Бруцеллез у собак — одна из опаснейших патологий. К счастью, у домашних питомцев она наблюдается не так часто. В группу риска входят особи, имевшие контакты с дикими лисами, грызунами, а также сельскохозяйственными животными или продуктами, которые от них получают (мясо, молоко). Чаще бруцеллез развивается у сексуально полноценных взрослых собак.
Возбудителем инфекционного заболевания является очень мелкая, не образующая спор аэробная бактерия бруцелла (Brucella canis). Штамм необычайно устойчив к внешним неблагоприятным факторам и обладает повышенной способностью к проникновению в организм. Уничтожить вредоносную бактерию можно путем кипячения, обработки дезинфектантом (достаточно нескольких минут), пастеризации (не менее получаса).
Опасность бруцеллеза в том, что его последствия крайне губительны для организма животного. У кобелей развиваются бесплодие и орхит. Сукам, которые очень восприимчивы к инфекции в период вынашивания потомства, бруцеллез грозит самопроизвольными абортами.
Заражение происходит во время случки, но может произойти и при контактах здоровых домашних питомцев с выделениями изо рта, носа, половых органов инфицированных особей. Иногда регистрируются случаи заражения воздушно-капельным путем.
Потомству бруцеллез передается от больной матери. При этом даже если инфицирование не произойдет внутриутробно, щенки заразятся во время родов.
Инфекционный период длится несколько недель. Затем появляются признаки заболевания, при этом они достаточно смазанные, в связи с чем их нередко путают с другими патологиями.
Бруцеллез, симптомы у собак:
- слабость, подавленность, общее изможденное состояние;
- сильное увеличение подкожных лимфатических узлов;
- незначительная гипертермия;
- потеря либидо;
- зеленовато-бурые выделения (у сук);
- снижение или полное отсутствие аппетита;
- дефицит веса;
- поражения суставов — артрит, бурсит (редко).
В некоторых случаях инфекции поражают глаза, почки, мозг, межпозвоночные диски. Признаки заболевания бруцеллёзом будут указывать на заражение этих систем организма.
Симптомами, указывающими непосредственно на бруцеллез у сук, являются поражения репродуктивной системы: задержка течки, бесплодие, инфекция матки, что приводит к гибели приплода — рождению мертвых щенят или самопроизвольному аборту. В матке развивается сильное воспаление, что приводит к задержке последа после родов.
У кобелей развиваются инфекции придатка семенника, эпидидимит, качество спермы падает. Когда она вырабатывается в яичках, то продолжает оставаться незрелой. У инфицированного кобеля можно наблюдать увеличенное яичко, мошонку, мошоночный дерматит, простатит. Если бруцеллез переходит в хроническую стадию, яички становятся сморщенными и атрофируются.
Инфицированные собаки представляют опасность для других животных в среднем в течение 12 месяцев. Кобели даже после проведения лечения и выздоровления нередко могут оставаться носителями штамма. Самка после самопроизвольного прерывания беременности продолжает распространять бактерицидные выделения в течение полугода.
Чтобы врач мог поставить диагноз «бруцеллез», ему нужно провести ряд диагностических исследований:
- бакпосев на бактерицидную среду;
- биологические пробы;
- серологические тесты;
- ПЦР-исследования;
- агглютинацию — выявление антител к возбудителю.
Если результаты обследования недостаточно информативны, диагностика проводится повторно через месяц. До этого времени животное считается положительно реагирующим.
Во время обследования врач должен исключить такие заболевания у собаки, которые так же могут способствовать самопроизвольному аборту. К ним относятся: сальмонеллез, хламидиоз, чума плотоядных и ряд других болезней инфекционного и неинфекционного характера.
Лечение бруцеллеза у больных собак не предполагает какой-то определенной схемы. Но если еще недавно зараженных животных усыпляли, то сегодня их лечат с помощью антибиотиков (если заболевание было выявлено на ранних стадиях). Однако антибиотики, хоть и позволяют контролировать инфекцию, полностью уничтожить ее не в состоянии — периодически животное будет распространителем инфекции.
Чтобы предупредить это явление, собак, перенесших бруцеллез, рекомендуется стерилизовать и отстранить от размножения, чтобы не допустить передачи вируса потомству.
Относительно иммунитета после бруцеллеза точных сведений нет. Известны случаи, когда собака заболевала повторно.
Да, и очень серьезная, так как бруцеллез является зоонозной инфекцией и передается от животных людям. Brucella canis легко может проникнуть в человеческий организм даже через неповрежденные кожные покровы. Даже если на руках нет царапин, ран, инфицирование вполне возможно. Бактерия поражает половую, сердечно-сосудистую, нервную и опорно-двигательную системы.
Человек на всю жизнь может остаться инвалидом, не сможет иметь детей в будущем. Заражение приводит к развитию таких опасных заболеваний, как менингит, энцефалит, артрит.
В группу риска входят ветеринары, заводчики и прочие лица, взаимодействующие с кровью и выделениями домашних животных. У обычного владельца шанс заразиться от пса бруцеллезом не так велик.
Однако в целях профилактики нужно соблюдать правила безопасности, например, если есть подозрение, что новорожденные щенки инфицированы бруцеллезом, осмотр их лучше производить в одноразовых перчатках, после чего тщательно мыть руки с мылом.
Есть опасность заразиться у лиц с пониженным иммунитетом, например, после продолжительной болезни, поэтому в этот период общение с четвероногим любимцем должно быть сведено к минимуму.
Бруцеллез не излечим и очень опасен для людей, и обезопасить человека на все 100% не может ни один способ защиты. Поэтому нужно взвесить все за и против относительно того, стоит ли рисковать, в особенности при наличии в доме маленьких детей. Порой эвтаназия становится единственным правильным решением.
Несмотря на то что медицина располагает современными методами лечения, вакцина от бруцеллеза пока не изобретена. Самыми действенными мерами профилактики на сегодняшний день являются систематические осмотры домашних питомцев в ветеринарной клинике, чистота и своевременная дезинфекция мест содержания.
Необходимо помнить о средствах индивидуальной защиты, а также в целях безопасности не приобретать бывшие в употреблении игрушки, клетки и инструменты, предназначенные для ухода.
Перед вязкой собаки обоего пола должны быть обследованы на бруцеллез.
К животным, содержащимся в питомниках, предъявляются особые требования содержания. Если у одной из сук произошел самопроизвольный аборт, плод исследуется на бруцеллы.
Не допускается кормление сырым мясом, молоком от сельскохозяйственных животных, содержащихся в неблагоприятных по бруцеллезу районах.
источник
Бруцеллез – это инфекционное заболевание, распространенное среди животных и поражающее органы репродуктивной системы. У инфицированных животных рождается мертвое потомство, часто происходят выкидыши, эпидидимиты (воспаление яичек, приводящее к бесплодию), орхиты (воспаление яичка), дискоспондилиты (воспаление межпозвонкового диска). О симптомах и лечении бруцеллёза читайте подробнее в нашей статье.
Бруцеллез у собак: симптомы и лечение
Бруцеллы (лат. Brucella) — род бактерий из семейства Brucellaceae класса альфа-протеобактерий. Данные бактерии обладают повышенной устойчивостью к внешним условиям, поэтому могут месяцами находиться в жидкостях, в тканях эмбриона и субстратах, органического происхождения.
Таблица 1. Виды бактерий бруцеллеза
| Виды бактерий | Паразитирующее действие |
|---|---|
| Brucellaabortus | Носителями выступают крупные сельскохозяйственные животные. Опасен для человека |
| Brucellacanis | Поражает собак. Опасен для человека |
| Brucellaceti | Происходит заражение морских ластоногих |
| Brucellamelitensis | Поражает коз, овец. Опасен для человека |
| Brucellamicroti | Носитель — серая полевка |
| Brucellaneotomae | Поражает кустарниковых крыс |
| Brucellaovis | Поражает баранов |
| Brucellapinnipedialis | Поражает китообразных |
| Brucellasuis | Поражает свиней. Опасен для человека |
Что нужно знать? Зараженные собаки являются носителями и распространяют во внешней среде бактерии бруцелл около 12 месяцев.
Бруцеллез – это заболевание, вызванное бруцеллами
Бруцеллы поражают лимфоузлы в организме собаки, размножаясь и выходя во внешнюю среду с жидкостью (моча, материнское молоко, амниотическая жидкость и др.). Бактерии сразу ведут к разрушению костного мозга, печени, селезенки, органов репродуктивной системы.
Как только бактерия попала в организм животного, она начинает развиваться на протяжении одного месяца. Бактерия отличается хорошей выживаемостью вне организма носителя и погибает только при высокой термической обработке, дезинфекции карболовой кислотой (фенол), раствором формальдегида (формалин) и другими дезинфицирующими средствами. В зараженных испражнениях бруцелла содержится около полугода и представляет собой опасность для окружающих.
Бруцелла накапливается в лимфоузлах, а потом уже распространяется по всему организму через кровоток
Попадая в организм, бруцеллы атакуют макрофагическую систему, распространяясь по всему организму, приводя к обширной интоксикации. У особей мужского пола бактерии поражают репродуктивные органы, приводя к орхитам и атрофии семенников. У особей женского пола при поражении появляется эндометрит, самопроизвольный аборт, мертворождение.
В период заболевания собака отказывается от еды
При инфицировании основными симптомами являются:
- апатия;
- слабость;
- повышение температуры;
- увеличенные лимфоузлы;
- потеря аппетита, нарушение работы органов ЖКТ;
- гнойные влагалищные выделения у самок;
- воспаления матки, вагинит, нарушение микрофлоры влагалища;
- артрит.
Основной способ заражения – поедание сырого мяса и молочных продуктов больных сельскохозяйственных животных
Бруцеллезом питомец может заразиться через контакт с дикими животными, бездомными собаками. Но чаще всего заражение происходит:
- пероральным путем (через прием пищи, зараженной воды либо последа, съедаемого после родов);
- половым путем (во время вязки);
- во время вскармливания потомства;
- через слизистые оболочки органов зрения;
- переносчиками инфекции (мухи запросто переносят бактерии, в числе которых находятся и бруцеллы, инфицирующие продукты питания);
- через кровь, при уколах, хирургическом вмешательстве;
- внутриутробным путем от матери к детенышу (бруцеллы проникают в плаценту, во время родов, либо через грудное молоко).
Жигалка является одним из способов распространения бруцеллеза
Симптомы бруцеллеза очень схожи с другим инфекционным заражением у собак, поэтому это затрудняет диагностику. В диагностированное обследование собаки включено:
- исследование вагинального секрета;
- исследование спермной жидкости;
- осмотр абортированного плода;
- выявление имеющихся антител к бруцелле (агглютинация);
- серологический анализ;
- иммунофлуоресцентный анализ;
- иммунохроматографический анализ (ИХА);
- иммуноэлектрофоретический анализ (ИЭФ).
Диагностирование может назначаться повторно, через определенный период времени, если результаты не будут нести определенной информации. До этого собака считается носителем с положительной реакцией на инфекцию.
В лаборатории проводится ряд анализов для обнаружения бактерий
Также параллельно проводятся диагностика на исключение заражения сальмонеллами, лептоспирозом, болезнью Карре (чумка), токсоплазмозом, дистиреозом.
Бруцеллез очень опасное заболевание и трудно поддается лечению. Во время приема лекарственных препаратов у животных часто проявляются аллергические реакции и аутоиммунные нарушения. Основными лечебными препаратами в борьбе с данной инфекции являются антибиотики:
- фторхинолоны: «Офлоксацин» (0,5 мл/10 кг 1 раз в сутки), «Ципрофлоксацин» (1 таб/10 кг 1 раз в сутки);
Препарат «Рифампицин» в форме капсул
Раствор для внутримышечного введения «Гентамицин»
Помимо антибиотиков, ветеринарным врачом может назначаться:
- стимуляторы иммунной системы: «Анандин»(15-20 мг/кг 1 раз в сутки), «Гамавит» (0,1 мл/кг внутримышечно), «Циклоферон» (0,1 мл/кг 1 раз в сутки);
Форма выпуска препарата «Гамавит»
Противовоспалительное средство «Бутадион»
Противоаллергическое средство «Тавегил»
Даже после полного приема курса антибиотиков нет гарантии, что инфекция уничтожена. Бруцеллы могут остаться в минимальных количествах в организме собаки и вновь распространиться при понижении защиты организма. Также, если рецидивы имеют частый характер, хозяевам стоит кастрировать (стерилизовать) питомцев.
Что нужно знать? На ранней стадии заражения бруцеллами лечение проводят курсом антибиотиков. Но даже назначение 2-3 видов препаратов не избавит организм питомца от опасной и живучей бактерии, поэтому животное будет считаться носителем инфекции.
Эти бактерии распространены в любой возрастной группе собак. Возраст, пол и порода животного здесь не имеют значения. Чаще всего подвергаются инфицированию беременные самки и собаки, имеющие контакт с дикими и сельскохозяйственными животными.
Охота на диких животных в зараженной бруцеллой зоне может привести к инфицированию собаки
В ветеринарной практике есть опыт применения вакцин в профилактических целях. Вакцинацию проходят сельскохозяйственные животные, но для собак до сих пор не изобретен действенный препарат.
Обязательное профилактическое исследование на бруцеллез проводится:
- в питомниках при содержании двух и более собак;
- если есть сомнительные результаты анализов;
- при имеющихся заболеваниях репродуктивной системы;
- при произвольном аборте у особей женского пола;
- при вязке питомцев.
Животные, содержащиеся в питомниках, имеют большие риски заражения бурцеллезом
Если вы являетесь владельцем четвероногого друга, то в целях профилактики стоит регулярно обрабатывать помещение карболовой кислотой (фенолом), раствором формальдегида (формалином) и другими дезинфицирующими средствами. Стоит взять на внимание питание питомцев и убрать из рациона сырые мясные продукты и молочку, если они были приобретены от зараженных сельскохозяйственных животных.
Уборка помещения, где обитает питомец, специальными дезинфицирующими веществами защитит ваших родных и предотвратит заражение
Так как при лечении антибиотиками нет гарантии полного выздоровления, и собака становится носителем данной инфекции, то владельцы должны знать, что подвергают себя и близких опасности. Бруцеллез с легкостью попадает в организм через здоровую неповрежденную кожу человека, развиваясь и разрушая центральную нервную систему, мочеполовые органы, сердце, сосуды, костно–мышечную систему.
Патология настолько опасна, что, разрушая внутреннюю работу организма, неизбежно приведет к инвалидности. Бруцелла активно развивает менингит, радикулит, артрит и энцефалит и приводит к бесплодию у молодых людей. В зоне риска находятся специалисты ветеринарных клиник, заводчики, люди, которые взаимодействуют с кровью, выделениями и инфицированными собаками, а также люди с ослабленной иммунной системой. О стандартных сценариях развития бруцеллеза можно прочесть ниже.
Симптомы бурцеллеза у человека
Что нужно знать? Бруцеллез неизлечим, поэтому стоит позаботиться о своей безопасности и безопасности родных. Если ваш питомец подвергся заражению бруцеллезом, то тут стоит выбирать: здоровая жизнь ваших детей или собаки.
После перенесенного заболевания собаку следует постоянно обследовать, сдавать анализы. Помещение, в котором содержалось животное, стоит продезинфицировать. Как правило, собаки в дальнейшем не способны вынашивать потомство и становятся бесплодны. Хоть бруцеллез и является нечастым инфекционным заболеванием среди домашних питомцев, но несет серьезную опасность. Поэтому животные каждые полгода должны проверяться на наличие инфекции. Переболевшие собаки исключаются из разведения, а новых собак помещают в карантинную зону на три месяца.
Беременное животное, зараженное бруцеллезом, не сможет выносить потомство и впоследствии останется бесплодным
К сожалению, в современном мире еще нет лекарства, которое смогло гарантировать защиту человека и его питомца от опасного возбудителя — бруцеллы. Лишь своими силами можно частично обезопасить себя, своих близких, проводя профилактическую работу и постоянный осмотр питомцев, дезинфекцию помещений, а также соблюдая меры личной гигиены при работе с лабораторными анализами и потенциальными носителями инфекции.
источник
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА
Animals. Laboratory diagnostics of brucellosis. Serological methods
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 7 июня 2017 г. N 99-П)
За принятие проголосовали:
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97
Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Минэкономики Республики Армения
Госстандарт Республики Беларусь
Госстандарт Республики Казахстан
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 июня 2017 г. N 582-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34105-2017 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2018 г.
5 ВЗАМЕН ГОСТ 25385-91 в части серологических методов диагностики
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)
Настоящий стандарт распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает следующие методы серологической диагностики бруцеллеза:
— реакция агглютинации с S — и R -бруцеллезными антигенами;
— пластинчатая реакция агглютинации с антигеном, окрашенным бенгальской розовой (роз бенгал проба);
— реакция связывания комплемента;
— реакция длительного связывания комплемента на холоде;
— реакция непрямой гемагглютинации;
— реакция иммунодиффузии в геле агара с олигополисахаридным антигеном;
— реакция иммунодиффузии в геле агара с R -бруцеллезным антигеном;
— кольцевая реакция с молоком;
— иммуноферментный анализ;
— иммунохроматографический анализ.
Примечание — Методы применимы ко всем видам бактерий рода Brucella.
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 12.0.004-2015 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения
ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны
ГОСТ 12.1.008-76 Система стандартов безопасности труда. Биологическая безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.4.011-89 Система стандартов безопасности труда. Средства защиты работающих. Общие требования и классификация
ГОСТ 1625-2016 Формалин технический. Технические условия
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 2651-78 Натрия бихромат технический. Технические условия
ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия
ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия
ГОСТ 4220-75 Реактивы. Калий двухромовокислый. Технические условия
ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия
ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 5962-2013 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ ISO 7218-2015 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям
ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия
ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 16445-2012 Сыворотка гемолитическая для реакции связывания комплемента. Технические условия
ГОСТ 16446-2012 Комплемент сухой для реакции связывания комплемента. Технические условия
ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий
ГОСТ 17206-96 Агар микробиологический. Технические условия
ГОСТ 18704-78 Кислота борная. Технические условия
ГОСТ 23519-93 Фенол синтетический технический. Технические условия
ГОСТ 25134-2013 Бруцеллин ВИЭВ. Технические условия
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 25794.1-83 Реактивы. Методы приготовления титрованных растворов для кислотно-основного титрования
ГОСТ 29230-91 (ИСО 835-4-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 4. Пипетки выдувные
ГОСТ 33675-2015 Животные. Лабораторная диагностика бруцеллеза. Бактериологические методы
Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3.1 В настоящем стандарте применены термины с соответствующими определениями по ГОСТ 33675.
3.2 В настоящем стандарте применены следующие сокращения:
— РА — реакция агглютинации;
— РСК — реакция связывания комплемента;
— РБП — пластинчатая реакция агглютинации с бруцеллезным роз бенгал антигеном;
— РДСК — реакция длительного связывания комплемента;
— РИД — реакция иммунодиффузии;
— ЛПС — липополисахаридный антиген;
— О-ПС — олигополисахаридный антиген;
— РНГА — реакция непрямой гемагглютинации;
— КР с молоком — кольцевая реакция с молоком;
— ИФА — иммуноферментный анализ;
— ИХА — иммунохроматографический анализ;
— PKг-G — раствор конъюгата, конъюгированного с пероксидазой;
— ФСБ-Т — фосфатно-солевой буферный раствор с твином;
— РБР-С — разводящий буферный раствор для сывороток;
— ТМБ-субстрат — тетраметилбензидин-субстрат;
— К+ — инактивированная сыворотка крови животных, содержащая специфические антитела класса G к бактериям рода Brucella (положительный контрольный образец);
— К- — инактивированная сыворотка крови животных, не содержащая специфических антител к бактериям рода Brucella (отрицательный контрольный образец).
4.1 Условия выполнения исследований
4.1.1 Общие требования к помещениям — по ГОСТ ISO 7218.
4.1.3 К проведению исследований допускаются квалифицированные сотрудники, имеющие опыт работы с микроорганизмами II группы патогенности*, изучившие методики микробиологических работ. В зонах неблагополучных по бруцеллезу сотрудники должны быть вакцинированы против бруцеллеза.
________________
* Группу патогенности устанавливают в соответствии с нормативными правовыми актами, действующими на территории государства, принявшего стандарт.
4.2 Требования безопасности
4.2.1 Общие требования безопасности при проведении работ с микроорганизмами — согласно ГОСТ 12.1.008.
4.2.2 Средства защиты работающих должны соответствовать требованиям ГОСТ 12.4.011.
4.2.3 Воздух рабочей зоны должен соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.005.
4.2.4 Обучение персонала безопасности труда — в соответствии с ГОСТ 12.0.004.
4.2.5 Обеззараживание материала после исследований, а также использованных индивидуальных средств защиты, инструментов и т.д. проводят путем кипячения в течение 30 мин или автоклавирования в течение 1 ч при давлении 2 атм (0,2) МПа и температуре (132±2)°С.
При проведении исследований используют следующие средства измерений, оборудование, материалы, реактивы и животных:
— pH-метр с точностью калибровки ±0,1 ед.pH при температуре от 20°С до 55°С;
— спектрофотометр с диапазоном длины волны от 198 до 1000 нм, разрешением 1 нм и точностью ±2 нм;
— пипетки градуированные выдувные вместимостью от 1 до 10 см по ГОСТ 29230;
— колбы мерные по ГОСТ 1770 исполнения 2 различной вместимости 1-го класса точности;
— центрифуга лабораторная со скоростью вращения ротора 2000-3000 об/мин;
— автоклав лабораторный;
— термостат, обеспечивающий поддержание температуры от 20°С до 50°С;
— баня водяная с терморегулятором с температурой нагрева до 100°С;
— холодильник бытовой, обеспечивающий поддержание температуры от 0°С до 10°С по ГОСТ 16317;
— насос вакуумный;
— иглы препаровальные;
— штамп для формирования лунок в агаре;
— осветитель настольный с пределом поворота фонаря вокруг горизонтальной и вертикальной осей 0-360 и источником света — лампой В/Ватт-8/20;
— чашки биологические (Петри) с крышками ЧБН 2 по ГОСТ 25336;
— чашка и ступка фарфоровые по ГОСТ 9147;
— комплект инструментов и приспособлений для серологических исследований крови животных на бруцеллез, в который входят:
1) шприц-полуавтомат (капельница) для дозирования сыворотки;
2) пипетка-капельница для дозирования антигена;
3) ручной смеситель на 25 лунок диагностической пластины;
4) аппарат для автоматического покачивания диагностических пластин;
— пластины с лунками 72-гнездные полистироловые (планшеты);
— штативы 100-гнездные для пробирок Флоринского;
— групповые дозаторы Флоринского;
— пробирки серологические Флоринского;
— микропипетки вместимостью от 0,1 до 0,5 см ;
— дозаторы одноканальные пипеточные переменного объема;
— наконечники для дозаторов вместимостью 0,2; 0,5; 1,0 см ;
— фильтры бумажные из бумаги фильтровальной по ГОСТ 12026;
— бумага фильтровальная по ГОСТ 12026;
— салфетки марлевые;
— спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962;
— вода дистиллированная по ГОСТ 6709;
— кислота соляная по ГОСТ 3118 х.ч;
— фенол по ГОСТ 23519 — 5%-ный раствор;
— формалин по ГОСТ 1625 — 1%-ный и 10%-ный растворы;
— натрий хлористый по ГОСТ 4233;
— кислота борная по ГОСТ 18704 — 3%-ный раствор;
— натрия бихромат по ГОСТ 2651;
— калий двухромовокислый по ГОСТ 4220;
— кислота серная по ГОСТ 4204;
— натрия гидроокись по ГОСТ 4328;
— сыворотка гемолитическая по ГОСТ 16445;
— комплемент сухой для РСК по ГОСТ 16446;
— кровь барана-донора;
— свинки морские массой 300-400 г;
— сыворотки крови животных;
— набор для ИФА, содержащий в своем составе:
1) планшет полистироловый 96-луночный с адсорбированной в лунках планшета смесью специфических антигенов Brucella ;
7) флакон N 6 — ТМБ-субстрат;
8) флакон N 7 — стоп-реагент объемом 6 см ;
— тест-система для определения антител к ЛПС антигену В.abortus и В. melitensis в сыворотке крови крупного рогатого скота и овец методом ИФА, содержащая в своем составе компоненты:
1) К — иммунохроматографические тест-полоски, нитроцеллюлозные мембраны на полимерной основе белого цвета, ламинированные защитными этикетками с обозначениями разного цвета: в нижней части — стрелки, указывающие направления погружения полоски в тестируемую пробу; в верхней части — название рода и вида возбудителя исключаемой болезни;
2) К — буферный раствор для разведения проб объемом 0,8 см ;
— негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных);
— антиген бруцеллезный для РА и РСК (РДСК);
— роз бенгал антиген для РБП;
— антиген бруцеллезный для КР с молоком;
— 0,85%-ный раствор хлористого натрия;
— 0,85%-ный раствор хлористого натрия с 0,5% фенола;
— 5%-ный раствор хлористого натрия с 0,5% фенола;
— 10%-ный раствор хлористого натрия с 0,5% фенола;
— раствор хлорамина 5%-ный;
— взвесь формалинизированных несенсибилизированных эритроцитов;
— молоко от здоровой коровы (буйволицы);
— набор для РИД, содержащий в своем составе:
1) О-ПС бруцеллезный антиген;
3) микробиологический агар-агар по ГОСТ 17206;
— набор для серологической диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота, содержащий в своем составе:
1) антиген бруцеллезный эритроцитарный для РНГА;
2) взвесь формалинизированных несенсибилизированных эритроцитов;
4) сыворотку негативную.
Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов, дезинфицирующих средств и материалов по качеству не ниже указанных. Допускается использование посуды одноразового применения.
6.1.1 Сыворотку крови получают методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают в термостате при 30°С-38°С в течение 1 ч или при комнатной температуре в течение 8-10 ч, сгусток крови от стенок отделяют стальной спицей, а затем пробирки выдерживают при 4°С-10°С. Через 20-24 ч после взятия крови отстоявшуюся сыворотку сливают в сухие стерильные пробирки и направляют для исследования в лабораторию в свежем или консервированном виде (сыворотку крови собак сливают через 3-4 ч и повторно через 10-12 ч).
6.1.2 Консервирование сывороток проводят:
— добавлением 0,05 см (1 капля) 5%-ного раствора фенола на 1 см сыворотки при тщательном перемешивании;
— сухой борной кислотой (3-4% к объему сыворотки) до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка;
— путем однократного замораживания.
Неконсервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 сут со дня взятия крови при условии хранения их при температуре от 2°С до 8°С.
Сыворотки, консервированные фенолом или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 сут, замороженные сыворотки — в течение 3 сут после однократного оттаивания. Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки к исследованию на бруцеллез не пригодны.
6.2 Для исследования молока на бруцеллез в кольцевой реакции пробу цельного свежего молока от коровы (буйволицы) берут из каждой доли вымени одного удоя в одну бактериологическую пробирку в количестве 10-15 см . При этом если молоко берут перед дойкой, то первые порции молока сдаивают. Пробы молока на рынках берут из каждой отдельной посуды (бидон, фляга и др.) после тщательного его перемешивания. Пробирки нумеруют и составляют опись проб.
6.2.1 Молоко исследуют свежее или консервированное добавлением в каждую пробу одной капли 10%-ного раствора формалина на 5 см молока. Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 2-3 сут. Перед исследованием молоко тщательно перемешивают для равномерного распределения сливок.
6.2.2 При массовом исследовании молока работу по отбору проб и постановке кольцевой реакции можно проводить непосредственно на ферме в специально отведенном помещении.
6.2.3 Не разрешается исследовать в кольцевой реакции молоко от коров (буйволиц), больных маститом или болезнями, сопровождающимися повышением температуры тела, а также молоко животных в первые две недели после родов. Молоко, имеющее повышенную кислотность (30° по Тернеру и выше), исследованию не подлежит, т.к. антиген обесцвечивается.
6.3 На направляемый в лабораторию материал заполняют сопроводительный документ.
7.1 Сущность методов заключается в выявлении в сыворотке крови животных специфических антител к бруцеллезным антигенам.
7.2 Пластинчатая реакция агглютинации с бруцеллезным роз бенгал антигеном (РБП)
7.2.1 Сущность метода
Сущность метода заключается в выявлении специфических антител в сыворотке крови животных, основанном на способности антител сыворотки агглютинировать бруцеллезный антиген, результатом чего является формирование выраженной агглютинации окрашенных бруцелл антигена в виде крупных или мелких хлопьев розового цвета.
7.2.2 Подготовка к исследованию
7.2.2.1 Приготовление 5%-ного раствора хлорамина
Для приготовления 5%-ного раствора хлорамина 5 г хлорамина растворяют в 100 см водопроводной воды. Раствор используют свежеприготовленным.
Примечание — Могут применяться другие растворы дезинфицирующих средств, эффективные в отношении бактерий рода Brucella, которые готовят в соответствии с инструкциями к ним.
7.2.2.2 Для массовых диагностических исследований используют комплект инструментов и приспособлений для серологических исследований крови животных на бруцеллез в соответствии с разделом 5.
Перед постановкой реакции роз бенгал антиген и исследуемые сыворотки выдерживают 30-40 мин при комнатной температуре и встряхивают для получения однородной смеси.
Реакцию проводят на чистых, сухих эмалированных диагностических пластинах с лунками при температуре не ниже 18°С. На бортиках пластинки против каждой лунки записывают номер исследуемой сыворотки.
7.2.3 Проведение исследования
7.2.3.2 После внесения каждой сыворотки шприц-полуавтомат (микропипетку) трижды промывают фенолизированным 0,85%-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2 и кончик подсушивают фильтровальной бумагой. При исследовании сыворотки крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов в каждую лунку рядом с сывороткой при помощи пипетки-капельницы для антигена, или микропипетки, или одноканального дозатора с наконечником вносят 0,03 см антигена (две капли), а при исследовании сывороток крови овец, коз и северных оленей (маралов), свиней и собак — 0,015 см антигена (одну каплю). Затем антиген в каждой лунке тщательно смешивают с сывороткой активными движениями ручного смесителя до получения однородной жидкости, распределяя ее при этом по всей поверхности лунки. После смешивания сывороток во всех лунках пластинки смеситель ополаскивают 0,85%-ным фенолизированным раствором хлористого натрия по 7.4.2 и просушивают марлевой салфеткой или фильтровальной бумагой.
Пластинку с сыворотками и антигеном покачивают в течение 4 мин осторожными вращательными движениями вручную или при помощи аппарата, предназначенного для этой цели. При положительной реакции в течение 4 мин появляются мелкие или крупные хлопья агглютината розового цвета.
В начале работы ставят контроль антигена с негативной и бруцеллезной сыворотками в тех же дозах, а также антигена на спонтанную агглютинацию (к 0,03 см 0,85%-ного фенолизированного раствора хлористого натрия добавляют 0,03 см роз бенгал антигена).
По окончании работы диагностические пластинки дезинфицируют погружением на 5 мин в 5%-ный раствор хлорамина либо другого дезинфицирующего средства в концентрации и экспозиции, определенной для возбудителя данного вида, затем обрабатывают любым моющим средством, промывают водопроводной, затем дистиллированной водой, высушивают на воздухе или в термостате при температуре 37°С-38°С и используют повторно.
7.2.4 Обработка результатов
Учет результатов реакции проводят визуально в течение 4 мин после смешивания сывороток с антигеном при слегка наклонном положении пластинки.
Реакцию считают положительной при наличии агглютината в виде мелких или крупных хлопьев розового цвета.
Реакцию считают отрицательной при отсутствии агглютинации (смесь гомогенная и равномерно окрашенная).
При не четко выраженной агглютинации проводят повторное исследование сыворотки и по его результатам дают окончательную оценку реакции (положительная или отрицательная).
При получении отрицательных результатов РБП по всему стаду его считают благополучным по бруцеллезу.
Сыворотки крови животных стада (фермы, населенного пункта), положительно реагирующие в РБП, исследуют на бруцеллез в РА и РСК (РДСК), или в РА и РИД, или в РНГА, или в ИФА, или в ИХА.
7.3 Кольцевая реакция (КР) с молоком
Сущность метода состоит в выявлении антигеном специфических антител в молоке больных бруцеллезом или иммунизированных агглютиногенными противобруцеллезными вакцинами коров. Положительная реакция проявляется в образовании синего кольца в верхнем слое сливок.
КР с молоком применяют с целью определения благополучия стад (ферм) по бруцеллезу крупного рогатого скота (буйволов) и для проверки молока при продаже его на рынках.
Исследование молока на бруцеллез в КР можно проводить в лабораториях или непосредственно в хозяйствах.
7.3.1 Подготовка к исследованию
Для постановки КР с молоком применяют тест-системы или наборы для диагностики бруцеллеза в кольцевой реакции (КР), используемые на территории государств, принявших стандарт, в состав которых входят антиген бруцеллезный для КР с молоком и сыворотка бруцеллезная. Реакцию ставят в серологических пробирках Флоринского, которые нумеруют в соответствии с описью проб молока, пробы которого отбирают по 6.1.
7.3.2 Проведение исследования
В пробирки вносят по 2 см молока пипеткой или дозатором. После каждой пробы пипетку двукратно промывают теплой водопроводной водой. Антиген вносят по 0,1 см в каждую пробирку с пробой молока. После внесения антигена в пробирки одного ряда штатив энергично встряхивают и т.д. После внесения антигена во все пробирки штатив встряхивают дополнительно.
При исследовании каждой партии молока ставят контрольные пробы:
— молоко от заведомо здоровой коровы (буйволицы);
— смесь молока здоровой коровы (буйволицы) с бруцеллезной сывороткой (0,1 см сыворотки на 2 см молока).
Штативы с исследуемыми контрольными пробами молока выдерживают на водяной бане при температуре 37°С-38°С в течение 1 ч или в термостате в течение 2 ч.
Результаты реакции учитывают визуально через 30-40 мин после извлечения штативов из водяной бани (термостата) и оценивают в крестах по следующей схеме:
«+++» (три креста) — четко выраженное синее кольцо в верхней части столбика молока в слое сливок, остальная часть молока остается белой;
«++» (два креста) — четко выраженное синее кольцо в верхней части столбика молока в слое сливок, остальная часть молока имеет синеватый цвет;
«+» (один крест) — синее кольцо в слое сливок выражено слабо, и весь столбик молока имеет синий цвет;
«-» (минус) — столбик молока остается равномерно окрашенным в первоначальный синий цвет, который был получен сразу после смешивания с антигеном, а слой сливок — белого или слегка желтоватого цвета.
7.3.3 Обработка результатов
Все пробы молока с оценкой в «+++» (три креста) и «++» (два креста) считают положительными, «+» (один крест) — сомнительными.
При получении отрицательных результатов КР по всему стаду его считают благополучным по бруцеллезу.
Сыворотку крови животных стада (группы, населенного пункта), в котором выявлены особи, сомнительно или положительно реагирующие в КР, исследуют на бруцеллез в РБП, или в РА и РСК (РДСК), или в РА и РИД, или в РНГА, или в ИФА. При этом проводят клинический осмотр животных и исключают их заболевание маститами.
7.4 Реакция агглютинации (РА) в пробирках
7.4.1 РА в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), овец, коз, лошадей, верблюдов, оленей (маралов), собак, пушных зверей и морских свинок.
7.4.2 Приготовление фенолизированных растворов хлористого натрия с содержанием фенола 0,5%
В 1 дм дистиллированной воды растворяют соответственно 8,5, 50 и 100 г хлористого натрия и добавляют к каждому раствору по 5 г фенола. Растворы фильтруют дважды через бумажный фильтр. Растворы хранят в стеклянных бутылях, укупоренных резиновыми пробками при температуре от 2°С до 20°С, и используют в течение 1 мес.
7.4.3 Проведение исследования
7.4.3.1 При исследовании в РА сыворотки крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок и антиген разводят фенолизированным 0,85%-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2; овец и коз — фенолизированным 5%-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2; оленей (маралов) — фенолизированным 10%-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2.
7.4.3.2 Сыворотки крови исследуют в четырех разведениях в пробирках Флоринского в объеме 1 см :
— для крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов — в разведениях 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;
— для овец, коз, оленей (маралов) и собак — в разведениях 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200;
— для собак с R -бруцеллезным антигеном ( B.canis ) — в разведениях 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;
— для пушных зверей и морских свинок — в разведениях 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.
Исследование каждой сыворотки проводят в пяти пробирках.
7.4.3.3 Получение исходного разведения проб сыворотки:
— сыворотки крови крупного рогатого скота (лошадей, верблюдов) по 0,1 см вносят в пробирки первого ряда, содержащие по 2,4 см фенолизированного 0,85%-ного раствора хлористого натрия по 7.4.2 (разведение 1:25);
— сыворотки крови овец, коз и собак по 0,2 см вносят в пробирки первого ряда, содержащие по 2,3 см фенолизированного 5%-ного раствора хлористого натрия по 7.4.2 (разведение 1:12,5);
— сыворотку крови оленей и маралов по 0,2 см вносят в пробирки первого ряда, содержащие по 2,3 см фенолизированного 10%-ного раствора хлористого натрия по 7.4.2 (разведение 1:12,5);
— сыворотку крови пушных зверей и морских свинок по 0,3 см вносят в пробирки первого ряда, содержащие по 1,2 см фенолизированного 0,85%-ного раствора хлористого натрия по 7.4.2 (разведение 1:5);
— при исследовании с R -бруцеллезным антигеном (B.canis) сыворотку крови собак по 0,1 см вносят в пробирки, содержащие по 2,4 см фенолизированного 0,85%-ного раствора хлористого натрия по 7.4.2 (разведение 1:25).
В пробирки второго ряда раствор хлористого натрия не вносят.
В пробирки третьего, четвертого и пятого рядов вносят по 0,5 см соответствующего фенолизированного раствора хлористого натрия по 7.4.2.
Затем в пробирки второго и третьего рядов вносят по 0,5 см исходного разведения сыворотки.
После пипетирования (не менее трех раз) разведение сыворотки из третьего ряда по 0,5 см переносят в пробирки четвертого ряда и после пипетирования из четвертого — в пятый. Из пробирок пятого ряда 0,5 см жидкости удаляют. Таким образом, получают последовательные двукратные разведения образцов сыворотки.
7.4.3.4 В пробирки второго, третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными сыворотками вносят при помощи группового дозатора Флоринского или другого дозирующего устройства по 0,5 см антигена в рабочем разведении 1:10 (1,0+9,0 см ) соответствующим фенолизированным раствором хлористого натрия по 7.4.2.
После внесения антигена разведение сыворотки в каждой пробирке удваивается.
В пробирки первого ряда антиген не вносят, они служат контролем сыворотки на самоагглютинацию. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты реакции агглютинации не учитывают.
После добавления к исследуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками интенсивно встряхивают для смешивания компонентов и помещают в термостат при температуре 37°С-38°С на 16-20 ч, затем выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч и проводят учет реакции.
7.4.3.5 На территориях, угрожаемых или неблагополучных по бруцеллезу, проводят массовые серологические исследования. При этом допускается проведение исследований в двух разведениях. Сыворотки разливают индивидуальной микропипеткой (с резиновой грушей), или групповыми дозаторами Флоринского, или одноканальными пипеточными дозаторами в две серологические пробирки Флоринского в дозах 0,02 и 0,01 см (сыворотки крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов) или 0,04 и 0,02 см при исследовании сывороток овец, коз, оленей (маралов) и собак. Затем в каждую пробирку вносят по 1,0 см антигена, разведенного соответствующим фенолизированным раствором хлористого натрия по 7.4.2 в соотношении 1:20. При этом сыворотки крови будут разведены соответственно 1:50 и 1:100 или 1:25 и 1:50.
При получении положительных или сомнительных результатов РА при массовом исследовании эти сыворотки исследуют в четырех разведениях.
Массовые исследования пушных зверей и морских свинок не проводят.
7.4.4 Обработка результатов
Результаты реакции учитывают визуально, определяя степень просветления жидкости, внешний вид агглютината (при его наличии) или антигена на дне пробирки до и затем, после легкого встряхивания, оценивают в крестах по следующей схеме:
«++++» (четыре креста) — полное просветление жидкости, микробные клетки антигена осели на дно пробирки в виде «зонтика», при легком встряхивании «зонтик» разбивается на хлопья и комочки, а жидкость остается прозрачной (100% агглютинации);
«+++» (три креста) — неполное просветление жидкости и хорошо выраженный «зонтик» агглютината (75% агглютинации);
«++» (два креста) — неполное просветление жидкости, «зонтик» агглютината умеренно выражен (50% агглютинации);
«+» (один крест) — едва заметное просветление жидкости, «зонтик» агглютината выражен слабо, при встряхивании заметно небольшое количество хлопьев или комочков (25% агглютинации);
«-» (минус) — просветления жидкости и образования «зонтика» агглютината не наступило, на дне пробирки по центру образуется небольшой осадок микробов антигена в виде точки или пятна. При встряхивании осадок легко разбивается, поднимается вверх в виде косички и равномерно распределяется в жидкости, которая при этом приобретает первоначальную мутность.
За титр антител принимают наибольшее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация на два креста («++»), что соответствует количеству международных единиц (ME) антител в 1 см сыворотки (например, сыворотка с титром 1:100 содержит 100 ME, 1:200 — 200 ME и т.д.).
Для более объективной оценки результатов РА готовят образцы сравнения мутности, соответствующие 75%, 50%, 25% и 0% просветления жидкости.
В четыре пробирки последовательно вносят 0,5; 1,0; 1,5 и 2,0 см антигена, разведенного 0,85%-ным фенолизированным раствором хлористого натрия в соотношении 1:10. Затем в том же порядке в три первые пробирки добавляют 1,5; 1,0 и 0,5 см соответствующего фенолизированного раствора хлористого натрия по 7.4.2. После перемешивания содержимого пробирок из каждой из них переносят по 1,0 см в серологические пробирки. Полученные образцы сравнения мутности соответствуют 75%, 50% и 25% просветления жидкости. В четвертой пробирке просветление отсутствует. Образцы сравнения мутности готовят каждый раз при постановке РА и выдерживают в термостате одновременно с основной реакцией.
При массовых исследованиях в двух разведениях все сыворотки, давшие агглютинацию с оценкой не менее чем на два креста («++») в каком-либо из указанных разведений, исследуют повторно в четырех разведениях.
В заключении лаборатории о результатах исследования должны быть отражены диагностическая оценка каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр) сыворотки, в котором получен соответствующий результат, выраженный в международных единицах (например: титр сыворотки крови крупного рогатого скота 1:200 с оценкой два — четыре креста — «положительная» 200 МЕ/см ; титр сыворотки 1:100 с оценкой два — четыре креста — «сомнительная» 100 МЕ/см ).
Результаты исследования исследуемой и контрольных сывороток, серию антигена, срок его годности записывают в журнал серологических исследований.
7.5 Реакция связывания комплемента (РСК) и реакция длительного связывания комплемента на холоде (РДСК)
7.5.1 РСК применяют при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), овец, коз, свиней, верблюдов, лошадей, оленей (маралов), собак и пушных зверей.
Сущность реакции состоит в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент, т.е. происходит связывание комплемента комплексом антиген — антитело.
7.5.2 РДСК применяют вместо РСК, в том числе для исследования сывороток, обладающих антикомплементарными свойствами.
Сущность реакции состоит в образовании иммунного комплекса антиген — антитело в присутствии комплемента на холоде в течение нескольких часов.
7.5.3 Подготовка к исследованию
7.5.3.1 Приготовление 0,85%-ного раствора хлористого натрия
Для приготовления 1 дм раствора 8,5 г хлористого натрия растворяют в дистиллированной воде, устанавливают pH 6,8-7,2 ед.pH 5%-ным раствором натрия гидроокиси и дважды фильтруют через бумажный фильтр. 0,85%-ный раствор хлористого натрия хранят в стеклянной бутыли, закрытой резиновой или корковой пробкой, и используют в течение 1 мес.
20 — исходное разведение комплемента (1:20).
Так как количество комплемента в рабочем разведении, требующемся для всей реакции (на 100 пробирок), равно 20 см (0,2·100), то к 0,6 см регидратированного комплемента добавляют 19,4 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия.
Гемолитическую сыворотку титруют по ГОСТ 16445 при использовании каждой новой серии и по истечении срока годности.
Рабочий титр гемолитической сыворотки для РСК и РДСК составляет удвоенную дозу от титра. Так, если титр сыворотки равен 1:1500, то рабочий титр в РСК и РДСК будет 1:750.
Эритроциты барана — 2,5%-ную взвесь эритроцитов барана в 0,85%-ном растворе хлористого натрия для РСК и РДСК готовят из свежей или консервированной крови барана по ГОСТ 16446 . Дефибринированную кровь фильтруют через марлю и консервируют стрептомицином из расчета 1 г препарата, растворенного в 10-20 см стерильного 0,85%-ного раствора хлористого натрия, на 100 см крови. Консервированная кровь при хранении в холодильнике пригодна для использования, как правило, в течение 10-14 сут.
Гемолитическую систему готовят перед каждой постановкой РСК. Для этого 2,5%-ную взвесь отмытых эритроцитов и раствор гемолитической сыворотки в рабочем разведении смешивают в равных объемах и при постановке РСК выдерживают в водяной бане при 37°С-38°С в течение 15-35 мин (в зависимости от объема и толщины стенок сосуда) при периодическом перемешивании, а при постановке РДСК — в холодильнике. При смешивании компонентов раствор гемолитической сыворотки вносят во взвесь эритроцитов.
Исследуемые и контрольные (бруцеллезная и негативная) сыворотки крови крупного рогатого скота в исходном разведении 1:5 инактивируют в день постановки реакции в водяной бане: для РСК — при 60°С-62°С в течение 30 мин (сыворотки крови ослов и мулов — 64°С-65°С, буйволов — 62°С-64°С, свиней — 58°С-60°С); для РДСК — сыворотки крови животных всех видов — при 63°С-64°С в течение 30 мин.
Рабочие разведения всех компонентов для РСК (РДСК) готовят перед постановкой реакции и проверяют их на антикомплементарные и гемотоксические свойства по следующей схеме, представленной в таблице 1.
Таблица 1 — Проверка антикомплементарных и гемотоксических свойств компонентов реакций
0,85%-ный раствор хлористого натрия
Комплемент в разведении 1:20
Гемолитическая сыворотка в рабочем разведении
Антиген в рабочем разведении
0,85%-ный раствор хлористого натрия
Водяная баня 10 мин при 37°С-38°С
Полная задержка гемолиза эритроцитов
В реакциях используют компоненты, не обладающие антикомплементарными и гемотоксическими свойствами.
7.5.4 Проведение исследования в РСК
При массовом исследовании постановку реакции проводят в одной пробирке в разведении сыворотки 1:5 с антигеном, при постановке в трех пробирках исследуемые сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (контроль на антикомплементарность сывороток), (таблица 2).
Необходимые разведения сывороток готовят следующим образом:
— при массовом исследовании в одной пробирке к 0,05 см исследуемой сыворотки добавляют 0,2 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия (разведение 1:5);
— при постановке реакции в трех пробирках в первую вносят 0,1 см исследуемой сыворотки, добавляют 0,4 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия (разведение сыворотки крови 1:5 в объеме 0,5 см ) и смешивают. Из первой пробирки переносят 0,2 см во вторую пробирку и 0,1 см — в третью. В третью пробирку добавляют 0,1 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия (разведение 1:10).
Инактивирование разведенных сывороток проводят в порядке, указанном в 7.5.3.3.
Сыворотку, 0,85%-ный раствор хлористого натрия и другие компоненты реакции вносят при помощи индивидуальных пипеток, (дозаторов), групповых дозаторов Флоринского или одноканальных пипеточных дозаторов с наконечником.
Постановку реакции проводят по схеме, представленной в таблице 2.
Таблица 2
При массовом исследовании
При исследовании в двух разведениях
пробирки с исследуемыми сыворотками (разведение)
пробирки для каждой исследуемой сыворотки (разведение)
Водяная баня 30 мин при 58°С-65°С
Водяная баня 20 мин при 37°С-38°С
Водяная баня 20 мин при 37°С-38°С
Примечание — Допускается смешивание равных объемов рабочих разведений антигена и комплемента непосредственно перед внесением в пробирки.
При постановке реакции ставят следующие контроли:
— негативной и бруцеллезной сывороток в разведении 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (по схеме реакции);
— гемолитической системы (0,4 см гемолитической системы и 0,6 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия) — полная задержка гемолиза;
— комплемента (0,2 см комплемента в рабочем разведении, 0,4 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия и 0,4 см гемолитической системы) — полный гемолиз;
— антигена (0,2 см антигена в рабочем разведении, 0,2 см комплемента в рабочем разведении, 0,2 см 0,85%-ный раствор хлористого натрия и 0,4 см гемолитической системы) — полный гемолиз.
При необходимости определения титра исследуемых проб сыворотки, разведения готовят следующим образом: в пробирки первого ряда (разведение 1:5) вносят по 0,8 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия, 0,2 см пробы сыворотки и смешивают пипетированием. В пробирки третьего, четвертого, пятого и шестого рядов вносят по 0,2 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия. Пробы сыворотки из первого ряда пробирок вносят по 0,2 см в пробирки второго и третьего рядов. В пробирках третьего ряда сыворотку смешивают, получая разведение 1:10; 0,2 см разведения сыворотки вносят в пробирки четвертого ряда, смешивают, получая разведение 1:20, и так далее до шестого разведения 1:80. Из пробирок последнего ряда по 0,2 см разведений сыворотки удаляют. В пробирки второго ряда вносят по 0,2 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия (ряд без внесения антигена — контроль антикомплементарных свойств сыворотки). Постановку реакции проводят по схеме, представленной в таблице 2.
7.5.5 Реакция длительного связывания комплемента на холоде (РДСК)
7.5.5.1 Подготовка к исследованию
Сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и в разведении 1:5 без антигена (контроль на антикомплементарность сыворотки), при массовом исследовании реакцию проводят в одной пробирке в разведении сыворотки 1:5 с антигеном. Инактивирование разведенных сывороток крови и приготовление гемолитической системы проводят по 7.5.3.3.
Комплемент применяют в рабочем разведении 1:25 или 1:20 при титре 0,06-0,1 или в разведении 1:20-1:15 при титре 0,1-0,14.
Одновременно определяют титр гемолитической системы с использованием свежей или консервированной сыворотки по схеме, приведенной в таблице 3.
Учет результатов титрования проводят немедленно после выемки штатива из водяной бани.
Таблица 3
Водяная баня 30 мин при 63°С-64°С
Холодильник 16-18 ч при 2°С-6°С
Водяная баня 20 мин при 37°С-38°С
7.5.5.2 Проведение исследования
Внесение компонентов и последовательность постановки реакции проводят по схеме, приведенной в таблице 4.
Таблица 4
При массовом исследовании
При исследовании в трех пробирках
пробирки с исследуемыми сыворотками (разведение)
пробирки для каждой исследуемой сыворотки (разведение)
0,85%-ный раствор хлористого натрия
Водяная баня 30 мин при 63°С-64°С
0,85%-ный раствор хлористого натрия
Антиген в рабочем раведении
Комплемент в рабочем разведении
Холодильник 2-6°С 16-18 ч и 20 мин при комнатной температуре
Гемолитическая система в рабочей дозе
Водяная баня 20 мин при 37°С-38°С
При постановке реакции ставят контроли:
— негативная и бруцеллезная сыворотки в разведении 1:5 и 1:10 с антигеном и в разведении 1:5 без антигена;
— гемолитическая система в рабочей дозе без сыворотки, антигена и комплемента (0,6 см гемолитической системы и 0,6 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия) — полная задержка гемолиза;
— антиген с 0,85%-ным раствором хлористого натрия и гемолитической системой (0,2 см антигена в рабочем разведении; 0,4 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия и 0,6 см гемолитической системы) — полная задержка гемолиза.
7.5.6 Обработка результатов РСК и РДСК
Реакцию связывания комплемента и реакцию длительного связывания комплемента учитывают визуально. При постановке реакции в одной пробирке (при массовом исследовании) учет проводят один раз — сразу после извлечения штативов из водяной бани. При исследовании в трех пробирках — через 3-4 ч, когда в контрольных пробах с бруцеллезной сывороткой эритроциты осядут на дно пробирки, или на следующий день (в этом случае штативы с пробирками оставляют в холодильнике).
Результаты реакции оценивают в крестах по следующей схеме:
«++++» (четыре креста) — отсутствие гемолиза, надосадочная жидкость прозрачная и бесцветная, осадок 100% эритроцитов на дне пробирки;
«+++» (три креста) — гемолиз 25% эритроцитов, осадок 75% эритроцитов;
«++» (два креста) — гемолиз 50% эритроцитов, осадок 50% эритроцитов;
«+» (один крест) — гемолиз 75% эритроцитов, осадок 25% эритроцитов;
«-» (минус) — гемолиз 100% эритроцитов, осадок эритроцитов отсутствует, жидкость интенсивно окрашена гемоглобином.
Степень гемолиза эритроцитов при необходимости определяют по шкале, которую готовят перед учетом реакции. Для этого из штатива выбирают пять пробирок с полным гемолизом, сливают их содержимое в одну и разводят по схеме, представленной в таблице 5.
Таблица 5
Процент гемолиза эритроцитов в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют путем сравнения со шкалой.
Реакцию считают:
— положительной — при задержке гемолиза на два-четыре креста в одном или в двух разведениях сыворотки (1:5 или 1:10) и полном гемолизе эритроцитов в контрольной пробирке (без антигена);
— сомнительной — при задержке гемолиза с оценкой в один крест в одном или двух разведениях сыворотки и полном гемолизе эритроцитов в контрольной пробирке (без антигена);
— отрицательной — при полном гемолизе эритроцитов в двух или трех пробирках.
7.6 Реакция иммунодиффузии (РИД) с О-полисахаридным антигеном (О-ПС)
7.6.1 Сущность метода состоит в выявлении бруцеллезных антител, основанном на способности антител и антигена диффундировать в агаровом геле и при взаимодействии образовывать комплекс антиген-антитело, наблюдаемый в виде линии преципитации.
7.6.2 Приготовление 0,8%-ного агар-агара и подготовка чашек Петри
Для приготовления 200 см агара 17 г хлористого натрия и 1,6 г микробиологического агар-агара переносят в стеклянную колбу вместимостью 500 см , добавляют 200 см дистиллированной воды.
Колбу закрывают непромокаемым материалом (пергаментной бумагой, фольгой и т.п.) и помещают на водяную баню, которую также накрывают для предотвращения испарения воды при кипении водяной бани. Для полного расплавления агара колбу выдерживают в водяной бане в течение 35-45 мин с момента закипания воды. В чашки Петри, помещенные на горизонтальную поверхность, вносят по 14-18 см расплавленного агара. Чашки оставляют в течение 1 ч с приоткрытыми крышками. После застывания агара чашки Петри закрывают крышками и помещают в холодильник при температуре от 2°С до 8°С, хранят не более 5 сут.
При помощи штампа в геле агара делают отверстия (лунки). В каждой чашке прорезают не менее шести семилуночных розеток, каждая из которых состоит из семи лунок: одна лунка в центре диаметром 3 мм, остальные шесть лунок диаметром 5 мм по окружности, расстояние между центральной и периферическими лунками — 3 мм. Образовавшиеся диски геля удаляют из лунок канюлей, соединенной с вакуумным или водоструйным насосом (или любым другим способом).
7.6.3 Проведение исследования
7.6.3.1 В РИД с О-ПС антигеном исследуют на бруцеллез сыворотку крови крупного и мелкого рогатого скота и северных оленей с целью дифференциации животных, инфицированных от вакцинированных; для дифференциации неспецифических реакций, обусловленных родственной с бруцеллами микрофлорой, в том числе иерсиниями.
Для исследования используют сыворотки крови животных неконсервированные и консервированные. Не консервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 сут со дня взятия крови при условии хранения их при температуре от 4°С до 8°С. Сыворотки, консервированные фенолом или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 сут; замороженные сыворотки — в течение 3 сут после однократного оттаивания. Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки исследованию на бруцеллез не подлежат.
7.6.3.2 Реакцию иммунодиффузии проводят в чашках Петри. В центральную лунку вносят 0,02 см О-ПС антигена, а в периферические — по 0,04 см исследуемых сывороток крови.
На каждой чашке Петри ставят контроль с положительной бруцеллезной сывороткой (преципитирующей).
После внесения компонентов чашки Петри закрывают крышками и помещают во влажную камеру (эксикатор) и выдерживают при температуре от 18°С до 26°С.
7.6.4 Обработка результатов
7.6.4.1 Учет результатов проводят визуально в косом проходящем свете с помощью осветителя через 24 и 48 ч после постановки реакции.
Линии преципитации между лунками с антигеном и исследуемой сывороткой, сформировавшиеся через 24 ч, свидетельствует о положительной реакции.
Сыворотки крови, давшие линию преципитации через 48 ч, подлежат повторному исследованию.
Линии преципитации, сформировавшиеся через 24 или 48 ч при повторном исследовании, свидетельствуют о положительной реакции.
При получении положительного результата в реакции иммунодиффузии, животное признают больным бруцеллезом.
7.6.4.2 Применение РИД с О-ПС антигеном при диагностике бруцеллеза
а) крупного рогатого скота в случаях:
1) в благополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых не применяли вакцины против бруцеллеза, исследуют сыворотки крови животных, сомнительно или положительно реагирующие в РА и (или) РСК (РДСК);
2) в благополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых животных вакцинируют против бруцеллеза агглютиногенными вакцинами:
— для контроля эпизоотического состояния по бруцеллезу животных не ранее чем через 1,5 мес после вакцинации;
— для дифференциации положительных реакций, полученных в РА (не выше 200 ME) или (и) РСК (РДСК) не выше чем в разведении 1:10 по истечении 6 мес после введения вакцины;
3) в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых животных вакцинируют против бруцеллеза агглютиногенными вакцинами:
— через 1,5 мес и далее один раз в месяц в течение 6 мес после иммунизации или реиммунизации с целью раннего выявления больных бруцеллезом животных;
— через 6 мес после иммунизации (реиммунизации) для оздоровления стада от бруцеллеза в комплексе мероприятий, предусмотренных по профилактике и борьбе с бруцеллезом;
б) северных оленей в случаях:
1) в благополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых противобруцеллезные вакцины не применяют. Исследуют сыворотки крови животных, сомнительно или положительно реагирующие в РА и (или) РСК (РДСК);
3) в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых вакцинируют против бруцеллеза агглютиногенными вакцинами:
— через 1,5 мес и далее один раз в месяц в течение 6 мес после иммунизации или реиммунизации с целью раннего выявления больных бруцеллезом животных;
— через 6 мес после иммунизации (реиммунизации) для оздоровления стада от бруцеллеза в комплексе мероприятий, предусмотренных по профилактике и борьбе с бруцеллезом;
1) в благополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота хозяйствах, где противобруцеллезные вакцины не применяют:
— при исследовании сыворотки крови животных, сомнительно и положительно реагирующих в РА или (и) РСК (РДСК);
2) в благополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота хозяйствах, где проводится иммунизация животных противобруцеллезными агглютиногенными вакцинами:
— для дифференциальной диагностики бруцеллеза овец и коз не ранее чем через 5 мес, только после однократной их иммунизации противобруцеллезными агглютиногенными вакцинами;
— для дифференциации неспецифических реакций, обусловленных родственной с бруцеллами микрофлорой, в том числе и иерсиниями;
3) в неблагополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота хозяйствах:
— с целью более раннего выявления больных бруцеллезом животных не ранее чем через 5 мес, только после однократной иммунизации противобруцеллезными агглютиногенными вакцинами;
— при снятии ограничений с неблагополучных по бруцеллезу хозяйств одновременно с РБП или РА, РСК (РДСК).
7.7 Реакция иммунодиффузии (РИД) с R -бруцеллезным антигеном при диагностике бруцеллеза собак, вызываемым B.canis
7.7.1 Подготовка к исследованию
7.7.1.1 Приготовление 0,85%-ного раствора хлористого натрия
В 1 дм дистиллированной воды растворяют соответственно 8,5 г хлористого натрия. Растворы фильтруют дважды через бумажный фильтр. Растворы хранят в стеклянных бутылях, укупоренных резиновыми пробками при температуре от 2°С до 20°С и используют в течение 1 мес.
7.7.1.2 Приготовление 0,8%-ного геля агара по 7.6.2
7.7.1.3 Пробы сыворотки крови от собак исследуют в РИД в свежем или консервированном виде.
7.7.2 Проведение исследования
Для постановки реакции иммунодиффузии используют биологические чашки Петри разного диаметра. Для исследования до четырех проб — диаметром 40 мм, для исследования 6-40 проб — диаметром 90 мм.
В центральную лунку геля вносят 0,02 см антигена, в периферические — по 0,04 см исследуемых проб сыворотки крови.
В каждой чашке ставят контроль антигена с негативной и R -бруцеллезной сывороткой для РИД.
Внутрь крышки каждой чашки вкладывают фильтровальной бумагу, вырезанную по размеру ее наружного диаметра, которую увлажняют фенолизированным 0,85%-ным раствором хлористого натрия. Чашку плотно прикрывают крышкой и оставляют при температуре от 18°С до 26°С.
7.7.3 Обработка результатов — по 7.6.4.
7.8 Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)
7.8.1 Сущность метода
Метод основан на выявлении бруцеллезным эритроцитарным антигеном специфических антител в сыворотке крови больных бруцеллезом животных или иммунизированных вакцинами против бруцеллеза животных.
7.8.2 Подготовка к исследованию
7.8.2.2 Приготовление хромовой смеси
В фарфоровую чашку вместимостью 300-500 см помещают 5 г тонкоизмельченного в фарфоровой ступке двухромовокислого калия или 6 г бихромата натрия, добавляют 100 см концентрированной технической серной кислоты и осторожно нагревают на водяной бане до полного растворения двухромовокислого калия (бихромата натрия). Хромовую смесь хранят при комнатной температуре до момента изменения цвета с темно-оранжевого до темно-зеленого.
7.8.2.3 Подготовка планшетов
Планшеты подготавливают к работе следующим образом: новые, погружают на 20-30 мин в теплый раствор с моющим средством и каждую лунку моют в этом растворе вращательным движением ватной или ватно-марлевой пробки. Ершом не пользуются, во избежание повреждения поверхности лунки. Затем планшеты не менее 6 раз промывают проточной водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и сушат при комнатной температуре или в термостате.
Допускается обработка планшетов хромовой смесью в течение одних суток, затем их промывают проточной водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и сушат.
При работе лицо, руки, одежду защищают от попадания хромовой смеси.
Реакцию ставят на 0,85%-ном растворе хлористого натрия. Сыворотку бруцеллезную сухую регидратируют дистиллированной водой или 0,85%-ным раствором хлористого натрия.
7.8.3 Проведение исследования
Крупный рогатый скот, иммунизированный против бруцеллеза, исследуют в сроки, предусмотренные инструкциями по применению вакцин.
Мелкий рогатый скот, иммунизированный против бруцеллеза, в РНГА не исследуют.
Реакцию ставят с использованием набора для серологической диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота для РНГА.
Реакцию проводят в объеме 0,55 см (0,5 см разведения сыворотки и 0,05 см антигена) в пробирках Флоринского.
При массовых исследованиях постановку реакции можно проводить с использованием исследуемых сывороток в одном (исходном) разведении. После прогревания исследуемые и контрольные сыворотки по 0,25 см вносят в лунки планшетов и добавляют в них по 0,25 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия.
В каждую лунку с разведением сыворотки вносят по 0,05 см антигена в рабочем разведении.
Содержимое лунок перемешивают до получения равномерной взвеси антигена в сыворотке, выдерживают при температуре от 18°С до 26°С в течение 3-4 ч и проводят учет реакции.
Сыворотки от неиммунизированного или иммунизированного неагглютиногенными противобруцеллезными вакцинами крупного рогатого скота исследуют с разведения 1:50. Исходное разведение 1:25 готовят путем внесения 0,1 см сыворотки в пробирки, содержащие 2,4 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия.
Сыворотки от крупного рогатого скота, иммунизированного агглютиногенными противобруцеллезными вакцинами, исследуют с разведения 1:100. Исходное разведение 1:50 готовят путем внесения 0,1 см сыворотки в пробирку с 4,9 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия или по 0,05 см сыворотки и 2,45 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия, если используются пробирки вместимостью до 5 см .
Сыворотки от мелкого рогатого скота исследуют с разведения 1:25. Исходное разведение 1:12,5 готовят путем внесения 0,2 см сыворотки в пробирки, содержащие 2,3 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия.
Одновременно с исследуемыми сыворотками аналогично готовят разведения контрольных сывороток: бруцеллезной и негативной.
Исследуемые и контрольные сыворотки в исходных разведениях в пробирках выдерживают в водяной бане, нагретой до 60°С-62°С в течение 30 мин.
При получении положительного результата исследования сыворотки крови животных в одном разведении, для определения титра гемагглютининов в РНГА постановку реакции проводят в четырех разведениях, при этом исходное разведение каждой сыворотки готовят заново.
Все сыворотки (исследуемые и контрольные) проверяют на отсутствие гемагглютинирующих свойств.
В лунки первого, второго, третьего и четвертого рядов планшета вносят по 0,5 см и пятого ряда по 0,25 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия.
В лунки первого ряда добавляют по 0,5 см , а в лунки пятого ряда по 0,25 см исследуемых и контрольных сывороток в исходном разведении. После смешивания путем пипетирования по 0,5 см разведенных сывороток из лунок первого ряда переносят в лунки второго ряда, из лунок второго — в лунки третьего, из лунок третьего — в лунки четвертого, из лунок четвертого ряда по 0,5 см разведенных сывороток удаляют.
Во все лунки первых четырех рядов с разведенными сыворотками добавляют по 0,05 см антигена в рабочем разведении, которое готовят путем смешивания равных объемов антигена и 0,85%-ного раствора хлористого натрия. В лунки пятого ряда вносят 0,05 см взвеси несенсибилизированных эритроцитов в рабочем разведении (один объем несенсибилизированных эритроцитов + один объем 0,85%-ного раствора хлористого натрия).
Содержимое лунок перемешивают путем легкого постукивания по краю планшета до получения равномерной взвеси антигена в сыворотке, выдерживают при температуре от 18°С до 24°С в течение 3-4 ч и проводят учет реакции.
Результат контроля на самоагглютинирующие свойства исследуемых и контрольных сывороток должен быть отрицательным.
Допускается постановка реакции в два этапа: накануне готовят исходные разведения исследуемых и контрольных сывороток крови, прогревают при указанном выше режиме, хранят при температуре от 2°С до 8°С и на следующий день исследуют.
После постановки реакции планшеты выдерживают в 1%-ном растворе хлорамина или другом антисептическом растворе 1,5-2,0 ч. Впоследствии их моют, как указано выше.
7.8.4 Обработка результатов
Реакции учитывают визуально и оценивают в крестах по следующей схеме:
«++++» (четыре креста) — 100%-ная агглютинация эритроцитов, агглютинат в виде хорошо выраженного «зонтика» покрывает все дно лунки, возможно сползание и заворачивание краев агглютината в виде «зонтика»;
«+++» (три креста) — 75%-ная агглютинация эритроцитов, агглютинат в виде хорошо выраженного «зонтика» меньшего диаметра, чем при оценке реакции на четыре креста. В центре лунки возможно образование с трудом различаемого кольца из осевших неагглютинированных эритроцитов;
«++» (два креста) — 50%-ная агглютинация эритроцитов, осевшие неагглютинированные эритроциты образуют на дне лунки ровное кольцо с зернистостью вокруг него;
«+» (один крест) — на дне лунки кольцо коричнево-красного цвета;
«-» (минус) — эритроциты оседают в виде компактной «пуговки» или колечка.
За титр антител принимают наибольшее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация эритроцитов с оценкой четыре или три креста. Реакции с оценкой два креста («++»), один крест («+») и минус («-«) считают отрицательными.
7.9 Иммуноферментный анализ (ИФА)
Сущность метода заключается в выявлении в образце сыворотки крови животных иммуноглобулинов класса G к бактериям рода Brucella.
7.9.1 Подготовка к исследованию
7.9.1.2 Приготовление рабочего раствора ФСБ-Т
ФСБ-Т — концентрированный раствор буфера (флакон N 1) разводят в 25 раз дистиллированной водой и тщательно перемешивают. Для этого содержимое одного флакона концентрата в объеме 26 см переносят в мерную колбу и доводят объем до 650 см дистиллированной водой. Если в концентрате присутствуют кристаллы, то его перед разведением нагревают и тщательно взбалтывают. В случае использования одного или нескольких стрипов планшета в чистый флакон отбирают необходимое для данного исследования количество составных частей ФСБ-Т в соответствии с таблицей 6.
Таблица 6 — Разведения ФСБ-Т
источник