Меню Рубрики

Вопросы по натуральной оспе

• Разве натуральная оспа не была искоренена прививками?

Искоренение натуральной оспы прививками — наиболее часто повторяемый медицинский миф. Кампания по продвижению практически любой вакцины на рынке начинается с вдохновенного рассказа о» простом сельском докторе Эдварде Дженнере и его прививках коровьей оспы, благодаря которым, как нас уверяет прививочная пропаганда, мы не знаем сегодня ужасов оспы натуральной. Беспристрастное изучение материалов показывает, однако, что натуральная оспа очень мало обращала внимания на то, получал ранее человек прививку коровьей оспы или нет. Зато на «привитость» населения обращали самое пристальное внимание медицинские власти, меняя по ходу дела определение болезни и ставя привитым заболевшим любые диагнозы, за исключением правильного. Так создавалась статистика, демонстрирующая пользу прививок. Известны и прекрасно документированы примеры стран, в которых заболеваемость оспой росла по мере увеличения числа прививок от этой болезни и снижалась вместе со снижением «прививочного охвата» — Япония, Мексика, Великобритания, Филиппины. Тяжелейшая в истории Европы панъевропейская эпидемия оспы в 1871-72 гг. поразила европейские страны с высоким прививочным «охватом» — Англию, Италию, Германию. С другой стороны, в странах, вообще не имевших обязательных прививок против натуральной оспы за всю свою историю или имевших их в течение очень непродолжительного времени (Австралия, Швейцария), почти не страдали от этой болезни. Известен пример английского промышленного города Лейстера, в котором после эпидемии 1871-72 гг. горожане в нарушение существовавших тогда законов решили вообще отказаться от прививок в пользу санитарно-гигиенического контроля. После этого оспенные эпидемии никогда больше не посещали Лейстер и он, оставаясь наименее «привитым» английским городом, славился и наименьшей заболеваемостью оспой.

• Так в чем заключалось открытие Дженнера?

Никакого открытия, вероятнее всего, вообще не было. Дженнер (который на самом деле не был никаким врачом, а докторский титул купил в одном из шотландских университетов) просто сделал достоянием гласности бродившие по его родному графству Глостершир слухи о том, что перенесший коровью оспу не заболевает натуральной оспой, хотя факты, полностью опровергающие это, были ему хорошо известны. Некоторые современные исследователи аргументированно доказывают: то, что Дженнер принимал за коровью оспу, было следами натуральной оспы человека на вымени коров или на бабках лошадей вследствие контактов животных с недавно инокулированными конюхами и доярами[41]. Подробно о практике инокуляций, предшествовавших прививкам коровьей оспы, о личности Дженнера и о его бездоказательных и безнравственных экспериментах написано в главе «О натуральной оспе и не только: с чего все начиналось» моей книги «Беспощадная иммунизация» и в готовящемся сейчас к печати в одном из российских издательств переводе знаменитой книги проф. Чарльза Крейтона «Дженнер и прививки. Странная глава в истории медицины» (1888).

• Если прививки от натуральной оспы были неэффективны, почему они распространились по всему миру?

Наиболее прозорливые из врачей и хирургов того времени сразу поняли, какие блестящие перспективы заработка и усиления своего влияния в обществе откроются им, если поставить дело спасения населения с помощью коровьей оспы (или того, что Дженнер за нее принимал) на коммерческую основу. Используя свои личные связи с политической элитой общества, медики как организованная группа повсюду насаждали прививки, обогащавшие их и усиливавшие их влияние[42]. Огромное число врачей и хирургов наживалось на частной оспопрививательной практике и на работе в финансируемых государством оспопрививательных учреждениях. Сам Дженнер дважды получал от английского парламента фантастические суммы, хотя перед парламентской комиссией выступали честные медики, указывавшие на полную несостоятельность «открытия» Дженнера. Натуральная оспа, как и почти любая инфекционная болезнь, ищет для себя подходящие условия — страдающее от бедности и голода население, скученность проживания, грязь, отсутствие чистого воздуха, канализации и доступа к чистой воде. Там, где удавалось улучшить санитарно-гигиенические условия проживания людей, оспа, как и другие инфекционные болезни, неизменно шла на убыль и исчезала — что с прививками, что без них. Виконт Морли, посетивший Индию с инспекцией, сообщил в палату общин Англии, что за 30 лет, с 1877 по 1906 год, в Индии было зарегистрировано 3 344 325 смертей от натуральной оспы, причем все умершие, вероятно, были привиты, так как прививки являлись обязательными по закону. С другой стороны, по словам виконта, в любой точке Индии, где прекращались прививки и вместо них вводились строгие санитарные меры, оспа немедленно исчезала, и это правило не знало исключений. Истинную цену дженнеровским прививкам точно определил проф. Йозеф Герман, долгие годы бывший главным врачом Венской городской больницы: «Я -смотрю на все дело оспопрививания вместе с его теорией как на самое вульгарное и вредное шарлатанство, и считаю за оскорбление чистой науки, когда оспопрививанию приписываются какие-то научные признаки»[43].

• Однако оспу удалось ликвидировать и в странах, которые остаются в числе беднейших и по сей день?

Кампания ВОЗ по искоренению натуральной оспы прививками стартовала в начале 1960-х гг. и довольно быстро показала свою полную неэффективность, чего, разумеется, и следовало ожидать, будучи знакомым с историей прививок от этой болезни.. В 1967 г. ВОЗ без лишнего шума приняла новую «интенсифицированную» программу, в которой акцент был перенесен с прививок на раннюю изоляцию заболевших и наблюдение за контактировавшими с ними. Именно санитарно-гигиенические мероприятия, а не прививки, стали ключом к искоренению натуральной оспы[44].

Предпосылками, к ликвидации натуральной оспы были биологические особенности этой болезни: генетическая стабильность возбудителя и сравнительно невысокая восприимчивость к нему людей, принадлежность натуральной оспы к антропонозам (то есть к болезням, поражающим лишь человека), отсутствие животных и насекомых переносящих возбудителя, а также отсутствие естественных природных очагов и скрытого «здорового» носительства инфекции (заразившийся оспой человек ею непременно заболевает). Все это сделало возможным ликвидацию натуральной оспы в масштабах планеты. Однако публике рассказывали и рассказывают только о спасительных прививках. Так возник Миф о победе над оспой благодаря массовой вакцинации.

• Насколько безопасными были прививки против натуральной оспы?

Тяжелейшие осложнения как тень сопровождали прививки с самого начала их появления. Почти неизменно за прививочной процедурой следовало инфицирование в месте укола или надреза на коже, лечение которого приносило вакцинаторам дополнительные барыши. Поскольку в течение почти всего XIX в. прививки делались методом «от руки к руке», с ними активно разносились сифилис, туберкулез, проказа. Тяжелыми и нередко смертельными осложнениями были ползучая и генерализованная вакцинии и энцефалиты. Еще до того, как была объявлена победа над оспой, США и Англия отказались от оспенных прививок из-за тяжелых осложнений, которые, несмотря на улучшение качества вакцин, продолжали поражать детей и взрослых. Так, в США (при фактическом отсутствии самой болезни) за 1959-1968 гг. оспенные прививки стали причиной только официально зарегистрированных 68 смертей — 60 при первичной вакцинации и 8 при ревакцинации[45]; многократно больше людей было ими искалечено. В одном Ленинграде за четыре года в клинике прививочных реакций НИИДИ после оспенных прививок было госпитализировано 173 ребенка, из них 37 с поражением центральной нервной системы (энцефалопатия — 29, энцефалит и миелит — по 3, менингоэнцефалит и серозный менингит — по 1), остальные с генерализованной вакцинией, вакцинальной экземой, ползучей вакцинией, обострением других болезней на фоне прививок[46]. Заявление ВОЗ о ликвидации натуральной оспы в 1980 г. положило конец прививкам и сохранило сотни жизней, которые иначе были бы принесены в жертву постпрививочным осложнениям.

• Покончено ли с натуральной оспой навсегда?

Ответа на этот вопрос никто не знает. В научных лабораториях как минимум двух стран, США и России, все еще сохраняются вирусы натуральной оспы. Их не уничтожают отчасти и потому, что они могут потребоваться для создания вакцин, если натуральная оспа вернется. С другой стороны, сохранение вирусов натуральной оспы оставляет вероятность того, что рано или поздно они могут попасть в руки террористов. Однако вряд ли кто-либо, знакомый с историей натуральной оспы, всерьез предположит, что эти вирусы будут использованы в качестве биологического оружия. В природе существуют, а в специальных лабораториях культивируются и сохраняются намного более опасные для человека микроорганизмы, а методы генной инженерии могут создавать их бесчисленные комбинации, исключающие защиту с помощью вакцин, если даже в такую защиту и верить. Тем не менее целый ряд фармацевтических компаний активно разрабатывает по заказам правительств разных стран вакцины от натуральной оспы.

Razzel P. Edward Jenner’s Cowpox Vaccine: The History of a Medical Myth. Caliban Books, 2 nd ed., 1980.

источник

Инкубационный период натуральной оспы 5-17 дней, в среднем 14 дней. Различают начальный период (2-4 дня), период высыпания и реконвалесценции. В начальном периоде появляется озноб, повышение температуры тела (до 40°С), мучительная головная боль, тошнота, рвота, жажда; характерный признак натуральной оспы — сильная боль в крестце (!), больные жалуются также на боли в пояснице, конечностях.

На высоте лихорадки появляется инициальная сыпь (до появления типичной сыпи!) в виде участков гиперемии с кореподобной, розеолезной, эритематозной сыпью, иногда геморрагической (Т.А. Левитов). Начальная сыпь появляется по обеим сторонам грудной клетки в области грудных мышц до подмышечных впадин; ниже пупка в паховых складках и на внутренних поверхностях бедер (треугольник Симона). Сыпь проходит стадии: пятна, папулы, везикулы, пустулы, корочки. С отторжением корочки образуются глубокие рубцы (оспины), которые остаются на всю жизнь («рябое лицо»). Одновременно с высыпаниями на коже, сыпь появляется на конъюнктивах, слизистых оболочках носа, ротоглотки, гортани, трахеи, бронхов, прямой кишки, мочеиспускательного канала, женских половых органов. Энантемы вскоре превращаются в эрозии.

Нагноение пузырьков происходит на 8-9-й день болезни; в этот период состояние больных вновь ухудшается, появляются признаки токсической энцефалопатии (бред, возбуждение, у детей возможны судороги). Далее наступает период подсыхания и отпадения корочек, который длится 1-2 недели; состояние и самочувствие больных постепенно улучшается. На лице и коже волосистой части головы образуются многочисленные глубокие рубцы. В периферической крови, на фоне нагноения элементов сыпи определяется лейкоцитоз; в особо тяжелых случаях — сдвиг влево до миелоцитов и юных клеток.

От типичного высыпания в тяжелых случаях могут быть отклонения, которые проявляются следующими формами сыпи: сливной папулезно-геморрагической и оспенной пурпурой.
Натуральная оспа у привитых, в случаях ее возникновения, отличается легкостью течения (вариолоид), более продолжительным инкубационным периодом (до 17 дней) и быстрым (через 2 недели) выздоровлением. У привитых возможна оспа без сыпи и с кратковременной лихорадкой, с необильной сыпью, вплоть до единичных элементов.

Сыпь при натуральной оспе, в отличие от ветряночной сыпи, характеризуется локальным мономорфизмом, многокамерностью и пупковидным втяжением в центре пузырька (Г.П. Руднев).

Осложнениями натуральной оспы могут быть энцефалиты, менингоэнцефалиты, пневмонии, панофтальмиты (ведущие к слепоте), кератиты (образование бельма), ириты, сепсис.
Диагностика натуральной оспы. Диагноз натуральной оспы в период эпидемии не представляет трудностей. При спорадических заболеваниях диагноз всегда труден и ответственен. Для вирусологического исследования берут содержимое высыпаний на коже, слизистых оболочках и кровь. Присутствие вируса в крови определяют с помощью электронной микроскопии, микропреципитацией в агаре иммунофлюоресцентным методом. Экспресс-диагностика возможна в пределах первых суток, но результат ее является предварительным. Окончательным результатом считается выделение специфического вируса- возбудителя.

В практических условиях диагноз первого случая заболевания натуральной оспой всегда сопряжен с возможными ошибками. В начальном периоде натуральную оспу дифференцируют с корью, скарлатиной, геморрагической лихорадкой; несколько позднее-с ветряной оспой, везикулезным гамазориккетсиозом, менингококкцемией, генерализованной осповакциной. В странах Африканского континента проводят дифференциальный диагноз с оспой обезьян. Клиническое отличие от последней — появление увеличенных ЛУ до периода высыпания.

Лечение натуральной оспы. Проводят внутримышечное введение противооспенного гамма-глобулина по 3-6 мл; внутрь — метисазон по 0,6 г 2 раза в день в течение 4-6 суток. При выраженной гнойной инфекции показаны антибиотики с широким спектром действия (цефалоспорины, макролиды, пенициллины). С учетом тяжести больного и ведущих симптомов проводят патогенетическую и симптоматическую терапию. Важна диетотерапия. Необходим внимательный, чуткий уход. Летальность при натуральной оспе в различные эпидемические вспышки колебалась от 2 до 100%. Выписка больных проводится не ранее 40 дней со времени заболевания.

Единственным источником инфекции является больной человек на протяжении всего периода болезни (до отпадения корочек). Натуральная оспа относится к конвенционным (особо опасным) ИБ. Все больные должны быть госпитализированы, изолированы. Контактировавшие с больным лица изолируются на 17 дней (максимальный период инкубации), подвергаются вакцинации против оспы. Медицинский персонал должен работать в противочумной одежде III типа с маской. В эпидемическом очаге проводят текущую и заключительную дезинфекцию.

источник

Цель:На основе знаний биологии вируса натуральной оспы (ВНО), особенностей его взаимодействия с макроорганизмом уметь обосновать тактику лабораторной диагностики, специфическую профилактику вызываемого им заболевания.

Классификацию, морфобиологическую характеристику вируса натуральной оспы.

Особенности эпидемиологии, патогенеза и иммунитета при натуральной оспе.

Лабораторную диагностику натуральной оспы: материал, методы.

Специфическую профилактику натуральной оспы.

Вскрывать зараженный куриный эмбрион, проводить индикацию вируса натуральной оспы.

Особенности вируса натуральной оспы, определяющие принадлежность вызываемого им заболевания к группе особо опасных, карантинных инфекций.

Классификация вируса натуральной оспы. Структура вириона и его антигенная характеристика.

Культивирование вируса натуральной оспы и методы индикации.

Особенности эпидемиологии, патогенеза и иммунитета при натуральной оспе.

Материал и методы лабораторной диагностики натуральной оспы.

Специфическая профилактика натуральной оспы. Глобальная ликвидация натуральной оспы. Вклад СССР в программу ВОЗ ликвидации натуральной оспы.

Вирус основакцины: его происхождение, использование в генной инженерии.

Задания, выполняемые в ходе занятия (УИРС):

Провести вирусологическое исследование с целью диагностики натуральной оспы, для чего: вскрыть куриный эмбрион, зараженный материалом от обследуемого с диагнозом «натуральная оспа»; провести индикацию вируса ( макроскопически, микроскопически при импрегнации серебром). Сделать вывод.

Методические указания, выполняемые в ходе УИРС:

Проведите вирусологическое исследование с целью диагностики натуральной оспы, для чего (начало исследования см занятие №30)

Вскройте куриный эмбрион, зараженным материалом от обследуемого с диагнозом «натуральная оспа»; проведите индикацию вируса (макроскопически, микроскопически при импрегнации серебром). Перед вскрытием скорлупу над воздушной камерой обработайте дезинфектантом (70% спирт), стерильными ножницами срежьте ее на 2-3 мм выше границы воздушной камеры. Пинцетом снимете белковую оболочку и подрежьте ножницами хорион-аллантоисную оболочку (ХАО) на границе с воздушной камерой. Содержимое эмбриона аккуратно вылейте в стерильную чашку Петри, а ХАО извлеките пинцетом в стерильную чашку Петри и с физ. раствором, расправьте и изучите макроскопически.

Если в исследуемом материале (содержимое везикул) имелся вирус натуральной оспы, то на ХАО через 72 ч инкубирования эмбрионов обнаруживаются мелкие, диаметром около 1 мм, белые, плотные, резко ограниченные бляшки.

При отсутствии следов поражения результаты исследования считаются отрицательными.

Для микроскопического исследования содержимого бляшек приготовьте препарат.Для этого ножницами вырежьте кусочек ХАО, поместите на предметное стекло и разотрите с помощью второго предметного стекла. Препараты высушите на воздухе и окрасьте по Морозову.

Техника окраски по Морозову.

Налить реактив №1 (фиксатор – жидкость Руге) на 1-3 минуты, тщательно промыть водой.

Налить реактив №2 (раствор танина), нагреть до отхождения паров, дать остыть, тщательно промыть водой.

Налить реактив №3 (раствор нитрата серебра), нагреть до отхождения паров, дать остыть, тщательно промыть водой.

Высушить и микроскопировать и иммерсионной системой. В случае положительного результата в препарате выявляют тельца Пашена.

На основании полученных результатов сделайте заключение, заполните бланк-направление и бланк – ответ из вирусологической лаборатории.

Для серологической идентификации полученной культуры вируса используют центрифугат суспензии ХАО и диагностическую сыворотку. Идентификацию проводят в реакции нейтрализации (РН), реакция торможения гемагглютинации (РТГА, РПГА.

Назовите свойство вируса натуральной оспы (ВНО), позволяющие обнаружить его в световом микроскопе.

Обоснуйте возможность использования вирусоскопической диагностики при натуральной оспе.

Назовите способы индикации ВНО при его культивировании в курином эмбрионе и культуру клеток ткани; какие свойства вируса лежат в их основе.

Кем и когда был предложен метод специфической профилактики натуральной оспы?

Назовите свойства вируса оспы коров, позволившие использовать его для специфической профилактики натуральной оспы у людей.

Назовите стратегию и тактику программы ВОЗ глобальной ликвидации натуральной оспы. Кем и когда впервые она была предложена.

В каком году был зарегистрирован в мире последний случай заболевания натуральной оспы и с какого года в России не проводиться плановая вакцинация?

Где сохраняются в настоящее время штаммы ВНО?

В чем заключается суть получения генно-инженерных вакцин на основе вируса осповакцины?

источник

Натуральная оспа Часто задаваемые вопросы. Что нужно знать об оспе? Оспа – это инфекционное и часто смертельное заболевание, вызываемое вирусом натуральной. — презентация

Презентация была опубликована 5 лет назад пользователемТатьяна Шаповалова

Презентация на тему: » Натуральная оспа Часто задаваемые вопросы. Что нужно знать об оспе? Оспа – это инфекционное и часто смертельное заболевание, вызываемое вирусом натуральной.» — Транскрипт:

1 Натуральная оспа Часто задаваемые вопросы

2 Что нужно знать об оспе? Оспа – это инфекционное и часто смертельное заболевание, вызываемое вирусом натуральной оспы (ВНО). Оспа относится к высококонтагиозным болезням. В среднем один больной заражал пять человек, хотя нередко эта цифра могла быть значительно больше. Вакцинация против оспы резко снижает восприимчивость к инфекции. Фото ВОЗ

3 Насколько опасна угроза оспы? В 1980 г. на 33-й Всемирной ассамблее здравоохранения было объявлено о глобальной ликвидации оспы и рекомендовано прекратить вакцинацию против данной инфекции. К настоящему времени население родившееся после 1980 года не имеет иммунитета против оспы, а люди старшего возраста, ранее вакцинированные против оспы, имеют ослабленный иммунитет. Возможность применения вируса натуральной оспы, как потенциального оружия биотеррористов, рассматривается сейчас, как реальная угроза.

4 Каковы клинические проявления оспы? Начальные симптомы оспы включают головную боль, слабость, бессонницу, тошноту, боли в мышцах и суставах, высокую температуру. После лихорадки появляются высыпания на коже, которые проходят стадию папулы, везикулы, пустулы и стадию образования корок. Корки отпадают примерно через три недели, оставляя на коже шрамы в виде оспин.

5 Как передается оспа? Вирус натуральной оспы передается воздушно- капельным путем. Иногда через кожу при непосредственном соприкосновении с поражённой кожей больного или инфицированными им предметами. Нет сведений о случаях распространения оспы насекомыми или животными.

6 Когда появляются первые симптомы заболевания, после заражения вирусом натуральной оспы? Средний инкубационный период у большинства больных равен дням. В течение инкубационного периода человек чувствует себя хорошо и не распространяет инфекцию.

7 Могу ли я получить вакцину против оспы? Население не имеет возможности получить вакцину против оспы, однако, в случае вспышки, имеется запас вакцины, для всех, кому будет необходимо.

8 Как долго длится действие вакцины против оспы? Прошлый опыт свидетельствует о том, что первая доза вакцины дает защиту от оспы на период от трех до пяти лет, после чего иммунитет снижается. Если человеку затем проводится ревакцинация, иммунитет сохраняется дольше.

9 Существует ли лечение от оспы? В настоящее время для лечения оспы перспективным является использование Цидофоир (ингибитор вирусной ДНК-полимеразы). Цидофоир– противовирусный препарат широкого спектра действия. Для лечения у человека не применялся, но широко тестировался на лабораторных животных. Кроме того, больным оспой необходима поддерживающая терапия и антибиотики против возможной сопутствующей бактериальной инфекции.

Читайте также:  Чем вызывается вирус ветряной оспы

10 Как долго вирус натуральной оспы сохраняет жизнеспособность? Вирус натуральной оспы устойчив во внешней среде. Длительное время сохраняется в замороженном виде (при t от -20 до -70°С сохраняет жизнеспособность свыше 5 лет), а также после лиофильного высушивания. Устойчив к глицерину и 1% фенолу (под действием 1% фенола инактивируются только через сутки). Погибает при нагревании: при t = 60°С — в течение 30 мин. Под действием 5% хлорамина разрушается через 2 часа.

11 Почему сейчас прививка от оспы не обязательна? Последний случай оспы был зарегистрирован в 1978 году. В 1980 году на 33-й Ассамблее ВОЗ было объявлено о ликвидации оспы и рекомендовано прекратить вакцинацию против данной инфекции. Болезнь была ликвидирована во всем мире, вакцинация больше не требуется для предупреждения заболевания.

12 Какое современное состояние по изучению вируса натуральной оспы? В настоящее время продолжаются эксперименты по изучению вируса натуральной оспы. Исследования направлены на создание эффективных противовирусных препаратов, современных противооспенных вакцин и средств экспресс- диагностики. Все исследования проводятся под контролем ВОЗ.

источник

Методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, учреждений и структурных подразделений других федеральных органов исполнительной власти, выполняющих в установленном порядке работы по диагностике натуральной оспы и ее дифференциации от клинически сходных заболеваний, а также осложнений после прививки оспенной вакцины. Методические указания определяют правила организации и выполнения исследований при лабораторной диагностике натуральной оспы: взятие материала от заболевшего, подготовка проб для исследования, хранение, транспортирование проб, проведение диагностического исследования с помощью методов экспресс-диагностики и выделения возбудителя, учет и регистрация результатов.

Ф едеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей
и благополучия человека

Л абораторная диагностика
натуральной оспы

1. Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Ю.В. Демина, Е.Б. Ежлова, Н.В. Шеенков); ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (С.С. Маренникова, С.Н. Щелкунов, Е.И. Рябчикова, М.П. Богрянцева, Е.В. Гаврилова, А.П. Агафонов, А.Н. Сергеев); ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН (Г.Р. Мацевич, Н.Н. Янова); ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН (Э.Б. Гурвич).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 14 декабря 2011 г.

3. Введены в действие 14 декабря 2011 г.

4. Введены взамен Инструкции по лабораторной диагностике натуральной оспы, утвержденной Заместителем министра здравоохранения СССР П.Н. Бургасовым 4.04.1972.

Руководитель Федеральной службы

по надзору в сфере защиты прав

потребителей и благополучия человека,

Главный государственный санитарный

врач Российской Федерации

Дата введения: 14 декабря 2011 г.

Лабораторная диагностика натуральной оспы

1.1. Методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, учреждений и структурных подразделений других федеральных органов исполнительной власти, выполняющих в установленном порядке работы по диагностике натуральной оспы и её дифференциации от клинически сходных заболеваний, а также осложнений после прививки оспенной вакцины.

1.2. Методические указания определяют правила организации и выполнения исследований при лабораторной диагностике натуральной оспы (далее оспы): взятие материала от заболевшего, подготовка проб для исследования, хранение, транспортирование проб, проведение диагностического исследования с помощью методов экспресс-диагностики и выделения возбудителя, учет и регистрация результатов.

1.3. Методические указания разработаны в соответствии с Федеральным законом от 31 марта 1999 г. «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» № 52-ФЗ [1], Федеральным законом от 10 января 2002 г. «Об охране окружающей среды» № 7-ФЗ [2], постановлением Правительства Российской Федерации от 15 сентября 2005 г. № 569 «О положении об осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора в Российской Федерации» (Собрание законодательства Российской Федерации, 2005, № 39, ст. 3953) [3], требованиями Международных медико-санитарных правил (2005 г.) [4, 5].

1. Федеральный закон от 31.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».

8. СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I — II групп патогенности (опасности)».

9. СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I — IV групп патогенности».

10. МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I — IV групп патогенности».

11. МУ 3.3.1.2044-06 «Проведение вакцинопрофилактики натуральной оспы».

13. МУ 3.4.2552-09 «Организация и проведение первичных противоэпидемических мероприятий в случаях выявления больного (трупа), подозрительного на заболевания инфекционными болезнями, вызывающими чрезвычайные ситуации в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения».

3.1. Натуральная оспа — острое инфекционное высококонтагиозное особо опасное заболевание вирусной этиологии, относящееся к карантинным инфекциям. Возбудитель — ДНК-содержащий вирус, принадлежащий к семейству Poxviridae , роду Orthopoxviruses .

3.2. Естественным резервуаром вируса является больной (а также умерший) человек. Заболевший натуральной оспой человек заразен от начала болезни до полного освобождения от корок. Заражение происходит воздушно-капельным, воздушно-пылевым или контактно-бытовым путями; вирус может также передаваться внутриутробно. Наиболее заразительным является период с 4 по 9 день болезни, когда во внешнюю среду при разговоре, кашле и чихании больного с отделяемым слизистых полости рта и зева выделяется большое количество вируса. В дальнейшем источником вируса является в основном содержимое кожных элементов и вируссодержащая пыль из отпавших и подсыхающих корок. Помимо этого заражение может произойти за счет контаминированных вирусом воздуха, белья больного и предметов.

3.3. В результате успешно проведенной под эгидой Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) международной программы (1958 — 1980 гг.) натуральная оспа была искоренена во всем мире. По рекомендации глобальной комиссии по сертификации ликвидации оспы вакцинация против этой инфекции была отменена в 1980 г.

По решению ВОЗ, коллекции штаммов этого возбудителя сохраняются для научных целей в двух Сотрудничающих центрах ВОЗ, регулярно контролируемых этой организацией:

• по диагностике ортопоксвирусных инфекций и музей штаммов и ДНК вируса оспы на базе ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (Россия, Новосибирская область, р. п. Кольцово);

• по оспе и другим поксвирусным инфекциям на базе Центра контроля и предупреждения инфекционных заболеваний (США, Атланта).

3.4. В освобожденном от натуральной оспы мире при отсутствии природного резервуара возбудителя этой инфекции эпидемический процесс может возникнуть снова только при артифициальном заражении. В этом случае источником инфекции может служить вируссодержащий материал, привнесенный в окружающую среду в результате совершения акта биотерроризма или иных причин (внутрилабораторное инфицирование, вскрытие затерянных или забытых хранилищ вируса, а также захоронений умерших от оспы, в некоторых из которых благодаря особым условиям не исключено сохранение жизнеспособного вируса). В результате может возобновиться трансмиссия оспы с передачей инфекции от человека к человеку. При этом резкое падение коллективного иммунитета к оспе у населения и его полное отсутствие у лиц, родившихся после отмены оспопрививания, может привести к более агрессивному, чем ранее, распространению инфекции.

3.5. Опыт борьбы с завозными вспышками оспы в прошлом показал, что клинический диагноз у первых заболевших этой инфекцией в большинстве случаев оказывался неверным. На сегодняшний день эта ситуация усугубляется тем, что современное поколение инфекционистов не встречалось с оспой и знает о ней только по описанию в литературе. В этой связи лабораторная диагностика как никогда раньше становится важнейшим звеном в предупреждении распространения оспы.

В случае чрезвычайной ситуации санитарно-эпидемиологического характера диагностические исследования без выделения возбудителя натуральной оспы (молекулярно-генетические и иммунологические) по поручению Главного государственного санитарного врача Российской Федерации могут осуществлять лаборатории, имеющие лицензии на проведение экспериментальных и диагностических видов работ с возбудителями инфекционных заболеваний 1 группы патогенности.

Врач, выявивший на дому больного с подозрением на натуральную оспу, обязан незамедлительно организовать следующие первичные противоэпидемические мероприятия:

• изолировать больного, снабдив его бельем, посудой, приемником выделений, предметами ухода за больным, личной гигиены и прочими необходимыми вещами, закрыть окна и дверь;

• принять меры для исключения контактов больного с окружающими;

• организовать проведение текущей дезинфекции в помещении, где находится больной до момента его госпитализации;

• срочно известить доступными способами руководство своего учреждения о выявлении подозрительного на натуральную оспу больного;

• собрать предварительные сведения о возможном источнике заражения и круге контактировавших с больными лиц.

Далее информация о выявлении подозрительного на натуральную оспу больного должна быть незамедлительно передана в местные и вышестоящие органы и учреждения санитарно-эпидемиологического надзора по подчиненности, Федерального медико-биологического агентства, отделы и управления здравоохранением по подчиненности, территориальные органы власти и заинтересованные ведомства.

Указанные органы направляют в очаг по месту выявления (или госпитализации) больного группу в составе эпидемиолога, опытного инфекциониста и вирусолога для верификации диагноза и эпидемиологического расследования.

Порядок проведения противоэпидемических и дезинфекционных мероприятий, направленных на обеспечение общественной и личной безопасности граждан при локализации и ликвидации очага (очагов) натуральной оспы при ее появлении на территории Российской Федерации вследствие биотеррористических акций или иных обстоятельств определен в МУ 3.1/3.5.2497-09 «Организация и проведение противоэпидемических и дезинфекционных мероприятий при натуральной оспе» [12].

4.1. Взятие проб осуществляют врачи вирусологи, прошедшие специальную подготовку и имеющие недавнюю (в пределах 3 лет) успешную прививку против оспы. Если к взятию проб привлекается невакцинированный сотрудник, то это может быть только тот, который не имеет противопоказаний к вакцинации. Последняя может потребоваться при подтверждении диагноза оспы. Для взятия проб необходимо иметь с собой упаковку с соответствующими стерильными инструментами, одноразовой пластиковой лабораторной посудой и материалами, перечень которых см. в приложении 1. Процедура взятия проб должна выполняться в соответствии с правилами противоэпидемического режима: работа в защитной одежде, маске, очках и перчатках, соблюдение мер личной и общественной безопасности и др. (см. СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I — II групп патогенности (опасности)») [8].

• содержимое кожных поражений (в зависимости от стадии болезни — везикул, пустул, корочки, соскоб со дна пузырьков, макул или папул);

• мазки с задней стенки глотки и миндалин;

• в случае смерти — кусочки органов умерших.

4.2.1. Для вирусологического и других исследований содержимое везикул или пустул отсасывают туберкулиновым шприцем, прокалывая стенку пузырька у его основания; для этой цели может использоваться игла, конец которой помещают над открытой пробиркой и несколько наклоняют его вниз, что облегчает отток жидкости. При недостаточной наполненности пузырьков в периоде подсыхания пустул для получения пробы применяют два способа. После вскрытия пузырька скальпелем или другим острым инструментом сбор остатков жидкости производят небольшими ватными тампонами (на коротком стержне), которые помещают затем в сухую пробирку, отламывая при необходимости стержни. При затруднении в использовании вышеописанного способа скальпелем или маленькими ножницами срезают верхушки пузырьков и помещают их в отдельную пробирку. Корочки отделяют глазным пинцетом.

Собранный из 6 — 10 однородных кожных элементов больного материал, как уже указывалось, помещают в пластиковые пробирки или флаконы с герметически завинчивающимися крышками. Крышки дополнительно фиксируют — например, парафинизированным полиэтиленом (парафильмом), липкой лентой, расплавленным парафином [14].

Взятие пробы для электронноскопического исследования производят путем легкого прикосновения подготовленной электронноскопической сеточки к основанию вскрытого пузырька (везикулы или пустулы). Используя этот же прием, следует сделать отпечатки на не менее чем трех сеточках, каждый раз несколько меняя давление на основание пузырька. Материал на сеточках должен просохнуть на воздухе. Сетки помещают в специальную коробку или ячейку коробки и записывают, какая ячейка использовалась для данного образца. Коробку обертывают фольгой или адгезивной пленкой.

Помимо этого, на обезжиренных предметных стеклах делают мазки соскоба или содержимого пузырьков, а также мазки-отпечатки с основания кожных элементов и мест удаления плотно «сидящих» корочек (по 2 — 3 мазка). Мазки высушивают на воздухе в течение 20 мин. Затем стекла маркируют, складывают таким образом, чтобы они не соприкасались между собой той стороной, на которой сделан мазок, и помещают их в специальную пластиковую коробку для стекол. Коробку заворачивают в фольгу или обертывают адгезивной пленкой.

Внимание! Мазки на предметных стеклах и электронноскопических сеточках могут быть сделаны у постели больного только в том случае, если у берущего пробы вирусолога имеются соответствующие навыки.

В противном случае это делается в диагностической лаборатории, куда будут направлены пробы.

4.2.2. При отсутствии у больного кожных поражений, что может иметь место в ранней стадии болезни или при некоторых формах оспы (оспа без сыпи, ранняя геморрагическая оспа), берут мазки с задней стенки глотки и миндалин. Процедуру осуществляют с помощью ватных тампонов на стержне, который затем опускают в пластиковую пробирку или флакон, не добавляя жидкости, и герметически ее закрывают. Мазки из зева следует брать и при недостаточном количестве материала из кожных поражений.

4.2.3. Кровь для обнаружения вируса берут из локтевой вены в количестве 4,5 мл шприцем, в который предварительно набирают 0,5 мл стерильного антикоагулянта. Кровь выливают в пробирку, которую осторожно встряхивают, чтобы предотвратить свёртывание крови, и герметично закрывают. Одновременно берут кровь (5 — 10 мл) для получения сыворотки, необходимой для серологического исследования, и 1 мл для проведения МПЦР.

4.4. В случае смерти больного с подозрением на оспу при аутопсии берут фрагменты кожи с поражениями, кусочки лимфатических узлов и внутренних органов (легких, печени, почек, селезёнки) предпочтительнее с макроскопически видимыми поражениями отдельно для вирусологического и патогистологического исследования. В последнем случае кусочки органов размером до 1 ´ 2 ´ 3 см помещают в пластиковые флаконы, используя отдельный флакон для каждого кусочка, и заливают 8 мл 4 %-го раствора параформальдегида. Фиксация образцов в параформальдегиде обеспечивает их обеззараживание в течение 48 ч. Порядок обращения с образцами для вирусологического исследования аналогичен описанному в пп. 4.2, 4.3 и разделе 5.

4.5. После завершения сбора образцов от больного (больных) все инструменты и подсобные материалы, а также использованные средства индивидуальной защиты (перчатки, халат и пр.) дезинфицируют согласно требованиям СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I — II групп патогенности (опасности)» [8].

Упаковку и транспортировку проб для исследования осуществляют в соответствии с требованиями СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I — IV групп патогенности» [9], МУ 3.4.2552-09 «Организация и проведение первичных противоэпидемических мероприятий в случаях выявления больного (трупа), подозрительного на заболевания инфекционными болезнями, вызывающими чрезвычайные ситуации в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения» [13] и WHO/HSE/EPR/2008.10 «Рекомендации по правилам перевозки инфекционных материалов» [14].

Маркированные и герметично закрытые пробирки, флаконы с пробами и коробку с мазками от каждого больного помещают отдельно, перекладывая адсорбирующим материалом (например, ватой) в двойной пластиковый пакет, который затем заклеивают или запаивают. Количество адсорбирующего материала должно быть достаточным для того, чтобы поглотить всю жидкость в случае повреждения упаковки. Не допускается упаковка образцов материалов от разных людей в один и тот же пакет.

Заклеенные пакеты с образцами помещают в закрывающийся (с возможностью опломбирования) металлический или пластиковый контейнер, на дне которого размещают адсорбирующий материал (марлевая салфетка , ткань, вата и пр.), смоченный раствором дезинфицирующего средства.

Контейнер с материалом подписывают (фамилия, имя, отчество больного (больных), дата взятия и вид материала), опечатывают, помещают в специальный переносной термоизолирующий контейнер, укомплектованный охлаждающими элементами, и транспортируют в лаборатории, указанные выше (см. п. 3.6). Транспортирование осуществляется нарочным, информированным о правилах доставки материала.

Сопроводительные документы составляют в двух экземплярах: один отправляют вместе с пробами в лабораторию, второй (копия) остается у лица, направляющего пробы на исследование. В сопроводительном документе указывают фамилию, имя, отчество, возраст больного, диагноз, даты начала заболевания, появления сыпи, взятия материала, характера материала для исследования, фамилию врача, взявшего пробы. Указывают, был ли привит заболевший против оспы и примерную дату вакцинации, отмечают наличие или отсутствие рубцов после вакцинации, характер контакта с предполагаемым источником инфекции. Указывают адрес места назначения, адрес, фамилию и телефон отправителя. Делается надпись: «Инфекционный материал». Перед транспортированием срочно извещают специализированную лабораторию, в которую направляется материал.

Все работы по проведению исследования материала проводят с соблюдением требований СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I — II групп патогенности (опасности)» [8].

Схема проведения лабораторного исследования приведена на рис. 3 (прилож. 8).

6.1. Учитывая, что фактор времени при появлении оспы имеет огромное значение для эффективности противоэпидемических мероприятий, обработка и исследование взятых у больных (или подозреваемых на заболевание) проб должны начинаться немедленно после поступления материала в лабораторию. В ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» исследование начинают одновременно методами ускоренной диагностики, включая электронную микроскопию, и путем выделения возбудителя. В других лабораториях, имеющих соответствующую лицензию, используют молекулярно-генетические и иммунологические методы ускоренной диагностики.

К методам ускоренной диагностики относятся:

• электронная микроскопия содержимого кожных поражений и мазков из глотки;

• обнаружение ортопоксвирусного антигена в обработанных пробах с помощью соответствующей тест-системы ИФА;

• выявления антител к ортопоксвирусам в сыворотке крови в соответствующей тест-системе ИФА;

• полимеразно-цепная реакция (ПЦР), в т.ч. мультиплексная полимеразная цепная реакция (МПЦР).

Проведение исследования с помощью электронной микроскопии и иммуноферментного анализа позволяет дать ответ в течение 2 — 4 ч после начала исследования. (Если используется набор реагентов для ИФА с планшетами, требующими предварительной сенсибилизации, то время проведения ИФА увеличивается до 22 — 26 ч). Эти методы не позволяют дифференцировать вирус оспы от других патогенных для человека ортопоксвирусов (вирусов вакцины, оспы обезьян и оспы коров). МПЦР обеспечивает не только идентификацию ДНК вируса оспы, но и ее дифференциацию от близкородственных патогенных для человека ортопоксвирусов. Время проведения теста 5 — 6 ч.

6.2. Обнаружение при электронной микроскопии вирионов группы герпеса при отсутствии вирионов оспенной группы и ортопоксвирусного антигена позволяет дать заключение о герпетической природе заболевания. При наличии в исследуемом материале ортопоксвирусных вирионов и/или ортопоксвирусного антигена внутривидовая дифференциация осуществляется с помощью МПЦР.

6.3. Для подтверждения диагноза и всесторонней характеристики возбудителя проводят выделение возбудителя на куриных эмбрионах или в культуре клеток.

6.4. При необходимости установления диагноза при отсутствии соответствующих тест-систем ИФА и невозможности исследовать пробу с помощью МПЦР можно использовать вспомогательные методы, описанные в разделе 10.

При подготовке проб следует учесть необходимость сохранить часть материала для контрольных и повторных исследований.

7.1. Для электронной микроскопии везикулярную и пустулезную жидкости исследуют неразведенными и в разведении 1:5 (на дистиллированной воде). При исследовании корок, их (в количестве 1 — 2) растирают в маленькой фарфоровой ступке или помещают на часовое стекло, покрывают 1 — 2 каплями дистиллированной воды, через 5 — 10 мин измельчают скальпелем и слегка растирают. Жидкая фракция представляет собой материал для исследования.

Мазки-отпечатки или мазки соскобов со дня пузырьков, макул или папул смывают 1 — 2 каплями дистиллированной воды и полученную взвесь используют для приготовления препаратов для электронноскопического исследования (негативное контрастирование). Последние готовят следующим образом. На покрытое парафином предметное стекло помещают последовательно три капли: 1) исследуемого материала; 2) дистиллированной воды и 3) 2 %-го раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты с рН 7,0. Заранее подготовленную (покрытую формваром или парлодием и напыленную углем) сетку для адсорбции вируса опускают на 30 — 60 с в каплю исследуемого материала, затем (для промывки) на 3 с в каплю дистиллированной воды и для контрастирования препарата на 30 — 40 с в каплю фосфорно-вольфрамовой кислоты. После каждого погружения сетку просушивают лёгким прикосновением её края к фильтрованной бумаге * .

* Обычно используют сетки, предназначенные для исследований взвесей. Их приготовление описано в прилож. 2.

Электронноскопические сетки, на которые была нанесена проба у постели больного, следует обрабатывать, начиная с промывки * .

* Для негативного контрастирования может быть использован также насыщенный водный или спиртовый раствор уранилацетата.

Если в зоне повышенной безопасности нет электронного микроскопа, то перед выносом сеток для просмотра их обеззараживают парами 37 %-го формальдегида и ультрафиолетовым облучением. Один из способов описан ниже. В 60 мм чашку Петри, содержащую приготовленные сетки, помещают небольшой пластиковый контейнер (15 мм в диаметре) с 10 каплями концентрированного (37 %-го) раствора формальдегида. Чашку Петри закрывают и ставят в большую (150 мм) чашку Петри без крышки, куда налит тонкий слой 5 %-го раствора хлорамина. Все помещается в предназначенное окно под ультрафиолетовые лучи. Источник облучения 15W ультрафиолетовая лампа, расстояние до объекта 5 см, время облучения 30 мин.

7.2. Для выявления ортопоксвирусного антигена в ИФА используют корки, жидкость из пузырьков, соскобы с кожных элементов, кровь, мазки из зева, кусочки органов умерших: корки, соскобы и кусочки органов гомогенизируют и добавляют физиологический раствор или фосфатно-цитратный буфер Мак-Ильвейна (рН 7,2; см. прилож. 3) в количестве, необходимом для получения суспензий в разведении примерно 1:5 — 1:50. Везикулярную и пустулезную жидкости используют цельными или, в зависимости от количества материала, разведенными 1:5 — 1:50.

Взятую для выделения вируса кровь (со стерильным антикоагулянтом) центрифугируют при 450 g ; плазму и светлый (лейкоцитарный) слой отсасывают раздельно, каждую фракцию разводят 1:2 буферным раствором Мак-Ильвейна (рН 7,2) и исследуют по отдельности.

Тампоны с отделяемым зева смывают 1,0 мл физиологического раствора или фосфатно-солевого буфера и исследуют.

7.3. Эти же подготовленные материалы используют для молекулярно-биологического исследования, изоляции вируса в клеточной культуре или куриных эмбрионов и других тестов (см. далее).

Перед заражением эмбрионов или культуры клеток в исследуемые материалы добавляют антибиотики (пенициллин, гентамицин или другие) в везикулярную жидкость и кровь — в расчете 200 ед./мл, в остальные материалы — по 500 ед./мл.

7.4. Для выявления антител к ортопоксвирусам из взятой для этой цели порции крови отсасывается сыворотка, которая исследуется в соответствующей тест-системе ИФА.

Просмотр подготовленных сеток проводят при увеличении 15000 — 20000. Обнаружение ортопоксвирусов осуществляется по характерной форме, структуре и размеру вирионов. Форма ортопоксвирусов может быть кирпичеобразной, либо овальной, размер 200 ´ 300 нм. Следует иметь в виду, что иногда вирионы адсорбируются на сетку меньшей плоскостью (торцом), и тогда они имеют вид округлых частиц диаметром около 150 нм.

Как правило, у большинства вирионов внутренняя структура не выявляется. Вместе с тем, у некоторых обнаруживается двухслойная наружная мембрана, разделённая электроннооптически плотным пространством, заполненным фосфорно-вольфрамовой кислотой, у других — на поверхности видны характерные удлиненные трубчатые структуры. Во внутренней полости вириона находится нуклеоид, который выявляется как структура низкой электроннооптической плотности (светлое образование двояковогнутой формы на тёмном фоне перенуклеоидного пространства, заполненного фосфорно-вольфрамовой кислотой). Вирионы могут располагаться по одиночкам или группами. Главными критериями (кроме формы и размеров), облегчающими идентификацию ортопоксвирусов, являются наличие поверхностных трубочек и нуклео-ида характерной двояковогнутой формы (рис. 1).

При проведении диагностических электронноскопических исследований могут быть выявлены возбудители заболеваний, протекающих с кожными поражениями. К их числу относятся вирусы группы герпеса (ветряной оспы, простого герпеса) и парапоксвирусы (рис. 2). Первые имеют меньшие размеры (110 — 120 нм), округлую форму и сферический нуклеоид. Неповреждённые вирионы группы герпеса окружены внешней оболочкой, имеющей неправильную форму с выступами (рис. 2). Вирионы парапоксвируса имеют не кирпичеобразную, а овоидную форму, меньшие размеры и отличаются от ортопоксвирусов характером поверхностного рельефа. При обнаружении вирионов их детальное изучение проводят при увеличении 50000 и более.

На рис. 1 приведен вид ортопоксвирусов при негативном контрастировании.

Рис. 1. Вирионы ортопоксвирусов

Рис. 2. Вирионы вируса ветряной оспы (А и Б) и вирионы парапоксвируса (В)

А — вирус ветряной оспы с наружной оболочкой-конвертом при увеличении 100000;

Б — тот же вирус без наружной оболочки при увеличении 168000;

В — вирионы парапоксвирусов (паравакцины)

Заключение о результатах исследования основывается на данных просмотра не менее 2 сеток от больного. Обнаружение 3 и более вирионов с характерной для ортопоксвирусов морфологией считается достаточным для заключения о наличии в материале ортопоксвирусов. Для отрицательного заключения в каждой из двух сеток просматривают не менее 1/4 ячеек в течение 30 мин.

Иммунная электронная микроскопия

Эффективность выявления возбудителей вирусных инфекций многократно возрастает при обработке материала специфической сывороткой — использовании так называемой иммунной электронной микроскопии (ИЭМ). Метод позволяет увеличить количество выявляемых вирионов, обнаруживать их уже на первых минутах просмотра, а также выявлять вирус в препаратах с низкой его концентрацией. Приготовление препаратов для иммунной электронной микроскопии производится следующим образом. Готовят 4 %-й агар «Difco» на физиологическом растворе или фосфатно-солевом буфере (рН 7,2) путём нагревания флакона в кипящей водяной бане. Агар растапливают и охлаждают до 56 °С, затем смешивают с равным объёмом сыворотки кролика, гипериммунизированного вирусом вакцины, в разведении 1:12 и 1:24 (разведения делают на фосфатно-солевом буфере — рН 7,2). Полученные смеси после тщательного перемешивания разливают в лунки полистироловых пластин (до края лунки) и маркируют. После застывания агара на его поверхность наносится по 25 — 30 мкл исследуемого материала.

На каплю помещается две — три электронноскопических сеточки, покрытые формваровой подложкой, стабилизированной углеродом. В таком виде материал оставляют на 25 — 30 мин при комнатной температуре. Затем сеточки снимают, излишек жидкости удаляют фильтровальной бумагой и помещают в каплю раствора 2 %-й фосфорно-вольфрамовой кислоты (рН 7,0) на 1 — 2 мин.

Обычно при ортопоксвирусных инфекциях в первые 10 мин просмотра обнаруживаются скопления вирионов ортопоксвируса. Условия для отрицательного заключения те же (см. п. 8.1.1).

Иммуноферментный анализ (ИФА) основан на специфическом взаимодействии антигена и антитела с предварительной иммобилизацией (фиксацией) одного из компонентов реакции (антигена или антител) на твердофазном носителе (в лунках полистироловых планшетов, стрипов и др.) и выявления образовавшегося комплекса антиген-антитело посредством ферментной метки (конъюгата). Выявление образовавшегося комплекса осуществляется по изменению интенсивности окраски (оптической плотности) субстратной смеси, содержащей вещество, с которым реагирует фермент, и индикатор, изменяющий цвет под действием продуктов реакции фермент-субстрат.

Для детекции антигена ортопоксвирусов в материалах от больных используют иммуноферментные тест-системы для выявления антигена ортопоксвирусов, зарегистрированные в Российской Федерации в установленном порядке. Эти наборы реагентов предназначены для выявления антигена ортопоксвирусов (натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, вакцины и др.) в везикулярной и пустулёзной жидкостях, суспензии корок и других материалах, полученных от людей и животных, в культуральной жидкости инфицированных клеточных культур. Детальное описание постановки ИФА, учёта и оценки результатов приводится в соответствующей инструкции по применению наборов реагентов.

Этот тест, основанный на выявлении IgG антител, может оказаться полезным, начиная с 4 — 5 дня болезни. Обнаружение у ранее невакцинированных против оспы лиц даже невысоких титров антител (80 — 160) указывает на наличие ортопоксвирусной инфекции. У вакцинированных в прошлом только высокие титры антител (640 и выше) могут свидетельствовать о свежей ортопоксвирусной инфекции. Для подтверждения наличия свежей инфекции в неясных случаях проводят повторное исследование сыворотки, взятой спустя несколько дней после первой пробы. При этом 2 — 4-кратное нарастание титра антител подтверждает диагноз.

Осуществление данного исследования производится в соответствии с инструкциями по применению иммуноферментных тест-систем для определения антител к ортопоксвирусам, зарегистрированных в Российской Федерации в установленном порядке.

Для целей возможно более ранней серологической диагностики ортопоксвирусных инфекций используют выявление в ИФА IgM антител (так называемых «ранних»), появление которых в сыворотке крови предшествует IgG антителам.

8 .1.4. Выявление (индикация) вируса натуральной оспы и других патогенных для человека ортопоксвирусов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

ПЦР применима для ускоренной диагностики при исследовании клинических образцов на наличие ДНК вируса натуральной оспы и для идентификации культуры выделенного вируса.

В данных МУ приведена методика, которая позволяет идентифицировать ДНК вируса оспы в клинических образцах и дифференцировать её от таковой близкородственных патогенных для человека ортопоксвирусов: оспы обезьян, оспы коров и вакцины с помощью набора реагентов для выявления ДНК вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакцины методом мультиплексной полимеразной цепной реакции.

Методика мультиплексной полимеразной цепной реакции (МПЦР) является вариантом классической ПЦР с анализом продуктов амплификации с помощью гель-электрофореза в агарозном геле, однако позволяет в одном анализе идентифицировать ДНК четырех видов ортопоксвирусов, в том числе ДНК вируса оспы в клинических образцах и дифференцировать её от таковой близкородственных патогенных для человека ортопоксвирусов: оспы обезьян, оспы коров и вакцины. Мультипраймерная система состоит из пяти пар праймеров, один из которых является родоспецифичным. Остальные пары праймеров являются видоспецифичными и при амплификации дают продукты длины, характерной для вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакцины.

Требования к организации работ при проведении исследований с использованием МПЦР приведены в МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I — IV групп патогенности» [10] и СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I — II групп патогенности (опасности)» [8].

Сотрудники, выполняющие МПЦР с материалом, подозрительным на зараженность вирусом оспы, также как и другие, работающие с этим вирусом, подлежат обязательной вакцинации в соответствии с МУ 3.3.1.2044-06 «Вакцинопрофилактика натуральной оспы» [11].

Выявление ДНК ортопоксвирусов с помощью МПЦР включает три стадии. На первой стадии после первичной подготовки проб проводят выделение ДНК из клинических образцов методом фенольной экстракции после разрушения клеток и вирусных частиц протеиназой К. Работа по выполнению этой стадии проводится в помещениях «заразной» зоны при соблюдении условий, указанных в СП 1.3.1285-03 [8] и МУ 1.3.2569-09 [10]. На второй стадии проводят реакцию МПЦР с выделенной ДНК. На третьей стадии проводят детекцию амплифицированной ДНК после гель-электрофореза в агарозном геле с визуализацией полос в УФ-свете после окраски геля бромистым этидием. Обе последние стадии могут проводиться за пределами «заразной» зоны в ПЦР-боксе в защитном костюме IV типа, дополненном резиновыми перчатками, с соблюдением правил выноса предметов из «заразной» зоны (внешняя обработка контейнера).

МПЦР представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза (амплификацию) специфичной области ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ), соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок-праймеров, определяющих границы амплифицируемого участка ДНК. В ходе МПЦР происходит амплификация только с помощью той пары праймеров, которая видоспецифична к ДНК-мишени, присутствующей в клиническом образце. Одна пара праймеров в смеси обеспечивает родоспецифичную амплификацию фрагмента размером 294 п.н. на ДНК любых видов ортопоксвирусов (дополнительный внутренний контроль).

Каждый цикл состоит из трех стадий с различными температурными режимами. На первой стадии при 93 °С происходит разделение цепей ДНК, затем при 62 °С — присоединение (отжиг) праймеров к гомологичным последовательностям на ДНК-мишени, на третьей стадии при температуре 72 °С — синтез новых цепей ДНК путем удлинения праймеров в направлении 3 конца. В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, ограниченного парой выбранных праймеров, что позволяет за 30 циклов наработать ДНК в количестве, достаточном для ее детекции с помощью электрофореза.

Выделение ДНК, постановку МПЦР и оценку результатов проводят по соответствующей инструкции по применению диагностической тест-системы для проведения МПЦР, зарегистрированной в Российской Федерации установленным порядком.

Список рекомендованного оборудования для проведения МПЦР приведен в прилож. 4. После выделения ДНК материал передают для проведения МПЦР. Передача материала осуществляется с соблюдением правил выноса предметов из «заразной» зоны (внешняя обработка контейнера) согласно СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I — II групп патогенности (опасности)» [8].

Для анализа результатов используют трансиллюминатор. Фрагменты анализируемой ДНК должны проявиться в виде светящихся оранжево-красных полос.

1. Положительный контроль (К + ) — должны выявляться специфичные полосы размером 832, 581,492, 421, 294, 200 пар нуклеотидов:

Длина продукта амплификации, пар нуклеотидов (п.н.)

Вирус оспы обезьян (Monkeypox virus)

Вирус вакцины (Vaccinia virus)

Вирус оспы коров (Cowpox virus)

Родоспецифичный фрагмент (Orthopoxvirus)

Вирус натуральной оспы (Variola virus)

* ЗА — Западноафриканский вариант вируса оспы обезьян

** ЦА — Центральноафриканский вариант вируса оспы обезьян

2. Отрицательный контроль (К * ) — полосы должны отсутствовать.

3. Анализируемые пробы — отсутствие полос строго на уровне положительного контроля свидетельствует об отрицательном ответе. Наличие полосы, соответствующей по размеру специфичному фрагменту в положительном контроле для какого-либо вида ортопоксвируса, свидетельствует о наличии в пробе ДНК данного вида ортопоксвируса. Внимание! Наличие полос ампликонов, располагающихся выше или ниже контрольных полос, является неспецифичным ответом и результат реакции оценивается как отрицательный.

• если в положительном контроле отсутствуют специфичные полосы (ошибка в постановке ПЦР, неправильное хранение или загрязнение реактивов в процессе работы, сбой программы амплификатора). Требуется повторная постановка реакции!

• если в отрицательном контроле выявляются специфичные полосы на уровне положительного контроля (контаминация реактивов пробположительной ДНК или продуктами амплификации). Необходимо использовать дополнительные отрицательные контроли при повторной постановке ПЦР. Если результат повторяется — необходимо сменить реактивы!

При проведении ПЦР-анализа в случаях несоблюдения вышеуказанных требований возможно получение ложноположительных результатов. К их появлению ведет ДНК-контаминация — попадание в реакционную смесь положительно реагирующих в ПЦР нуклеиновых кислот (из исследуемых образцов, положительных контролей, продуктов амплификации — ампликонов). Ампликоны могут накапливаться на лабораторном оборудовании, одежде, поверхности кожи сотрудников и легко переноситься аэрозольным путем. О наличии контаминации свидетельствует положительный ответ в отрицательном контроле. В этом случае необходимо повторить анализ, начиная с этапа выделения ДНК.

В случаях повторных положительных ответов в отрицательном контроле производят замену всех используемых для данного анализа реактивов, как на этапе подготовки проб, так и при проведении ПЦР, обрабатывают рабочие поверхности столов, приборов, штативов, автоматических пипеток 1N раствором соляной кислоты; облучают помещение УФ в течение 1,5 л. Заменяют рабочую одежду, набор инвентаря для уборки и приостанавливают работу в данном помещении до проведения указанных мер.

Режимы обеззараживания различных объектов при лабораторной диагностике натуральной оспы методом МПЦР приведены в СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I — II групп патогенности (опасности)» [8] и МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I — IV групп патогенности» [10].

Может осуществляться на куриных эмбрионах или в культуре клеток.

Используют хорошо развитые эмбрионы 12-дневного возраста. Эмбрионы готовят к заражению следующим образом. Во время просмотра (осуществляется в затемнённой комнате, пучок света должен падать сверху на тупой конец яйца) делают отметку простым карандашом в центре воздушного мешка. Затем поворачивают яйцо острым концом вверх и замечают место, где белок занимает наибольшее пространство. На противоположной этому месту стороне делают отметку для пропиливания, выбирая участок между двумя сосудами и их ответвлениями. Метку ставят между ветвями соседних вен, но не на самих сосудах.

Пропиливание осуществляется сепарационным вулканитовым диском бормашины, а при её отсутствии — любым инструментом типа маленького напильника. Одно отверстие пропиливают в центре воздушного мешка, второе — очень осторожно во избежание кровоизлияний — по отметке и боковой стороне яйца. Необходимо следить, чтобы была пропилена скорлупа и не затронута подскорлупная оболочка. Величина отверстий: длина — 3 — 4 мм, ширина — 1,5 мм. После пропиливания отверстий яйца укладывают на бок таким образом, чтобы отверстие на боковой поверхности было обращено вверх.

Подскорлупную оболочку в отверстии в центре воздушного мешка прорывают изогнутой хирургической иглой. Затем на боковое отверстие наносят 0,1 мл буферного раствора, подогретого (в водяной бане) до 50° и той же иглой очень осторожно расслаивают (продавливают) подскорлупную оболочку для образования маленькой щели, через которую под подскорлупную оболочку проходит капля буферного раствора. Последняя частично отслаивает хориоаллантоисную оболочку (ХАО). Полное её опускание происходит после отсасывания воздуха с помощью резиновой груши через отверстие в центре естественного воздушного мешка. Для контроля наличия и величины искусственных воздушных мешков яйца снова просвечивают и отбрасывают все, имеющие кровоизлияния и с воздушным мешком под ХАО и без искусственных воздушных мешков.

Подготовленные яйца (с опущенной ХАО) должны находиться до заражения в термостате в течение 2 ч. Для заражения используют материал от больного в исходном разведении, а также в разведениях 10 -2 — 10 -5 .

После введения инокулята материал равномерно распределяют по оболочке осторожным круговым вращением яйца.

Отверстие на боковой стороне яйца заклеивают липким пластырем с таким расчетом, чтобы оставалась как бы склеенная петля, за которую можно было бы держать яйцо при вскрытии. Яйца укладывают на бок (вверх заклеенным отверстием).

Заражение производят с соблюдением правил асептики. На каждый материал, предварительно обработанный антибиотиками, используют по 2 — 3 эмбриона на разведение. Инкубацию зараженных эмбрионов проводят при температуре 34,5 — 35,0 °С в течение 72 ч.

Вскрытие производят над посудой с высокими краями на четверть заполненную 5 %-м раствором хлорамина. Одной рукой берут яйцо за петлю липкого пластыря, которым заклеено отверстие над искусственным воздушным мешком. В другую руку берут прямые глазные ножницы. Браншу ножниц вставляют в отверстие над воздушным мешком и осторожно удаляют половину скорлупы, противоположную месту инокуляции, а также все содержимое яйца, за исключением части ХАО, принадлежащей к искусственному мешку (место инокуляции). Последнюю отделяют пинцетом, промывают физиологическим раствором и просматривают в чашке Петри на наличие поражений (на чёрном фоне), отмечают также состояние эмбриона (живой или погибший).

При наличии вируса оспы на ХАО обнаруживаются мелкие (размером около 1 мм в диаметре к 72 ч) белые точечные резко ограниченные возвышающиеся оспины. Их своеобразный характер существенно отличается от поражений, вызываемых другими патогенными для человека ортопоксвирусами. Так, вирус вакцины образует более плоские поражения, имеющие большие размеры (до 3 — 4 мм в диаметре к 72 ч инкубации). Вирус оспы коров образует поражения, сходные с вакцинными, но отличающиеся резко геморрагическим характером («красные» оспины). Вирус оспы обезьян вызывает поражения, по размерам напоминающие оспенные, но имеющие геморрагии в центре. Кроме того, среди основной массы типичных для вирусов оспы коров и оспы обезьян поражений встречается около 1 % более крупных белых оспин без геморрагии.

Вирусы вакцины, оспы коров и оспы обезьян также более патогенны для куриных эмбрионов, чем вирус натуральной оспы: при введении на ХАО 10 6 — 10 7 ООЕ/0,1 мл этих вирусов они, как правило, вызывают гибель куриных эмбрионов. При отсутствии бактериального загрязнения зараженные вирусом оспы эмбрионы, как правило, не погибают. Если в качестве исследуемых проб используют материал из кожных поражений в указанных выше разведениях, положительный результат получают через 72 ч после заражения без проведения пассажа. Пассаж делают при малом количестве материала для исследования и отсутствии поражений на ХАО при первичном заражении. Для этого извлечённые ХАО измельчают и приготовляют суспензию на физиологическом или буферном растворе из расчёта 1:3 — 1:5. Суспензию центрифугируют 10 мин при 2000 об./мин, надосадочную жидкость используют для заражения куриных эмбрионов.

При отсутствии специфических поражений результат выделения признают отрицательным.

Вирус оспы может быть также выделен из лейкоцитарной фракции или плазмы крови (особенно при тяжёлом течении) в первые дни болезни. В отделяемом зева он обнаруживается в первые 1 — 2 дня болезни до появления сыпи нерегулярно и в последующем выделяется с момента появления до исчезновения элементов на слизистой. Выделение вируса оспы из крови и отделяемого зева при отсутствии кожных поражений чаше имеет место при проведении пассажа. Отрицательный результат выделения вируса из этих материалов не исключает заболевания.

Для выделения вируса оспы могут быть использованы первичные и перевиваемые клеточные культуры различного происхождения: полученные от человека (фибробласты эмбриона человека, почки, амниотическая ткань), обезьяны, свиньи и др. Предпочтительнее использовать первичные клеточные культуры эпителиального характера, медленнее дегенерирующие и с более наглядной картиной цитопатического действия вируса (ЦПД). Обработанный антибиотиками исследуемый материал вносят (по 0,1 мл) в 4 — 6 пробирок с образовавшимся клеточным монослоем, в том числе желательно в 2 — 3 пробирки со стеклянными пластинками * (для возможно более раннего выявления ортопоксвирусного антигена с помощью МФА). Часть пробирок с незараженной культурой оставляют в качестве контроля. Пробирки инкубируют при температуре 36 °С и ежедневно оценивают состояние монослоя при малом увеличении микроскопа.

* Метод обработки стеклянных пластин указан в прилож. 5.

При достаточной концентрации вируса оспы ЦПД в первичной культуре клеток отмечается, как правило, уже в первые сутки после заражения культуры. В сплошном клеточном монослое появляются очаги округлых клеток с чёткими границами и зеркальной поверхностью (сильно преломляют лучи света); такие клетки часто увеличены в размере («гигантские»). В последующем скопления округлых клеток увеличиваются, клетки обособляются, прорывая монослой; постепенно клеточный пласт превращается в скопления очагов округлых клеток при наличии участков неизмененных клеток монослоя между ними вплоть до полного поражения клеток всего пласта.

Клеточные культуры перевиваемых линий реагируют на заражение вирусом оспы пролиферативным типом поражений — вирус вызывает усиленное размножение клеток, что проявляется в образовании гиперпластических фокусов, участков многослойного роста. Они выглядят как компактные клеточные нагромождения, усиленно преломляющие свет («зеркальные»). Размеры пролиферативных очагов и их количество постепенно увеличиваются, округлые дегенеративные клетки становятся зернистыми, нарушается целостность монослоя и затем происходит деструкция всего пласта.

При нечётко выраженных цитопатических изменениях проводят пассаж — вторую партию клеточных культур заражают взвесью клеток в культуральной жидкости (после проведения трёхкратного цикла замораживания и оттаивания культур). Однако, длительное (до 7 дней) наблюдение за зараженной культурой более эффективно, чем проведение «слепых» пассажей.

ЦПД вируса оспы и вируса вакцины имеет специфические особенности, что позволяет дифференцировать их в клеточной культуре. Для вируса вакцины характерен ускоренный темп развития клеточных поражений при отсутствии очаговости (за исключением начальной стадии ЦПД при малых дозах заражения), с распространением ЦПД на весь клеточный пласт и быстрым наступлением тотальной дегенерации культуры (через 1 — 2 дня). Наблюдается стертость клеточных границ, образование симпластов, сохранение цитоплазматических мостиков и др.

Для подтверждения специфичности ЦПД (для ортопоксвирусов), а также дифференциации от ЦПД вируса герпеса, можно использовать реакцию гемадсорбции. Для этого надо удалить культуральную жидкость из части заражённых и контрольных пробирок (по 2 пробирки, которые после постановки реакции уничтожаются) и добавить к клеткам по 0,2 мл 0,5 % взвеси куриных эритроцитов * . Пробирки выдерживают в горизонтальном положении 10 мин, после чего их просматривают при малом увеличении микроскопа. При положительном феномене гемадсорбции наблюдаются скопления адсорбированных клетками эритроцитов («ожерелья» из эритроцитов по контурам и на поверхности клеток), которые не удаляются при промывании клеточного пласта физиологическим раствором хлористого натрия (1 мл). Феномен гемадсорбции отрицателен (отсутствие ортопоксвирусов), если эритроциты не оседают на клетках, а свободно перемещаются в поле зрения микроскопа и удаляются при промывании. Клеточный пласт в контрольной (незараженной) культуре клеток должен оставаться свободным от скоплений адсорбированных эритроцитов. Феномен гемадсорбции обычно опережает видимое ЦПД вируса оспы (в культурах человеческого происхождения и почек обезьян). Вирус герпеса не даёт феномена гемадсорбции. При отсутствии ЦПД в течение 7 дней наблюдения и отрицательной реакции гемадсорбции результат выделения вируса считается отрицательным.

* Для постановки этой и других реакций следует использовать петухов-доноров, эритроциты которых чувствительны к воздействию ортопоксвирусов.

Для быстрого обнаружения вируса в культуре клеток и его серологической идентификации используют метод флюоресцирующих антител (МФА). С этой целью стеклянные пластинки вынимают через 12 — 24 ч после заражения культуры, отмывают от среды фосфатно-буферным раствором и после заключительного промывания в дистиллированной воде производят их фиксацию и окраску противооспенным люминесцирующим иммуноглобулином, как это описано в разделе 10.

При этом контролем служит: 1) незараженная культура клеток, окрашенная смесью гомологичного конъюгата и бычьего альбумина и 2) зараженная культура клеток, окрашенная смесью гетерологичного конъюгата и бычьего альбумина.

Препараты просматривают в люминесцентном микроскопе с использованием объектива ´ 40 и ´ 90.

Положительный ответ дают на основании обнаружения в клеточном пласте, окрашенном в оранжево-коричневатый цвет, клеток с ярко-зеленой, перинуклеарной флюоресценцией в цитоплазме, обусловленной наличием антигена ортопоксвирусов. В контрольных препаратах зелёное свечение должно отсутствовать.

При выделении в культуре клеток дифференцировать ортопоксвирусы возможно при использовании дополнительных приёмов дифференциации (см. ниже). Отрицательный ответ дают при отсутствии специфического свечения в культурах при первичном заражении и пассаже.

9. Критерии дифференциации вируса оспы от вирусов, вызывающих заболевания, сопровождающиеся кожными проявлениями

Осуществляется при электронной микроскопии по характерной форме и размеру вирусных частиц. Кроме того, вирусы группы герпеса дают отрицательный результат в ИФА при выявлении антигена ортопоксвирусов. При наличии вирусов герпеса отсутствует ярко-зелёная флюоресценция при окраске препаратов противооспенным люминесцирующим иммуноглобулином.

При выделении на куриных эмбрионах вирус ветряной оспы не вызывает поражений на ХАО. Некоторые штаммы вируса герпеса простого вызывают поражения, трудно отличимые от оспенных. Дифференциация вирусов в таких случаях проводится на основании исследования суспензии пораженной оболочки в ИФА.

При выделении вируса в культуре клеток дифференциацию ортопоксвирусов от вирусов герпеса проводят на основе отсутствия гемадсорбции и/или свечения при использовании МФА с противооспенным люминесцирующим иммуноглобулином.

9.2. Дифференциация вируса натуральной оспы от других патогенных для человека ортопоксвирусов (вакцины, оспы коров, оспы обезьян)

Основным методом дифференциации (кроме МПЦР) является характер поражений (оспин) на ХАО куриных эмбрионов (см. выше п. 8.2.1).

При выделении вируса в культуре клеток или в случаях, когда характер поражений на ХАО куриных эмбрионов не позволяет решить вопрос, каким ортопоксвирусом они вызваны, прибегают к дополнительному приёму дифференциации. С этой целью выделенную культуру вируса исследуют на способность вызывать реакцию на коже кроликов (заражение на скарифицированный участок).

Заражение кроликов на скарифицированную кожу

Нанесение вируса оспы на скарифицированный участок выстриженной кожи кролика (размер участка 2,5 ´ 2,5 см, объём инокулюма — 0,2 мл) не приводит к развитию специфических элементов. На месте нанесения вируса к 3 — 5 дню после заражения остаются лишь сухие бледные царапины (след от скарификации кожи). В противоположность этому вирус вакцины вызывает образование сочных характерных специфических элементов (папул, пустул), зачастую сливающихся между собой и образующих к 3 — 5 дню после заражения как бы «подушку», выступающую над поверхностью незараженной кожи. Вирус оспы коров и оспы обезьян образует элементы, аналогичные вакцинным, но отличающиеся выраженным геморрагическим характером.

Речь идет о диагностических приемах, которые могут быть использованы при отсутствии ряда описанных выше приборов и реагентов.

Метод флюоресцирующих антител для выявления возбудителя непосредственно в материале от больных.

Метод используют для быстрого обнаружения антигена ортопоксвирусов на ранних стадиях заболевания (до появления пустул!). Содержимое кожных элементов — мазки соскобов или отпечатки со дна везикул, макул, папул, мазки везикулярной жидкости на предметных стеклах фиксируют в охлаждённом ацетоне (х.ч.) в течение 10 мин. После 5-минутного просушивания их окрашивают смесью равных объёмов люминесцирующего оспенного иммуноглобулина и бычьего альбумина, меченого фторидом сульфородамина (прилож. 6), разведенных предварительно до «рабочего» разведения (см. соответствующую инструкцию по применению).

Обнаружение многочисленных мелких, округлой формы образований, дающих ярко-зелёную флюоресценцию и расположенных на оранжево-коричневом фоне при отсутствии зелёной флюоресценции в контроле свидетельствует о наличии в материале ортопоксвируса.

Внеклеточный вирус может образовывать цепочки, скопления и располагаться попарно. В ряде случаев специфический антиген может обнаруживаться в цитоплазме попавших в мазок клеток спущенного эпителия.

Исследование осуществляется в соответствии с инструкцией по применению препарата люминесцирующего оспенного иммуноглобулина, зарегистрированного в Российской Федерации установленным порядком.

Метод неприменим для исследования материала от больного в стадии пустул из-за наличия аутофлюоресценции элементов белой крови.

В качестве дополнительного метода быстрого обнаружения в материале от больного антигена ортопоксвирусов может быть использована РМПА.

В водяной бане растапливают 1 %-й агар на фосфатно-солевом буфере (см. прилож. 7), затем охлаждают до 60 °С и прибавляют подогретый до этой же температуры мертиолят (0,01 %). Агар наносят тонким слоем на предметное стекло (2 мл агара на предметное стекло размером 2,6 ´ 7,6 см). После застывания агара полой металлической трубочкой в нём прорезывают 4 круглых лунки диаметром 4 мм, центры которых находятся друг от друга на расстоянии 5 — 6 мм. Лунки располагают по углам ромба. В одну из боковых лунок наливают диагностическую оспенную сыворотку, в другую — нормальную кроличью сыворотку. В качестве известного антигена используют сухой оспенный диагностикум, который наливают в верхнюю лунку. Испытуемый антиген (везикулярная, пустулезная жидкость, суспензия корок, органов и т.д.) закапывают в нижнюю лунку.

Стекло с налитыми в лунки реагентами помещают во влажную камеру, в качестве которой может быть использована чашка Петри с влажной фильтровальной бумагой. Камеру оставляют при комнатной температуре. Просмотр стёкол производят через 2 — 5 и 24 часа в проходящем свете.

Реакция считается положительной в случае появления полосы преципитации между лунками с известным антигеном и диагностической противооспенной сывороткой при одновременном появлении такой же полосы между испытуемым антигеном и этой сывороткой и отсутствии их между антигенами и нормальной сывороткой. Положительный результат исследования свидетельствует о наличии в исследуемом материале антигена ортопоксвирусов. Отрицательный результат не исключает заболевания.

Этот простой и доступный метод, дающий ответ в пределах 1,5 — 2,0 ч, основан на подавлении специфическими антителами феномена агглютинации чувствительных эритроцитов кур, вызываемого рядом ортопоксвирусов. Установлено, что у заболевших оспой обнаруживаются высокие титры антигемагглютининов (АГА), значительно превосходящие таковые у вакцинированных против оспы лиц. Максимальные титры АГА наблюдаются к 10 — 15 дню, после чего постепенно снижаются. Следует отметить, что у отдельных больных оспой титры АГА остаются невысокими (20 — 40), поэтому наличие низких титров АГА не позволяет исключить диагноз оспы. Реакцию обычно ставят с 4 и 2 АЕ (агглютинирующими единицами).

Обнаружение при электронной микроскопии ортопоксвирусных вирионов и/или ортопоксвирусного антигена в ИФА свидетельствует о наличии инфекции, вызванной представителем рода ортопоксвирусов. Дальнейшая идентификация возбудителя проводится по результатам МПЦР. При наличии в исследуемом материале ДНК вируса натуральной оспы ставится диагноз «натуральная оспа».

Серологическое исследование с большой долей определенности дает ответ в отношении невакцинированных против оспы людей. В этом случае наличие даже невысоких (80 — 160) титров антител свидетельствует об ортопоксвирусной природе болезни.

Окончательный диагноз «натуральная оспа» ставится после выделения и идентификации возбудителя.

1. Противочумный костюм II-го типа с защитным респиратором ШБ-1 (РБ) «Лепесток-200» или их аналогами отечественного или зарубежного производства.

2. Набор стерильных инструментов в упаковке:

пинцеты для электронноскопических сеток;

3. Пробирки пластиковые с завинчивающимися пробками вместимостью 1,5 — 3,0 мл.

4. Пробирки пластиковые с завинчивающимися пробками вместимостью 5 и 10 мл.

5. Обезжиренные предметные стекла (2 — 4 шт.).

6. Подготовленные для взятия проб электронноскопические сетки.

10. Маркер для стекол, пробирок.

11. Пластиковые флаконы вместимостью 10 мл с завинчивающейся крышкой.

12. Ватные тампоны на стержне (4 — 6 шт.).

13. Полиэтиленовые пакеты типа Zip- lock .

17. Дезинфицирующие средства, разрешенные к применению в установленном порядке.

Для приготовления опорных пленок используется 0,25 — 0,3 %-й раствор формвара на дихлорэтане, который хранят в холодильнике. Дихлорэтан должен храниться в холодильнике в плотно закрывающейся посуде и иметь квалификацию «хч» или «чда». Для приготовления пленок раствор нагревают до комнатной температуры и в него опускают чистое обезжиренное предметное стекло на 3/4 высоты на 20 — 30 с. Затем стекло просушивают и острым скальпелем или лезвием бритвы вырезают формваровую пленку, отступя от края стекла на 2 — 3 мм. Для отделения пленки стекло медленно погружают под углом 60° в сосуд с дистиллированной водой. На поверхность пленки выкладывают сетки. Затем пленку с сетками накрывают полоской газетной бумаги (без краски) или плотной фильтровальной бумаги. Бумагу вместе с сетками, покрытыми пленкой, вынимают из воды и укладывают в чашку Петри для просушивания.

Для приготовления опорных пленок может использоваться 1 %-й раствор парлодия в амилацетате. При этом каплю раствора наносят на поверхность дистиллированной воды. Через 10 — 15 с, после испарения амилацетата, на поверхность образовавшейся пленки укладывают сетки, которые затем снимают на бумагу, аналогично формваровым.

После просушки сетки, покрытые формваровой или парлодиевой пленкой, напыляют углем в вакуумной напылительной установке при давлении 10 -4 — 10 -5 мм ртутного столба. Визуально напыление контролируют по появлению на бумаге с сетками первых признаков видимого слоя угля светло-серого цвета. Формваровые пленки можно использовать без напыления.

Приготовление смолы для заливки образцов, предназначенных для исследования методом ультратонких срезов

Использование смеси эпоксидных смол эпона и аралдита позволяет получить заливочную среду, обеспечивающую хорошее пропитывание образца, оптимальную для резки твердость блоков и хорошее контрастирование срезов.

Исходный раствор готовится с использованием смол:

Смолы сливаются в стеклянный сосуд и тщательно перемешиваются до получения гомогенной смеси. Смесь хранится при комнатной температуре в плотно закрытой посуде неограниченное время и используется для пропитки образцов и полимеризации.

Раствор № 1 — 0,84 г лимонной кислоты растворяют в 1 л очищенной воды.

Раствор № 2 — 0,712 г Na 2 HPO 4 × 2Н2O растворяют в 1 л очищенной воды.

Для получения буферного раствора с рН — 7,2 следует смешать 130 мл раствора № 1 и 870 мл раствора № 2.

Состав фосфатно-буферного раствора (0,15 М, рН = 7,2 — 7,4), используемого для промывания препаратов, исследуемых МФА.

Раствор № 3 — 10,21 г КН2РO 4 растворяют в 500 мл воды очищенной.

Раствор № 4 — 26,85 г Na 2 HPO 4 × 2Н2O растворяют в 500 мл воды очищенной.

Для получения буферного раствора требуемой молярности и рН следует к 200 мл физиологического раствора добавить 172,0 мл раствора № 4 и 47,8 мл раствора № 3.

Наименование, тип и шифр средств испытаний

1. рН-метр типа РВ-11 Sartorius

Предел измерения (1 — 14) ед. рН

2. Холодильник бытовой типа ГОСТ 16317-87

Температура в холодильной камере от 0 до 10 °С

3. Малогабаритная высокоскоростная лабораторная микроцентрифуга типа «ЦиклоТемп-201»

16000 об./мин, со сменными роторами для микропробирок — 0,5/0,6 мл и 1,5/2,0 мл

4. Микроцентрифуга/встряхиватель типа ТЭТА 2

Скорость вращения гнезда до 2500 об./мин

5. Программируемый твердотельный термостат типа Т-2415

Диапазон рабочих температур от 20 до 120 °С

6. Морозильная камера типа «Kelvinator»

Температура в морозильной камере от -20 до -70 °С

7. Автоматические пипетки типа «Ленпипет» 1 — 10, 5 — 40, 20 — 200, 200 — 1000 мкл

8. Термостат программируемый четырехканальный типа ТП 4-ПЦР-01-«Терцик»

4 независимо управляемых блока, емкость каждого термоблока 10 ´ 0,5 мл, диапазон от 4 до 99 °С, скорость нагревания/охлаждения блока 2 °С/с

Предел взвешивания 15 кг, погрешность 5 г

Диапазон измерений от 0,2 до 60 мин. Класс точности 0,2

13. Набор для горизонтального электрофореза типа «Sub Cell GT»

Размер геля 15 ´ 10 см, заливочный столик

14. Источник тока типа «PowerPac Basic (300)»

Выход на 4 камеры, до 300 В и 400 мА

15. Трансиллюминатор типа «ТСР-20МС»

Длина волны 312 нм и 254 нм, экран 20 ´ 20 см, 6 ламп для каждой длины волны

Примечание . Могут использоваться средства измерения и контроля, имеющие характеристики не хуже приведенных.

Нарезанные из предметных стёкол пластинки (2,5 ´ 0,8 см) в сухом виде погружают в хромпик на 24 ч (на 1 л концентрированной серной кислоты 250 г двухромовокислого калия). Раствор хромпика используют через 24 ч. Стёкла после хромпика промывают сутки в проточной воде, после чего ополаскивают дистиллированной водой, вытирают и опускают в смесь Никифорова (спирт-эфир 1:1) на 6 — 24 ч. Затем каждое стекло протирают чистой марлей и пинцетом погружают в пробирки. Пробирки со стёклами подвергают стерилизации.

Готовят двукратные разведения альбумина на физиологическом растворе. На фиксированные препараты (по два на каждое разведение) наслаивают различные разведения альбумина. Последующую обработку препаратов проводят по методике, описанной в разделе 10.1. Яркость люминесценции оценивают по 3-крестовой шкале:

3+ — отчётливо выраженная люминесценция оранжево-красного цвета;

2+ — отчетливая люминесценция оранжево-коричневого цвета;

+ — заметная флюоресценция серовато-жёлтого цвета;

За «красящий» титр бычьего альбумина принимают его максимальное разведение, которое обусловливает оранжево-красноватое или оранжево-коричневатое свечение фона препарата на 2 — 3 креста. При правильно выбранных «рабочих» разведениях смесь люминесцирующего оспенного иммуноглобулина и меченого альбумина должна обеспечить при окраске препаратов, инфицированных вирусом вакцины, изумрудно-зелёное специфическое свечение на 3 — 4 креста внутриклеточно и внеклеточно расположенного вируса, чётко контрастируемое на фоне оранжево-красной или коричневатой флюоресценции окружающих клеток, клеточного дебриза или прочих гетерологичных частиц.

Берётся 1 весовая часть агара и 50 весовых частей воды. Агар в горячем состоянии осаждают 0,5 %-м раствором хлористого кальция (хлористый кальций добавляют из расчёта 5 г на 1 л агара) и тут же фильтруют через слой ваты. Затем затвердевший агар нарезают на куски и промывают в проточной воде в течение 72 ч. Агар опять расплавляют и добавляют в буфер из расчёта 10 г на литр буферного раствора. Состав фосфатно-солевого буфера (рН 7,2): Na 2 HPO 4 M /15 — 70 мл, КН2Р O 4 М/15 — 30 мл.

* Выявление ортопоксвируса непосредственно в материале от больного в ранние стадии болезни (до появления пустул).

источник

Обозначение: МУ 1.3.2970-11
Название рус.: Лабораторная диагностика натуральной оспы
Статус: действует
Заменяет собой: «Инструкция по лабораторной диагностике натуральной оспы» (Утверждена 04.04.1972)
Дата актуализации текста: 05.05.2017
Дата добавления в базу: 01.09.2013
Дата введения в действие: 14.12.2011
Утвержден: 14.12.2011 Главный государственный санитарный врач Российской Федерации
Опубликован: Роспотребнадзор (2012 г. )
Ссылки для скачивания:

Популярные записи

Спирт при ветряной оспе
Кому была сделана прививка от оспы впервые
Гулять при ветряной оспе
Вакцина против оспы овец
Ветряная оспа проявления полости рта
Люди которые изобрели вакцину против оспы
Натуральная оспа пути передачи инфекции
Прививка оспы изменила цвет