Типирование вирусный гепатит с

Это заболевание часто называют «ласковым убийцей», а озвученный врачом диагноз становится шоком для большинства пациентов. Дело в том, что в большинстве случаев это заболевание протекает незаметно для человека, бессимптомно, обнаруживается зачастую случайно, обычно тогда, когда уже успевает причинить непоправимый вред организму.

Передается инфекция через кровь, в том числе и половым путем, поэтому многие люди думают, что гепатит С – это удел наркоманов и проституток. Действительно, среди этих категорий много больных и скрытых носителей, но вирус не обладает избирательностью и поражает всех, кто оказывается в зоне риска. А заразиться можно множествами способов, в которых фигурирует кровь.

Гепатит С – тяжелая и опасная форма вирусного гепатита

Опасность вируса состоит в его нестабильности. Он постоянно находится в процессе мутации, поэтому организм сам не может выработать к нему иммунитет, а ученые – изготовить эффективную вакцину. Однако существуют данные, что примерно в 15% всех случаев инфицирования организму все-таки удается самостоятельно подавить вирус и справиться с болезнью.

Но остальные заболевшие рискуют заполучить цирроз печени или даже раковое поражение этого жизненно важного органа как результат длительного воздействия вируса.

Провоцируют развитие гепатита С флавивирусы. Они неустойчивы вне организма человека, в окружающей среде, склонны к постоянным изменениям, мутациям. В организме вирус может иметь крайне разнообразный инкубационный период, который измеряется разным количеством дней – от 20 до 140. Это зависит от множества показателей и факторов, в том числе и от состояния здоровья, крепости иммунитета, возраста. Самой главной опасностью этого заболевания является нестабильность вируса, что не позволяет получить универсальную вакцину, а также крайняя сложность полного от него избавления.

При благоприятном стечении обстоятельств процент выздоровления составляет 70-80%, но существует и высокий риск перерождения в цирроз и даже рак печени.

Хотя основная причина развития заболевания – это попадание вируса в кровь, произойти это может разными путями:

• Переливание крови. Это наиболее распространенный способ.
• Инъекции нестерильным или общим шприцем, в подавляющем количестве случаев происходит в наркоманской среде, когда колются сразу несколько зависимых.
• Ненадлежащая стерилизация инструментария в медицинских учреждениях, особенно в стоматологии.
• Отсутствие или некачественная стерилизация маникюрных и педикюрных инструментов в салонах.
• Незащищенные половые контакты, включая гомосексуальные.
• При беременности. Ребенок может быть инфицирован больной матерью или во время родов.
• Бодимодификация разного вида, включая пирсинг и татуировки.

Чаще всего заболевание проявляется общими симптомами, которые невозможно отнести только к гепатиту. Больной жалуется на общую слабость, дискомфорт и боль в правом подреберье, отсутствие аппетита, которое иногда доходит до отвращения к пище, тошноту, диарею, снижение веса, иногда до критических показателей. Чаще других при диагностике обнаруживаются 1, 2 и 3 генотипы вируса гепатита С.

ПЦР-анализ позволяет выявить болезнь на ранней стадии

Симптомы и внешние признаки заболевания не имеют характерных черт, по которым можно сразу сказать, чем болен пациент.

Для того, чтобы выявить истинную природу заболевания и определить существующие генотипы вируса гепатита С, больного направляют на следующие обследования и анализы:

1. Ультразвуковая диагностика. На экране монитора могут быть видны рубцовые изменения печени, возникающие при гепатите, а также характерный для него стеатоз – вкрапления жировых клеток в ткань органа.
2. Анализ крови. Его выполняют на антитела к вирусу и на выделение РНК вируса.

Основной методикой обнаружения вируса является твердофазный иммуноферментный анализ. Антитела к вирусу могут обнаруживаться к крови больного еще долгий период после выздоровления, но в этот период его РНК уже не находится, так как сам вирус погиб.

Так как вирус гепатита С чрезвычайно мутагенный, существует множество его разновидностей, которые называются генотипы вируса гепатита С. Всего на данный момент их зарегистрировано 11. Каждый из них имеет подтипы, которые обозначаются буквами латинского алфавита:

Выявление генотипа вируса важно для правильного подбора и назначения препаратов.

Генотип является важным в определении метода и курса терапии

Генотипы вируса гепатита С имеют отличия между собой. Чаще других встречающийся 1b обычно попадает в организм человека при переливании. Этот генотип распространен в России наряду с 4 типом вируса. Наркоманы чаще имеют 3a, а 10% больных имеют сразу два генотипа вируса — 1b и 3a.

Генотип 1b хуже других реагирует на лечение, но при правильном подборе средств реакция организма составляет 51%. Первый генотип также влияет на длительность лечения. Оно обычно составляет 48 недель, а в тяжелых случаях – до 72 и более недель.

Для сравнения: генотипы 2 и 3 требуют на лечение 24 недели, а уровень реакции на лечение достигает 80%. Также имеются различия в количество применяемых препаратов. При 2 и 3 генотипе используют 800 мг Рибавирина в сутки, а при генотипе 1 дозу нужно рассчитывать в зависимости от веса пациента. Стеатоз, то есть повышенное количество жира в печени, более характерен и выражен при 3 генотипе гепатита С.

По распространению характерных подтипов становится понятно, как вирус поражал определенные группы населения. Его эволюция заняла несколько тысячелетий, а по областям распространения можно проследить миграцию определенных человеческих масс:

• 1a – Австралия, Северная и Южная Америка.
• 1b – Европа, Азия.
• 2a – Китай, Япония.
• 2b – Северная Европа, Соединенные Штаты Америки.
• 2c – Южная и Западная Европа.
• 3a – Европа, Австралия, Южная Азия.
• 4a – Египет.
• 4c – Центральная Африка.
• 5a – Южная Африка.
• 6a – Гонконг, Макао, Вьетнам.
• 7a, 7b – Таиланд.
• 8a, 8b, 9a – Вьетнам.
• 10a, 11a – Индонезия.

Больше информации о гепатите С можно узнать из видео:

Вирус гепатита С недаром называют «ласковым убийцей». Его опасность не только в том, что симптомы болезни проявляются очень поздно, когда в печени уже произошли необратимый изменения, но и в разнообразности генотипов, самым опасным из которых считается гепатит С, генотип 1 b .

Возбудитель заболевания – РНК – содержащий вирус открыт относительно недавно (в 1989 г), поэтому создать эффективную вакцину до сих пор не удается. Генотип 1б считается самым устойчивым к лечению. Сейчас ведётся тщательно изучение всех возможных вариантов генотипа вируса и поиск оптимальной схемы терапии.

Этот тип вируса называют «японским», поскольку чаще всего он выявляют в странах юго-восточной Азии, в Японии, Китае, на Тайване, а также на Дальнем Востоке России. В группе риска по заражению вирусом часто оказываются туристы, отдыхающие на популярных курортах Таиланда.

Гепатит С по генотипу 1 b – гемоконтактная инфекция. То есть способ заражения такой же, как и при других разновидностях гепатита – при контакте с кровью или другими биологическими жидкостями заражённого человека. Заражение вирусом может произойти при несоблюдении санитарных норм во время проведения медицинских манипуляций (инъекций, переливания крови), при проведении стоматологических или косметических процедур.

Если во время маникюра, пирсинга, нанесения татуировки или в процессе лечения зуба происходит повреждение кожи или слизистых оболочек, вирус легко проникает в кровь и беспрепятственно разносится по организму.

Именно поэтому в медицинских, стоматологических и косметологических заведениях существуют правила обработки инструментария и работы с биологическими жидкостями пациентов. Но есть и другие способы заражения опасным вирусом, тяжело поддающиеся контролю. Это половой путь передачи инфекции, заражение детей от больной матери во время родов и лактации, а также распространение вируса среди наркоманов, использующих для инъекций общие шприцы.

Это общие пути заражения, характерные для всех разновидностей вирусного гепатита С. Следует отметить, что источником инфекции могут быть только биологические жидкости больного человека. Вирус содержится в крови, сперме, вагинальном секрете, материнском молоке. При очень большой вирусной нагрузке может содержаться в слюне, но в большинстве случаев этого не отмечается.

Генотип 1 b отличается о прочих разновидностей гепатита С следующими характеристиками:

• Чаще выявляется у пациентов, которым переливалась кровь и ее компоненты. Согласно статистическим данным до 80 % больных заразились именно по этой причине.
• Данная разновидность гепатита С тяжело поддается лечению, требует более длительного курса терапии и проявляет склонность к последующим рецидивам.
• Клиническая картина заболевания отличается выраженным астеновегетативным синдромом, который проявляется немотивированной слабостью, сонливостью, хронической усталостью.
• Генотип 1 b значительно повышает вероятность развития рака печени (гепатоцеллюлярной карциномы).

Вирус гепатита С генотип 1 b отличается длительным периодом носительства и бессимптомного течения. Он может занимать до 10 лет или больше. К концу этого периода постепенно начинают развиваться нарушения сна, утомляемость и слабость, которые не являются специфичными симптомами. Пациент часто может считать их следствием тяжёлой работы или возрастных изменений, поскольку довольно часто этот тип вируса обнаруживается в крови у пациентов старше 40 лет.

Симптомы поражения печени проявляются обычно через несколько лет после заражения и сопровождаются резким снижением работоспособности, особенно при физических нагрузках, появлением болей в правом боку, стойким повышением температуры, снижением аппетита. Желтушный синдром не характерен, чаще всего единственное проявление поражения печени – кожный зуд. Изменение цвета кожи, мочи и кала незначительное.

После первого появления симптомов очень быстро развиваются признаки цирроза – боли в правом подреберье, появление сосудистых звёздочек на коже лица, шеи и груди, накопление жидкости в брюшной полости и увеличении живота за счёт этого, развитие истощения. Частые осложнения цирроза – кровотечения различных локализаций. Опасная особенность именно этого типа вируса в том, что симптомы развиваются быстро, длительно сохраняется высокая вирусная нагрузка в крови, несмотря на лечение, поэтому велика вероятность летального исхода.

1. Острая инфекционная фаза может сопровождаться ярко выраженными признаками, которые возникают в ответ на воспаление тканей печени. Но чаще клиническая картина выражается стертыми симптомами и проявляется только астеновегетативным синдромом. Этот период длится до 6 месяцев и может завершиться самовыздоровлением (в 30%), либо перейти в хроническую стадию.
2. Фаза носительства протекает при отсутствии симптомов. На протяжении этого цикла вирус еще может покинуть организм и произойдет самоизлечение. В противном случае вирусоноситель представляет угрозу для здоровых людей. Эта стадия болезни продолжается от полугода до нескольких лет.
3. Латентная фаза. В этот период пациент не подозревает о том, что болен, поскольку никаких симптомов болезни нет. Тем временем вирус постепенно разрушает печень и через определенное время процесс становится необратимым.
4. Фаза разгара болезни начинается через несколько месяцев или лет после заражения и сопровождается характерными симптомами, вызванными тяжелым поражением печени.

Основной метод диагностики этого заболевания – обнаружение РНК вируса гепатита С генотип 1 b в крови пациента. Для этого проводится качественный и количественный анализ ПЦР. Качественный анализ подтверждает факт наличия или отсутствия вируса и имеет очень высокую чувствительность, количественный анализ – определяет уровень вирусной нагрузки, т.е. количество вирусных тел в крови. Его чувствительность ниже, поэтому отрицательный результат требует подтверждения в виде качественного анализа.

Для уточнения состояния внутренних органов и определения степени их поражения используются биохимический анализ крови, иммуноферментный анализ, проводится УЗИ брюшной полости и биопсия печени. Все эти исследования осуществляют с определённой периодичностью, позволяющей отследить динамику заболевания и эффективность лечения. Частоту их выполнения определяет врач.

Борьба с вирусом гепатита – непростая задача, однако при своевременном обнаружении инфекции и качественной терапии удается замедлить прогрессирование болезни и предотвратить такие осложнения, как печеночная недостаточность, цирроз или рак печени. Основу лечения гепатита С 1 b генотип составляют противовирусные, патогенетические и симптоматические препараты.

Пегелированный интерферон (Пегинтрон) и Рибавирин являются препаратами первой линии при любом типе вирусного гепатита. Их назначение называют стандартной двойной терапией. Действие препаратов основано на том, что они блокируют размножение вирусов, не позволяя им проникать в клетки и таким образом, останавливают развитие заболевания.

В случае с генотипом 1 b вместе со стандартной двойной терапией сразу же назначают средства, действие которых направлено на борьбу осложнениями гепатита.

Это ингибиторы протеазы, которые не дают развиваться дальнейшему поражению печени и препараты, поддерживающие нормальное кроветворение (его угнетение – побочный эффект двойной противовирусной терапии). После окончания основного курса лечения назначают гепатопротекторы, действие которых направлено на регенерацию клеток печени и восстановление ее функций.

Следует отметить, что противовирусная терапия редко переносится легко – препараты имеют множество побочных эффектов, а курс лечения длительный и продолжается от 5 до 18 месяцев. С учетом этого, стоимость лечения гепатита С 1 b оказывается очень высокой.

Тем не менее, если прервать курс или отказаться следовать предписаниям врача, есть риск рецидива, который всегда сопровождается быстрым ухудшением состояния. К тому же борьба с рецидивом болезни всегда требует больших усилий, чем первый курс лечения.

Если рецидив болезни возникает после окончания курса стандартной двойной терапии, прием Рибавирина и Пегинтерферона продолжают, дополнив схему лечения такими препаратами, как Телапревир или Боцепривир. После основного курса обязательно назначается поддерживающая терапия, позволяющая значительно продлить жизнь пациента.

Один из относительно новых препаратов при гепатите С генотип 1 b – Софосбувир (Сольведо). Он блокирует репликацию вируса, и может быть назначен как во время основного курса лечения, так и в качестве поддерживающей терапии. Его применяют не только при гепатитах, но и при других хронических вирусных инфекциях, в том числе ВИЧ, и при сочетании ВИЧ и гепатита.

В процессе лечения и после его окончания обязательно осуществляется лабораторный контроль вирусной нагрузки. Критерием эффективности противовирусной терапии считается исчезновение симптомов гепатита и отрицательный результат ПЦР, подтверждающий отсутствие РНК- вируса в крови пациента. При этом важно помнить, что полной элиминации (исчезновения) вируса не происходит, поэтому необходимо продолжать соблюдать предписания врача даже по окончании курса лечения.

Пациент считается полностью здоровым при сохранении нормального уровня печеночных ферментов, отсутствии осложнений (цирроза) и отрицательном анализе ПЦР спустя год после окончания курса лечения.

В лечении вирусного гепатита особую роль играет корректировка образа жизни и рациона питания. Это помогает ослабить влияние повреждающих факторов и делает медикаментозное лечение более эффективным. Если же пациент не выполняет врачебные рекомендации (нарушает предписанную диету, не отказывается от вредных привычек) – это может свести к нулю результаты дорогой и длительной терапии.

При гепатите С пациенту назначают диету стол №5 по Певзнеру, предполагающую исключение специй, копчёных, жареных и жирных блюд, животных жиров. Это поможет снизить нагрузку на печень и улучшить ее функционирование. Если пациент страдает от ожирения или наличия нескольких лишних килограммов, необходим контроль количества калорий в пище. Это тоже поможет разгрузить печень и предотвратить развитие осложнений (жирового гепатоза).

Из рациона полностью исключают фаст-фуд, консервы, полуфабрикаты, кондитерские изделия, сдобную выпечку, сладости, мороженое, газированные напитки. Запрещено употребление овощей с грубой клетчаткой и высоким содержанием эфирных масел (белокочанной капусты, тыквы, болгарского перца, редьки, редиса, лука, чеснока, хрена). Не стоит употреблять кислые фрукты и ягоды, зато спелые и сладкие фрукты можно без опасений включать в рацион. Полезно кушать арбузы, дыни, персики, груши, абрикосы, пить свежевыжатые овощные и фруктовые соки, разбавленные наполовину водой.

Запрещены жирные сорта мяса и рыбы, насыщенные мясные бульоны, колбасные изделия, сало, жирные соусы, специи и приправы. Не стоит употреблять шоколад, какао, крепкий черный кофе. Можно пить теплую минеральную воду без газа, компот из сухофруктов, кисель, морсы, разбавленные соки. Общий объем жидкости, употребляемой за день должен быть не мене 1,5 литров.

Основу диеты составляют фрукты и овощи, богатые витаминами, диетические сорта мяса и рыбы, нежирные кисломолочные продукты. Алкоголь полностью исключается. На поздних этапах заболевания может быть дополнительно регламентировано количество употребляемой жидкости и соли. Все блюда необходимо готовить на пару, отваривать или тушить.

Питание должно быть дробным, кушать нужно часто (5-6 раз в день, но понемногу, причем принимать пищу лучше в определенные часы). Рекомендуется увеличить в рационе количество потребляемого белка, мясные и рыбные блюда лучше готовить в виде паровых котлет, биточков, суфле, кнелей.

Пользу принесут паровые омлеты, разварные вязкие каши, вегетарианские супы, овощные гарниры, салаты из свежих овощей с растительным маслом. В ежедневное меню рекомендуется включать обезжиренный кефир, творог, натуральный йогурт. В день можно съедать 2- 3 кусочка подсушенного пшеничного хлеба вчерашней выпечки.

Для поддержания организма втонусе требуется умеренная физическая активность – прогулки, посильные упражнения, дыхательная гимнастика, выполнение несложных домашних обязанностей. Старайтесь каждый день совершать длительные прогулки, чаще бывать на свежем воздухе. Это поможет поддержать иммунитет и бороться с болезнью. Необходимо в корне поменять образ жизни, правильно питаться, отказаться от курения и

употребления алкоголя. Важно очень строго соблюдать лечебный режим, своевременно принимать лекарственные препараты и выполнять все предписания врача. Только в этом случае можно надеяться на благоприятный исход болезни.

Можно ли вылечить гепатит С генотип 1 b полностью? Сделать это сложно, поскольку вирус постоянно мутирует и может сочетаться с другими штаммами возбудителя. Еще одна опасность этой разновидности гепатита в том, что практически в 70% случаев он переходит в хроническую форму, которая тяжело лечится и протекает с необратимыми последствиями для организма.

Шансы на выздоровление при подобном диагнозе во многом зависят от таких факторов, как возраст больного, наличие сопутствующих заболеваний, способность переносить лекарственные средства, применяемых в процессе терапии. При своевременном обнаружении инфекции и адекватном лечении прогноз достаточно благоприятный. При переходе болезни в стадию ремиссии больные вирусным гепатитом по генотипу 1 b могут прожить долгие годы.

При отсутствии лечения или игнорировании рекомендаций врача болезнь прогрессирует, развиваются тяжелые поражения печени (цирроз, рак), ведущие к летальному исходу.

источник

Для проведения адекватной терапии, подбора лекарственных средств и составления прогноза исхода заболевания.

ВОЗ выделяет 6 основных генотипов вируса гепатита С. Каждый определенный тип наиболее распространен в конкретном регионе или стране. Генотипы от 1 до 3 распространены по всему миру, на Ближнем Востоке, в Африке у пациентов 4 генотип определяют чаще, шестой присущ азиатским странам, пятый распространен в ЮАР.

Кроме основных типов различают подтипы или квази-типы, от отдельного подтипа зависит течение заболевания и клинические проявления. Чувствительность вируса к применяемым схемам терапии зависит от генотипа и подтипа вируса.

• Первый имеет три квази-типа a, b и c.
• 2 генотип вируса гепатита С разделяется на четыре формы – от a до d.
• У третьего типа 6 подтипов – от a до f.
• 4 генотип имеет 10 квази-типов – от a до j.
• Пятый и шестой генотипы гепатита С имеют только подтип a.

Чтобы правильно определить тип вируса необходимо сдать анализ на генотип гепатита С. Он называется генотипирование вируса гепатита С.

Метод исследования – ПЦР (полимеразная цепная реакция) Real time. Этот метод позволяет произвести правильное определение генотипа гепатита с точностью более 97%.

Для диагностики генотипированием вируса гепатита С берется венозная кровь. Выявляется идентифицирующий участок РНК. В большинстве лабораторий при анализе на генотип гепатита С определяются самые распространенные квази-типы – 1,2 и 3.

Иногда генотип при проведении генотипирования HCV не определяется, такой результат проведенного анализа крови на генотип гепатита С не означает, что вируса нет. Такой исход можно объяснить двумя причинами:

1. нетипичный генотип для конкретного региона, необходим другой набор реагентов для проведения анализа на генотип вируса гепатита С;
2. низкие концентрации вирусных РНК в крови пациента, тогда нужна более мощная и чувствительная аппаратура для проведения генотипирования вируса гепатита С.

При комбинации двух типов вирусов в одном организме также осложняется проведение генотипирования HCV. Сдавать анализы лучше в крупных лабораториях, обладающих всем необходимым набором реактивов и современным оборудованием, тогда можно быть уверенным в результатах проведенных исследований.

Генотип с течением времени не может измениться, поэтому результат анализа действителен на протяжении всего курса лечения.

При проведении анализа на генотип гепатита С цена – это немаловажный фактор, в зависимости от региона она может варьироваться от 1200 до 2000 рублей. Это небольшая цена за уверенность в отсутствии или наличии определенного типа. Это крайне важно для назначения правильной схемы лечения, которая действительно поможет с 99% гарантией.

С появлением в 2013 году прямых противовирусных препаратов (ингибиторов обратной транскриптазы), ВОЗ и Европейской ассоциацией по изучению печени (EASL) были разработаны новые схемы лечения в зависимости от генотипа гепатита С. Выздоровление наступает в более 96% случаев.

После получения нового прямого противовирусного препарата Велпатасвира началась новая эра в лечение гепатита С. Комбинация Велпатасвира с Софосбувиром позволяет излечить пациентов даже без получения результата анализа крови на определение генотипа гепатита С. Перед пациентом и врачом уже не так остро стоит вопрос – как определить генотип гепатита С, как это было раньше до появления Велпатасвира. Но всё же генотипирование остается важным звеном диагностики и исключать его нельзя.

Для получения гарантированного положительного результата лечения необходимо не только пить назначаемые врачом препараты, но и соблюдать следующие ограничения:

• не употреблять алкоголь, наркотические вещества;
• хотя бы на время лечения нужно бросить курить;
• не применять народные средства и гепатопротекторы;
• максимально исключить любые нагрузки на печень – фаст-фуд, жирное, жареное, копченое.

Имеются клинически подтвержденные данные, что самолечение и алкогольная зависимость в большом проценте случаев приводят к циррозу. Кроме вирусной нагрузки пациент дополнительно разрушает печень этилом.

При сопутствующих заболеваниях, таких как: сахарный диабет, лишний вес, патологии щитовидной железы, индивидуальная непереносимость компонентов медикаментов, может потребоваться корректировка схем лечения. Все решения по изменению терапии может правильно принять только лечащий врач (вирусолог, гепатолог).

До появления прямых противовирусных средств самым опасным генотипом гепатита С считался 1b. Он в большинстве случаев приводил к тяжелым поражениям печени – циррозу, печеночной недостаточности, тяжелой интоксикации, раку печени. Заболевание протекало очень тяжело и только половина больных полностью излечивались. Высокий риск возможности появления рецидивов.

Схема лечения гепатита С первого генотипа всех подтипов в зависимости от имеющихся дополнительных патологий выглядит следующим образом:

источник

Изобретение относится к вирусологии и иммунологии и может быть использовано для типирования вируса гепатита С (НСV). Биологический образец контактируют с первым полипептидным реагентом, содержащим типоспецифический эпитоп, специфичный для первого типа вируса гепатита С и/или эпитопа кластерспецифического эпитопа, специфичного к кластеру первого типа вируса гепатита С либо к наборам антител, специфичных для указанных эпитопов. Эпитопы выбирают из эпитопов, локализованных между аминокислотными остатками 67 и 84, 1689 и 1718, и 2281 и 2313 НСV-1 или гомологичных областей НСV других типов. Набор полипептидов включает полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности типоспецифического или кластертипоспецифического эпитопов НСV. Изобретение позволяет типировать НСV путем иммунологического анализа. 3 c. и 8 з.п.ф-лы, 4 ил., 17 табл.

Изобретение относится к типированию вирусов гепатита C (HCV). В частности, настоящее изобретение относится к способу типирования HCV, используя новые типозависимые пептиды.

Известно, что вирусный гепатит вызывается пятью различными вирусами, известными как гепатит A, B, C, D и E. HAV является РНК-содержащим вирусом и не вызывает длительных клинических симптомов. HBV является ДНК-содержащим вирусом. HDV является зависимым вирусом, который не способен инфицировать клетки в отсутствии HBV, HEV-вирус, передающийся через воду. HCV впервые был идентифицирован и охарактеризован как вызывающий -A,- -B гепатиты (NANBH). Houghtonetal, Европейская заявка 388232. Это привело к открытию множества общих и специфических полипептидов, применимых как иммунологические реагенты для идентификации HCV, См. например, Choo et al. (1989) Seince, 244: 359-362, Kuo et al. (1989) Seicnce, 244: 362-364 и Houghton et al. (1991) Hopatology, 14: 381-388. HCV является основной причиной гепатитов, передаваемых при переливании крови.

Прототипный изолят (штамм) HCV был описан в Европейских заявках 318216 и 388222. Используемый здесь термин «HCV» включает вновь выделенные виды вируса NANBH. Термин «HCV-1» относится к вирусу, описанному в вышеупомянутых публикациях.

Со времени первоначальной идентификации HCV было идентифицировано по крайней мере шесть различных типов вируса, обозначенных как HCV-1 — HCV-6. Cha et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89, 7144-7148. Среди этих типов существует множество подтипов. Тип вируса, которым инфицирован пациент, может влиять на клинический прогноз и также на реакции к различным способам лечения. Yoshioka et al. (1992) Hepatology, 16: 293-299. В свете того факта, что наиболее серьезным клиническим исходом инфекции HCV является гепатоклеточная карцинома, было бы полезно иметь возможность определять, каким типом или типами HCV инфицирован пациент.

Используемый в настоящее время метод определения типа вируса состоит в типировании гена, то есть выделении вирусной РНК и определении последовательности различных сегментов путем полимеразной цепной реакции (PCR). Этот метод не только трудоемкий и требует много времени, но и не удобен для применения с пробами, которые содержались в условиях, не позволяющих сохранить РНК, или пробами от больных, у которых недостаточный высокий титр вируса. Было бы полезным иметь метод для типирования HCV путем иммунологического или серологического типирования.

Применяемым в настоящее время методом для скрининга крови и диагностики пациентов является иммунологический анализ. При этом иммунологическом анализе используется антиген из HCV-1, который содержит достаточное количество общих эпитопов для выявления антител к другим типам HCV. Иммунологический анализ не выявляет различий между инфекциями различными типами HCV.

Настоящее изобретение включает композиции и методы типирования HCV по генотипу и серотипу. Эти композиции включают типоспецифические эпитопы, нуклеиновые кислоты, кластертипоспецифических эпитипов, кодирующие эпитопы для использования в качестве зондов, и нуклеиновые кислоты, комплементарные к областям, граничащим с теми, которые кодируют эпитопы, для использования в качестве затравок.

Одним из аспектов изобретения является метод типирования HCV, включающий этапы приготовления содержащих антитела проб от индивидумов, контактирование проб с типоспецифическим эпитопом или кластер-типоспецифическими эпитопами в условиях, позволяющих связывание антигена с антителом, и определение того, связываются ли антитела в пробе с этим эпитопом.

Другой аспект изобретения относится к способу типирования HCV, включающему этапы получения антител, содержащий пробы от индивидуума, контактирование пробы с первым типоспецифическим эпитопом или кластертипоспецифическим эпитопом в условиях, позволяющих связывание антигена с антителом, контактирование пробы со вторым типоспецифическим эпитопом и типо-кластерспецифическим эпитопом в условиях, позволяющих связывание антигена с антителом, и определение того, связываются ли антитела из проб с первым или вторым эпитопом.

Другой аспект изобретения относится к полипептидам, содержащим типоспецифические эпитопы или кластертипоспецифические эпитопы. Полипептиды получают из трех различных областей генома HCV. Один набор полипептидов включает типоспецифический эпитоп или кластертипоспецифические эпитопы, полученные из области нуклеотида HCV. Этот первый набор обнаружен между 67 и 84 аминокислотными остатками HCV-1 и гомологичными областями других типов HCV. Здесь используются следующие сокращения аминокислотных остатков: A — аланин, I — изолейцин, L — лейцин, М — метионин, F — фенилаланин, P — пролин, W — триптофан, V — валин, N — аспарагин, C — цистеин, Q — глютамин, G — глицин, S — серин, T — треонин, Y — тирозин, R — аргинин, H — гистидин, K — лизин, D — аспарагиновая кислота, E — глютаминовая кислота.

Конкретные последовательности аминокислотных остатков, полученных из области нуклеотида, и подтипы, из которых они получены, следующие: 1. PEGRTWAQ, подтип 1а или 1б, 2. STCKSWGK, подтип 2а или 2б. 3. SEGRSWAQ, подтип 3а или 4, Другой набор полипептидов включает типоспецифический эпитоп, полученный из неструктурной области 4(NS4) HCV. Этот второй набор находится между аминокислотными остатками 1689 — 1718 HCV-1 и гомологическими областями других типов HCV.

Конкретные последовательности аминокислотных остатков и типы или подтипы, из которых они получены, следующие: 1. CSQHLPY, подтип 1a, 2. CASHLPV, подтип 16. 3. CASRAAL, подтип 2а или 2б.

Другой набор полипептидов включает типоспецифический эпитоп или кластертипоспецифические эпитопы, полученные из неструктурной области 5 (NS5) вируса гепатита C. Этот набор находится между аминокислотными остатками 2281-2313 HCV-1 и гомологическими областями других типов вируса гепатита C.

Конкретные последовательности аминокислотных остатков и типы или подтипы, из которых они происходят, следующие: 1. PDYEPVVHG, подтипы 1a, 2. PDYVPPVVHG, подтип 1б. 3. PDYQPATVAG, подтип 2а. 4. PGYEPPTVLC, подтип 2б. 5. FAQASPVW, подтип 1a. 6. FPPQALP1W, подтип 1б. 7. FPQALPAW, подтип 2a. 8. FPPQALPPW, подтип 2б.

Другой аспект изобретения охватывает молекулы нуклеионовых кислот, кодирующих последовательности аминокислотных остатков, описанных типоспецифических и кластертипоспецифических эпитопов. Эти молекулы нуклеиновых кислот применяются в качестве зондов, например, в блот-тесте по методу Сатерна или других методах выявления ДНК, таких как метод схватывания описанным в патенте США N 4868105 и N 5124246.

Другой аспект изобретения включает молекулы нуклеиновых кислот, комплементарные к фланкирующим участкам, кодирующих типоспецифические и кластертипоспецифические эпитопы. Такие молекулы нуклеиновых кислот используются при проведении полимеразной цепной реакции для определения генотипа конкретного HCV.

Фиг. 1 представляет диаграмму экспериментальной стратегии серотипирования.

Фиг. 2 представляет диаграмму исчерпывающей стратегии картирования эпитопа.

Фиг. 3 является сводкой графиков представляющих результаты картирования эпитипа HCV 1а (Rodneg).

Фиг. 4 является сводкой графиков, представляющих результаты картирования эпитопа HCV 2b (Nomoto).

«Вирус гепатита C» или «HCV» относится к видам вирусов, патогенные типы которых вызывают NANBH, и к происходящим из них аттенуированным типам или дефектным интерферируемым частицам, см., главным образом, публикации, цитируемые в разделе «Предпосылки изобретения». Геном HC. состоит из РНК. РНК-содержащие вирусы имеют относительно высокий уровень спонтанных мутаций, порядка 10 -3 — 10 -4 на встроенный нуклеотид. Fields & Knipe (1986) «Fundamental Verology» (Raven Press, NV). Поскольку гетерогенность и текучесть генотипа присущи РНК-содержащим вирусам, существует множество типов/подтипов среди видов HCV, которые могут быть вирулентными или невирулентными. Культивирование, идентификация, обнаружение и выделение различных типов HCV описаны в литературе. Как показано здесь, все нуклеотидные последовательности и последовательности аминокислотных остатков происходят из упомянутых типов HCV. Номер HCV-1 генома и последовательностей аминокислотных остатков, как таковы, описано Choo et al. (1990) Brit. Med. Bull., 46: 423- 441. Данное здесь описание позволяет диагностировать эти различные типы вирусов.

Использующийся в настоящем изобретении термин «тип» относится к вирусам HCV, которые различаются генотипически более чем на 30%, «подтип» относится к вирусам HCV, которые различаются генотипически на 10-20%, а термин «изолят» относится к вирусам HCV, которые различаются генотипически менее чем на 10%. «Типирование» относится к распознаванию одного типа HCV от другого.

Сведения о нескольких различных типах/подтипах HCV описаны в международной заявке WO 93/00365, в частности о типе или подтипе CDC/HCV1 (также называемом HCV-1). Информации об одном типе или подтипе, частичная геномная такой как или аминокислотная последовательность достаточно, чтобы позволить знакомому с этой областью науки специалисту, используя стандартную технику, выделить новые типы HCV. Например, нескольких различных типов HCV были подвергнуты скринингу, как описано ниже. Эти типы, которые были получены из нескольких человеческих сывороток (и из различных географических областей), были типированы, используя метод и реагенты, описанные в настоящей работе.

Была выведена геномная структура и нуклеотидная последовательность геномной РНК HCV-1. Геном, по-видимому, является однонитчатый РНК, содержащей 10.000 нуклеотидов, представляет собой положительную цепь и имеет непрерывную открытую рамку считывания (OPC), кодирующую полипептид, состоящий приблизительно из 3000 аминокислот. В OPC (ORF) структурный белок (белки), по-видимому, кодированы приблизительно в первой четверти области аминоконца, вместе с большинством полипротеинов, ответственных за неструктурные (NS) белки. Если сравнения со всеми известными вирусными последовательностями наблюдаются небольшие, но достоверные колинеарные гомологии с неструктурными (NS) белками семейства флавивирусов и с пестивирусами (которые в настоящее время также считаются частью семейства Флавивирусов).

Основываясь на предполагаемых аминокислотных остатках, закодированных в нуклеотидной последовательности HCV-1, и других доказательствах, возможные белковые домены кодированного полипротеина HCV и также приблизительные границы представлены в таблице 1.

Таблица 1 Предполагаемый домен — Приблизительная граница номера аминокислот) C (белок нуклеокапсида) — 1-191 E1 (белок оболочки вириона) — 192-383 E2/NS1 (оболочка) — 384-800 NS2 (неизвестная функция) — 800-1050
NS3 (протеаза) — 1050-1650
NS4 (неизвестная функция) — 1651-2100
NS5 (полимераза) — 2100 — 3011 (конец)
Эти домены являются гипотоническими предполагаемыми. Например, E1 — NS2 граница находится, возможно, в 750-810 области, а граница NS3 — NS4 примерно в 1640-1650. Имеется также доказательство, что 191 аминокислотная (aa) версия C является предшественником, который далее претерпевает процессинг до длины около 170 aa, и что белки NS2. NS4 и NS5 каждый также подвергаются процессингу в два зрелых белка.

Различные типа HCV определяются в соответствии с различными критериями, так, например, OPC, состоящая приблизительно из 9000 до 12000 нуклеотидов, кодирующая полипротеин, сходный по размерам с таковым вируса HCV-1, кодированный полипротеин сходного гидрофобного и/или антигенного характера, что и таковой вируса HCV-1, и наличие колинеарной полипептидной последовательностей, которые сохраняются с HCV-1.

Следующие параметры гомологии нуклеиновых кислот и гомологии аминокислот применимы как сами по себе, так и в комбинации для идентификации типов HCV. В целом, как описано выше, различные типы HCV проявляют около 70% гомологии, тогда как подтипы проявляют 80- 90% гомологии, а изоляты около 90% гомологии.

Используемый в настоящей работе термин — полинуклеотид, «происходящий из» обозначенной последовательности, относится к полинуклеотидной последовательности, которая состоит из последовательности по крайней мере около 6 нуклеотидов, предпочтительнее не менее 8 нуклеотидов, более предпочтительно не менее около 10-12 нуклеотидов, еще более предпочтительно по крайней мере около 15-20 нуклеотидов, соответствующих области обозначенной нуклеотидной последовательности. Термин «соответствие» означает гомологичный или комплементарный обозначенной последовательности. Предпочтительно, чтобы последовательность области, из которой происходит этот полинуклеотид, являлась гомологичной или комплементарной последовательности, которая уникальная для HCV генома. Методики гибридизации для определения комплементарности последовательностей нуклеиновых кислот в этой области известна. См., например, Moniatis et al. (1982). Кроме того, несовпадения двойных полинуклеотидов, образовавшихся при гибридизации, можно определить известными методами, включающими, например, переваривание нуклеазой, такой как 1, которая специфически переваривает однониточные участки в двойных полинуклеотидах. Области, из которых можно «извлечь» типичные последовательности ДНК, включают, но не ограничиваются, например, областями, кодирующими типоспецифические эпитопы, а также и несчитываемые и/или нетранслируемые области.

Производный полинуклеотид не обязательно физически происходит от показанной нуклеотидной последовательности, но может быть генерирован любым способом, включая, например, химический синтез, или репликацию ДНК, или обратную транскрипцию, или просто транскрипцию. Кроме того, комбинации областей, соответствующих таковой обозначенной последовательности, могут быть модифицированы известными в данной области науки, путями в соответствии с предполагаемым использованием.

Подобным образом, термин полипептидная или аминокислотная последовательность, «происходящая из» обозначенной последовательности аминокислоты или нуклеиновой кислоты, относится к полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, идентичную таковой полипептида, закодированного в этой последовательности или ее части, эта часть состоит, по крайней мере, из 3-5 аминокислот, или более предпочтительно, по крайней мере, из 8-10 аминокислот, и еще более предпочтительно, по крайней мере, из 11-15 аминокислот, или которую можно иммунологически идентифицировать с полипептидом, закодированным в последовательности. Эта терминология также включает полипептид, экспрессированный из обозначенной последовательности нуклеиновой кислоты.

Рекомбинантный или производный полипептид не обязательно транслируется из обозначенной последовательности нуклеиновых кислот, он может быть создан любым способом, включая, например, химический синтез, или экспрессию рекомбинантной системы экспрессии, или выделение из HCV, включая мутированные HCV. Описанные здесь полипептиды обычно относительно короткие и таким образом очень легко синтезируются химически.

Рекомбинантный или производный полипептид может включать в свою последовательность один или более аналогов аминокислот или неприродных аминокислот. Методы вставки аналогов аминокислот в последовательность известны в данной области науки. Он также может включать одну или более меток, которые известны специалистам в данной области науки. Подробное описание аналогов и «мимотопов» представлено в патенте США N 5,194,392.

Аналоги пептидов включают делеции, добавки, замены или его модификации, которые сохраняют способность типирования HCV. Предпочтительные «замены» — это те, которые консервативными, т.е. один остаток заменен другим того же общего типа. Хорошо понятно, что естественно встречающиеся аминокислоты могут быть подразделены на кислые, основные, нейтральные и полярные, или нейтральные и неполярные. Далее три из кодируемых аминокислот являются ароматическими. Обычно предпочтительно, чтобы кодируемые полипептиды, отличающиеся от природного эпитопа, содержат замещенные кодоны для аминокислот, которые относятся к той же группе, что и котоды замещенной аминокислоты. Таким образом, в целом основные аминокислоты Lys, Arg и His взаимозаменяемы, кислые аминокислоты аспарагин и глютамин взаимозаменяемы, нейтральные полярные аминокислоты Ser, Thr, Cys, Cln и Asn взаимозаменяемы, неполярные алифатические аминокислоты Cly, Ala, Yal, Ile и Leu консервативны относительно друг друга (но из/за размера Gly и Ala более близко родственны, и Val, Ile и Leu более близко родственны, а ароматические аминокислоты Phe, Trp и Tyr взаимозаменяемы). Хотя пролин является неполярной нейтральной аминокислотой, он представляет трудности из-за его влияния на конформацию, замена его или им не является предпочтительной, за исключением тех случаев, когда можно получить те же или сходные результаты конформации. Полярные аминокислоты, которые представляют консервативные изменения, включают Ser, Thr, Gln, Asn и, в меньшей мере, Met. Кроме того, хотя их классифицируют в различные категории, Ala, Cly и Ser представляются взаимозаменяемыми, а Cys дополнительно входит в эту группу или может быть классифицирован полярными нейтральными аминокислотами.

Следует далее отметить, что, если полипептиды получены синтетически, могут быть сделаны замены аминокислотами, которые не кодированы геном. Альтернативные остатки включают, например, омега аминокислоты формулы H₂N(CH₂)_nCOOH, где n = 2-6. Это нейтральные неполярные аминокислоты так же как саркозин (Sar), трет-бутилаланин (t-BuA), трет-бутилглицин (t-BuG), N-метил-Ile (N-MeIle) и норлейцин (Nle). Фенилглицин, например, может быть заместителем для Trp, Tyr или Phe — ароматической нейтральной аминокислоты, цитруллин (Cit) и метионин сульфоксид (MSO) являются полярными, но нейтральными, циклогексил аланин (Cha) нейтральный и неполярный, цистеиновая кислота (Cya) — кислая, а орнитин (Orn) — основной. Определяющие конформацию свойства пролиновых остатков могут быть сохранены, если один или несколько из них замещаются гидроксипропином (Hyp).

Термин «рекомбинантный полинуклеотид», используемый в настоящей работе, предполагает полинуклеотид геномного сДНК, полусинтетического или синтетического происхождения, который по существу своего происхождения или манипуляции: (1) не ассоциирован со всем или с частью полинуклеотида, с которым он связан в природе, (2) присоединен к полинуклеотиду, иному, чем тот, с которым он связан в природе, или (3) не встречается в природе.

Термин «полинуклеотид», используемый в настоящей работе, относится к полимерной форме нуклеотидов любой длины, будь то рибонуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды. Этот термин относится только к первичной структуре молекулы. Таким образом, этот термин включает только двух и однонитчатые ДНК и РНК. Он также включает известные типы модификаций, например метки, которые хорошо известны в этой области науки, метилирование «кэпы», и замещение одного или нескольких естественно встречающихся нуклеотидов аналогом, междунуклеотидные модификации, такие как, например, модификации с незаряженными связями (например, метил фосфонатами, фосфотриэфирами, фосфорамидатами, карбаматами и т.д.) и с заряженными связями (например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и т. д. ), связи, содержащие подвешенные остатки, такие, как например, белки, включая, но не ограничиваясь, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды и поли-L-лизин, интеркаляторы (например, акридин, псорален, и т.п.), содержащими хелаторы (т.е., металлы, радиоактивные металлы, борон, металлы-окислители, и т. п. ), содержащими алкиляторы, полинуклеотиды с модифицированными связями (например, альфа аномерные нуклеиновые кислоты и т.п.), а также немодифицированные формы полинуклеотидов. Полинуклеотиды, описанные здесь, являются относительно короткими и поэтому могут быть легко синтезированы химически.

Термин «очищенный» полипептид относится к полипептиду, находящемуся в состоянии, по существу свободном от других полипептидов, т.е. в композиции, которая содержит как минимум приблизительно 50% по весу (выбранного полипептида/к общему составу полипептидов в композиции), предпочтительно минимум около 70%, и еще более предпочтительно минимум около 90% выбранного полипептида безотносительно к небелковым материалам в этой композиции. Методика очистки вирусных полипептидов известнаа в этой сфере науки. Термин «очищенные» антитела в этой области науки определяются подобным же образом.

Как принято в настоящей работе, термин «эпитоп» относится к антигенной детерминанте полипептида. Эпитоп может содержать 3 или более аминокислот, которые определяют сайт связывания антитела. Обычно эпитоп содержит по крайней мере 5 аминокислот, но иногда состоит из не менее 8 аминокислот. Методы картирования эпитопов хорошо известны в данной области науки.

Как принято в настоящей работе, термин «типоспецифический эпитоп» относится к эпитому, обнаруживаемому у одного типа HCV. «Кластертипоспецифический эпитоп» обнаруживается у более чем одного типа, но реже, чем у всех типов HCV, Например, конкретный эпитоп может быть распознан антителами от пациента, инфицированного HCV-1, но не распознаваться или распознаваться менее эффективно антителами от пациента, инфицированного HCV-2. Аналогично кластертипоспецифический эпитоп от HCV-3 может быть распознан антителами от пациента, инфицированного HCV-3 или HCV-4, но не антителами от пациента, инфицированного HCV-1 или HCV-2. «Сохраненные эпитопы»- это те, которые распознаются антителами, специфическими для всех типов HCV.

Полипептид является «иммунологически реактивным» с антителами, которые связываются с пептидами благодаря распознаванию антителами специфического эпитопа, содержащегося в полипептиде. Иммунологическая реактивность может определяться связыванием антител, особенно, кинетикой связывания антител и/или конкуренцией в связывании, используя в качестве конкурентов известные полипептиды, содержащие эпитоп, против которого направлено антитело. Методики определения иммунологической реактивности полипептида с антителом известны в этой сфере науки.

Как используется в настоящей работе, термин «антитело» относится к полипептиду или группе полипептидов, которые включают по крайней мере один соединяющий антитела сайт. Термин «соединяющий антитела сайт» или «связывающий домен» образован из сложения вариабельных доменов молекул(ы) антитела с образованием трехмерных связывающих пространств с формой внутренней поверхности и распределением заряда, комплементарно к характеристикам эпитопа антигена, что позволяет проходить иммунологической реакции с антигеном. Соединяющий антитела сайт может быть образован из домена тяжелой и/или легкой цепи (V_н и V_L соответственно), которые образуют гипервариабельные петли, способствующие связыванию антигена. Термин «антитело» включает, например, сочлененные антитела, гибридные антитела, химерные антитела, измененные антитела, унивалентные антитела, Фаб-белки и однодоменные антитела.

Антитела, специфические к полипептидам, и полипептиды могут быть получены любым известным экспериментальным методом. Например, суспензию полипептидов в физиологически приемлемом буфере смешивают с подходящем адъювантом и вводят животному. Методы создания поликлональных и моноклональных антител хорошо известны и не будут здесь детально описаны.

Термин «полипептид» относится к полимеру аминокислот и не имеет отношения к определенной длине продукта, тем самым полипептиды, олигопептиды и белки включены в определение полипептида. Этот термин не относится или не исключает пост-экспрессионные модификации полипептида, например гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование и т.п. Включены в данное определение, например, полипептиды, содержащие один или более аналогов аминокислот (включая, например, неприродные аминокислоты и др.), полипептиды с замещенными связями, а также другие известные науке модификации, как встречающиеся в природе, так и не встречающиеся в природе.

«Лечение» — термин, употребляемый в настоящей работе, относится к профилактике и/или терапии.

Термин «индивидуум», употребляемый в данной работе, относится к позвоночным, в частности к представителям видов млекопитающих, и включает, но не ограничивается ими, животных (например, собак, кошек, крупный рогатый скот, свиней, овец, коз, кроликов, мышей, крыс, морских свинок и т.д.) и приматов, включая обезьян, шимпанзе, бабуинов и человека.

Как употреблено здесь, термин «смысловая нить» нуклеоиновой кислоты содержит последовательность, имеющую гомологию последовательности к таковым мРНК. Термин «антисмысловая нить» содержит последовательность, комплементарную к таковой «смысловой нити».

Употребляемый в данной работе термин «геном с колонительной нитью» (или «геном с + РНК) — это такой геном, в котором, будь то РНК или ДНК, является однонитчатым и который кодирует вирусный полипептид (ы). Примеры вирусов с + РНК включают Тогавириды, Коронавириды, Нетровириды, Пикорнавириды и Калицивириды. Сюда относятся также Флавовириды, которые ранее классифицировались как Топавириды. См. Fields & Knipe (1986).

Как употреблено в настоящей работе, термин «антитело-содержащая проба организма» относится к компоненту, организма индивида, который является источником представляющих интерес антител. Антитело-содержащие компоненты организма известны в данной области и включают, но не ограничиваются ими, например, плазму, сыворотку, спинномозговую жидкость, лимфоидную жидкость, внешние отделы дыхательного, кишечного и мочеполового трактов, слезы, слюна, молоко, белые кровяные тельца и миеломы.

Как употреблено в настоящей работе, термин «биологическая проба» относится к пробе ткани или жидкости, выделенной от индивидуума, включая, но не ограничиваясь, например, плазму, сыворотку, спинально-мозговую жидкость, лимфатическую жидкость, внешние срезы кожи, дыхательного, пищеварительного и мочеполового трактов, слезы слюны, молоко, клетки крови, опухоли и органы. Сюда также относятся пробы компонентов клеточных культур in vitro (включая, но не ограничиваясь ими, кондиционированную среду, получаемую от выращивания клеток в культуральной среде, предположительно зараженные вирусом клетки, рекомбинантные клетки и клеточные компоненты).

Практическая часть настоящего изобретения будет использовать, если не указано иначе, общепринятые методы молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК, синтез полипептидов и нуклеиновых кислот и иммунологии, которые относятся к этой области науки. Такие методы полно описаны в литературе. См. Moniatis, Fitsch & Sambrook, «Molecular Cloning: A Laborototy Manual» (1982); «DNA Cloning, Volums Iandll» (D.N. Clovered 1985); «Oligonueleotide Synthesis» (M.J.Gfit ed, 1984); «Nucleic Acid Hylridirazation» (B.D. Hames & S.J. Higgins eds, 1984); «Transeription and Translation» (B. D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); «Anunal Cell Culture» (R.I.Freshneg ed. 1986); «Immobilired Cells and Enrymes» (IRLPress, 1986); B.Perbal, «Apractical Guide To Molecular Cloning «(1984); the series», Methods in Erymology» (Academic Press, Inc); «Cene Transfer Vectos For Mammalion cells» (J.H. Millerand M.P. Calos eds., 1987. Cold Spring Harbor Laboratory). Meth. Enzymol., Vol. 154 and 155 (Wuand Grossman, and Wu, eds, respectively), Mayer and Walker, eds. (1987), «Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology» (Academic Press, London); Scopes, (1987) «Protein Purification. Prineipalsand Practuce», Second Edition (Springer Verlag, N. V.); and «Handbook of Experimental Immunology», Volumes I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds. 1986).

Все патенты, патентные заявки и публикации, упомянутые здесь как выше, так и ниже, таким образом, включены здесь в виде ссылок.

Изобретение включает способы для выявления HCV и идентификации инфекции различными типами HCV. Изобретение также включает полипептиды и молекулы нуклеиновых кислот, использованные в методах.

Способы для выявления и типирования инфекции HCV включают как иммуноанализы, так и идентификацию нуклеиновых кислот методами, включающими, но не ограниченными ими, (Southern) блот аналогом Сатерна и полимеразной цепной реакцией. Чтобы идентифицировать инфекцию вирусом HCV, биологическую пробу инкубируют с одним из полипептидов, описанным выше, в условиях, которые позволяют связываться антителу с антигеном, и определяют, связались ли антитела в пробе с эпитопом, обнаруженными на полипептиде.

Иммунологический анализ и диагностические наборы
Пептиды, содержащие типоспецифические эпитопы и кластертипоспецифические эпитопы, полезны в иммунологических анализах для выявления присутствия антител к HCV, или присутствия вирусов и/или вирусных антигенов в биологических пробах. Постановка иммологических анализов подвержена большому количеству вариаций, и в этой области известно множество методик. Для иммунологического теста используется, по крайней мере, один типоспецифический эпитоп или кластертипоспецифический эпитоп. В одном варианте иммунологический тест использует комбинацию типоспецифических эпитопов и/или кластертипоспецифических эпитопов.

Полипептиды полезны для типирования HCV путем использования эпитопов для определения присутствия типоспецифических или кластертипоспецифических антител. Полипептиды также пригодны для получения типо- или кластертипоспецифических антител, которые затем могут быть использованы в иммунологических тестах для выявления различий между типами HCV.

Полипептиды получают из трех различных областей генома HCV. Один набор полипептидов включает типо- или кластертипоспецифический эпитоп, полученный из нуклеоидной области HCV. Другой набор полипептидов включает типо- или кластертипоспецифические эпитопы, полученные из неструктурной области 4 (NS4) HCV. Другой набор полипептидов включает типо- или кластертипоспецифический эпитоп, полученный из неструктурной области 5 (NS5) вируса гепатина C. Этот набор находится между аминокислотными остатками 2281 и 2313 HCV-1 и гомологичными регионами других типов вируса гепатита C.

Полипептиды пригодны для использования в иммунологических тестах для одного или более типов HCV. Для определения одного типа пробу контактируют с одним или несколькими полипептидами, содержащими кластертипоспецифический эпитоп, в условиях, которые позволяют связываться антителу с антигеном, и определяют, связываются ли антитела в пробе с этим эпитопом.

В иммунологическом тесте для определения конкретного типа HCV биологическую пробу получают от индивидуума, контактируют с первым типоспецифическим эпитопом или кластертипоспецифическим эпитопом в условиях, которые позволяют связываться антигену с антителом, контактируют со вторым типоспецифическим эпитопом или кластертипоспецифическим эпитопом в условиях, которые позволяют связываться антителу с антигеном, и определяют, связывались ли антитела в пробе с первым или вторым эпитопом. Эти этапы могут быть повторены с любым числом полипептидов, содержащих типо- и/или кластертипоспецифические эпитопы.

Обычно иммунологически тест на анти-HCV антитело (а) включает отбор и приготовление тестируемых проб, подозреваемых на наличие антител, таких как биологическая проба, затем инкубацию ее с типоспецифическим эпитопом или кластертипоспецифическим эпитопом в условиях, которые позволяют образоваться комплексам антиген-антитело, и затем выявление образования таких комплексов. Подходящие инкубационные условия методически хорошо известны. Иммунологический тест может быть без ограничений в гетерогенных или гомогенных условиях и стандартного или конкурентного типа.

В гетерогенных условиях типоспецифический эпитом или кластертипоспецифический эпитоп обычно связан с твердой подложкой для улучшения разделения пробы от полипептида после инкубации. Примеры твердых подложек, которые могут быть использованы, включают, но не ограничиваются, нитроцеллюлозу (например, в виде мембраны или пластинки для микротитрования), поливинилхлорид (например, в виде пластин или микротитровальных лунок), полистирольный латекс (например, в бусах или планстиках для микротитрования, поливинилфторид (известный как Immulon ), диазотированную бумагу, нейлоновые мембраны, активированные бусы и бусы с белком A. Например, микротитровальные пластины DynatechImmulon 1 или Immulon 2 или 0,25-дюймовые полистирольные бусы (Precicion Plastic Ball) могут быть использованы в гетерогенных условиях. Твердые подложки, содержащие типоспецифические эпитопы или кластертипоспецифические эпитопы, обычно отмываются после отделения от гестируемой пробы и перед определением связанных антител. Как стандартный, так и конкурентный методы хорошо известны в данной области.

В гомогенных условиях тестируемую пробу инкубируют с типоспецифическим эпитопом или кластертипоспецифическим эпитопом в растворе. Например, это может быть в условиях, которые ускоряют образование любых комплексов антиген-антитело. Как стандартные, так и конкурентные условия для этих тестов хорошо известны в данной области.

В стандартных условиях количество антител HCV, образующих комплекс антитело-типо- или пластертипоспецифический эпитоп контролируется непосредственно. Это может быть достигнуто определением, будут ли меченые анти-ксеногенные (например, античеловеческие) антитела, которые распознают эпитоп на анти-HCV антителах, связываться в результате образования комплекса. В конкурентных условиях количество антител к HCV в пробе определяется контролем влияния конкурентного эффекта на связывание известного количества меченых антител (или другого конкурирующей связи) в комплексе.

В тесте ингибирования определяется способность антител связываться с полипептидами, содержащими различные типоспецифические эпитопы к кластертипоспецифическим эпитопам. Антитела сначала контактируют с полипептидами, содержащими эпитоп(ы) одного типа или кластер-типа HCV, и затем с полипептидами, содержащими эпитоп(ы) другого типа или пластер-типа HCV. Этот процесс может быть повторен для дополнительных типов или кластер-типов HCV.

Образовавшиеся комплексы, включающие анти-HCV антитела (или в случае конкурентного метода количества конкурентного антитела), выявляют любым из ряда известных способов в зависимости от условий. Например, немеченые антитела HC в комплексе могут быть выявлены, используя конъюгат антиксеногенно Iq, соединенного с меткой (например, ферментной меткой).

В типичном иммунологическом тесте тестируемую пробу, обычно биологическую пробу, инкубируют с полипептидами, содержащими один или несколько типоспецифических или кластертипоспецифических эпитопов, в условиях, которые способствуют образованию комплексов антиген-антитело. Можно применять различные условия. Например, может быть применен метод «сэндвича», в котором антитела, связанные с твердой подложкой, инкубируют с тестируемой пробой, затем отмывают, инкубируют со вторым, меченым антителом к анализу и подложку снова отмывают. Аналит выявляется определением, связано ли второе антитело с подложкой. В конкурентных условиях, которые могут быть либо гетерогенными, либо гомогенными, тестируемую пробу обычно инкубируют с антителом, а меченый конкурирующий антиген тоже инкубируют последовательно или одновременно. Эти и другие методы хорошо известны в данной области науки.

Антитела против типоспецифических эпитопов или кластертипоспецифических эпитопов можно использовать в иммунологических тестах для выявления вирусных антигенов у пациентов с HCV-вызванным NANBH, и у инфицированных доноров крови. Более того, эти антитела могут быть чрезвычайно полезными для выявления острой фазы у доноров и пациентов.

В иммунологическом тесте можно использовать, например, моноклональные антитела к типоспецифическим эпитопам или кластертипоспецифическим эпитопам, комбинацию моноклональных антител к эпитопам одного вирусного антигена, моноклональные антитела к эпитопам различных вирусных антигенов, поликлональные антитела к тому же вирусному антигену, или поликлональные антитела к различным вирусным антигенам. Методики могут быть основаны, например, на конкуренции или прямой реакции, или определении типа «сэндвич». Методики могут также, например, использовать твердую подложку или проводиться путем иммунопреципитации. Большинство тестов включают использование меченых антител или полипептидов, метки могут быть, но не ограничиваются энзиматическими, флуоресцентными, хемилюминесцентными, радиоактивными или молекулами красителей. Тесты, при которых усиливаются сигналы зонда, также хорошо известны, например тесты, использующие биотин и авидин, и энзиматически меченные и опосредованные иммунологические тесты, такие как ELISA.

Далее изобретение включает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих последовательность аминокислотных остатков описанных типоспецифических эпитопов и кластертипоспецифических эпитопов. Эти молекулы нуклеиновых кислот применимы в качестве зондов, например, в Southern блотах или других тестах узнавания ДНК, таких как отлавливающее определение, описанное в патентах США N 4868105 и N 5124246.

Изучение антигенного картирования путем экспрессии кДНК HCV показало, что ряд клонов, содержащих эти кДНК, экспрессировали полипептиды, которые были иммунологически реактивными с сывороткой индивидуумов с проявлениями NANBH. Ни один полипептид не был иммунологически реактивен со всеми сыворотками. Пять из этих полипептидов были очень иммуногенными в том смысле, что антитела к HCV-эпитопам в этих полипептидах были выявлены в сыворотках многих различных пациентов, хотя перекрест в выявлении был неполным. Таким образом, результаты по иммуногенности полипептидов, закодированных в различных клонах, позволяют предположить, что эффективные системы выявления инфекции HCV могут включать использование панелей эпитопов. Эпитопы в этих панелях могут быть сконструированы в один или множественные полипептиды. Тесты на различные эпитопы могут быть последовательными или одновременными.

Наборы, удобные для иммунодиагностики и содержащие соответствующие меченые реагенты, создаются путем упаковки соответствующих материалов, включая по данному изобретению полипептиды, содержащие типоспецифические эпитопы и кластертипоспецифические эпитопы или антитела против типоспецифических эпитопов и кластертипоспецифических эпитопов, в удобные контейнеры вместе с оставшимися реагентами и материалами, требующимися для проведения тестов, а также необходимый набор инструкций для проведения тестов.

Далее изобретение включает молекулы нуклеиновых кислот, комплементарные к флаксирующим областям последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих типоспецифические эпитопы и кластертипоспецифические эпитопы. Такие молекулы нуклеиновых кислот пригодны при проведении ПЦР (PCR) для определения генотипа конкретного HCV.

Следует отметить, что вариабельные и гипервариабельные области имеются в геноме HCV, поэтому гомология в этих областях ожидается значительно меньшей, чем во всем геноме.

Методики для определения гомологии последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот хорошо известны. Например, последовательность аминокислот может быть определена непосредственно и сравнена с последовательностью, предлагаемой в настоящей работе. Альтернативно может быть определена последовательность нуклеотидов геномного материала предполагаемого HCV (обычно через промежуточную кДНК), может быть определена аминокислотная последовательность, закодированная в нем, и сравнены соответствующие области.

Представленное выше обсуждение и примеры только иллюстрируют изобретение, средний специалист в данной области поймет, что изобретение может быть осуществлено другими путями и изобретение определяется исключительно формулой изобретения.

Пример 1. Сравнение главных эпитопов разнообразных различных типов HC.

Сравнивают гомологию аминокислотных остатков у различных типов и подтипов HCV для разных областей. Подтип HCV — такой, как описан филогенетическим анализом Simmondsa. Нумерация аминокислотной последовательности соответствовала таковой, описанной для последовательности прототипа HCV-1 Choo et al. В таблице 2 показан процент гомологии аминокислотных остатков типоспецифических эпитопов и кластертипоспецифических эпитопов и сохраненного главного эпитопа для области NS4. В таблице 3 показана гомология аминокислотных остатков между двумя типоспецифическими эпитопами или кластертипоспецифическими эпитопами области NS5. В таблице 4 показан процент гомологии аминокислотных остатков главных сохраненных эпитопов нуклеотидной области и типоспецифических эпитопов.

Пример 2. Синтез пептидов
Синтезируют два набора полипептидов. Первый набор разрабатывают для проведения картирования эпитопа HCV-1, а второй набор разрабатывают для определения, какие эпитопы, идентифицированные при изучении картирования эпитопа, содержали типоспецифические эпитопы. В первом наборе полипептидов шестьдесят четыре набора (в дубликатах), перекрывающих октапептидов, были синтезированы Mimotopes по всему HCV-1 полипротеину (3011 аминокислотных остатков).

Второй набор полипептидов получают в соответствии с методом, описанным Geysen (1990) J. Top. Med. Pub. Health, 21: 523-533, и Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154.

Для синтеза типоспецифического эпитопа во втором наборе полипептидов выбирают четыре антигенных области, которые представляют главные эпитопы неконсервативных последовательностей в HCV-1 из нуклеотида NS4, NS5 и их соответствующих последовательностей из подтипов HCV 1b, 2a, 3a и типа 4. Последовательность из нуклеотида выбирают из менее консервативной области аминокислотных остатков 67-88. Последовательность из NS4 области выбирают из области аминокислотных остатков 1689-1718. Последовательности, выбранные из области NS5, являются из области аминокислотных остатков 2281- 2313 и 2673-2707.

Пример 3. Биологические пробы
Чтобы определить эффективность полипептидов в способности определения различий между антителами, специфическими к различным типам CHV, получают антисыворотки от двадцати четырех хронических пациентов с NANBH из различных районов мира, включая восточное побережье и западное побережье Соединенных Штатов, Японии, Западно-европейских стран, Южноевропейских стран и Южной Африки. Выделение вирусной РНК, синтез кДНК, амплификация ПЦР секвенирование ДНК и гибридизация олигонуклеотидного зонда проводят как описано Cha et al. (1992) Proc Natl. Acad. Sci. USA, 89: 7144-7148.

Пример 4. Процедуры картирования эпитопов
Чтобы определить, какие области HCV содержат эпитопы, группоспецифические или консервативные, весь полипротеин HCV-1 подвергают эпитопному картированию. Примененный метод по существу такой же, как представлен на фиг. 2.

Шестьдесят четыре набора (в дубликатах) перекрывающихся октапептидов синтезируют Mimotopes через весь полипротеин HCV-1 (3011 аминокислот). Панель из 40 проб, содержащие 25 образцов реактивных антител к HCV из США, 9 реактивных проб к HCV из Японии и 6 HCV- нереактивных проб отрицательного контроля, отбирают для эпитопного картирования и кластерного анализа. Иммунологический тест проводят с использованием стандартных процедур ELISA.

Критерии для идентификации главных эпитопов основываются на частоте реакции антител и интенсивности реакции антител (титр) к этим эпитопам. Результаты представлены на фиг. 3 и 4.

Пример 5. Пептидзависимые, связанные с ферментом иммуносорбентные тесты
Чтобы определить оптимальный иммунологический тест с использованием полипептидов, описанных в примере 2, проводят два отдельных полипептидзависимых связанных с ферментом иммуносорбентных теста ELISA и сравнивают результаты. Первый тип ELISA представляет Nune Maxisore TM , на котором пептиды просто адсорбируются, а во втором типе используют Nune Covalink NH TM , на котором полипептиды связаны ковалентно. Образование амидных связей между карбоксильными кислотами и аминами инициируется добавлением карбодиимида. Для снижения гидролиза активный сложный эфир можно приготовить добавлением N-гидрокси-сукцинимида (NHS) к вышеуказанным процедурам конъюгирования.

Микротитровальные пластинки для первого типа ELISA готовят следующим образом. Полипептиды помещают в лунки микротитровальных пластин Nune Maxisore TM в концентрации 1 мкг/на лунку в 100 мкл физраствора с фосфатным буфером (PBS). Полипептиды оставляют на ночь для адсорбции при комнатной температуре. Затем микротитровальные пластины отмывают четыре раза с PBS без детергента. Затем лунки покрывают 220 мкл Superblook R (Picrce) на один час, а затем отсасывают без дальнейшего промывания и высушивают под вакуумом.

Определение проводят следующим образом. Пробы сыворотки объемом 5 мкл добавляют в лунку со 100 мкл 5% обезжиренного молока и инкубируют один через при 37 o C. Затем лунки отмывают пять раз в PBS с 0,05% Tween. Конъюгаты очищенного по сродству козьего анти-человеческого IgG, меченные пероксидазой хрена (Jackson Laboratories), затем используют для определения степени связывания антител человека с полипептидами. Конъюгаты предварительно разбавляют до 5% IgG в 150 mM NaCl, PBS и 5% лошадиной сыворотки (денатурированной нагреванием). 100 мкл конъюгата помещают в лунки и инкубируют один час при 37 o C. Затем лунки отмывают пять раз в PBS/Tween и OPD [о-фенилен-диамин-2HCl, одна таблетка на проявляющий буфер (цитрат фосфатный, забуфериренный 0,02% H₂O₂), Sigma] в течение тридцати минут при комнатной температуре и определяют поглощение при 492 нм и 620 нм. Разницу определяют из 200 случайных (нормальных) образцов при семи стандартных отклонениях от среднего или около 0.45.

Микротитровальные пластины для второго типа ELISA готовят следующим образом. Полипептиды помещают в лунки микротитровальных пластин Nune Maxisorl TM в концентрации 10 мкг/на лунку в 50 мкл воды. Затем добавляют 25 мкл 0,1 М NHS (сульфо-N-гидросукцинимида, Pierсe) и 25 мкл 0.1 М EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропилкарбодиимида) Sigma) к полипептидам и перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин на качающейся платформе. Все содержимое затем добавляют к 52 мл ледяного 0.1 М a-карбонатного буфера pH 8.6. 100 мкл смеси используют для покрытия лунок микротитровальной пластины и затем 30 мин инкубируют при 4 o C, затем пластины четыре раза отмывают раствором PBS/0,1% Triton X-100. После этого пластинки обрабатывают Superblock и тест проводят как описано выше.

Полученные результаты представлены в таблицах 5-14.

Пример 6. Тест ингибирования
Тесты ингибирования проводят для определения способности пептидов конкурировать друг с другом в связывании антител. Синтезируют три набора коротких полипептидов из нуклеотидных областей NS4 и NS5 различных типов последовательностей HCV. Эти полипептиды охватывают области последовательностей от аминокислот 1689-1695, 1696-1702 и 1711-1917. Тесты ингибирования проводят добавлением 10 мкг вышеуказанных полипептидов к пробе и инкубации при 37 o C в течение одного часа, а затем проводят тест ELISA, как описано выше. Если обнаруженное ингибирование составляло более 50% связывания антител, полипептид считался ингибиторным. Полученные результаты представлены в таблице 15.

Пример 7. Типирование из клинических проб HC
Типо- или кластертипоспецифические эпитопы, представленные в таблице 16, используют в тестах ELISA примера 5 для тестирования 13 клинических проб от больных не-А, не-Б гепатитом (10 платных доноров, 3 зараженных при переливании крови хронических больных не-А, не-Б гепатитом). В таблице 17 представлены результаты этих тестов. Каждую клиническую пробу исследуют на реактивность с двенадцатью различными пептидами, соответствующими данным областям (aa 67-84, 1689-1718 или 2281-2313), представляющим различные типоспецифические или кластертипоспецифические эпитопы. Каждая проба дала нереактивный (NR), слабо реактивный (WR) или реактивный (R) ответ с каждым типированием пептидов. Эти результаты предсказывают генотип HCV для каждой пробы, который коррелирует с генотипом HCV, определенным по ПЦР, представленным в правой колонке.

1. Способ типирования вируса гепатита С (HCV), включающий в себя стадии а) получения биологического образца, предположительно содержащего HCV; b) контактирования этого образца с первым полипептидным реагентом в условиях, обеспечивающих образование комплексов антитело — эпитоп и с) определения присутствия комплексов антитело — эпитоп и типа HCV, отличающийся тем, что (i) первый полипептидный реагент содержит типоспецифический эпитоп, специфический для первого типа вируса гепатита С и/или эпитопа типа кластерспецифического эпитопа, специфичного к кластеру первого типа вируса С, и (ii) указанные эпитопы выбирают из эпитопов, локализованных между аминокислотными остатками 67 и 84, 1689 и 1718, 2281 и 2313 вируса гепатита С-1 (HCV-1) или гомологичных областей вируса гепатита С других типов.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно включает в себя стадии d) контактирования указанного образца с вторым полипептидным реагентом в условиях, обеспечивающих образование комплексов антитело — эпитоп, е) определения наличия в образце комплексов антитело — эпитоп, при этом i) второй полипептидный реагент содержит типоспецифический эпитоп для вируса гепатита С второго типа и/или кластертипоспецифический эпитоп для кластера второго типа вируса гепатита С, и ii) указанные эпитопы выбирают из эпитопов, локализованных между аминокислотными остатками 67 и 84, 1689 и 1718, 2281 и 2313 вируса гепатита С-1 (HCV-1) или гомологичных участков вируса гепатита С других типов.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что эпитопы второго и первого полипептидных реагентов выбирают из различных областей HCV.

4. Способ по любому из пп.1 — 3, отличающийся тем, что указанные эпитопы выбирают из аминокислотных последовательностей PEGRTWAQ, STGKSWGK, SEGRSWAQ, CSQHLPY, CASHLPY, CASRAAL, CASKAAL, SQHLPY, ASRAAL, ASKAAL, FAQALPVW, FPPQALPPW, FDYEPPVVHG, PDYVPPVVHG, PDYQPATVAG, PGYEPPTVLG и PDYRPPVVHG.

5. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что стадию определения выполняют с помощью конкурентного теста, сэндвич-анализа, иммунофлуоресцентного анализа, радиоиммуноанализа или твердофазного иммуноферментного анализа.

6. Способ типирования вируса гепатита С (HCV), включающий в себя стадии а) получения биологического образца, предположительно содержащего HCV, b) контактирования этого образца с набором антител, специфичных для эпитопов HCV в условиях, обеспечивающих образование комплексов антитело — эпитоп, и е) определения наличия комплексов антитело — эпитоп и типа HCV, отличающийся тем, что i) HCV-эпитопы являются типоспецифическими эпитопами, специфичными для первого типа вируса гепатита С, и/или кластерспецифическим эпитопом, специфичным для кластера первого типа вирусов гепатита С, и ii) указанные эпитопы выбирают из эпитопов, локализованных между аминокислотными остатками 67 и 84, 1689 и 1718, 2281 и 2313 вируса гепатита С-1(HCV-1) или гомологичных областей вируса гепатита С других типов.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что дополнительно включает в себя стадии d) контактирования указанного образца с вторым набором антител, специфичных к эпитопам HCV, в условиях, обеспечивающих образование комплексов антитело — эпитоп, е) определения наличия в образце комплексов антитело — эпитоп, при этом i) эпитопы HCV являются типоспецифическими эпитопами для вируса гепатита С второго типа и/или кластертипоспецифическими эпитопами для кластера второго типа вирусов гепатита С и ii) указанные эпитопы выбирают из эпитопов, локализованных между аминокислотными остатками 67 и 84, 1689 и 1718, 2281 и 2313 вируса гепатита С-1 (HCV-1) или гомологичных участков вируса гепатита С других типов.

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что второй набор антител узнает эпитопы HCV из другого участка генома HCV нежели первый набор антител.

9. Способ по любому из пп.6 — 8, отличающийся тем, что указанные эпитопы HCV выбирают из аминокислотных последовательностей PEGRTWAQ, STGKSWGK, SEGRSWAQ, CSQHLPY, CASHLPY, CASRAAL, CASKAAL, SQHLPY, ASRAAL, ASKAAL, FAQALPVW, FPPQALPPW, PDYEPPVVHG, PDYVPPVVHG, PDYQPATVAG, PGYEPPTVLG и PDYRPPVVHG.

10. Способ по любому из пп.6 — 9, отличающийся тем, что стадию определения выполняют с помощью конкурентного теста, сэндвич-анализа, иммунофлуоресцентного анализа, радиоиммуноанализа или твердофазного иммуноферментного анализа.

11. Набор полипептидов для типирования вируса гепатита С, включающий в себя полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность по меньшей мере одного эпитопа вируса гепатита С, выбираемую из аминокислотных последовательностей PEGRTWAQ, STGKSWGK, SEGRSWAQ, CSQHLPY, CASHLPY, CASRAAL, CASKAAL, SQHLPY, ASRAAL, ASKAAL, FAQALPVW, FPPQALPPW, FDYEPPVVHG, PDYVPPVVHG, PDYQPATVAG, PGYEPPTVLG и PDYRPPVVHG.

источник