Вирусвакцина против оспы овец культуральная живая сухая

Вакцина предназначена для профилактической иммунизации овец против оспы и заразного узелкового дерматита (нодулярного дерматита) КРС в неблагополучных и угрожаемых пунктах и хозяйствах. Лекарственная форма – лиофилизированная масса. По внешнему виду вакцина представляет собой однородную сухую пористую массу светло-желтого цвета, полностью растворяющуюся в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия (физиологическом растворе) в течение 1,5 минуты.

Вакцина предназначена для профилактической иммунизации овец против оспы и заразного узелкового дерматита (нодулярного дерматита) КРС в неблагополучных и угрожаемых пунктах и хозяйствах. Запрещено прививать клинически больных и/или ослабленных животных.

Способ вакцинации

Вирусвакцину вводят овцам подкожно в бесшерстстый участок кожи (подмышечная область, подхвостовая складка) с соблюдением правил асептики в дозе 1 см3. Перед применением сухую вирусвакцину, соблюдая правила асептики, растворяют охлажденным до 4 °C физиологическим раствором. Для чего во флакон, содержащий 50 прививных доз вирусвакцины, при помощи шприца вносят 2 см3, а во флакон, содержащий 100 прививных доз –4 см3 физиологического раствора и тщательно встряхивают до полного ресуспендирования. После ресуспендирования вирусвакцину объединяют с 48 см3 или 96 см3 (для получения 50 и 100 прививных доз) стерильного физиологического раствора и тщательно встряхивают. Для вакцинации используют шприцы и иглы, которые стерилизуют кипячением в течение 20 минут. Допускается использование одноразовых шприцов. Дезинфекция шприцов и игл химическими средствами не допускается. Поверхность кожи в месте введения вирусвакцины обрабатывают 70% этиловым спиртом или другими антисептиками. При плановой вакцинации прививают овец с 3-месячного возраста. Ревакцинацию животных проводят через каждые 12 месяцев. В неблагополучном пункте и хозяйствах угрожаемой зоны вакцинируют животных всех возрастных групп, не имеющих признаков заболевания оспой, не зависимо от срока предыдущей вакцинации. При этом молодняк в возрасте до 6 месяцев прививают двукратно с интервалом 14 суток. Ревакцинируют молодняк через 6–7 месяцев, а взрослых животных – через 12 месяцев. При плановой вакцинации для профилатики нодулярного дерматита КРС прививают животных с 3х месячного возраста. Ревакцинацию животных проводят через каждые 6 месяцев. В неблагополучном пункте и хозяйствах угрожаемой зоны вакцинируют животных всех возрастных групп, не имеющих признаков заболевания нодулярным дерматитом, не зависимо от срока предыдущей вакцинации. При этом молодняк в возрасте до 6 месяцев прививают двукратно с интервалом 14 суток. Через 6 месяцев молодняк и взрослых животных ревакцинируют. Вирусвакцину вводят КРС подкожно в область средней трети шеи, с соблюдением правил асептики, в дозе 1 см3. Перед применением сухую вирусвакцину, соблюдая правила асептики, растворяют охлажденным до 4 °C физиологическим раствором. Для чего во флакон, содержащий 5 прививных доз вирусвакцины, при помощи шприца вносят 2 см3, а во флакон, содержащий 10, 20 или 50 прививных доз –4 см3 физиологического раствора и тщательно встряхивают до полного ресуспендирования. После ресуспендирования вирусвакцину объединяют с 3 см3 (для получения 5 прививных доз), 6 см3 (для получения 10 прививных доз), 16 см3 (для получения 20 прививных доз), 46 см3 (для получения 50 прививных доз) стерильного физиологического раствора и тщательно встряхивают.

Вирусвакцина вызывает формирование иммунного ответа у привитых овец против оспы и заразного узелкового дерматита (нодулярного дерматита) КРС через 5 суток после однократного применения, продолжительностью не менее 12 месяцев. Вакцина безвредна, лечебными свойствами не обладает.

Условия хранения

Вакцину хранят и транспортируют в сухом темном месте при температуре от 2 °C до 8 °C. Срок годности вакцины 24 месяца с даты выпуска при соблюдении условий хранения и транспортирования. По истечении срока годности вирусвакцина к применению не пригодна.

источник

«Временное наставление по применению вирусвакцины против оспы овец сухой культуральной из штамма НИСХИ»

Документ по состоянию на август 2014 г.

Утверждено
Главным управлением
ветеринарии Министерства
сельского хозяйства СССР
23 июня 1984 года

1.1. Вирусвакцина против оспы овец сухая культуральная изготовлена из живого вакцинного штамма НИСХИ, выращенного в первичной культуре клеток почки ягнят. Вакцина лиофильно высушена и представляет собой гомогенную массу желтовато-белого цвета, растворяющуюся в течение 1 — 1,5 мин. в физиологическом растворе.

1.2. Вакцину выпускают в стеклянных, запаянных под вакуумом ампулах, содержащих по 2 мл сухой массы, составляющей 50 прививных доз для овец.

На каждой ампуле указывают наименование препарата, номер серии и дату изготовления. На коробке с сухой вирусвакциной должно быть указано наименование и товарный знак предприятия-изготовителя, полное наименование биопрепарата, номер серии, номер государственного контроля, количество ампул в коробке, объем вакцины и количество доз в ампуле, дата изготовления, срок годности, условия хранения и обозначения настоящих ТУ. В каждую коробку вкладывают наставление по применению вакцины и ярлык с указанием фамилии или номера упаковщика.

1.3. Сухую вакцину хранят при температуре не выше 8 °С в сухом, темном месте (допускается хранение при любой температуре ниже 0 °С).

1.4. Срок годности вирусвакцины 12 мес. со дня изготовления.

2.1. Сухую вирусвакцину применяют для профилактической иммунизации овец против оспы. Вакциной прививают клинически здоровых овец в эпизоотических очагах и угрожаемых по оспе районах. Молодняк вакцинируют с месячного возраста с обязательной ревакцинацией в возрасте 6 мес.; взрослых овец прививают однократно. Периодичность прививок через 12 мес.

2.2. Вирусвакцину нельзя применять ранее чем через 2 нед. после вакцинации другими биопрепаратами.

2.3. Перед употреблением вирусвакцину растворяют охлажденным до 4 — 10 °С стерильным физиологическим раствором хлористого натрия.

Ампулу с вакциной осторожно, соблюдая правила асептики, вскрывают, вносят в нее 2 мл стерильного физиологического раствора и легко встряхивают. После растворения содержимое ампул при помощи шприца переносят в стерильный флакон, в который доливают 48 мл физиологического раствора. Содержимое флакона тщательно смешивают путем встряхивания. Разведенная вакцина должна быть использована в течение 2 ч с момента ее растворения.

2.4. Ампулы с вакциной, имеющие механические повреждения, различного рода включения, видимые изменения цвета и консистенции содержимого, к применению не допускаются и подлежат обезвреживанию путем кипячения в течение 30 мин. Таким же образом уничтожают вакцину, не использованную в течение 2 ч после ее растворения.

Места, загрязненные вакциной, подлежат обеззараживанию 3-процентным раствором едкого натра.

2.5. Разведенную вирусвакцину вводят подкожно по 1 мл в области бесшерстного участка кожи (подмышечная область).

2.6. Иммунитет наступает через 4 — 5 дней после вакцинации и сохраняется в течение 12 мес.

3.1. За привитыми животными устанавливают ветеринарное наблюдение в течение 12 дней, имея в виду, что часть овец (до 3) реагирует на введение вирусвакцины образованием на 4 — 6-й день в месте инъекции воспалительного отека в виде уплотнения размеров 1 — 5 см, иногда с развитием поверхностного некроза. Уплотнение и некротические участки обычно исчезают через 3 — 15 дней. У некоторых овец может повышаться температура тела до 41,5 °С в течение 1 — 4 дней.

3.2. Проведение прививки оформляют актом с указанием даты, количества привитых овец по возрастным группам, номера серии вакцины и госконтроля, срока годности и предприятия-изготовителя, а также ответственного лица, проводившего прививки.

Акт составляют в 2 экз., один из которых хранят в хозяйстве, другой — в делах ветеринарного учреждения.

3.3. В случае, если после прививок имели место осложнения, об этом необходимо в срочном порядке сообщить во Всесоюзный государственный научно-контрольный институт ветеринарных препаратов Минсельхоза СССР (123022, Москва, Д-22, Звенигородское шоссе, 5), предприятию-изготовителю в соответствии с указанием Главного управления ветеринарии Минсельхоза СССР от 8 сентября 1982 г. «О порядке предъявления рекламаций на биологические препараты». Одновременно в институт высылают 4 — 5 ампул с вакциной с указанием номера серии вакцины, времени прививок, количества привитых овец, характера осложнений.

источник

Временное наставление по применению вирусвакцины против оспы овец сухой культуральной из штамма НИСХИ (утв. Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 23 июня 1984 г.)

Временное наставление по применению вирусвакцины против оспы овец сухой культуральной из штамма НИСХИ
(утв. Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 23 июня 1984 г.)

1.1. Вирусвакцина против оспы овец сухая культуральная изготовлена из живого вакцинного штамма НИСХИ, выращенного в первичной культуре клеток почки ягнят. Вакцина лиофильно высушена и представляет собой гомогенную массу желтовато-белого цвета, растворяющуюся в течение 1-1,5 мин в физиологическом растворе.

1.2. Вакцину выпускают в стеклянных, запаянных под вакуумом ампулах, содержащих по 2 мл сухой массы, составляющей 50 прививных доз для овец.

На каждой ампуле указывают наименование препарата, номер серии и дату изготовления. На коробке с сухой вирусвакциной должно быть указано наименование и товарный знак предприятия-изготовителя, полное наименование биопрепарата, номер серии, номер государственного контроля, количество ампул в коробке, объем вакцины и количество доз в ампуле, дата изготовления, срок годности, условия хранения и обозначения настоящих ТУ. В каждую коробку вкладывают наставление по применению вакцины и ярлык с указанием фамилии или номера упаковщика.

1.3. Сухую вакцину хранят при температуре не выше 8°С в сухом, темном месте (допускается хранение при любой температуре ниже 0°С).

1.4. Срок годности вирусвакцины 12 мес. со дня изготовления.

2. Порядок применения вирусвакцины

2.1. Сухую вирусвакцину применяют для профилактической иммунизации овец против оспы. Вакциной прививают клинически здоровых овец в эпизоотических очагах и угрожаемых по оспе районах. Молодняк вакцинируют с месячного возраста с обязательной ревакцинацией в возрасте 6 мес.; взрослых овец прививают однократно. Периодичность прививок через 12 мес.

2.2. Вирусвакцину нельзя применять ранее чем через 2 нед. после вакцинации другими биопрепаратами.

2.3. Перед употреблением вирусвакцину растворяют охлажденным до 4-10°С стерильным физиологическим раствором хлористого натрия.

Ампулу с вакциной осторожно, соблюдая правила асептики, вскрывают, вносят в нее 2 мл стерильного физиологического раствора и легко встряхивают. После растворения содержимое ампул при помощи шприца переносят в стерильный флакон, в который доливают 48 мп физиологического раствора. Содержимое флакона тщательно смешивают путем встряхивания. Разведенная вакцина должна быть использована в течение 2 ч с момента ее растворения.

2.4. Ампулы с вакциной, имеющие механические повреждения, различного рода включения, видимые изменения цвета и консистенции содержимого к применению не допускаются и подлежат обезвреживанию путем кипячения в течение 30 мин. Таким же образом уничтожают вакцину, не использованную в течение 2 ч после ее растворения.

Места, загрязненные вакциной, подлежат обеззараживанию 3%-ным раствором едкого натра.

2.5. Разведенную вирусвакцину вводят подкожно по 1 мл в области бесшерстного участка кожи (подмышечная область).

2.6. Иммунитет наступает через 4-5 дней после вакцинации и сохраняется в течение 12 мес.

3. Наблюдение за вакцинированными животными

3.1. За привитыми животными устанавливают ветеринарное наблюдение в течение 12 дней, имея в виду, что часть овец (до 3) реагирует на введение вирусвакцины образованием на 4-6-й день в месте инъекции воспалительного отека в виде уплотнения размеров 1-5 см, иногда с развитием поверхностного некроза. Уплотнение и некротические участки обычно исчезают через 3-15 дней. У некоторых овец может повышаться температура тела до 41,5°С в течение 1-4 дней.

3.2. Проведение прививки оформляют актом с указанием даты, количества привитых овец по возрастным группам, номера серии вакцины и госконтроля, срока годности и предприятия-изготовителя, а также ответственного лица, проводившего прививки.

Акт составляют в 2 экз., один из которых хранят в хозяйстве, другой — в делах ветеринарного учреждения.

3.3. В случае, если после прививок имели место осложнения, об этом необходимо в срочном порядке сообщить во Всесоюзный государственный научно-контрольный институт ветеринарных препаратов Минсельхоза СССР (123022, Москва, Д-22, Звенигородское шоссе, 5), предприятию-изготовителю в соответствии с указанием Главного управления ветеринарии Минсельхоза СССР от 8 сентября 1982 г. «О порядке предъявления рекламаций на биологические препараты». Одновременно в институт высылают 4-5 ампул с вакциной с указанием номера серии вакцины, времени прививок, количества привитых овец, характера осложнений.

Откройте актуальную версию документа прямо сейчас или получите полный доступ к системе ГАРАНТ на 3 дня бесплатно!

Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.

Временное наставление по применению вирусвакцины против оспы овец сухой культуральной из штамма НИСХИ (утв. Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 23 июня 1984 г.)

Текст наставления опубликован в сборнике «Ветеринарное законодательство». Том IV. — М.: Агропромиздат, 1988

источник

Применяют с целью профилактики оспы. Прививке подлежат только здоровые овцы, не имеющие клинических признаков бо­лезни, независимо от их возраста и физиологического состояния (суягность, кормящие Овцематки и др.). Перед применением вак­цину тщательно встряхивают. Вакцину вводят подкожно в дозе: взрослым животным 5 мл, ягнятам до 4-месячного возраста 3 мл. Иммунитет возникает на 15-й день и сохраняется у молодняка 4-5 мес, у взрослых овец до 8 мес.

Сухая культуральная вирусвакцина против оспы овец из штам­ма НИСХИ для профилактической иммунизации.Ее вводят здоро­вым овцам независимо от возраста и физиологического состоя­ния (суягные или кормящие овцематки), но не ранее 14 дней после вакцинации другими препаратами. Вакцину растворяют физиологическим раствором, встряхивают и вводят однократно в области бесшерстного участка кожи (подмышечная область) в дозе 1 мл. Ягнят, привитых в возрасте 1 мес, ревакцинируют в той же дозе в возрасте 6 мес. Иммунитет наступает через 4-5 дней, длится до 12 мес.

Гидроокисьалюминиевая формолглицериновая вакцина Таджик­ской НИВОС против оспы коз.С профилактической целью вакци­нируют коз всех возрастов без ограничений; в неблагополучных хозяйствах — только здоровых коз с нормальной температурой. Вакцину вводят подкожно в области внутренней поверхности бедра — взрослым козам и молодняку старше 3 мес 3-5 мл; мо­лодняку с 2-нецельного и до 3-месячного возраста 1,5-2,0 мл. Через 3-4 мес молодняк ревакцинируют в дозе 3 мл. Иммунитет возникает через 10-14 дней и длится до 6 мес.

Оспенный детрит(используемый в медицине). Применяют для иммунизации свиней и верблюдов против оспы. Свиней приви­вают только в неблагополучных хозяйствах, верблюдов — в не­благополучных и угрожаемых хозяйствах. Вакцинируют всех жи­вотных, не имеющих клинических признаков болезни, независи­мо от возраста. На месте введения шерсть выстригают, поле инъекции обрабатывают спиртом или 0,5%-ным раствором фено­ла, затем насухо вытирают стерильной ватой. После этого скари­фицируют кожу, делая 2-3 неглубокие царапины длиной 2-4 см, и на них наносят глазной пипеткой 2-3 капли растворен­ной вакцины (у свиней втирают препарат шпателем). Через 5-7 дней животных осматривают и при отсутствии местной реакции прививают повторно.

Контрольные вопросы. 1. Каковы клинические признаки оспы у овец, коз, свиней, крупного рогатого скота, верблюдов и лошадей? 2. Как поставить диагноз на оспу? 3. Какова специфическая профилактика оспы животных?

Актиномикоз и актинобациллез(Actinomycosis, Actinobacillosis) — хронические инфекционные болезни живот­ных, характеризующиеся образованием гранулематозных разрас­таний и абсцессов в различных органах и тканях. Восприимчив и человек.

Распространенность.Эти болезни выявляют у животных, в особенности у крупного рогатого скота, во всех странах мира.

Возбудители этих двух болезней — патогенный гриб Actinomyces bovis и бакте­рия Actinobacillus Iignieresii. Под микроскопом Actinomyces bovis выглядит в виде лучистого гриба с радиально расположенными булавовидными утолщениями. Центральная часть этой друзы окрашивается по Граму в темно-синий цвет, периферическая — в розовый. Actinobacillus Iignieresii образует мелкие серовато-желтые друзы, которые гематоксилином окрашиваются в синий, эозином — в красный цвет; в мазках из такого гноя обнаруживают короткие грамотрицательные палочки.

Актиномицеты выращивают на мясо-пептонном агаре с глюкозой и глицери­ном, на печеночных средах, на полужидком МПА с. глюкозой и среде Китта — Тароцци. При посеве на агар через 10-45 дней в толще агарового столбика обнаруживают белые или желтоватые колонии. Актинобациллы выращивают на сывороточном или кровяном агаре, мозговой среде, синтетических средах. На сывороточном агаре через 24 ч вырастают круглые блестящие колонии актиноба-цилл.

К A. bovis восприимчивы хомяки, молодые белые мыши, крольчата, к A. Iig­nieresii — морские свинки, куриные эмбрионы и 7-8-дневные цыплята. Актино­мицеты хорошо переносят высушивание (до 6 лет), при низкой температуре сохраняются до 2 лет. 3%-ный раствор формальдегида, температура 80 °С убива­ют споры гриба через 5 мин.

Эпизоотологические данные.Актиномикозом болеют крупный рогатый скот, реже — свиньи, овцы, козы, лошади; актинобациллезом — крупный рогатый скот, буйволы, овцы, свиньи, олени и другие животные. Возбудители длительное время сохраняются во внешней среде — в почве, на растениях. Заражение происходит через поврежденные слизистые оболочки и кожные поврежде­ния.

Патогенез.Внедрение возбудителя вызывает воспалительный процесс с явлениями клеточной пролиферации и экссудации. Образуется гранулема, характеризующаяся развитием некроти­ческих процессов в ее центре. Поражение костной ткани проте­кает в виде остита, остеомиелита с некротическим распадом ткани.

Клинические признаки.Основной признак болезни — образо­вание опухолей, чаще всего шаровидной формы, различных раз­меров, серовато-белого или красновато-серого цвета на разрезе с наличием очагов размягчения. На поверхности слизистых оболо­чек образуются грибовидные разрастания, язвы. При поражении костей происходит распад костного вещества, а также увеличе­ние объема кости за счет продуцирования периостом нового костного вещества. В отличие от актиномикоза при актинобациллезе кости почти никогда не поражаются. Локализация опу­холей: у крупного рогатого скота и овец — язык, челюсти, меж­челюстное пространство, область глотки, пищевод, желудок, ки­шечник, реже — органы дыхания и мочеполовая система; у свиней — вымя, миндалины, челюсти, язык; у овец — миндали­ны и легкие; у лошадей — семенной канатик (осложнение после кастрации).

Патологоанатомические изменения.В легких, печени, почках, селезенке, мозгу, пищеварительном тракте, вымени, различных лимфатических узлах, а также коже можно обнаружить соедини­тельнотканные опухоли и абсцессы.

Диагнозставят по клиническим признакам и результатам мик­роскопического исследования. В лабораторию направляют кусоч­ки опухоли (в 30%-ном водном растворе глицерина) или сте­рильно взятый гной из невскрывшихся абсцессов. Из прислан­ного материала выбирают желтоватые или сероватые комочки, промывают их водой, обрабатывают 15%-ным раствором едкого натра, раздавливают между двумя предметными, стеклами, изуча­ют в неокрашенном виде и после окраски по Граму. При отри­цательном результате микроскопического исследования делают посев на питательные среды для получения культуры возбудите­ля. Иногда заражают восприимчивых животных.

Дифференциальный диагноз. При постановке диагноза у крупного рогатого скота следует исключить лейкоз по результатам клинико-гематологических исследований. При актиномикозе пораженные ткани более плотные, отмечаются абсце­дирование с образованием фистул и сращение с подкожной клетчаткой. Характерное для актиномикоза поражение костной ткани при лейкозе не наблюдается. Дифференцируют также от туберкулеза по результатам аллергической пробы.

Профилактика, меры борьбы, лечение.Больных животных изо­лируют и лечат. Поверхностно расположенные ограниченные опухоли удаляют с последующим промыванием раны растворами йодистых препаратов или антибиотиков (пенициллина). Внутрь дают водный раствор йодистого калия 3 раза в день в течение 2-4 нед в дозе 5-10 г взрослым животным, 2-4 г молодняку. Одновременно в опухоли вводят пенициллин 3-4 раза в день с интервалом 3-4 ч в дозе 1000 ЕД на 1 кг массы животного или окситетрациклин — 200-400 тыс. ЕД в зависимости от возраста. При обнаружении актиномиком в глубоко расположенных орга­нах и тканях систематически дают внутрь или вводят внутривен­но йодистые препараты и внутримышечно пенициллин, стрепто­мицин, окситетрациклин или хлортетрациклин. Хорошо действу­ет аутогемотерапия в сочетании с лечением полимиксином.

В неблагополучных по актиномикозу хозяйствах избегают вы­паса животных на заболоченных пастбищах. В стойловый период грубые корма перед скармливанием рекомендуют запаривать.

Контрольные вопросы. 1. Каковы пути заражения животных актиномикозом? 2. Как лечить больное актиномикозом животное?

Микозы и микотоксикозы.

Аспергиллез(Aspergillosis) — инфекционная болезнь птиц, реже — млекопитающих животных, вызываемая грибами рода Aspergillus и поражающая в основном органы дыхания (пнев-мокониоз), реже — другие органы и ЦНС. Болеет и человек.

Распространенность.Болезнь регистрируют повсеместно.

Возбудители — патогенные грибы рода Aspergillus, относящиеся к несовер­шенным грибам. Вспышки болезни чаще вызывает гриб Aspergillus fumigatus. Возбудители аспсргиллеза продуцируют протеолитические ферменты и эндоток­син; на растительных остатках и в почве ведут себя как сапрофиты; в организме животных проявляют патогенное действие, вызывая образование гранулем и оча­гов некроза.

Эпизоотологические данные.Болезнь поражает птиц всех воз­растов (особенно молодняк), эмбрионы, а также млекопитаю­щих: лошадей, рогатый скот, оленей, обезьян, кошек, лаборатор­ных животных. Распространение болезни зависит от степени заражения грибами объектов внешней среды и резистентности животных. Иногда заболевает до 30-50% молодняка птиц. Ис­точник возбудителя болезни — больные птицы и млекопитающие животные, загрязняющие своими выделениями корма, подстил­ку, инвентарь, гнезда, яйца. Вспышки болезни возникают в связи со скармливанием животным пораженных грибом кормов или содержанием на заплесневелой подстилке. Яйца обсеменя­ются спорами грибов в период транспортировки; при инкубиро­вании таких яиц споры проникают в эмбрионы. Заражение воз­можно и в период наклева (в выводном шкафу), и в комнате для сортировки цыплят.

Болезнь проявляется в любое время года, но чаще в мае-июне. Заражение происходит через органы дыхания или пищева­рения.

Патогенез.В месте внедрения возбудителя возникает воспале­ние, образуются гранулемы, в центре которых находится некро­тическая масса (чаще в органах дыхания), содержащая мицелий гриба. Развивается пневмония. У птиц кроме легких и бронхов поражаются воздухоносные мешки. Поражаются также печень, селезенка, сердце, плевра и другие серозные покровы. Токсины гриба вызывают не только локальное воспаление, но и общую интоксикацию организма.

Клинические признаки.Течение болезни у взрослых птиц хро­ническое, у молодняка острое и подострое. Инкубационный пе­риод 3-10 дней. При остром течении птица малопо­движна, крылья опущены, глаза закрыты, пушок и перья взъеро­шены, аппетит отсутствует. Появляются зевота, одышка, клюв раскрыт, шея вытянута, отмечаются истечение из носа, посине­ние гребня, клюва, лапок. Угнетение и слабость усиливаются, возникают конвульсивные движения конечностями, и птица по­гибает. Длительность болезни 1-4 дня. Летальность до 100%. При подостром течении у цыплят более старшего воз­раста болезнь длится 6-12 дней. Отмечают признаки пневмо­нии, а также поражения воздухоносных мешков — вдох сопро­вождается характерным свистящим хрипом. Аппетит отсутствует, бывает понос. При хроническом течении — прогресси­рующее истощение, понос, затрудненное дыхание.

У других животных в большинстве случаев болезнь протекает бессимптомно. При значительном поражении органов дыхания появляются признаки бронхита и катаральной пневмонии, позд­нее — эмфиземы. Снижается аппетит, у коров уменьшаются удои.

Патологоанатомические изменения.Трупы птиц истощены. Легкие отечны, на их поверхности и на разрезе, в бронхах, воздухоносных мешках и на серозных покровах внутренних орга­нов обнаруживают небольшие серые или серо-желтые узелки, на разрезе которых видны концентрические наслоения разросшейся грануляционной ткани. При вскрытии погибших эмбрионов птиц обнаруживают темно-зеленые или черные колонии гриба.

Диагнозставят по клинико-эпизоотологическим, патологоанатомическим данным и результатам лабораторных исследований. В лабораторию для микрологического исследования направляют пораженные органы, трупы птиц, яйца и эмбрионы. Нередко возникает необходимость исследования кормов и подстилки, ко­торые могут быть факторами передачи возбудителей болезни.

Дифференциальный диагноз. У птиц аспергиллез нужно дифференцировать от туберкулеза, колигрануломатоза, пуллороза, а у других животных — от пневмоний, вызванных другими причинами. Окончательный диагноз ставят при выделе­нии культуры гриба — возбудителя аспергиллеза.

Лечение.В большинстве случаев оно неэффективно. В начале вспышки аспергиллеза птиц с лечебно-профилактической целью можно применить йодистые препараты (йодистый калий, люголевский раствор) с кормом, водой. Эффективны также аэрозоли йодистого алюминия, однохлористого йода и особенно йодтриэтиленгликоля в дозе 200 мг/м в течение 3 дней подряд (3-4 курса с 2-дневными интервалами между ними).

Профилактика и меры борьбы.Запрещается скармливать пора­женные грибом корма и использовать зараженную подстилку. Для перевозки инкубационных яиц используют только дезинфи­цированную тару. Дезинфицируют инвентарь и инкубаторы перед закладкой яиц и в период инкубации. Яйца овоскопируют и при обнаружении темных пятен колоний гриба выбраковыва­ют. В обязательном порядке дезинфицируют все закладываемые в инкубатор яйца. Тщательно дезинфицируют помещения (обо­рудование и инвентарь) перед размещением в них новых партий молодняка птиц.

При установлении аспергиллеза больных птиц уничтожают, ос­тальным вводят аэрозольным методом йодистые препараты, кото­рые кроме лечебного действия обеззараживают воздух и поверх­ности в помещениях. Корма и подстилку, пораженные грибом, уничтожают. Для дезинфекции помещений используют фунгицидные дезинфектанты (5-10%-ный хлорамин Б, гипохлор, со­держащий 5-10% активного хлора, оксифенолят натрия и др.).

Дерматомикозы(Dermatomycosis), стригущий лишай(Herpes tonsurans) — инфекционные болезни кожи и ее производных, вызываемые патогенными грибами — дерматофитами. Наибольшее распространение среди животных имеют три­хофития и микроспория.

Трихофития (Trichophytia) — инфекционная болезнь живот­ных и человека, характеризующаяся образованием на коже резко ограниченных круглых пятен, голых или сохранивших остатки волос, воспалительной реакцией кожи и фолликулов с выделени­ем серозно-гнойного экссудата и образованием корок.

Распространенность.Болезнь регистрируют повсеместно.

Возбудитель — грибы рода Trichophyton. Возбудитель трихофитии у парноко­пытных — Tr. faviforme (verrucosum); у лошадей — Tr. equinum; у свиней, кошек, собак, лошадей, пушных зверей, грызунов — Tr. gypseum. Это — грибы из группы несовершенных грибов Fungi iniperfecli, близко стоящих к плесеням. Они растут на коже и волосах, а также на сене, соломе, дереве, навозе и искусственных питательных средах. На коже и волосе паразитируют в виде мицелия, гифы которого лежат рядами по длине волоса у его основания. Споры гриба однокле­точные, овальные, расположены внутри мицелия, их размер 3-8 мкм.

Гриб очень устойчив. В патологическом материале (волос, чешуйки кожи) сохраняется до 7 лет, в почве — до 142 дней, в навозе — до 8 мес. Споры выдержи­вают нагревание до 100 °С (сухой жар) в течение 1ч. Губительно действуют на возбудителя ультрафиолетовые лучи. Из дезередств наиболее эффективны 10%-ный серно-карболовый раствор, подогретый до 50 °С; 5%-ный раствор формалина с содержанием 1% едкого натра, 10%-ный раствор едкого натра, 10%-ный раствор однохлористого йода.

Эпизоотологические данные.Чаще поражаются крупный рога­тый скот, лошади, собаки, кошки. Свиньи, овцы и козы болеют редко. Заражаются и дикие животные, особенно грызуны. Наи­более восприимчивы телята в возрасте от 2 мес до 1 года.

Источник возбудителя инфекции — больные животные. Занос возможен ухаживающим персоналом, с кормом, подстилкой. Переносчиками могут быть эктопаразиты. Заражение скота про­исходит при контакте больных и здоровых животных в помеще­ниях, на пастбищах, при транспортировке. Факторами передачи возбудителя могут быть контаминированные грибом предметы ухода, подстилка, навоз и т.д. Важную роль в распространении болезни играют мышевидные грызуны.

Случаи заболевания возникают в течение круглого года, но наиболее часто — осенью и зимой, чему благоприятствуют сырая влажная погода и плохой уход за кожей животных.

Патогенез.Попав на кожу, споры или мицелий гриба враста­ют в волосяные фолликулы и размножаются в них, а также, в эпидермисе непосредственно под слоем ороговевших клеток. Эн­дотоксины гриба и продукты неполного распада кератина вызы­вают воспалительный процесс, появляются быстро лопающиеся пузырьки, превращающиеся в корочки, вследствие чего пора­женная кожа шелушится. Гриб проникает в лимфу и кровь, а с ними — в другие участки кожи.

Гриб и его токсины вызывают набухание и дегенеративные изменения клеток корневого влагалища, в результате чего нару­шается питание волос, они расщепляются и становятся ломкими. При трихофитии устанавливают повышение температуры и лей­коцитоз. У многих животных развивается истощение из-за нару­шения обмена веществ.

Клинические признаки.Различают поверхностную, глубокую (фолликулярную), стертую (атипичную) формы болезни. Инкуба­ционный период 8-30 дней. У крупного рогатого скота поража­ется кожа головы, шеи, боков и реже спины, области ануса, а у телят — кожа вокруг рта, около глаз, лба и основания ушей.

При поверхностной форме трихофитии вначале за­метны только возвышающиеся над здоровыми участками, кожи резко ограниченные пятна с взъерошенными волосами, возника­ет зуд в пораженных местах. Пятна увеличиваются и покрывают­ся тонкими корками; через 1-2 мес корки отторгаются, остают­ся голые места, на которых шелушится кожа. Затем начинается отрастание волос. Такая форма болезни наблюдается у взрослого крупного рогатого скота.

Глубокая (фолликулярная) форма наблюдается у телят и характеризуется выраженным воспалительным процес­сом в местах поражений кожи с выделением экссудата, который подсыхает, образуя толстые корки (до 1 см). Поражения со вре­менем увеличиваются, особенно на голове, и вся морда имеет такой вид, будто она вымазана тестом. Больные телята теряют упитанность, отстают в развитии и росте.

Стертая (атипичная) форма бывает летом. Замет­но лишь облысение кожи без характерных признаков воспале­ния. У лошадей чаще поражается кожа крупа, боков, головы, шеи, груди, спины; возможна любая из описанных клинических форм болезни.

У собак и кошек поражается кожа головы, шеи и ног (пре­имущественно глубокая форма).

У овец и коз трихофития бывает редко, поражения локализу­ются у основания ушей, в области лба, носа, век, затылка, голодной ямки. Формы болезни такие же, как у крупного, рога­того скота. У свиней поражается кожа на голове, груди, спине, но болезнь протекает доброкачественнее, чем у рогатого скота. У пушных зверей трихофития протекает, как и у сельскохозяйст­венных животных.

Диагноз ставят на основании клинических и эпизоотологичес­ких данных. Важно поставить диагноз, когда болезнь еще не получила широкого распространения. В сомнительных случаях с границы пораженного и здорового участков направляют в лабо­раторию соскобы. При необходимости делают посев на специ­альные среды.

Дифференциальный диагноз. Трихофитию у мел­ких животных и рогатого скота следует отличать от микроспо­рии, используя люминесцентный метод исследования. Трихофи­тию дифференцируют и от чесотки, при которой поражения не имеют округлой формы, нет толстых корочек, а при микроско­пическом исследовании обнаруживают чесоточных клещей. Эк­земы, дерматиты незаразной этиологии возникают лишь у от­дельных животных; вид поражений иной — нет характерных для трихофитии резко ограниченных круглых пятен, волосы не обла­мываются.

Лечение. Если оно своевременно начато и проводится тща­тельно и регулярно, есть возможность предотвратить рассеивание возбудителя. На время лечения животных следует изолировать. С лечебной целью применяют вакцину ЛТФ-130 и другие средства. Эффективны такие фунгицидные средства, как однохлористый йод, трихоцетин, POCK, СК-9, мазь «Ям». С положительным результатом испытан антибиотик гризеофульвин, который при­меняют с кормом (см. «Практические занятия»).

Иммунитет. У переболевших животных вырабатывается имму­нитет, и, как правило, они повторно не болеют. В сыворотке крови обнаружены антитела. Созданы средства активной специ­фической профилактики трихофитии: вакцина ЛТФ-130 для круп­ного рогатого скота (сухая вакцина из штамма трихофитон-130), СПЫ — вакцина для лошадей и «Ментавак» — для пушных зве­рей и- кроликов. Вакцины безвредны, применяются с профилак­тической и лечебной целями. Иммунитет у привитых животных сохраняется практически пожизненно.

Профилактика и меры борьбы.Необходимо соблюдать правила ухода за животными, профилактически дезинфицировать поме­щения, инвентарь и предметы ухода, проводить дератизацию, полноценно кормить, ежемесячно осматривать животных с целью выявления первых случаев заболевания. В благополучных и угрожаемых хозяйствах с профилактической целью телят с месячного возраста иммунизируют вакциной ЛТФ-130.

При установлении болезни хозяйство или часть его объявляют неблагополучными. Больных изолируют и лечат фунгицидными средствами или проводят вакцинотерапию. Для ухода за этой группой животных выделяют отдельный персонал. Остальных животных вакцинируют с профилактической целью. Подрастаю­щий молодняк иммунизируют по достижении прививочного воз­раста. Проводят очистку и дезинфекцию после каждого случая выявления больных животных, текущую дезинфекцию не реже 1 раза в декаду. Для дезинфекции помещений, внутреннего обо­рудования используют 5%-ный раствор формалина с содержани­ем 1% едкого натра или формалин-керосиновую эмульсию, со­стоящую из 10 частей формалина, 10 — керосина, 5 — креолина и 75 частей воды.

Поверхность почвы обезвреживают взвесью хлорной извести, содержащей не менее 5% активного хлора, 4%-ным раствором формальдегида. Навоз обезвреживают биотермическим способом. Дезинфицировать нужно и предметы ухода, упряжь, одежду уха­живающего персонала. Всю работу проводят, соблюдая меры личной профилактики.

Хозяйство объявляют благополучным по трихофитии через 2 мес после последнего случая выявления клинически больных животных при условии проведения заключительной дезинфек­ции.

Микроспория (Microsporia) — инфекционная болезнь животных и человека, вызываемая грибами рода Microsporum и характери­зующаяся поверхностным воспалением кожи и ее производных.

Распространенность.Болезнь встречается повсеместно.

Возбудители — грибы из рода Microsporum, чаще всего виды М. equinum (по­ражает лошадей), М. lanosum (чаще всего поражает кошек, собак, пушных зве­рей), М.gypseum (поражает кошек, собак, лошадей, иногда телят и других живот­ных), М. nanum (поражает свиней). Споры гриба располагаются внутри и на поверхности пораженного волоса.

Эпизоотологические данные.Микроспория чаще встречается у кошек, собак и лошадей. Восприимчивы также пушные звери, крысы, мыши, морские свинки.

Источник возбудителя — больные животные; для человека — главным образом больные кошки и собаки. 85% случаев заболе­вания людей связано с заражением от кошек.

Болезнь регистрируют в любое время года, но чаще — в осен­не-зимний период. Нередко отмечают крупные вспышки болез­ни, особенно среди пушных зверей.

Патогенез.Такой же, как при трихофитии.

Клинические признаки.Как и при трихофитии, различают по­верхностную, глубокую и атипичную формы болезни. Инкубаци­онный период 22-47 дней.

У лошадей поражается кожа головы, шеи, области лопаток, холки, крупа, конечностей. При поверхностной форме появляются небольшие воспаленные участки, на которых замет­ны пузырьки величиной с просяное зерно. Они лопаются, обра­зуются асбестоподобные корочки. Волосы в местах поражения обламываются, наблюдается зуд. Глубокая форма встре­чается редко, клинические признаки при этом такие же, как при трихофитии. Стертая форма бывает летом.

У кошек микропория протекает преимущественно в поверх­ностной и стертой (субклинической) формах. Поражается кожа головы, внутренней поверхности ушных раковин, туловища и лап. В местах поражения выпадают волосы, кожа шелушится, отечная. При стертой форме таких признаков нет, поражены лишь отдельные волоски в разных местах. Обнаружить их удает­ся только с помощью люминесцентного метода.

У собак болезнь протекает в поверхностной форме, пораже­ния локализуются на коже морды, туловища, хвоста, иногда — на коже лап.

У пушных и хищных зверей микроспория протекает в поверх­ностной, глубокой и стертой формах.

Диагнозпоставить часто довольно трудно, поскольку клини­ческие признаки микроспории, особенно при стертой форме, недостаточно выражены. Использование люминесцентного метода, особенно у кошек, облегчает постановку диагноза. В отличие от трихофитии волосы, пораженные грибами рода Microsporum, под действием ультрафиолетовых лучей дают зеленое свечение. При необходимости в лаборатории проводят микроскопическое исследование патологического материала и посев на специаль­ные среды.

Лечение и меры борьбы.Они не отличаются от таковых при трихофитии. Для специфической профилактики микроспории приняты вакцины вандерм, поливак. При работе с больными животными надо строго соблюдать меры личной профилактики.

Дата добавления: 2015-11-23 ; просмотров: 749 | Нарушение авторских прав

источник

Владельцы патента RU 2403064:

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии. Вирусвакцина содержит антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» вируса оспы овец (BOO), Variola virus ovinum, сем. Poxviridae, подсем. Chordopoxvirinae, рода Capripoxvirus, полученного в культуре клеток гонад козы Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см 3 , депонированного в коллекцию ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером (ссылкой) «ВНИИЗЖ», и стабилизатор. Дополнительно вакцина содержит антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз (ВОК) Variola virus caprinum, сем. Poxviridae, подсем. Chordopoxvirinae, рода Capripoxvirus, полученного в культуре клеток гонад козы Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см 3 и депонированного в коллекцию ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером (ссылкой) «ВНИИЗЖ 2003» — ДЕП, в соотношении, мас.%: антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO 40,0-45,0, антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК — 40,0-45,0, стабилизатор — остальное. Вирусвакцина стерильна, специфична, обладает высокой иммуногенной активностью, безвредна для овец и коз. 9 табл., 4 ил.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении средств специфической профилактики оспы овец и оспы коз.

Оспа овец и оспа коз — высококонтагиозные вирусные заболевания мелких жвачных, проявляющиеся интоксикацией организма, лихорадкой, папулезно-пустулезными поражениями кожи и слизистых оболочек, часто с летальным исходом, особенно среди молодняка. Они наносят животноводству огромный экономический ущерб, слагающийся из гибели и вынужденного убоя больных животных, снижения продуктивности, затрат на проведение ветеринарно-санитарных и охранно-карантинных мероприятий.

В соответствии с классификацией, установленной Международной комиссией по таксономии вирусов (International Committee on Taxonomy of Viruses — ICTV) вирус оспы относится к роду 00.058.1.04 Capripoxvirus, принадлежащему к подсемейству 00.058.1 Chordopoxvirinae семейства 00.058 Poxviridae (1).

Род Capripoxvirus включает вирус оспы овец (BOO), вирус оспы коз (ВОК) и вирус кожной бугорчатки КРС (вирус нодулярного дерматита (ВБ)). Представители рода близкородственны, что доказывается иммунологическим анализом и структурой генома. Так ВОК является близкородственным BOO, но таксономически самостоятельным видом. BOO и ВОК не обладают четко выраженной хозяйской специфичностью: несмотря на то что обычно вирусы вызывают наиболее выраженное заболевание либо у овец, либо у коз, некоторые штаммы патогенны для обоих видов животных-хозяев (2, 3).

В связи с этим на практике, как правило, не дифференцируют два этих заболевания, а обычно обозначают как единое заболевание — оспа овец и коз.

Именно под таким названием заболевание оспа овец и коз приводится в перечне Международной организации здравоохранения животных (МЭБ) болезней, обязательных к декларированию, хотя это и затрудняет анализ реальной распространенности оспы овец и оспы коз как отдельных заболеваний.

По данным МЭБ эти заболевания регистрируются на всех континентах, за исключением Австралии и Океании. В последние годы оспа получила широкое распространение и в тех странах, где раньше никогда не регистрировалась (Вьетнам, 2005; Монголия, 2006; Греция, 2007).

Напряженная ситуация остается в странах СНГ Среднеазиатского и Кавказского регионов (Казахстан, Таджикистан, Киргизия, Азербайджан, Грузия). В 1996-2003 гг. неблагополучными по этим заболеваниям были 55 стран, в том числе 7 стран СНГ. Так, в Таджикистане в 2000 г. оспу коз регистрировали в виде отдельных случаев, в 2001 г. — уже во всех зонах республики. Вначале заболевание выявлялось только у коз ангорской породы, а в 2002 г. — и у коз местных пород.

В течение длительного времени Россия оставалась благополучной по данным заболеваниям. Однако во время вспышки в 1993 г. на юге Российской Федерации (РФ) в Ставропольском крае и Дагестане в 5 очагах оспой заболело 1413 животных, из которых пало 628 голов. В дальнейшем в России отмечалось увеличение количества очагов и оспа мелкого рогатого скота в 1994-1999 гг. проявлялась ежегодно. За это время было зарегистрировано 85 очагов оспы преимущественно среди овец. В 2002 г. во время вспышки оспы овец на Дальнем Востоке отмечались единичные случаи заболевания коз, а в 2003 г. оспа коз проявила себя как самостоятельное заболевание.

В связи с тем что Россия имеет общую границу и тесные экономические связи со многими неблагополучными по оспе государствами, заболевание представляет большую угрозу для нашей страны в отношении возможности заноса возбудителей болезни.

Создавшаяся эпизоотическая ситуация по оспе овец и оспе коз свидетельствует о необходимости иметь высокоэффективные диагностические препараты и средства специфической профилактики как против оспы овец, так и против оспы коз, которые в короткие сроки позволили бы идентифицировать возбудителей этих заболеваний и быстро купировать распространение инфекций.

Это обстоятельство вынуждает вести постоянный поиск новых штаммов BOO и ВОК, пригодных для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики оспы овец и оспы коз.

В странах, где отмечены вспышки этих заболеваний, специфическая профилактика оспы овец и оспы коз проводится с помощью культуральных вирусвакцин из аттенуированных штаммов возбудителей заболеваний и инактивированных тканевых и культуральных вакцин, которые производят в виде монопрепаратов.

В результате многочисленных исследований установлено, что инактивированные вакцины уступают вирусвакцинам по иммуногенной активности.

Известно использование в ряде стран вирусвакцины из аттенуированного штамма RM/65 BOO, но она оказалась не эффективной против некоторых местных полевых изолятов BOO в Индии и Марокко (4, 5, 6). В связи с этим были получены аттенуированные варианты BOO из местных эпизоотических штаммов (7, 8).

В нашей стране получили культуральную вирусвакцину против оспы овец из вируса, адаптированного к культуре клеток почки крольчат, и проверили ее в производственных условиях (9).

Известна вирусвакцина против оспы овец, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма Variola ovina ВГНКИ (НИСХИ) №77 BOO, полученного в культуре клеток почки ягнят с титром инфекционной активности 5,0÷6,0 lg ТЦД_50/см 3 , и целевую добавку в виде стабилизатора, в соотношении, мас.%:

Известна вирусвакцина против оспы овец, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма Sheep capripoxvirus ВГНКИ №6 BOO, полученного в подкожной клетчатке овец с титром инфекционной активности 4,0÷6,5 ИД_50/0,2 см 3 , и целевую добавку в виде стабилизатора в соотношении, мас.%:

Известна вирусвакцина против оспы овец, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток гонад козы Capra hircus L. (в культуре клеток Ch-91) с титром инфекционной активности 5,0÷6,5 ТЦД_50/см 3 , и целевую добавку в виде стабилизатора в соотношении, мас.%:

Известна вирусвакцина против оспы овец, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «НИСХИ» BOO, полученного в культуре клеток почки овцы ПО-ВНИИВВиМ с инфекционной активностью 5,5-6,0 ТЦД_50/см 3 , и целевую добавку в виде стабилизатора в объемном соотношении 1:1 (13).

Известна вирусвакцина против оспы коз, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «Durg» BOK, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде стабилизатора в эффективном соотношении (14).

Известна вирусвакцина против оспы коз, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «GT₄-STV₄₂» BOK, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде стабилизатора в эффективном соотношении (15).

Известна вирусвакцина против оспы коз, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «Mysore» BOK, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде стабилизатора в эффективном соотношении (16).

Известна вирусвакцина против оспы коз, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «Gorgan» BOK, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде стабилизатора в эффективном соотношении (17).

Известна вирусвакцина против оспы коз культуральная сухая, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «ОК/А-04» BOK, полученного в культуре клеток почки овцы ПО-ВНИИВВиМ с титром инфекционной активности 5,5÷6,0 ТЦД_50/см 3 , и целевую добавку в виде лактозо-пептонного стабилизатора в объемном соотношении 1:1 (18).

Недостатки вышеприведенных вирусвакцин против оспы овец и оспы коз состоят в том, что они являются монопрепаратами и содержат в своем составе лишь один из двух вакцинных штаммов, и их последовательное независимое введение оказывает более сильное стрессовое воздействие на организм иммунизированных животных и требует удвоенного количества трудовых затрат при вакцинации.

Указанные недостатки могут быть устранены созданием ассоциированных вакцин. Уже известна первая попытка создания таких препаратов.

Известна ассоциированная вакцина против сибирской язвы и оспы овец, содержащая смесь из суспензии жизнеспособных спор сибиреязвенного вакцинного штамма «55-ВНИИВВиМ» в исходной концентрации 180-360 млн спор/см 3 и антигенного материала из аттенуированного штамма «НИСХИ» BOO, полученного в культуре клеток почки овцы ПО-ВНИИВВиМ с инфекционной активностью не менее 5,0 lg ТЦД_50/см 3 , и лактозо-пептонный стабилизатор в эффективном соотношении (19).

Недостаток указанной вакцины состоит в том, что она обладает низкой иммуногенной активностью и не обеспечивает удовлетворительной защиты животных против эпизоотического BOO, циркулирующего на территории Российской Федерации.

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вирусвакцина против оспы овец, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток Ch-91 с титром инфекционной активности 5,0÷6,0 lg ТЦД_50/см 3 , и целевую добавку в виде стабилизатора в соотношении, мас.%:

Существенный недостаток вирусвакцины-прототипа состоит в том, что она не создает защиты против оспы коз.

В связи с этим проблема создания ассоциированной вирусвакцины против оспы мелких жвачных животных, обладающей высокой иммуногенной активностью и безвредностью, продолжает оставаться актуальной и является основным направлением исследований.

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в получении вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз культуральной сухой, создающей эффективную защиту мелких жвачных животных против возбудителей оспы.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала высокоиммуногенных, безвредных и ареактогенных ассоциированных вирусвакцин против оспы овец и оспы коз культуральных сухих, способных защитить мелких жвачных животных от возбудителей оспы.

Указанный технический результат достигнут созданием ассоциированной вирусвакцины против оспы овец и оспы коз культуральной сухой, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.

Согласно изобретению предлагаемая вирусвакцина содержит смесь активных веществ, состоящих из антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO (авторское наименование), из антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК (авторское наименование), полученных в культурах клеток животного происхождения, и целевую добавку стабилизатор; в объемном соотношении и в количествах, обеспечивающих протективную иммунную активность каждого антигена в организме животных после введения им целевого препарата.

BOO из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» выращивают в культуре клеток Ch-91, которая является гетерологичной по отношению к овцам.

ВОК из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» выращивают в культуре клеток Ch-91, которая является гомологичной по отношению к козам.

Для изготовления предлагаемой вирусвакцины используют вышеуказанные антигенные материалы с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см 3 , в равном объемном соотношении.

В качестве стабилизатора используют защитную среду, содержащую 5% сахарозы, 1% желатозы и 3% гидролизата лактальбумина (ГЛА).

В результате проведенных исследований авторами изобретения определен оптимальный состав предлагаемой вирусвакцины:

1. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см 3 , в количестве 40,0÷45,0 мас.%.

2. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученного в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см 3 , в количестве 40,0÷45,0 мас.%.

3. Стабилизатор в количестве 10,0÷20,0 мас.%.

Штамм «ВНИИЗЖ» BOO получен путем адаптации исходного BOO ВГНКИ (НИСХИ) №77 к перевиваемой культуре клеток Ch-91. При стационарном способе культивирования в культуре клеток Ch-91 вирус накапливается в титрах 5,0-6,0 lg ТЦД_50/см 3 .

Аттенуированный штамм «ВНИИЗЖ» BOO депонирован 27.06.1996 г. в качестве вакцинного во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, ФГУ ВГНКИ и ему присвоен регистрационный номер (шифр) — «ВНИИЗЖ».

Штамм «ВНИИЗЖ» BOO характеризуется следующими признаками и свойствами (12).

Вирус штамма «ВНИИЗЖ» обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя оспы овец.

При подкожном введении овцам вызывает образование вируснейтрализующих и комплементсвязывающих антител.

Штамм «ВНИИЗЖ» BOO выращивают и поддерживают в перевиваемой культуре клеток Ch-91. Вирус адаптируют к указанной культуре клеток путем проведения 3-5 пассажей. Цитопатогенное действие вируса наступает через 48-96 часов на 98÷100% поверхности зараженного монослоя культуры клеток. При стационарном способе выращивания в культуре клеток Ch-91 вирус накапливается в титрах 5,0÷6,0 lg ТЦД_50/см 3 .

При подкожном введении BOO штамма «ВНИИЗЖ» в дозе 1000 ТЦД₅₀ создает стойкий иммунитет у привитых овец на 4÷5 день после вакцинации продолжительностью 12 месяцев.

BOO штамма «ВНИИЗЖ» безвреден для овец при подкожном введении. Не передается контактным путем чувствительным животным. Для лабораторных животных (кроликов, морских свинок, мышей) не является патогенным. При введении вакцины в прививной дозе в разведении 1:25 кожной и температурной реакции не отмечается.

BOO штамма «ВНИИЗЖ» ареактогенен для овец при подкожном введении. У овец может вызывать исчезающую через 5÷7 дней местную реакцию в виде воспалительного отека размером 2×3 см при введении вируса в нативном виде по 5,0 см 3 подкожно в бесшерстный участок подмышечной области.

Реверсибельность и контагиозность

BOO штамма «ВНИИЗЖ» не восстанавливает вирулентных свойств после 5 последовательных пассажей на овцах (не реверсибелен) и не передается при совместном содержании привитых и интактных овец (не контагиозен).

Стабильность свойств при пассировании

Основные иммунобиоогические свойства штамма стабильно сохраняются на протяжении 10 пассажей в перевиваемой культуре клеток Ch-91 (срок наблюдения).

В нативном состоянии штамм «ВНИИЗЖ» BOO не снижает своей активности в течение 3 месяцев при плюс 4°С, в лиофилизированном виде в присутствии 3% пептона, 5% сахарозы и 1% желатина его активность остается на исходном уровне при плюс 4°С и минус 20°С в течение 2 лет (срок наблюдения). После восстановления из лиофилизированного состояния физиологическим раствором вирус не инактивируется при комнатной температуре в течение 24 часов, при минус 4°С — 7 суток.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003», ВОК был выделен в 2003 г. в Приморском крае Российской Федерации от больных оспой коз.

Для получения вируса, обладающего оптимальными биологическими свойствами, использовали различные системы культивирования, в том числе линии клеток: ПО, Ch-91, ПСГК, MDBK, СПЭВ, Vero, BHK-21 и Marc-145. В процессе адаптации было установлено, что гомологичная система культивирования перевиваемая линия клеток Ch-91 высокочувствительна к ВОК и оказалась оптимальной культурой для выращивания выделенного вируса. В результате проведения 35 последовательных пассажей изолята на культуре клеток Ch-91 был получен аттенуировнный штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, имеющий стабильные биотехнологические, антигенные и иммуногенные свойства.

В зависимости от дозы заражения и количества пассажей в условиях стационарного культивирования накопление ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» в культуре клеток Ch-91 обеспечивалось на уровне от 6,0 до 7,5 lg ТЦД_50/см 3 .

По сравнению с исходным изолятом штамм «ВНИИЗЖ 2003» имеет генетические и фенотипические отличия. По результатам сравнительного изучения иммунобиологических характеристик различных штаммов ВОК установлено, что штамм «ВНИИЗЖ 2003» является авирулентным, обладает хорошей антигенной и иммуногенной активностью и защищает от контрольного заражения гомологичным эпизоотическим вирусом.

Преимущество штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК по сравнению с аналогичными штаммами заключается в стабильно высоком накоплении вируса в культуре клеток Ch-91 и его высокой биологической, антигенной иммуногенной активности.

Штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК депонирован 6 июня 2006 г. во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве. Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ ВГНКИ) под регистрационным номером (ссылкой) — производственный вакцинный штамм «ВНИИЗЖ 2003» — ДЕП ВОК.

Штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК характеризуется следующими признаками и свойствами.

Штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК относится к роду Capripoxvirus, семейства Poxviridae и обладает морфологическими признаками, характерными для ВОК.

Вирион ВОК состоит из вирусной сердцевины (нуклеоида), овальных латеральных тел и наружной оболочки. Нуклеоид окружен гладкой мембраной толщиной 5 нм. Внутри него находится нуклеопротеин (ДНК, связанная с белком), имеющий S-образную или более сложную форму. Чувствительные к трипсину структуры, называемые боковыми телами, сдавливают нуклеоид, придавая ему форму двояковогнутого диска, имеющего на срезе вид гантели. Нуклеоид и боковые тела окружены наружной оболочкой, состоящей из липидов и трубчатых белковых структур (10×5 нм).

Геном представлен двухцепочечной ДНК. Две цепи ДНК соединены шпилькообразными петлями, в результате чего образуется одна непрерывная, ковалентно связанная полинуклеотидная цепь. Флип-флоп формы ДНК (т.н. «шпильки») образованы инвертированными концевыми повторами: идентичными, но противоположно ориентированными последовательностями ДНК, длина которых варьирует даже в пределах одного рода (Классификация и номенклатура вирусов позвоночных, 2002).

По своим антигенным свойствам штамм «ВНИИЗЖ 2003» относится к ВОК.

Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой в реакции нейтрализации (РН) на культуре клеток Ch-91, в реакции диффузионной преципитации (РДП) и в реакции длительного связывания комплемента (РДСК). Штамм проявляет антигенную активность в РДП 1:16÷1:32, в РДСК 1:120÷1:160 и в иммуноферментном анализе (ИФА) 1:1000÷1:4000.

Испытания вирусвакцины против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» в лабораторных условиях показали, что иммунизация коз сопровождается образованием вируснейтрализующих антител в крови животных в титре не менее 2,0 log₂.

Штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК проявляет высокую биологическую, антигенную иммунологическую активность в лиофилизированном виде и в виде культуральной вируссодержащей суспензии. Штамм предназначен для изготовления вакцинных и диагностических препаратов. Вирус штамма «ВНИИЗЖ 2003» репродуцируется в монослойных культурах клеток: первичнотрипсинизированной культуре клеток почки овцы и перевиваемой культуре клеток Ch-91, — и в течение 5-7 суток инкубирования накапливается в титре не менее 5,5 lg ТЦД_50/см 3 . Сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 35 пассажей.

Геном ВОК не обладает инфекционностью и представлен молекулой линейной двухцепочечной ДНК с центральным менее вариабельным участком длиной около 145 нв и более вариабельными концами.

При электронной микроскопии штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК были выявлены вирусные частицы, структура и размеры которых характерны для каприпоксвирусов.

Вирионы оспы имеют линейную двухслойную ДНК длиной 45÷60 мкм, молекулярной массой 80÷240 МДа. Плавучая плотность ДНК вирусов оспы в хлористом цезии и сахарозе равна 1,676÷1,723 г/см 3 . Важной особенностью ДНК вируса оспы является необычно прочная структура двухспиральной молекулы. Обе нити молекулы ДНК связаны между собой ковалентно.

Устойчивость к внешним факторам

ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» устойчив к высушиванию эфиром, не стоек к воздействию высокой температуры, различных химических веществ, например формалину (0,5÷1%), слабым растворам йода (1:10000), соляной, серной кислот (2,5%), спирту, его инфекционная активность сохраняется при pH 6,0÷7,4.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность — иммуногенен в составе живой лиофилизированной вакцины.

Реактогенность — в месте подкожного введения нативного вируса в объеме 5 см 3 образуется кожный тяж длиной до 4 см.

Патогенность — при внутримышечном введении животным заболевания не вызывает. При испытании вирусвакцины против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» на козах было установлено, что она не вызывала ответной местной реакции на подкожное введение в объеме 5 см 3 (125 прививных доз), была безвредна и ареактогенна для коз.

Вирулентность — авирулентен для мелких жвачных животных при контрольном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Антигенные свойства — вирус индуцирует у коз и овец образование вируснейтрализующих антител.

Стабильность биологических свойств — сохраняет исходные характеристики при пассировании на культуре клеток Ch-91 в течение 35 пассажей. Штамм нереверсибелен в течение 5 пассажей на козах.

При изготовлении вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO и антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученных в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см 3 , смешивают в равном объемном соотношении, а затем к полученной смеси добавляют стабилизатор в соотношении, мас.%:

Содержание антигенных материалов и стабилизатора в прививной дозе предлагаемой вирусвакцины в вышеуказанном соотношении является оптимальным, так как обеспечивает толерантную презентацию каждого антигена в организме иммунизированных животных.

Полученную смесь расфасовывают в ампулы по 2,0 см 3 или во флаконы по 4,0 см 3 , замораживают при температуре минус 50°С и подвергают лиофильному высушиванию. После сублимации ампулы (флаконы) заполняют сухим стерильным воздухом или инертным газом, ампулы запаивают, а флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают металлическими колпачками. Контроль качества полученного препарата проводят на стерильность, безвредность, специфичность и иммуногенную активность в соответствии с показателями, установленными стандартом организации-изготовителя.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:

1. Вирусвакцина ассоциированная против оспы овец и оспы коз культуральная сухая.

3. Активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток животного происхождения, в эффективном количестве.

4. Активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученного в культуре клеток животного происхождения, в эффективном количестве.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вирусвакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:

1. Вирусвакцина ассоциированная против оспы овец и оспы коз культуральная сухая.

2. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток животного происхождения и депонированного в коллекцию ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером (ссылкой) «ВНИИЗЖ».

По сравнению с вирусвакциной-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемой вирусвакцины является то, что она содержит дополнительно антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК Variola virus caprinum, сем. Poxviridae, подсем. Chordopoxvirinae, рода Capripoxvirus, полученного в культуре клеток животного происхождения и депонированного в коллекцию ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером (ссылкой) «ВНИИЗЖ 2003» — ДЕП, в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток Ch-91, в эффективном количестве.

2. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см 3 , в количестве 40,0÷45,0 ТЦД_50/см 3 .

3. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученного в культуре клеток Ch-91, в эффективном количестве.

4. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученного в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см 3 , в количестве 40,0÷45,5 мас.%.

5. Стабилизатор в эффективном количестве.

6. Стабилизатор в количестве 10,0÷20,0 мас.%.

7. Смесь из антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, из антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученных в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см 3 , и стабилизатора, взятых в соотношении, мас.%:

Предлагаемое изобретение расширяет арсенал вирусвакцин ассоциированных против оспы овец и оспы коз культуральных сухих, обладающих высокой антигенной и иммуногенной активностью и обеспечивающих эффективную защиту мелких жвачных животных от возбудителей оспы.

В результате проведенных исследований авторами предлагаемого изобретения установлено, что между антигенами, входящими в состав предлагаемой вирусвакцины, отсутствует конкуренция.

Авторами предлагаемого изобретения обнаружено также явление синергизма при соединении указанных антигенов в предлагаемой вакцине, что позволило снизить их количественное содержание в препарате при сохранении такой же напряженности и длительности иммунитета у вакцинированных животных, как и при использовании для иммунизации соответствующих монопрепаратов.

Сущность изобретения пояснена на графических материалах, на которых на:

фиг.1 представлено графическое изображение изменения титра ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» при его пассировании в культуре клеток Ch-91 (доза заражения 0,01÷0,05 ТЦД_50/кл.);

фиг.2 — фотографическое изображение под электронным микроскопом характерной морфологии ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» (фото получено д.б.н. А.П.Пономаревым), увеличение ×76000;

фиг.3 — хроматограмма результатов видовой дифференциации каприпоксвирусов, полученных методом мультиплексной ПЦР с видоспецифическими праймерами, на которой:

1 — отрицательный контроль;

2 — маркер (снизу вверх — 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 п.н. и т.д.);

3 — BOO, вакцинный штамм «ВНИИЗЖ»;

4 — BOO, эпизоотический штамм «Афганский»;

5 — BOO, эпизоотический штамм «Приморский»;

6 — BOO, эпизоотический штамм «ЕАО»;

7 — BOO, эпизоотический штамм «Таджикский»;

8 — ВОК, вакцинный штамм «ВНИИЗЖ 2003»;

9 — ВОК, эпизоотический штамм «Приморский 2003»;

10 — ВОК, эпизоотический штамм «Pellor»;

фиг.4 — хроматограмма результатов видовой дифференциации BOO и ВОК, полученных методом рестрикции гена «ankyrin-repeat», на которой:

1 — маркер (снизу вверх — 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 п.н. и т.д.);

2 — BOO, вакцинный штамм «ВНИИЗЖ»;

3 — BOO, эпизоотический штамм «Афганский»;

4 — BOO, эпизоотический штамм «Приморский»;

5 — BOO, эпизоотический штамм «ЕАО»;

6 — ВОК, вакцинный штамм «ВНИИЗЖ 2003»;

7 — ВОК, эпизоотический штамм «Приморский 2003»;

8 — ВОК, эпизоотический штамм «Таджикский»;

9 — ВОК, эпизоотический штамм «Pellor».

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают объем изобретения.

Технологический процесс изготовления вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз культуральной сухой состоит из двух этапов: получения посевного BOO штамма «ВНИИЗЖ» и посевного ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» и производственной серии предлагаемого препарата.

Посевной BOO штамма «ВНИИЗЖ» выращивают в культуре клеток Ch-91. Для этого клетки штамма Ch-91, хранящиеся в жидком азоте, размораживают путем оттаивания в водяной бане при (+37)÷(+38)°C и проводят 1÷2 пассажа для восстановления исходной скорости роста в монослое. Из культурального сосуда с монослоем клеток удаляют среду культивирования. Монослой клеток дважды обрабатывают диспергирующим раствором, содержащим 0,25%-ный раствор трипсина и 0,02%-ный раствор версена, взятые в соотношении 1:3, с добавлением 0,5% декстрозы, до начала отслаивания клеток. Диспергирующий раствор сливают, вносят среду Игла с 10% сыворотки КРС и 0,03% глутамина и суспензию клеток разливают в клинские матрасы. Культуру клеток инкубируют при 37°С в течение 48÷72 часов до момента формирования плотного монослоя. Для получения антигенного материала используют суспензию лиофилизированного или нативного BOO штамма «ВНИИЗЖ» с титром инфекционной активности от 5,0 до 6,0 lg ТЦД_50/см 3 . Средняя инфицирующая доза вируса должна составлять 0,1 ТЦД₅₀/кл. Внесенную вирусную суспензию экспонируют на предварительно отмытый от остатков ростовой среды раствором Хенкса монослой в течение 1 часа при (37±0,5)°С, после чего в необходимом объеме вносят поддерживающую питательную среду ПСП. Культивирование BOO проводят в течение 12 суток при указанной температуре. При поражении вирусом площади монослоя не менее 80% (округление и появления светопреломляющего эффекта) проводят сбор вируса. Для этого содержимое клинских матрасов замораживают при температуре минус 40°С и проводят оттаивание при комнатной температуре, энергично встряхивая для отделения монослоя. Из каждого матраса берут пробу по 3 см 3 для определения контаминирующих примесей и цитопатической активности. Полученный материал хранят при минус 20°С не более 6 месяцев. При активности BOO не ниже 5,5 lg ТЦД_50/см 3 стерильный вируссодержащий материал используют для составления производственной серии ассоциированной вирусвакцины против оспы овец и оспы коз культуральной сухой.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, был выделен в 2003 г. от больных оспой коз в Приморском крае Российской Федерации. Подготовку материала проводили общепринятым методом.

Биологические и вирусологические методы включали адаптацию вируса, выделенного от больных коз, к культурам первичнотрипсинизированных и перевиваемых линий клеток и его аттенуацию. Для выращивания ВОК были испытаны различные линии культур клеток: ПО, Ch-91, ПСГК, MDBK, СПЭВ, Vero, ВПК-21, Marc-145. В процессе адаптации было установлено, что перевиваемая линия клеток Ch-91 высокочувствительна к ВОК и оказалась оптимальной культурой для получения расплодки штамма для изготовления предлагаемой вирусвакцины.

В дальнейшем для получения расплодки вирусную суспензию вносили на освобожденный от ростовой среды монослой культуры клеток и экспонировали в течение часа в термостате при температуре (37±0,5)°С. После этого вносили поддерживающую среду ПСП или Игла с добавлением 1÷2% сыворотки крови КРС. Инфицированную культуру инкубировали при (37±0,5)°С до появления ЦПД вируса, которое характеризовалось округлением клеток, скоплением их в виде групп по 10÷20 клеток и в дальнейшем тотальной деструкцией монослоя клеток. При поражении площади монослоя не менее 70÷80% (округление и появление светопреломляющего эффекта, отслоение от стекла) 3-кратным промораживанием культуральных матрасов проводили сбор вируса с последующим отбором проб для исключения микробной контаминации и определения инфекционной активности вируса титрованием его в культуре клеток Ch-91.

Выделенный вирус обладал цитопатическим действием на культуре клеток Ch-91 с первоначальным титром 3,0÷4,0 lg ТЦД_50/см 3 . В последующих пассажах на этой же культуре клеток титр вируса повышался в 6÷7-м пассажах до 5,0÷5,5 lg ТЦД_50/см 3 , в 9÷10-м пассажах до 6,0 lg ТЦД_50/см 3 .

В зависимости от дозы заражения, составляющей 0,01÷1,0 ТЦД_50/кл., накопление аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК в культуре клеток Ch-91 обеспечивалось на уровне 5,33÷7,17 lg ТЦД_50/см 3 за 4÷7 суток при 50÷90% поражении клеточного монослоя. Оптимальной инфицирующей дозой вируса считали 0,01÷0,05 ТЦД_50/кл., вызывающей при стационарном культивировании в течение 5÷7 суток накопление вируса в титре от 6,67±0,08 до 7,17±0,10 lg ТЦД_50/см 3 при 80÷90% поражении клеточного монослоя. Результаты исследований представлены в таблице 1. Стабильность культуральных свойств лиофилизированного вируса при определении степени его накопления в течение 35 пассажей в культуре клеток Ch-91 при заражающей дозе 0,01÷0,05 ТЦД_50/кл. представлена на фиг.1.

Из данных, представленных на фиг.1, следует, что в процессе пассирования в условиях стационарного культивирования ВОК с дозой заражения 0,01÷0,05 ТЦД_50/кл. его инфекционная активность 6,0÷7,5 lg ТЦД_50/см 3 отмечалась в течение первых 13 пассажей. При увеличении количества пассажей инфекционная активность вируса постепенно снижалась. Результаты исследования сроков культивирования ВОК в культуре клеток Ch-91 представлены в таблице 2.

Инфекционная активность штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК при дозе заражения 0,01÷0,05 ТЦД_50/кл зависела от количества пассажей. На уровне 8÷13 пассажей продолжительность культивирования ВОК не превышала 7 дней. За это время достигалось наиболее выраженное 80÷90% ЦПД вируса и его максимальное накопление в культуре клеток Ch-91. В дальнейшем накопление вируса установлено на более низком уровне, и инфекционная активность вируса следующих пассажей характеризовалась меньшими значениями с увеличением продолжительности культивирования.

В результате осуществления 35 последовательных пассажей выделенного ВОК на культуре клеток Ch-91 был получен аттенуированный штамм «ВНИИЗЖ 2003», имеющий стабильные биотехнологические, антигенные и иммуногенные свойства, которые позволяют использовать его для получения антигенного материала при изготовлении диагностикумов и вирусвакцины против оспы коз.

В дальнейшем культуру клеток Ch-91 использовали для получения расплодки ВОК для изготовления вирусвакцины.

Полученный штамм ВОК был испытан сначала в лабораторных, а затем и в эпизоотических условиях. В результате проведенных исследований установлено следующее:

1. Проверку на стерильность осуществляли путем высева проб вируссодержащей жидкости на бактериальные питательные среды МПБ, МПА, МППБ, агар Сабуро (жидкий) и тиогликолевую среду, а также среды Эдварда или Мартена для выявления микоплазм. Бактериальные или грибковые загрязнения штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК отсутствовали, как и контаминация другими вирусами.

2. При электронной микроскопии штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК были выявлены вирусные частицы, структура и размеры которых характерны для каприпоксвирусов (фиг.2).

3. Видовая принадлежность штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК подтверждена двумя молекулярно-генетическими методами: мультиплексной ПНР с видоспецифичными праймерами (фиг.3) и рестрикционным анализом фрагмента гена «ankyrin-repeat» белка (фиг.4).

4. Специфичность штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК была подтверждена в РДП, РДСК и ИФА.

Полученный штамм депонирован в июне 2006 г. во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером (ссылкой) — производственный вакцинный штамм «ВНИИЗЖ 2003» — ДЕП ВОК.

В ходе разработки мультиплексной ПЦР для индикации и видовой дифференциации каприпоксвирусов в результате анализа полных нуклеотидных последовательностей генома каприпоксвирусов, представленных в базе данных GenBank, были установлены видоспецифичные участки для BOO, ВОК и ВБ. На основе этих данных были сконструированы видоспецифичные праймеры S1 и S2 — для BOO, G1 и G2 — для ВОК, L1 и L2 — для ВБ. Видоспецифичные праймеры были рассчитаны таким образом, чтобы синтезируемые с их участием ампликоны имели разную длину: 415 п.н. для ВОК, 311 п.н. для BOO и 254 п.н. для ВБ. Это позволило использовать все три пары праймеров в одной реакции и различать продукты мПЦР по размеру с помощью электрофореза в агарозном геле.

В ходе видовой дифференциации каприпоксвирусов было исследовано 11 проб вируссодержащих клеточных культур с вакцинным штаммом «ВНИИЗЖ» и с эпизоотическими штаммами «Афганский», «Приморский», «ЕАО» BOO, с вакцинным штаммом «ВНИИЗЖ 2003» и с эпизоотическими штаммами «Приморский 2003», «Pellor» ВОК, с ВБ, а также с изолятами «ЕАО» и «Таджикский» в виде суспензии кожи больных животных.

На фиг.3 отражены результаты ПЦР с видоспецифичными праймерами. В пробах, содержащих ДНК штамма «ВНИИЗЖ 2003», синтезировался фрагмент длиной 415 п.н., в амплификации которого участвуют видоспецифичные для ВОК праймеры.

С помощью метода рестрикционного анализа можно также дифференцировать BOO и ВОК и определять штаммовую принадлежность BOO. С использованием родоспецифических праймеров проводится амплификация участка гена «ankyrin-repeat» белка длиной 564 п.н. Затем проводится обработка амплификонов рестриктазой Dra I. В пределах амплифицируемого фрагмента генома у эпизоотических изолятов BOO расположен один сайт рестрикции Dra I, у вакцинных штаммов BOO — два сайта, у ВОК — таких сайтов нет. Анализ продуктов рестрикции в агарозном или полиакриламидном геле позволяет легко отличать BOO от ВОК и вакцинные штаммы BOO от эпизоотических изолятов по характерному набору фрагментов ДНК.

При проведении данного метода у вакцинного штамма «ВНИИЗЖ» BOO ампликон в результате обработки рестриктазой Dra I расщеплялся на три фрагмента, у всех эпизоотических изолятов BOO — на два фрагмента, а у вакцинного штамма «ВНИИЗЖ 2003» и двух эпизоотических изолятов ВОК расщепления ампликона не происходило (фиг.4).

Таким образом, при обработке эндонуклеазой Dra I фрагмента гена «akrylin-repeat» белка штамма «ВНИИЗЖ 2003» расщепления ДНК не наблюдалось, что указывает на принадлежность штамма к ВОК.

Дополнительно специфичность штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК была подтверждена и серологическими методами в РДП и РДСК. РДП и РДСК были положительными только между специфическим вирусом с гомологичной сывороткой (табл.3, табл.4).

Для получения посевного ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» используют культуру клеток Ch-91 с хорошо сформировавшимся монослоем 2-3 суточного возраста в клинских матрасах и суспензию лиофилизированного или нативного ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» с инфекционным титром от 5,0 до 6,0 lg ТЦД₅₀/см 3 . Средняя инфицирующая доза вируса составляет 0,1 ТЦД₅₀/кл. Внесенную вирусную суспензию экспонируют на предварительно отмытый от остатков ростовой среды раствором Хенкса монослой в термостате в течение часа при (37±0,5)°С, затем в необходимом объеме вносят поддерживающую питательную среду ПСП. Культивирование вируса проводят в течение 12 суток при указанной температуре.

При поражении вирусом площади монослоя не менее 80% (округление и появление светопреломляющего эффекта) проводят сбор вируса. Для этого содержимое клинских матрасов замораживают при температуре минус 40°С и проводят оттаивание при комнатной температуре, энергично встряхивая для отделения монослоя. Из каждого матраса берут пробу по 3 см 3 для определения контаминирующих примесей и цитопатической активности. Полученный материал хранят при -20°С не более 6 месяцев. При активности ВОК не ниже 5,5 lg ТЦД_50/см 3 стерильный вируссодержащий материал используют для составления производственной серии вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз культуральной сухой.

Для изготовления целевого препарата предварительно объединяют равные объемы антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного так, как описано в примере 1, и антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученного так, как описано в примере 4. Полученную смесь тщательно перемешивают, а затем в нее вносят стабилизатор при постоянном перемешивании. В качестве стабилизатора используют защитную среду, содержащую 5% сахарозы, 1% желатозы и 3% ГЛА.

Для получения одного миллиона доз ассоциированной вирусвакцины необходимо получить 20 литров суспензии BOO и 20 литров суспензии ВОК.

Из полученного антигенного материала готовят 2 серии вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз культуральной сухой, отличающихся содержанием стабилизатора в препарате.

Серия №1 предлагаемой вирусвакцины содержит, мас.%:

Серия №2 предлагаемой вирусвакцины содержит, мас.%:

Полученную вирусвакцину фасуют в ампулы по 2,0 см 3 или во флаконы по 2,0 или 4,0 см 3 , замораживают при температуре минус 50°С и подвергают лиофильному высушиванию. После сублимации флаконы (ампулы) заполняют сухим стерильным воздухом или инертным газом, закрывают резиновыми пробками и закатывают металлическими колпачками, ампулы запаивают.

Вирусвакцина ассоциированная против оспы овец и оспы коз культуральная сухая, расфасованная во флаконы или ампулы, представляет собой однородную пористую массу цилиндрической формы светло-желтого цвета, растворяющуюся в течение 1÷1,5 минут в физрастворе. В одной ампуле содержится 2,0 см 3 , а во флаконе 2,0 или 4,0 см 3 сухой вирусвакцины, содержащей соответственно в ампуле 50 и во флаконе 50 или 100 прививных доз препарата для овец и коз.

Полученный препарат подвергают контролю на стерильность, безвредность, специфичность и иммуногенную активность в соответствии с показателями, установленными стандартом организации-изготовителя.

Проведены испытания инфекционной активности вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз культуральной сухой, изготовленной так, как описано в примере 5.

Инфекционную активность аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO и аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК в полученной вирусвакцине после лиофилизации определяют титрованием десятикратных разведении вирусной суспензии каждого штамма в культуре клеток Ch-91 во флаконах. Учет результатов проводят в течение 12 суток по наличию ЦПД. Результаты титрования 2-х серий вирусвакцины представлены в таблице 5.

Инфекционная активность вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз составила 5,23±0,15 lg ТЦД₅₀/см 3 .

Результаты исследования инфекционной активности ассоциированной вирусвакцины в процессе длительного хранения представлены также в таблице 5.

При хранении в течение 36 месяцев титр вирусов оспы снижался не более чем на 0,5 lg ТЦД₅₀/см 3 . Однако следует отметить, что хранение вирусвакцины ассоциированной в течение 2÷3 недель при комнатной температуре снижало инфекционную активность вирусов на 1,0÷1,5 lg ТЦД₅₀/см 3 . По этой причине транспортировка вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз должна осуществляться при низких температурах.

Проведены испытания безвредности и реактогенности вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз культуральной сухой, изготовленной так, как описано в примере 5, и содержащей, мас.%:

Для определения безвредности и реактогенности вирусвакцину вводили козам и овцам по 5,0 см 3 в исходном разведении (125 прививных доз) подкожно в область бесшерстного участка внутренней поверхности передней конечности. За животными вели наблюдение в течение 21 суток.

При исследовании вирусвакцины на безвредность и реактогенность в единичных случаях у животных на месте введения вакцины в исходном разведении установлено образование на 4÷6 сутки воспалительного отека в виде небольшого тяжа размером от 1 до 3 см, который исчезал на 3÷14 сутки после появления и никак не отражался на клиническом состоянии животных. На протяжении всего срока наблюдения (21 сутки) температура тела овец и коз оставалась в пределах физиологической нормы. Это позволило заключить, что вирусвакцина ассоциированная против оспы овец и оспы коз культуральная сухая является безвредным и нереактогенным препаратом.

Проведены испытания антигенной активности вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз культуральной сухой, изготовленной так, как описано в примере 5, и содержащей, мас.%:

Антигенную и иммуногенную активность вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз культуральной сухой определяли на овцах и козах.

Вирусвакцину во флаконах разводили питательной средой в исходном объеме, из которого затем готовили разведения 1:25, 1:1000 и 1:10000 и вводили животным в объеме по 1,0 см 3 подкожно в подмышечной области. Использовали по 6 голов каждого вида животных на разведение 1:25 и по 2 головы на разведения 1:1000 и 1:10000. Для контроля использовали по 6 голов каждого вида животных.

Через 7, 14 и 21 сутки после вакцинации у животных отбирали пробы крови с целью получения сыворотки.

Сыворотки крови животных исследовали на наличие антител против оспы в РН с BOO и ВОК с постоянной дозой каждого вируса 100 ТЦД_50/см 3 против ряда последовательных двукратных разведении сывороток от 1:2 до 1:32.

При наблюдении за животными после вакцинации установлено, что все овцы и козы были клинически здоровы, температура тела оставалась в норме, местной реакции не выявлено.

В сыворотках крови овец и коз, иммунизированных вирусвакциной ассоциированной против оспы овец и оспы коз, через 21 сутки после вакцинации специфические вируснейтрализующие антитела (ВНА) выявляли на уровне от 0,25 до 3,17 log₂.

У всех животных, которым вводили вирусвакцину ассоциированную против оспы овец и оспы коз в разведении 1:25 (10 4 ТЦД₅₀), отмечали появление ВНА уже на 7-е сутки после вакцинации на уровне от 0,5 до 1,83 log₂, на 14-е сутки титры антител у этих животных составляли 1,0÷2,23 log₂, на 21-е сутки — 1,0÷3,17 log₂. У животных, привитых в дозе 10 ТЦД₅₀, антитела на 7-е сутки не выявляли, а на 21-е сутки титры антител составляли 0,25÷1,16 log₂, у животных, привитых в дозе 100 ТЦД₅₀, уровень антител на 21-е сутки после вакцинации составил 0,5÷1,66 log₂. Результаты исследований представлены в таблицах 6 и 7.

Следует отметить, что при постановке РН с BOO титр антител у овец был выше, чем с ВОК. А у коз при постановке РН с ВОК титры антител были выше, чем с BOO.

Через 21 сутки после иммунизации вакцинированных и контрольных овец заражали внутрикожно в области подхвостовой складки вирулентным BOO, штамм «Афганский», в дозе по 1000 ИД₅₀. Вакцинированных и контрольных коз заражали аналогично вирулентным ВОК, штамм «Приморский 2003», в дозе по 1000 ИД₅₀. В течение 14 суток после заражения за вакцинированными и контрольными животными вели наблюдение, измеряли температуру тела. При осмотре животных после заражения было установлено, что овцы и козы, иммунизированные вирусвакциной ассоциированной в разведении 1:25, оставались клинически здоровыми, повышения температуры тела и местной реакции на введение вируса не отмечали.

Козы, которым вводили вирусвакцину ассоциированную в разведении 1:1000 и 1:10000, также оставались устойчивыми к контрольному заражению вирулентным вирусом без проявления местной реакции и повышения температуры тела. У овец №8 и №10, вакцинированных разведениями 1:1000 и 1:10000 соответственно, после заражения отмечали повышение температуры тела до 40,7°С и появление гиперемии и отека на месте введения вирулентного вируса в течение всего срока наблюдения. У овцы №7, вакцинированной разведением 1:1000, температура тела повышалась до 40,5°С, которая затем приходила в норму к концу срока наблюдения. Появление характерных поражений кожи на других участках тела у этих животных не выявлено. Результаты исследований представлены в таблицах 8 и 9.

Все контрольные овцы и козы болели с характерными признаками оспы. Проявление местной реакции (гипертермии и отека) отмечали на 3÷4 сутки после заражения, появление папул на бесшерстных участках тела — на 5÷10 сутки, опухание головы и суставов у некоторых животных — на 11÷14 сутки. Болезнь всегда заканчивалась летально в период с 7-х по 14-е сутки после введения вирулентного ВОК или BOO.

Таким образом, проведенные испытания вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз культуральной сухой показали, что данная вирусвакцина стерильна, специфична, обладает высокой иммуногенной активностью, безвредна для овец и коз, предохраняет всех привитых животных от заболевания оспой, а также не реверсибельна. Предлагаемая вирусвакцина может быть рекомендована для профилактической иммунизации овец и коз против оспы.

2. Kitching R.P. The control of sheep and goats pox // Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. — 1986. — V.5, №2. — P.503-511.

3. Gershon P.O., Black D.N. A comparison of the genomes of capripoxvirus isolates of sheeps, goats and cattle // Virology. — 1988. — V.164. — P.341-349.

4. Fassi-Fehri M. et al. Etnde experimentale de l’immunite anticlaveleuse post-vaccinale // M.Fassi-Fehri, M.El-Harrak, D.Johnson // Ann. Rech. Vet. — 1984. — Vol.15. №1. — Р.59-64.

5. Sharma P.C. et al. Immunological response of RM/65 sheep-pox vaccine in lambs // P.C.Sharma, S.Prasad, S.K.Karla // Indian J. Anim. Sci. — 1987. — Vol.57. №9. — P.923-928.

6. Singh J.P. et al. Comparative evaluation of sheep-pox vaccines // Indian J. Anim. Sci. — 1984. — Vol.54. №7. — P.650-653.

7. Das S.K. et al. Indian J. Exp. Biol., 1986, 24, 6.

8. Karla S.K. et al. Indian J. Anim. Sci., 1984, 54, 5.

9. Лихачев Н.В. Аттенуированный штамм вируса оспы овец // Тез. докл. научн. конф. / ВГНКИ. — M., 1974. — C.1-2.

10. Иванющенков В.Н. и соавт. Реактогенные и иммуногенные свойства вирусвакцины против оспы овец // Ветеринария. — 1990, №7. — С.28-30.

11. Пат. РФ №1614201; A61K 39/275, 20.03.1995 г.

12. Пат. РФ №2121366; A61K 39/275, C12N 7/00, 5/00, 5/02; 10.11.1998 г.

13. Пат. РФ №2138291; A61K 39/275, C12N 5/00, 7/00; 27.09.1999 г.

14. Joshi R.K. Physico-chemical characterization of «Durg» isolate of goat pox virus // Indian Vet. J. — 2001. — Vol.78. №5. — P.369-370.

15. Wang Shaohua et al. The pathomorphological studies on immunological effect of attenuated goat pox cellular virus // Acta Vet. Zootechn. Sinica. — 1988. — Vol.19. №2. — P.111-116.

16. Kitching R.P., Carn V.M. Sheep pox and goat pox // OIE Manual of standarts for diagnostic test and vaccines; 4 th edn. — Paris: World organization for animal health.2000. — P.168-177.

17. Tulman E.R. et al. The genomes of pox and goat pox viruses // J. of Virol. — 2000. — V.76. №12. — Р.6054-6061.

18. Грачев Д.В. Иммунобиологические свойства вируса оспы коз, выделенного в Республике Таджикистан // Автореф. дисс. на соискание уч. степ. канд. вет. наук. — Покров, 2006. — 26 с.

19. Пат. РФ №2181296; А61К 39/07, А61К 39/275; 20.04.2002 г.

Вирусвакцина ассоциированная против оспы овец и оспы коз культуральная сухая, содержащая антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» вируса оспы овец (BOO), Variola virus ovinum, сем. Poxviridae, подсем. Chordopoxvirinae, рода Capripoxvirus полученного в культуре клеток гонад козы Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД₅₀/см 3 и депонированного в коллекцию ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером (ссылкой) «ВНИИЗЖ», и стабилизатор, отличающаяся тем, что она содержит дополнительно антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз (ВОК) Variola virus caprinum, сем. Poxviridae, подсем. Chordopoxvirinae, рода Capripoxvirus, полученного в культуре клеток гонад козы Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД₅₀/см 3 и депонированного в коллекцию ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером (ссылкой) «ВНИИЗЖ 2003» — ДЕП в соотношении, мас.%:

источник