Алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита с у доноров крови

Длительность периода (в среднем 66 дней) сероконверсии, то есть периода от момента заражения до выявления anti-HCV при вирусном гепатите С и аналитическая ограниченность современных методов лабораторной диагностики привели к необходимости поиска и внедрения новых подходов при скрининге донорской крови на ВГС. В частности, была предложена процедура повторного серологического контроля доноров.

На повторное обследование направлялись доноры, у которых в исследуемом образце при первичном скрининговом исследовании на anti-HCV методом ИФА значения оптической плотности образца находились в пределах «серой зоны», то есть рассматривались как сомнительные результаты, а подтверждающий тест с использованием иммунологического блотинга отрицательный или неопределенный.

Появление сомнительных результатов может быть связано с недостаточным уровнем антител у инфицированных пациентов на данном этапе заболевания, или наличием перекрестных реакций с другими антигенами при отсутствии выявляемой патологии. Повторное обследование доноров через промежуток времени от 1 до 3 месяцев значительно повышает вероятность появления определяемого уровня anti-HCV у лиц с наличием инфекции.

В исследуемую группу было включено 99 доноров. Проведенное повторное лабораторное обследование не выявило у 70 (70,7%) доноров антител к вирусу гепатита С, и лабораторный диагноз «Вирусный гепатит С» был снят. Вместе с тем, в сыворотке крови 5-ти (5,0%) доноров из исследуемой группы были обнаружены anti-HCV и поставлен лабораторный диагноз «Вирусный гепатит С». От донорства данные лица были отстранены и направлены на клиническое обследование в гепатологический центр инфекционной клинической больницы № 1 ДЗ г. Москвы. У 24 (24,2%) доноров при серологическом исследовании были получены сомнительные результаты, которые расценивались как неспецифическая реакция на anti-HCV. Эти лица также были отстранены от донорства и направлены на клиническое обследование.

Эффективность внедрения повторного лабораторного обследования доноров на наличие маркеров вирусного гепатита С представлена на рисунке 2.

Рисунок 2. Результаты повторного серологического контроля на маркеры ВГС.

После клинического обследования 24 доноров с неспецифической реакцией, двум из них был поставлен диагноз ВГС, у остальных диагноз остался неопределенным.

Таким образом, семи донорам (7,1%) из 99 при динамическом наблюдении и дополнительном клиническом обследовании был поставлен диагноз «Вирусный гепатит С» и заготовленная от них продукция была забракована, чем предупреждено инфицирование возможных реципиентов. Здоровые доноры в количестве 70 человек (70,7%) были восстановлены в донорстве

Результаты лабораторного исследования определяют алгоритм дальнейшего использования заготовленной гемопродукции. Из всех компонентов крови наибольший срок годности имеет свежезамороженная плазма. Она подвергается глубокой заморозке и обязательному хранению (карантинизации) до 3-х месяцев. По результатам проведенного повторного серологического контроля плазма 70 доноров с отрицательной серологической реакцией на ВГС была карантинизирована и впоследствии реализована, плазма остальных 29 доноров забракована и утилизирована.

Внедрение процедуры повторного серологического контроля позволило в 2007 году возвратить в донорский контингент 70 человек, у которых был получен отрицательный результат в ходе обследования на anti-HCV, что составило 0,19 % от общего числа (37250) доноров плазмы и крови. Плазма крови этих доноров была использована для гемотрансфузии.

В то же время, доноры с положительной реакцией на anti-HCV (5 человек, 0,013%) получили абсолютный отвод от донорства, а все компоненты крови были утилизированы.

Согласно алгоритму, который использовался ранее, и был регламентирован приказами Минздрава РФ, карантинизированные и не подлежащие карантинизации компоненты крови доноров с сомнительными результатами исследований на ВГС могли быть использованы для реципиентов.

Таким образом, введение повторного серологического контроля через 1-3 месяца крови доноров, у которых при первом проведении ИФА образец расценивался как сомнительный, при втором проведении ИФА получен отрицательный результат на anti-HCV, а подтверждающий тест отрицательный или неопределенный, позволило на 0,013% (p

источник

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему: Алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита C у доноров крови

Автореферат диссертации по медицине на тему Алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита C у доноров крови

АЛГОРИТМ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА

14.00.46 — клиническая лабораторная диагностика

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении выс: профессионального образования «Российский государственный медицин университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развит

доктор медицинских наук, профессор

Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосов« Департамента здравоохранения г. Москвы.

Защита состоится « » 2009 года в 14.00 часов на засед]

диссертационного совета Д 208.072.08 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по ад 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО России! государственного медицинского университета по адресу: 117997, Москва, Островитянова, д.1.

Автореферат разослан « » 2009 года

Тогузов Руслан Тимофеевич

Семененко Татьяна Анатольевна

Кафарская Людмила Ивановна

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

Вирусный гепатит С — кровяная вирусная инфекционная болезнь с контактным механизмом передачи. Она характеризуется преимущественным поражением печени и является социальнозначимой инфекционной патологией. На долю вирусного гепатита С в структуре вирусных гепатитов в нашей стране приходится от 5 до 15 % случаев [Онищенко Г .И., 2008].

Возбудитель заболевания — РНК-содержащий вирус. Источником инфекции являются люди, больные острым и хроническим гепатитом С, и вирусоносители. Вирус гепатита С (HCV) передается парентеральным путем. Один из способов передачи — трансмиссивное заражение при проведении гемотрансфузий.

Частота носительства возбудителя гепатита С у доноров крови достигает 7% [Дашкова Н.Г., Расницын С.П., и др., 2005]. Это обуславливает необходимость лабораторного тестирования крови доноров для выявления возможных вирусоносителей гепатита С и выбраковки гемопродукции, заготовленной от этих доноров.

Существовавший до последнего времени алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита С в крови доноров включал определение антител к вирусу гепатита С путем иммуноферментного анализа и проведение подтверждающего теста — иммунологического блотинга, метода выявления антител к отдельным антигенам возбудителя. Проведенные в последнее время исследования [Дашкова Н.Г., 2006; Карслян JI.C., 2007] указывают на недостаточность использования данных методов. Они не обеспечивают максимальную безопасность реципиентов от заражения вирусным гепатитом С и не позволяют с высокой степенью надежности оценить возможность сохранения заготовленной гемопродукции от лиц, сомнительные результаты первичного обследования которых не связаны с указанным выше вирусом.

Поэтому разработка усовершенствованного алгоритма лабораторной диагностики вирусного гепатита С у доноров крови и ее компонентов является актуальной, так как адекватная схема диагностики снижает риск развития посттрансфузионного вирусного гепатита С у реципиентов, по результатам

лабораторных исследований решается вопрос о возможности использования заготовленной от донора гемопродукции, и способствует сохранению кадровых доноров.

Разработать рациональный алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита С у доноров крови и ее компонентов в соответствии с современными достижениями в области лабораторных исследований для снижения риска его трансфузионно-трансмиссивной передачи.

1. Обобщить данные о риске развития посттрансфузионного вирусного гепатита С.

2. Провести мониторинг выявления вирусного гепатита С у доноров крови и ее компонентов в зависимости от используемых методов лабораторной диагностики.

3. Усовершенствовать алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита С в крови доноров в соответствии с использованием современных доступных методов.

4. Разработать алгоритм выбраковки гемопродукции по результатам лабораторного обследования донорской крови на наличие маркеров вирусного гепатита С.

5. Оценить медико-экономическую эффективность внедрения разработанного алгоритма лабораторной диагностики вирусного гепатита С у доноров крови и ее компонентов.

Разработан алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита С у доноров крови, впервые включающий процедуру повторного серологического контроля крови доноров с неоднозначными значениями по результатам первичного лабораторного скрининга и процедуру тестирования всех серонегативных на антитела к вирусу гепатита С образцов на наличие РНК вируса гепатита С (ПСУ). Разработан алгоритм выбраковки и использования заготовленной от доноров гемопродукции по итогам лабораторного

тестирования на наличие маркеров вирусного гепатита С. Рассчитаны уровни выявляемое™ вирусного гепатита С среди доноров крови г. Москвы за 20002008 гг. Рассчитан остаточный риск трансфузионно-трансмиссивной передачи вирусного гепатита С в г. Москве.

Практическая значимость исследования

Алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита С у доноров крови, включающий повторное обследование доноров через 1-3 месяца и РНК-тестирование серонегативных на антитела к вирусу гепатита С (апй-НСУ) образцов сыворотки крови, снижает риск инфицирования реципиентов при переливании компонентов крови.

Предложенный алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита С у доноров крови позволяет сократить количество ложноположительных результатов исследования и использовать гемопродукцию, заготовленную от неинфицированных доноров.

Разработанные методические основы вычисления остаточного риска трансфузионно-трансмиссивной передачи вирусного гепатита С могут быть использованы на станциях переливания крови.

Положения, выносимые на защиту

1. Введение повторного серологического контроля через 1-3 месяца крови доноров с неопределенными или сомнительными результатами скринингового лабораторного исследования на наличие маркеров вирусного гепатита С позволяет снизить риск инфицирования реципиентов при применении компонентов крови.

2. Внедрение тестирования крови доноров на наличие РНК вируса гепатита С позволяет уменьшить остаточный риск инфицирования гепатитом С потенциальных реципиентов.

3. Алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита С в крови доноров, включающий повторное обследование доноров через 1-3 месяца и РНК-тестирование, позволяет увеличить безопасность гемотрансфузий и минимизировать получение ложноположительных результатов.

4. Разработанный алгоритм выбраковки гемопродукции по результатам лабораторного обследования донорской крови на наличие маркеров вирусного гепатита С позволяет сохранить пригодные к использованию компоненты крови.

5. Медико-экономическая эффективность внедрения разработанного алгоритма лабораторной диагностики вирусного гепатита С у доноров крови и ее компонентов заключается в снижении остаточного риска посттрансфузионного инфицирования ВГС, уменьшении заболеваемости в данном спектре патологии и сокращении затрат на лечение.

Внедрение результатов исследования

Разработанный алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита С у доноров крови лег в основу Приказа Департамента здравоохранения г. Москвы № 513 от 29 ноября 2007 г «Об усилении мер, направленных на снижение риска развития посттрансфузионных осложнений».

Методика расчета относительного риска развития трансфузионно-трансмиссивной передачи ВГС используется централизованной клинико-диагностической лабораторией станции переливания крови ДЗ. г. Москвы для оценки качества заготовленной гемопродукции.

Результаты полученные в ходе диссертационного исследования используются в процессе обучения врачей и биологов клинико-диагностических лабораторий на циклах усовершенствования и профессиональной переподготовки на кафедре клинической лабораторной диагностики ФУВ ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.

Апробация состоялась 23 марта 2009 г. на совместном заседании кафедры клинической лабораторной диагностики ФУВ, ПНИЛ нуклеинового и белкового обмена ГОУ ВПО РГМУ Росздрава и централизованной клинико-диагностической лаборатории (ЦКДЛ) станции переливания крови Департамента здравоохранения г. Москвы.

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Автор провел повторное серологическое обследование 99 доноров. При этом выполнил 256 исследований методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) и 58 методом линейного иммунологического блотинга. В период с 2005 по 2008 г выполнил 3250 исследований методом ИФА, 4826 методом хемилюминесцентного иммунохимического анализа на микрочастицах, 568 методом линейного иммунологического блотинга. Внедрил метод тестировании РНК HCV на анализаторе Cobas Amplicor, проанализировав при этом 4248 образцов сыворотки крови доноров. Провел мониторинг выявляемое™ вирусного гепатита С у доноров крови СПК ДЗ г. Москвы за 2000-2008 гг. Рассчитал остаточный риск трансфузионно-трансмиссивной передачи вирусного гепатита С в период до и после внедрения исследования крови доноров на наличие РНК HCV. Автором проведена статистическая обработка и анализ полученных результатов.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 113 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и библиографического списка, включающего 113 отечественных и 63 иностранных источника. Работа иллюстрирована И таблицами и 10 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на кафедре КЛД ФУВ ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (зав. кафедрой, д.м.н., проф. Р.Т. Тогузов). Практическая часть работы проводилась на базе централизованной клинико-диагностической лаборатории станции переливания крови ДЗ г. Москвы (главный врач — д.м.н., проф. Майорова О. А., зав. ЦКДЛ- к.м.н. Тарасенко О. А.).

В исследование включены образцы крови, полученные при аллогенных донациях цельной крови, процедурах тромбоцит- и плазмафереза, проведенных на станции переливания крови и в 15 отделениях переливания крови лечебно-профилактических учреждений ДЗ г. Москвы.

Всего исследовано 164522 образца от 84396 доноров.

Из исследования были исключены гемолизированные и хилезные образцы сыворотки крови. Всего исключено 74 образца.

Лабораторные исследования выполнены с соблюдением действующего законодательства по обеспечению контроля качества лабораторных исследований с использованием тест-систем и контрольных материалов, разрешенных к применению на территории РФ.

Выявление маркеров вирусного гепатита С проводилось с использованием следующих методов:

1. Определение антител HCV осуществлялось методом гетерогенного твердофазного иммуноферментного анализа на тест-системах «Murex anti-HCV», производства фирмы Abbot, США с использованием комплекта обрудования для полуавтоматического анализа в составе: инкубатора «Inkubator 1000» Heizmodul, Германия, автоматического промывающего устройства «PW40» BIO RAD, США, автоматического фотометра «MRX II» Dynex Technologies, США, и программы учета результатов реакции «Revelation».

2. Определение антител к HCV методом хемилюминесцентного анализа на микрочастицах проводилось на автоматическом иммунохемилюминесцентном анализаторе «Architect ¡2000SR», Abbott Diagnostics, США с использованием тест-систем Architect Anti-HCV», Abbott Diagnostics, США.

3. Определение антител к специфичекским белкам HCV выполнялось методом линейного иммунохимического анализа (иммунологического блотинга) на тест-системах «ЛИА ВГС», Ниармсдик ПЛЮС, Россия с использованием комплекта оборудования в составе: шейкера-инкубатора «ST-3», Elmi, Литва и аналитической программы интерпретации результатов «Ниармедик», Россия.

4. Определение РНК HCV проводилось методом «ПЦР-анализа в режиме реального времени» на тест-системах «COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV», ROCHE, США. Выделение РНК проводилось на автоматическом анализаторе «Cobas Ampliprep», ROCHE США. Определение РНК HCV

осуществлялось на автоматическом ПЦР-анализаторе «COBAS AMPLICOR», ROCHE, США.

Ретроспективный анализа выявляемое™ вирусного гепатита С у доноров проведен с использованием базы данных единого донорского центра СПК ДЗ г. Москвы. Проанализированы 341952 карты доноров за период с 01.01.2000 по 31.12.2008 г.

Расчет остаточного риска трансфузионно-трансмиссивной передачи вирусного гепатита С произведен с использованием математической модели «инцидентность/период окна» [Kleinman S., Busch М.Р., Korelitz J.J.,1997].

Оригинальные данные для повторного анализа могут быть получены в информационной базе единого донорского центра г. Москвы и архиве ЦКДЛ станции переливания крови ДЗ г. Москвы.

Статистическая обработка результатов при оценке полученных данных проводилась общепринятыми методами математической статистики с использованием программы Statistica 6.0 (Statsoft, США) и статистического пакета программы Excel 2003 (Microsoft, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Лабораторная диагностика ВГС у доноров крови ее компонентов регламентирована Российским законодательством и направлена на обеспечение безопасности гемотрансфузии.

В 1996 году в систему скрининга донорской крови на наличие трансфузионно-трансмиссивных инфекций было внедрено исследование на антитела к вирусу гепатита С. С этого момента произошло значительное совершенствование методов и алгоритмов лабораторной диагностики, усовершенствование методик и переход на автоматические методы анализа.

К началу данного исследования алгоритм лабораторной диагностики ВГС у доноров крови включал две постановки ИФА на наличие anti-HCV. Первая постановка проводилась для всех без исключения исследуемых образцов, вторая постановка проводилась в тот же день при получении положительных или сомнительных результатов для исключения технических ошибок анализа и

увеличения надежности полученных данных. Для подтверждения наличия инфекции, все положительные в двух постановках ИФА образцы дополнительно тестировались более чувствительным методом линейного иммунохимического блотинга для определения антител к специфическим белкам НСУ.

Основная задача при обследовании доноров на вирусные инфекции -снижение вероятности инфицирования потенциальных реципиентов. Современное законодательство регламентирует определение в крови доноров уровня АЛТ и антител к вирусу гепатита С, однако они не являются универсальными маркерами заболевания.

На каждом этапе развития инфекционного процесса присутствуют различные маркеры вирусного гепатита С, как неспецифические АЛТ, так и специфические — антитела к НСУ, вирусная РНК (рисунок 1).

Рисунок 1. Маркеры вирусного гепатита С в различные периоды инфекционного процесса.

Ни один из маркеров ВГС не бывает повышен в крови в течение всего периода заболевания. Для вируса гепатита С характерно наличие «серологического окна», то есть промежутка времени, в течение которого антитела к вирусу гепатита С не определяются. С целью обеспечения инфекционной безопасности гемотрансфузионной терапии необходимо

проводить комплексное исследование маркеров ВГС крови доноров с использованием различных методов, искать новые подходы и алгоритмы лабораторной диагностики.

Процедура повторного серологического контроля

Длительность периода (в среднем 66 дней) сероконверсии, то есть периода от момента заражения до выявления апй-НСУ при вирусном гепатите С и аналитическая ограниченность современных методов лабораторной диагностики привели к необходимости поиска и внедрения новых подходов при скрининге донорской крови на ВГС. В частности, была предложена процедура повторного серологического контроля доноров.

На повторное обследование направлялись доноры, у которых в исследуемом образце при первичном скрининговом исследовании на апи-НСУ методом ИФА значения оптической плотности образца находились в пределах «серой зоны», то есть рассматривались как сомнительные результаты, а подтверждающий тест с использованием иммунологического блотинга отрицательный или неопределенный.

Появление сомнительных результатов может быть связано с недостаточным уровнем антител у инфицированных пациентов на данном этапе заболевания, или наличием перекрестных реакций с другими антигенами при отсутствии выявляемой патологии. Повторное обследование доноров через промежуток времени от 1 до 3 месяцев значительно повышает вероятность появления определяемого уровня апй-НСУ у лиц с наличием инфекции.

В исследуемую группу было включено 99 доноров. Проведенное повторное лабораторное обследование не выявило у 70 (70,7%) доноров антител к вирусу гепатита С, и лабораторный диагноз «Вирусный гепатит С» был снят. Вместе с тем, в сыворотке крови 5-ти (5,0%) доноров из исследуемой группы были обнаружены апй-НСУ и поставлен лабораторный диагноз «Вирусный гепатит С». От донорства данные лица были отстранены и направлены на клиническое обследование в гепатологический центр инфекционной клинической больницы № 1 ДЗ г. Москвы. У 24 (24,2%) доноров при серологическом исследовании были получены сомнительные результаты,

которые расценивались как неспецифическая реакция на апИ-НСУ. Эти лица также были отстранены от донорства и направлены на клиническое обследование.

Неспецифическая реакция на апй’-НСУ 24%

Рисунок 2. Результаты повторного серологического контроля на маркеры ВГС.

Результаты лабораторного исследования определяют алгоритм

дальнейшего использования заготовленной гемопродукции. Из всех

компонентов крови наибольший срок годности имеет свежезамороженная

плазма. Она подвергается глубокой заморозке и обязательному хранению

(карантинизации) до 3-х месяцев. По результатам проведенного повторного

серологического контроля плазма 70 доноров с отрицательной серологической

реакцией на ВГС была карантинизирована и впоследствии реализована, плазма

остальных 29 доноров забракована и утилизирована.

Внедрение процедуры повторного серологического контроля позволило в 2007 году возвратить в донорский контингент 70 человек, у которых был получен отрицательный результат в ходе обследования на antí-HCV, что составило 0,19 % от общего числа (37250) доноров плазмы и крови. Плазма крови этих доноров была использована для гемотрансфузии.

Согласно алгоритму, который использовался ранее, и был регламентирован приказами Минздрава РФ, карангинизированные и не подлежащие карантинизации компоненты крови доноров с сомнительными результатами исследований на ВГС могли быть использованы для реципиентов.

источник

480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ‘, MOUSEOFF, FGCOLOR, ‘#FFFFCC’,BGCOLOR, ‘#393939’);» onMouseOut=»return nd();»> Диссертация — 480 руб., доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат — бесплатно , доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Шубина Юлия Федоровна. Алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита С у доноров крови : диссертация . кандидата медицинских наук : 14.00.46 / Шубина Юлия Федоровна; [Место защиты: ГОУВПО «Российский государственный медицинский университет»].- Москва, 2009.- 109 с.: ил.

Глава I. Обзор литературы 11

1.1. Посттрансфузионные инфекционные осложнения 11

1.2. Потенциальные риски гемотрапсфузий 39

1.3. Факторы риска развития посттрансфузионных инфекционных осложнений 41

Глава II. Материалы и методы 47

2.1. Нормативно-правовые основы обеспечения инфекционной безопасности гемотрансфузий 47

2.2. Материалы и этапы исследования 50

2.3. Методы исследования 52

2.4. Контроль качества при проведении исследования 59

2.5. Ретроспективный анализ заболеваемости ВГС доноров крови 59

2.6. Статистическая обработка результатов исследования 61

Глава III Результаты и их обсуждение 64

3.1. Основные понятия и определения 65

3.2. Процедура повторного серологического контроля 68

3.3. Тестирование нуклеиновых кислот 73

3.4. Выявляемость маркеров вирусного гепатита С 75

3.5. Оценка остаточного риска трапсфузиоино-трансмиссивной передачи вирусного гепатита С 85

3.6. Социально-экономическое обоснование внедрения алгоритма лабораторной диагностики вирусного гепатита С у доноров крови 90

Библиографический список 97

Частота носительства возбудителя гепатита С у доноров крови достигает 7% [Дашкова Н.Г., Расницын СП., и др., 2005]. Это обуславливает необходимость лабораторного тестирования крови доноров для выявления возможных вирусоносителей гепатита С и выбраковки гемопродукции, заготовленной от этих доноров.

Существовавший до последнего времени алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита С в крови доноров включал определение антител к вирусу гепатита С путем иммуноферментного анализа и проведение подтверждающего теста — иммунологического блотинга, метода выявления антител к отдельным антигенам возбудителя. Проведенные в последнее время исследования [Дашкова Н.Г., 2006; Карслян Л.С., 2007] указывают на недостаточность использования данных методов. Они не обеспечивают максимальную безопасность реципиентов от заражения вирусным гепатитом С и не позволяют с высокой степенью надежности оценить возможность сохранения заготовленной гемопродукции от лиц, сомнительные результаты первичного обследования которых не связаны с указанным выше вирусом.

Обобщить данные о риске развития постгрансфузионного вирусного гепатита С.

Провести мониторинг выявления вирусного гепатита С у доноров крови и ее компонентов в зависимости от используемых методов лабораторной диагностики.

Усовершенствовать алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита С в крови доноров в соответствии с использованием современных доступных методов.

4. Разработать алгоритм выбраковки гемопродукции по результатам
лабораторного обследования донорской крови на наличие маркеров вирусного
гепатита С.

5. Оценить медико-экономическую эффективность внедрения
разработанного алгоритма лабораторной диагностики вирусного гепатита С у
доноров крови и ее компонентов.

Разработан алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита С у доноров крови, впервые включающий процедуру повторного серологического контроля крови доноров с неоднозначными значениями по результатам первичного лабораторного скрининга и процедуру тестирования всех серонегативных на антитела к вирусу гепатита С образцов на наличие РНК вируса гепатита С (HCV). Разработан алгоритм выбраковки и использования заготовленной от доноров гемопродукции по итогам лабораторного

тестирования на наличие маркеров вирусного гепатита С. Рассчитаны уровни выявляемости вирусного гепатита С среди доноров крови г. Москвы за 2000-2008 гг. Рассчитан остаточный риск трансфузионно-трансмиссивной передачи вирусного гепатита С в г. Москве.

Практическая значимость исследования

Алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита С у доноров крови, включающий повторное обследование доноров через 1-3 месяца и РНК-тестирование серонегативных на антитела к вирусу гепатита С (anti-HCV) образцов сыворотки крови, снижает риск инфицирования реципиентов при переливании компонентов крови.

Положения, выносимые на защиту

1. Введение повторного серологического контроля через 1-3 месяца крови
доноров с неопределенными или сомнительными результатами скринингового
лабораторного исследования на наличие маркеров вирусного гепатита С
позволяет снизить риск инфицирования реципиентов при применении
компонентов крови.

Внедрение тестирования крови доноров на наличие РНК вируса гепатита С позволяет уменьшить остаточный риск инфицирования гепатитом С потенциальных реципиентов.

Алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита С в крови доноров, включающий повторное обследование доноров через 1-3 месяца и РНК-тестирование, позволяет увеличить безопасность гемотрансфузий и минимизировать получение ложноположительных результатов.

4. Разработанный алгоритм выбраковки гемопродукции по результатам
лабораторного обследования донорской крови на наличие маркеров вирусного
гепатита С позволяет сохранить пригодные к использованию компоненты
крови.

5. Медико-экономическая эффективность внедрения разработанного
алгоритма лабораторной диагностики вирусного гепатита С у доноров крови и
ее компонентов заключается в снижении остаточного риска
посттрансфузионного инфицирования ВГС, уменьшении заболеваемости в
данном спектре патологии и сокращении затрат на лечение.

Внедрение результатов исследования

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Автор провел повторное серологическое обследование 99 доноров. При этом выполнил 256 исследований методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) и 58 методом линейного иммунологического блотинга. В период с 2005 по 2008 г выполнил 3250 исследований методом ИФА, 4826 методом хемилюминесцентного иммунохимического анализа на микрочастицах, 568 методом линейного иммунологического блотинга. Внедрил метод тестировании РНК HCV на анализаторе Cobas Amplicor, проанализировав при этом 4248 образцов сыворотки крови доноров. Провел мониторинг выявляемое вирусного гепатита С у доноров крови СПК ДЗ г. Москвы за 2000-2008 гг. Рассчитал остаточный риск трансфузионно-трансмиссивной передачи вирусного гепатита С в период до и после внедрения исследования крови доноров на наличие РНК HCV. Автором проведена статистическая обработка и анализ полученных результатов.

Объем и структура диссертации

Заготовленная донорская плазма, форменные элементы и криопрсципитат поступают в лечебные учреждения для проведения гемотрансфузнй. Заключение об их вирусной безопасности делается на основе лабораторных анализов сыворотки крови доноров. Сами компоненты крови, вводимые человеку, не контролируются на отсутствие вирусных инфекций. В России принято считать, что мероприятий но врачебному контролю доноров и тестирования сыворотки доноров достаточно для предотвращения попадания в продукты донорской крови вирусных агентов. Введение требований GMP («Good manufacturing practice» — «Правила правильного производства») о входном контроле исходного сырья для производства препаратов крови и требований по контролю препарата «криопреципитат» показало, что отечественная система заготовки компонентов крови не обеспечивает их вирусную безопасность и, поэтому, требует обязательной модернизации. Опыт использования продуктов крови в клинической практике последних лет указывает на высокую вирусную опасность гемотрапсфузий, особенно для категорий больных, которым показаны длительные или частые введения компонентов крови. Оказалось, что при контроле препарата «плазма для фракционирования» (аналог свежезамороженной плазмы для переливаний) и препарата «криопреципитат», полученных по принятой в Российской Федерации технологии врачебного контроля и анализа сыворотки крови доноров в указанных продуктах крови определяются маркеры вирусных инфекций [27, 70].

При анализе ситуаций в Российской Федерации но обеспечению инфекционной безопасности продуктов донорской крови [38, 59] было установлено что наиболее вирусоопасным является препарат «криопреципитат». Его потенциальная вирусная опасность превышает опасность плазмы в 4 раза по отношению к гепатиту В и примерно в 1,5 раза по отношению к гепатиту С. Учитывая, что основное количество криопреципитата и свежезамороженной плазмы D РФ не проходит контроль готовой лекарственной формы и переливается лишь на основании результатов лабораторного обследования доноров, риск заражения вирусными инфекциями при переливании остается значительным. В 1 из 151 дозы криопреципитата возможно обнаружение маркеров гепатита В и в 1 из 184 доз маркеров гепатита С. Суммарный риск обнаружения маркеров одной из трех вирусных инфекций в случае криопреципитата примерно 2 раза выше, чем у свежезамороженной плазмы. Контроль плазмы для фракционирования в 2003 г. был проведен примерно для 60 000 доз (1,5% всей заготовленной крови). Это означает, что при объеме заготовок в Российской Федерации 4 млн доз в год в лечебную сеть и для производства препаратов крови поступает примерно 1620 доз, потенциально имеющих маркеры вируса ВИЧ-1/2, 13900 доз, имеющих маркеры вируса гепатита В и 21500 доз, имеющих маркеры вируса гепатита С. Возможно, эти данные объясняют высокий уровень зараженности вирусными инфекциями отдельных категорий больных, которым по жизненным показателям показано многократное переливание больших доз компонентов крови. Рассчитанные потенциальные риски обнаружения маркеров вирусных инфекций в продуктах крови не могут полностью соответствовать рискам заражения вирусными инфекциями при гемотраисфузиях, установленным по клиническим случаям, однако в значительной степени позволяют оценить инфекциошгую безопасность гемокомпоиетов. В то же время факт обнаружения маркеров вирусных инфекций в продуктах крови, вводимых человеку, является недопустимым, так как может привести к инфицированию пациента в результате проведения гемотрансфузин.

Гарантии безопасности, заложенные в современных технологиях бактериальной и вирусной инактивации крови и ее компонентов, глубокой переработки плазмы базируются на качественном отборе и использовании адекватных методов лабораторной идентификации образцов крови 11].

В России за последние годы произошли серьезные изменения в донорском движении. За последние 15 лет общее число доноров уменьшилось более, чем в два раза, в том числе за последние 10 лет на 40% [83, 84]. При этом отмечается троекратное увеличение числа активных доноров и 50-процентное сокращение количества доноров резерва. Из общего числа доноров (2,2 миллиона) активные доноры составляют 22,6%, доноры резерва -76,4%. Одной из важнейших причин роста риска артифициальной передачи гемоконтактных инфекций ряд российских и зарубежных авторов считает увеличение популяции платных доноров [14, 58, 132]. Резкому падению числа безвозмездных доноров в России способствует возрастающая денежная компенсация донорам за сданную кровь и ее компоненты. Учитывая, что денежная компенсация донорам составляет более 40% стоимости компонентов крови, увеличение компенсации донорам ведет к резкому удорожанию компонентов крови.

Рост числа платных доноров вызывает особую тревогу, так как именно среди этой категории нередко встречаются лица из социально неблагополучных слоев, страдающие хроническими гепатитами, ВИЧ-инфекцией и другими социальнозпачимыми заболеваниями [63]. Серьезные изменения произошли в группе доноров — родственников, в которой истинные родственники составляют 6-7%, а остальные — это посторонние лица, сдающие кровь по договоренности с близкими больного за денежное вознаграждение. Несмотря на денежные компенсации и прочие привилегии, предлагаемые донорам, ряд инфицированных лиц, будучи информированными о своей патологии, продолжают сдавать кровь. Тем самым данные лица подвергают риску потенциальных реципиентов. Законодательная база в отношении данной группы граждан недостаточно строга. Это приводит к снижению эф фективности принимаемых службой крови мер по обеспечению инфекционной безопасности гемотрансфузий, к дополнительному расходованию средстн на выявление данных субъектов и лечение зараженных реципиентов. Указанные выше лица негативно влияют на общий социальный статус донора.

Все лабораторные исследования были выполнены с соблюдением действующего законодательства по обеспечению контроля качества лабораторных исследований, в том числе:

1. Приказ Минзрава РФ от 07 февраля 2000г. № 45 «О системах мер по повышению качества клинических лабораторных исследований в учреждениях здравоохранения Российской Федерации».

2. Приказ Комитета Здравоохранения г. Москвы от 24 марта 2000 г. № 118 «О системе мер по повышению качества клинических лабораторных исследований в учреждениях здравоохранения г. Москвы».

3. Приказ Минздрава РФ от 26 мая 2003 г. № 220 «Правила проведения вігутрилабораторіюго контроля качества количественных методов клинических лабораторных исследований с использованием контрольных материалов».

Для проведения ретроспективного анализа заболеваемости доноров крови ВГС была использована база данных единого донорского центра СПК ДЗ г. Москвы.

Единый донорский центр (ЕДЦ) станции переливания крови Департамента здравоохранения г. Москвы в режиме реального времени получает информицию о донорах, их донациях и результатах лабораторных исследований крови доноров со станции переливания крови ДЗ г. Москвы, 15 отделений переливания крови лечебно-профилактических учреждений г. Москвы (ОПК) и отдела государственной регистрации заболеваний (ОГРЗ). Схема взаимодействия и обмела информацией структурных подразделений службы крови ДЗ г. Москвы представлена па рисунке 4.

Данные предоставлялись в виде общих отчетов за необходимый период наблюдения и карт доноров, содержащих информацию о дате и тиле проведенной донации, а также результаты лабораторных исследований.

Были проанализированы 341952 карты доноров за период с 01.01.2000 по 31.12.2008 г. В исследование включены только данные об аллогенных донациях цельной крови и процедурах тромбоцит- плазмафереза.

Расчет остаточного риска проводился по следующей схеме. Уровень инфицированности HCV на 1000 донаций был определен как отношение общего числа доноров с подтвержденным лабораторным диагнозом «положительная реакция на гепатит С» к общему числу донаций за анализируемый период. Уровни заболеваемости были отдельно рассчитаны для первичных и повторных доноров, которые во время первой донаций были здоровы. Уровень заболеваемости на 1000 человеко-лет был вычислен только с учетом повторных доноров, имевших 2 и более донаций за период наблюдения. Для всех доноров с отрицательной реакцией на гепатит С показатель человеко-годы рассчитывался как сумма всех временных промежутков между донациями за период наблюдения. Для доноров с подтвержденой положительной реакцией на гепатит С показатель человеко-годы рассчитывался как сумма всех междонационных периодов плюс половина серокон вереи онного периода.

Остаточный риск трансфузионно-трансмиссивной передачи вирусного гепатита С на 1 миллион донаций был рассчитан как произведение уровня заболеваемости и периода серологического окна, выраженное в годах.

Статистическая обработка результатов для оценки полученных данных проводилась общепринятыми методами с использованием программы Statistica 6.0 (Statsoft, США) [77] и статистического пакета программы Excel 2003 (MicrosoH, CUIA). Оценка достоверности результатов исследования проводилась следующими способами: 1. Определение ошибок репрезентативности средних величин и интенсивных показателей. 2. Определение доверительных границ средних величин и интенсивных показателей в генеральной совокупности. 3. Оценка достоверности разности между средними величинами и интенсивными показателями по критерию t (критерию Стьюдента) Вычисление параметров качественных признаков. Для описания распределения качественного номинального признака использовался показатель мода (Мо) — наиболее часто встречающееся на данной выборке, типичное для нее значение номинального признака. Для качественного номинального признака были вычислены абсолютные и относительные частоты. На основании анализа данных выборки были вычислены границы доверительных интервалов с учетом коэффициента доверительной вероятности 95%. При вычислении верхней и нижней границ доверительного интервала для относительной частоты бинарного признака использовалась приближенная формула: где Р- относительная частота события, выраженная в десятичном дробью, л- общее число объектов исследования в выборке, і — значение I-критерия, соответствующее объему исследуемой выборки и доверительною интервала (t=l,96 для 95% доверительный интервал), — — поправка на 2п непрерывность, компенсирующая ошибку, возникающую при аппроксимации биноминального распределения нормальным.

В России периодически отмечаются случаи инфицирования пациентов вирусным гепатитом С при проведении медицинских манипуляций, в частности, транефузионной терапии. Вероятность риска посттрансфузионного инфицирования реципиентов сохраняется. Создание нового алгоритма выявления доноров, зараженных вирусом гепатита С, который позволит снизить риск инфицирования реципиентов является важной государственной задачей, решение которой будет способствовать сохранению здоровья населения.

Основные задачи при обследовании доноров на вирусные инфекции -снижение вероятности инфицирования потенциальных реципиентов, сохранение кадровых доноров и максимальное использование крови и ее компонентов, полученных от здоровых доноров. Наличие «серологического окна», то есть промежутка времени» в течение которого антитела к вирусу гепатита С не определяются, а также получение сомнительных результатов лабораторного обследования, заставляет искать новые подходы и алгоритмы лабораторной диагностики.

Для оценки эффективности вновь предложенного алгоритма предполагается проанализировать эффективность процедуры серологического контроля доноров на выявление маркеров ВГС через 1-3 месяца, эффективность внедрения метода тестирования нуклеиновых кислот (ТНК) для раннего выявления РНК HCV в крови доноров и оценить остаточный риск посттрансфузионного инфицирования реципиентов вирусным гепатитом С до И после внедрения НОВОГО алгоритма лабораторной диагностики.

Данная процедура подразумевает повторное обследование доноров через промежуток времени» который в зависимости от ситуации составляет от 1 до 3 месяцев. Такой разброс сроков вызова донора на обследование обусловлен рядом факторов. За данный промежуток времени значительно возрастает вероятность появления антител к HCV у лиц с сомнительными результатами при первом скрининге. В то же время, большие трудности вызывает повторный вызов донора на обследование.

На повторное обследование направлялись доноры, у которых в исследуемом образце при первичном проведении ИФЛ ОП0б ОП ри1 — 0,2 ОПКр)Т, а подтверждающий тест с использованием ЛИА отрицательный или неопределенный. В исследуемую группу было включено 99 доноров. Проведенное повторное лабораторное обследование не выявило у 70 (70,7%) из обследованных доноров наличия антител к вирусу гепатита С, и лабораторный диагноз «вирусный гепатит С» был снят, указанные лица были возвращены в донорский контингент. Вместе с тем в сыворотке крови 5-ти (5,0%) допоров из исследуемой группы были обнаружены anti-HCV и поставлен лабораторный диагноз «вирусный гепатит С». От донорства данные лица были отстранены и направлены на клиническое обследование в гепатологический центр инфекционной клинической больницы № 1 Департамента здравоохранения города Москвы (ИКБ Ле 1). У 24 (24,2%) доноров при серологическом исследовании была получена неспецифическая реакция на anti-HCV, они также были отстранены от донорства и направлены в гепатологический центр инфекционной клинической больницы № 1 для клинического обследования. Эффективность внедрения повторного лабораторного обследования доноров на наличие маркеров вирусного гепатита

По информации единого донорского центра двум (8,3%) из 24 доноров с неспецифической серологической реакцией на anti-HCV в ИКБ №1 был поставлен клинический диагноз «вирусный гепатит С». Пять доноров (20,8%) проходят обследование в гепатологическом центре, их дальнейшая судьба не известна. У оставшихся 17 (70,8%) человек в донорских карточках значится лабораторный диагноз «неспецифическая реакция на ВГС».

Результаты лабораторного дальнейшего использования заготовленной Таким образом, семи донорам (7,1%) из 99 при динамическом наблюдении был поставлен диагноз «вирусный гепатит С» и заготовленная от них продукция была забракована, чем предупреждено инфицирование возможных реципиентов. Здоровые доноры в количестве 70 человек (70,7%) были восстановлены в донорстве (Рис.6). исследования определяют алгоритм гемопродукции. Из всех компонентов крови наибольшим сроком годности отличается свежезамороженная плазма.

Данные повторного серологического контроля через 3 месяца (от 7.05.2007). Первая постановка ИФА: 0 =0,45 при ОП» = 0,3. Вторая постановка ИФА: ОПобр=0,4 при ОП ркт 0,3. Результаты линейного иммунохимического анализа положительные.

При лабораторном исследовании 20.02.2007г. в первой постановке ИФА выявлено значение оптической плотности исследуемого образца в границах «20% серой зоны». Во второй постановке ИФА получен отрицательный результат на anti-HCV. Подтверждающий тест отрицательный. Полученные данные могут быть интерпретированы двояко. Во-первых, возможно получен ложноположительный результат при первой постановке ИФА, вторая постановка ИФА и конфирматорный тест подтверждают это предположение. С другой стороны, возможно, титр антител к вирусу гепатита С в крови доноров находится на границе диагностической чувствительности используемых в исследовании тест-систем. В целях обеспечения безопасности гемотрансфузии все не подлежащие карантинизации компоненты крови этого донора были утилизированы, а плазма крови карантинизироваиа до момента получения результатов серологического контроля донора через 1-3 месяца. По результатам проведенного 17.05.2007г. лабораторного обследования, донору N был поставлен лабораторный диагноз «вирусный гепатит С». Данный диагноз был позднее подтвержден клинически в гепатологическом центре ИКБ №1,о чем имеется запись в карте донора единого донорского центра.

Резюмируя приведенные сведения, следует отметить, что внедрение процедуры серологического контроля позволило в 2007 году возвратить в донорский контингент 70 человек у которых был получен отрицательный результат в ходе обследования на an(i-HCV, Что составило 0,19 % ОТ общего числа (37250) доноров плазмы и крови. Плазма крови этих доноров была карантинизироваиа и в дальнейшем реализована.

В то же время, положительная реакция на anii-1-lCV была получена в 5-ти случаях, то оставило 0,013% от общего числа (37250) доноров плазмы и крови. Эти доноры получили абсолютный отвод от донорства, а все компоненты крови были утилизированы.

Согласно процедуре лабораторной диагностики, которая использовалась до 2002 г, и была регламентирована приказами Минздрава РФ, каранти низи ро ванные компоненты крови этих доноров, а также компоненты, не подлежащие карантинизации могли быть использованы для потенциальных реципиентов.

Таким образом, введение повторного серологического контроля через 1-3 месяца крови доноров, у которых в исследуемом образце при первом проведении ИФА ОПобр находится в области сомнительных значений, при втором проведении ИФА отрицательный на anti-HCV, а подтверждающий тест отрицательный или неопределенный, позволяет на 0,013% (р 0,05, п=37250) снизить риск инфицирования реципиентов при применении компонентов крови, и на 0,19% (р 0,05, п=37250) уменьшает абсолютный отвод от донорства столь ценных в наши дни доноров.

Для оценки результативности методов детекции вирусного гепатита С было проведено ретроспективное исследование по изучению выявляемости маркеров вирусного гепатита С у доноров станции переливания крови ДЗ г. Москвы. Следует отметить, что с эпидемиологической точки зрения, для службы крови показатель выявляемости вирусных инфекций идентичен показателю инцидентности, поскольку при расчете учитываются только впервые выявленные случаи заболевания. Это возможно благодаря использованию базы данных ЕДЦ и ОГРЗ. Проанализированы 341952 карты доноров за период с 01.01.2000г. по 31.12.2008 г. В исследование включены только данные об аллогенных донациях цельной крови, процедурах плазма- и тромбоцитафереза. Изучено распределение годовых показателей инцидентности вирусного гепатита С у доноров СПК ДЗ г. Москвы. Уровни инцидентности ВГС у доноров крови в период с 2000 по 2008 гг. представлены а в таблице 5 и графически отражены на рисунке 7. Как видно из иллюстрационного материала, в период с 2000 по 2002 год отмечался рост показателя вывляемости ВГС у доноров крови, который достиг уровня 34,08 0,0194 на 1000 доноров.

Начиная с 2003 года показатель выявляемости ВГС начал снижаться и в 2008 году составил 10,37 0,0009 на 1000 доноров. Таким образом, показатель инцидентности ВГС к 2008 году снизился в 3,2 раза по сравнению с 2002 годом.

Изменение тенденции инфицированности доноров вирусным гепатитом С соответствуют, в основном, тенденциям заболеваемости (инцидентности) ВГС населения Российской Федерации в целом за период наблюдения (Рисунок 8) 161,621 Снижение показателя инцидентности связано как с общим уменьшением заболеваемости ВГС населения РФ, так и совершенствованием методов лабораторной диагностики ВГС. За период времени с 2000 по 2008 гг. для выявления у доноров ВГС менялись тест-системы для ИФЛ, а также добавлялись новые методы исследования (таблица 6). В таблице 6, кроме методов, использованных в разные годы, указан период «серологического окна». «Серологическое окно» или диагностическое окно это период между заражением и возможностью выявления вируса современными методами лабораторной диагностики. Для каждой диагностической системы данный период определяется разработчиком путем анализа сероконверсионных панелей. Данные по периоду серологического окна разработчик приводит в инструкции по применению набора.

Как видно из таблицы 6, в 2000 и 2001гг. для диагностики ВГС лаборатория СПК ДЗ г. Москвы использовала ИФА тест-системы 2-го поколения. В настоящий момент на рынке лабораторной диагностике представлены ИФА тест-системы 4-го поколения для диагностики anli-HCV.

В первом поколении тест-систем в качестве антигена использовали белки кодированные зоной NS3 и NS4 РНК HCV, данные тест-системы основывались на обнаружении антител К вирусному антигену с 100 (анти-сЮО) (Таблица 7) (139]. Однако анти-сЮО могут появляться через много лет после инфицирования ВГС, при этом наблюдается высокая частота ложноположительных результатов в популяциях низкого риска, таких как доноры [106, 134].

Во втором поколении тест-систем ИФА к белкам, использованным в диагностикумах первого поколения, дополнительно добавлены белки, кодированные С — зоной РНК HCV (с22), а также зоной NS3 (с200 и сЗЗс) [114]. Тем самым тест-системы второго поколения являются более чувствительными [152]. Антитела к данным антигенам обнаруживаются чаше, чем анти-ЫОО, и появляются в более ранние сроки. Тест-системы второго поколения могут использоваться в диагностике как острой, так и хронической ВГС-инфекции.

В соответствии с процедурой лабораторной диагностики ВГС, действовавшей в лаборатории в 2000-2001 п\ постановка лабораторного диагноза «положительная реакция на гепатит С» производилась но результатам двух постановок ИФА на наличие anti-HCV. Вторая постановка ИФА проводилась в тот же день при получении положительных или сомнительных результатов на anti-HCV с целью исключить техническую ошибку анализа и увеличения надежности результата.

Положительной реакция считалась при получении оптической плотности в исследуемой сыворотки ОП0(ф ОПкрт-0,1 ОПкр„г, с учетом 10% «серой зоны», то есть зоны сомнительных результатов, в соответствии с рекомендациями производителя реагентов. С 2002г. для диагностики ВГС стали использоваться ИФА тест-системы 3 поколения. Помимо белков, применяемых в диагностикумах второго поколения, в диагностический препарат третьего поколения введен белок, информация о котором находится в NS5 зоне РНК HCV. На вопрос о необходимости введения этого белка в диагностические препараты нет однозначного ответа. По мнению некоторых исследователей, отсутствие образцов сывороток крови с наличием изолированных антител к белкам, кодированных зоной NS5, делает ненужным его использование в диагностическом препарате. Третье поколение тест-систем ИФА широко используется для скрининга донорской крови, является более чувствительным и специфичным по сравнению с тест-системами ИФА предыдущих поколений [118, 143] и дает высокую гарантию предотвращения заражения реципиентов донорской крови. Применение диагностикумов третьего поколения позволило сократить время первого выявления anti-HCV в процессе острой инфекции [157]. Если с помощью диашостикумов первого и второго поколений первый позитивный результат регистрировали на 16 и 10 неделе заболевания, с диагностикумами последующих поколений — начиная с 2-3 недели. Их внедрение в службу переливания крови позволило резко сократить число случаев поеттранфузионного гепатита С. Частота выявления anti-HCV среди РНК HCV позитивных образцов при помощи диагностикумов первого, второго и третьего поколений соответственно составляет 70—80%; 92-95% и 97%. По расчетам американских исследователей риск инфицирования гепатитом С при переливании крови в США составляет 1:103000. Столь высокий уровень предотвращения контаминации крови вирусом гепатита С обеспечивается высокой чувствительностью применяемых для выявления ВГС диагностических тест-систем. Вместе с тем некоторое количество сывороток крови, содержащих вирус гепатита С, НС удается выявить самыми современными ИФЛ диагностикумами, применяемыми для выявления anli-HCV.

С целью улучшения скрининга на основании анализа работы лаборатории предыдущих лет серая зона при постановке ИФЛ была расширена до 20%. Положительными на наличие маркеров ВГС считались образцы, дающие положительную реакцию в двух постановках ИФЛ со значениями ОПоГ р ОПкр1-0,2ОПкрП.. Расширение размера «серой зоны» было введено для обеспечения безопасности гемокомпонентов, не подлежащих карантинизации. Расширение размера «серой зоны» привело к незначительному увеличению ложноположительных результатов, которые трактовались как «положительная реакция» для выбраковки гемолродукции, но не использовались для постановки лабораторного диагноза и отвода донора от донорства. Данные действия привели к увеличению выявляемости ВГС у доноров в 2002 году, что не коррелирует с общей тенденцией по данному показателю в стране (Рисунок 7).

Вместе с тем, именно эти действия позволили предотвратить инфицирование реципиентов гемопродуктами. Как показал проведенный ретроспективный анализ, у восьми доноров с первично сомнительными результатами, то есть попавшими в 20% «серую зону» при проведении иммуноферментного анализа на наличие anli-MCV, впоследствии были выявлены маркеры вирусного гепатита С. В серую зону, в основном попадают пациенты имеющие низкий уровень антител в соответствии с серологическим окном и пациенты у которых возникает перекрестная реакция с другими антигенами.

источник

М.И.Михайлов, Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН, Москва

При постановке диагноза «гепатит С» необходимо учитывать следующие наиболее важные факторы:

показатели активности «печеночных» ферментов;

наличие или отсутствие маркеров инфицирования вирусом гепатита С (ВГС) и другими гепатотропными вирусами;

данные эпидемиологического анамнеза;

результаты клинического осмотра пациента. Только комплексный учет данных факторов позволяет с высокой степенью надежности диагностировать это заболевание. Лабораторный работник должен предоставить объективную информацию о выявленном спектре вирусных антигенов и антител, а также РНК ВГС, позволяющую клиницисту, сотруднику службы переливания крови и врачу-эпидемиологу решать стоящие перед ними задачи. Чаще всего это:

выявление лиц с наличием ВГС для снижения уровня посттрансфузионного гепатита С;

постановка диагноза и разграничение острого и хронического гепатита С;

прогноз заболевания;

назначение, оценка и прогноз эффективности проводимой терапии;

изучение широты распространения ВГС в популяции и различных группах населения.
При этом основными направлениями работ, выполняемых лабораторными сотрудниками, являются:

разработка и выбор наиболее информативных методов выявления маркеров инфицирования ВГС;

определение критериев объективной оценки полученных результатов;

разработка оптимальных алгоритмов проведения лабораторных исследований;

внедрение системы повышения качества выявления маркеров инфицирования ВГС.

Основой лабораторной диагностики гепатита С служат знания о ВГС, его репликации, информация о динамике появления и исчезновения маркеров инфицирования, а также современные иммунохимические и молекулярно-биологические методы детекции антигенов, антител и нуклеиновых кислот.

ВИРУС ГЕПАТИТА С. ВГС впервые был идентифицирован в 1988 году, когда группа исследователей во главе с М. Houghton и Choo Q.L, применив новые молекулярнобиологические методы исследования, клонировала и секвинировала геном вируса [I]. Частица вируса гепатита С имеет сферическую форму со средним диаметром около 50 нм [2,3]. Попытки визуального обнаружения и изучения строения вируса гепатита С предпринимались с момента открытия вируса, однако до сих пор отсутствуют хорошо документированные результаты этих исследований, что, возможно, связано с трудностями накопления вирусных частиц в необходимых количествах.

ВГСединственный член рода Hepacivirus в семействе Flaviviridae, в которое входят такие вирусы, как вирус диареи быков и лихорадки свиней (род Pestivirus) и вирус желтой лихорадки, вирус дэнге и GB-вирусы: GBV-A, GBV-B и GBV-C/HGV (род Flavivi-rus). Схема строения вируса гепатита С может быть представлена следующим образом (схема № 1). Нуклеокапсид содержит РНК вируса гепатита С. Сверху нуклеокапсид покрыт липидной оболочкой с утопленными в ней оболочечными белками, кодированными РНК ВГС. Геном вируса представлен однонитевой линейной молекулой РНК положительной полярности, протяженностью около 9600 нуклеотидов. Организация генома ВГС подобна другим флавивирусам. В нем выделяют две зоны, кодирующие структурные и неструктурные (функциональные) белки. Гены, кодирующие структурные белки, расположены у 5′ области генома вируса, а неструктурные у 3′ области. Ген ВГС имеет одну открытую рамку считывания (ОРС), единый полипептид (приблизительно в 3000 аминокислот), который под действием вирусных и клеточных протеаз нарезается на структурные и неструктурные белки.

Рис. 1. Структурные элементы HCV

К структурным белкам относят белки, кодированные Core, El и Е2 зонами РНК ВГС. Выявлено три формы С-белка ВГС: полноразмерная (р21) с молекулярной массой — 21 kD, усеченная (р19) и форма (р16), обнаруженная в ядрышках инфицированных гепатоцитов. На своей поверхности С-белок несет различные высококонсервативные В-клеточные эпитопы, существование которых чрезвычайно важно для выявления антител к ВГС в процессе лабораторной диагностики гепатита С.

Зоны РНК ВГС — Е1 и Е2 кодируют белки с молекулярной массой 31 и 70 kD . Эти белки имеют несколько участков N-гликозилирования; в Е1 белке определено до 6 таких участков, а в Е2 — 11. В участке Е2 заключена информация о небольшом белке — р7, который в структуре вируса не обнаружен.

Обозначение регионов, расположенных ближе к 3′- концу РНК ВГС — как зон, несущих информацию о неструктурных белках вируса, указывает на то, что эти белки не являются структурными компонентами вирусной частицы. В неструктурной зоне РНК ВГС выделяют участки, обозначенные как: NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B. Большинство из белков, кодированных неструктурными зонами РНК ВГС, необходимы для репликации вируса.

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей РНК изолятов ВГС, полученных в различных регионах мира и даже в процессе заболевания от одного и того же пациента, выявил основную особенность этого вируса — высокую гетерогенность РНК. Положение о значительной генетической вариабельности РНК ВГС легло в основу теорий, объясняющих: длительное (иногда пожизненное) носительство вируса, частое развитие хронического заболевания, трудности в терапии и создании эффективных вакцинных препаратов. Наиболее значительные отличия последовательностей РНК ВГС сосредоточены в N-концевой части региона Е2, которую обозначают — «гипервариабельный регион» (HVR) [4].

В настоящее время определено 6 основных генотипов и свыше 100 субтипов ВГС. Генотипы 1а, 1в, 2а, 2в, 2с и За составляют более 90% HCV-изолятов, полученных в Северной и Южной Америке, Европе, России, Китае, Японии и Австралии/Новой Зеландии [5]. Генотипы 4, 5а и 6 соответственно регистрируются в Центральной и Южной Африке, Юго-Восточной Азии. В России и странах СНГ зарегистрировано преобладание генотипа 16 (не менее 68,9%) [6,7]. Считается, что пациенты, инфицированные генотипом 1 (особенно 1в), отвечают хуже на лечение по сравнению с пациентами, инфицированными другими генотипами вируса.

У больного ВГС циркулирует как популяция частиц вируса, у которых геномы отличаются друг от друга на 1-2% (квазиспецифичности) в результате мутаций, накапливающихся во время инфекции и/или попавших в организм пациента при заражении. Эти мутантные формы могут способствовать более активной репликации или могут помогать вирусу уклоняться от иммунного ответа организма и потенциально влиять на исход острой инфекции, различия в течении заболевания и ответе на интерферонотерапию [8].

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИ-ВГС. После открытия вируса ВГС и определения его роли в развитии посттрансфузионного гепатита — «ни А, ни В» перед исследователями стояла задача разработать методы, способные выявлять лиц с ВГС и пригодные для диагностики острого и хронического гепатита С. Было установлено, что антигены ВГС циркулируют в чрезвычайно низких концентрациях, и очевидно, что методический уровень конца 80-х годов XX века, применяемый для детекции вирусных антигенов, был явно недостаточен.

В 1989 году группа исследователей фирмы «Chiron Corporation» под руководством Q-L.Choo осуществила клонирование РНК ВГС и получила иммунореактивные олигопептиды, вступающие в реакцию с антителами, циркулирующими в крови больных хроническим гепатитом «ни А, ни В». Эти олигопептиды стали основой диагностических препаратов для выявления антител к ВГС. Это определило быстрый прогресс в разработке и промышленном выпуске диагностических препаратов. Основным методом, применяемым для детекции анти-ВГС, стал твердофазный иммуноферментный анализ, как метод, отвечающий требованиям практического здравоохранения -т.е. обладающий высокой чувствительностью, специфичностью и простотой проведения.

Учитывая, что ВГС персистирует в крови больных острым и хроническим гепатитом С одновременно с анти-ВГС, внимание разработчиков диагностических препаратов концентрировалось на создании тест-систем для детекции антител, обеспечивающих максимально полное выявление носителей вируса и максимально ранние сроки диагностики острой инфекции. Многообразие антигенов и антигенных детерминант, кодированных структурной и неструктурной зоной РНК ВГС, определило направление в конструировании диагностических препаратов выбором и аранжировкой олигопептидов, применяемых для их создания. За время, прошедшее с момента открытия ВГС, созданы диагностические системы трех поколений ( таблица 1).

Таблица 1
Диагностические препараты для выявления анти-ВГС [9]

Применяемые пептиды,
зоны РНК ВГС, в которых
они кодированы

Время первого
выявления
анти-ВГС от
начала желтухи

С22-3 Core
С200 NS3 и NS4
СЗЗс NS3
С 100-3 NS4

С22-3 Core
С200 NS3 и NS4
СЗЗс NS3
Пептид NS5

Введение дополнительных пептидов, прежде всего с22-3 (Core), в диагностические препараты 2-го и 3-го поколения позволило решить главную задачу, то есть увеличить чувствительность, специфичность и, самое главное, выявляемость анти-ВГС . Благодаря диагностикумам 3-го поколения удается выявлять до 97% носителей ВГС. Вместе с тем, определенную дискуссию вызвало решение о введении в диагностикум пептида, кодированного NS5 регионом РНК ВГС. По мнению некоторых исследователей, присутствие этого пептида не имеет принципиального значения для улучшения качества диагностического препарата. [10,11]. Однако антитела к NS5 могут быть выявлены в более ранние сроки инфекции, что улучшает качество лабораторной диагностики острого гепатита С. [12].

В настоящее время во всем мире, в том числе и в России, применяются диагностические препараты 3-го поколения. Пептиды, применяемые в диагностических препаратах, получены при помощи рекомбинантной технологии (например, диагностикумы фирм: «Диагностические препараты», г. Нижний Новгород; «Вектор» г. Новосибирск; «Roche»; «Abbott» и др.), или синтетической (000 МЦ «Авиценна» г. Санкт-Петербург; «Organon» и др.). Диагностикумы, в которых одновременно использованы оба вида пептидов, получили обозначения, как препараты 4-го поколения. По своим характеристикам эти препараты не обладают значимыми различиями. Сравнительные испытания, регулярно проводимые МЗ России, продемонстрировали сопоставимую чувствительность диагностических препаратов отечественных и зарубежных производителей.

Установлено, что применение диагностикумов 3-го поколения для выявления анти-ВГС среди иммунокомпетентного населения (например, доноров крови) оценивается в 98,8-100%. В то же время среди иммунокомпрометированных лиц, например, таких как пациенты после трансплантации почки, костного мозга или лица, инфицированные ВИЧ, этот показатель значительно ниже — 50 — 95% [12]. S.George с соавт. [13] продемонстрировали, что у 8,4% больных ВИЧ-инфекцией регистрируются ложно-негативные результаты выявления анти-ВГС. Причем у таких пациентов в процессе наблюдения может регистрироваться серореверсионный эффект, т.е. регистрация позитивного результата после серонегативного анти-ВГС периода [14].

Одна из наиболее важных проблем при проведении исследований на наличие анти-ВГС — ложнопозитивные результаты. Их появление может быть связано с неспецифическим взаимодействием компонентов реакции, возможными перекрестными реакциями с другими вирусными антигенами и многими другими факторами. Уровень ложно-позитивных результатов при выявлении анти-ВГС с различными диагностическими препаратами может достигать 10-20% [15,16]. Повышенный уровень таких результатов отмечен среди больных онкологическими и аутоиммунными заболеваниями, лиц с иммунодефицитными состояниями и больных сифилисом [16,17]. Существование ложнопозитивных результатов ставит перед лабораторным работником задачу их разграничения с истинным выявлением анти-ВГС. Для решения этой задачи служит обнаружение в образце сыворотки крови РНК ВГС. Однако отрицательный результат обнаружения РНК ВГС не позволяет говорить о наличии ложнопозитивного выявления анти-ВГС. Необходимо учитывать, что анти-ВГС могут изолированно циркулировать в крови пациента, который выздоровел после острого гепатита С (10-15%) или у которого произошла элиминация РНК ВГС в результате проводимой терапии.

КОНФИРМАЦИОННЫЕ (SUPPLEMENTAL) ТЕСТЫ. Для разграничения ложнопозитивных образцов и образцов, действительно содержащих антитела к ВГС, разработаны дополнительные (Supplemental) тесты. Наиболее часто в этих тестах используется принцип иммуноблота [например — тест RIBA («Ortho-Clinical Diagnostics»); «LiaTek HCV» (Organon Teknika)], когда на нитроцеллюлозной мембране адсорбируются в виде отдельных полос антигены, кодированные различными зонами РНК ВГС. Анти-ВГС взаимодействуют с адсорбированными антигенами с помощью меченных ферментом антител против Ig G человека с последующей их детекцией при помощи субстратного комплекса. Помимо иммуноблота в качестве дополнительных тестов также используют диагностические препараты для выявления анти-ВГС против конкретных антигенов, кодированных различными зонами РНК ВГС [«Спектр 4» («Имбио», г. Нижний Новгород; РекомбиБест АНТИ-ВГС-СПЕКТР» — ЗАО «Вектор Бест», г. Новосибирск; ИФА- Анти-НСУ-Спектр, НПО «Диагностические системы», г. Нижний Новгород].

Разработка и внедрение этих тестов идет параллельно с внедрением скрининговых тестов для выявления анти-ВГС, повторяя принцип расширяющегося спектра использованных пептидов в каждом последующем поколении диагностических препаратов. Так, диагностикум RIBA-III отличается от предыдущего поколения добавлением пептида, кодированного зоной NS5. Принципы, позволяющие подтвердить позитивный результат выявления анти-ВГС, прежде всего включают: возможность (в некоторых случаях) получения более четких результатов ферментативной реакции при взаимодействии с отдельными пептидами, а также применение в диагностикуме расширенного спектра пептидов, которые не используются в скрининговых тестах. Только введение новых пептидов позволяет повысить диагностическую ценность подтверждающих тестов.

Трактовка полученных результатов, например в таком тесте, как RIBA-III, включает три возможных ответа : позитивный, негативный и неопределенный результат. Последний из них выдается в случае отсутствия четких показаний (согласно инструкции, прилагаемой к диагностическому набору), позволяющих определенно судить о наличии или отсутствии анти-ВГС в исследуемом образце. Соотношение спектра регистрируемых ответов при проведении подтверждающих тестов колеблется в зависимости от характеристик групп пациентов, у которых первично выявлены анти-ВГС [18]. По данным J.M. Pawlotsky с соавт. [19], в половине случаев результатов, трактуемых как «неопределенные», удается обнаружить РНК ВГС. На наш взгляд, правомочность ответа — «неопределенный результат выявления анти-ВГС», выдаваемого лабораторным работником клиницисту, очевидна не только при проведении подтверждающего теста, но и рутинном исследовании на наличие анти-ВГС. Необходимость такой трактовки полученных результатов является отражением современного состояния лабораторной диагностики гепатита С.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ IgM АНТИ- ВГС. В настоящее время созданы и промышленно выпускаются диагностические наборы для выявления IgM анти-ВГС фирмами: «Вектор Бест»; «Диагностические системы»; «Имбио», «Abbott» и др. На этапе конструирования диагностических наборов были созданы наборы для ИФА, основой которых являлись пептиды, кодированные различными регионами РНК ВГС [20] . Выбор был остановлен на пептиде, кодированном Core регионом РНК ВГС и выявлении антител к нему класса IgM. Так же как и при использовании тестов для выявления анти-ВГС (IgG), при исследовании IgM анти-ВГС могут быть зарегистрированы ложнопозитивные результаты. По данным Stevensona D.L. с соавт. [21], до 70% больных с хроническим гепатитам С с наличием IgM анти-ВГС одновременно имели повышенный уровень ревматоидного фактора, который способствует появлению ложнопозитивных результатов. Вместе с тем, по мнению Pawlotsky J.M., наличие ревматоидного фактора не влияет на качество выявления IgM анти-ВГС [22].

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИГЕНОВ ВГС. Возможность определения антигенов ВГС привлекала внимание исследователей сразу же после открытия вируса. Принципиальная возможность их тестирования была продемонстрирована К. Krawczynski с соавторами [23], которые иммуногистохимически обнаружили в печеночной ткани антигены ВГС, доказав специфичность иммунофлюоресцентного свечения. Применение поли- и моноклональных антител к различным антигенам ВГС установило наличие ВГС core Ag, антигенов, кодированных NS3 и NS4 зонами РНК ВГС, в ядре и цитоплазме гепатоцитов, у 60-90% больных хроническим ГС [24].Однако дальнейшие исследования продемонстрировали, что антигены ВГС удается обнаружить менее чем в 5% печеночных клеток.

Первые диагностические тест-системы («Ortho Antibody to Core Antigen (Murine Monoclonal) EL1SA Test System» и «Imucheck F-HCV Ag Core Kokusai») для выявления антигена ВГС появились на рынке иммунобиологических препаратов в 1999 году. В качестве цели детекции был избран Core антиген ВГС, который определяют при помощи твердофазного варианта ИФА, сконструированного на основе моноклональных антител. Первые исследования по применению этих тестов определили их высокую чувствительность, специфичность, и перспективность применения, прежде всего, в службе переливания крови [25,26]. Установлены:

возможность определения Core Ag ВГС в сыворотке или плазме крови;

специфичность выявления Core Ag ВГС;

наличие лиц с циркулирующим антигеном в крови серонегативных по анти-ВГС;

частое (90,3%) обнаружение Core Ag ВГС в сыворотках крови с наличием анти-ВГС и РНК ВГС [25];

прямая корреляция между концентрацией РНК ВГС и выявлением Core Ag ВГС [25];

сокращения фазы «окна» — от момента инфицирования до первого позитивного результата выявления анти-ВГС . Определено, что Core Ag ВГС удается выявлять в 83% случаев (n=24) на следующий день после первого обнаружения РНК ВГС [26] и задолго (в среднем 26 дней) до появления анти-ВГС [27].

МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ РНК ВГС. Современный этап лабораторной диагностики гепатита С можно охарактеризовать как этап начала широкого применения молекулярно — биологических методов выявления РНК ВГС. Подавляющее большинство методов выявления нуклеиновых кислот было апробировано для выявления РНК ВГС. Принципам конструирования диагностических препаратов и их применению для детекции вирусных ДНК или РНК посвящено значительное количество литературных обзоров, опубликованных как в отечественных [28], так и зарубежных изданиях [29]. Все эти методы можно разделить на две группы, в основе которых лежит применение принципов гибридизации без амплификации избранного участка нуклеиновой кислоты или с их амплификацией, что позволяет значительно повысить разрешающую способность метода.

Метод гибридизации основан на соединении меченных гибридизационных зондов (генноинженерные или синтетические молекулярные структуры, содержащие в себе нуклеотидные последовательности, комплементарные избранным участкам РНК). Учет результатов осуществляют по интенсивности сигнала, поступающего от метки в составе образовавшегося комплекса.

При гепатите С этот метод выявления РНК ВГС прежде всего нашел применение для ее идентификации непосредственно в гепатоцитах, в тестах обозначаемых — in situ hibidization [30]. Возможность непосредственной детекции РНК ВГС в ткани позволила обнаружить ее в мононуклеарных клетках крови, клетках слюнных желез и других тканях организма больного гепатитом С [31,32].

Метод гибридизации, применяемый для детекции РНК ВГС, позволяет продемонстрировать наличие негативных (репликативных) цепей РНК ВГС, что свидетельствует об активной репликации вируса [33].

Метод полимеразнной цепной реакции — в настоящее время наиболее широко применяемый методический прием, лежащий в основе практически всех молекулярно-биологических методов детекции РНК ВГС. Причем определение РНК ВГС возможно как в качественном, так и количественном варианте, что особенно важно для назначения, мониторинга и оценки эффективности применяемой терапии.

В качестве основных вариантов метода можно выделить:

полимеразную цепную реакцию (ПЦР);

лигазную цепную реакцию;

NASBA;

ТМА (Реакция транскрипционно опосредованной амплификации, Transcrip-tion-mediated amplification).

Полимеразная цепная реакция — широко применяемый как в России, так и за рубежом метод детекции РНК ВГС. В его основе лежит многоцикловой процесс, напоминающий естественную репликацию нуклеиновой кислоты, причем каждый цикл состоит из последовательных этапов.

Из исследуемого материала (сыворотка или плазма крови, печеночный биоптат) выделяется РНК ВГС. Учитывая, что нуклеиновая кислота ВГС представлена РНК, а для амплификации необходима молекула кДНК, при помощи фермента — обратной транскриптазы, происходит образование однонитевых молекул кДНК ВГС. На следующем этапе к определенному участку каждой из цепей кДНК ВГС присоединяются т.н. праймеры — короткие олигонуклеотиды, комплементарные известным нуклеотидным последовательностям. Сравнение первичной структуры 5’UTR области генома различных изолятов ВГС выявило их незначительную изменчивость (между генотипами, гомология нуклеотидов — 92-98%, а внутри генотипа 98-99%). Это сделало предпочтительным выбор праймеров из этой зоны РНК ВГС и их применение в диагностических тест-системах, выпускаемых у нас в стране и за рубежом.

Далее, при помощи фермента ДНК- зависимой ДНК полимеразы происходит синтез новых участков ДНК. В настоящее время в качестве источника этого фермента чаще всего используют бактерии Thermophilus termus (Tth-полимераза) или Thermophilus aquaticus (Taq-полимераза). Обладая термостабильностью в присутствии ионов марганца и магния, этот фермент может быть одновременно использован для синтеза комплементарных одноцепочечных молекул кДНК ВГС и амплификации избранных участков кДНК. На завершающем этапе одного цикла реакции, при помощи ДНК полимеразы происходит синтез новых цепей комплементарных кДНК ВГС. Многократное повторение циклов реакции приводит к накоплению фрагментов кДНК ВГС, которые возможно зарегистрировать при помощи электрофореза в полиакриламидном геле с последующей визуальной детекцией или же с применением гибридизации с олигонуклеотидными зондами, что увеличивает чувствительность и специфичность применяемых диагностических препаратов. Применение праймеров, меченных ферментами, позволяет проводить учет результатов ПЦР при помощи иммуноферментного анализа.

Постоянная цель, стоящая перед исследователями, конструирующими диагностические системы для выявления РНК ВГС, — повышение чувствительности и специфичности. Этой цели служит вариант ПЦР, обозначенный — «гнездовой ПЦР» (nested PCR) [34]. Отличительной особенностью этого метода от «классического» является одновременное использование двух пар праймеров, одна из которых комплементарно связывается с внутренним участком ампликона, полученного после первого раунда амплификации. Вместе с тем считается, что при этом варианте ПЦР более высок риск контаминации образцов, что может привести к ложноположительным результатам [35] .

Острая потребность в определении РНК ВГС и сложности, связанные с крупномасштабным производством высокочувствительных и специфичных диагностических наборов для ПЦР диагностики, определили широкое применение препаратов, изготовленных в научных лабораториях. Сравнение этих тест-систем, так называемых — «домашних» тестов («in house tests»), продемонстрировало их высокую вариабельность по чувствительности и специфичности, а также отсутствие воспроизводимости результатов между лабораториями и сериями диагностических препаратов. Так, при проведении первого Европейского цикла «внешнего» контроля качества оценки выявления РНК ВГС (1996 г.) из 136 лабораторий только 22 (16%) смогли абсолютно правильно определить наличие или отсутствие вирусной РНК в предоставленных контрольных образцах [36]. Подобный результат отмечен и в нашей стране, во время проведения аналогичной работы в рамках Федеральной системы внешнего контроля качества (2001 г.), когда из 14 участвующих лабораторий лишь 3 (21,4%) смогли правильно решить поставленную задачу [37].

Причины появления ложнонегативных и ложнопозитивных результатов выявления РНК ВГС разнообразны. При ложноотрицательных результатах:
— потеря или разрушение РНК ВГС в ходе подготовки к реакции клинического материала;
— наличие в образце ингибиторов, влияющих на различные компоненты ПЦР. Эти ингибиторы представлены различными химическими или белковыми субстанциями. Например: наличие в спермальной жидкости ингибиторов обратной транскриптазы не позволяло обнаружить РНК ВГС и говорить о возможности реализации полового пути передачи гепатита С [38]; наличие гепаприна [39]; высокий уровень криоглобулинов в сыворотке крови [40];
— несоблюдение теплового режима хранения и транспортировки клинического материала. При ложнопозитивных результатах:
— контаминация между пробами (при обработке образцов и/или работе с реакционной смесью), в том числе и контаминацией позитивным контрольным образцом;
— контаминация продуктами предшествующий амплификации (ампликонами), которые могут загрязнять исследуемые образцы и растворы через аэрозоли или лабораторное оборудование.

Массовое внедрение ПЦР диагностики по определению РНК ВГС поставило перед органами практического здравоохранения задачи перехода на новый уровень проведения лабораторных исследований. Выделение изолированных зон для осуществления основных этапов ПЦР (для подготовки проб; проведения амплификации; для учета полученных результатов); отдельный комплект для каждого этапа реакции лабораторной одежды, автоматических пипеток; существование стандартных диагностических наборов и самое главное — наличие высококвалифицированных лабораторных сотрудников позволяет снизить уровень появления ложных результатов.

Первый стандартизированный набор для определения РНК ВГС («AmplicorTM HCV», «Roche Diagnostic Systems») изготовлен в 1993 году. За прошедшие годы наборы для выявления РНК ВГС прошли эволюцию, основной целью которой стало повышение их чувствительности и специфичности. При конструировании «Amplicor TM HCV» использовано несколько оригинальных методических приемов, позволяющих выявлять 100 и выше копий РНК ВГС в мл., а также бороться с возможными случаями контаминации образцов и растворов, применяемых в наборе. Использование фермента — амперазы и дезиксиуридинтрифосфата (dUTP) позволяет разрушать в первом цикле амплификации предшествующие апликоны, которыми могла произойти контаминация. Разрушение амперазы в конце первого цикла амплификации (при +55 С) не позволяет ферменту разрушать ампликоны, избранные в качестве мишени. Принципиальным новшеством стало введение внутреннего контроля. Смысл этого новшества заключается во введении в каждый исследуемый образец последовательности, подобной амплифицируемому участку РНК ВГС, которая в дальнейшем выявляется с помощью соответствующих праймеров в реакции амплификации в аналогичном режиме. Отсутствие позитивной реакции при выявлении внутреннего контроля свидетельствует о наличии ложнонегативного результата реакции на наличие РНК ВГС в исследуемом образце. Диагностикумом следующего поколения стал препарат, обозначенный — «HCV Amplicor 2,0», при использовании обладающий пределом чувствительностью 50 молекул РНК ВГС.

Систему выявления РНК ВГС при помощи наборов фирмы «Roche» нельзя рассматривать в отрыве от их приборного обеспечения, определяющего высокое качество тестирования. Разработчики метода стремились к полной автоматизации всех этапов реакции. Воплощением этой идеи стала система «COBASAmpliPrepTM», позволяющая полностью автоматизировать процесс выделения РНК ВГС, амплификации и детекции, тем самым уменьшить риск получения ложнопозитивных и ложнонегативных результатов, сохранив при этом высокую чувствительность и специфичность [41].

Лигазная цепная реакция выявления РНК BГC.(LCR). Метод основан на способности фермента «ДНК- зависимой ДНК-лигазы» сшивать (лигировать) разрывы фосфодиэфирной связи в ДНК в присутствии АТФ и ионов Mg 2+. Так же как и при проведении «классической» ПЦР для выявления РНК ВГС, первый этап LCR — обратная транскрипция с получением кДНК ВГС. Далее ДНК-лигаза осуществляет связывание двух пар праймеров (комплементарных 5′ некодированной зоне РНК ВГС), которые в дальнейшем амплифицируются. Детекция продуктов амплификации LCR осуществляется при помощи учета реакции антиген-антитело. Каждый из двух прайеров метится различным гаптеном. Первый из них захватывается антителами, адсорбированными на микрочастицах. После процедуры промывания при помощи второй пары антител, меченных флуоресцентной меткой, происходит их избирательное взаимодействие с гаптеном в амплификационном продукте с последующим проведением субстратной реакции и учетом на флюориметре.

Чувствительность этого метода составляет около 200 копий РНК ВГС в мл, что позволяет его использовать для решения различных клинико-диагностических задач [42]. В настоящее время диагностические наборы выявления РНК ВГС, основанные на LCR, изготовлены фирмой «Abbott».

Nucleic Acids Seaquencence Amplification — NASBA —метод детекции РНК ВГС основан на одновременном действии трех ферментов: обратной транскриптазы вируса миелобластомы птиц, РНК-азы Н и РНК-полимеразы Т7 [43.]. В отличие от RT PCR на первом этапе не проводится обратная транскрипция РНК ВГС. При помощи использованных ферментов удается получить более 10(9) копий участка кДНК ВГС в течение 90 минут [44]. Возможность проведения реакции при небольших температурах (+41 С) значительно упрощает работу и позволяет отказаться от оборудования, обеспечивающего циклические изменения высоких температур. Учет результатов реакции осуществляется при помощи электрохемилюминесценции. Несмотря на то, что по своей чувствительности NASBA близка к RT PCR, метод широко не используется для выявления РНК ВГС. В настоящее время проводится разработка варианта метода, сочетающего принципы проведения NASBA и «Real-time RT PCR».

Метод транскрипционно опосредованной амплификации (Transcription-mediated amplification — ТМА) отличается от ПЦР и LCR прежде всего тем, что непосредственно амплифицируются фрагменты РНК ВГС , а не кДНК ВГС. На начальном этапе реакции к РНК ВГС присоединяется праймер (№1) и с помощью фермента (обратной транскриптазы) синтезируется копия молекулы мишени — кДНК. Обратная транскриптаза, обладая также активностью РНКазы-Н, разрушает вирусную РНК в гибриде РНК-кДНК. Далее к молекуле кДНК присоединяется второй праймер с последующей достройкой двухцепочечной ДНК при помощи обратной транскриптазы. При помощи другого фермента -РНК-полимеразы происходит транскрипция РНК с кДНК, что приводит к образованию от 100 до 1000 копий ампликона РНК ВГС в одном цикле реакции. К этим РНК-апликонам присоединяется праймер № 2 с дальнейшим синтезом кДНК-копий и разрушением молекулы РНК. Присоединение праймера №1 на кДНК с последующей достройкой двухцепочечной ДНК запускает следующий цикл амплификации. Учет результатов реакции осуществляют на люменометре, так как образовавшиеся РНК-ампликоны специфически взаимодействуют с ДНК-зондами, меченными хемилюминафорами.

В качестве преимуществ ТМА-метода при выявление РНК ВГС отмечают:

проведение реакции при более низких температурах по сравнению с ПЦР;

образование большего числа ампликонов в одном цикле реакции, что уменьшает время, необходимое для получения конечного результата (30-40 минут), и повышает чувствительность реакции (50 копий /мл.) [45].

снижение риска контаминации, так как РНК менее устойчива, чем ДНК.

Сравнительные исследования по детекции РНК ВГС при помощи ТМА и другими методами продемонстрировали высокий уровень совпадений результатов [45].

Сочетание принципов гибридизации и амплификации лежит в основе метода выявления РНК ВГС, обозначенного как «Метод гибридизации с использованием разветвленных зондов или Branched DNA assay (bDNA) [46]. В отличие от ПЦР в данном тесте осуществляется амплификация не молекул кДНК ВГС, а сигнала. Реакция проводится в 96 луночных планшетах, на которых адсорбированы фрагменты РНК ВГС из 5′ нетранслируемой зоны и core-гена РНК ВГС. За счет последующего связывания с синтетической молекулой разветвленной ДНК и гибридизацией с пробой, меченной щелочной фосфотазой с усилителем и последующей ферментативной реакцией достигается резкое увеличение полученного сигнала. В настоящее время на диагностическом рынке появились диагностикумы третьего поколения (Вауег 3.0 Hepati-tis С Virus RNA Quantitation by bRNА), обладающие чувствительностью, позволяющей выявлять 520 IU/ml (2500 копий РНК ВГС).

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ РНК ВГС. Для оценки концентрации РНК ВГС применяют количественный вариант ПЦР. Первоначально концентрацию РНК ВГС пытались охарактеризовать порядковыми величинами, например»+»,»++» и т.д., визуально отражающими интенсивность полос, полученных при электрофорезе продуктов амплификации, или же методом конечных разведений, т.е по наличию позитивного результата в конечной точке титрования. Трудности стандартизации всех этапов ПЦР не позволяют объективно оценить концентрацию РНК ВГС, что приводит к существенным ошибкам трактовки полученных результатов.

В настоящее время результаты исследования выражают в количественных единицах: количество копий РНК ВГС, содержащихся в 1 мл., в абсолютном или логарифметическом выражении (log 10). Исходя из того, что концентрация обнаруженной РНК ВГС отражает количество вирусных частиц, данный показатель обозначают как «вирусный эквивалент (eq)», с добавлением приставки k (килограмм, тысяча) или М (миллион). Еще одним способом выражения количества вирусных частиц являются их весовые эквиваленты. Например, в граммах или пикограммах (1 pg соответствует приблизительно 1 миллиону eq). Разнообразие применяемых величин создает трудности трактовки результатов, полученных в различных лабораториях. Поэтому комитет экспертов ВОЗ по биологической стандартизации изготовил «международный стандартный образец», содержащий РНК ВГС (лиофильновысушенная сыворотка крови, содержащая РНК ВГС 1-го генотипа), концентрация которой выражена в международных единицах (IU/mL) [47]. Специальные коэффициенты позволяют пересчитывать полученные показатели концентрации в международные единицы.

Для определения концентрации РНК ВГС применяют практически все варианты ПЦР. При этом к диагностическим препаратам предъявляется ряд специфических требований, важнейшим из которых является строгая линейность результатов, т.е. увеличение сигнала регистрируемой реакции при увеличении концентрации РНК ВГС в исследуемом образце. Применение внутренних стандартов с различным содержанием РНК ВГС позволяет избежать многих методических ошибок, которые могут отразиться на конечном результате реакции [28]. Чувствительность применяемых диагностикумов (Amplicor HCV Monitor v2.0; LCx HCV RNA Quantitative Assay) позволяет выявлять РНК ВГС, начиная с 50 копий в мл [48,49], что особенно важно для прогнозирования эффективности избранной противовирусной терапии.

ПЦР в реальном времени («Real-time RT PCR») —один из наиболее перспективных вариантов количественного метода выявления РНК ВГС. Метод и его аппаратное обеспечение совместно разработаны специалистами фирм «Roche» и «Percin Elmer». Принцип метода заключается в способности гидролизовать последовательности кДНК в направлении 5′—- 3′. В реакции применяется специальный зонд, меченный двумя флюоресцентными красителями, имеющими близкие максимумы поглощения и флюоресценции. При наличии продуктов амплификации Tag-полимераза расщепляет зонд, что приводит к предотвращению переноса энергии от одной молекулы красителя к другой, и тем самым предотвращает выход кванта света. Специальный прибор осуществляет учет реакции и математическое моделирование кинетики флюоресценции на каждом этапе реакции, что позволяет получить информацию об исходной концентрации РНК ВГС.

Отличительной особенностью «ПЦР в реальном времени» считают возможность получать информацию о наличии РНК ВГС непосредственно в процессе реакции, что позволяет уменьшить время анализа в сочетании с высокой чувствительностью и линейностью получаемых результатов [50]. По данным Татьяны Яшиной с соавторами, данный метод позволяет выявлять от 200 копий РНК ВГС в мл. [51].

МЕТОДЫ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ РНК ВГС. Определение принадлежности ВГС к определенному генотипу и субтипу нашло свое применение для решения не только чисто научных, но и практических вопросов. Например: поиск источника инфекции во время вспышек гепатита С или прогнозирование эффективности применяемой терапии.

«Золотой стандарт» генотипирования ВГС — непосредственное определение первичной структуры РНК ВГС с его последующим филогенетическим анализом [52], что позволяет четко охарактеризовать данный изолят вируса. Получить эту информацию возможно при использовании следующих вариантов секвенирования:

прямого;

на основе стандартного клонирования;

секвенирования продуктов ПЦР реакции (Limited-sequencing).
Несмотря на точность получаемого результата, метод непосредственного секвенирования не используется в практическом здравоохранении из-за технических сложностей проведения исследования и высокой стоимости работ. Вместе с тем наличие информации о первичной структуре РНК ВГС является референтным методом генотипирования, а наличие приборов для автоматического секвинирования упрощает получение результата.

В настоящее время в большинстве случаев для генотипирования РНК ВГС применяются методы, основанные на использовании ПЦР с типоспецифическими праймерами. Впервые генотипирование РНК ВГС проведено Н. Okamoto с соавторами в 1992 году при помощи RT-ПЦР [53], включающего два этапа амплификации. Первый из них проводился с универсальными, для всех генотипов ВГС, праймерами, второй со смесью типоспецифических праймеров с получением специфических продуктов амплификации различной длины. О наличии того или иного генотипа судили по размеру амплифицированного продукта. В качестве праймеров используются типоспецифические зонды, информация о которых расположена в 5’UTR, Core или NS5 — областях РНКВГС[54].

Гибридизация амплифицированных продуктов с адсорбированными геноспецифическими зондами (из 5′-нетранслируемой зоны РНК ВГС), адсорбированными на нитроцеллюлозной мембране, лежит в основе теста — обозначенного «INNO-LiPA HCV, INNO-GENETICS» [55]. Первоначально с помощью этого теста удавалось типировать генотипы: la; lb; 2a; 2b;3a; 3Ь; 4 и 5а. В дальнейшем тест-системы 2-го поколения «INNO-LiPA HCV II , INNOGENETICS» позволяют различать все 6 генотипов и дополнительно 2с; 2d; 2i; 3с; 4a-h; 6а и 10а. [56]

Методический арсенал определения генотипов ВГС не ограничивается вышеперечисленными способами и включает в себя разнообразные методы:

генотипирование на основе анализа профилей рестрикции амплифицированных продуктов (RFLP). Продукты амплификации фрагментов РНК ВГС (5’UTR — область или NS5 область РНК ВГС) расщепляются рестриктазами. Образовавшиеся фрагменты различаются по длине в зависимости от имеющихся внутри них сайтов рестрикции, по которым идет расщепление. Результаты электрофореза и их сравнение позволяют идентифицировать генотип ВГС в исследуемом образце [57]. Сравнение результатов генотипирования методом ПЦР- RFLP с данными секвинирования продемонстрировало высокий уровень совпадения результатов — 95% [58].

генотипирование на основе метода SSCP (оценки конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК). В качестве объекта исследования выбран 5′-нетранслируемый регион РНК ВГС, который обладает минимальным набором нуклеотидных вариаций, отличающих генотипы друг от друга. Этот факт определяет возможность применить общие праймеры при генотипировании [59].

СЕРОТИПИРОВАНИЕ Анти-ВГС стало возможным благодаря исследованиям P.Simmonds с соавторами, установившим наличие антител, направленных к генотипспецифичным эпитопам, информация о которых кодирована NS4 зоной РНК ВГС [60]. При помощи диагностикума для ИФА, сконструированного на основе синтетических пептидов, удалось разграничить случаи гепатита С, вызванные вирусами 1, 2 и 3 генотипа (89% совпадения с результатами генотипирования). Разработка тестсистем с использованием синтетических и рекомбинантных антигенов, кодированных NS4 и Core зонами РНК ВГС, позволила расширить перечень типируемых вариантов вируса, а также судить о наличии подтипов (1а, lb, 2a, 2Ь, За, и 4а) [61,62]. В настоящее время осуществляется коммерческий выпуск диагностических препаратов для проведения серотипирования как в плашечном варианте проведения ИФА — «Мurех НС 1-6 Serotyping Assay, Murex Diagnostics», так и в варианте «иммуноблот» — RIBA HCV Serotyping Assay, Chiron Diagnostics. Сравнительные данные результатов серотипирования и генотипирования РНК ВГС продемонстрировали высокий уровень совпадения результатов, достигая 95% [62].

Серотипирование анти- ВГС по сравнению с генотипированием РНК ВГС обладает такими преимуществами, как простота проведения реакции и более низкая стоимость. Вместе с тем, этот метод ни в коем случае не может заменить генотипирование. Результаты серотипирования анти-ВГС свидетельствуют о типовой принадлежности анти-ВГС при текущей или ранее перенесенной инфекции. В некоторых случаях (наиболее часто у больных гемофилией) регистрируется одновременное выявление анти-ВГС различных подтипов, что может свидетельствовать о множественном инфицировании различными субтипами и генотипами ВГС [63]. Кроме того, у пациентов с гепатитом С на фоне выраженного иммунодефицитного состояния РНК могут быть единственным маркером, что делает невозможным проведение серотипирования.

ВЫЯВЛЕНИЕ и ТРАКТОВКА РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕСТИРОВАНИЯ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ВГС-ИНФЕКЦИИ. Наличие широкого спектра серологических маркеров текущей или предшествующей ВГС инфекции, а также современная методологическая база позволяют решить многие задачи лабораторной диагностики и профилактики гепатита С. В таблице № 2 представлены серологические маркеры ВГС инфекции и наиболее важные направления их тестирования.

Таблица 2
Диагностическая значимость маркеров текущей или предшествующей ВГС инфекции

Подтвер-
ждение
результата
+ анти-ВГС

Одной из главных задач лабораторной диагностики гепатита С является постановка диагноза и разграничение острого от хронического гепатита С при помощи выявления серологических маркеров инфицирования. Так же как и при других острых вирусных гепатитах, серологические маркеры инфицирования ВГС последовательно появляются и исчезают по ходу инфекции и процесса выздоровления (Рисунок 2).

РНК ВГС удается обнаружить на 7 — 21-й день после инфицирования ВГС, а анти-ВГС на 20 — 150-й день (в среднем 50-й день) [64]. Спектр анти-ВГС может различаться в зависимости от периода острого гепатита. Считается, что первыми удается определить антитела, кодированные Core и NS5 зоной РНК ВГС. Анти-ВГС к белкам, кодированным NS4 зоной, в острую фазу гепатита С отсутствуют [65]. Сравнительное изучение уровня концентраций анти-ВГС, спектра анти-ВГС и РНК ВГС у больных острым и хроническим гепатитом продемонстрировало некоторые различия [66]. На наш взгляд, эти различия могут быть связаны с индивидуальными особенностями инфекционного процесса, что снижает их диагностическую ценность.

Рис. 2. Острый гепатит С

По аналогии с лабораторной диагностикой гепатита А и В ожидали, что определение антител к ВГС класса IgM будут иметь столь же большое диагностическое значение как IgM анти-ВГА и IgM анти-НВс. Однако данные тестирования сывороток крови больных острым и хроническим гепатитом С на наличие IgM анти-ВГС указывают на частое их выявление среди этих больных — 50-93% и 50-70% соответственно [67,68], эти результаты свидетельствуют, что обнаружение IgM анти-ВГС не может быть использовано как маркер острой ВГС инфекции.

Отсутствие маркера, претендующего на роль «золотого» стандарта острого гепатита С, определяет необходимость комплексной оценки полученных результатов, основанных на динамическом наблюдении за пациентом.

Не менее важное направление использования высокочувствительных методов тестирования РНК ВГС — снижение риска развития посттрансфузионного гепатита С. Необходимость таких работ определяется наличием фазы «окна», т.е. временем между первым обнаружением РНК ВГС и появлением анти-ВГС , а также существованием доноров крови (больных хроническим гепатитом С), у которых имеются РНК ВГС при отсутствии анти-ВГС. Современная система контроля донорской крови на наличие ВГС включает только тестирование анти-ВГС, риск заражения гепатитом С сохраняется. Исходя из этого правомерна постановка вопроса о тестировании крови на наличие РНК ВГС современными методами (методы NAT — «nucleic acid amplification test»). Фактор, ограничивающий эту работу, — высокая цена исследований. Для сокращения затрат рекомендуется тестирование пулов сывороток крови (от 8 до 96 образцов) с последующим поиском позитивного образца в случае выявления РНК ВГС в пуле сывороток. Учитывая фактор разведения искомой РНК ВГС при пулировании сывороток крови, принципиальным становится вопрос о применении наиболее чувствительных методов детекции. Считается, что использование диагностических наборов для NAT — с чувствительностью 50-100 IU/mL позволяет значительно уменьшить риск посттрансфузионного гепатита С.

Несомненно, перечень вопросов, которые можно решить при тестировании всего спектра маркеров ВГС-инфекции, не исчерпывается этими двумя направлениями. Наличие современных методов тестирования в совокупности со знанием их возможностей открывает широкие перспективы научных и прикладных работ по гепатиту С.

источник