Жидкая инактивированная вакцина против бешенства вниизж

В. В. НЕДОСЕКОВ ВНИИВВиМ

Одним из основных и эффективных способов предотвращения бешенства является своевременная и эффективная иммунопрофилактика, основанная на использовании антирабических вакцин [Б, 11]. С момента создания Л. Пастером первой антирабической вакцины прошло более 100 лет. За это время предложено, апробировано и внедрено в ветеринарную практику множество разных препаратов против бешенства [9, 14].

Используя принципы изготовления и механизмы действия в организме, все антирабические вакцины условно можно разделить на 4 группы: цельновирионные, субъединичные, рекомбинантные и ДНК-вакцины.

В ветеринарной практике широкое распространение получили живые и инактивированные цельновирионные вакцины на основе вакцинных штаммов вируса бешенства (Paris Pasteur, Pitman-Moore, CVS-27, Kelev, Flury LEP и HEP, SAD, ERA, Внуково-32, Щелково-51 и ТС-80), которые выращивают в первичных (почка собаки, хомяка, поросенка) и перевиваемых [ВНК-21/13, WI-38 (диплоидная), CEF, Vero, линия 4647, MDBK и ПС] линиях клеток [14].

Практически все антирабические препараты в мире готовят, используя разные сочетания описанных штаммов вируса бешенства и культур клеток [3].

Из этих двух групп препаратов большее предпочтение отдают инактивированным, поскольку, несмотря на достигнутые успехи, применение живых вакцин в будущем может привести к необходимости защиты животных от массированной агрессии модифицированного природой «вакцинного» вируса бешенства [4].

С другой стороны, широкое использование инактивированных вакцин стало возможным благодаря успехам биотехнологии, в частности крупномасштабному культивированию вируса бешенства, в первичных и перевиваемых линиях клеток, что позволило конструировать и изготавливать высокоиммуногенные парентеральные препараты.

В настоящее время в Российской Федерации рекомендованы к применению несколько отечественных и зарубежных вакцин.

Одна из первых отечественных разработок — промышленная технология изготовления сухой инактивированной вакцины из фиксированного вируса бешенства, штамм Щелково-51, выращенного в ВНК-21/13 [6]. В 1976-1991 гг. было изготовлено и успешно испытано более 9 млн доз препарата, который при двукратной иммунизации обеспечивал напряженный иммунитет в течение 2 лет. При этом на 14-е сутки титр вируснейтрализующих антител в крови собак превосходил в 17-38 раз минимальный уровень антител, обеспечивающих защиту животных от заражения (0,5 МЕ/мл) [4].

Сегодня Щелковский биокомбинат из штамма Щелково-51 и клеточной системы ВНК-21 выпускает: вакцину антирабическую инактивированную сухую культуральную; вакцину антирабическую инактивированную жидкую культуральную (Рабиков); вакцину антирабическую инактивированную сухую культуральную для собак и кошек (Рабикан).

В нашем институте изготовляют антирабическую инактивированную культуральную сорбированную вакцину, выпускаемую в жидкой и сухой формах. Разработанная технология позволяет получать материал с высокой инфекционной (7,5-8,0 Ig МЛД /см3) и антигенной активностью (3-5 ME). Для инактивации используют теотропин отечественного производства, который обеспечивает щадящий режим, не изменяя конформационную структуру протективно значимых эпитопов гликопротеина вируса бешенства. Сухая и жидкая вакцина у собак и кошек создавали напряженный антирабический иммунитет, который формировался на 14-21-й день и сохранялся в течение 18 мес, что определяли путем контрольного заражения животных [1].

ВНИИЗЖ выпускает жидкую и сухую формы антирабической инактивированной культуральной вакцины, изготовленной из штамма Щелково-51, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21/17, инактивированного аминоэтилэти-ленимином. Сорбирована она на гидроокиси алюминия.

Для иммунизации собак и кошек в Экспериментально-производственном предприятии по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН разработана антирабическая культуральная концентрированная очищенная инактивированная сухая вакцина, изготовленная из штамма Внуково-32, выращенного в культуре клеток почек сирийского хомяка и инактивированного ультрафиолетовыми лучами [3].

Для вакцинации собак и кошек на территории нашей страны используют зарубежные антирабические вакцины: Дефенсор-3 (Пфайзер, США); Nobivac Rabies (Intervet, Голландия); Rabisin (Merial, Франция). Данные препараты из пастеровских штаммов вируса бешенства, инактивированного бета-пропилактоном, обеспечивают формирование иммунитета после двукратной вакцинации в течение 3-5 лет [3].

Кроме антирабических моновакцин применяют комбинированные мультивалентные препараты против разных возбудителей инфекционных болезней, что ведет к расширению стратегий иммунопрофилактики и значительно упрощает календарь прививок. Данные вакцины используют для иммунизации собак и кошек. Так в антирабическую вакцину для собак включены антигены возбудителей чумы и гепатита собак, лептоспироза и парвовироза плотоядных, а в комбинированные антирабические вакцины для кошек — антигены вируса панлейкопении кошек, калицивируса и парвовируса кошачьих. Установлена высокая иммуногенная потенция вакцины против парвовирусного энтерита и чумы собак, содержащей инактивированный вирус бешенства, штамм Щелково-51 [4].

С 1999 г. на территории России применяют отечественную вакцину против чумы плотоядных, парвовирусного энтерита, инфекционного гепатита, аденовироза, лептоспироза и бешенства собак БИОРАБИК.

Следующим типом антирабических вакцин являются субъединичные препараты, которые безопасны (не содержат вируса) и свободны от балластных белков [2]. Однако из-за низкой иммуногенной активности и высокой стоимости их использование ограничено.

Успехи в области клонирования и экспрессии генов привели к созданию рекомбинантных вакцин против бешенства, которые просты в изготовлении, устойчивы во внешней среде и индуцируют напряженный иммунитет. Применение рекомбинантного вируса исключает попадание во внешнюю среду потенциально опасного генома вакцинного вируса бешенства.

Наибольшее распространение рекомбинантные препараты получили при пероральной вакцинации диких плотоядных. Хотя использование антигенов разных серотипов вируса бешенства позволяет изготовлять мультивалентные вакцины для парентерального введения. Так, использование вектора, несущего участки гликопротеинов серотипов 1 и 5, позволило создавать активный иммунитет к этим серотипам вируса бешенства [10].

Рекомбинантные вакцины широко применяют во многих странах мира как экологически наиболее безопасные для борьбы с бешенством диких плотоядных.

Относительно новой вехой рабиологической вакцинологии является разработка ДНК-вакцин, представляющих собой плазмидную ДНК, в которую встроен ген гликопротеина вируса бешенства. Преимущества этих препаратов: стабильность, высокая степень очистки, отсутствие балластных белков и контаминации посторонними агентами и индуцирование у животных системного и местного иммунитета [12, 15]. Двукратная внутримышечная вакцинация собак плазмидной ДНК, экспрессирующей гликопротеин вируса бешенства, защищает животных от контрольного заражения вирулентным штаммом вируса бешенства [12, 13].

Еще одним важным преимуществом ДНК-вакцины является возможность встраивания в ДНК плазмиды гликопротеинов нескольких лиссавирусов, что позволяет повысить степень защиты против нескольких серотипов вируса бешенства [10]. Эффективность иммунизации животных ДНК-вакцинами очевидна, однако потребуется еще много усилий для практической реализации нового подхода к профилактике бешенства.

Таким образом, несмотря на различные типы, современные вакцины позволяют формировать напряженный иммунитет, даже при однократном введении препаратов (ДНК-вакцина, рекомбинантная и инактивированная вакцины) титр антител спустя 540 дней составляет не менее порогового уровня (0,5 МЕ/мл) [13].

Одним из важнейших факторов иммунопрофилактики является способ инъецирования антигена, для этого на протяжении длительного времени использовали подкожный метод введения антирабических препаратов. Однако мы установили, что после внутрикожной и подкожной иммунизации мышей и овец инактивированными вакцинами у животных формировались антирабические вируснейтрализующие антитела с практически идентичной активностью [7, 8]. Полученные данные подтвердили связь между вводимым антигеном и центральной нервной системой, которая проявлялась усилением иммунного ответа при инъецировании антирабической вакцины в места, богатые нервными окончаниями [4].

В настоящее время проблемы иммунизации сельскохозяйственных животных сохраняются, поэтому мы считаем актуальным использование внутрикожного введения антигена с помощью безыгольного инъектора, которое позволит существенно уменьшить материальные затраты при высокой иммунологической эффективности.

Заключение. В распоряжении ветеринарной практики имеются разные типы антирабических препаратов, обеспечивающие защиту животных от летальной инфекции, однако наибольшее распространение получили инактивированные вакцины. Они высокоэффективны, обладают экономически обоснованной простой технологией изготовления. Использование описанных препаратов и внутрикожное их применение будет способствовать снижению напряженности эпизоотической ситуации по бешенству в Российской Федерации.

1. Вишняков И. Ф. и др. // Ветеринария. 1998. 1. 2. ГрибенчаС. В-//Вопросы вирусологии. 1988. 33, 4. 3. Груздев К. Н. и др. Бешенство животных. Аквариум. 2001. 4. Иванов В. С. и др. // Вестник РАСХН. 2000. 2. 5. Комитет экспертов ВОЗ по бешенству // 8-й доклад. Женева, ВОЗ. 1994 (СТД 824). 6. Кузнецов П. П. и др. Сб. Передовой научно-производ, опыт вбиол, промышленности, 1979, 3. 7. Недосеков В. В. и др. Мат. междунар. конф. Покров, 2002. 8. Недосеков В. В. Мат. Ill конф. по болезням домашних животных. Персиановка. 2000. 9. Laboratory techniques in rabies 4-th ed. Geneva. 1996. 10. Desmezieres E. et al. // J. Gen. Virol. 1999. 80, 9. 11. Pastoret P. P. //Virus Research. 2002, 82. 12. Perrin P. etal. //Vaccine. 1999, 14, 5-6, 13. Stanley A. etal. // Vaccines. 1999. 14. Sureau P. // Vertrebrate Cell Cult. 1987
The modern vaccines against animal rabies V. V. Nedosekov

источник

Чего хотят пациенты? Качественных и доступных медицинских услуг. Чего хотят врачи? Достойной зарплаты и надлежащих условий труда!

ВНИИЗЖ выпускает жидкую и сухую формы антирабической инактивированной культуральной вакцины, изготовленной из штамма Щелково-51, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21/17, инактивированного аминоэтилэтиленимином. Сорбирована она на гидроокиси алюминия.

Следующим типом антирабических вакцин являются субъединичные препараты, которые безопасны (не содержат вируса) и свободны от балластных белков. Однако из-за низкой иммуногенной активности и высокой стоимости их использование ограничено.

Относительно новой вехой рабиологической вакцинологии является разработка ДНК-вакцин, представляющих собой плазмидную ДНК, в которую встроен ген гликопротеина вируса бешенства. Преимущества этих препаратов: стабильность, высокая степень очистки, отсутствие балластных белков и контаминации посторонними агентами и индуцирование у животных системного и местного иммунитета. Двукратная внутримышечная вакцинация собак плазмидной ДНК, экспрессирующей гликопротеин вируса бешенства, защищает животных от контрольного заражения вирулентным штаммом вируса бешенства.

Еще одним важным преимуществом ДНК-вакцины является возможность встраивания в ДНК плазмиды гликопротеинов нескольких лиссавирусов, что позволяет повысить степень защиты против нескольких серотипов вируса бешенства. Эффективность иммунизации животных ДНК-вакцинами очевидна, однако потребуется еще много усилий для практической реализации нового подхода к профилактике бешенства.

Лекарственное сырье животного происхождения
В современной фармакогнозии объекты животного происхождения единичны (пиявки, шпанская мушка); больше применяются продукты их переработки — животные жиры, выделения, змеиный яд, продукты жизнедеяте .

Заключение
В настоящее время не существует никаких сомнений в том, что все лекарственные средства минерального и животного происхождения являются большой ценностью для медицины. При умелом и грамотном использ .

Гигиена дыхания.
Физиологии наиболее важные газы — O2, CO2, N2. Они присутствуют в атмосферном воздухе в пропорциях . Кроме того, атмосфера содержит водяные пары в сильно варьирующих количества .

источник

Вакцина антирабическая культуральная концентрированная очищенная инактивированная сухая (Vaccinum rabiei culturalt concentratum purificatum inactivatum siccum)

Инактивированная очищенная концентрированная вакцина (культура производственного штамма вируса бешенства Внуково−32, выращенного на первичной культуре клеток почек сирийского хомяка), иммуногенная активность не менее 2,5 МЕ/мл (1 доза). Стабилизаторы: желатоза — в конечной концентрации до 1%, сахароза — в конечной концентрации до 7,5% и альбумин — в конечной концентрации до 0,1%. Лиофилизат в виде пористой таблетки в ампулах по 1 мл в комплекте с растворителем (дистиллированная вода) в в ампулах по 1 мл; в упаковке 5 комплектов.

Формирует иммунитет к вирусу бешенства.

Показания препарата Вакцина антирабическая культуральная концентрированная очищенная инактивированная сухая

Бешенство (лечебно-профилактическая и профилактическая иммунизация).

Для лечебно-профилактической иммунизации, проводимой по жизненным показаниям, противопоказаний нет. Для профилактической иммунизации: гиперчувствительность, острые инфекционные и общие заболевания, застойная сердечная недостаточность, хронические заболевания почек и эндокринной системы, коллагенозы, бронхиальная астма, беременность, лактация.

Отек в месте введения, краснота, зуд, увеличение регионарных лимфоузлов, недомогание, головная боль, тошнота, незначительное повышение температуры.

В/м, в дельтовидную мышцу взрослым и детям старше 5 лет. Детям до 5 лет вводят в мышцы бедра (верхняя часть переднебоковой поверхности). Содержимое ампулы с вакциной растворяют в 1 мл дистиллированной воды, растворенная вакцина хранению не подлежит. Дозировка и схема иммунизации зависит от показаний.

После введения необходимо наблюдение за привитыми в течение 30 мин (возможность развития аллергических реакций). Не пригоден к применению препарат в ампулах с нарушенной целостностью и маркировкой, при изменении физических свойств (мутность, интенсивное окрашивание, наличие неразбивающихся хлопьев), при истекшем сроке годности, неправильном хранении.

Условия хранения препарата Вакцина антирабическая культуральная концентрированная очищенная инактивированная сухая

Хранить в недоступном для детей месте.

Срок годности препарата Вакцина антирабическая культуральная концентрированная очищенная инактивированная сухая

Не применять по истечении срока годности, указанного на упаковке.

Вакцина антирабическая культуральная концентрированная очищенная инактивированная сухая
Инструкция по медицинскому применению — РУ № Р N002816/01

Дата последнего изменения: 28.04.2017

Лиофилизат для приготовления раствора для внутримышечного введения.

Одна доза (1,0 мл) вакцины содержит:

Активный компонент: специфический антиген вируса бешенства штамм «Внуково-32» — 2,5 ME (Международных Единиц);

Вспомогательные вещества: альбумин — 5,0 мг; сахароза — 75,0 мг; желатин — 10,0 мг

Растворитель — вода для инъекций.

Препарат не содержит консервантов и антибиотиков.

Пористая масса белого цвета, гигроскопична. Растворенная вакцина представляет собой прозрачную или слабо опалесцирующую жидкость от бесцветной до светло-желтого цвета.

Вакцина представляет собой вакцинный вирус бешенства штамм Внуково-32, выращенный в первичной культуре клеток почек сирийских хомячков, инактивированный ультрафиолетовыми лучами и формалином, концентрированный методом ультрафильтрации с последующей очисткой методом гель-хроматографии.

Вакцина индуцирует выработку иммунитета против вируса бешенства. Титр антирабических антител более 0,5 МЕ/мл (RFFIT) согласно рекомендациям ВОЗ считается защитным.

лечебно-профилактическая иммунизация: контакт и укусы больными бешенством животными, теплокровными животными с подозрением на заболевание бешенством, дикими или неизвестными теплокровными животными;
профилактическая иммунизация: работники служб, проводящих отлов животных (ловцы, водители, охотники, лесники и др.); работники ветеринарных станций по борьбе с болезнями животных, имеющие контакт с животными (ветврачи, фельдшеры, лаборанты, младший персонал); работники научно-исследовательских институтов и диагностических лабораторий, проводящие исследования на бешенство; работники вивариев и других учреждений, работающие с животными; обслуживающий персонал лечебно-профилактических учреждений, имеющий высокий риск заражения (патологоанатомы, специалисты, участвующие в проведении парентеральных вмешательств больным бешенством).

Для лечебно-профилактической иммунизации

Для профилактической иммунизации

острые инфекционные и неинфекционные заболевания, хронические заболевания в стадии обострения или декомпенсации — прививки проводят не ранее одного месяца после выздоровления (ремиссии);
аллергические реакции на предшествующее введение антирабической вакцины;
сильная реакция (температура выше 40°С, отек и гиперемия в месте введения свыше 8 см в диаметре) или осложнение на предыдущее введение препарата;
беременность.

При лечебно-профилактической иммунизации беременность и период грудного вскармливания не является противопоказанием.

Профилактическую иммунизацию беременным и женщинам в период грудного вскармливания не проводят.

Вскрытие ампул и процедуру вакцинации осуществляют при строгом выполнении правил асептики.

Содержимое ампулы с вакциной растворяют в 1,1 мл воды для инъекций. Время растворения не должно превышать 5 мин. Растворенную вакцину вводят медленно внутримышечно в дельтовидную мышцу плеча, детям до 5 лет — в верхнюю часть переднебоковой поверхности бедра. Хранение растворенной вакцины более 5 мин не допускается.

Внимание! Введение вакцины в ягодичную область не допускается,в связи с риском недостаточной эффективности вакцинации.

Дозы и схемы иммунизации одинаковы для детей и взрослых.

Оказание антирабической помощи

Антирабическая помощь состоит из:

местной обработки ран (укусов, царапин, ссадин), мест ослюнений;
лечебно-профилактической иммунизации (введение антирабической вакцины или, при наличии показаний, комбинированного введения антирабической вакцины и антирабического иммуноглобулина (АИГ)).

1. Местная обработка ран проводится в соответствии с приказом М3 РФ № 297 от 07.10.1997 «О совершенствовании мероприятий по профилактике заболевания людей бешенством». Местная обработка ран (укусов, царапин, ссадин) и мест ослюнений должна начинаться немедленно или как можно раньше после укуса или повреждения. Она заключается в обильном промывании в течение не менее 15 минут раневой поверхности водой с мылом или другим моющим средством (детергентом). В случае отсутствия мыла или детергента место повреждения промывается струей воды. После этого края раны следует обработать 70% спиртом или 5% водно-спиртовым раствором йода.

По возможности следует избегать наложения швов на раны в течение первых трех дней. Наложение швов показано исключительно в следующих случаях:

при обширных ранах — несколько наводящих кожных швов после предварительной обработки раны;
по косметическим показаниям (наложение кожных швов на раны лица);
прошивание кровоточащих сосудов в целях остановки наружного кровотечения.

После местной обработки ран (повреждений) немедленно начинают лечебно-профилактическую иммунизацию.

При наличии показаний к применению АИГ его используют сразу после местной обработки раны, путем инфильтрации в рану и в ткани вокруг раны.

2. Лечебно-профилактическая иммунизация

Лечебно-профилактической иммунизации подлежат все лица, подвергшиеся риску заражения бешенством.

Курс лечебно-профилактической иммунизации назначают независимо от срока обращения пострадавшего за антирабической помощью, даже через несколько месяцев после контакта с больным бешенством животным, подозрительным на заболевание бешенством теплокровным животным, диким или неизвестным теплокровным животным.

Схема лечебно-профилактических прививок антирабической вакциной

Характер контакта Данные о животном Лечение 1 Нет повреждений кожных покровов, нет ослюнений кожных покровов, нет ослюнений слизистых Больное бешенством Не назначается 2 Ослюнения неповрежденных кожных покровов, ссадины, царапины, поверхностные укусы туловища, верхних и нижних конечностей (кроме головы, лица, шеи, кисти, пальцев рук и ног), нанесенные домашними и сельскохозяйственными теплокровными животными

Если в течение 10 суток наблюдения за животным оно остается здоровым, то лечение прекращают (т.е. после 3-ей инъекции)

Если у животного отсутствуют клинические проявления и лабораторно доказано отсутствие бешенства, то лечение прекращают с момента установления отсутствия бешенства.

Во всех других случаях, когда невозможно 10-ти дневное наблюдение за животным (убито, погибло, убежало, исчезло и пр.), лечение продолжить по указанной схеме

Начать лечение немедленно: вакцина по 1,0 мл

Любые ослюнения слизистых оболочек, любые укусы головы, лица, шеи, кисти, пальцев рук и ног, гениталий; одиночные или множественные глубокие рваные раны, нанесенные домашними и сельскохозяйственными теплокровными животными.

Любые ослюнения и повреждения, нанесенные дикими плотоядными животными, летучими мышами и грызунами

Если имеется возможность наблюдения за животным и оно в течение 10 суток остается здооовым. то лечение прекращают (т.е. после 3-ей инъекции)

Если у животного отсутствуют клинические проявления и лабораторно доказано отсутствие бешенства у животного, то лечение прекращают с момента установления отсутствия бешенства

Во всех остальных случаях, когда невозможно наблюдение за животным, лечение продолжить по указанной схеме

Начать немедленно комбинированное лечение антирабическим иммуноглобулином: АИГ в 0 день и антирабической вакциной: по 1,0 мл в 0, 3, 7, 14, 30 и 90 день

Для лиц, получивших ранее полный курс лечебно-профилактических или профилактических прививок, с окончания которого прошло не более 1 года, назначают три инъекции антирабической вакцины по 1,0 мл в 0, 3, 7 день; если прошел год и более, или был проведен неполный курс иммунизации, то прививки проводят в соответствии с приведенной «Схемой лечебно-профилактических прививок антирабической вакциной». При комбинированном применении АИГ и антирабической вакцины оба препарата вводятся одновременно в разные места, независимо от сроков обращения за антирабической помощью. Иммуноглобулин и вакцину нельзя смешивать в одном шприце и вводить в одну и ту же область тела.

Перед введением АИГ из сыворотки крови лошади необходимо проверить индивидуальную чувствительность пациента к лошадиному белку. Гетерологичный АИГ вводят не позднее 3-х суток после укуса, гомологичный АИГ вводят не позднее 7 суток после укуса. Как можно большая часть рассчитанной дозы АИГ должна быть инфильтрирована в ткани вокруг раны и в глубине раны. Если анатомическое расположение повреждения (кончики пальцев и др.) не позволяет ввести всю дозу антирабического иммуноглобулина в ткани вокруг раны, то остаток вводят внутримышечно в другие места, отличные от места введения вакцины.

Окончательное решение о необходимости, схеме, объеме вакцинации принимается квалифицированным медицинским специалистом.

Профилактическая иммунизация лиц, имеющих высокий риск заражения бешенством, осуществляется в прививочных кабинетах лечебно-профилактических учреждений. Вакцина вводится внутримышечно в дельтовидную мышцу плеча по 1,0 мл в 0, 7 и 30 день. Ревакцинацию проводят однократно, в дозе 1,0 мл через год и далее каждые три года.

Схема профилактической иммунизации

Первичная иммунизация	По 1 дозе (1,0 мл) — 3 инъекции в 0; 7 и 30 день
Первая ревакцинация через 1 год	По 1 дозе (1,0 мл) — 1 инъекция
Последующие ревакцинации через каждые 3 года	По 1 дозе (1,0 мл) — 1 инъекция

После курса лечебно-профилактической или профилактической иммунизации привитому выдается справка («Сертификат о профилактических прививках») с указанием необходимых сведений (наименования и номеров серий препаратов, сроков годности, курса прививок, наличия поствакцинальных реакций).

Использовались следующие критерии оценки частоты встречаемости нежелательных явлений: часто (≥1/100 до

источник

Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему: Культуральная инактивированная вакцина против бешенства из штаммов ВНИИЗЖ и ERA

Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Культуральная инактивированная вакцина против бешенства из штаммов ВНИИЗЖ и ERA

КУЛЬТУРАЛЬНАЯ ИНАКТИВИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ БЕШЕНСТВА ИЗ ШТАММОВ «ВНИИЗЖ» И «ERA»

16.00.03 «Ветеринарная микробиология,

вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология»

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Работа выполнена в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Научный руководитель — доктор ветеринарных наук,

старший научный сотрудник МИХАЛИШИН Валерий Васильевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

СТРИЖАКОВ Александр Анатольевич; кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник СТАРОВ Сергей Константинович

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский и

технологический институт биологической промышленности (г.Щелково)

Защита диссертации состоится « 04 » 2005г. в /0°° часов на заседании диссертационного совета Д 220.015.01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, Г.Владимир, п.Юрьевец

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Автореферат разослан 63 2005г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Бешенство относится к группе опасных инфекционных заболеваний человека и животных, характеризующихся поражением центральной нервной системы, практически абсолютной летальностью и является одним из наиболее распространенных зооантропонозов. По оценке ряда исследователей, это заболевание относится к зоонозам, наносящим наибольший экономический ущерб (В.П.Назаров, 1961; М.А.Селимов, 1987).

Ежегодно в мире погибает от бешенства свыше 50 тысяч людей и более 1 миллиона животных (К.Н.Груздев, В.В.Недосеков, 2001). Сложная эпидемическая и эпизоотическая ситуация по бешенству наблюдается более чем в 110 странах мира. По оценке ВОЗ, ежегодно получают укусы и имеют контакты с подозреваемыми животными около 10 млн. человек, 4 млн. из их числа получают специальную медицинскую помощь (С.ИДжупина, 2002).

Вспышки болезни регистрируются среди диких и домашних животных, что в конечном счете обуславливает заболеваемость и людей (М.А.Селимов, 1987; В.А.Ведерников, 2002).

В системе мер борьбы с бешенством домашних и диких животных в современных условиях решающее значение приобретает своевременная и надежная лабораторная экспресс-диагностика. В настоящее время в мировой практике диагноз на бешенство ставится на основании результатов прямого обнаружения антигена вируса в головном мозге животных реакцией прямой иммунофлюоресценции (РПИФ), твердофазным иммуноферментным анализом (ТФ ИФА), а также изоляцией вируса биопробой.

Вакцинопрофилактика бешенства занимает ведущее место в борьбе с этим заболеванием. Для профилактики бешенства применяются как живые, так и инактивированные вакцины. В последние годы наиболее часто применяют инактивированные вакцины.

Для вакцинации домашних и сельскохозяйственных животных применяют, как правило, инактивированные вакцины, а для профилактики бешенства среди диких млекопитающих — вирусвакцины орального

применения (П.П.Кузнецов, В.С.Иванов, С.В.Кузнецова, 1979; А.В.Борисов и др. 2002).

При выборе вакцины особое внимание обращают на безопасность препарата и длительность иммунитета у животных.

Для производства вакцины необходим штамм вируса, обладающий высокими иммуногенными свойствами и сохраняющий эти свойства в процессе культивирования и хранения.

В современной биотехнологии при производстве антирабических вакцин используют различные вакцинные штаммы, которые выращивают в первичных и перевиваемых клеточных культурах (ВНК-21. ПС, Vero и др.), применяя различные методические приемы — пристеночный монослой, суспензионный и псевдосуспензионный методы (М.А.Селимов, 1961, 1982; В.С.Иванов, 1995; И.Ф.Вишняков и др., 1998; В.В.Михалишин и др., 2001).

Для массового выпуска вакцины требуются методы культивирования вируса бешенства, при которых его иммуногенные свойства не изменяются, и при этом вирус накапливается в высоких титрах, исключая необходимость концентрирования при изготовлении вакцины.

Для получения инактивированных вакцин применяют различные инактнванты и подбирают оптимальные условия инактивации. В таких случаях вирус должен полностью утрачивать свои инфекционные свойства и максимально сохранять антигенность.

Указанные выше проблемы являются актуальными и послужили основной предпосылкой для исследования по разработке технологии изготовления вакцин против бешенства.

Цели и задачи исследования. Главная цель наших исследований состояла в разработке технологии получения экспериментальных образцов культуральной инактивированной вакцины против бешенства из штамма «ВН1ШЗЖ» и «ERA» и изучении иммунобиологических свойств этих вакцин в лабораторных и производственных условиях.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

— отработать метод культивирования штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERA» вируса бешенства;

— разработать метод инактивации культурального вируса бешенства, пригодного для получения антирабических вакцин;

— разработать технологию получения культуральной инактивированной сорбированной и эмульсионной антирабической вакцины;

— изучить иммуногенные свойства полученных инактивированных сорбированных и эмульсионных вакцин в лабораторных условиях;

— проверить иммуногенные свойства полученных вакцин на естественно-восприимчивых животных;

— изучить изменения иммуногенных свойств вакцин при хранении при различных температурах.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований:

-предложен метод культивирования штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERA» вируса бешенства в культуре клеток ВНК-21;

-разработаны методы инактивации штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERA» вируса бешенства аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) и р-пропиолактоном;

— впервые использован штамм вируса бешенства «ВНИИЗЖ» для производства антирабической культуральной инактивированной вакцины;

-разработана технология получения культуральной инактивированной сорбированной и эмульсионной антирабической вакцины из штамма «ВНИИЗЖ»;

-изучены иммуногенные свойства полученных инактивированных сорбированных и эмульсионных антирабических вакцин;

-проверена иммуногенность полученных вакцин на целевых видах животных;

-изучена сохраняемость вакцин в процессе хранения.

Практическое значение работы.

Показана возможность культивирования штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERA» вируса бешенства на культуре клеток ВНК-21 пристеночным и суспензионным способах культивирования.

При инактивации штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERA» вируса бешенства аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) и Р-пропиолактоном получаются безвредные инактивированные препараты.

Получена безвредная, экологически безопасная и высокоэффективная инактивированная культуральная вакцина из штамма «ВНИИЗЖ», которая может быть рекомендована для практического применения для профилактики бешенства.

Разработанная вакцина из штамма «ВНИИЗЖ» сохраняет исходную активность при хранении при температуре 4-8°С в течение года (срок наблюдения).

Разработан проект НТД на технологию изготовления сорбированной и эмульсионной вакцины из штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERA» вируса бешенства.

Положения, выносимые на защиту:

Методика культивирования штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERA» вируса бешенства;

Результаты инактивации вируса бешенства аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) Р-пропиолактоном;

Технология получения культуральной инактивированной адсорбированной антирабической вакцины;

Технология получения культуральной эмульсионной антирабической вакцнны;

Характеристика иммуногенных свойств адсорбированных и эмульсионных антирабических вакцин в лабораторных и производственных условиях;

Изменения иммуногенных свойств вакцин в процессе хранения.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и опубликованы: в Материалах Международной научной конференции, посвященной 45-летию ВНИИЗЖ (г.Владимир, 2003г.); Международной научно-практической конференции, посвященной 60-летию питомника охотничьих собак ВНИИОЗ, (г.Киров, 2004 г.), также докладывались на ученом совете ВНИИЗЖ в 2003-2004 г.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических предложений и приложения.

Диссертация иллюстрирована 24 таблицами. Список использованной литературы включает 231 наименование работ, из них 76 на русском языке.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы Материалы

Вирусный материал. В исследованиях использовали следующие штаммы фиксированного вируса бешенства:

— штамм «ВНИИЗЖ», адаптированный к суспензионной культуре клеток ВНК-21, с титром инфекционности 6,50-7,50 lgJI/WM;

— штамм «ERA», выращенный в культуре клеток ПС;

— штамм «CVS»-международный референс-штамм.

Культура клеток. Для изготовления антирабических вакцин использовали:

— перевиваемую линию клеток ВНК-21 почки сирийского хомяка;

— первичную культуру клеток почки свиньи.

Животные. Для расплодки фиксированного вируса использовали следующих животных: овец в возрасте 1-1,5 года; белых мышей массой 10-12 грамм.

Для исследования иммуно-биологических свойств антирабических вакцин использовали: крупный рогатый скот, лошадей, мелкий рогатый скот, собак (беспородных) в возрасте от 2 до 12 месяцев.

Питательные среды. Для выращивания клеток в суспензии и монослое использовали: ростовую среду по прописи ВНИЯИ с 0,25% гидролизата белков мышц (ФГМС) и 0,25 % гидролизата белков крови (ФГБК); среду Игла; фетальную сыворотку крови КРС (импортную) фирмы Sigma; L- глютамин; антибиотики: гентамицин и канамицин; 0,02 % раствор версена; 0,25 % раствор трипсина; 0,15М фосфатно-буферный раствор рН-7,2-7,4; сыворотку КРС производства ВНИИЗЖ.

МЕТОДЫ Культивирование клеток

Клетки ВНК-21 выращивали в среде ВНИЯИ с 5% сыворотки в реакторах объемом 40-2000 литров в течение 1-4 дней при 37°С. Культивирование прекращали, когда концентрация клеток в конечном сосуде составляла 2,2-3,0 млн/мл.

Культивирование вируса бешенства в монослое культуры клеток ВНК-21

Культивирование вируса бешенства вели в клинских матрасах и роллерах. В культуральные сосуды вносили питательную среду, состоящую из среды Игла, 7% сыворотки КРС, 3% глютамина, и антибиотики с широким спектром действия. Затем добавляли культуру клеток ВНК-21, посевная концентрация клеток составляла 140-200 тыс/мл. После чего вносили вирус бешенства, множественность заражения составляла 0,01-0,1 ЛД50/кл. Культивирование проводили при температуре 37°С в течение 48, 72 и 96 часов. Культуральную вируссодержащую жидкость фасовали в отдельные флаконы, маркировали, исследовали на биологическую активность и хранили до использования.

Культивирование вируса бешенства в суспензии культуры клеток ВНК-21

Культивирование вируса бешенства вели в аппаратах КС-40. Посевная концентрация клеток составляла 700-1000 тыс./мл, множественность заражения 0,1- 0,5 ЛД50/КЛ. Культивирование вели при температуре 37°С в течение 48 часов. После окончания культивирования величину рН доводили до 7,0 раствором бикарбоната натрия, брали пробы для биологического контроля, хранили и использовали для изготовления вакцины.

Освежение штамма и подготовка посевного вируса

Для освежения штамма вируса бешенства использовали овец.

Производственный штамм использовали для заражения 3 овец в возрасте 1-1,5 года. Животных заражали интрацеребрально культуральной вируссодержащей жидкостью в дозе 1,0 мл с титром инфекционности не ниже 6,5 ЛД50/МЛ в разведении 10’3 и 10″4 (на растворе Хенкса или среде Игла). При появлении типичной клиники паралитического бешенства на 5-6 сутки овец забивали в атональном состоянии и в асептических условиях извлекали мозговой материал в стерильный флакон и промораживали, затем мозговой материал измельчали, тщательно растирали в фарфоровой ступке. Суспензию готовили традиционным способом на среде Игла с рН 7,4-7,6.

Мозговую суспензию с титром инфекционности вируса не ниже 6,0 1

Очищенную мозговую суспензию фасовали во флаконы и хранили при температуре -40°С.

Определение титра инфекционности вируса

Титр инфекционности вируса определяли на белых мышах массой 1012 г. Для этого готовили 10-кратные разведения суспензии вируса на ФБР (10″1 до 10″7) и каждым разведением заражали 4 белых мышей интрацеребрально в дозе 0,03 мл. За животными вели наблюдение в течение 14 дней. Титр инфекционности рассчитывали по методу Рида и Менча.

Оценка иммуногенной активности инактивированных вакцин

Иммуногенную активность определяли объемным методом (метод NIH). Для этого из каждой серии вакцин брали пробы и из них делали 4 последовательных разведения с 5-ти кратным шагом (1:5, 1:25, 1:125, 1:625) стерильным физиологическим раствором. Разведения вакцины сохраняли до использования в сосуде со льдом. Кавдое разведение референс-вакцины и испытуемой вакцины вводили по 0,5 мл внутрибрюшинно 16 мышам, двукратно с недельным интервалом. 40 невакцинированных мышей сохраняли для титрования тест штамма CVS фиксированного вируса бешенства. Через 7 суток после второй вакцинации мышам вводили по 0,03 мл интрацеребрально разрешающую дозу международного тест штамма CVS, содержащего по предварительному титрованию 100 ЛДзо/О.ОЗмл. Срок наблюдения за инфицированными мышами 14 суток. Одновременно на 40 невакцинированных мышах проводили контрольное титрование вируса. На основании полученных результатов по методу Рида и Менча рассчитывали дозу вируса для контрольного заражения. По результатам учета выживших мышей определяли ЭДзо референс-вакцины и ЭД50 испытуемой вакцины, используя метод Рида и Менча.

Определение титра вируснейтрализующих антител в сыворотке крови

Для этого испытуемые сыворотки предварительно инактивировали в течение 30 минут при температуре 56°С. Готовили ряд двукратных разведений сыворотки и смешивали с равным объемом вируса штамма CVS, содержащим 30-300 ЛДзо/0,03мл.

Полученную смесь выдерживали при температуре 37°С в течение 1 часа и вводили интрацеребрально мышам массой 10-12 г в объеме 0,03 мл. Для каждого разведения сыворотки брали по 4 мыши. Наблюдение за животными вели в течение 21 дня. Регистрировали число погибших животных. Гибель мышей в первые пять дней после заражения считалась неспецифической. Подсчет титра вируснейтрализующих антител проводили по методу Рида и Менча.

Определение стерильности вируссодержащей суспензии, антигена и вакцины

Проверку на стерильность проводили в соответствии с ГОСТ 28085-89. Метод заключается в определении отсутствия роста бактериальной и грибковой микрофлоры в посевах образцов вакцины, вируссодержащей суспензии или антигена на питательных средах.

Определение безвредности вакцины Метод заключается в определении реакции у белых мышей после введения вакцины. Для этого пробу вакцины тщательно перемешивали и подкожно вводили по 0,5 мл 10 мышам. За мышами вели наблюдение 14 дней. Вакцина считается безвредной, если мыши в течение срока наблюдения остались живыми и клинически здоровыми. На месте введения вакцины допускается образование припухлости за счет депонирующих веществ.

Статистическая обработка результатов исследований Для обработки результатов исследований использовали статистические методы в биологии (И.П.Ашмарин, А.А.Воробьев, 1962). Достоверность статистической разницы между средними величинами определяли по методу Н.А.Плохинского, 1970.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Культивирование штамма «ВНИИЗЖ» вируса бешенства Для выращивания вируса бешенства в культуре клеток ВНК-21 использовали среду Игла с 7-8% сыворотки КРС, инактивированной при 56°С в течение двух часов, с добавлением глютамина и антибиотиков. Концентрация клеток ВНК-21 при посеве составляла 150-160 тыс./мл, а множественность инфицирования-0,5-1,2 ДД50/КЛ. Инфицировали мозговой суспензией вируса бешенства, приготовленной в растворе Хенкса с рН 7,4-7,6. Через 24, 48 и 72 часа проводили смену ростовой среды. Время культивирования вируса составляло 48-72 часа.

Сравнительное изучение методов культивирования штамма «ВНИИЗЖ» вируса бешенства в монослое и суспензии клеток ВНК-21 Для репродукции штамма «ВНИИЗЖ» использовали перевиваемую монослойную культуру клеток ВНК-21, полученную в клинских матрасах и роллерах, для репродукции в суспензии клеток использовали аппараты КС-40. Результаты культивирования штамма «ВНИИЗЖ» вируса бешенства представлены в таблице 1.

Параметры культивирования штамма «ВНИИЗЖ» вируса бешенства

Показатели Параметры культивирования клеток

в клинских матрасах в роллерах в КС-40

Посевная концентрация (тыс/мл) 140-200 140-200 700- 1000

Время получения полноценного монослоя (ч) 24 24 —

Оптимальное время культивирования (ч) 48 48 48

Множественность заражения (ЛД50/Ю1) 0,01 — 0,1 0,01 — 0,1 0,1-0,5

Условия культивирования (величина рН) 7,2 + 0,08 7,2 + 0,08 7,2 + 0,08

Температура культивирования (°0 36,75 + 0,125 36,75 + 0,125 36,75 ±0,125

Титр инфекционное™ вируса Ой ЛД5о/мл) М + т 7,10 + 0,28 7,25 ± 0,35 7,2 + 0,19

В опытах отмечено, что наиболее благоприятная температура для культивирования вируса 36,5-37,0°С и среда должна быть слабощелочной (значение рН 7,0-7,4). Максимальное накопление вируса происходило при монослойном культивировании при дозе заражения 0,01-0,1 ЛД50/мл, а при суспензионном культивировании — 0,1-0,5 ЛДя/мл.

Оптимальная посевная концентрация клеток при монослойном культивировании составляла 140-200 тыс/мл, а при суспензионном культивировании — 700-1000 тыс/мл. Показано, что штамм «ВНИИЗЖ» вируса бешенства при монослойном культивировании стабильно накапливается в

титрах 7,00-7,50 ДЦ50/МЛ, а при суспензионном культивировании- 6,80- 7,50 ДЦ50/МЛ.

Были проведены исследования по определению динамики накопления вируса в зависимости от срока культивирования.

В опыте показано, что титр инфекционности вируса достигал максимальных значений 7,33 ЛДд/мл после 48 часов культивирования и затем оставался на этом уровне.

Влияние способа подготовки посевного вируса на иммунобиологические свойства штамма «ВНИИЗЖ» Для заражения культуры клеток ВНК-21 использовали посевной вирус в виде 10% суспензии мозга овец, с титром инфекционности 6,0 ЛД50/мл и вирус первого пассажа на монослойной культуре клеток с титром инфекционности 6,5 ЛД50/мл.

Доза заражения для обоих способов культивирования была одинаковая (равная 0,1 ЛД50/МЛ). Культивирование осуществляли в течение 72 часов. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Влияние посевного вируса на иммунобиологические свойства штамма «ВНИИЗЖ»

Способы Вид посевного вируса

мозговой первый пассаж на монослое

Титр инфекц. Л Титр инфекц. Л

суспензионный 7,0 7,25 1,8 1,5 6,25 7,0 0,8 0,7

М + ш 7,30 + 0,118 р Цеденхуу, Пуревхуу :: 2005 :: Владимир

2.1. Вирус бешенства и его свойства

2.2. Эпизоотологические особенности бешенства

2.3. Культивирование вируса бешенства

2.4. Очистка и концентрирование вируса бешенства

2.5. Инактивация вируса и инактиванты

2.6. Адъюванты и их использование в антирабических вакцинах.

2.7. Определение качества вакцин против бешенства

Введение диссертации по теме «Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология», Цеденхуу, Пуревхуу, автореферат

Актуальность темы. Бешенство относится к группе опасных инфекционных заболеваний человека и животных, характеризующихся поражением центральной нервной системы, практически абсолютной летальностью и является одним из наиболее распространенных зооантропонозов. По оценке ряда исследователей это заболевание относится к зоонозам, наносящим наибольший экономический ущерб (22, 52, 59).

Ежегодно в мире погибает от бешенства свыше 50 тысяч людей и более 1 миллиона животных. Сложная эпидемическая и эпизоотическая ситуация по бешенству наблюдается более чем в 110 странах мира. По оценке ВОЗ, ежегодно получают укусы и имеют контакты с подозреваемыми животными около 10 млн. человек, 4 млн. из их числа получают специальную медицинскую помощь (25).

Все страны мира несут значительный экономический ущерб из-за прямых потерь от гибели, уничтожения больных и подозреваемых в заражении бешенством животных, недополучении сельскохозяйственной продукции, приплода, затрат на проведение диагностических исследований, вынужденную и профилактическую вакцинацию. Анализ данных, характеризующих эпизоотическую ситуацию по бешенству в Российской Федерации за 1991-2003 годы, свидетельствует о тенденции к ее усугублению.

Вспышки болезни регистрируются среди диких и домашних животных, что в конечном счете обуславливает заболеваемость и людей (16,25 и др.).

В системе мер борьбы с бешенством домашних и диких животных в современных условиях решающее значение приобретает своевременная и надежная лабораторная экспресс диагностика. В настоящее время в мировой практике диагноз на бешенство ставится на основании результатов прямого обнаружения антигена вируса в головном мозге животных реакцией прямой иммунофлюо-ресценции (РПИФ), твердофазным иммуноферментным анализом (ТФ ИФА), а также изоляцией вируса биопробой.

В современной биотехнологии при производстве антирабических вакцин используют различные вакцинные штаммы, которые выращивают в первичных и перевиваемых клеточных культурах (ВНК-21, ПС, Vero и др.), применяя различные методические приемы — пристеночный монослой, суспензионный и псевдосуспензионный методы (4, 16, 20, 60 и др.).

Для получения инактивированных вакцин применяют различные инакти-ванты и подбирают оптимальные условия инактивации. В таких случаях вирус должен полностью утрачивать свои инфекционные свойства и максимально сохранять антигенность.

Цели и задачи исследования. Главная цель наших исследований состояла в разработке технологии получения экспериментальных образцов культураль-ной инактивированной вакцины против бешенства из штамма «ВНИИЗЖ» и «ERA» и изучение иммунобиологических свойств этих вакцин в лабораторных и производственных условиях.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

— отработать метод культивирования штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERA» вируса бешенства;

— разработать метод инактивации культурального вируса бешенства пригодного для получения антирабических вакцин;

— проверить иммуногенные свойства полученных вакцин на естественно-восприимчивых животных;

— изучить изменения иммуногенных свойств вакцин при хранении при различных температурах.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований:

-предложен метод культивирования штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERA» вируса бешенства в культуре клеток ВНК-21;

-разработаны методы инактивации штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERA» вируса бешенства аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) и (3-пропиолактоном;

-проверена иммуногенность полученных вакцин на целевых видах животных;

-изучена сохраняемость вакцин в процессе хранения.

Практическое значение работы.

При инактивации штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERA» вируса бешенства ами-ноэтилэтиленимином (АЭЭИ) и Р-пропиолактоном получаются безвредные инактивированные препараты.

Разработанная вакцина из штамма «ВНИИЗЖ» сохраняют исходную активность при хранении при температуре 4-8°С в течение года (срок наблюдения).

Положения, выносимые на защиту:

Методика культивирования штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERA» вируса бешенства;

Результаты инактивации вируса бешенства аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ), Р-пропиолактоном;

Технология получения культуральной инактивированной адсорбированной антирабической вакцины;

Технология получения культуральной эмульсионной антирабической вакцины;

Изменения иммуногенных свойств вакцин в процессе хранения.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и опубликованы: в Материалах Международной научной конференции, посвященной 45-летию ВНИИЗЖ (г.Владимир, 2003г.); Международной научно-практической конференции, посвященной 60-летию питомника охотничьих собак ВНИИОЗ, Киров, 2004 г.), также докладывались на ученом совете ВНИИЗЖ в 2003-2004г.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических предложений и приложения.

Заключение диссертационного исследования на тему «Культуральная инактивированная вакцина против бешенства из штаммов ВНИИЗЖ и ERA»

1 .Разработаны безвредные, экологически безопасные и высокоэффективные культуральные антирабические вакцины из штамма «ВНИИЗЖ», которые способны индуцировать напряженный и длительный иммунитет и обеспечивать защиту животных от прямого заражения высоковирулентным вирусом бешенства.

2. Установлено, что штаммы «ВНИИЗЖ» и «ERA» вируса бешенства хорошо культивируются в культуре клеток ВНК-21 с использованием в качестве посевного материала 10% суспензии мозга овец, зараженных вирусом, и при культивировании в суспензионной культуре клеток можно получать большие количества вируса, необходимого для производства инактивированных вакцин.

3. Отработаны оптимальные условия культивирования штамма «ERA» вируса бешенства в монослое и суспензии культур клеток и показано, что максимальное накопление вируса бешенства в суспензионной культуре происходит за 48 часов, а в монослойной — за 72 часа.

4. Показано, что при использовании «мозгового вируса» в качестве посевного материала повышается иммуногенность антирабических вакцин по сравнению с культуральным посевным вирусом примерно в 2,7 раза.

5. Установлено, что доза заражения вируса для штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERA» в суспензионной культуре клеток должна быть 0,001 ЛД50/КЛ. при начальной концентрации клеток 1 млн/мл.

6. Разработан режим инактивации штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERA» вируса бешенства аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) и бета-проллоктаном и показано преимущество использования АЭЭИ как инактиванта при производстве промышленных серий вакцин, обеспечивающего полную инактивацию вируса и получение безопасного препарата, и как более дешевого инактиванта.

7. Иммуногенная активность антирабических вакцин из штамма «ВНИИЗЖ», изготовленных из вируса репродуцированного в суспензионной культуре клеток ВНК-21 в 2 раза выше, чем вакцин, полученных из вируса, культивируемого в монослойной культуре.

8. Показано, что после вакцинации животных вакциной из штамма «ВНИИЗЖ» вируса бешенства вируснейтрализирующие антитела в сыворотке крови обнаруживаются через 7 суток и сохраняются в сыворотке крови животных в течение 12 месяцев в титрах до 3,2 лог2, что достаточно для предохранения животных от прямого заражения вирусом.

9. Установлено, что инактивированные вакцины из штамма «ВНИИЗЖ» с адъювантами ISA-70, ПАК и ГОА способствуют формированию более напряженного иммунитета у различных видов привитых животных по сравнению с иммунитетом на живую антирабическую вакцину из штамма «ERA».

10. Показано, что инактивированная вакцина из штамма «ERA» обладает низкими иммуногенными свойствами и без концентрирования антигена не обеспечивает защиту животных от заражения бешенством.

11. Показано, что разработанные инактивированные культуральные антирабические вакцины из штамма «ВНИИЗЖ» сохраняют исходную иммуногенность, стерильность и безвредность в течение 12 месяцев хранения при температуре 4-8°С (срок наблюдения).

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предлагаются:

Проект нормативно-технической документации на изготовление культуральной инактивированной вакцины из штамма «ВНИИЗЖ» вируса бешенства:

— Инструкция по изготовлению и контролю антирабической культуральной вакцины из штамма «ВНИИЗЖ» (утверждена директором института 27 сентября 2004 г.).

— Технические условия на культуральную инактивированную вакцину из штамма «ВНИИЗЖ».

— Наставление по применению культуральной инактивированной вакцины против бешенства из штамма «ВНИИЗЖ» (утверждено директором института 27 сентября 2004 г.).

Кроме того, предлагаются следующие методики, которые одобрены ученым советом ВНИИЗЖ и утверждены директором института в 2004 г:

-«Методика культивирования штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERA» вируса бешенства и культуре клеток ВНК-21»;

-«Методика инактивации штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERA» вируса бешенства аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) и бета-пропилактоном».

источник

Изобретение предназначено для изготовления средств специфической профилактики бешенства всех видов сельскохозяйственных и домашних животных. Фиксированный вирус бешенства (ВБ) культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при 35-37°С в течение 96-144 ч. По окончании репродукции ВБ в вируссодержащую суспензию вносят сначала в качестве стабилизатора полиакриловую кислоту (ПАК) или феракрил (ФА) до концентрации 0,7-1,0%. Затем вносят в качестве инактиванта димер этиленимина (ДЭИ) до концентрации 0,1-0,3%. Смесь инкубируют при 35-37°С в течение 20-24 ч. Полученную вакцину используют как в жидком, так и в сухом виде. Для получения сухого препарата жидкую вакцину высушивают сублимацией. Изобретение повышает специфическую безопасность, иммуногенную активность, стабильность и безвредность вакцины, а также снижает ее реактогенность и аллергенность. 7 з.п. ф-лы, 2 табл.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении средств специфической профилактики бешенства всех видов сельскохозяйственных и домашних животных.

Бешенство животных относится к заболеваниям, неизбежно приводящим к гибели и, безусловно, является одной из самых страшных болезней, передаваемых человеку от животных. Поэтому борьба с ним представляется не только экономической, но социальной проблемой, успешное решение которой в значительной мере зависит от качества антирабических вакцин, применяемых с профилактической целью. Проблемы с созданием эффективной вакцины против бешенства животных обусловлены прежде всего трудностями, связанными с наработкой качественной биомассы вируса бешенства (ВБ).

Известен способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных, включающий репродукцию фиксированного ВБ, штамм «овечий» ВГНКИ, в мозговой ткани овец, внесение в вируссодержащую суспензию 1 % раствора фенола в качестве инактиванта, инкубацию смеси при 22 o C в течение 48 часов, ее соединение со средой высушивания, расфасовку препарата и его высушивание. Среда высушивания содержит 90 мл дистиллированной воды, 10 г сахарозы и 1,5 г желатины (1).

Недостатки данного способа заключаются в низкой иммуногенной активности полученной вакцины, высокой токсичности фенола и значительном содержании в препарате остаточного вируса, что способствует проявлению поствакцинальных осложнений у привитых животных, особенно у крупного рогатого скота и декоративных пород собак. Кроме того, содержащиеся в готовом препарате высокие концентрации сахарозы и желатины увеличивают реактогенность и аллергенность вакцины. Данный способ допускает выпуск нестерильного препарата.

Известен способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных с использованием инактиванта гидроксиламина (2).

Недостаток данного способа состоит в том, что используемый гидроксиламин не инактивирует микрофлору, присутствующую в вирусной суспензии.

Известен способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных, включающий репродукцию фиксированного ВБ, штамм «овечий» ВГНКИ, в мозговой ткани овец, внесение в вируссодержащую суспензию 20-21% раствора этанола в качестве инактиванта, инкубацию смеси при 30-31 o C в течение 12-14 суток, ее соединение со средой высушивания, расфасовку препарата и его высушивание. Среда высушивания включает 22.5 г сахарозы и 3 г желатины на 100 мл дистиллированной воды (3).

Недостатки данного способа заключаются в низкой иммуногенной активности полученного препарата, высокой трудоемкости его изготовления и нестерильности целевого продукта. Кроме того, содержащиеся в готовом препарате высокие концентрации сахарозы и желатины увеличивают реактогенность и аллергенность вакцины.

Известен способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных, включающий репродукцию фиксированного ВБ в культуре клеток ВНК-21, внесение в вируссодержащую суспензию в качестве инактиванта бета-пропиолактона до концентрации 0,02-0,03%, инкубацию смеси при 4-6 o C в течение 2-4 часов с последующим добавлением гидроокиси алюминия и сапонина в качестве адъювантов (4).

Недостатками данного способа являются нестабильность полученной вакцины, поскольку она выпускается в жидком виде, высокая себестоимость препарата, так как готовится из концентрированного антигена, наличие в вирусной суспензии контаминирующих вирусов и микрофлоры, попавших с сывороткой, клетками ВНК и из окружающей среды, так как использование бета-пропиолактона для инактивации инфекционности ВБ не обеспечивает стерильность вирусной суспензии.

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных, включающий репродукцию фиксированного ВБ в культуре клеток ВНК-21, внесение в вируссодержащую суспензию в качестве инактиванта бета-пропиолактона до концентрации 0,02-0,03%, инкубацию смеси при 4-6 o C в течение 2-4 часов, добавление в нее стабилизатора, адьюванта и лиофилизацию целевого продукта. Стабилизатор содержит, мас.%: пептон (7,5-15), сахарозу (7,5-150), желатину (3-6), воду — остальное. В качестве адъюванта используют сапонин (5, 6).

Недостатки способа — прототипа: 1) низкая иммуногенная активность полученной вакцины; 2) использование бета-пропиолактона в режиме инактивации инфекционности ВБ не обеспечивает стерильность вирусной суспензии от контаминирующих агентов, попавших в нее с сывороткой, клетками ВНК и из окружающей среды; 3) содержащиеся в готовом препарате высокие концентрации пептона, сахарозы, желатины и сапонина увеличивают реактогенность и аллергенность вакцины.

В задачу создания изобретения входила разработка способа изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных, обеспечивающего унифицированное производство специфически безопасной, высокоиммуногенной, стабильной, безвредной, свободной от контаминирующих агентов вакцины как в жидком, так и сухом виде. Применение препарата должно гарантировать эффективную профилактику бешенства у всех видов сельскохозяйственных и домашних животных.

Технический результат от использования изобретения заключается в повышении специфической безопасности, иммуногенной активности, стабильности и безвредности вакцины, а также в снижении ее реакгогенности и аллергенности.

Указанный технический результат достигается созданием изобретения, охарактеризованного следующей совокупностью признаков: 1) способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных; 2) репродукция фиксированного ВБ в культуре клеток; 3) в качестве культуры клеток используют суспензионную культуру клеток ВНК-21; 4) по окончании репродукции вируса в вируссодержащую суспензию сначала вносят стабилизатор, а затем инактивант; 5) в качестве стабилизатора используют полиакриловую кислоту (ПАК) или ее соль; 6) в качестве соли ПАК используют феракрил (ФА);
7) ПАК или ФА вносят в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,7-1,0%;
8) в качестве инактиванта вируса используют димер этиленимина (ДЭИ);
9) ДЭИ вносят в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,1-0,3%;
10) смесь вируссодержащей суспензии, ПАК или ФА с ДЭИ инкубируют при 35-37 o C в течение 20-24 часов;
11) полученный препарат используют в жидком виде;
12) полученный препарат высушивают сублимацией.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1) способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных;
2) репродукция фиксированного ВБ в культуре клеток;
3) по окончании репродукции вируса в вируссодержащую суспензию сначала вносят стабилизатор, а затем инактивант;
4) использование ПАК или ее соли в качестве стабилизатора;
5) использование ДЭИ в качестве инактиванта ВБ.

Предлагаемый способ характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы его выполнения:
1) в качестве культуры клеток используют суспензионную культуру клеток ВНК-21;
2) в качестве соли ПАК используют феракрил (ФА);
3) стабилизатор ПАК или ФА вносят в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,7-1,0%;
4) ДЭИ вносят в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,1-0,3%;
5) смесь инкубируют при 35-37 o C в течение 20-24 часов;
6) полученный препарат используют в жидком виде;
7) полученный препарат высушивают сублимацией.

Достижение технического результата от использования предлагаемого изобретения можно объяснить следующим образом.

Повышение специфической безопасности препарата, полученного предлагаемым способом, достигается за счет инактивации ВБ и контаминирующих агентов смесью ПАК или ФА с ДЭИ.

Повышение иммуногенной активности препарата, полученного предлагаемым способом, достигается за счет присутствия в вакцине смеси ПАК или ФА с ДЭИ.

Повышение стабильности вакцины, полученной предлагаемым способом, достигается за счет иммобилизации органических веществ в вируссодержащей суспензии с помощью ПАК или ФА.

Снижение реактогенности и аллергенности сухого препарата, полученного предлагаемым способом, достигается за счет исключения сапонина и среды высушивания, включающей пептон, сахарозу и желатину, а жидкой вакцины — за счет исключения гидроокиси алюминия и сапонина. ПАК и ФА не являются антигенами.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый способ и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1) способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных;
2) репродукция фиксированного ВБ в культуре клеток;
3) внесение инактиванта в вируссодержащую суспензию для инактивации полученного вируса;
4) инкубация смеси;
5) внесение стабилизатора.

По сравнению со способом-прототипом существенными отличительными признаками изобретения являются:
1) по окончании репродукции вируса в вируссодержащую суспензию сначала вносят стабилизатор, а затем инактивант;
2) использование ПАК или ее соли в качестве стабилизатора;
3) использование ДЭИ в качестве инактиванта ВБ.

Предлагаемый способ характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы его выполнения:
1) в качестве культуры клеток используют суспензионную культуру клеток ВНК-21;
2) в качестве соли ПАК используют ФА;
3) ПАК или ФА вносят в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,7-1,0%;
4) ДЭИ вносят в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,1-0,3%;
5) смесь инкубируют при 35-37 o C в течение 20-24 часов;
6) полученный препарат используют в жидком виде;
7) полученный препарат высушивают сублимацией.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентам и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого способа, позволил установить, что заявитель не обнаружил источник, характеризующийся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого способа. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности признаков аналога, позволил установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков в предлагаемом способе, изложенных в формуле изобретения.

Следовательно, предлагаемый способ соответствует условию патентоспособности «новизна».

Для проверки соответствия предлагаемого способа условию патентоспособности «изобретательский уровень» заявителем проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть формулы изобретения. В результате поиска установлено следующее.

Известно использование ПАК в качестве стимулятора иммунитета (7, 8).

Известно использование ФА (неполная железная соль полиакриловой кислоты) в качестве гемостатика, обезболивающего средства, а также препарата, обладающего бактерицидной и бактериостатической активностью в отношении ряда грамположительных и грамотрицательных микробов (9, 10).

Авторами изобретения установлены новые, ранее не известные свойства ПАК и ее соли ФА повышать вирулицидную и бактерицидную активность ДЭИ при их добавлении в вирусную суспензию перед внесением в нее инактиванта и одновременно служить стимуляторами иммуногенности и стабилизаторами вакцины при ее высушивании или хранении в жидком виде. Последовательное внесение ПАК или ФА и ДЭИ в вирусную суспензию позволили получить стерильную суспензию инактивированного ВБ. В этом случае инактивацию микрофлоры обеспечивает в три раза меньшая концентрация ДЭИ. При использовании каждого препарата в отдельности или порядка их внесения в вирусную суспензию не удалось добиться ее стерильности и стабильности.

Авторами установлено также, что при высушивании ПАК или ФА формируют прочную строму, предотвращающую потери препарата в процессе сушки. Сохранность иммуногенности жидкой вакцины проверена в течении 12 месяцев при температуре 4-8 o C с положительным результатом.

Известно также использование ДЭИ для инактивации вируса ящура (II).

Для инактивации ВБ ДЭИ использован авторами впервые. ДЭИ инактивирует ВБ по реакции первого порядка. Однако исследования по инактивации контаминирующей микрофлоры в образцах суспензии ВБ с помощью ДЭИ показали, что при 37 o C в течение 24 часов концентрация ДЭИ вплоть до 0,3% не всегда обеспечивала стерильность специально контаминированной суспензии. Вопрос получения стерильной суспензии ВБ был решен с помощью ПАК или ФА при добавлении их в вирусную суспензию перед внесением в нее ДЭИ. При этом от использования ПАК и ФА получены одинаковые результаты.

Результаты поиска показывают, что предлагаемый способ не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого способа), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого способа преобразований для достижения технического результата. Следовательно, предлагаемый способ соответствует условию патентоспособности «изобретательский уровень».

Для изготовления вакцины против бешенства животных используют фиксированный ВБ штамм «Щелково-51», репродуцированный в суспензионной культуре перевиваемых клеток ВНК-21 в среде Игла, содержащей 5-10% сыворотки и 0,25% гемогидролизата. Культивирование вируса ведут в течение 96-144 часов при температуре 35-37 o C, получая вирусную суспензию с титром инфекционности 5,5-6,5 lg ЛД_50/мл. Накопление ВБ в среде культивирования и клетках ВНК-21 происходит без признаков цитопатического действия вируса. По окончании репродукции вируса в вируссодержащую суспензию вносят сначала в качестве стабилизатора ПАК м.м.

1.000.000 или ФА до концентрации 0,7-1,0%, а затем — в качестве инактиванта ДЭИ до концентрации 0,1-0,3%. Смесь инкубируют при 37 o C в течение 20-24 часов. Полученную вакцину расфасовывают в 10 мл флаконы для сублимационного высушивания или реализации в жидком виде. В жидком виде вакцина имеет следующее соотношение компонентов, об.%:
ПАК или ФА — 14-20
ДЭИ — 0,5-1,5
вируссодержащая суспензия — остальное.

Для приготовления сухого препарата жидкую вакцину высушивают сублимацией. Готовую вакцину контролируют на физические свойства, стерильность, иммуногенность, безвредность, авирулентность.

Инактивацию инфекционности ВБ изучали по методике определения величины К₅₀ и в динамике снижения титра инфекционности, используя для этого мышат массой 10-12 г.

К₅₀ — это выраженная в % концентрация ДЭИ, снижающая инфекционность ВБ до уровня 1 ЛД_50/0,03 мл в течение 24 часов при температуре 37 o C. К₅₀ рассчитывают по формуле Кербера-Ашмарина
K₅₀= lgDm-lgd(Li-0,5),
где D_m — концентрация ДЭИ в образце суспензии, обеспечивающая авирулентность ВБ;
d — кратность испытанных концентраций ДЭИ;
L — отношение числа живых мышей к числу зараженных по каждому образцу вирусной суспензии;
i — номер образца суспензии.

Результаты опытов приведены в таблице 1.

Из приведенных в таблице 1 данных следует, что авирулентность суспензий обеспечивала концентрация ДЭИ ниже 0,009-0,012%. Расчетная концентрация ДЭИ, равная 0,004%, снижала инфекционность ВБ до одной ЛД_50/0,03 мл.

Известно, что олигомеры этиленимина, к которым относится ДЭИ, инактивируют все вирусы по реакции первого порядка. Для проверки этого факта сняли динамику инактивации ВБ, используя 0,2% концентрацию ДЭИ при 37 o C. Проба суспензии, взятая через час инактивации, имела титр инфекционности o C в течение 24 часов концентрация ДЭИ вплоть до 0,3% не всегда обеспечивала стерильность специально контаминированной суспензии. Контроль стерильности проводили по ГОСТ 28085-89. Вопрос получения стерильной суспензии ВБ был решен с помощью ПАК или ФА при добавлении их в вирусную суспензию до оптимальной концентрации 0,7-1,0% перед внесением в нее ДЭИ. В такой последовательности внесения в вирусную суспензию вышеуказанных препаратов инактивацию микрофлоры обеспечивала в три раза меньшая концентрация ДЭИ.

Различия в количестве ДЭИ, обеспечивающем авирулентность суспензии ВБ (0,009-0,012%) и инактивацию микрофлоры в вирусной суспензии (0,2-0,3%) требовали проведения исследований по влиянию высоких концентраций ДЭИ на иммуногенную активность жидкой и сухой вакцины против бешенства.

Установлено, что иммуногенная активность указанных препаратов не снижалась при увеличении концентрации ДЭИ от 0 до 0,5% (пределы исследований). Следовательно, ДЭИ можно использовать в концентрации 50-кратно превышающей минимально необходимую для инактивации инфекционности ВБ, обеспечивая высочайшую степень специфической безопасности вакцины.

ПАК и ФА, кроме повышения активности ДЭИ, являются стимуляторами иммунитета. При этом они проявляют одинаковую активность. При изготовлении сухой вакцины ПАК и ФА формируют прочную строму, предотвращающую потери препарата в процессе его высушивания сублимацией.

Сохраняемость иммуногенной активности жидкой вакцины проверена в течение 12 месяцев при 4-8 o C с положительным результатом.

Результаты контроля иммуногенной активности на мышах жидких и сухих вакцин против бешенства, изготовленных предлагаемым способом, приведены в таблице 2.

Из приведенных в таблице 2 данных следует, что ФА и ПАК, являясь стимуляторами бактерицидности ДЭИ, существенно повышают иммуногенность как жидких, так и сухих вакцин.

Экономическая эффективность от использования предлагаемого способа будет обусловлена следующими факторами:
1) отсутствием в готовом препарате биологических контаминирующих агентов, способных к репродукции в благоприятных условиях;
2) отсутствием дополнительных органических или неорганических примесей в виде пептона, желатины и сахарозы в сухой вакцине или гидроокиси алюминия и сапонина в жидком препарате;
3) унификацией производства жидкой и сухой вакцины.

Таким образом, изложенные сведения свидетельствуют о выполнении при использовании предлагаемого способа следующей совокупности условий:
— способ, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в области ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
— для предлагаемого способа в том виде, как он охарактеризован в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;
— способ, воплощающий предлагаемое изобретение при его осуществлении, обеспечивает достижение усматриваемого заявителем технического результата: повышение специфической безопасности, иммуногенной активности, стабильности и безвредности вакцины, а также снижение ее реактогенности и аллергенности.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности «промышленная применимость».

1. Авт. свид. СССР N 117464, A 61 K 39/205, 21.11.58 г.

2. Вагабов P. M. Разработка и экспериментальное изучение сухой антирабической вакцины, инактивированной гидроксиламином. Канд. дис. М., 1969, 44-60.

3. Авт. свид. СССР N 770196; C 12 N 7/00, A 61 K 39/205; 23.05.79 г.

4. Лихачев Н.В. Вакцины против бешенства. В кн. Биологические и химиотерапевтические ветеринарные препараты. М., 1963, 28-38.

5. Пат. РФ N 955577, A 61 K 39/205, 03.03.81 г. (прототип).

6. Временная инструкция по изготовлению и контролю сухой инактивированной культуральной антирабической вакцины. Утверждена ГУБ МСХ СССР 16.09.76 г.

7. Петров Р.В., Хаитов P.M. и др. Иммуногенетика и искусственные антигены. М., Медицина, 1983, 255 с.

8. Химическая энциклопедия. М., БРЭ, 1992, 3, 602 (ПАК).

9. Регистр лекарственных средств России. М. Инфармхим, 1993, 876-877 (ФА).

10. Авт. свид. СССР N 698622, A 61 K 33/26, 22.02.74 г. (ФА).

11. Пат. РФ N 594771, A 61 K 39/12, C 12 N 7/04; 07.05.73 г.

12. ГОСТ 28085-89. Препараты биологические. Метод бактериологического контроля стерильности.

13. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В. и др. Динамика вирусных болезней животных. Справочник. М., Агропромиздат, 1991, 255-270.

14. Иванов B. C. Перспективы совершенствования технологии изготовления культуральных инактивированных антирабических вакцин. Вирусные болезни с.-х. животных. Владимир, 1995, 203.

15. Иванов B.C., Скичко Н.Д. Разработка и внедрение в промышленное производство и ветеринарную практику России культуральных инактивированных вакцин против бешенства. Курской биофабрике и агробиологической промышленности России — 100 лет. Тез. докл. науч.-прооизвод. конф., 27-30 августа 1996 г., Курск, 1996, 126-128.

16. Пат. Великобритании N 1551437, C 12 N 7/00, 30.08.79 г.

17. Пат. Великобритании N 1596653, A 61 K 39/205, 26.08.81 г.

18. Пат. США N 4347239, A 61 K 39/205, 31.08.82 г.

19. Пат. США N 4584194, A 61 K 39/205, 22.04.86 г.

20. Пат. США N 4649049, A 61 K 39/205, 10.03.87 г.

21. Пат. США N 4664912, A 61 K 39/205, 12.05.87 г.

22. Пат. США N 4726946, A 61 K 39/12, 23.02.88 г.

23. Пат. Румынии N 87856, A 61 K 39/12, 30.11.85 г.

24. Пат. ЧССР N 238794, A 61 K 39/205, 16.12.85 г.

25. Пат. Швейцарии N 658192, A 61 K 39/205, 31.10.86 г.

1. Способ изготовления инактивированной вакцины против бешенства животных, включающий репродукцию фиксированного вируса бешенства в культуре клеток, внесение инактиванта в вируссодержащую суспензию, инкубацию смеси и внесение в нее стабилизатора, отличающийся тем, что по окончании репродукции вируса в вируссодержащую суспензию сначала вносят стабилизатор, а затем инактивант, при этом в качестве стабилизатора используют полиакриловую кислоту или ее соль, а в качестве инактиванта — димер этиленимина.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве культуры клеток используют суспензионную культуру перевиваемых клеток ВНК-21.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве соли полиакриловой кислоты используют феракрил.

4. Способ по пп.1-3, отличающийся тем, что полиакриловую кислоту или феракрил вносят в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,7-1,0%.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что димер этиленимина вносят в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,1-0,3%.

6. Способ по пп.1-5, отличающийся тем, что смесь инкубируют при 35-37 o C в течение 20-24 ч.

7. Способ по пп.1-6, отличающийся тем, что полученный препарат используют в жидком виде.

8. Способ по пп.1-6, отличающийся тем, что полученный препарат высушивают сублимацией.

источник