Вирус вакцина ассоциированная против оспы овец и оспы коз культуральная сухая

Оспа овец и коз (Variola ovium) — Вирусная, остро протекающая контагиозная болезнь, вызываемая ДНК-содержащим вирусом сем. Poxviridae, рода Capripoxvirus. Оспа характеризуется лихорадкой, явлениями интоксикации, развитием на коже и слизистых оболочках папулезно-пустулезной сыпи, высокой смертностью животных, особенно молодняка. Оспой болеет и человек.

Историческая справка. Первые сведения об оспе относятся к древнейшим временам (около 3700 лет до н.э.; Египет , Индия, Китай). В Европу оспа была занесена с Ближнего Востока в 5 в. до н.э.Первые сведения об оспе овец относятся ко 2веку. Заразительность оспы овец установил Буржеля в 1763году.

В России оспа овец имела широкое распространение в 18-19 веках. В СССР болезнь была ликвидирована к 1969г. Большую роль при этом сыграло применение в ветеринарной практике гидроокисьалюминиевой формолвакцины (Н.В. Лихачев, 1944).

Возбудителя болезни впервые описал французкий исследователь Борел (1903).

В настоящее время оспа овец широко распространена в Турции, Иране, Пакистане, Афганистане, Индии, Марокко, Алжире, Тунисе, Ливии, Кувейте и ряде других стран Азии и Африки. В России оспа эпизодически регистрируется на приграничных территориях.

Решением МЭБ оспа овец и коз отнесена к группе А – быстро распространяющихся болезней животных.

Экономический ущерб. Болезнь наносит овцеводству огромный ущерб, за счет потерь от падежа, вынужденного убоя животных, снижения продуктивности, затрат на проведение ветеринарно-санитарных и охранно-карантинных мероприятий.

Этиология. Возбудитель (Sheep capripoxvirus) — относится к группе покс-вирусов. Эти ДНК-содержащие вирусы характеризуются эпителиотропностью и относительно большими размерами. Вирионы имеют вид кирпичеобразных или овальных образований размером до 250mµ. Частицы вируса оспы (тельца Пашена) окрашиваются по Морозову серебрением и видны под обычным микроскопом в виде округлых образований, располагающихся одиночно, попарно или кучками. В организме животных вирусные частицы обнаруживаются в эпителиальных клетках оспенных поражений и содержимом везикул и пустул.

Вирус чувствителен к действию высоких температур. При нагревании до 53° убивает его через 15 минут. Низкие температуры консервируют вирус до двух лет и более. В овчарнях вирус сохраняется до полугода, на пастбище до 62 дней, а в шерсти овец до двух месяцев. При гниении вирус погибает быстро. Замораживание консервирует вирус. Обычные дезинфицирующие препараты (карболовая кислота, хлорная известь, растворы едкого натра, формалин, глутаровый альдегид и другие) быстро инактивируют вирус на объектах внешней среды.

Эпизоотологические данные. Болеют овцы всех пород и возрастов, особенно тонкорунные и молодняк. Источником возбудителя инфекции являются больные овцы и вирусносители в инкубационном периоде и после выздоровления. В естественных условиях овцы чаще заражаются при контакте здоровых животных с больными, которые рассеивают вирус в окружающую среду с подсыхающими и отторгающимися оспенными корками и слущивающимся эпителием. Вирус, выделяемый со слизью из носа, может передаваться здоровым овцам аэрогенным путем. Не исключен и алиментарный путь заражения при попадании его на слизистую оболочку рта, пищевода, преджелудков, особенно при повреждении ее грубыми кормами.

Большую опасность представляют переболевшие овцы, у которых в сухих корках оспин, вирус может оставаться жизнеспособным до нескольких месяцев. При поражении оспой молочной железы вирус выделяется с молоком.

Факторами передачи возбудителя инфекции являются корма, навоз, предметы ухода, загрязненные выделениями больных животных. Переносчиками возбудителя могут быть животные других видов и люди.

Болезнь возникает в любое время года, но особенно тяжело протекает при холодной, сырой погоде.

Наиболее тяжело протекает оспа у овец тонкорунных пород, а также у молодых животных. При этом большое значение имеют условия содержания животных; например, на выпасах в теплую погоду оспа протекает сравнительно легко, при неудовлетворительных условиях содержания болезнь может приобретать злокачественную форму.

Болезнь в хозяйстве (стаде) распространяется в виде эпизоотий. Через 2-4 недели в стаде, если не приняты своевременно меры, зараженными оказываются большинство животных. Летальность при вспышке оспы невысокая до 2-5%.

Патогенез. Попавший в организм животных вирус приблизительно через четыре дня обнаруживается в крови и в паренхиматозных органах. Вирусемия продолжается не более 2-3 дней, а затем вирус проникает к эпителиальным клеткам кожи и слизистых оболочек. В местах размножения вируса происходят реактивные изменения типа воспалительного процесса, вначале серозного, а затем гнойного. Оспенную экзантему следует рассматривать как защитно-приспособительную реакцию на действие вируса. Четко выраженная стадийность развития оспенного патологического процесса — свидетельство способности организма локализовать возбудителя болезни. После продромального периода, во время которого отмечается угнетение животного, лихорадка, поражение слизистых оболочек, наблюдаются следующие, сменяющие одна другую стадии патологического процесса: 1) стадия высыпания оспенной экзантемы: появление красных пятен (розеол); длительность 1-2 дня; 2)превращение пятен в узелки (папулы) — круглые конические образования, окруженные красным пояском, длительность 1-3 дня; 3) везикулярная стадия; папулы превращаются в пузырьки, наполненные желтоватой серозной жидкостью, длительность 5-6 дней; в этот период болезни температура тела животного снижается, общее состояние улучшается; 4) стадия нагноения; везикулы превращаются в пустулы; содержимое везикул вначале мутное, затем становится гнойным вследствие скопления лейкоцитов и размножения гноеродных микробов; продолжительность стадии в среднем 3 дня; 5) крустозная стадия; на месте высохших пустул образуется бурый струп, под которым восстанавливается эпителий кожи. Если поражение было глубоким, образуется соединительнотканный рубец. Струп отпадает через 5-6 дней.

Течение и симптомы болезни. Инкубационный период продолжается 3-14 дней. Заболевание начинается с опухания век, из глаз и носа появляется сначала серозно-слизистый, затем серозно-гнойный экссудат. Дыхание у овец становится затрудненным и сопящим. Появляется оспенная сыпь на голове, губах, вокруг глаз, на внутренней поверхности передних и задних конечностей, на мошонке и крайней плоти у самцов, а также на коже вымени и слизистой оболочке срамных губ у самок. При этом сыпь вначале имеет вид круглых розоватых пятнышек с незначительным отеком по периферии. Спустя 2 дня пятнышки превращаются в плотные округлые папулы, окруженные красным возвышающим пояском; папулы быстро увеличиваются в размере. Температура тела, до этого повышенная (до 40-41°С) незначительно снижается. Через 1-3 дня эпидермис на периферии папул приподнимается. Папулы в это время пропитаны прозрачной слегка желтоватой серозной жидкостью. У большинства больных овец встречаются пелликулированные папулы, характеризующиеся разными размерами и темно-красной припухлостью кожи. По мере формирования папулы бледнеют, приобретают серо-белый или серо-желтый вид с розовым ободком; в это время эпидермис легко отделятся в виде пленки. Если появляется много папул, то оно сливаются; везикулы и пустулы обычно не образуются. На пораженных участках кожи под струпом образуются соединительнотканные рубцы, которые в зависимости от степени повреждения ткани слабо зарастают или совсем покрываются волосом. Струп у больных животных отпадает через 4-6дней. В том случае, если оспенный процесс осложнился, то у больного животного появляются признаки секундарной инфекции, протекающей с признаками поражения дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта.

При тяжелом течении оспы отмечаем: происходит покрытие больших участков кожи экзантемой, когда отдельные папулы, сливаясь между собой, образуют на больном животном сплошные поражения значительных участков кожи, которые подвергаются гнойному воспалению.

При тяжелом течении болезнь сопровождается повышением температуры тела, особенно в период нагноения, происходит ухудшение общего состояния больного животного. Врачи часто эту форму оспы называют сливной; чаще подобная форма оспы бывает у ягнят. В результате такой формы течения болезни погибает от сепсиса 40 — 80% ягнят.

Абортивная форма. На теле у животных появляется небольшое количество оспин, которые не претерпевают всех стадий превращений и быстро исчезают. Общее состояние больного при этом нарушается незначительно, лихорадка бывает небольшой.

Патологоанатомические изменения. Помимо характерных изменений на коже и слизистых оболочках ротовой полости обнаруживают геморрагическое воспаление слизистой оболочки желудочно-кишечного и дыхательных путей. В глотке и трахее находят эрозии, а иногда и язвы. Отмечаются кровоизлияния на серозных покровах; в легких могут быть очаги гепатизации и гангренозные очаги. Печень глинистого цвета, селезенка иногда увеличена. Мышца сердца дряблая. Происходит увеличение всех поверхностных и региональных лимфатических узлов. В срезах папул, окрашенных по Пашену и Романовскому, выявляют элементарные частицы вируса — вирионы возбудителя болезни.

Диагноз ставят комплексно на основании анализа данных:

• эпизоотологических;
• клинических;
• патологоанатомических;
• результатов лабораторных исследований, включая биопробу.

При оценке эпизоотологических данных необходимо учитывать, что из домашних животных болезнь поражает только овец, независимо от возраста и породы, а из диких – сайгаков и козерогов.

При постановке клинического диагноза начальную стадию болезни дифференцируют от грибковой парши, клещевой чесотки, папулезной (незаразной) экземы и контагиозного пустулезного дерматита овец и коз (эктимы).

Для подтверждения диагноза на оспу необходимо взять материал (участок кожи, имеющие свежие, только что образовавшиеся папулы до их нагноения, пораженные легкие, селезенку, лимфатические узлы, кровь) и направлять в областную ветеринарную лабораторию на исследование в соответствии с действующими методическими указаниями.

Иммунитет и иммунизация. Переболевание животных оспой вызывает у них невосприимчивость к вирусу. В большинстве случаев иммунитет сохраняется пожизненно.

Для активной иммунизации овец применяют культуральную вирус вакцину из аттенуированного штамма НИСХИ, которая создает у вакцинированных животных иммунитет продолжительностью до 12 месяцев.

Мероприятия по профилактике оспы овец.

Для профилактики заболевания овец оспой все овцепоголовье хозяйств и населенных пунктов угрожаемой по оспе овец зоны, включая поголовье, расположенное на территории районов, непосредственно граничащих со странами, неблагополучными по оспе овец, необходимо регулярно, согласно плану профилактических и противоэпизоотических мероприятий, прививать противооспенной вакциной в соответствии с наставлением по ее применению.

Вакцинации подлежат также овцы населенных пунктов (хозяйств), бывших ранее неблагополучными по оспе, в течение 3 лет после ликвидации в них болезни.

Для предупреждения возникновения оспы и недопущения ее распространения руководители хозяйств, других сельскохозяйственных предприятий и организаций, а также граждане-владельцы овец обязаны:

• не допускать ввода (ввоза) в хозяйство, на ферму, отделение, в отару и населенный пункт — овец, а также кормов и инвентаря из хозяйств, неблагополучных по оспе овец;
• всех вновь поступающих в хозяйство овец содержат изолированно в течение 30 дней;
• постоянно содержать в надлежащем ветеринарно-санитарном состоянии пастбища, места поения, животноводческие помещения, а также осуществлять другие мероприятия предусмотренные Законом РФ « О ветеринарии»;
• закрепить за отарами постоянный обслуживающий персонал, а также пастбищные участки, места поения и пути перегона;
• обеспечить систематическое ветеринарное наблюдение за состоянием овец.

Лечение. Специфических средств лечения больных оспой овец не разработано.

Больных животных изолируют, обеспечивают хорошими кормами (если необходимо-полужидкими); овец содержат в местах, защищенных от дождя и ветра. Для лечения применяются симптоматические средства. Предупреждение осложнений у овец достигается применением антибиотиков, в том числе и современных цефалоспоринового ряда в общепринятых дозах. Тяжело больных животных убивают.

Меры борьбы. При возникновении оспы овец на хозяйство Постановлением Губернатора накладывается карантин. Оздоровительные мероприятия проводят в соответствии с Инструкцией о мероприятиях по предупреждению и ликвидации заболевания овец оспой. Утвержденной Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР 23 марта 1982г.

На время карантина в соответствующих пунктах органы местной власти и руководители хозяйств обязаны выставить необходимое количество охранно-карантинных ветеринарно-милицейских постов с круглосуточным дежурством; выделить людей для несения дежурства на охранно-карантинных постах и обеспечить их дезинфицирующими средствами и необходимым оборудованием.

По условиям карантина запрещается:

• ввод и ввоз в неблагополучный пункт, вывод и вывоз из него животных всех видов, перегруппировка животных внутри хозяйства, а также выпас, водопой и содержание больных овец вместе со здоровыми животными всех видов;
• вывоз из неблагополучного пункта фуража (сена, соломы, комбикорма и пр.), с которым соприкасались больные овцы (в кошарах, на пастбищах). Этот фураж скармливают на месте животным, не восприимчивым к оспе овец или больным и переболевшим оспой овец;
• использование овечьего молока и полученных из него продуктов в необеззараженном виде. Молоко, полученное от овец в хозяйстве, подлежит обеззараживанию на месте путем пастеризации при температуре 85°С в течение 30минут или кипячением в течение 5 минут с последующим его использованием в хозяйстве;
• стрижка овец неблагополучных по оспе отар до снятия карантина;
• торговля животными и продуктами животноводства, проведение выставок, ярмарок, базаров и других мероприятий, связанных со скоплением животных, людей, транспорта на карантинированной территории;
• проезд всех видов транспорта (легкового, пассажирского, грузового и т.д.) по территории очага оспы овец. Для проезда транспорта к месту его назначения должны быть указаны объездные пути;
• доступ людей, не связанных с обслуживанием животных неблагополучных групп, в помещения и другие места, где содержатся эти животные.

В неблагополучных по оспе овец хозяйствах и населенных пунктах берут на учет все поголовье овец, независимо от их принадлежности, и подвергают 1 раз в 10 дней ветеринарному осмотру. Выявляемых больных овец, изолируют и при необходимости подвергают лечению симптоматическими средствами.

Трупы овец, павших при наличии клинических признаков оспы, сжигают. Снимать шкуры и использовать шерсть с трупов запрещается.

Всех клинически здоровых овец прививают против оспы вакциной в соответствии с наставлением по ее применению. В течение 14 дней привитые животные должны находиться под наблюдением ветеринарных специалистов. При выявлении среди привитого поголовья больных овец их переводят в группу больных и подвергают лечению.

После каждого случая падежа овец и уборки трупов, а также по окончании иммунизации овец все животноводческие помещения, загоны и другие места нахождения животных подвергаются механической очистке с последующей дезинфекцией.

Для дезинфекции помещений, загонов и других мест содержания животных, применяют одно из следующих дезинфицирующих средств: горячий 2%-ный раствор едкого нарта или калия; горячий 3%-ный раствор сернокарболовой смеси; 20%-ный раствор свежегашеной извести; осветленный раствор хлорной извести или гипохлорита натрия, содержащий не менее 2% активного хлора;2%-ный раствор формальдегида. Стены, заборы и различные деревянные ограждения следует обеззараживать свежеприготовленным раствором негашеной хлорной извести. Навоз обеззараживают в течение 3 недель биотермическим способом.

В случае обнаружения в животноводческих помещениях кошарных клещей необходимо произвести тщательную дезинсекцию этих помещений.

В случае появления оспы овец в местностях, где ее не регистрировали в течение 3 и более лет, Губернатор по представлению главного госветинспектора области, может принять решение о немедленном убое всех овец неблагополучной группы (больных, подозрительных по заболеванию и подозреваемых в заражении).

Овец убивают на специально оборудованной площадке с соблюдением ветеринарно-санитарных правил под непосредственным контролем главного ветврача хозяйства с последующей дезинфекцией всей территории убойной площадки и мест, где находилась подвергнутая убою неблагополучная группа овец.

Санитарную оценку мяса и других продуктов, полученных от убоя больных и подозрительных по заболеванию оспой овец, осуществляют согласно требованиям, предусмотренным действующими «Правилами ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов».

Кожи, полученные при убое овец, дезинфицируют в 3%-ном растворе фенола или в 2,5%-ной эмульсии креолина в течение 24ч, после чего просушивают. Вывоз овчин разрешается только после снятия карантина.

Шерсть и другое сырье животного происхождения, заготовленные в хозяйстве до установления карантина, обеззараживают в паровой дезкамере при температуре 110°С в течение 30 минут, а затем в таре из плотной ткани вывозят на перерабатывающие предприятия после снятия карантина.

В районах, неблагополучных по оспе овец, организуют мероприятия, направленные на ограничение миграции диких животных, восприимчивых к оспе овец, предотвращения соприкосновения овец с дикими животными в местах водопоя и на выпасах.

Снятие карантина.

Карантин снимают в установленном порядке по истечению 20 дней после полного выздоровления, падежа или убоя последней больной овцы в данном пункте.

Перед снятием карантина руководители хозяйств и граждане-владельцы овец по указанию ветеринарных специалистов обязаны провести очистку и заключительную дезинфекцию всех животноводческих помещений и территории выгульных дворов и загонов, где находились больные оспой овцы.

Санитарной обработке подлежат также предметы ухода за животными, инвентарь, одежда и обувь обслуживающего персонала.

В зависимости от свойств обрабатываемого объекта используют одно из следующих дезинфицирующих средств: горячий 2%-ный раствор едкого натра или калия; горячий 3%-ный раствор серно-карболовой смеси; осветленный раствор хлорной извести или гипохлорита натрия, содержащий не менее 2% активного хлора; 2%-ный раствор формальдегида; 1%-ный формалина для пароформалиновой камеры.

Овец и животных других видов, находящихся в очаге оспы, в теплое время года купают в 1%-ной эмульсии креолина.

Ветеринарные специалисты и другие лица, принимавшие участие в работах по ликвидации оспы овец в неблагополучном пункте, проходят санитарную обработку под горячим душем с обязательной дезинфекцией одежды и обуви в пароформалиновой камере.

После снятия карантина вновь вводимых в хозяйство овец в обязательном порядке в период профилактического карантина прививают противооспенной вакциной.

Зерно и фураж, находящиеся на карантинированной территории, скармливаются в этом же хозяйстве невосприимчивым животным, а также овцам, переболевшим оспой и вакцинированным против нее.

В последующем на территории бывшего неблагополучного пункта (хозяйства) овцы подлежат ежегодной вакцинации против оспы в течение 3 лет после ее ликвидации.

источник

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии. Вирусвакцина содержит антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» вируса оспы овец (BOO), Variola virus ovinum, сем. Poxviridae, подсем. Chordopoxvirinae, рода Capripoxvirus, полученного в культуре клеток гонад козы Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см 3 , депонированного в коллекцию ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером (ссылкой) «ВНИИЗЖ», и стабилизатор. Дополнительно вакцина содержит антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз (ВОК) Variola virus caprinum, сем. Poxviridae, подсем. Chordopoxvirinae, рода Capripoxvirus, полученного в культуре клеток гонад козы Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см 3 и депонированного в коллекцию ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером (ссылкой) «ВНИИЗЖ 2003» — ДЕП, в соотношении, мас.%: антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO 40,0-45,0, антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК — 40,0-45,0, стабилизатор — остальное. Вирусвакцина стерильна, специфична, обладает высокой иммуногенной активностью, безвредна для овец и коз. 9 табл., 4 ил.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении средств специфической профилактики оспы овец и оспы коз.

Оспа овец и оспа коз — высококонтагиозные вирусные заболевания мелких жвачных, проявляющиеся интоксикацией организма, лихорадкой, папулезно-пустулезными поражениями кожи и слизистых оболочек, часто с летальным исходом, особенно среди молодняка. Они наносят животноводству огромный экономический ущерб, слагающийся из гибели и вынужденного убоя больных животных, снижения продуктивности, затрат на проведение ветеринарно-санитарных и охранно-карантинных мероприятий.

В соответствии с классификацией, установленной Международной комиссией по таксономии вирусов (International Committee on Taxonomy of Viruses — ICTV) вирус оспы относится к роду 00.058.1.04 Capripoxvirus, принадлежащему к подсемейству 00.058.1 Chordopoxvirinae семейства 00.058 Poxviridae (1).

Род Capripoxvirus включает вирус оспы овец (BOO), вирус оспы коз (ВОК) и вирус кожной бугорчатки КРС (вирус нодулярного дерматита (ВБ)). Представители рода близкородственны, что доказывается иммунологическим анализом и структурой генома. Так ВОК является близкородственным BOO, но таксономически самостоятельным видом. BOO и ВОК не обладают четко выраженной хозяйской специфичностью: несмотря на то что обычно вирусы вызывают наиболее выраженное заболевание либо у овец, либо у коз, некоторые штаммы патогенны для обоих видов животных-хозяев (2, 3).

В связи с этим на практике, как правило, не дифференцируют два этих заболевания, а обычно обозначают как единое заболевание — оспа овец и коз.

Именно под таким названием заболевание оспа овец и коз приводится в перечне Международной организации здравоохранения животных (МЭБ) болезней, обязательных к декларированию, хотя это и затрудняет анализ реальной распространенности оспы овец и оспы коз как отдельных заболеваний.

По данным МЭБ эти заболевания регистрируются на всех континентах, за исключением Австралии и Океании. В последние годы оспа получила широкое распространение и в тех странах, где раньше никогда не регистрировалась (Вьетнам, 2005; Монголия, 2006; Греция, 2007).

Напряженная ситуация остается в странах СНГ Среднеазиатского и Кавказского регионов (Казахстан, Таджикистан, Киргизия, Азербайджан, Грузия). В 1996-2003 гг. неблагополучными по этим заболеваниям были 55 стран, в том числе 7 стран СНГ. Так, в Таджикистане в 2000 г. оспу коз регистрировали в виде отдельных случаев, в 2001 г. — уже во всех зонах республики. Вначале заболевание выявлялось только у коз ангорской породы, а в 2002 г. — и у коз местных пород.

В течение длительного времени Россия оставалась благополучной по данным заболеваниям. Однако во время вспышки в 1993 г. на юге Российской Федерации (РФ) в Ставропольском крае и Дагестане в 5 очагах оспой заболело 1413 животных, из которых пало 628 голов. В дальнейшем в России отмечалось увеличение количества очагов и оспа мелкого рогатого скота в 1994-1999 гг. проявлялась ежегодно. За это время было зарегистрировано 85 очагов оспы преимущественно среди овец. В 2002 г. во время вспышки оспы овец на Дальнем Востоке отмечались единичные случаи заболевания коз, а в 2003 г. оспа коз проявила себя как самостоятельное заболевание.

В связи с тем что Россия имеет общую границу и тесные экономические связи со многими неблагополучными по оспе государствами, заболевание представляет большую угрозу для нашей страны в отношении возможности заноса возбудителей болезни.

Создавшаяся эпизоотическая ситуация по оспе овец и оспе коз свидетельствует о необходимости иметь высокоэффективные диагностические препараты и средства специфической профилактики как против оспы овец, так и против оспы коз, которые в короткие сроки позволили бы идентифицировать возбудителей этих заболеваний и быстро купировать распространение инфекций.

Это обстоятельство вынуждает вести постоянный поиск новых штаммов BOO и ВОК, пригодных для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики оспы овец и оспы коз.

В странах, где отмечены вспышки этих заболеваний, специфическая профилактика оспы овец и оспы коз проводится с помощью культуральных вирусвакцин из аттенуированных штаммов возбудителей заболеваний и инактивированных тканевых и культуральных вакцин, которые производят в виде монопрепаратов.

В результате многочисленных исследований установлено, что инактивированные вакцины уступают вирусвакцинам по иммуногенной активности.

Известно использование в ряде стран вирусвакцины из аттенуированного штамма RM/65 BOO, но она оказалась не эффективной против некоторых местных полевых изолятов BOO в Индии и Марокко (4, 5, 6). В связи с этим были получены аттенуированные варианты BOO из местных эпизоотических штаммов (7, 8).

В нашей стране получили культуральную вирусвакцину против оспы овец из вируса, адаптированного к культуре клеток почки крольчат, и проверили ее в производственных условиях (9).

Известна вирусвакцина против оспы овец, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма Variola ovina ВГНКИ (НИСХИ) №77 BOO, полученного в культуре клеток почки ягнят с титром инфекционной активности 5,0÷6,0 lg ТЦД_50/см 3 , и целевую добавку в виде стабилизатора, в соотношении, мас.%:

Известна вирусвакцина против оспы овец, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма Sheep capripoxvirus ВГНКИ №6 BOO, полученного в подкожной клетчатке овец с титром инфекционной активности 4,0÷6,5 ИД_50/0,2 см 3 , и целевую добавку в виде стабилизатора в соотношении, мас.%:

Известна вирусвакцина против оспы овец, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток гонад козы Capra hircus L. (в культуре клеток Ch-91) с титром инфекционной активности 5,0÷6,5 ТЦД_50/см 3 , и целевую добавку в виде стабилизатора в соотношении, мас.%:

Известна вирусвакцина против оспы овец, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «НИСХИ» BOO, полученного в культуре клеток почки овцы ПО-ВНИИВВиМ с инфекционной активностью 5,5-6,0 ТЦД_50/см 3 , и целевую добавку в виде стабилизатора в объемном соотношении 1:1 (13).

Известна вирусвакцина против оспы коз, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «Durg» BOK, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде стабилизатора в эффективном соотношении (14).

Известна вирусвакцина против оспы коз, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «GT₄-STV₄₂» BOK, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде стабилизатора в эффективном соотношении (15).

Известна вирусвакцина против оспы коз, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «Mysore» BOK, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде стабилизатора в эффективном соотношении (16).

Известна вирусвакцина против оспы коз, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «Gorgan» BOK, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде стабилизатора в эффективном соотношении (17).

Известна вирусвакцина против оспы коз культуральная сухая, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «ОК/А-04» BOK, полученного в культуре клеток почки овцы ПО-ВНИИВВиМ с титром инфекционной активности 5,5÷6,0 ТЦД_50/см 3 , и целевую добавку в виде лактозо-пептонного стабилизатора в объемном соотношении 1:1 (18).

Недостатки вышеприведенных вирусвакцин против оспы овец и оспы коз состоят в том, что они являются монопрепаратами и содержат в своем составе лишь один из двух вакцинных штаммов, и их последовательное независимое введение оказывает более сильное стрессовое воздействие на организм иммунизированных животных и требует удвоенного количества трудовых затрат при вакцинации.

Указанные недостатки могут быть устранены созданием ассоциированных вакцин. Уже известна первая попытка создания таких препаратов.

Известна ассоциированная вакцина против сибирской язвы и оспы овец, содержащая смесь из суспензии жизнеспособных спор сибиреязвенного вакцинного штамма «55-ВНИИВВиМ» в исходной концентрации 180-360 млн спор/см 3 и антигенного материала из аттенуированного штамма «НИСХИ» BOO, полученного в культуре клеток почки овцы ПО-ВНИИВВиМ с инфекционной активностью не менее 5,0 lg ТЦД_50/см 3 , и лактозо-пептонный стабилизатор в эффективном соотношении (19).

Недостаток указанной вакцины состоит в том, что она обладает низкой иммуногенной активностью и не обеспечивает удовлетворительной защиты животных против эпизоотического BOO, циркулирующего на территории Российской Федерации.

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вирусвакцина против оспы овец, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток Ch-91 с титром инфекционной активности 5,0÷6,0 lg ТЦД_50/см 3 , и целевую добавку в виде стабилизатора в соотношении, мас.%:

Существенный недостаток вирусвакцины-прототипа состоит в том, что она не создает защиты против оспы коз.

В связи с этим проблема создания ассоциированной вирусвакцины против оспы мелких жвачных животных, обладающей высокой иммуногенной активностью и безвредностью, продолжает оставаться актуальной и является основным направлением исследований.

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в получении вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз культуральной сухой, создающей эффективную защиту мелких жвачных животных против возбудителей оспы.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала высокоиммуногенных, безвредных и ареактогенных ассоциированных вирусвакцин против оспы овец и оспы коз культуральных сухих, способных защитить мелких жвачных животных от возбудителей оспы.

Указанный технический результат достигнут созданием ассоциированной вирусвакцины против оспы овец и оспы коз культуральной сухой, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.

Согласно изобретению предлагаемая вирусвакцина содержит смесь активных веществ, состоящих из антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO (авторское наименование), из антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК (авторское наименование), полученных в культурах клеток животного происхождения, и целевую добавку стабилизатор; в объемном соотношении и в количествах, обеспечивающих протективную иммунную активность каждого антигена в организме животных после введения им целевого препарата.

BOO из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» выращивают в культуре клеток Ch-91, которая является гетерологичной по отношению к овцам.

ВОК из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» выращивают в культуре клеток Ch-91, которая является гомологичной по отношению к козам.

Для изготовления предлагаемой вирусвакцины используют вышеуказанные антигенные материалы с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см 3 , в равном объемном соотношении.

В качестве стабилизатора используют защитную среду, содержащую 5% сахарозы, 1% желатозы и 3% гидролизата лактальбумина (ГЛА).

В результате проведенных исследований авторами изобретения определен оптимальный состав предлагаемой вирусвакцины:

1. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см 3 , в количестве 40,0÷45,0 мас.%.

2. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученного в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см 3 , в количестве 40,0÷45,0 мас.%.

3. Стабилизатор в количестве 10,0÷20,0 мас.%.

Штамм «ВНИИЗЖ» BOO получен путем адаптации исходного BOO ВГНКИ (НИСХИ) №77 к перевиваемой культуре клеток Ch-91. При стационарном способе культивирования в культуре клеток Ch-91 вирус накапливается в титрах 5,0-6,0 lg ТЦД_50/см 3 .

Аттенуированный штамм «ВНИИЗЖ» BOO депонирован 27.06.1996 г. в качестве вакцинного во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, ФГУ ВГНКИ и ему присвоен регистрационный номер (шифр) — «ВНИИЗЖ».

Штамм «ВНИИЗЖ» BOO характеризуется следующими признаками и свойствами (12).

Вирус штамма «ВНИИЗЖ» обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя оспы овец.

При подкожном введении овцам вызывает образование вируснейтрализующих и комплементсвязывающих антител.

Штамм «ВНИИЗЖ» BOO выращивают и поддерживают в перевиваемой культуре клеток Ch-91. Вирус адаптируют к указанной культуре клеток путем проведения 3-5 пассажей. Цитопатогенное действие вируса наступает через 48-96 часов на 98÷100% поверхности зараженного монослоя культуры клеток. При стационарном способе выращивания в культуре клеток Ch-91 вирус накапливается в титрах 5,0÷6,0 lg ТЦД_50/см 3 .

При подкожном введении BOO штамма «ВНИИЗЖ» в дозе 1000 ТЦД₅₀ создает стойкий иммунитет у привитых овец на 4÷5 день после вакцинации продолжительностью 12 месяцев.

BOO штамма «ВНИИЗЖ» безвреден для овец при подкожном введении. Не передается контактным путем чувствительным животным. Для лабораторных животных (кроликов, морских свинок, мышей) не является патогенным. При введении вакцины в прививной дозе в разведении 1:25 кожной и температурной реакции не отмечается.

BOO штамма «ВНИИЗЖ» ареактогенен для овец при подкожном введении. У овец может вызывать исчезающую через 5÷7 дней местную реакцию в виде воспалительного отека размером 2×3 см при введении вируса в нативном виде по 5,0 см 3 подкожно в бесшерстный участок подмышечной области.

Реверсибельность и контагиозность

BOO штамма «ВНИИЗЖ» не восстанавливает вирулентных свойств после 5 последовательных пассажей на овцах (не реверсибелен) и не передается при совместном содержании привитых и интактных овец (не контагиозен).

Стабильность свойств при пассировании

Основные иммунобиоогические свойства штамма стабильно сохраняются на протяжении 10 пассажей в перевиваемой культуре клеток Ch-91 (срок наблюдения).

В нативном состоянии штамм «ВНИИЗЖ» BOO не снижает своей активности в течение 3 месяцев при плюс 4°С, в лиофилизированном виде в присутствии 3% пептона, 5% сахарозы и 1% желатина его активность остается на исходном уровне при плюс 4°С и минус 20°С в течение 2 лет (срок наблюдения). После восстановления из лиофилизированного состояния физиологическим раствором вирус не инактивируется при комнатной температуре в течение 24 часов, при минус 4°С — 7 суток.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003», ВОК был выделен в 2003 г. в Приморском крае Российской Федерации от больных оспой коз.

Для получения вируса, обладающего оптимальными биологическими свойствами, использовали различные системы культивирования, в том числе линии клеток: ПО, Ch-91, ПСГК, MDBK, СПЭВ, Vero, BHK-21 и Marc-145. В процессе адаптации было установлено, что гомологичная система культивирования перевиваемая линия клеток Ch-91 высокочувствительна к ВОК и оказалась оптимальной культурой для выращивания выделенного вируса. В результате проведения 35 последовательных пассажей изолята на культуре клеток Ch-91 был получен аттенуировнный штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, имеющий стабильные биотехнологические, антигенные и иммуногенные свойства.

В зависимости от дозы заражения и количества пассажей в условиях стационарного культивирования накопление ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» в культуре клеток Ch-91 обеспечивалось на уровне от 6,0 до 7,5 lg ТЦД_50/см 3 .

По сравнению с исходным изолятом штамм «ВНИИЗЖ 2003» имеет генетические и фенотипические отличия. По результатам сравнительного изучения иммунобиологических характеристик различных штаммов ВОК установлено, что штамм «ВНИИЗЖ 2003» является авирулентным, обладает хорошей антигенной и иммуногенной активностью и защищает от контрольного заражения гомологичным эпизоотическим вирусом.

Преимущество штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК по сравнению с аналогичными штаммами заключается в стабильно высоком накоплении вируса в культуре клеток Ch-91 и его высокой биологической, антигенной иммуногенной активности.

Штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК депонирован 6 июня 2006 г. во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве. Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ ВГНКИ) под регистрационным номером (ссылкой) — производственный вакцинный штамм «ВНИИЗЖ 2003» — ДЕП ВОК.

Штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК характеризуется следующими признаками и свойствами.

Штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК относится к роду Capripoxvirus, семейства Poxviridae и обладает морфологическими признаками, характерными для ВОК.

Вирион ВОК состоит из вирусной сердцевины (нуклеоида), овальных латеральных тел и наружной оболочки. Нуклеоид окружен гладкой мембраной толщиной 5 нм. Внутри него находится нуклеопротеин (ДНК, связанная с белком), имеющий S-образную или более сложную форму. Чувствительные к трипсину структуры, называемые боковыми телами, сдавливают нуклеоид, придавая ему форму двояковогнутого диска, имеющего на срезе вид гантели. Нуклеоид и боковые тела окружены наружной оболочкой, состоящей из липидов и трубчатых белковых структур (10×5 нм).

Геном представлен двухцепочечной ДНК. Две цепи ДНК соединены шпилькообразными петлями, в результате чего образуется одна непрерывная, ковалентно связанная полинуклеотидная цепь. Флип-флоп формы ДНК (т.н. «шпильки») образованы инвертированными концевыми повторами: идентичными, но противоположно ориентированными последовательностями ДНК, длина которых варьирует даже в пределах одного рода (Классификация и номенклатура вирусов позвоночных, 2002).

По своим антигенным свойствам штамм «ВНИИЗЖ 2003» относится к ВОК.

Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой в реакции нейтрализации (РН) на культуре клеток Ch-91, в реакции диффузионной преципитации (РДП) и в реакции длительного связывания комплемента (РДСК). Штамм проявляет антигенную активность в РДП 1:16÷1:32, в РДСК 1:120÷1:160 и в иммуноферментном анализе (ИФА) 1:1000÷1:4000.

Испытания вирусвакцины против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» в лабораторных условиях показали, что иммунизация коз сопровождается образованием вируснейтрализующих антител в крови животных в титре не менее 2,0 log₂.

Штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК проявляет высокую биологическую, антигенную иммунологическую активность в лиофилизированном виде и в виде культуральной вируссодержащей суспензии. Штамм предназначен для изготовления вакцинных и диагностических препаратов. Вирус штамма «ВНИИЗЖ 2003» репродуцируется в монослойных культурах клеток: первичнотрипсинизированной культуре клеток почки овцы и перевиваемой культуре клеток Ch-91, — и в течение 5-7 суток инкубирования накапливается в титре не менее 5,5 lg ТЦД_50/см 3 . Сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 35 пассажей.

Геном ВОК не обладает инфекционностью и представлен молекулой линейной двухцепочечной ДНК с центральным менее вариабельным участком длиной около 145 нв и более вариабельными концами.

При электронной микроскопии штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК были выявлены вирусные частицы, структура и размеры которых характерны для каприпоксвирусов.

Вирионы оспы имеют линейную двухслойную ДНК длиной 45÷60 мкм, молекулярной массой 80÷240 МДа. Плавучая плотность ДНК вирусов оспы в хлористом цезии и сахарозе равна 1,676÷1,723 г/см 3 . Важной особенностью ДНК вируса оспы является необычно прочная структура двухспиральной молекулы. Обе нити молекулы ДНК связаны между собой ковалентно.

Устойчивость к внешним факторам

ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» устойчив к высушиванию эфиром, не стоек к воздействию высокой температуры, различных химических веществ, например формалину (0,5÷1%), слабым растворам йода (1:10000), соляной, серной кислот (2,5%), спирту, его инфекционная активность сохраняется при pH 6,0÷7,4.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность — иммуногенен в составе живой лиофилизированной вакцины.

Реактогенность — в месте подкожного введения нативного вируса в объеме 5 см 3 образуется кожный тяж длиной до 4 см.

Патогенность — при внутримышечном введении животным заболевания не вызывает. При испытании вирусвакцины против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» на козах было установлено, что она не вызывала ответной местной реакции на подкожное введение в объеме 5 см 3 (125 прививных доз), была безвредна и ареактогенна для коз.

Вирулентность — авирулентен для мелких жвачных животных при контрольном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Антигенные свойства — вирус индуцирует у коз и овец образование вируснейтрализующих антител.

Стабильность биологических свойств — сохраняет исходные характеристики при пассировании на культуре клеток Ch-91 в течение 35 пассажей. Штамм нереверсибелен в течение 5 пассажей на козах.

При изготовлении вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO и антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученных в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см 3 , смешивают в равном объемном соотношении, а затем к полученной смеси добавляют стабилизатор в соотношении, мас.%:

Содержание антигенных материалов и стабилизатора в прививной дозе предлагаемой вирусвакцины в вышеуказанном соотношении является оптимальным, так как обеспечивает толерантную презентацию каждого антигена в организме иммунизированных животных.

Полученную смесь расфасовывают в ампулы по 2,0 см 3 или во флаконы по 4,0 см 3 , замораживают при температуре минус 50°С и подвергают лиофильному высушиванию. После сублимации ампулы (флаконы) заполняют сухим стерильным воздухом или инертным газом, ампулы запаивают, а флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают металлическими колпачками. Контроль качества полученного препарата проводят на стерильность, безвредность, специфичность и иммуногенную активность в соответствии с показателями, установленными стандартом организации-изготовителя.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:

1. Вирусвакцина ассоциированная против оспы овец и оспы коз культуральная сухая.

3. Активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток животного происхождения, в эффективном количестве.

4. Активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученного в культуре клеток животного происхождения, в эффективном количестве.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вирусвакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:

1. Вирусвакцина ассоциированная против оспы овец и оспы коз культуральная сухая.

2. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток животного происхождения и депонированного в коллекцию ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером (ссылкой) «ВНИИЗЖ».

По сравнению с вирусвакциной-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемой вирусвакцины является то, что она содержит дополнительно антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК Variola virus caprinum, сем. Poxviridae, подсем. Chordopoxvirinae, рода Capripoxvirus, полученного в культуре клеток животного происхождения и депонированного в коллекцию ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером (ссылкой) «ВНИИЗЖ 2003» — ДЕП, в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток Ch-91, в эффективном количестве.

2. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см 3 , в количестве 40,0÷45,0 ТЦД_50/см 3 .

3. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученного в культуре клеток Ch-91, в эффективном количестве.

4. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученного в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см 3 , в количестве 40,0÷45,5 мас.%.

5. Стабилизатор в эффективном количестве.

6. Стабилизатор в количестве 10,0÷20,0 мас.%.

7. Смесь из антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, из антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученных в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см 3 , и стабилизатора, взятых в соотношении, мас.%:

Предлагаемое изобретение расширяет арсенал вирусвакцин ассоциированных против оспы овец и оспы коз культуральных сухих, обладающих высокой антигенной и иммуногенной активностью и обеспечивающих эффективную защиту мелких жвачных животных от возбудителей оспы.

В результате проведенных исследований авторами предлагаемого изобретения установлено, что между антигенами, входящими в состав предлагаемой вирусвакцины, отсутствует конкуренция.

Авторами предлагаемого изобретения обнаружено также явление синергизма при соединении указанных антигенов в предлагаемой вакцине, что позволило снизить их количественное содержание в препарате при сохранении такой же напряженности и длительности иммунитета у вакцинированных животных, как и при использовании для иммунизации соответствующих монопрепаратов.

Сущность изобретения пояснена на графических материалах, на которых на:

фиг.1 представлено графическое изображение изменения титра ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» при его пассировании в культуре клеток Ch-91 (доза заражения 0,01÷0,05 ТЦД_50/кл.);

фиг.2 — фотографическое изображение под электронным микроскопом характерной морфологии ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» (фото получено д.б.н. А.П.Пономаревым), увеличение ×76000;

фиг.3 — хроматограмма результатов видовой дифференциации каприпоксвирусов, полученных методом мультиплексной ПЦР с видоспецифическими праймерами, на которой:

1 — отрицательный контроль;

2 — маркер (снизу вверх — 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 п.н. и т.д.);

3 — BOO, вакцинный штамм «ВНИИЗЖ»;

4 — BOO, эпизоотический штамм «Афганский»;

5 — BOO, эпизоотический штамм «Приморский»;

6 — BOO, эпизоотический штамм «ЕАО»;

7 — BOO, эпизоотический штамм «Таджикский»;

8 — ВОК, вакцинный штамм «ВНИИЗЖ 2003»;

9 — ВОК, эпизоотический штамм «Приморский 2003»;

10 — ВОК, эпизоотический штамм «Pellor»;

фиг.4 — хроматограмма результатов видовой дифференциации BOO и ВОК, полученных методом рестрикции гена «ankyrin-repeat», на которой:

1 — маркер (снизу вверх — 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 п.н. и т.д.);

2 — BOO, вакцинный штамм «ВНИИЗЖ»;

3 — BOO, эпизоотический штамм «Афганский»;

4 — BOO, эпизоотический штамм «Приморский»;

5 — BOO, эпизоотический штамм «ЕАО»;

6 — ВОК, вакцинный штамм «ВНИИЗЖ 2003»;

7 — ВОК, эпизоотический штамм «Приморский 2003»;

8 — ВОК, эпизоотический штамм «Таджикский»;

9 — ВОК, эпизоотический штамм «Pellor».

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают объем изобретения.

Технологический процесс изготовления вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз культуральной сухой состоит из двух этапов: получения посевного BOO штамма «ВНИИЗЖ» и посевного ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» и производственной серии предлагаемого препарата.

Посевной BOO штамма «ВНИИЗЖ» выращивают в культуре клеток Ch-91. Для этого клетки штамма Ch-91, хранящиеся в жидком азоте, размораживают путем оттаивания в водяной бане при (+37)÷(+38)°C и проводят 1÷2 пассажа для восстановления исходной скорости роста в монослое. Из культурального сосуда с монослоем клеток удаляют среду культивирования. Монослой клеток дважды обрабатывают диспергирующим раствором, содержащим 0,25%-ный раствор трипсина и 0,02%-ный раствор версена, взятые в соотношении 1:3, с добавлением 0,5% декстрозы, до начала отслаивания клеток. Диспергирующий раствор сливают, вносят среду Игла с 10% сыворотки КРС и 0,03% глутамина и суспензию клеток разливают в клинские матрасы. Культуру клеток инкубируют при 37°С в течение 48÷72 часов до момента формирования плотного монослоя. Для получения антигенного материала используют суспензию лиофилизированного или нативного BOO штамма «ВНИИЗЖ» с титром инфекционной активности от 5,0 до 6,0 lg ТЦД_50/см 3 . Средняя инфицирующая доза вируса должна составлять 0,1 ТЦД₅₀/кл. Внесенную вирусную суспензию экспонируют на предварительно отмытый от остатков ростовой среды раствором Хенкса монослой в течение 1 часа при (37±0,5)°С, после чего в необходимом объеме вносят поддерживающую питательную среду ПСП. Культивирование BOO проводят в течение 12 суток при указанной температуре. При поражении вирусом площади монослоя не менее 80% (округление и появления светопреломляющего эффекта) проводят сбор вируса. Для этого содержимое клинских матрасов замораживают при температуре минус 40°С и проводят оттаивание при комнатной температуре, энергично встряхивая для отделения монослоя. Из каждого матраса берут пробу по 3 см 3 для определения контаминирующих примесей и цитопатической активности. Полученный материал хранят при минус 20°С не более 6 месяцев. При активности BOO не ниже 5,5 lg ТЦД_50/см 3 стерильный вируссодержащий материал используют для составления производственной серии ассоциированной вирусвакцины против оспы овец и оспы коз культуральной сухой.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, был выделен в 2003 г. от больных оспой коз в Приморском крае Российской Федерации. Подготовку материала проводили общепринятым методом.

Биологические и вирусологические методы включали адаптацию вируса, выделенного от больных коз, к культурам первичнотрипсинизированных и перевиваемых линий клеток и его аттенуацию. Для выращивания ВОК были испытаны различные линии культур клеток: ПО, Ch-91, ПСГК, MDBK, СПЭВ, Vero, ВПК-21, Marc-145. В процессе адаптации было установлено, что перевиваемая линия клеток Ch-91 высокочувствительна к ВОК и оказалась оптимальной культурой для получения расплодки штамма для изготовления предлагаемой вирусвакцины.

В дальнейшем для получения расплодки вирусную суспензию вносили на освобожденный от ростовой среды монослой культуры клеток и экспонировали в течение часа в термостате при температуре (37±0,5)°С. После этого вносили поддерживающую среду ПСП или Игла с добавлением 1÷2% сыворотки крови КРС. Инфицированную культуру инкубировали при (37±0,5)°С до появления ЦПД вируса, которое характеризовалось округлением клеток, скоплением их в виде групп по 10÷20 клеток и в дальнейшем тотальной деструкцией монослоя клеток. При поражении площади монослоя не менее 70÷80% (округление и появление светопреломляющего эффекта, отслоение от стекла) 3-кратным промораживанием культуральных матрасов проводили сбор вируса с последующим отбором проб для исключения микробной контаминации и определения инфекционной активности вируса титрованием его в культуре клеток Ch-91.

Выделенный вирус обладал цитопатическим действием на культуре клеток Ch-91 с первоначальным титром 3,0÷4,0 lg ТЦД_50/см 3 . В последующих пассажах на этой же культуре клеток титр вируса повышался в 6÷7-м пассажах до 5,0÷5,5 lg ТЦД_50/см 3 , в 9÷10-м пассажах до 6,0 lg ТЦД_50/см 3 .

В зависимости от дозы заражения, составляющей 0,01÷1,0 ТЦД_50/кл., накопление аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК в культуре клеток Ch-91 обеспечивалось на уровне 5,33÷7,17 lg ТЦД_50/см 3 за 4÷7 суток при 50÷90% поражении клеточного монослоя. Оптимальной инфицирующей дозой вируса считали 0,01÷0,05 ТЦД_50/кл., вызывающей при стационарном культивировании в течение 5÷7 суток накопление вируса в титре от 6,67±0,08 до 7,17±0,10 lg ТЦД_50/см 3 при 80÷90% поражении клеточного монослоя. Результаты исследований представлены в таблице 1. Стабильность культуральных свойств лиофилизированного вируса при определении степени его накопления в течение 35 пассажей в культуре клеток Ch-91 при заражающей дозе 0,01÷0,05 ТЦД_50/кл. представлена на фиг.1.

Из данных, представленных на фиг.1, следует, что в процессе пассирования в условиях стационарного культивирования ВОК с дозой заражения 0,01÷0,05 ТЦД_50/кл. его инфекционная активность 6,0÷7,5 lg ТЦД_50/см 3 отмечалась в течение первых 13 пассажей. При увеличении количества пассажей инфекционная активность вируса постепенно снижалась. Результаты исследования сроков культивирования ВОК в культуре клеток Ch-91 представлены в таблице 2.

Инфекционная активность штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК при дозе заражения 0,01÷0,05 ТЦД_50/кл зависела от количества пассажей. На уровне 8÷13 пассажей продолжительность культивирования ВОК не превышала 7 дней. За это время достигалось наиболее выраженное 80÷90% ЦПД вируса и его максимальное накопление в культуре клеток Ch-91. В дальнейшем накопление вируса установлено на более низком уровне, и инфекционная активность вируса следующих пассажей характеризовалась меньшими значениями с увеличением продолжительности культивирования.

В результате осуществления 35 последовательных пассажей выделенного ВОК на культуре клеток Ch-91 был получен аттенуированный штамм «ВНИИЗЖ 2003», имеющий стабильные биотехнологические, антигенные и иммуногенные свойства, которые позволяют использовать его для получения антигенного материала при изготовлении диагностикумов и вирусвакцины против оспы коз.

В дальнейшем культуру клеток Ch-91 использовали для получения расплодки ВОК для изготовления вирусвакцины.

Полученный штамм ВОК был испытан сначала в лабораторных, а затем и в эпизоотических условиях. В результате проведенных исследований установлено следующее:

1. Проверку на стерильность осуществляли путем высева проб вируссодержащей жидкости на бактериальные питательные среды МПБ, МПА, МППБ, агар Сабуро (жидкий) и тиогликолев

источник

Оспа овец и коз распространена на всех континентах, за исключением Австралии и Океании. Основными путями заражения животных является контактный и воздушно-капельный путь.Источником инфекции являются больные животные.

В настоящее время вирус оспы овец и коз, несмотря на тесное антигенное родство между собой, отнесены к отдельным видам Goatpox virus и Sheeppox virus соответственно и рассматриваются как самостоятельные нозоединицы семейства Poxviridae, рода Capripoxvirus. Вирус устойчив в условиях внешней среды.Инкубационный период от 15 до 21 дня.

Основные признаки инфекционного заболевания: угнетение, повышение температуры тела до 41-42°С, снижение аппетита, отеки век, серозно–слизистые истечения из глаз и носовой полости, затрудненное дыхание, гиперемия слизистых оболочек, учащенный пульс, характерная оспенная сыпь (эрозии, папулы, пустулы) на голове, губах, крыльях носа, щеках, вокруг глаз, на внутренней поверхности кожи передних и задних конечностей, коже вымени, мошонке.

ФГБУ «ВНИИЗЖ» проводит диагностику различными методами: иммуноферментный анализ (ИФА), полимеразная цепная реакция (ПЦР), реакция длительного связывания комплемента (РДСК), реакция диффузной преципитации (РДП), постановка биопробы, гистологические исследования, заражение культуры клеток. Для исследования после гибели направляют материал из папул и пустул, поражений легких или лимфатических узлов; при жизни животных – материал, собранный с помощью биопсии всех слоев кожи.

Для иммунизации животных ФГБУ «ВНИИЗЖ» производят следующие биопрепараты: вакцина против оспы овец культуральная сухая, вакцина против оспы коз культуральная сухая, вакцина ассоциированная против оспы овец и коз культуральная сухая. Симптоматическое лечение обычно малоэффективно.

На территории Российской Федерации организована вакцинация овец и коз против оспы. Анализ мероприятий, проводимых при ликвидации очагов оспы овец на территории субъектов Российской Федерации, показывает, что не в полном объеме выполняются требования «Инструкции о мероприятиях по предупреждению и ликвидации заболевания овец оспой», утвержденной ГУВ МСХ СССР 23 марта 1982 г. В частности не исполняется пункт 4.6. указанной инструкции, предписывающий полное уничтожение всего поголовья овец неблагополучной по оспе группы, при регистрации болезни впервые за последние 3 года. Учитывая высокую устойчивость вируса оспы овец во внешней среде и его контагиозность, указанное нарушение способствует формированию эндемичных по оспе овец и коз зон на территории субъектов Российской Федерации.

В связи с эндемичностью по оспе овец и коз таких стран как Иран и Ирак, а также неблагополучием в 2015 году Республики Казахстан, риск заноса возбудителя этой инфекции высок на территории Астраханской, Волгоградской, Саратовской, Самарской и Оренбургской областей.

Исходя из эпизоотической ситуации по оспе овец и коз в России в 2010-2013 гг. и эндемичности инфекции в Китае, риску заноса и распространения болезни подвержены приграничные субъекты Российской Федерации: Забайкальский, Хабаровский и Приморский края, а также Еврейская автономная и Амурская области.

Россельхознадзором проводятся мониторинговые исследования в приграничных субъектах Российской Федерации подверженных риску заноса и распространения оспы овец и коз.

Библиографический список

Васильева Ю.Б. Интерактивные формы обучения студентов / Ю.Б. Васильева, И.И. Богданов, С.Н. Золотухин, О.Н. Марьина / Материалы научно-методической конференции профессорско-преподавательского состава академии «Инновационные технологии в высшем профессиональном образовании». — 2013. — С. 39-42.

Васильева Ю.Б. Эпизоотология и инфекционные болезни животных / Ю.Б. Васильева, И.И. Богданов / Учебное пособие для студентов по специальности «Ветеринарно-санитарная экспертиза» / Ульяновск, 2015.

Васильева Ю.Б. Эпизоотология и инфекционные болезни животных / Ю.Б. Васильева, И.И. Богданов / Учебное пособие для студентов по специальности «Ветеринария» / Ульяновск, 2015.

Мухин Е.Б. Разработка препарата на основе бактериофагов / Е.Б. Мухин, Ю.Б. Васильева, А.Г. Семанин, А.Г. Загуменнов, Е.И. Суркова / Знания молодых для развития ветеринарной медицины и АПК страны. — 2015. — С. 147-148.

Найденова В.А. Инфекции: неизбежность или безответственность? / В.А. Найденова, Ю.Б. Васильева / VII Международная студенческая электронная научная конференция: «Студенческий научный форум – 2015». — Электронное издание. — 2015. — http://www.scienceforum.ru/2015/1064/10921

Нафеев А.А. Вопросы эпидемиолого-эпизоотологического надзора за зоонозными инфекциями / А.А. Нафеев, Н.И. Пелевина, Ю.Б. Васильева / Дезинфекционное дело. — 2014. — № 1. — С. 39-43.

Нафеев А.А. Зоонозные инфекции, с природной очаговостью, с позиции эпидемиологического и эпизоотологического диагнозов / А.А. Нафеев, Д.А. Васильев,, С.Н. Золотухин, Ю.Б. Васильева / Материалы Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы ветеринарной науки.». — 2015. — С. 50-53.

Пирюшова А.Н. Анализ эпизоотической ситуации по карантинным инфекциям / А.Н. Пирюшова, Ю.Б. Васильева / VI Международная студенческая электронная научная конференция: «Студенческий научный форум -2014». Электронное издание. 2014. -http://www.scienceforum.ru/2014/645/5113

Пирюшова А.Н. Особо опасные инфекции из-за рубежа / А.Н. Пирюшова, Ю.А. Журавкова, Ю.Б. Васильева / VII Международная студенческая электронная научная конференция: «Студенческий научный форум – 2015». — Электронное издание. — 2015. — http://www.scienceforum.ru/2015/1064/10924

Пульчеровская Л.П. Организация самостоятельной работы студентов при изучении клинических дисциплин кафедры МВЭ и ВСЭ / Л.П. Пульчеровская, Н.И. Молофеева, Ю.Б. Васильева, Д.А. Васильев / Материалы научно-методической конференции профессорско-преподавательского состава академии «Инновационные технологии в высшем профессиональном образовании». — 2015. — С. 144-146.

Семанин А.Г Разработка селективной добавки для выделения возбудителя респираторной инфекции / А.Г. Семанин, Ю.Б. Васильева, А.В. Загуменнов, Е.Б. Мухин / Знания молодых для развития ветеринарной медицины и АПК страны. — 2015. — С. 196-197.

источник