Руководство по лабораторным исследованиям полиомиелита женева

Об актуальных изменениях в КС узнаете, став участником программы, разработанной совместно с ЗАО «Сбербанк-АСТ». Слушателям, успешно освоившим программу выдаются удостоверения установленного образца.

Программа, разработана совместно с ЗАО «Сбербанк-АСТ». Слушателям, успешно освоившим программу, выдаются удостоверения установленного образца.

Письмо Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 15 мая 2008 г. N 01/5023-8-32 «О рекомендациях по эпидемиологии, клинике, диагностике и профилактики заболеваний, вызванных энтеровирусом 71 типа»

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека сообщает, что по данным на 13 мая 2008 г. число зарегистрированных случаев энтеровирусной инфекции (HFMD — англ. «руки-ноги-рот-болезнь») среди населения Китайской народной республики (КНР) составляет 27,5 тыс. человек, из них 93% — дети до 4-х лет. Зарегистрировано 39 случаев смерти детей по причине данного заболевания, из них 25 — подтверждены лабораторно выделением энтеровируса 71-го типа.

По данным вирусологических исследований материала от заболевших в большинстве случаев идентифицируется энтеровирус тип 71, а также вирусы типов Коксаки А16 и Echo.

Эпицентром подъема заболеваемости остается город Фуань восточной провинции Аньхой, где по состоянию на 05.05.2008 г. зарегистрировано 5840 случаев заболеваний, госпитализировано 1314 детей.

В эпидемический процесс вовлечены 19 административных образований страны, в том числе провинции Аньхой, Гуандун, Хэнань, Хунань, Хубэй, Шаньси, Чжэцзян, Цзянси, Цзянсу, Цзилинь, Юньнань, Хэбей, Гуанси-Чжуанский район и города центрального подчинения — Шанхай, Пекин, Чунцин, Хайнань, Гонконг и Макао.

Пик заболеваемости в КНР ожидается в июне-июле текущего года.

Принимая во внимание возможность завоза из КНР и распространения энтеровирусной инфекции на территории нашей страны, направляем для использования в работе рекомендации по эпидемиологии, клинике, диагностике и профилактике инфекции, вызванной энтеровирусом 71 типа, разработанные при участии Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН.

Рекомендации
по эпидемиологии, клинике, диагностике и профилактике заболеваний, вызванных энтеровирусом 71 типа

В настоящее время энтеровирус 71 типа (ЭВ71) рассматривается как один из наиболее значимых патогенных агентов из числа энтеровирусов человека. Этот вирус характеризуется высокой нейропатогенностью, может вызывать крупные вспышки с летальными исходами.

ЭВ71 — мелкий безоболочечный РНК — содержащий вирус, относится к семейству Picornaviridae, роду Enterovirus, к виду Human Enterovirus A (HEV-A). По основным физико-химическим и биологическим характеристикам ЭВ71 практически не отличается от остальных энтеровирусов. Вирус был выделен и идентифицирован как отдельный серотип в 1970 г. во время вспышки серозного менингита в Калифорнии (США). В настоящее время показано генетическое разнообразие штаммов ЭВ71. Различают 4 генетических линии вируса (A-D), внутри которых выделяют генотипы.

На протяжении последних 40 лет ЭВ71 являлся одним из наиболее патогенных серотипов энтеровирусов. Зарегистрировано три волны вспышек ЭВ71 инфекции: в 1969 — 1978 гг. (США, Австралия, Япония, Швеция, Болгария, Венгрия); в 1985-1991 гг. (Гонконг, США, Бразилия, Тайвань) и в 1996-2006 гг. (Малайзия, Сингапур, Тайвань, Канада, Австралия, Корея, Китай, Вьетнам, Япония).

В 1975 г. в Болгарии зарегистрирована крупная вспышка неврологического заболевания (704 случая болезни, из которых 545 — серозного менингита и 148 — паралитического заболевания, в 43 случаях закончившегося летально), этиологическим агентом которой явился ЭВ71.

В 1998г. на Тайване зарегистрировано около 1 400 000 случаев заболевания, вызванного ЭВ71; 78 случаев закончились летально. В 2006-2007 гг. вспышки и отдельные случаи ЭВ71 инфекции имели место в Индии, Тайланде, Китае, Малайзии, Брунее, Японии.

Во время вспышек ЭВ71 инфекции в странах Юго-Восточной Азии (1996-2006 гг.) наблюдали, в основном, ящуроподобное заболевание. Летальные исходы были связаны с неврологическими осложнениями и с острым нейрогенным отеком легких. Установлено, что подъем заболеваемости в эти годы был связан с ЭВ71 генотипов В3, В4, В5, С2, С4 и С5, которые часто коциркулировали. В Норвегии в последние годы показана широкая бессимптомная циркуляция ЭВ71 генотипа С1. Взаимоотношения между ЭВ71 разных генотипов и их перекрестная нейтрализующая реактивность не изучены.

Учитывая высокую патогенность вируса и его быстрое распространение, в том числе и в странах, граничащих с Россией, нельзя исключить занос вирулентных штаммов ЭВ71 в нашу страну.

Эпидемиология инфекции, вызываемой ЭВ71.

Энтеровирусы распространены повсеместно. Человек, в организм которого попал вирус чаще становится носителем вируса, или переносит заболевание в легкой форме. Около 85% случаев ЭВИ протекает бессимптомно, около 12-14% диагностируются как легкие формы заболевания, и только 1-3% имеют тяжелое течение.

Вирус ЭВ71 в основном поражает детей до 10 лет, наиболее подвержены инфекции дети первого года жизни. Серьезные осложнения энтеровирус 71 типа чаще всего вызывает у детей до двух лет. У взрослых людей вероятность развития заболевания мала.

Вспышки инфекции, вызванной ЭВ71, чаще всего имеют весеннюю и осеннюю сезонность. В странах умеренного климата характерна сезонность с повышением заболеваемости в середине лета и начале осени.

Подъемы заболеваемости ЭВИ в странах Азии, обусловленные ЭВ71, регистрируются каждые 5-10 лет с пиком в июне-июле, что связано с формированием коллективного иммунитета к данному типу вируса и последующим накоплением неиммунной, восприимчивой к вирусу возрастной группы детей младшего возраста.

Заболевания могут наблюдаться в виде спорадических случаев, локальных вспышек (чаще в детских коллективах) и в виде крупных эпидемий, поражающих ряд стран.

Источником инфекции является больной человек или бессимптомный вирусоноситель. Вирус выделяется из носоглотки или с фекалиями. Вирус также может выделяться из везикулярных высыпаний. Механизмы передачи инфекции — фекально-оральный, воздушно-капельный, контактный, которые реализуются контактно-бытовым, пищевым и водным путем. Учитывая способность вируса несколько дней существовать в окружающей среде, для инфицирования необязателен непосредственный контакт.

Относительная роль каждого из путей передачи до конца не изучена и, по мнению специалистов, может варьировать в зависимости от наличия или отсутствия контакта с источником инфекции, потреблением контаминированных продуктов, воды, климатических условий (высокая температура воздуха при высокой влажности способствует длительному выживанию вируса во внешней среде на контаминированных поверхностях) и др.

На распространение инфекции влияет плотность населения, интенсивность сообщения между населенными пунктами.

Заболеванию свойственна высокая контагеозность, образование эпидемических очагов в детских коллективах, а также семейных и домашних очагов, захватывающих ряд близлежащих домов. Длительность существования очага зависит от числа детей в коллективе и может растянуться на 3-4 недели. Ежедневная заболеваемость ограничивается единичными случаями, между которыми возможны интервалы, укладывающиеся в срок инкубационного периода. Обычно в коллективе переболевают 30-65% детей. В учреждениях с изолированными группами заболевания могут быть только в отдельных группах, а при отсутствии изоляции, инфекция поражает весь коллектив.

Инкубационный период варьирует от 2 дней до трех недель, в среднем около 7 дней. Заразительность инфицированных лиц выше на ранних сроках заболевания. Выделение вируса с фекалиями обычно происходит до 3-4 недель от начала заболевания, из носоглотки — не дольше 3 дней.

При вспышках ЭВ71 инфекции часто отмечается циркуляция других энтеровирусов, в особенности, Коксаки А16. Этот вирус может вызывать сходное с ЭВ71 инфекцией ящуроподобное заболевание, однако неврологические осложнения при этом встречаются редко.

Эпидемиологический надзор за инфекцией, вызванной ЭВ71 не отличается от надзора за другими энтеровирусными инфекциями и осуществляется в соответствие МУ 3.1.1.2130-06 «Энтеровирусные заболевания: клиника, лабораторная диагностика, эпидемиология, профилактика». Надзор включает:

— выявление, клиническую, вирусологическую и серологическую диагностику, регистрацию и учет заболеваний;

— систематический активный сбор, текущий и ретроспективный анализ и оценку соответствующей информации;

— анализ клинических проявлений и результатов лабораторного исследования;

— контроль, оценку качества и эффективности профилактических мероприятий.

Кишечные вирусы проникают в организм через слизистую оболочку верхних отделов респираторного и пищеварительного тракта. В ряде случаев на месте ворот инфекции возникают изменения в виде поражения слизистых оболочек (синдром острого респираторного заболевания, фарингиты, герпангина).

После накопления вируса в месте первичного размножения возбудитель проникает в кровь (вирусемия) и разносится по всему организму. Энтеровирусы обладают тропизмом к нервной ткани, мышцам и эпителиальным клеткам, что проявляется как в клинической картине болезни, так и в морфологических изменениях тканей. Некоторое значение имеет лимфогенное распространение вирусов. У беременных возможно внутриутробное поражение плода. Перенесенное энтеровирусное заболевание (или инаппарантная инфекция) оставляет после себя иммунитет к тому типу вируса, которым была обусловлена инфекция. Существуют перекрестные иммунологические реакции к некоторым энтеровирусам.

Обычно инфекция протекает достаточно легко и бессимптомно, или с призанками легкого недомогания — лихорадкой, головной болью, подташниванием, болями в брюшной области, фотофобией, иногда рвотой, и заканчивается через 7-10 дней. Но как только вирус попадает в кровь, он способен поразить различные органы, вызывая серьезные заболевания. Заражение энтеровирусом-71 может привести к опасным осложнениям — менингитам, энцефалитам, поражениям сердца и легких, параличу.

Инфекция, вызываемая ЭВ71, может иметь двуфазное течение.

Первая фаза — заболевание с ящуроподобным синдромом.

Симптомы: гипертермия, рвота, изъязвление слизистой полости рта, высыпания на кожных покровах рук и ног, герпангина. Начинается остро с повышения температуры до 38-40оС, которая держится от 3 до 5 дней, сопровождается головной болью, тошнотой, рвотой. Нередко наблюдаются боли в животе и в мышцах, жидкий стул. В некоторых случаях наблюдаются катаральные явления со стороны верхних дыхательных путей, насморк, кашель. На 1-2 день болезни появляется пятнисто-папулезная эритематозная или везикулярная сыпь, преимущественно на руках, ногах, вокруг и в полости рта. В отдельных случаях в зеве наблюдаются поражения по типу герпангины. Высыпания держатся в течение 24-48 ч, иногда до 8 дней и затем бесследно исчезают. Ящуроподобный синдром поражает преимущественно детей в возрасте от 6 мес. до 12 лет. Как правило, заболевание протекает сравнительно легко и заканчивается выздоровлением.

Вторая фаза — неврологические осложнения — наблюдается преимущественно у детей раннего возраста (6 мес. — 3 года). Признаки вовлечения ЦНС возникают обычно через 2-5 дней после начала первой фазы болезни. Поражение ЦНС продолжает развиваться на фоне еще сохраняющихся проявлений ящуроподобного синдрома. Фаза неврологических осложнений может включать в себя три основных синдрома:

— Асептический менингит. Симптомы: головная боль, рвота, температура, ригидность затылочных мышц. Исход — выздоровление без последствий.

— Острые вялые параличи конечностей. Потери тактильной и температурной чувствительности не отмечается. Исход — слабость и атрофия мышц конечностей.

— Ромбэнцефалит. По характеру клинических проявлений в течении ромбэцефалита можно выделить три степени тяжести:

I степень — генерализованные миоклонические судороги с тремором, атаксия.

II степень — миоклонус с вовлечением черепномозговых нервов. Нарушение функции глазодвигательных мышц (нистагм, косоглазие). Бульбарный паралич (нарушение глотания, нарушение речи, афония). Слабость лицевого нерва.

III степень — преходящий миоклонус, за которым следует быстрое развитие респираторных расстройств (острый нейрогенный отек легких), цианоз, шок, кома, потеря реакции зрачка на свет, остановка дыхания, смерть. Все пациенты с III степенью тяжести ромбэнцефалита нуждаются в искусственной вентиляции легких и кардиопульмонарной поддержке. До 75% пациентов с III степенью тяжести ромбэнцефалита могут погибнуть в течение 3-12 часов после развития синдрома.

У 1/3 детей, выживших после перенесенной ЭВ71-нейроинфекции, сохранялись нарушения двигательных функций, глотания, дыхания.

Дифференциальный диагноз проводят в зависимости от клинической формы (с серозными менингитами, инфекционными конъюнктивитами, ротавирусньми диареями, полиомиелитом и др.). Особая осторожность необходима при диагностике эпидемической миалгии, которая бывает сходна с острыми хирургическими заболеваниями (острый аппендицит, кишечная непроходимость и др.).

Лабораторная диагностика инфекции, вызванной энтеровирусом 71 типа.

Для лабораторного подтверждения диагноза используют выделение вирусов (из слизи и смывов зева, цереброспинальной жидкости, испражнений) и серологические исследования.

Во время эпидемических вспышек диагноз может быть установлен на основании характерной клинической симптоматики.

Отбор, хранение и транспортировка проб. При отборе, хранении и транспортировке проб руководствуются МУ 3.1.1.2130-06 «Энтеровирусные заболевания: клиника, лабораторная диагностика, эпидемиология, профилактика».

Для отбора проб используют стерильную пластиковую посуду. Две пробы фекалий для выделения вируса или вирусной РНК отбирают в первые 7 дней после начала болезни с интервалом 24-48 часов.

Носоглоточные смывы отбирают в первые 3-4 дня от начала заболевания. Отбор материала с помощью глоточного тампона производят в те же сроки. Тампоном протирают заднюю стенку глотки, миндалины и небные дужки. Тампоны помещают в пробирку с 1 мл раствора Хэнкса; пробу исследуют сразу или хранят в замороженном виде.

Для взятия материала везикулы участок, где расположена везикула, очищают спиртом. Пузырек прокалывают иглой или вскрывают скальпелем, собирают вытекающую жидкость на ватный тампон, которым также протирают везикулу. Тампон помещают в 1 мл раствора Хэнкса.

Спинномозговую жидкость берут в первые дни болезни только по клиническим показаниям.

Пробы крови для серологической диагностики следует брать в пробирки, не содержащие антикоагулянта. Первую пробу крови берут как можно раньше после начала болезни, вторую — на 3-4-й неделе. Сыворотку крови хранят в замороженном виде.

В случае летального исхода для исследования забирают секционные материалы — ткани головного, спинного и продолговатого мозга и варолиева моста, лимфоузлы, содержимое кишечника и ткань кишечной стенки, соскоб кожных высыпаний. Пробу нужно брать как можно раньше после смерти. Для иссечения тканей пользуются стерильными инструментами (отдельный набор для каждой пробы). Объем каждой пробы (кусочка) из тканей центральной нервной системы должен составлять примерно 1 см3.

Собранные пробы немедленно отправляют в лабораторию. Носоглоточные мазки сразу после взятия помещают в транспортировочную среду. Пробы хранят при температуре +40 — +8.С. Если время до отправки превышает 24 часа, пробы замораживают, и обеспечивают этот режим во время транспортировки.

При транспортировке материалов в лабораторию необходимо соблюдать принцип «тройной упаковки». Недопустимо отправлять материалы без предварительной договоренности с получателем.

Методами лабораторного подтверждения энтеровирусной инфекции являются выделение вируса (в культуре клеток или на животных) и обнаружение РНК ЭВ71 с помощью ПЦР. При выделении энтеровирусов в культуре клеток следует руководствоваться принципами, изложенными в «Рекомендациях по эпидемиологическому надзору за энтеровирусами для поддержки программы ликвидации полиомиелита». ВОЗ, Женева, 2005 г., «Руководстве по лабораторным исследованиям полиомиелита». 4-е издание. ВОЗ, Женева, 2005 г., Методических указаниях 4.2.2029-05 «Санитарно-вирусологический контроль водных объектов», Москва, 2006.

Некоторые штаммы ЭВ71 могут вызывать цитопатогенное действие в культуре клеток RD, другие не обладают цитопатогенностью в известных культурах клеток и могут быть выделены только на чувствительных лабораторных животных (сосунки белых мышей). Вирус идентифицируют в реакции нейтрализации инфекционности.

Для диагностических целей необходимы, по крайней мере, две пробы сыворотки от обследованного лица. Диагноз инфекции ЭВ71 подтверждается 4-кратным и большим подъемом титра специфических антител во второй пробе. Исследование единичного образца сыворотки неинформативно. В настоящее время для серологической диагностики используют преимущественно реакцию нейтрализации инфекционности.

Осуществляется в соответствии с МУ 1.3.1888-04 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III-IV групп патогенности».

Молекулярная детекция энтеровирусов может быть выполнена при помощи ПЦР к 5″ нетранслируемой области генома. Методика выделения и детекции РНК ЭВ71 не отличается от методик для других энтеровирусов, в том числе вируса полиомиелита. Определение энтеровирусной РНК производится в соответствии с Руководством по лабораторным исследованиям полиомиелита (4-е издание, ВОЗ, Женева, 2005). Выделение вирусной РНК может быть выполнено любым из современных методов из фекального экстракта, смывов с ротоглотки, соскобов с кожных элементов, спинно-мозговой жидкости и другого клинического материала, с использованием зарегистрированных и разрешенных в установленном порядке диагностических наборов для идентификации РНК энтеровирусов методом ПЦР.

Молекулярная идентификация ЭВ71 производится на основании определения частичной нуклеотидной последовательности области генома VP1. Критерием принадлежности к типу ЭВ71 считается более чем 70% сходство нуклеотидной последовательности изолята в области генома VP1 со штаммами ЭВ71, выделенными ранее и внесенными в базу данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Описанные на сегодняшний день методы специфической амплификации в ПЦР области генома VP1 ЭВ71 отличаются низкой чувствительностью и специфичностью и недостаточно проверены в реальных условиях.

Интерпретация результатов. Энтеровирусы распространены повсеместно, и обнаружение энтеровирусной РНК не является основанием для этиологического диагноза. Наиболее информативно обнаружение энтеровирусной РНК в материале посмертного исследования ЦНС пациентов, умерших с характерной клинической картиной ЭВ71 инфекции. Большое значение имеет исследование материалов везикул. Обнаружение энтеровирусной РНК в спинномозговой жидкости может быть диагностическим признаком ЭВ71 инфекции только в сочетании с наблюдаемой очаговой неврологической симптоматикой, характерной для ЭВ71 инфекции. Обнаружение энтеровирусной РНК в СМЖ при симптомах менингита может иметь место при серозном менингите, вызванном любым из десятков известных энтеровирусов. Выявление энтеровирусной РНК в смывах с ротоглотки и в пробах фекалий имеет минимальное диагностическое значение.

Алгоритм этиологической расшифровки вспышек ЭВ71 инфекции.

Доказательство этиологической роли ЭВ71 должно быть мультидисциплинарным.

Клиническая картина изучаемого заболевания должна быть охарактеризована по физическим и патолого-анатомическим данным. Необходимо изучить эпидемиологические характеристики заболевания (источник инфекции, пути передачи, возраст, социальные и географические условия и т.п.), которые могли бы свидетельствовать в пользу ЭВ71 инфекции. От больных должен быть выделен ЭВ71 или обнаружены его нуклеотидные последовательности.

Предположительное заключение о вспышке ЭВ71 инфекции может быть сделано на основании регистрации в данной местности в течение 7 дней не менее 10 случаев лихорадочного заболевания, сопровождающегося экзантемой на коже рук и ног и на слизистых у детей в возрасте до 6 лет и обнаружение энтеровирусной РНК в материалах кожных элементов у более чем 50% пациентов.

Важным является установление эпидемиологических взаимосвязей в очагах инфекции и возможного факта заноса вируса с других территорий. С этой целью проводят сравнение нуклеотидных последовательностей области генома VP1 энтеровируса 71, идентифицированного у заболевших, контактных и в потенциальных факторах передачи, между собой, а также с соответствующими последовательностями штаммов ЭВ71, выделенных на других территориях. Идентичность нуклеотидных последовательностей ЭВ71, выделенных в очаге, позволит установить источник инфекции и возможные факторы передачи. При установлении идентичности нуклеотидных последовательностей ЭВ71 с последовательностями известных генотипов ЭВ71, циркулирующего в эндемичных районах, можно предположить факт заноса вируса.

Этиотропное лечение отсутствует. Имеются указания об эффективности иммуноглобулина с высоким титром антител при лечении больных тяжелыми формами энтеровирусного энцефалита у лиц с дефицитом антител. Назначают общеукрепляющие и симптоматические средства. При менингитах, миокардите и инфекционных экзантемах эффективно назначение преднизолона, начиная с 30-40 мг/сут с последующим снижением дозы. Курс лечения 5-7 дней.

В большинстве случаев благоприятный; серьезный при миелитах и энцефалитах, неблагоприятный при энцефаломиокардитах новорожденных. Сроки потери трудоспособности зависят от клинической формы. При серозных менингитах стационарное лечение продолжается 2-3 нед, выписка производится после полного клинического выздоровления и санации цереброспинальной жидкости.

Санитарно-противоэпидемические мероприятия при инфекции ЭВ71 направлены на предотвращение распространения инфекции и ликвидацию эпидемического очага, в том числе:

1. Раннее выявление и госпитализацию всех больных в инфекционный стационар не менее, чем на две недели, проведение клинической и лабораторной диагностики случаев заболевания.

2. Изоляцию и вирусологическое обследование лиц с подозрением на заболевание, медицинское наблюдение за этими лицами.

3. При подозрении на инфекцию ЭВ71 сбор материала для вирусологического исследования, в том числе с объектов внешней среды (исследование сточных вод, источников водоснабжения, зон рекреаций и др.).

4. Организация и проведение подворных обходов в период подъема заболеваемости (ежедневно или через день в течение 1-2 недель) в целях выявления больных.

5. Усиление контроля за качеством водоснабжения, питания населения.

6. Запрещение купания в открытых водоемах (при необходимости).

7. Дезинфекционные мероприятия.

Мероприятия в очагах инфекции ЭВ71. По месту жительства и в детских организованных учреждениях осуществляются ежедневные медицинские наблюдения в целях активного выявления новых случаев заболевания. При этом осуществляют сбор фекалий у лиц, контактировавших с больным, для вирусологического обследования.

К числу необходимых мероприятий в очагах нужно отнести карантины, накладываемые на детские учреждения, в которых возникли случаи заболевания инфекцией ЭВ71. Запрещается проведение массовых детских мероприятий, занятия в начальных классах отменяют до снижения заболеваемости. В период эпидемий необходимо усилить контроль за проведением дезинфекционных мероприятий и ежедневным медицинским контролем при приеме детей в детских учреждениях. Важное значение имеет санитарно-просветительная работа с населением через СМИ о природе заболевания и его предупреждении.

В эпидемическом очаге дезинфекцию проводят препаратами, разрешенными к применению в установленном порядке и обладающих вирулицидной активностью.

Методы профилактики ЭВ71 инфекции. В настоящее время вакцина против ЭВ71 отсутствует.

Одним из методов экстренной профилактики ЭВ71 инфекции является применение аттенуированной оральной полиомиелитной вакцины (ОПВ). Принцип действия ОПВ основан на быстром (2-3 дня) заселении кишечника у детей в возрасте от 1 года до 14 лет вакцинным полиовирусом и, как следствие, вытеснении из циркуляции других ЭВ71.

Применение ОПВ по эпидемическим показаниям проводится однократно, независимо от ранее проведенных профилактических прививок против полиомиелита.

Живая полиомиелитная вакцина была успешно использована для купирования вспышки ЭВ71 инфекции в Болгарии и вспышек серозного менингита и энтеровирусного увеита в России.

Письмо Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 15 мая 2008 г. N 01/5023-8-32 «О рекомендациях по эпидемиологии, клинике, диагностике и профилактики заболеваний, вызванных энтеровирусом 71 типа»

источник

• Главная
• «ЭНТЕРОВИРУСНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ: КЛИНИКА, ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, ЭПИДЕМИОЛОГИЯ, ПРОФИЛАКТИКА. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУ 3.1.1.2130-06» (утв. Роспотребнадзором 09.09.2006)

3. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА НЕПОЛИОМИЕЛИТНЫХ ЭНТЕРОВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ

В данном разделе изложены основные сведения по специфической лабораторной диагностике энтеровирусных инфекций. Много полезных сведений об основах специфической диагностики энтеровирусных инфекций можно получить дополнительно в изданных ранее справочных руководствах, например, в главе: «Энтеровирусы» в книге «Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных болезней» (под редакцией Э. Леннета и Н. Шмидт, Москва, «Медицина», 1974, с. 421 — 479), в «Руководстве по вирусологическим исследованиям полиомиелита», изданном ВОЗ на русском языке в 2005 году, а также в «Рекомендациях по эпидемиологическому надзору за энтеровирусами для поддержки программы ликвидации полиомиелита», изданными ВОЗ на русском языке в 2005 г.

Первоначально энтеровирусы были выделены в самостоятельную группу на основании физико-химических характеристик, таких как плавучая плотность (1,31 — 1,35 г/куб. см в хлористом цезии), коэффициент седиментации (от 150S до 165S), вес вириона (от 8 x 10(6) до 9 x 10(6) Da), отсутствие липидной оболочки, устойчивость к обработке эфиром и стабильность при pH от 3 до 10. Разделение энтеровирусов человека на четыре больших группы (вирусы полиомиелита, Коксаки A, Коксаки B, ЕСНО) было основано на их патогенности для лабораторных животных или способности вызывать цитопатический эффект в культуре клеток приматов (табл. 2). Идентификация серотипа основывалась на нейтрализации инфекционности вируса для животных или цитопатического действия вируса в культуре клеток специфическими антисыворотками (табл. 3).

ЭНТЕРОВИРУСЫ ЧЕЛОВЕКА: ВОСПРИИМЧИВЫЕ ЖИВОТНЫЕ И КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК

Примечание. Имеется много штаммов энтеровирусов, которые имеют характеристики, свойственные одновременно разным группам энтеровирусов.

НЕПОЛИОМИЕЛИТНЫЕ ЭНТЕРОВИРУСЫ ЧЕЛОВЕКА (ПРИНЯТАЯ РАНЕЕ КЛАССИФИКАЦИЯ)

1. Не менее 20 серотипов энтеровирусов человека еще не классифицировано.

2. Вирус Коксаки A23 идентичен ранее описанному вирусу ЕСНО 9.

3. Вирус ЕСНО 8 идентичен ранее охарактеризованному вирусу ЕСНО 1.

4. Вирус ЕСНО 10 оказался реовирусом.

5. Вирусы ЕСНО 22 и ЕСНО 23 были выделены как род Parechovirus и его отдельные серотипы.

6. Вирус ЕСНО 28 оказался риновирусом.

7. Вирус ЕСНО 34 идентичен ранее охарактеризованному вирусу Коксаки A24.

8. Энтеровирус 72 является возбудителем гепатита A и выделен в отдельный род Hepatovirus в семействе Picornaviridae (см. табл. 4).

Согласно последней классификации вирусов (Международный комитет по таксономии вирусов, 2003), основанной на геномных характеристиках вирусов, неполиомиелитные энтеровирусы человека представлены 4 видами (A, B, C, D), входящими в род Enterovirus, который относится к семейству Picornaviridae (от pico — малый и rna — содержащий РНК) (табл. 4). К каждому из 4 видов отнесены различные серотипы неполиомиелитных энтеровирусов (табл. 5). Типовым представителем рода является вирус полиомиелита.

СЕМЕЙСТВО PICORNAVIRIDAE, РОДЫ, ВИДЫ И ЧИСЛО ВХОДЯЩИХ В ВИДЫ СЕРОТИПОВ

Примечание. Приведенная в таблице классификация основана на геномных характеристиках вирусов. По-видимому, будут считаться отдельными родами еще несколько энтеровирусов животных. Большое число энтеровирусов (не менее 20) еще не классифицировано.

ТАКСОНОМИЧЕСКИЕ ВИДЫ НЕПОЛИОМИЕЛИТНЫХ ЭНТЕРОВИРУСОВ ЧЕЛОВЕКА И ВХОДЯЩИЕ В ВИДЫ СЕРОТИПЫ

В настоящее время определена полностью или частично нуклеотидная последовательность геномов многих энтеровирусов. Все энтеровирусы оказались сходными по общей схеме организации геномов, хотя и имеют различия по видам и серотипам.

3.1.2. Влияние химических и физических агентов

Энтеровирусы вне организма нечувствительны к воздействию всех известных антибиотиков и химиотерапевтических препаратов. Эфир, дезоксихолат и различные детергенты, разрушающие арбовирусы, миксовирусы и ряд других вирусов, не оказывают влияния на энтеровирусы. Энтеровирусы устойчивы в кислой среде (pH 3 — 5). Обработка 0,3%-м формальдегидом, 0,1 N HCl или свободным остаточным хлором в концентрации 0,3 — 0,5 мг/л ведет к быстрой инактивации энтеровирусов, однако присутствие органических веществ может оказывать защитное действие.

При 50 °C энтеровирусы быстро разрушаются. Добавление к вирусной взвеси хлористого магния в одномолярной концентрации сохраняет титр вируса при 50 °C практически неизменным в течение часа.

В замороженном состоянии активность энтеровирусов сохраняется в течение многих лет, при хранении в обычном холодильнике (4 — 6 °C) — в течение нескольких недель, а при комнатной температуре — на протяжении нескольких дней.

Энтеровирусы быстро разрушаются под воздействием ультрафиолетового облучения или при высушивании. Они выдерживают многократное замораживание и оттаивание без потери активности.

Для бесспорного признания вируса этиологическим агентом в обследуемом случае заболевания не всегда достаточно выделить вирус и продемонстрировать появление специфических антител. Особенно это касается этиологии спорадических случаев или первых случаев во время вспышек заболеваний, этиология которых на первых порах была неясной. Интерпретация лабораторных данных в указанных случаях требует особенной осторожности.

Для признания определенного вируса этиологическим фактором заболевания сбор и анализ доказательств должны быть многосторонними.

Клиническая картина изучаемого заболевания с неясной этиологией должна быть очерчена по физическим, лабораторным, патологоанатомическим данным.

Должны быть изучены эпидемиологические характеристики заболевания (источник инфекции, пути передачи, возраст заболевших, социальные, географические условия, сезонность и т.п.) в пользу его своеобразия.

Должны быть представлены данные в пользу вирусной этиологии болезни (т.е. данные, исключающие роль других микроорганизмов и неинфекционных причин).

От больного должен быть выделен предполагаемый вирусный агент или выявлены его нуклеотидные последовательности, а также установлена его таксономическая принадлежность.

Следует показать, что вирус не случайно присутствовал в организме пациента и не является контаминантом, полученным от использованных для выделения вируса животных или культур клеток.

Должны быть показаны сероконверсия или другие признаки иммунитета после перенесенного заболевания.

Заболевание должно быть воспроизведено при введении выделенного агента животным и изучены характеристики вызванного заболевания.

Вакцина или иммунная сыворотка должны предохранять от заболевания. Следует учитывать влияние на болезнь и других воздействий (например, интерференции с вакцинным вирусом полиомиелита у детей с энтеровирусной инфекцией).

Желательно, чтобы результаты этиологического изучения болезни были подтверждены другими исследователями.

Энтеровирусы очень часто вызывают бессимптомную инфекцию; доказаны случаи одновременной инфекции двумя, тремя и даже четырьмя энтеровирусами. Некоторые энтеровирусы (полиомиелита, Коксаки A7, A9, A16, A21 и другие, вирусы ЕСНО типов 4, 6, 9, 11, 16, 19, 30 и другие, энтеровирус типа 71) обнаруживаются периодически в качестве этиологических агентов эпидемических вспышек, и их патогенность для человека хорошо доказана. Однако эти же энтеровирусы часто выделяют от здоровых людей или на фоне очень легкого недомогания. Поэтому простое выделение вируса еще не является безоговорочным доказательством этиологической роли этого агента при заболевании и может быть случайным совпадением. Выделение энтеровируса из пищеварительного тракта даже при 4-кратном нарастании титра антител к этому вирусу может не иметь отношения к этиологии обследуемого случая заболевания. Вместе с тем, регулярное выделение энтеровируса одного типа от сходных случаев заболеваний и от клинически здоровых лиц из окружения больных в совокупности с гомотипичной иммунологической реакцией является веским доказательством этиологической роли соответствующего агента.

Выделение предполагаемого энтеровируса из стерильных жидкостей организма (СМЖ, крови и др.) или из тканей (центральной нервной системы, сердечной мышцы и др.), обнаружение характерных патологоанатомических признаков, обнаружение вирусного антигена (или геномных последовательностей вируса) в пораженных клетках рассматривают как убедительные доказательства этиологической связи выявленного агента с обследуемым заболеванием. Выделение одного и того же типа вируса от больных со сходными клиническими симптомами во время вспышки, особенно если оно подкрепляется результатами серологических исследований, указывает на этиологическую роль вируса этого типа. Для признания этиологической роли энтеровируса при изучении вновь возникающих заболеваний (например, вируса Коксаки A7 и энтеровируса типа 71 при вспышках полиомиелитоподобного заболевания, вирусов ЕСНО 19 и ЕСНО 11 при вспышках острого энтеровирусного увеита), помимо комплекса данных, полученных в одной лаборатории, чрезвычайно ценным является получение сходных эпидемиологических и лабораторных данных в других лабораториях, других районах и в другие годы.

3.3.1. Безопасность работы в лаборатории, выполняющей диагностические исследования энтеровирусных инфекций

Согласно российским официальным нормативным документам, неполиомиелитные энтеровирусы отнесены к IV группе патогенности («Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I — IV групп патогенности». СП 1.2.036-95). Правила устройства микробиологических лабораторий, получения разрешений на работу с микроорганизмами и безопасности работы регламентируются СП 1.2.006-93 и СП 1.2.731-99.

Выполнение диагностических исследований энтеровирусных инфекций допускается в лабораториях, организациях, структурных подразделениях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение и лицензию на выполнение работ с микроорганизмами III — IV групп патогенности.

Организация работы в лаборатории выполняется в соответствии с СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами».

: В связи с утратой силы СП 1.2.731-99, следует руководствоваться принятыми взамен СП 1.3.2322-08.

Клинические материалы, которые используются для диагностических исследований энтеровирусных инфекций, могут быть инфицированы диким полиовирусом, поэтому при работе с ними необходимо соблюдать правила, изложенные в следующих нормативных документах:

— СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования материалов, инфицированных или потенциально инфицированных диким полиовирусом»;

: Официальный источник электронного документа содержит неточность: СП 1.2.036-95 имеет название «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I — IV групп патогенности».

— СП 1.3.1325-03 «Безопасность работы с материалами, инфицированными или потенциально инфицированными диким полиовирусом».

Основные рекомендации по работе лабораторий, выполняющих диагностические исследования энтеровирусных инфекций, содержатся в «Руководстве по лабораторным исследованиям полиомиелита» (4-е издание. ВОЗ, Женева, 2005) и в «Рекомендациях по эпидемиологическому надзору за энтеровирусами для поддержки программы ликвидации полиомиелита» (ВОЗ, Женева, 2005).

Среди лиц, работающих с энтеровирусами, точно документированные случаи лабораторных заражений являются редкими. Это — или следствие несчастного случая, или несоблюдение соответствующих предосторожностей. Известен случай заноса дикого вируса полиомиелита в семью работником производства полиовирусной вакцины. Хорошее владение техникой работы и употребление различных защитных приспособлений значительно снижают этот риск. Наиболее частой причиной лабораторных заражений является вдыхание аэрозолей вируссодержащих материалов, образующихся при работе с пипетками, шприцами, при центрифугировании, а также контакт с зараженными животными.

Работников, осуществляющих работу с инфекционными материалами, нужно инструктировать о необходимости обращения к врачу в случае заболевания лихорадочного типа. Следует периодически брать пробы крови у персонала и хранить сыворотки в замороженном виде для серологических исследований в случае заболевания. Для каждой лаборатории в соответствии с конкретными условиями работы следует разработать руководство по технике безопасности. Основное внимание следует уделять необходимости сознательного и ответственного отношения к работе со стороны персонала, а также тщательному обучению правилам безопасности новых сотрудников, поскольку само по себе существование правил безопасности и защитных приспособлений еще не обеспечивает предупреждения лабораторных заражений.

Санитарными правилами СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами» определяются требования к организации работы, включая требования к помещениям и оборудованию лабораторий, проведению работ в лаборатории, средствам индивидуальной защиты, содержанию животных, обеззараживанию материала и уборке помещений, мероприятиям по ликвидации аварий и организации контроля за выполнением требований биологической безопасности. В этих санитарных правилах предписаны режимы обеззараживания различных зараженных материалов (поверхностей рабочих столов, стен и полов помещений, защитной одежды, лабораторной посуды и вируссодержащих материалов, инструментов). В этих правилах предписываются также режимы дезинфекции предметов, которые могут быть контаминированы выделениями больных людей (одежда, обувь, белье, посуда, жидкие отходы, посуда из-под выделений, санитарно-техническое оборудование, уборочный материал, мусор, транспорт). Рекомендуются также средства и методы дезинфекции, используемые при работе с микроорганизмами III и IV групп патогенности и бактериологический метод контроля эффективности работы парового стерилизатора.

3.3.2. Правила забора и транспортирования материалов от больных для проведения вирусологических исследований

Для подтверждения вирусной этиологии заболевания необходимо проведение лабораторного исследования, эффективность которого зависит от правильного сбора соответствующих материалов (тканей, фекалий, носоглоточных смывов, крови, везикулярной жидкости, спинно-мозговой жидкости) и транспортирования их в лабораторию. Все пробы для выделения вируса необходимо брать с соблюдением соответствующих предосторожностей для исключения контаминации одной пробы материалом другой пробы этого же больного или материалом пробы другого обследуемого. Для успешного лабораторного исследования необходимо производить как можно более ранний отбор проб.

Забор материалов осуществляется медицинскими работниками лечебно-профилактического учреждения, куда госпитализирован больной. Для отбора проб используют стерильную стеклянную или пластиковую посуду.

Две пробы фекалий для выделения вируса отбирают в течение 7 дней после начала болезни, но не позднее 14 дней, с интервалом 24 — 48 ч.

Носоглоточные/глоточные смывы отбирают в первые 3 — 4 дня от начала заболевания. Для получения носоглоточного/глоточного смыва можно использовать стерильную дистиллированную воду, бульон или солевой раствор. Отбор материала с помощью глоточного тампона производят в те же сроки. Тампоном протирают заднюю стенку глотки, миндалин и небных дужек. Тампоны помещают в пробирку с 1 — 2 мл раствора Хэнкса; пробу исследуют сразу или хранят в замороженном виде.

Спинно-мозговую жидкость берут в первые дни болезни в асептических условиях стерильным шприцем только по клиническим показаниям.

Пробы крови для серологической диагностики следует брать утром натощак. На всех этапах взятия и обработки крови принимают меры для предотвращения гемолиза. Первую пробу крови (5 мл) берут как можно раньше после начала болезни, вторую — на 3 — 4-й неделе, в стадии реконвалесценции. Параллельно кровь исследуют на выделение вируса — возбудителя болезни.

В случае летального исхода для исследования проводят забор секционного материала (ткани головного, спинного и продолговатого мозга и варолиева моста, содержимое кишечника и ткань кишечной стенки). При необходимости исследованию подвергают и другие материалы — ткань сердечной мышцы, печени, легких, селезенки, почек, лимфатических узлов, глаза и т.д. Пробу нужно брать как можно раньше после смерти. Ткани берут в заранее намеченном порядке, чтобы избежать их контаминации содержимым желудка и кишечника. Для иссечения тканей пользуются стерильными инструментами (отдельный набор для каждой пробы). Объем каждой пробы (кусочка) из тканей центральной нервной системы должен составлять примерно 1 куб, см; из толстой кишки иссекается сегмент длиной 3 — 5 см, содержащий фекальные массы.

Собранные пробы немедленно отправляют в лабораторию. Все пробы, кроме фекалий, спинно-мозговой жидкости и крови, сразу же после взятия помещают в транспортировочную среду. Если отправка проб задерживается, их помещают в холодильник при температуре 4 — 8 °C. Если время до отправки превышает 24 ч, пробы замораживают при температуре -20° или ниже. Следует сохранять их замороженными до получения лабораторией. Сыворотки без добавления консервантов хранят в замороженном виде. Повторное замораживание и оттаивание сывороток (больше 4 раз) может оказывать неблагоприятное влияние на титр антител.

Пробы помещают в пластиковые мешки так, чтобы избежать протечек и повреждений. Все материалы должны сопровождаться соответствующими документами — направлением на исследование с указанием наименования учреждения, адреса, телефона, адреса электронной почты, факса и сопроводительными документами, содержащими основные сведения о больном.

Транспортирование проб осуществляют с соблюдением условий «холодовой цепи» в термоконтейнерах или термосах, обеспечивающих эти условия. При транспортировании проб руководствуются санитарными правилами «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I — IV групп патогенности. СП 1.2.036-95».

При отборе, хранении и транспортировании проб руководствуются основными методическими документами:

— «Рекомендации по эпидемиологическому надзору за энтеровирусами для поддержки программы ликвидации полиомиелита» (ВОЗ, Женева, 2005);

— «Руководство по лабораторным исследованиям полиомиелита» (4-е издание. ВОЗ, Женева, 2005).

3.3.3. Выделение энтеровирусов

Основными методами лабораторного подтверждения энтеровирусной инфекции являются выделение вируса (в культуре клеток или на животных) и обнаружение РНК энтеровирусов с помощью ПЦР. Выделение вируса хотя и требует большего времени, дает наиболее однозначный ответ на вопрос об этиологии заболевания и позволяет использовать выделенный вирус для последующих эпидемиологических исследований. ПЦР обладает большей чувствительностью, большей быстротой и позволяет выявлять вирусы, не размножающиеся в культуре клеток. ПЦР используют при исследовании спинно-мозговой жидкости и материалов из верхних дыхательных путей.

Универсальной культуры клеток (или культуральной системы), пригодной для выделения всех энтеровирусов, не существует. Некоторые штаммы энтеровирусов не обладают цитопатогенностью ни для одной из известных культур клеток и могут быть выделены только с использованием чувствительных лабораторных животных, что достаточно сложно в условиях практической лаборатории. Обобщенные сведения о чувствительности наиболее распространенных в лабораториях перевиваемых культур клеток к различным энтеровирусам представлены в табл. 6.

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК К РАЗЛИЧНЫМ ЭНТЕРОВИРУСАМ

Для увеличения вероятности выделения энтеровируса из исследуемого материала целесообразно использовать не менее двух видов культур клеток, одной из которых должна быть культура клеток RD.

Эффективность исследования материала зависит от состояния клеточных культур: клетки должны сохранять высокую чувствительность к энтеровирусам, аутентичность, стабильность и быть свободными от загрязнения микроорганизмами (простейшими, бактериями, грибами, дрожжами, микоплазмами, вирусами).

Культуры клеток должны быть получены из аттестованного официального источника. Подробные рекомендации по работе с культурами клеток изложены в «Руководстве по лабораторным исследованиям полиомиелита» (4-е издание. ВОЗ, Женева, 2005).

3.3.3.2. Подготовка проб для исследования в культуре клеток

Пробы фекалий. Готовят 10 — 20%-ю суспензию фекалий в сбалансированном солевом растворе (ФСБ) с антибиотиками. Пробы обрабатывают хлороформом, к действию которого устойчивы энтеровирусы. Такая обработка позволяет избавиться от бактериального и грибкового загрязнения пробы, удаляет потенциально токсичные липиды, способствует диссоциации вирусных агрегатов.

В маркированную центрифужную пробирку последовательно добавляют 10 мл ФСБ с антибиотиками, 1 г стеклянных бус и 1 мл хлороформа. Вносят примерно 2 г фекальной пробы, плотно закрывают пробирку и интенсивно встряхивают в течение 20 мин. Центрифугируют с охлаждением в течение 20 мин. при 1500 g. Надосадочную жидкость отбирают для исследования. (Руководство по лабораторным исследованиям полиомиелита. 4-е издание. ВОЗ, Женева, 2005.)

Тампоны. Тампоны встряхивают в транспортировочной среде для высвобождения клеточного материала, избегая образования аэрозолей. Полученную суспензию обрабатывают хлороформом, как описано выше.

Спинно-мозговая жидкость. Пробы спинно-мозговой жидкости используют для исследования без дополнительной обработки. Если проба мутная, ее осветляют центрифугированием при 1600 — 2000 g в течение 10 мин.

Тканевые пробы. Готовят 10 — 20%-ю тканевую суспензию. Для этого ткани растирают в стерильной ступке, добавляя при необходимости стерильный песок и небольшое количество транспортировочной среды. Суспензию осветляют центрифугированием при 1600 — 2000 g в течение 10 мин.

3.3.3.3. Выделение и идентификация вирусов на культуре клеток

При выделении энтеровирусов с помощью чувствительных культур клеток следует руководствоваться принципами, изложенными в «Рекомендациях по эпидемиологическому надзору за энтеровирусами для поддержки программы ликвидации полиомиелита» (ВОЗ, Женева, 2005), «Руководстве по лабораторным исследованиям полиомиелита» (4-е издание. ВОЗ, Женева, 2005), МУ 4.2.2029-05 «Санитарно-вирусологический контроль водных объектов» (Москва, 2006).

Энтеровирусы обычно идентифицируют в реакциях нейтрализации инфекционности, связывания комплемента, преципитации, иммунофлюоресценции или подавления гемагглютинации. Проведение всех этих реакций возможно лишь при наличии диагностических типоспецифических иммунных сывороток высокого титра. Наиболее чувствительным, специфичным и распространенным способом идентификации является реакция нейтрализации инфекционности.

В основе реакции нейтрализации инфекционности лежит взаимодействие исследуемого вируса с гомологичной сывороткой (или смесью антисывороток), которая нейтрализует вирус, что проявляется в виде отсутствия ЦПЭ на культуре клеток. В опыте по нейтрализации вирусную суспензию, содержащую 100 ТЦД_50, смешивают в равном объеме с диагностическими сыворотками. После инкубации в течение 1 — 2 ч при 37 °C смесь вводят в культуры клеток. Иммунная сыворотка, которая предотвращает развитие ЦПЭ, указывает на тип вируса.

При постановке реакции нейтрализации для идентификации выделенного агента руководствуются вышеуказанными методическими документами.

3.3.4. Серологические методы диагностики энтеровирусных инфекций

В сыворотке пациента можно обнаружить специфические антитела (нейтрализующие, комплементсвязывающие, преципитирующие, подавляющие гемагглютинацию). Диагностика отдельных случаев заболевания только серологическими методами требует большого количества исследований со всеми известными серотипами энтеровирусов, поэтому ее предпринимают только при наличии данных, позволяющих предполагать тип этиологического агента (характерной клинической картины болезни, выделения и идентификации энтеровируса от больного, наличия вспышки заболеваний, вызванных установленным типом вируса).

Определение антител проводят с диагностической целью или при изучении эпидемиологических аспектов инфекции.

Для диагностических целей необходимы, по крайней мере, две пробы сыворотки, первую из которых берут как можно раньше после начала болезни, а вторую — через 2 — 3 недели после первой. Диагноз инфекции подтверждается значительным подъемом титра специфических антител во второй пробе. Диагностически значимым считают 4-кратный и больший подъем титра антител.

Для эпидемиологических исследований достаточно одной пробы сыворотки от каждого обследуемого; внимание следует обращать на правильный отбор обследуемых лиц и компоновку групп, чтобы получить наиболее представительные результаты.

В настоящее время для серологической диагностики используют преимущественно реакцию нейтрализации инфекционности. Другие методы выявления антител (реакцию связывания комплемента, преципитацию в агаре, подавление гемагглютинации) используют редко. В основе определения титров антител с помощью реакции нейтрализации лежит принцип взаимодействия известного вируса с гомологичными антителами, присутствующими в сыворотке, что проявляется в виде отсутствия ЦПЭ на культуре клеток.

Разведения сыворотки (двукратные или пятикратные до, приблизительно, 1:2500) смешивают с равными объемами разведения вируса, содержащего 100 ТЦД_50, в том объеме смеси, который будет введен в культуру при заражении. Смесь выдерживают 2 ч при 37 °C и вносят в 2 — 3 пробирки или лунки с культурой клеток. Контроль должны включать: а) наименьшее (1:4) разведение сыворотки для проверки токсичности; б) контроль качества клеток со средой; в) титрование рабочей дозы вируса. Титром сыворотки считают наибольшее разведение, защищающее 50% зараженных культур от действия 100 ТЦД_50 вируса.

3.3.5. Молекулярно-биологические методы диагностики энтеровирусных инфекций

Основные сведения об использовании молекулярно-биологических методов для индикации и идентификации энтеровирусов изложены в Методических указаниях 4.2.2029-05 «Санитарно-вирусологический контроль водных объектов».

Разработанные в последние годы молекулярно-биологические методы индикации и типирования энтеровирусов позволяют выявить наличие энтеровирусных геномных последовательностей в исследуемом материале уже через несколько часов после начала работы и установить их типовую принадлежность в большинстве случаев уже через 2 — 3 дня.

Обязательным условием для получения достоверных результатов при проведении молекулярно-биологической диагностики является наличие квалифицированного персонала.

Набор помещений и оборудования (ОТ-ПЦР, электрофорез), организация работы должны исключать возможность случайной контаминации исследуемых проб.

Главное преимущество молекулярно-биологических методов — быстрота и достоверность выявления и типирования возбудителей. Это создает возможность раннего этиологического диагноза и экономию на средствах лечения и длительности пребывания в стационаре (например, при снятии диагноза бактериального менингита или сепсиса). При быстрой постановке этиологического диагноза возможно проведение быстрой специфической профилактики (например, введение гамма-глобулина при вспышках энтеровирусного менингита или увеита).

Главным недостатком традиционных методов выделения и типирования энтеровирусов является их длительность.

Быстрота и специфичность определения принадлежности возбудителя могут иметь исключительно важное значение при изучении вспышек заболеваний («молекулярная эпидемиология»). Создается надежная основа для быстрого и точного установления источников инфекции, времени и путей распространения возбудителя, влияния бытовых условий, соблюдения режимов санитарии в больницах, эффективности проведения профилактических мероприятий.

Наиболее часто ОТ-ПЦР используют для диагноза энтеровирусной инфекции путем прямого выявления последовательностей геномной РНК вируса в клинических пробах. Имеется множество модификаций методики, но все методы, способные установить родовые последовательности энтеровирусов, имеют несколько общих узловых характеристик. Наиболее важной из них является использование праймеров для 5′ нетранслируемой области вирусного генома. Опубликованы последовательности многих праймеров, специфичных для различных последовательностей этого региона у разных групп энтеровирусов. Однако значительная часть праймеров не проверена на достаточно большом числе штаммов, выделенных из клинических материалов, чтобы проконтролировать их реактивность со всеми серотипами и штаммами и поэтому не оценена достаточно хорошо для использования в диагностике. Главным преимуществом панэнтеровирусной ОТ-ПЦР является быстрое выявление энтеровируса даже с малым количеством исследуемого материала (как, например, СМЖ) и вирусов, которые не размножаются в культурах клеток. Главным недостатком ОТ-ПЦР-диагностики является вариабельность результатов, зависящая главным образом от природы исследуемой пробы. Хотя в некоторых случаях ОТ-ПЦР способна уловить единичные копии вирусной РНК, иногда ее чувствительность оказывается намного ниже, например, при исследовании проб кала (но все же не ниже чувствительности культур клеток).

Молекулярное типирование энтеровирусов основано на ОТ-ПЦР и определении нуклеотидной последовательности в области генома, кодирующей белок капсида VP1. Серотип исследуемого изолята определяют сравнением полученных последовательностей с имеющимися в генном банке последовательностями прототипных энтеровирусов человека. Этот метод несоизмеримо ускоряет типирование и может быть использован для идентификации изолятов, которые трудно или невозможно типировать, используя обычные иммунологические и вирусологические методы. Метод особенно полезен для оценки родства штаммов во время вспышек.

источник