Бруцеллы (род Brucella) – возбудители бруцеллеза человека и животных. В. melitensis, В. abortus и В. suis – вызывают заболевание у человека; B. ovis, B. canis, B. neotomae заболевания человека не вызывают.
Морфология, физиология. Мелкие Гр– коккобактерии размером 0,5-0,7х0,6-1,5 мкм. Также могут быть палочковидной формы; в мазках обычно расположены беспорядочно. Жгутиков не имеют. Спор не образуют. Свежевыделенные штаммы могут образовывать нежную капсулу при культивировании на средах, содержащих 10% иммунной сыворотки барана или лошади, а также при выращивании на куриных эмбрионах.
Требовательны к питательным средам. Для выращивания обычно применяют триптозный, триптозо-казеиново-соевый и кровяной (5% овечьей крови) агары; оптимальная среда для культивирования — печёночный агар Хеддльсона. Выделяемые из организма больных они размножаются очень медленно, рост может быть обнаружен только через 1–3 недели после посева исходного материала. Многократное пересевание в лабораторных условиях делает культуры способными расти в течение 1–2 дней. На плотных питательных средах образуют мелкие, выпуклые, бесцветные с перламутровым блеском колонии S-формы (жемчужины), легко переходят в мукоидную и шероховатую. В жидких средах возникает равномерное помутнение. Под влиянием антибиотиков образуют L-формы.
Бруцеллы строгие аэробы, а В. abortus в первых поколениях требует увеличенной концентрации (5–10%) СО2.
БХ: расщепляют глюкозу и некоторые другие углеводы, разлагать мочевину и аспарагин, гидролизовать белок, пептоны, аминокислоты, выделять каталазу, гиалуронидазу, пероксидазу, липазу, фосфатазу и другие ферменты. Внутри видов бруцелл различают биовары. Их дифференциация основана как на биохимических различиях, так и на способности расти на средах с фуксином и тионином, лизабельности фагом Т6, агглютинабельности моноспецифическими сыворотками.
АГ. Содержат поверхностно расположенный Vi-АГ и соматические видоспецифические АГ А и М, количественное соотношение которых различно у разных видов. У В.melitensis преобладают М-АГы. у В. abortus и В. suis – А-АГ. Для идентификации бруцелл по антигенным свойствам используют реакцию адсорбции агглютининов или монорецепторные сыворотки.
Экология и распространение. Зоонозная инфекция. Возбудители разных видов циркулируют среди животных, от которых заражаются и люди. В.melitensis вызывает заболевания мелкого рогатого скота, В. abortus – КРС, В.suis – свиней. Непатогенные для человека
Бруцеллы устойчивы к действию факторов окружающей среды. Они длительно сохраняют жизнеспособность при низкой температуре. В почве, моче, испражнениях животных, больных бруцеллезом, в навозе, сенной трухе возбудители выживают 4–5 мес., в шерсти– 3– 4 мес., в пыли – 1 мес., в замороженном мясе – до 5 мес. К высокой температуре и дезинфицирующим веществам бруцеллы высокочувствительны: при 60°С погибают за 30 мин, при кипячении – мгновенно. Все дезинфектанты губят бруцелл в течение нескольких минут.
Патогенность и патогенез. Проникновение – алиментарным, контактным и воздушно-капельным путями. Алиментарный путь заражения связан с употреблением в пищу продуктов животноводства (масла, молока, мяса), полученных от больных животных. Контактным путем заражаются чаще ветеринары, зоотехники, работники мясокомбинатов при уходе за больными животными, обработке сырья. Заражение возможно при работе с инфицированной шерстью, ветошью, когда имеет место распыление, попадание бруцелл в воздух. Для человека наиболее патогенными являются В.melitensis – возбудитель болезни мелкого рогатого скота (овец, коз).
Выраженные инвазивные и агрессивные свойства бруцелл обусловливают способность возбудителя проникать в организм через неповрежденные слизистые оболочки. После проникновения в организм распространяются лимфогенным путем, попадают в кровь, а из крови – в селезенку, костный мозг, лимфоузлы, где, локализуясь внутриклеточно, могут длительно сохраняться.
Болезнетворность бруцелл определяется действием эндотоксина. Выделяющиеся ферменты (гиалуронидаза и др.) способствуют распространению микробов в тканях. В патогенезе бруцеллеза имеет значение способность возбудителя размножаться в клетках лимфоидно-макрофагальной системы.
С первых дней болезни возникает реакций ГЗТ, которая сохраняется в течение всей болезни и длительное время после выздоровления.
Иммунитет. В основе иммунитета при бруцеллезе лежит активность системы Т-лимфоцитов. Важную роль играет фагоцитоз и состояние аллергии. Обезвреживание бруцелл происходит при участии антител – опсонинов, агглютининов.
Лабораторная диагностика. Проводится бактериологическим и серологическим методами. Материалом для бактериологического исследования служат кровь, испражнения и моча больных, иногда – спинномозговая жидкость. Выделением возбудителя занимается специальная режимная лаборатория.
Образцы инкубируют в МПБ или бульоне Мартена (можно использовать соевый бульон) при 37°С. При проведении исследования засевают 2 порции среды и в одной создают повышенную концентрацию СО. Через 4-5 сут наблюдают рост бруцелл, нередко в виде мелких колоний, вкрапленных в тяжи фибрина; среда остаётся слегка мутной или прозрачной. После пересева на твёрдые среды отмечают характерный рост колоний, из которых отвивают чистые культуры с последующими идентификацией биохимических свойств, определением способности расти на средах с добавлением некоторых анилиновых красителей (бактериостатический метод Хеддльсона) и определением биотипа реакциями агглютинации.
Серологические исследования. Реакция агглютинации (реакция Райта) — один из основных методов диагностики бруцеллёза. Динамика реакции может быть различной, для неё характерно колебание титров в течение суток; положительная реакция с первого дня заболевания; наиболее высокие титры отмечают через 1-2 мес. Для получения адекватных результатов необходимо использовать негемолизированную сыворотку и Аг, приготовленный из S-форм бруцелл (применять Аг диссоциированных форм нельзя); в эндемичных очагах, вызванных Brucella melitensis, рекомендуют применять гомологичный Аг. Следует помнить, что для реакции Райта характерны проагглютинационные зоны, или прозоны (отсутствие агглютинации в первых разведениях и чёткое её проявление в более высоких разведениях сыворотки). Часто применяют микрометод реакции агглютинации на стекле (реакция Хеддльсона). В острой фазе заболевания диагностическую ценность имеет иммуноферментный метод, выявляющий IgM в сыворотке больного. Выявление неполных AT (реакция Кумбса) с применением антиглобулиновой сыворотки. Для диагностики, особенно при отрицательных результатах бактериологических и серологических исследований, используют аллергические кожные пробы (проба Бюрне), обычно положительные у 70-85% пациентов к концу 1 мес заболевания. В качестве Аг применяют бруцеллин (мелитин, абортин) — протеиновый экстракт культуры бруцелл. Пробу также применяют для проведения эпидемиологических обследований; бывает положительной после вакцинации.
Для выявления возбудителя в молоке широко применяется кольцевая проба Банга.
Профилактика и лечение. Общие и специфические мероприятия ветеринарной службы. Выявляют и ликвидируют бруцеллез среди сельскохозяйственных животных, обезвреживают продукты и сырье животного происхождения. Людей, подвергающихся опасности заражения, вакцинируют живой бруцеллезной вакциной. Лечение бруцеллёза затруднено внутриклеточным паразитизмом бруцелл, что защищает их от действия антимикробных препаратов и AT. Препаратами выбора считают тетрациклин и стрептомицин. В тяжёлых и упорных случаях можно назначить рифампин (рифамицин). Смертность без лечения может достигать 5-10%.
источник
У крупного рогатого скота, яков, буйволов, верблюдов, лошадей бруцеллез вызывает В. abortus ; у свиней, северных оленей — В. suis ; у овец и коз — В. melitensis ; у собак — В. canis . Наряду с видовой патогенностью бруцелл возможна миграция их на другие виды животных. Наиболее часты случаи заражения крупного рогатого скота, собак и других животных В. melitensis .
Источником возбудителя инфекции служат больные бруцеллезом животные и микробоносители, особенно опасны абортировавшие самки, которые выделяют чрезвычайно большое количество бруцелл с околоплодными водами, плодными оболочками, абортированным плодом, истечениями из половых путей. Выделяются бруцеллы также с молоком, спермой, мочой, калом.
Занос бруцеллеза в благополучные хозяйства чаще всего происходит с больными животными или переболевшими — бруцеллоносителями при несоблюдении правил карантинирования. Возникновению бруцеллеза способствуют несвоевременная уборка последов, навоза, несоблюдение режима дезинфекции. Передача инфекции возможна при контакте больных и здоровых животных на пастбищах, в местах водопоя. Заражение происходит алиментарно и контактно (половым путем), через слизистые оболочки и кожу. Продукты, инфицированные бруцеллами, особенно молочные (молоко, обрат, сыворотка), сырье животного происхождения, предметы ухода, корма, подстилка, вода, почва относятся к факторам передачи. В овцеводческие хозяйства бруцеллез может быть занесен инфицированными сторожевыми собаками. На фермах крупного рогатого скота, овец, коз, свиней, северных оленей бруцеллез протекает в виде эпизоотических вспышек, а у лошадей, буйволов, собак и других животных проявляется спорадически. В свежих очагах бруцеллеза за несколько месяцев может быть инфицировано до 60 % и более восприимчивых животных. Молодняк более устойчив к заражению бруцеллезом, чем взрослые животные.
Возникновению бруцеллеза способствуют также неудовлетворительные ветеринарно-санитарные условия содержания и выращивания поголовья, обусловливающие снижение резистентности организма животных.
Патогенез. В развитии бруцеллезной инфекции различают три фазы: первичную (регионарная) инфекцию, фазу генерализации и фазу вторичной локализации.
Первая фаза патогенеза соответствует инкубационному периоду болезни, когда бруцеллы проникают в организм и задерживаются в регионарных лимфатических узлах. В зависимости от количества и вирулентности возбудителя, а также от резистентности организма бруцеллы в лимфатических узлах уничтожаются или размножаются и проникают в кровь, с которой заносятся в паренхиматозные органы.
Проникновение возбудителя в кровь соответствует второй стадии — фазе генерализации, проявляется особенно характерно у беременных животных при проникновении бруцелл в матку, что сопровождается воспалительным процессом, пролиферативными и дегенеративно-некротическими изменениями, приводящими к гибели и изгнанию плода; у самцов отмечают орхиты, бурситы и другие симптомы. С развитием инфекционного процесса в крови животных появляются антитела. Затем развивается аллергическое состояние, которое особенно ярко проявляется в период затухания инфекционного процесса.
Генерализованная фаза инфекции сменяется латентным течением бруцеллеза без клинических проявлений — фазой вторичной локализации. При этом отмечается клиническое выздоровление животного, однако у него сохраняется бактерионосительство. Такие животные способны длительно выделять возбудитель во внешнюю среду и являться источниками возбудителя инфекции.
Течение и клиническое проявление. Инкубационный период продолжается 2. 4нед. Бруцеллез у животных протекает в основном в латентной форме, и если среди восприимчивого поголовья нет беременных, то выявить болезнь можно только при помощи серологических исследований.
Течение болезни в стаде зависит от числа беременных животных. В отдельных стадах абортируют до 50 % животных и более. Основной клинический признак бруцеллеза у самок — аборт, наблюдающийся обычно во втором периоде беременности. У коров аборты происходят на 5. 8-м месяце стельности, за 1. 2 дня до аборта нередко отмечают припухание наружных половых органов, истечение из влагалища буроватой слизи, без запаха, и набухание вымени. У абортировавших животных отмечают задержание последа и эндометрит, иногда возникают маститы, бурситы, у самцов возможны орхиты, эпидидимиты. При заносе бруцеллеза в ранее благополучное стадо может абортировать до 50. 60 % животных. Коровы или нетели, как правило, абортируют один, реже два раза.
Овцы и козы абортируют на 3. 5-М месяце беременности. В некоторых случаях плоды донашиваются, но, как правило, погибают в первые дни жизни. В первые 1. 1,5мес после аборта развиваются артриты, метриты, бурситы.
Свиноматки могут абортировать как в первой, так и во второй половине супоросности, чаще всего на 60. 90-й день беременности. Аборт, как правило, протекает легко, и многие свиноматки уже через 4. 5 дней снова приходят в охоту, у некоторых из них послед задерживается на 1. 2сут, после чего развивается эндометрит, возникают маститы, а в подкожной клетчатке, скелетной мускулатуре — абсцессы.
У быков, баранов, хряков при бруцеллезе отмечают орхиты, эпидидимиты с последующей атрофией семенников. У лошадей наиболее характерными признаками бруцеллеза являются бурситы в области затылка и холки, а у северных оленей и маралов — бурситы конечностей. Отмечено более легкое переболевание бруцеллезом буйволов и зебувидного скота.
У собак и кошек болезнь протекает бессимптомно и может быть обнаружена при серологическом исследовании.
Патологоанатомические признаки. Картина вскрытия при бруцеллезе нехарактерная. У абортировавших животных плодные оболочки набухшие, покрыты хлопьями фибрина и гноя. Возможны признаки гнойно-катарального мастита, у самцов — гнойно-некротических орхитов. У абортированных плодов находят отеки подкожной клетчатки и пупочного канатика, а также катаральное воспаление слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта, легких, некротические участки в печени.
Диагностика и дифференциальная диагностика. Диагноз на бруцеллез устанавливают комплексно на основании анализа эпизоотологических данных, клинических признаков, лабораторных и аллергических (у свиней) исследований.
Из эпизоотологических данных учитывают благополучие местности по бруцеллезу, факты приобретения животных из других хозяйств. При клиническом обследовании животных обращают внимание на наличие абортов, задержание последов, эндометритов, а у самцов — бурситов, орхитов.
Для бактериологического исследования в лабораторию посылают патологический материал (плод с плацентой, содержимое бурс, кусочки паренхиматозных органов, кровь, молоко и др.) свежий или консервированный. Одновременно в лабораторию направляют для серологического исследования молоко, сыворотку крови или кровь от абортировавшего или убитого с диагностической целью животного.
Бактериологическая диагностика бруцеллеза предусматривает бактериоскопию мазков из патологического материала и при необходимости постановку биопробы на морских свинках. Бактериоскопия мазков-отпечат-ков, окрашенных по Граму и специальными методами (по Козловскому, Шуляку—Шину), имеет ориентировочное значение. Выделение культуры бруцелл при посеве биоматериала на специальные питательные среды и положительная биопроба на морских свинках имеют решающее значение при постановке бактериологического диагноза на бруцеллез.
Для массовых профилактических и диагностических прижизненных исследований скота на бруцеллез широко используют РА, РСК, РДСК, РДП и РИД. Применяют также РБП (роз-бенгал проба) и кольцевую реакцию (КР) с молоком коров. Все указанные реакции используют в серологической диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота, яков, зебу, буйволов.
Сыворотки крови животных благополучных хозяйств, дающие положительную РБП, сразу же исследуют в РА и РСК для установления титра агглютининов и наличия комплементсвязывающих антител. Кольцевая реакция (КР) с молоком применяется для контроля за благополучием стада по бруцеллезу, положительные результаты необходимо перепроверять по РА, РСК, РДСК. У мелкого рогатого скота, лошадей, верблюдов, оленей используют РА, РСК/РДСК, РБП, а у свиней — аллергический метод. У собак и животных других видов используют РА и РСК. Аллергический метод исследования используется у свиней, и наибольшую диагностическую ценность он имеет на поздних стадиях развития болезни. Для аллергических исследований применяют бруцеллин ВИЭВ.
Диагноз на бруцеллез считают установленным: 1) при выделении культуры бруцелл из биоматериала; 2) при положительной биопробе; 3) при положительных результатах серологических исследований невакциниро-ванных животных в следующих показателях: для крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), верблюдов и лошадей — РА с наличием антител 200 МЕ/мл и выше, а также при положительных результатах в РИД; для овец и коз — РА 100 МЕ/мл и выше; для оленей (маралов) и собак — РА 50 МЕ/мл и выше; для всех видов животных РСК в разведении сыворотки 1:5 и выше. При выявлении среди крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), верблюдов и лошадей, реагирующих только в РА с содержанием антител 50. 100 МЕ/мл, а среди овец, коз, оленей (маралов) — 25. 50 МЕ/мл, их обследуют повторно через 15. 30 дней; 4) свиней признают больными бруцеллезом, если аллергическая проба с бруцеллином подтверждена положительной РСК.
Иммунизированных животных исследуют на бруцеллез согласно утвержденным правилам.
Бруцеллез дифференцируют от других инфекционных болезней, которые сопровождаются абортами: кампилобактериоза, трихомоноза, сальмонеллеза, хламидийного аборта, лептоспироза, инфекционного эпидидимита, иерсиниоза, а также от незаразных болезней с симптомами аборта.
Иммунитет, специфическая профилактика. Иммунитет при бруцеллезе относительно напряженный и формируется медленно. Ведущее значение в иммунной защите при бруцеллезе играет клеточный иммунитет. Наличие антител в сыворотках крови животных не предохраняет их от повторного заражения. Для специфической профилактики возможно применение живых, аттенуированных, инактивированных и генно-инженерных вакцин. Наибольшее применение нашли живые вакцины из штамма В. abortus 19 и слабоагглютиногенного штамма В. abortus 82 для вакцинации крупного рогатого скота. Для иммунизации овец и коз используют вакцину из штамма В. melitensis Рев-1.
Профилактика. Мероприятия по профилактике бруцеллеза животных в благополучных хозяйствах, населенных пунктах и мероприятия по его ликвидации в неблагополучных хозяйствах предусмотрены в соответствии с действующими Санитарными и ветеринарными правилами. В благополучных по бруцеллезу хозяйствах и населенных пунктах проводят ветери-нарно-санитарные мероприятия по охране хозяйств от заноса в них возбудителя инфекции (контроль за приобретением, перемещением животных и реализацией животноводческой продукции, профилактическое каран-тинирование и т. д.). С профилактической целью в плановом порядке на бруцеллез исследуют быков-производителей, коров, буйволов, зебу, яков, верблюдов, оленей, маралов и телок в возрасте старше 1 года, баранов-производителей, овцематок и козематок, оставшихся без ягнят, хряков и свиноматок 1 раз в год. Лошадей и других животных исследуют в хозяйстве, неблагополучном по бруцеллезу, при выявлении признаков данного заболевания (аборты, бурситы) и др. Положительно реагирующих на бруцеллез лошадей отправляют на убой. В звероводческих хозяйствах ветеринарный контроль заключается в бактериологических исследованиях абортированных плодов. В хозяйствах, поставляющих молоко в детские и медицинские учреждения и торговую сеть по прямым связям, крупный рогатый скот исследуют на бруцеллез 2 раза в год (весной и осенью) в РА и РСК или РА и РИД. В племенных хозяйствах быков исследуют на бруцеллез 2 раза в год в РА и РСК или РА и РИД. Всех животных, поступающих из других областей, исследуют в период карантина в РА и РСК, свиней — в РСК/РДСК и аллергическим методом. Откормочное поголовье обследуют на бруцеллез перед сдачей на убой за 30 дней до отправки на мясокомбинат.
Лечение. Лечение животных, больных бруцеллезом, не проводится, они подлежат убою.
Меры борьбы. При установлении диагноза на бруцеллез хозяйство (населенный пункт) объявляют неблагополучным и вводят ограничения, по условиям которых запрещаются: 1) провоз (прогон) животных через неблагополучную территорию, ввоз на эту территорию восприимчивых к бруцеллезу животных, перегруппировка животных внутри хозяйства без разрешения главного ветеринарного врача хозяйства; 2) использование больных (положительно реагирующих) бруцеллезом животных и полученного от них приплода для воспроизводства стада; 3) продажа населению с целью откорма или выращивания животных, содержащихся на неблагополучных фермах; 4) совместный выпас, водопой и иной контакт больных животных и поголовья неблагополучных стад со здоровыми животными; 5) вывоз сена и соломы за пределы неблагополучного хозяйства.
Животных всех видов, положительно реагирующих на бруцеллез, немедленно изолируют и в течение 15 дней сдают на убой без откорма и нагула независимо от их племенной ценности, возраста, состояния беременности.
Молоко от коров, положительно реагирующих на бруцеллез, обеззараживают кипячением или перерабатывают на топленое масло. Молоко от нереагирующих коров неблагополучного стада обеззараживают в хозяйстве при температуре 70° С в течение 30 мин или при температуре 85. 90 «С в течение 20 с. Перед отправкой с молочного завода молоко и обрат должны быть подвергнуты обеззараживанию. Запрещается их использование без термической обработки для кормления молодняка.
Оздоровление хозяйств, неблагополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота, осуществляют двумя способами: 1) полной заменой неблагополучного поголовья и проведением комплекса мер по санации помещений, территорий ферм, пастбищ и т. д.; 2) иммунизацией скота противо-бруцеллезными вакцинами с последующим систематическим исследованием, согласно утвержденным наставлениям по их применению.
Первый метод применяют при установлении бруцеллеза в благополучных областях, краях, республиках и районах, не проводящих иммунизацию скота против бруцеллеза, находящихся на территории неблагополучных административных территорий, а также во всех случаях острого течения бруцеллеза, сопровождающегося массовыми абортами коров в стаде, и когда не достигается оздоровление хозяйства в течение 2. 5 календарных лет с применением противобруцеллезных вакцин.
Второй способ оздоровления неблагополучных хозяйств с использованием противобруцеллезных вакцин применяют в районах, областях, краях и республиках с широким распространением бруцеллеза по разрешению ветеринарной службы области, края, республики и согласованию с ветеринарными органами МСХ РФ.
Хозяйство признается оздоровленным от бруцеллеза крупного рогатого скота в следующих случаях: при полной замене неблагополучного поголовья и проведении комплекса мер по санации животноводческих помещений, территории (механическая очистка, санитарный ремонт животноводческих помещений, дезинфекция) и получении двух отрицательных результатов серологических исследований на бруцеллез всех видов животных с интервалом 30 дней, включая скот, принадлежащий гражданам, проживающим в данном населенном пункте.
После выполнения всего комплекса оздоровительных мероприятий в хозяйстве ограничения по бруцеллезу снимают в установленном порядке.
Оздоровление хозяйств, неблагополучных по бруцеллезу овец (коз), на стационарно благополучных территориях проводят путем убоя неблагополучной отары и проведения серологического исследования остального поголовья мелкого рогатого скота до двукратного получения (с интервалом 30 дней) отрицательного результата, после чего ограничения снимают при условии выполнения комплекса ветеринарно-санитарных мероприятий. В стационарно неблагополучных по бруцеллёзу овец хозяйствах оздоровление ведут с использованием противобруцеллезной вакцины согласно наставлению по ее применению.
Оздоровление свиноводческих хозяйств, неблагополучных по бруцеллезу, проводят путем убоя всего неблагополучного поголовья соответствующих свинарников. После санации помещений, территории и снятия ограничений на ферму завозят здоровых свиней.
В звероводческих хозяйствах, где установлен бруцеллез, животных исследуют 1 раз в месяц серологическим методом. Ограничения снимают после убоя больных животных и получения отрицательных результатов серологических исследований и санации помещений ферм. Если бруцеллез установлен среди скота частных ферм, все поголовья исследуют серологически до двукратного получения отрицательных результатов.
Транспортировку животных на убой осуществляют под контролем ветеринарного специалиста. Убой положительно реагирующих на бруцеллез животных производят на санитарной бойне мясокомбината с последующей дезинфекцией производственного помещения и технологического оборудования.
На неблагополучных по бруцеллезу фермах обязательны дезинфекция, дезинсекция и дератизация, санитарный ремонт животноводческих помещений и другие ветсанмероприятия в соответствии с действующими правилами. Для дезинфекции применяют 20%-ную взвесь свежегашеной извести или осветленный раствор хлорной извести, содержащий 2 % активного хлора, 5%-ный горячий раствор кальцинированной соды, 2%-ный раствор формальдегида, 0,5%-ный раствор глутарового альдегида, 5%-ный раствор фенолята натрия и другие препараты. Навоз обезвреживается биотермическим методом.
Меры по охране людей от заражения бруцеллезом. Заражение человека бруцеллезом происходит преимущественно контактным (с больными животными, сырьем и инфицированными продуктами животного происхождения) или алиментарным путем. Для людей наиболее патогенны В. melitensis , которые могут вызывать эпидемические вспышки заболевания, протекающего в тяжелой форме.
К работе с животными, реагирующими при исследовании на бруцеллез, допускаются работники, привитые против бруцеллеза и проинструктированные по соблюдению санитарных правил. Лица, имеющие на кистях рук порезы, ссадины и другие повреждения кожи, допускаются к работе только в резиновых перчатках после предварительной обработки пораженного участка.
При проведении противобруцеллезных мероприятий строго соблюдают меры предосторожности, исключающие заражение людей и инфицирование объектов внешней среды. Запрещаются доение овец и коз, изготовление брынзы и сыров на фермах, неблагополучных по бруцеллезу. Шерсть от овец из неблагополучных отар подвергают в хозяйстве дезинфекции бромистым метилом под пленкой, после чего ее вывозят для переработки.
Контрольные вопросы и задания. 1. Этиологическая структура и эпизоотологические особенности бруцеллеза у животных разных видов. 2. Назовите основные методы прижизненной диагностики болезни по видам животных. 3. Что вызывает подозрение на бруцеллез и как поступить в этих случаях в целях установления достоверного диагноза? 4. От каких болезней и на основании каких данных следует проводить дифференциальную диагностику бруцеллеза? 5. На основании каких результатов лабораторных исследований диагноз на бруцеллез считают установленным у животных разных видов вакцинированных и невакци-нированных поголовий? 6. Что запрещается по условиям ограничений при бруцеллезе? 7. Какие существуют способы оздоровления хозяйств и чем обусловлен их выбор в практических условиях? 8. Каков порядок использования молока и молочных продуктов из неблагополучных по бруцеллезу хозяйств? 9. Перечислите биопрепараты, используемые для специфической диагностики и иммунопрофилактики бруцеллеза животных. 10. Составьте схемы оздоровления хозяйств, неблагополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота, овец (коз), буйволов, яков, зебу, верблюдов, свиней, северных оленей и пушных зверей. 11. Как проводят оздоровление от бруцеллеза животных в хозяйствах граждан? 12. В чем состоят мероприятия по профилактике бруцеллеза на предприятиях мясной промышленности? 13. Какими методами и средствами осуществляют защиту людей от инфицирования бруцеллами в хозяйствах (предприятиях) различных категорий на региональном и местном уровнях?
источник
Возбудители бруцеллеза (Brucella melitensis, Brucella abortus, Brucella suis и Brucella canis) высоко контагиозны и работа с ними проводится в специализированных лабораториях особо опасных инфекций. Постановку серологических реакций и аллергических проб для диагностики бруцеллеза производят соответственно в обычных микробиологических лабораториях и больничных условиях.
Главным резервуаром бруцелл являются домашние сельскохозяйственные животные, а также другие виды животных, от которых человек заражается преимущественно контактным или контактно-бытовым, реже алиментарным путем. Клинические проявления бруцеллеза многообразны, поражаются лимфатическая, сосудистая, гепато-лиенальная системы и особенно опорно-двигательный аппарат Методы микробиологической диагностики бруцеллеза представлены в схеме 7.
Схема 7. Микробиологическая диагностика бруцеллеза
|
Серологический метод— постановка РА с сывороткой крови больного (реакция Райта, ставят в начале 2-й недели болезни, диагностический титр 1:200 и выше), ускоренной РА на стекле (реакция Хеддльсона), РСК и ИФА.
Диагностикумом в реакции Райта и Хеддльсона является взвесь убитых бруцелл с красителем генциановым фиолетовым или метиловым фиолетовым.
Реакцию агглютинации Хеддльсона ставят на стеклянной пластинке, на которую наносят микропипеткой неразведенную исследуемую сыворотку в количествах 0,08; 0,04; 0,02; 0,01 и 0,02 мл, добавляют по 0,03 мл бруцеллезного диагностикума, кроме последней дозы, в которую вносят 0,03 мл ФР (контроль сыворотки). Контролем диагностикума является смесь из 0,03 мл антигена и 0,03 мл ФР. Все капли перемешивают стеклянной палочкой или бактериологической петлей и после легкого покачивания стекла наблюдают за появлением мелкозернистого окрашенного агглютината. Отсутствие агглютинации во всех пробах сыворотки оценивается как отрицательная реакция, наличие агглютинации в 1-й пробе (0,08 мл сыворотки) — сомнительная, во 2-й (0,04 мл) — слабоположительная, в 3-й или 4-й пробах (0,02-0,01 мл) — положительная, во всех пробах — резко положительная реакция. Поскольку реакция агглютинации Хеддльсона иногда бывает положительной у здоровых людей за счет нормальных антител, она обязательно подтверждается реакцией Райта.
РИФ, РНГА, РСК и особенно ИФА более чувствительны, чем реакция агглютинации. Для ранней диагностики бруцеллеза особую ценность имеет ИФА, позволяющий выявить в сыворотке больных антибруцеллезные антитела класса IgM,которыев отличие от IgG появляются в ранние сроки болезни, свидетельствуя о свежем инфицировании.
Аллергический метод –постановка внутрикожной аллергической пробы Бюрне с 15-20 дня заболевания. Учет реакции проводится через 24-48 часов, положительной считается реакция в случае появления на месте введения аллергена (бруцеллина) болезненности, гиперемии и инфильтрации кожи диаметром 3 см и более. Положительная аллергическая реакция на бруцеллин сохраняется в течение длительного времени после перенесенного бруцеллеза, а также после прививки.
Бактериологический метод— посев крови для выделения гемокультуры в 2 флакона с 50 мл печеночного или асцитического бульона (рН 7,1-7,2) или МПБ с добавлением 1 % глюкозы, 2 % глицерина и антифаговой сыворотки (для инактивации бруцеллезного бактериофага) в первые дни болезни при наличии лихорадки. При отрицательных результатах исследование повторяют, т.к. бактериемия наблюдается в течение 1 года и более.
Один флакон выращивают в обычных аэробных условиях, другой — в герметично закрытом сосуде с 10 % углекислого газа (или СО2-инкубаторе) при температуре 37 0 С до 1 месяца, делая пересевы на скошенный печеночный агар или эритрит-агар каждые 4-5 дней. На жидких средах бруцеллы растут с образованием легкого помутнения и небольшого слизистого осадка, на плотных средах в виде округлых, диаметром до 5 мм, серовато-белых, блестящих, прозрачных с янтарным оттенком в проходящем свете колоний. Типичные колонии пересевают на скошенный агар и идентифицируют выделенную культуру до уровня вида.
Выполняются также посевы исследуемого материала в желток свежего куриного яйца или в желточный мешок куриного эмбриона с последующей их инкубацией в течение 5 дней при 37 0 С и пересевом содержимого желточного мешка на плотные и жидкие питательные среды для выделения чистой культуры бруцелл.
Бруцеллы идентифицируют на основании изучения морфологических (рис. 13 — грамотрицательные коккобактерии), культуральных, биохимических (они не ферментируют уг-
Рис. 13. Возбудитель бруцеллеза (Brucella melitensis). Окраска по Граму. Мелкие грамотрицательные коккобактерии.
леводы, не свертывают молоко и не разжижают желатину, выделяют сероводород), антигенных свойств (постановка РА с моноспецифическими сыворотками против антигеновА, М, R), чувствительности к специфическому бактериофагу и бактериостатическому действию анилиновых красителей (табл. 8).
Таблица 8.Дифференциация основных видов бруцелл
| Признак | Вид бруцелл | ||
| Br. melitensis | Br. abortus | Br. suis | |
| Условия культивирования | аэробные | 10% СО2 | аэробные |
| Рост на средах с красителями: | |||
| фуксином 1:50000 | + | + | — |
| тионином 1:25000 | + | — | + |
| пиронином 1:200000 | + | + | — |
| Образование Н2S | — | ± | ± |
| РА с монорецепторными сыворотками | |||
| А | ± | ± | + |
| М | ± | ± | ± |
| Чувствительность к бруцеллезному фагу | — | + | ± |
. Обозначения: «-« — отрицательная; «+» — положительная; «±» — непостоянная реакции.
Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:
источник
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ
INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стан» дартиэации установлены ГОСТ 1.0—92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2—2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные. правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «8ГНКИ»)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстан-
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 12 ноября 2015 г. № 82-П)
‘ а принятие проголосовали:_
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004—97
Код страны по МК 3 и позволяющий получать частицы суспензии диаметром 10 — 50 мкм.
Микроскоп иммерсионный или стереоскопический по ГОСТ 8074.
Центрифуга лабораторная со скоростью вращения до 6000 об./мин.
СОг-инкубатор или эксикатор стеклянный (микроанаэростат) с содержанием углекислого газа от 10% до 15%.
Термостат, обеспечивающий поддержание температуры от 20 -‘С до 50 °С.
Холодильник бытовой, обеспечивающий поддержание температуры от О °С до 10 °С по ГОСТ 16317.
Баня водяная с терморегулятором.
5.2 Питательные среды и реактивы
Агар микробиологический по ГОСТ 17206 или агар пищевой по ГОСТ 16260.
Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей по ГОСТ 13805.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Йод кристаллический по ГОСТ 4159.
Калий йодистый по ГОСТ 4232.
Калия гидроокись по ГОСТ 24363.
Кислота борная по ГОСТ 9656 или ГОСТ 18704.
Кислота соляная по ГОСТ 3118.
Кислота уксусная по ГОСТ 61.
Кристаллический фиолетовый (генцианеиолет) по ГОСТ 4919.1.
Малахитовый зеленый по ГОСТ 4919.1.
Метанол технический по ГОСТ 2222.
Метиленовый синий по ГОСТ 4919.1.
Натрий хлористый по ГОСТ 4233.
Натрия гидроокись по ГОСТ 4328.
Натрий лимоннокислый по ГОСТ 22280.
Раствор натрия хлорида 0.9 %-ный изотонический (физиологический раствор).
Физиологический раствор фенолиэированный 0.5 %-ный.
Сафранин. 2 %-ный водный раствор по ГОСТ 4919.1.
Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962.
Стандарт мутности оптический, эквивалентный 10 международным единицам.
Пипетки градуированные вместимостью 1.2.5 и 10 см 3 по ГОСТ 29230.
Пипетки Мора вместимостью 100 см 3 .
Пробирки бактериологические по ГОСТ 25336.
Пробирки серологические Флоринского по ГОСТ 25336.
Стекла предметные по ГОСТ 9284.
Ступка фарфоровая по ГОСТ 9147.
Чашки бактериологические одноразового использования или стеклянные по ГОСТ 25336.
5.4 Животные и материалы Бактериофаг бруцеллезный*.
Бумага фильтровальная марок ФБ-II или ФБ-HI по ГОСТ 12026.
Добавки селективные, ингибирующие рост посторонней микрофлоры и не влияющие на рост бруцелл**.
Дозаторы одкоканальные пипеточные переменного объема.
Иглы ветеринарные для взятия крови.
Иглы инъекционные по ГОСТ ISO 7864.
Масло иммерсионное для микроскопии по ГОСТ 13739.
Наконечники для дозаторов вместимостью 0.2. 0.5 и 1.0 см 3 .
Пакет для гомогенизации с фильтром.
Перчатки анатомические медицинские одноразовые по ГОСТ 32275.
Перчатки хирургические резиновые по ГОСТ 3.
* Примером может служить бактериофаг Тбилиси (76). Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.
’* Примером селективной добавки служит добавка, содержащая во флаконе: полимиксин В — 2500 ME. 6а-цитрацин — 12500 ME. циклогексимид — 50.0 ME. нистатин — 50000 ME. натамицин — 50,0 мг. налидиксоеую кислоту — 2.5 мг. ванкомицин — 10.0 мг. Содержимое флакона может не содержать циклогексимид. Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.
Пинцеты медицинские по ГОСТ 21241.
Свинки морские массой 300 —400 г.
Сыворотка крови крупного рогатого скота или лошади (нормальная, стерильная).
Шприцы медицинские инъекционные многократного применения по ГОСТ 22967.
Шприцы медицинские инъекционные однократного применения по ГОСТ ISO 7886-1.
Штативы 100-гнеэдмые для пробирок Флоринского.
5.5 Допускается применение других средств измерений и посуды с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов и материалов по качеству не ниже указанных выше.
5.6 Допускается применение готовых питательных сред, а также других сред, приготовленных по прописи производителя, предназначенных для культивирования бруцелл с проверенными ростовыми свойствами.
5.7 Допускается применение готовых растворов генциан фиолетового. Люголя, фуксина Циля, малахитового зеленого и 5%-ной спиртовой настойки йода.
5.8 Допускается использовать другие селективные добавки, обладающие аналогичным действием, указанным в 5.4.
5.9 Допускается использовать посуду одноразового применения.
6.1.1 Материал для диагностики бруцеллеза отбирают от каждого животного в отдельности.
6.1.2 При взятии проб необходимо соблюдать меры, предупреждающие заражение людей и обсеменение объектов внешней среды в соответствии с требованиями, действующими на территории государства, принявшего стандарт.
6.1.3 Пробы направляют в лабораторию и исследуют в день отбора или на следующий день.
6.2 Отбор проб патологического материала
6.2.1 Для бактериологического и молекулярно-генетического исследования на бруцеллез направляют абортированный плод с плодовыми оболочками (от многоплодных животных берут не менее трех плодов). От плодов крупных животных направляют селезенку, печень, желудок с содержимым. перевязанный со стороны пищевода и двенадцатиперстной кишки, и околоплодную жидкость.
6.2.2 Если в течение 24 —30 ч взятый материал доставить в лабораторию не представляется возможным, его консервируют стерильным 30 %-ным водным раствором химически чистого глицерина. Материал заливают консервирующей жидкостью в количестве, превышающем его объем в четыре —пять раз. Крупные плоды направляют в неконсервированном виде.
6.2.3 От абортировавшего животного одновременно с патологическим материалом направляют кровь (сыворотку крови) для молекулярно-генетического исследования на бруцеллез.
6.3 Отбор проб для прижизненной диагностики бруцеллеза
Для прижизненной диагностики бруцеллеза от животных берут:
• содержимое гигром, бурс и абсцессов.
При диагностическом убое дополнительно берут:
• лимфатические узлы: подчелюстные, заглоточные, предлопаточные. надколенные, подколенные. надвыменные. парааортальные. тазовые;
6.3.2.1 Кровь морских свинок для получения сыворотки с последующим исследованием при постановке биопробы берут из краевой ушной вены или из сердца по 1—3 см 3 стерильными шприцами в стерильные пробирки подходящей вместимости.
6.3.2.2 Приготовление сыворотки
Сыворотку крови получают методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают в термостате при температуре 30 °С — 38 °С в течение 1 ч или при комнатной температуре в течение 8 — 10 ч, сгусток крови от стенок отделяют стальной спицей, а затем пробирки выдерживают в холодильнике при температуре 4 °С — 10 °С. Через 20 — 24 ч полученные сыворотки сливают в сухие стерильные пробирки и направляют для исследования в лабораторию.
6.3.2.3 Пробы крови от животных для бактериологического исследования берут стерильными шприцами в объеме 18 — 20 см 3 , в которые предварительно набирают антикоагулянтное средство (глюгицир или аналогичное>. Сразу после взятия крови иглы, не отсоединяя от шприцев, закрывают колпачками и перемешивают содержимое, переворачивая шприцы. Перед посевом использованные иглы заменяют стерильными.
6.3.3.1 Перед взятием проб молока у коров (буйволиц) вымя обмывают теплой водой, соски об* рабатывают 70 %-ным этиловым спиртом. Для исследования из каждой доли вымени берут последние порции молока в объеме 10 —15 см 3 в отдельные стерильные пробирки с резиновыми пробками.
6.3.3.2 У овец и коз пробы молока берут путем пункции цистерны вымени. Для этого животное фиксируют в боковом положении, вымя у основания соска протирают 70 %-ным этиловым спиртом и смазывают 5 %-ным раствором йода. Стерильным шприцем с иглой делают пункцию у основания соска и после попадания иглы в цистерну (о чем судят по свободному движению конца иглы) набирают в шприц молоко в объеме 10 см 3 и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.
6.3.4 Отбор проб содержимого гигром, бурс и абсцессов
При взятии содержимого гигром, бурс и абсцессов в области поражения выстригают шерсть, кожный покров дезинфицируют 70 %-ным этиловым спиртом и смазывают 5%-ным раствором йода. Затем стерильным шприцем с ветеринарной иглой для взятия крови делают пункцию, отбирают содержимое гигромы, бурсы или абсцесса и переносят его в стерильную бактериологическую пробирку вместимостью 16—18 см 3 с резиновой пробкой.
6.3.5 Упаковка и маркировка проб
6.3.5.1 Отобранные в стерильные пробирки пробы крови и молока помещают во влагонепроницаемую тару (полиэтиленовые пакеты или полистироловые контейнеры с крышками).
Пробы патологического материала упаковывают в пергаментную бумагу, маркируют и помещают во влагонепроницаемую тару (полиэтиленовые пакеты или полистироловые контейнеры с крышками).
6.3.5.2 Пробы маркируют с указанием:
— вида, попа и возраста животного;
— инвентарного номера животного;
7 Бактериоскопический метод
Сущность бактериоскопического метода заключается в окрашивании мазков и мазков-отпечатков из патологического материала и последующем микроскопическом выявлении клеток бруцелл.
7.2 Подготовка к исследованию
7.2.1 Подготовка растворов для окраски
7.2.1.1 Приготовление кристаллического фиолетового и генцианового фиолетового
Берут 1 г кристаллического фиопетоеого или генцианового фиолетового и растирают в ступке с 2 г фенола, добавляя небольшими порциями 96 %-ный этиловый спирт в объеме 10 см 3 . После полного растворения краски в ступку при постоянном помешивании добавляют 100 см 3 дистиллированной воды. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр в колбу вместимостью 200 см 3 .
Срок хранения растворов при температуре от 2 °С до 10°С — не более 6 мес.
7.2.1.2 Приготовление раствора Люголя
Для приготовления раствора Люголя в 10 см 3 дистиллированной воды растворяют 2 г йодистого калия. Затем прибавляют 1 г кристаллического йода. Раствор выдерживают в течение 5 — 6 ч до полного растворения йода и добавляют 290 см 3 дистиллированной воды.
Срок хранения раствора при температуре от 2 °С до 10 °С а склянке из темного стекла — не более 30 сут.
7.2.1.3 Приготовление карболового фуксина Циля
Для приготовления карболового фуксина Циля 1 г основного кристаллического фуксина растирают в ступке с 5 г кристаллического фенола и 0.5 см 3 глицерина, добавляя небольшими порциями 96 %-ный этиловый спирт в объеме 10 см 3 , а затем при постоянном помешивании в ступку добавляют 100 см 3 дистиллированной воды. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр в колбу вместимостью 200 см 3 .
Срок хранения раствора при температуре 18 °С —- 22 °С во флаконах из темного стекла с при* тертой пробкой —не более 6 мес.
Непосредственно перед работой к одной части полученного раствора карболового фуксина Циля добавляют девять частей дистиллированной воды.
7.2.1.4 Приготовление 0,75 %-ного и 1.0 %-ного водных растворов малахитового зеленого Берут 0.75 или 1.00 г малахитового зеленого и растворяют в 100 см 3 кипящей дистиллирован*
Срок хранения раствора при температуре от2 0 Сдо8′ : ‘С — не более 1 мес.
7.2.1.5 Приготовление 0.5 %*ного раствора уксусной кислоты
Берут 0.5 см 3 уксусной кислоты и добавляют 99.5 см 3 дистиллированной воды.
Срок хранения раствора при температуре от 2 °С до 8 °С — не более 1 мес.
7.2.1.6 Приготовление 1 %-ного водного раствора метиленового синего
Берут 1 г метиленового синего и растворяют в 100 см 3 дистиллированной воды.
Срок хранешя раствора при температуре от 2 °С до 8 °С — не более 1 мес.
7.2.1.7 Приготовление 2 %-ного водного раствора сафранина
Берут 2 г сафранина и растворяют в 100 см 3 дистиллированной воды.
Срок хранения раствора при температуре от 2 0 С до 8 °С — не более 1 мес.
7.2.1.8 Приготовление 5 %-ного спиртового раствора йода
Берут 5 г кристаллического йода и переносят в мерную колбу вместимостью 250 см 3 , добавляют 10 г калия иодида и равные объемы дистиллированной воды и 96 %*ного этилового спирта, доводя раствор до объема 100 см 3 .
Срок хранения раствора при температуре не выше от 2 °С до 25 °С в склянке из темного стекла — не более пяти лет.
7.2.1.9 Приготовление 3 %-ного слиртоаого раствора гидроокиси калия
Берут 3 г гидроокиси калия, растворяют в 5 см 3 дистиллированной воды и в мерной колбе вместимостью 200 см 3 доводят объем раствора 96 %-ным этиловым спиртом до 100 см 3 . Декантируют прозрачный раствор.
Срок хранения раствора при температуре не выше 25 °С не более одного года.
7.2.2.1 Из проб патологического материала по 6.2 делают по два мазка. При исследовании абортированных плодов готовят мазки-отпечатки из паренхиматозных органов (печени, селезенки), котиледонов плодовых оболочек и другого плотного материала, а жидкий материал (содержимое желудка. жидкости брюшной и грудной полостей, околоплодную жидкость) наносят на предметные стекла пастеровской пипеткой.
7.2.2.2 Для приготовления мазкое-отпечатков используют чистые обезжиренные предметные стекла. Абортированный плод вскрывают, поверхность паренхиматозных органов, котиледонов плодовых оболочек и другого плодного материала стерилизуют, прикладывая раскаленный шпатель или обжигая факелом, смоченным 95 %-ным этиловым спиртом. Стерильными ножницами вырезают кусочки размером 1.5 * 1.0 * 1.5 см и прикладывают поверхности срезов к предметному стеклу (по три отпечатка на два предметных стекла). Мазки-отпечатки высушивают на воздухе в течение 5 мин и фиксируют над пламенем горелки. Мазки-отпечатки на одном предметном стекле окрашивают по Козловскому или Стампу, на другом — по Г раму.
7.3 Проведение исследования
Для окраски мазкое по Граму на фиксированный мазок по 7.2.2 кладут кусочек фильтровальной бумаги, наносят кристаллический фиолетовый или генциан фиолетовый и выдерживают в течение 2 мин. после чего снимают бумагу, сливают краску, промывают дистиллированной водой и наносят на мазок раствор Люто ля (мазок чернеет). Через 1—2 мин раствор сливают и наносят 96 %-ный этиловый спирт на 0.5 —1.0 мин. Затем мазок промывают дистиллированной водой и дополнительно окрашивают разведенным в соотношении 1:10 фуксином Циля в течение 1-2 мин. Краску сливают, промывают дистиллированной водой и просушивают мазок фильтровальной бумагой.
Если после нанесения раствора Люголя мазок не чернеет, то необходимо приготовить новый раствор.
7.3.2 Окрашивание по Козловскому
Для окраски по Козловскому фиксированный мазок по 7.2.2 окрашивают 2 %-ным водным раствором сафранина с подогреванием на водяной бане до появления пузырьков. Мазок промывают дистиллированной водой и дополнительно окрашивают 0.75 %-ным или 1 %-ным водным раствором малахитового зеленого в течение 0.5 —1.0 мин. Краску сливают, промывают дистиллированной водой и просушивают мазок фильтровальной бумагой.
7.3.3 Окрашивание по Стампу
Для окраски по Стампу фиксированный мазок по 7.2.2 окрашивают в течение 10 мин карболо-вым фуксином Циля, разведенным no 7.2.1.3 в соотношении 1:10. Мазок промывают дистиллированной водой, а затем 0.5 %-ным раствором уксусной кислоты в течение 30 с. Вновь тщательно промывают дистиллированной водой и докрашивают 1 %-ным раствором метиленового синего в течение 20 — 30 с. Краску сливают, промывают дистиллированной водой и просушивают мазок фильтровальной бумагой.
7.3.4 Полученные по 7.3.1 — 7.3.3 мазки микроскопируют под иммерсионным маслом.
При микроскопии окрашенных мазков, содержащих бруиеллы. должны наблюдаться мелкие, грамотрицательныв. расположенные отдельно, попарно или кучно коккобактерии. окрашенные в красный цвет.
Сущность культурального метода заключается в посеве патологического материала на питательные среды с последующим культивированием, идентификацией и дифференциацией выделенной культуры.
8.2 Подготовка к исследованию
8.2.1 Приготовление мясной воды
Для приготовления мясной воды свежее мясо крупного рогатого скота освобождают от костей, жира и сухожилий и пропускают через мясорубку. 500 г фарша заливают 1 дм 3 водопроводной воды и выдерживают в течение 15 — 18 ч в прохладном месте. Затем сливают полученный настой в колбу вместимостью 2 дм 3 или кастрюлю из нержавеющей стали вместимостью 3 дм 3 и кипятят в течение 30 — 40 мин на электрической или газовой плите, доливают дистиллированную воду до объема 1 дм 3 и фильтруют через ватко-марлевый или тканевый фильтр. Полученную мясную воду стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °С в течение 20 мин.
Срок хранения мясной воды в стеклянных бутылях вместимостью 5 — 15 дм 3 при температуре от 2 °С до 25 “С — не более одного года.
8.2.2 Приготовление печеночной воды
Для приготовления печеночной воды свежую печень крупного рогатого скота освобождают от жира, канальцев, пленок и пропускают через мясорубку. В емкость из нержавеющей стали с крышкой вместимостью 3 дм 3 вносят 500 г фарша, заливают 1 дм 3 водопроводной воды, настаивают в течение 1 ч и кипятят на электрической или газовой плите при периодическом помешивании в течение 30 мин. После отстаивания фарш удаляют, а полученную жидкость доводят до 1 дм 3 дистиллированной водой и фильтруют через ватко-марлевый фильтр или тканевый фильтр. Полученную печеночную воду разливают по колбам и стерилизуют при температуре 11S °С и давлении 0,07 МПа в течение 30 мин.
Срок хранения печеночной воды в стеклянных бутылях вместимостью 5 — 15 дм 3 при температуре от 2 °С до 25 °С — не более одного года.
В емкость из нержавеющей стали с крышкой вместимостью 3 дм 3 наливают 610 см 3 мясной воды по 8.2.1 и 305 см 3 печеночной воды по 8.2.2.10 г пептона. 5 г хлорида натрия и 20 — 30 г пищевого или микробиологического агара, предварительно промытого и хорошо отжатого. Смесь кипятят на электрической или газовой плите в течение 30 мин. устанавливают pH 7.2 — 7.4 10 %-ным раствором натрия гидроокиси, добавляют 10 г глюкозы и 20 см 3 глицерина и фильтруют через ватно-марлевый или тканевый фильтр. Полученную среду разливают в пробирки по 7-8 см 3 или во флаконы по 250 —300 см 3 соответствующей вместимости и стерилизуют при температуре 115 °С и давлении 0.07 МПа в течение 30 мин. pH среды после стерилизации составляет 6.8 —7.0.
Срок хранения МППГТБ в пробирках и флаконах при температуре от 2 °С до 8 °С — не более 3 мес.
6 емкость из нержавеющей стали с крышкой вместимостью 3 дм 3 наливают 610 см 3 мясной во-ды по 8.2.1 и 305 см 5 печеночной воды по 8.2.2. 10 г пептона. 5 г хлорида натрия и 20 —30 г микробиологического агара, предварительно промытого и хорошо отжатого. Смесь кипятят на электрической или газовой плите в течение 1 ч. устанавливают pH 7.2 —7.4 10 %-ным раствором гидроокиси натрия и добавляют 10 г глюкозы и 20 см 3 глицерина и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Полученную среду разливают в пробирки или флаконы вместимостью 500 см 3 и стерилизуют при температуре 115 °С и давлении 0.07 МПа в течение 30 мин. pH среды после стерилизации составляет 6.8 —7.0.
Срок хранения МППГГА в пробирках и флаконах при температуре от 2 °С до 8 °С — не более 3 мес.
МППБ готовят аналогично МППГГА по 8.2.3 без добавления агара, глюкозы и глицерина.
Срок хранения МППБ при температуре от 2 °С до 8 *С — не более 3 мес
8.2.6 Приготовление сывороточко-декстрозного агара
8 емкость из нержавеющей стали с крышкой вместимостью Здм 3 наливают 835 см 3 дистиллированной воды, добавляют 20 г пищевого или микробиологического агара. 10 г пептона. 5 г хлорида натрия и 165 см 3 мясной воды по 8.2.1. Полученную смесь кипятят на электрической или газовой плите при периодическом помешивании в течение 30 мин до расплавления агара. pH до стерилизации — 7.8. Затем стерилизуют в автоклаве текучим паром в течение 1 ч. После автоклавирования среду отстаивают в течение 1 ч. затем фильтруют через ватный или бумажный фильтр, доводят pH среды до 7,2-7.4 10 %*ным раствором гидроокиси натрия, разливают в колбы (пробирки, флаконы) и стерилизуют при температуре 115 °С и давлении 0.07 МПа в течение 30 мин. После стерилизации pH среды составляет 6.8 —7.0.
Срок хранения сывороточно-декстрозного агара при температуре от 2 °С до 8 *С —не более 3 мес.
Перед применением среду в колбах (пробирках, флаконах) расплавляют в кипящей водяной бане. охлаждают до температуры 50 °С —60 °С и добавляют 40 %-ный стерильный раствор глюкозы в количестве 1 % к объему питательной среды во флаконе (например. 2.5 см 3 40 %-ного стерильного раствора глюкозы добавляют к 97.5 см 3 питательной среды).
8.2.7 Приготовление селективной добавки для внесения в питательные среды
Содержимое флакона по 5.4 растворяют в 5 см 3 50 %-ного метилового спирта и перемешивают
до образования гомогенной суспензии.
Раствор используют свежеприготовленным.
Полученное количество селективной добавки стерильно добавляют к 500 см 3 расплавленной питательной среды.
8.3 Проведение исследования
8.3.1 Перед посевом материала кожу абортированного плода по белой линии живота протирают тампоном, смоченным 5 %-ным раствором фенола, приготовленного путем растворения 5 г кристаллического фенола в 100 см 3 дистиллированной воды. Стерильными ножницами вскрывают брюшную стенку и грудную клетку плода, содержимое грудной и брюшной полостей пастеровскими пипетками высевают в одну бактериологическую пробирку с МППГГБ и после пипетирования полученную взвесь переносят в объеме по 1.0-1.5 см 3 на скошенную плотную питательную среду по 8.2.4 и 8.2.6 в двух пробирках. Содержимое желудка в объеме по 1 —2 см 3 высевают в две пробирки с МППГББ и в пять пробирок на скошенную плотную питательную среду по 8.2.4 и 8.2.6.
8.3.2 Лимфатические узлы, очищенные от жира и мышечных волокон, кусочки печени и селезенки размером 2.0 * 1,5» 2.5 см погружают в 96 %-ный этиловый спирт на 1 с и обжигают, проведя над пламенем спиртовки. После обработки от лимфоузлов стерильными ножницами отрезают кусочки размером 1 —2 см. Подготовленный материал помещают в пакет для гомогенеэации с фильтром, добавляют 4 —5 см 3 физиологического раствора и гомогенезируюг с использованием гомогенизатора по 5.1.
Допускается приготовление суспензии путем растирания материала в стерильной фарфоровой ступке с добавлением физиологического раствора до получения однородной гомогенной суспензии.
Полученный гомогенат высевают пастеровской пипеткой по 0.1 —0,2 см 3 на поверхность предварительно подсушенных после скашивания плотных питательных сред по 8.2.4 и 8.2.6 в пробирках и на чашки Петри.
Допускается высев материала пастеровской пипеткой непосредственно из лимфатических узлов и органов. Для этого место прокола пастеровской пипеткой предварительно прижигают шпателем.
нагретым над пламенем спиртовки. Из каждого объекта проводят посев в одну бактериологическую пробирку с МППГГБ и после пипетирования полученную взвесь в объеме по 1.0 —1.5 см 3 переносят на скошенную плотную питательную среду по 8.2.4 и 8.2.6 едва пробирки.
8.3.3 Если в лабораторию доставлен только желудок плода, высев проводят не менее чем в десять пробирок на среды по 8.2.4-8.2.6.
8.3.4 При поступлении нескольких плодов от одного животного посевы делают из органов и тканей каждого плода отдельно.
8.3.5 Из плодовых оболочек вырезают кусочки тканей с утолщенными ворсинками и стенками, наличием на поверхности фибрина или гнойного экссудата (выбирают менее загрязненные участки без некротических изменений).
Для уничтожения посторонней микрофлоры кусочки плаценты помещают в чашку Петри и заливают 3 %-ным раствором гидроокиси калия на 30 мин. Затем их промывают стерильным физиологическим раствором, готовят из этого материала суспензию в гомогенизаторе или в ступке со стерильным песком и делают посев пастеровской пипеткой в пробирки со средами по 8.2.3. 8.2.4 или 8.2.6. содержащими бактериостатические красители: генцианвиолет в разведении 1:200000 (0.1 см 3 0.5 %• ного слиртоводного раствора генцианвиолета на 100 см 3 среды) или кристаллвиолет в разведении 1:100000. генцианвиолет и малахитовую зелень в разведении каждой краски 1:200000. уксуснокислый натрий из расчета 12.5 мг на 100 см 3 среды, или селективную добавку, ингибирующую рост посторонней микрофлоры и грибов.
8.3.6 Содержимое бурс, гигром и абсцессов высевают на три-четыре чашки Петри с плотной питательной средой по 8.2.4 и 8.2.6. содержащей бактериостатические красители Во всех случаях вместо бактериостатических красителей допускается применение селективных добавок.
8.3.7 Пробы молока центрифугируют в течение 30 мин при 3000 об./мин. Верхний спой (сливки) и осадок набирают в пастеровскую пипетку и по 0.1 —0.2 см 3 вносят в три-четыре чашки Петри со средами по 8.2.4 и 8.2.6. содержащими бактериостатические красители или селективные добавки.
8.3.8 Для выделения культуры бруцелл. в том числе и Brucella canls. кровь от животных с антикоагулянтом вносят по 10 —18 см 3 во флаконы, содержащие по 100 см 3 МППГГБ. и по 0.3 —0.5 см э в чашки Петри с плотной питательной средой по 8.2.4 и 8.2.6. Посевной материал равномерно распределяют по поверхности питательной среды. Через 25 —30 мин чашки Петри помещают в термостат при температуре 37 °С — 38 °С агаром вверх. Туда же помещают и флаконы с посевами.
Через семь суток инкубирования из посевов во флаконах делают пересев на три пробирки с плотной питательной средой по 8.2.4 и 8.2.6 и инкубируют при тех же условиях.
8.3.9 При исследовании материала от крупного рогатого скота половину пробирок и чашек Петри культивируют в термостате при температуре 37 °С — 38 °С. другую — в СОг-инкубаторе с содержанием 5 % —10 % углекислого газа или эксикаторе (микроакаэростате).
Примечание — Допускается культивирование в пробирках, которые плотно укупоривают резиновыми пробками и заливают парафином или обертывают ватно-марлевые пробки парафильмом.
8.3.10 Необходимое содержание углекислого газа в эксикаторе можно получить путем:
• внесения бикарбоната натрия и серной или соляной кислоты (0.48 г бикарбоната натрия и 5 см 3 25 %-ного раствора кислоты или 0.4 г бикарбоната натрия и 0.35 см 3 концентрированной соляной кислоты на 1 дм 3 объема):
• сжигания ваты, смоченной спиртом. При этом пробирки и чашки с посевами должны занимать не более половины объема эксикатора.
8.3.11 Посевы, полученные по 8.3.1 —8.3.9. выдерживают в термостате при температуре 37 °С — 38 °С в течение 30 сут. Первичный осмотр посевов проводят через 48 — 72 ч. При отсутствии роста часть поверхности агара орошают посевным материалом.
В последующем посевы просматривают каждые 4 сут визуально, при необходимости через лупу или малом увеличении микроскопа.
При значительном росте посторонней микрофлоры (80 % и более засеянных пробирок) бактериологическое исследование прекращают.
8.4.1 При просмотре посевов обращают внимание на характер роста бактерий.
8.4.2 На поверхности твердых питательных сред по 8.2.4 и 8.2.6 бруцеллы образуют мелкие, блестящие, выпуклые, с ровными краями и гладкой поверхностью бесцветные колонии, имеющие в отраженном сеете голубоватый оттенок, в падающем свете —сероватый. При длительном культивировании колонии мутнеют и приобретают более темную окраску, что связано с появлением пигмента.
8.4.3 В жидких питагепьных средах по 8.2.1. 8.2.3 и 8.2.5 бруцеллы образуют равномерное помутнение и пристеночное кольцо, возвышающееся над поверхностью бульона, а в дальнейшем небольшой осадок на дне пробирки. В отраженном свете пристеночное кольцо имеет голубоватый оттенок.
8.4.4 При обнаружении роста на жидких питательных средах и отсутствии характерного роста на твердых питательных средах из каждой пробирки готовят мазки, которые окрашивают одним из методов по 7.3.1— 7.3.2. и делают пересев на чашки Петри с твердой питательной средой для выделе* ния чистой культуры. Пересевы на чашках Петри культивируют так же. как и высевы из патологического материала. При отсутствии роста культуры бруцелл наблюдение за посевами прекращают по истечении 30 сут.
9 Идентификация выделенных культур
9.1 Пластинчатая реакция агглютинация
9.1.1 Подготовка к исследованию
9.1.1.1 Подготовка двухсуточных культур бруцелл
Для идентификации используют двухсуточные агаровые культуры (иэоляты) бруцелл. выделенные из патологического материала. С этой целью выделенные культуры пересевают бактериологической петлей штрихом на поверхность плотной питательной среды по 8.2.4. 8.2.6, скошенной в пробирках. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37 °С —38 °С в течение двух суток. Выращенные культуры исследуют непосредственно после извлечения из термостата.
Примечание —Допустимый срок хранения культур при температуре от 2°С до 8*С—не более 14 сут.
9.1.1.2 Подготовка Я• и S-бруцеллеэных агглютинирующих сывороток
R. и 5- бруцеллезные агглютинирующие сыворотки разводят 0,5 %-ным фенолизированным физиологическим раствором до рабочего разведения. Разведенные сыворотки хранят при температуре от 2 °С до 8 °С и используют в течение 30 сут.
9.1.2 Проведение исследования
На предметное стекло раздельно наносят по одной капле Я- и S-бруцеллезных сывороток по
9.1.1 и физиологического раствора. Испытуемую культуру бактериологической петлей отдельно перемешивают в капле S-. Я-бруцеллезной сыворотки и физиологического раствора. Параллельно ставят контроли: со стандартными S- и Я-бруцеллеэными сыворотками и гомологичными антигенами.
9.1.3 Учет и оценка результатов реакции агглютинации
При положительной РА в капле сыворотки образуется четко выраженный агглютинат в виде хлопьев или комочков, а жидкость просветляется, что особенно заметно при покачивании стекла. В физиологическом растворе наблюдается гомогенная взвесь без признаков просветления жидкости.
Реакцию учитывают визуально в течение 1-3 мин и оценивают в крестах:
• ■♦+♦+* (четыре креста) — полное просветление жидкости с образованием четко выраженного агглютината —положительная реакция;
• «+♦+» (три креста) — неполное просветление жидкости с выраженным агглютинатом — положительная реакция;
• «++» (два креста) — неполное просветление жидкости со слабо выраженным агглютинатом — положительная реакция;
•«+» (один крест) — жидкость без просветления с едва заметным агглютинатом —сомнительная реакция;
• «•» (минус) — просветление жидкости не наступило, смесь гомогенная —отрицательная реакция.
Результаты реакции с испытуемой культурой считают достоверными, если в контролях Я- и
S-бруцеллезных сывороток с гомологичными антигенами агглютинация четко выражена не менее чем на два креста, а с физиологическим раствором — отсутствует.
9.1.4 Обработка результатов
Культуры, обладающие типичными для бруцелл морфологическими, культуральными (см. раздел 8) и тинкгориальными свойствами (см. раздел 7), а также дающие положительную реакцию агглютинации с S- или Я-бруцеллезной сывороткой или с обеими сыворотками одновременно при отсутствии самоагглютинации в физиологическом растворе, считают бруцеллами.
9.2 Методы определения диссоциации культур бруцелл
9.2.1 Проба на стекле с раствором акрифлавина
На предметное стекло наносят каплю раствора акрифлавина в разведении 1:1000 в дистиллированной воде, в которой суспензируют с помощью бактериологической петли испытуемую культуру. У диссоциированных культур (Я- форма) в течение 1—2 мин наступает агглютинация с образованием хорошо выраженных хлопьев. Взвесь культур бруцелл в S-форме остается гомогенной.
9.2.2 Реакция термоаггтотииации
Взвесь двухсуточной агаровой культуры бруцелл в физиологическом растворе ло 9.1.1 с со» держанием ло оптическому стандарту мутности 1 млрд/см 3 микробных клеток в объеме 4-5 см 3 про» гревают в пробирке вместимостью 20 см 3 на водяной бане при температуре 90 °С в течение 30 мин.
Результаты учитывают через 30 мин. 1 ч и через 24 ч при комнатной температуре.
При наличии диссоциации наступает выраженная агглютинация клеток бруцелл с формированием осадка, тогда как суспензия недиссоциированной культуры бруцелл в S-форме остается гомогенной.
9.2.3 Окраска колоний по Уайт-Билсону
Двухсуточную агаровую культуру бруцелл по 9.1.1 разводят физиопогическим раствором с таким расчетом, чтобы она по мутности соответствовала 10 ЕД оптического стандарта мутности. Полученную суспензию в объеме 3 см 3 смешивают с 2 см 3 физиологического раствора и делают десятикратные разведения до 10*. используя для каждого разведения отдельную пипетку, и высевают по 0.1см э на четыре-шесть чашек Петри с МППГГА. Поверхность агара в чашках равномерно орошают посевным материалом, выдерживают на горизонтальной поверхности стола в течение 20-30 мин и инкубируют при температуре 37 °С — 38 «С агаром вверх в течение 4-S сут.
Окраску колоний проводят рабочим раствором кристаллического фиолетового, приготовленного ло 7.2.1.1 в разведении 1:2000. В чашку Петри с изолированными колониями бруцелл пастеровской пипеткой с грушей вносят осторожно без напора рабочий раствор кристалвиолета. Через 30 с раствор краски удаляют с помощью пипетки с грушей, сливая в дезинфицирующую жидкость (3 %-ный раствор фенола или 5 %-ный раствор хлорамина). Колонии просматривают под бинокулярной лупой.
Колонии бруцелл в Я-форме (диссоциированные) имеют равномерно окрашенный широкий периферический ободок синего или фиолетового цвета и менее интенсивно окрашенную поверхность такого же цвета, иногда с исчерченностью.
Колонии бруцелл в S-форме имеют тонкий периферический ободок, окрашенный в синий или фиолетовый цвет. Центральная часть колоний светло-желтого цвета (не окрашивается).
9.3 Методы дифференциации бруцелл
Для дифференциации бруцелл используют следующие тесты:
— устойчивость к фуксину и тионину;
• способность аглютинироваться монорецепторными A.MuRбруцеллезными сыворотками:
9.3.1 Образование сероводорода (H2S)
9.3.1.1 Подготовка к исследованию
В качестве реактива применяют насыщенный водный раствор уксуснокислого свинца (30 г свинца растворяют в 100 см 3 дистиллированной воды), которым пропитывают полоски фильтровальной бумаги размером 1 * 8 см. Пропитанные полоски фильтровальной бумаги высушивают при температуре ^ С — 20 °С в течение 20 мин.
Срок хранения пропитанных полосок фильтровальной бумаги в банке из темного стекла с притертой пробкой — не более 2 мес.
9.3.1.2 Проведение исследования
Двухсуточную взвесь культуры бруцелл по 9.1.1 в физиологическом растворе концентрацией 2 * 10*/см 3 микробных клеток по оптическому стандарту мутности на 10 ЕД засевают в пробирку бактериологической петлей на скошенную поверхность печеночного агара ло 6.2.4. Полоску фильтровальной бумаги зажимают между пробиркой и ватной пробкой так. чтобы нижний ее конец свободно свисал над верхним краем посева и не касался поверхности питательной среды.
Ватная пробка должна быть рыхлой, не задерживать выхода из пробирки углекислоты.
Пробирки с посевами помещают в термостат при температуре 37 °С — 38 Л С на 6 сут.
Показателем интенсивности образования сероводорода является почернение нижнего конца полоски, которое измеряют в миллиметрах.
Результаты учитывают через каждые 2 сут в течение 6 сут. При каждом учете тест-полоску заменяют новой. Для окончательной оценки способности культуры к образованию сероводорода полученные три значения суммируют.
Суммарное значение почернения тест-полосок, свидетельствующее о продуцировании сероводорода. составляет для культур:
• В. abortus (биовар 1) — 5-7 мм:
Культура В. metoensis (биоеар 1), как правило, не образует сероводорода или вызывает только слабо выраженное почернение тест-лолосхи. Культуры В. ovis и в .canis сероводород не продуцируют.
9.3.2 Определение редуцирующей активности в отношении красок
9.3.2.1 Подготовка к исследованию
Для приготовления исходных растворов фуксина и тионика в разведении 1:1000 во флаконах вместимостью 200 см 3 смешивают 0.1 г краски. 20 см 3 96 %-ного этилового спирта и 80 см Ь дистиллированной воды.
Срок хранения исходных растворов фуксина и тионина в темном месте — не более 6 — 10 мес.
Для приготовления питательной среды МППГГА с красками к 100 см 3 охлажденного до температуры 50 °С — 60 °С агара с соблюдением правил асептики добавляют 2 см 3 исходного раствора краски для получения разведения 1:50000.
Питательную среду с краской разливают пипеткой по 20 — 25 см 3 в чашки Петри и подсушивают при комнатной температуре, не открывая чашки.
Срок хранения среды с красками в холодильнике при температуре от 2 9 С до 8 “С — не более 10— 15сут.
Обесцвеченные среды для тестирования не используют.
9.3.2.2 Проведение исследования
Взвесь бруцепл готовят из двухсуточной агаровой культуры. Посевы испытуемых культур проводят бактериологической петлей из взвеси, содержащей 2 млрд/см 3 микробных клеток, на среду МППГГА с фуксином и тиоником по 9.4.2.1 и на среду МППГГА без добавления красок (контроль). Одну петлю взвеси засевают путем нанесения пяти отдельных штрихов на поверхность агара. На одну чашку Петри можно одновременно засевать четыре—шесть культур, предварительно разделив чашку Петри на четыре—шесть секторов.
Чашки с посевами переворачивают агаром вверх и выдерживают в термостате при температуре 37 °С — 38 9 С в течение 3 сут.
Учет результатов проводят через трое суток инкубации по следующей схеме:
• выраженный рост культуры во всех штрихах «♦+♦+»;
• выраженный рост в первых двух и более слабый в последующих штрихах «++♦»;
• умеренно выраженный рост в первых двух штрихах и слабый или отсутствие роста в остальных штрихах «++»:
• слабый сплошной рост или отдельные колонии в первых двух штрихах «+».
9.3.3 Реакция агглютинации с монорецепторными А и М бруцеллезными сыворотками
9.3.3.1 Проведение испытания
Для проведения РА монорецепторные А и М бруцеллезные сыворотки разводят последовательно двукратно, получая соотношения 1:5,1:10.1:20.1:40 и 1:80 в объеме 0.5 см 3 . В качестве антигена используют взвесь двухсуточной агаровой культуры бруцелл в физиологическом растворе е концентрации 2 млрд/см 3 микробных клеток по оптическому стандарту мутности.
Антиген добавляют по 0.5 см 3 во все пробирки таким образом, разведение сыворотки удваивается (1:10.1:20 ит. д.).
Пробирки со смесью сыворотки и антигена выдерживают в термостате при температуре 37 °С в течение 16 —18 ч. а затем в течение 1 ч при комнатной температуре.
Положительная РА в разведении сыворотки 1:20 с оценкой не менее чем на два креста позволяет отнести культуру бруцеллы к виду B.abortus или В. malitensis.
9.3.4 Определение чувствительности культур бруцелл к фагу ТЪ
Бруцеллезный фаг ТЬ избирательно лизирует бруцеллы вида В. abortus, находящиеся в S-форме.
9.3.4.1 Подготовка к исследованию
Для определения чувствительности бруцелл к лизису бактериофагом используют два его разведения: 1 * 10 s корпускул/см 3 и 1 ■ 10 е корпускуп/см 3 . Разведения бактериофага готовят путем десятикратных разведений исходной культуры в физиологическом растворе.
9.3.4.2 Проведение исследования
Для исследования используют МППГГА в чашках Петри с концентрацией агара 1.5 % —1.8 %. Среду и взвесь двухсуточной агаровой культуры бруцелл в физиологическом растворе по 9.1.1 с концентрацией 1 млрд/см 3 микробных клеток по ОСО мутности на 10Е подсушивают при комнатной температуре в течение 18 — 20 ч.
Взвесь культуры бруцепл подсушивают при комнатной температуре в течение 18 — 20 ч. в объеме 0.4 • 0.5 см 3 наносят на поверхность МППГТА в чашках Петри и тщательно распределяют по его поверхности. Избыток посевного материала удаляют пастеровской пипеткой.
Засеянные чашки Петри подсушивают в течение 1 ч при температуре 37 °С — 38 °С до полного впитывания в агар посевного материала. После чего на поверхность питательной среды в два разных места наносят пастеровской пипеткой по одной капле 0.05 см 3 бактериофага каждого разведения. Чашки наклоняют, чтобы капли бактериофага стекли по поверхности питательной среды двумя дорожками. Контролем являются посевы культуры бруцелл на среде без внесения бактериофага. Посевы помещают в термостат агаром вверх и инкубируют в течение четырех —пяти суток при температуре 37 °С — 38 °С.
Результаты исследования учитывают в крестах:
• полный лизис культуры на месте нанесения фага (или линии стекания)
• лизис с небольшим количеством отдельных колоний бруцелл или слившиеся бляшки (участок лизиса) в виде сот
• резко ослабленный рост культуры бруцелл и небольшое количество бляшек «+•*■»;
• очень слабый лизис культуры бруцелл «+»:
— отсутствие лизиса культуры бруцелл «-».
За положительный результат чувствительности к лизису фагом принимают лизис культуры бруцелл не менее чем на два креста.
Дифференциальные свойства видов и биоваров рода вгисеНа приведены в приложении А.
10.1 Подготовка к исследованию
Для постановки биологической пробы используют морских свинок (не менее двух животных), не реагирующих на бруцеллез при серологическом исследовании в пробирочной РА. Пробы сыворотки крови от животных в разведении 1:5 не должны агглютинировать S-бруцеллезный антиген.
10.2 Проведение исследования
Из органов и содержимого желудка абортированного плода готовят суспензию на стерильном физиологическом растворе в соотношении 1:10 и вводят морской свинке подкожно с внутренней стороны бедра в объеме 1 см 3 .
Из плаценты и плодовых оболочек, предварительно обработанных тампонами, смоченными дезинфицирующим раствором, и подсушенных сухими стерильными тампонами, вырезают кусочки размером 0.5 х 0.5 см. фламбируют на пламени горелки, растирают в фарфоровой ступке со стерильным песком или гомогенизируют и заливают физиологическим раствором в соотношении 1:10. Полученную суспензию вводят морской свинке подкожно в объеме 1 см 3 .
Содержимое гигром, бурс вводят морским свинкам подкожно в объеме 0.2 — 0.3 см 3 . При этом необходимо учитывать возможность гибели животного от сопутствующей микрофлоры, особенно стрептококков.
Пробы молока центрифугируют в течение 30 мин при 3000 об7мин. Морской свинке вводят подкожно 2 — 3 см 3 материала из верхнего слоя (сливки) и осадка молока после центрифугирования.
Через 15, 25 и 40 сут после заражения у морских свинок берут кровь в объеме 1—2 см 3 из ушной вены путем надреза или из сердца путем пункции и готовят сыворотку, которую исследуют в РА в пробирках в разведениях от 1:10 до 1:80.
При положительной реакции агглютинации в разведении 1:10 и выше морских свинок убивают. В случае необходимости получения культуры возбудителя материал от них исследуют бактериологически (раздел 8). высевы делают пастеровскими пипетками в одну пробирку с бульоном и две пробирки с агаром из паховых, подчелюстных, заглоточных, парааортальных лимфатических узлов (правых и левых), селезенки (два высева), печени и костного мозга. Посевы культивируют по 8.3.8.
При отрицательной РА у морских свинок биопробу считают отрицательной, подопытных животных убивают, бактериологическое исследование не проводят.
При выделении культуры бруцелл на питательных средах биологическое исследование прекращают. а ранее зараженных морских свинок убивают.
Результат исследования на бруцеллез считают положительным при получении у морской свинки положительной РА в разведении сыворотки крови 1:10 и выше, даже если из исходного материала культура бруцелл не выделена.
11 Молекулярно-генетический метод исследований
11.1 Молекулярно-генетическое исследование на бруцеллез проводят е полимеразной цепной реакции (ПЦР). руководствуясь инструкциями по применению конкретных тест-систем.
11.2 Молекулярно-генетическое исследование методом ПЦР проводят в случае аборта и (или) при появлении у животных других клинических признаков, вызывающих подозрение на бруцеллез, а также при получении положительных и (или) сомнительных результатов серологического исследования на бруцеллез животных, не иммунизированных противобруцеллезными вакцинами из хозяйств, благополучных по данному заболеванию и для идентификации культур бруцепл (изолятов), выделенных при исследовании патологического материала.
11.3 Для исследования в ПЦР используют тот же патологический материал, что и для бактериологической диагностики.
Дифференциальные свойства видов и биоваров рода Brucella А.1 Дифференциальные свойства видов и биоваров рода ВгисоНо приведены в таблице А.1.
источник