплемент — сыворотка крови морской свинки, лиофильно высушенная, биофабричного изготовления или нативная (свежая или консервированная добавлением 2 — 4% борной кислоты).
Сухой биофабричный комплемент растворяют физиологическим раствором, как указано на этикетке коробки. Берут такое количество ампул (флаконов), в которых содержится необходимое для проведения всего опыта количество комплемента. В каждую ампулу (флакон) вносят физиологический раствор и, не встряхивая, помещают в холодильник на 20 — 30 мин. Растворившийся комплемент осторожно перемешивают путем легкого встряхивания ампул (флаконов), сливают в одну пробирку, смешивают и помещают в холодильник при 4 — 10 °С. Непосредственно перед внесением в пробирки для титрования растворенный или нативный комплемент разводят физиологическим раствором 1:20, а остальной — хранят в холодильнике для постановки главного опыта. Рабочее разведение комплемента также готовят непосредственно перед внесением в пробирки главного опыта;
— гемолитическая сыворотка (гемолизин) — сыворотка крови кролика, гипериммунизированного эритроцитами барана, — для РСК и РДСК в удвоенном титре. Титрование гемолизина проводят при использовании каждой новой серии и по истечении срока годности (см. Прил. N 2, п. 5);
— эритроциты барана — 2,5%-ная от осадка взвесь эритроцитов барана в физиологическом растворе для РСК и РДСК (см. Прил. N 2, п. 3).
Для приготовления гемолитической системы взвесь эритроцитов и раствор гемолизина в рабочем разведении смешивают в равных объемах и при постановке РСК выдерживают в водяной бане при 37 — 38 °С в течение 15 — 20 мин. при периодическом перемешивании, а при постановке РДСК — в холодильнике. При смешивании компонентов раствор гемолизина вливают во взвесь эритроцитов;
— физиологический раствор — 0,85%-ный раствор химически чистого хлорида натрия в дистиллированной воде с рН 6,8 — 7,2 или физиологический раствор, содержащий ионы магния и кальция (см. Прил. N 2, п. 2). Последний в обязательном порядке готовят в случае использования нативного комплемента (свежей или консервированной сыворотки крови морской свинки).
Рабочие разведения всех компонентов для РСК или РДСК готовят перед постановкой реакции и при необходимости проверяют их на антикомплементарность и гемотоксичность по следующей схеме:
источник