Вирус вакцина ассоциированная против оспы овец и коз культуральная сухая

Оспа овец и коз — высоко контагиозное, быстро передающееся, сопровождающееся лихорадкой, папулёзно-пустулёзными высыпаниями на кожных покровах и слизистых, заболевание. Поражает животных любого возраста, в 50% случаев заканчивается летальным исходом. Для предупреждения распространения заболевания показана иммунизация мелкого скота с трёхмесячного возраста.

Выжившие животные приобретают устойчивый иммунитет к этому вирусу на 2 года. В качестве специфической профилактики используется культуральная вирус-вакцина атте-нуированного штамма НИСХИ (вирус оспы), обеспечивающая защиту привитым козам и овцам на 12 месяцев.

Сегодня для прививания мелкого и крупного рогатого скота против оспы и заразного узелкового дерматита используется вакцина «ШипПокс-ЛСД вак». Это единственный вид иммунизации.

Препарат сделан на основе культуральной жидкости перевиваемых клеток ДНК козы, инфицированной штаммом НИСХИ. В качестве дополнительных элементов в составе присутствует 10% сахарозы и 2% пищевого желатина.

Ответная иммунная реакция на однократное введение вакцины у мелкого скота появляется спустя 5 суток. Препарат безвредный, лечебными свойствами не обладает

Предназначение вакцины — профилактика оспы и нодулярного дерматита у здоровых овец, коз и крупного рогатого скота. Иммунизация проводится с возраста 3-х месяцев. Ревакцинация организовывается каждые 12 месяцев.

В неблагополучных пунктах и хозяйствах угрожаемой зоны проводят прививки для всех возрастных групп скота, вне зависимости от количества времени, которое прошло с момента прошлой иммунизации. Ягнят возрастом до 6 мес. вакцинируют двукратно, с интервалом в 2 недели. Ревакцинацию молодняка проводят спустя 6-7 мес., взрослых особей — 1 год.

Инструкция по применению:

1. Охладить физраствор (натрий хлорид) 0,9% концентрации до +4°С.
2. Во флакон с сухой порошковой вакциной, рассчитанный на 50 прививных доз, ввести при помощи шприца 2 см³ натрий хлорида, на 100 доз — 4 см³. Встряхивать ёмкость до полного суспензирования препарата.
3. Объединить полученную суспензию с 48 см³ физраствора (для 50 доз) иди 96 см³ (для 100 доз).
4. Ввести при помощи шприца 1 см³ готовой вакцины в бесшерстный участок дермы животного (подмышечная впадина или подхвостовая область).

• Запрещено прививать:
• больных, ослабленных животных;
• самок на последней стадии беременности.

Побочных эффектов при введении препарата не выявлено. При превышении дозировок вспышек оспы не обнаружено.

При использовании нужно соблюдать следующие меры предосторожности:

1. Надеть чистую одежду.
2. Руки обработать этиловым спиртом.
3. Работать в стерильных перчатках.
4. Вводить суспензию в бесшерстный участок кожного покрова, предварительно обработав его спиртом.
5. При попадании вакцины на кожные покровы или слизистые человека, промыть участок водой.
6. Если вакцина случайно была введена подкожно работнику фермы, нужно сразу протереть участок этиловым спиртом, обратиться в больницу и сообщить врачу о происшествии.

Лекарственная форма препарата — порошковая масса, светло-жёлтого цвета. Полностью растворяется в физрастворе 0,9% концентрации за 1,5 минуты. Производитель: ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Плановая профилактическая вакцинация позволяет уберечь поголовье от вспышек оспы. Для поддержания нормального состояния животных необходимо проводить манипуляцию ежегодно.

источник

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии. Вирусвакцина содержит антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» вируса оспы овец (BOO), Variola virus ovinum, сем. Poxviridae, подсем. Chordopoxvirinae, рода Capripoxvirus, полученного в культуре клеток гонад козы Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см 3 , депонированного в коллекцию ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером (ссылкой) «ВНИИЗЖ», и стабилизатор. Дополнительно вакцина содержит антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз (ВОК) Variola virus caprinum, сем. Poxviridae, подсем. Chordopoxvirinae, рода Capripoxvirus, полученного в культуре клеток гонад козы Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см 3 и депонированного в коллекцию ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером (ссылкой) «ВНИИЗЖ 2003» — ДЕП, в соотношении, мас.%: антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO 40,0-45,0, антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК — 40,0-45,0, стабилизатор — остальное. Вирусвакцина стерильна, специфична, обладает высокой иммуногенной активностью, безвредна для овец и коз. 9 табл., 4 ил.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении средств специфической профилактики оспы овец и оспы коз.

Оспа овец и оспа коз — высококонтагиозные вирусные заболевания мелких жвачных, проявляющиеся интоксикацией организма, лихорадкой, папулезно-пустулезными поражениями кожи и слизистых оболочек, часто с летальным исходом, особенно среди молодняка. Они наносят животноводству огромный экономический ущерб, слагающийся из гибели и вынужденного убоя больных животных, снижения продуктивности, затрат на проведение ветеринарно-санитарных и охранно-карантинных мероприятий.

В соответствии с классификацией, установленной Международной комиссией по таксономии вирусов (International Committee on Taxonomy of Viruses — ICTV) вирус оспы относится к роду 00.058.1.04 Capripoxvirus, принадлежащему к подсемейству 00.058.1 Chordopoxvirinae семейства 00.058 Poxviridae (1).

Род Capripoxvirus включает вирус оспы овец (BOO), вирус оспы коз (ВОК) и вирус кожной бугорчатки КРС (вирус нодулярного дерматита (ВБ)). Представители рода близкородственны, что доказывается иммунологическим анализом и структурой генома. Так ВОК является близкородственным BOO, но таксономически самостоятельным видом. BOO и ВОК не обладают четко выраженной хозяйской специфичностью: несмотря на то что обычно вирусы вызывают наиболее выраженное заболевание либо у овец, либо у коз, некоторые штаммы патогенны для обоих видов животных-хозяев (2, 3).

В связи с этим на практике, как правило, не дифференцируют два этих заболевания, а обычно обозначают как единое заболевание — оспа овец и коз.

Именно под таким названием заболевание оспа овец и коз приводится в перечне Международной организации здравоохранения животных (МЭБ) болезней, обязательных к декларированию, хотя это и затрудняет анализ реальной распространенности оспы овец и оспы коз как отдельных заболеваний.

По данным МЭБ эти заболевания регистрируются на всех континентах, за исключением Австралии и Океании. В последние годы оспа получила широкое распространение и в тех странах, где раньше никогда не регистрировалась (Вьетнам, 2005; Монголия, 2006; Греция, 2007).

Напряженная ситуация остается в странах СНГ Среднеазиатского и Кавказского регионов (Казахстан, Таджикистан, Киргизия, Азербайджан, Грузия). В 1996-2003 гг. неблагополучными по этим заболеваниям были 55 стран, в том числе 7 стран СНГ. Так, в Таджикистане в 2000 г. оспу коз регистрировали в виде отдельных случаев, в 2001 г. — уже во всех зонах республики. Вначале заболевание выявлялось только у коз ангорской породы, а в 2002 г. — и у коз местных пород.

В течение длительного времени Россия оставалась благополучной по данным заболеваниям. Однако во время вспышки в 1993 г. на юге Российской Федерации (РФ) в Ставропольском крае и Дагестане в 5 очагах оспой заболело 1413 животных, из которых пало 628 голов. В дальнейшем в России отмечалось увеличение количества очагов и оспа мелкого рогатого скота в 1994-1999 гг. проявлялась ежегодно. За это время было зарегистрировано 85 очагов оспы преимущественно среди овец. В 2002 г. во время вспышки оспы овец на Дальнем Востоке отмечались единичные случаи заболевания коз, а в 2003 г. оспа коз проявила себя как самостоятельное заболевание.

В связи с тем что Россия имеет общую границу и тесные экономические связи со многими неблагополучными по оспе государствами, заболевание представляет большую угрозу для нашей страны в отношении возможности заноса возбудителей болезни.

Создавшаяся эпизоотическая ситуация по оспе овец и оспе коз свидетельствует о необходимости иметь высокоэффективные диагностические препараты и средства специфической профилактики как против оспы овец, так и против оспы коз, которые в короткие сроки позволили бы идентифицировать возбудителей этих заболеваний и быстро купировать распространение инфекций.

Это обстоятельство вынуждает вести постоянный поиск новых штаммов BOO и ВОК, пригодных для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики оспы овец и оспы коз.

В странах, где отмечены вспышки этих заболеваний, специфическая профилактика оспы овец и оспы коз проводится с помощью культуральных вирусвакцин из аттенуированных штаммов возбудителей заболеваний и инактивированных тканевых и культуральных вакцин, которые производят в виде монопрепаратов.

В результате многочисленных исследований установлено, что инактивированные вакцины уступают вирусвакцинам по иммуногенной активности.

Известно использование в ряде стран вирусвакцины из аттенуированного штамма RM/65 BOO, но она оказалась не эффективной против некоторых местных полевых изолятов BOO в Индии и Марокко (4, 5, 6). В связи с этим были получены аттенуированные варианты BOO из местных эпизоотических штаммов (7, 8).

В нашей стране получили культуральную вирусвакцину против оспы овец из вируса, адаптированного к культуре клеток почки крольчат, и проверили ее в производственных условиях (9).

Известна вирусвакцина против оспы овец, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма Variola ovina ВГНКИ (НИСХИ) №77 BOO, полученного в культуре клеток почки ягнят с титром инфекционной активности 5,0÷6,0 lg ТЦД_50/см 3 , и целевую добавку в виде стабилизатора, в соотношении, мас.%:

Известна вирусвакцина против оспы овец, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма Sheep capripoxvirus ВГНКИ №6 BOO, полученного в подкожной клетчатке овец с титром инфекционной активности 4,0÷6,5 ИД_50/0,2 см 3 , и целевую добавку в виде стабилизатора в соотношении, мас.%:

Известна вирусвакцина против оспы овец, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток гонад козы Capra hircus L. (в культуре клеток Ch-91) с титром инфекционной активности 5,0÷6,5 ТЦД_50/см 3 , и целевую добавку в виде стабилизатора в соотношении, мас.%:

Известна вирусвакцина против оспы овец, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «НИСХИ» BOO, полученного в культуре клеток почки овцы ПО-ВНИИВВиМ с инфекционной активностью 5,5-6,0 ТЦД_50/см 3 , и целевую добавку в виде стабилизатора в объемном соотношении 1:1 (13).

Известна вирусвакцина против оспы коз, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «Durg» BOK, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде стабилизатора в эффективном соотношении (14).

Известна вирусвакцина против оспы коз, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «GT₄-STV₄₂» BOK, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде стабилизатора в эффективном соотношении (15).

Известна вирусвакцина против оспы коз, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «Mysore» BOK, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде стабилизатора в эффективном соотношении (16).

Известна вирусвакцина против оспы коз, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «Gorgan» BOK, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде стабилизатора в эффективном соотношении (17).

Известна вирусвакцина против оспы коз культуральная сухая, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «ОК/А-04» BOK, полученного в культуре клеток почки овцы ПО-ВНИИВВиМ с титром инфекционной активности 5,5÷6,0 ТЦД_50/см 3 , и целевую добавку в виде лактозо-пептонного стабилизатора в объемном соотношении 1:1 (18).

Недостатки вышеприведенных вирусвакцин против оспы овец и оспы коз состоят в том, что они являются монопрепаратами и содержат в своем составе лишь один из двух вакцинных штаммов, и их последовательное независимое введение оказывает более сильное стрессовое воздействие на организм иммунизированных животных и требует удвоенного количества трудовых затрат при вакцинации.

Указанные недостатки могут быть устранены созданием ассоциированных вакцин. Уже известна первая попытка создания таких препаратов.

Известна ассоциированная вакцина против сибирской язвы и оспы овец, содержащая смесь из суспензии жизнеспособных спор сибиреязвенного вакцинного штамма «55-ВНИИВВиМ» в исходной концентрации 180-360 млн спор/см 3 и антигенного материала из аттенуированного штамма «НИСХИ» BOO, полученного в культуре клеток почки овцы ПО-ВНИИВВиМ с инфекционной активностью не менее 5,0 lg ТЦД_50/см 3 , и лактозо-пептонный стабилизатор в эффективном соотношении (19).

Недостаток указанной вакцины состоит в том, что она обладает низкой иммуногенной активностью и не обеспечивает удовлетворительной защиты животных против эпизоотического BOO, циркулирующего на территории Российской Федерации.

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вирусвакцина против оспы овец, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток Ch-91 с титром инфекционной активности 5,0÷6,0 lg ТЦД_50/см 3 , и целевую добавку в виде стабилизатора в соотношении, мас.%:

Существенный недостаток вирусвакцины-прототипа состоит в том, что она не создает защиты против оспы коз.

В связи с этим проблема создания ассоциированной вирусвакцины против оспы мелких жвачных животных, обладающей высокой иммуногенной активностью и безвредностью, продолжает оставаться актуальной и является основным направлением исследований.

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в получении вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз культуральной сухой, создающей эффективную защиту мелких жвачных животных против возбудителей оспы.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала высокоиммуногенных, безвредных и ареактогенных ассоциированных вирусвакцин против оспы овец и оспы коз культуральных сухих, способных защитить мелких жвачных животных от возбудителей оспы.

Указанный технический результат достигнут созданием ассоциированной вирусвакцины против оспы овец и оспы коз культуральной сухой, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.

Согласно изобретению предлагаемая вирусвакцина содержит смесь активных веществ, состоящих из антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO (авторское наименование), из антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК (авторское наименование), полученных в культурах клеток животного происхождения, и целевую добавку стабилизатор; в объемном соотношении и в количествах, обеспечивающих протективную иммунную активность каждого антигена в организме животных после введения им целевого препарата.

BOO из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» выращивают в культуре клеток Ch-91, которая является гетерологичной по отношению к овцам.

ВОК из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» выращивают в культуре клеток Ch-91, которая является гомологичной по отношению к козам.

Для изготовления предлагаемой вирусвакцины используют вышеуказанные антигенные материалы с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см 3 , в равном объемном соотношении.

В качестве стабилизатора используют защитную среду, содержащую 5% сахарозы, 1% желатозы и 3% гидролизата лактальбумина (ГЛА).

В результате проведенных исследований авторами изобретения определен оптимальный состав предлагаемой вирусвакцины:

1. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см 3 , в количестве 40,0÷45,0 мас.%.

2. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученного в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см 3 , в количестве 40,0÷45,0 мас.%.

3. Стабилизатор в количестве 10,0÷20,0 мас.%.

Штамм «ВНИИЗЖ» BOO получен путем адаптации исходного BOO ВГНКИ (НИСХИ) №77 к перевиваемой культуре клеток Ch-91. При стационарном способе культивирования в культуре клеток Ch-91 вирус накапливается в титрах 5,0-6,0 lg ТЦД_50/см 3 .

Аттенуированный штамм «ВНИИЗЖ» BOO депонирован 27.06.1996 г. в качестве вакцинного во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, ФГУ ВГНКИ и ему присвоен регистрационный номер (шифр) — «ВНИИЗЖ».

Штамм «ВНИИЗЖ» BOO характеризуется следующими признаками и свойствами (12).

Вирус штамма «ВНИИЗЖ» обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя оспы овец.

При подкожном введении овцам вызывает образование вируснейтрализующих и комплементсвязывающих антител.

Штамм «ВНИИЗЖ» BOO выращивают и поддерживают в перевиваемой культуре клеток Ch-91. Вирус адаптируют к указанной культуре клеток путем проведения 3-5 пассажей. Цитопатогенное действие вируса наступает через 48-96 часов на 98÷100% поверхности зараженного монослоя культуры клеток. При стационарном способе выращивания в культуре клеток Ch-91 вирус накапливается в титрах 5,0÷6,0 lg ТЦД_50/см 3 .

При подкожном введении BOO штамма «ВНИИЗЖ» в дозе 1000 ТЦД₅₀ создает стойкий иммунитет у привитых овец на 4÷5 день после вакцинации продолжительностью 12 месяцев.

BOO штамма «ВНИИЗЖ» безвреден для овец при подкожном введении. Не передается контактным путем чувствительным животным. Для лабораторных животных (кроликов, морских свинок, мышей) не является патогенным. При введении вакцины в прививной дозе в разведении 1:25 кожной и температурной реакции не отмечается.

BOO штамма «ВНИИЗЖ» ареактогенен для овец при подкожном введении. У овец может вызывать исчезающую через 5÷7 дней местную реакцию в виде воспалительного отека размером 2×3 см при введении вируса в нативном виде по 5,0 см 3 подкожно в бесшерстный участок подмышечной области.

Реверсибельность и контагиозность

BOO штамма «ВНИИЗЖ» не восстанавливает вирулентных свойств после 5 последовательных пассажей на овцах (не реверсибелен) и не передается при совместном содержании привитых и интактных овец (не контагиозен).

Стабильность свойств при пассировании

Основные иммунобиоогические свойства штамма стабильно сохраняются на протяжении 10 пассажей в перевиваемой культуре клеток Ch-91 (срок наблюдения).

В нативном состоянии штамм «ВНИИЗЖ» BOO не снижает своей активности в течение 3 месяцев при плюс 4°С, в лиофилизированном виде в присутствии 3% пептона, 5% сахарозы и 1% желатина его активность остается на исходном уровне при плюс 4°С и минус 20°С в течение 2 лет (срок наблюдения). После восстановления из лиофилизированного состояния физиологическим раствором вирус не инактивируется при комнатной температуре в течение 24 часов, при минус 4°С — 7 суток.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003», ВОК был выделен в 2003 г. в Приморском крае Российской Федерации от больных оспой коз.

Для получения вируса, обладающего оптимальными биологическими свойствами, использовали различные системы культивирования, в том числе линии клеток: ПО, Ch-91, ПСГК, MDBK, СПЭВ, Vero, BHK-21 и Marc-145. В процессе адаптации было установлено, что гомологичная система культивирования перевиваемая линия клеток Ch-91 высокочувствительна к ВОК и оказалась оптимальной культурой для выращивания выделенного вируса. В результате проведения 35 последовательных пассажей изолята на культуре клеток Ch-91 был получен аттенуировнный штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, имеющий стабильные биотехнологические, антигенные и иммуногенные свойства.

В зависимости от дозы заражения и количества пассажей в условиях стационарного культивирования накопление ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» в культуре клеток Ch-91 обеспечивалось на уровне от 6,0 до 7,5 lg ТЦД_50/см 3 .

По сравнению с исходным изолятом штамм «ВНИИЗЖ 2003» имеет генетические и фенотипические отличия. По результатам сравнительного изучения иммунобиологических характеристик различных штаммов ВОК установлено, что штамм «ВНИИЗЖ 2003» является авирулентным, обладает хорошей антигенной и иммуногенной активностью и защищает от контрольного заражения гомологичным эпизоотическим вирусом.

Преимущество штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК по сравнению с аналогичными штаммами заключается в стабильно высоком накоплении вируса в культуре клеток Ch-91 и его высокой биологической, антигенной иммуногенной активности.

Штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК депонирован 6 июня 2006 г. во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве. Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ ВГНКИ) под регистрационным номером (ссылкой) — производственный вакцинный штамм «ВНИИЗЖ 2003» — ДЕП ВОК.

Штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК характеризуется следующими признаками и свойствами.

Штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК относится к роду Capripoxvirus, семейства Poxviridae и обладает морфологическими признаками, характерными для ВОК.

Вирион ВОК состоит из вирусной сердцевины (нуклеоида), овальных латеральных тел и наружной оболочки. Нуклеоид окружен гладкой мембраной толщиной 5 нм. Внутри него находится нуклеопротеин (ДНК, связанная с белком), имеющий S-образную или более сложную форму. Чувствительные к трипсину структуры, называемые боковыми телами, сдавливают нуклеоид, придавая ему форму двояковогнутого диска, имеющего на срезе вид гантели. Нуклеоид и боковые тела окружены наружной оболочкой, состоящей из липидов и трубчатых белковых структур (10×5 нм).

Геном представлен двухцепочечной ДНК. Две цепи ДНК соединены шпилькообразными петлями, в результате чего образуется одна непрерывная, ковалентно связанная полинуклеотидная цепь. Флип-флоп формы ДНК (т.н. «шпильки») образованы инвертированными концевыми повторами: идентичными, но противоположно ориентированными последовательностями ДНК, длина которых варьирует даже в пределах одного рода (Классификация и номенклатура вирусов позвоночных, 2002).

По своим антигенным свойствам штамм «ВНИИЗЖ 2003» относится к ВОК.

Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой в реакции нейтрализации (РН) на культуре клеток Ch-91, в реакции диффузионной преципитации (РДП) и в реакции длительного связывания комплемента (РДСК). Штамм проявляет антигенную активность в РДП 1:16÷1:32, в РДСК 1:120÷1:160 и в иммуноферментном анализе (ИФА) 1:1000÷1:4000.

Испытания вирусвакцины против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» в лабораторных условиях показали, что иммунизация коз сопровождается образованием вируснейтрализующих антител в крови животных в титре не менее 2,0 log₂.

Штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК проявляет высокую биологическую, антигенную иммунологическую активность в лиофилизированном виде и в виде культуральной вируссодержащей суспензии. Штамм предназначен для изготовления вакцинных и диагностических препаратов. Вирус штамма «ВНИИЗЖ 2003» репродуцируется в монослойных культурах клеток: первичнотрипсинизированной культуре клеток почки овцы и перевиваемой культуре клеток Ch-91, — и в течение 5-7 суток инкубирования накапливается в титре не менее 5,5 lg ТЦД_50/см 3 . Сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 35 пассажей.

Геном ВОК не обладает инфекционностью и представлен молекулой линейной двухцепочечной ДНК с центральным менее вариабельным участком длиной около 145 нв и более вариабельными концами.

При электронной микроскопии штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК были выявлены вирусные частицы, структура и размеры которых характерны для каприпоксвирусов.

Вирионы оспы имеют линейную двухслойную ДНК длиной 45÷60 мкм, молекулярной массой 80÷240 МДа. Плавучая плотность ДНК вирусов оспы в хлористом цезии и сахарозе равна 1,676÷1,723 г/см 3 . Важной особенностью ДНК вируса оспы является необычно прочная структура двухспиральной молекулы. Обе нити молекулы ДНК связаны между собой ковалентно.

Устойчивость к внешним факторам

ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» устойчив к высушиванию эфиром, не стоек к воздействию высокой температуры, различных химических веществ, например формалину (0,5÷1%), слабым растворам йода (1:10000), соляной, серной кислот (2,5%), спирту, его инфекционная активность сохраняется при pH 6,0÷7,4.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность — иммуногенен в составе живой лиофилизированной вакцины.

Реактогенность — в месте подкожного введения нативного вируса в объеме 5 см 3 образуется кожный тяж длиной до 4 см.

Патогенность — при внутримышечном введении животным заболевания не вызывает. При испытании вирусвакцины против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» на козах было установлено, что она не вызывала ответной местной реакции на подкожное введение в объеме 5 см 3 (125 прививных доз), была безвредна и ареактогенна для коз.

Вирулентность — авирулентен для мелких жвачных животных при контрольном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Антигенные свойства — вирус индуцирует у коз и овец образование вируснейтрализующих антител.

Стабильность биологических свойств — сохраняет исходные характеристики при пассировании на культуре клеток Ch-91 в течение 35 пассажей. Штамм нереверсибелен в течение 5 пассажей на козах.

При изготовлении вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO и антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученных в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см 3 , смешивают в равном объемном соотношении, а затем к полученной смеси добавляют стабилизатор в соотношении, мас.%:

Содержание антигенных материалов и стабилизатора в прививной дозе предлагаемой вирусвакцины в вышеуказанном соотношении является оптимальным, так как обеспечивает толерантную презентацию каждого антигена в организме иммунизированных животных.

Полученную смесь расфасовывают в ампулы по 2,0 см 3 или во флаконы по 4,0 см 3 , замораживают при температуре минус 50°С и подвергают лиофильному высушиванию. После сублимации ампулы (флаконы) заполняют сухим стерильным воздухом или инертным газом, ампулы запаивают, а флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают металлическими колпачками. Контроль качества полученного препарата проводят на стерильность, безвредность, специфичность и иммуногенную активность в соответствии с показателями, установленными стандартом организации-изготовителя.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:

1. Вирусвакцина ассоциированная против оспы овец и оспы коз культуральная сухая.

3. Активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток животного происхождения, в эффективном количестве.

4. Активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученного в культуре клеток животного происхождения, в эффективном количестве.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вирусвакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:

1. Вирусвакцина ассоциированная против оспы овец и оспы коз культуральная сухая.

2. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток животного происхождения и депонированного в коллекцию ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером (ссылкой) «ВНИИЗЖ».

По сравнению с вирусвакциной-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемой вирусвакцины является то, что она содержит дополнительно антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК Variola virus caprinum, сем. Poxviridae, подсем. Chordopoxvirinae, рода Capripoxvirus, полученного в культуре клеток животного происхождения и депонированного в коллекцию ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером (ссылкой) «ВНИИЗЖ 2003» — ДЕП, в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток Ch-91, в эффективном количестве.

2. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см 3 , в количестве 40,0÷45,0 ТЦД_50/см 3 .

3. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученного в культуре клеток Ch-91, в эффективном количестве.

4. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученного в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см 3 , в количестве 40,0÷45,5 мас.%.

5. Стабилизатор в эффективном количестве.

6. Стабилизатор в количестве 10,0÷20,0 мас.%.

7. Смесь из антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, из антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученных в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см 3 , и стабилизатора, взятых в соотношении, мас.%:

Предлагаемое изобретение расширяет арсенал вирусвакцин ассоциированных против оспы овец и оспы коз культуральных сухих, обладающих высокой антигенной и иммуногенной активностью и обеспечивающих эффективную защиту мелких жвачных животных от возбудителей оспы.

В результате проведенных исследований авторами предлагаемого изобретения установлено, что между антигенами, входящими в состав предлагаемой вирусвакцины, отсутствует конкуренция.

Авторами предлагаемого изобретения обнаружено также явление синергизма при соединении указанных антигенов в предлагаемой вакцине, что позволило снизить их количественное содержание в препарате при сохранении такой же напряженности и длительности иммунитета у вакцинированных животных, как и при использовании для иммунизации соответствующих монопрепаратов.

Сущность изобретения пояснена на графических материалах, на которых на:

фиг.1 представлено графическое изображение изменения титра ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» при его пассировании в культуре клеток Ch-91 (доза заражения 0,01÷0,05 ТЦД_50/кл.);

фиг.2 — фотографическое изображение под электронным микроскопом характерной морфологии ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» (фото получено д.б.н. А.П.Пономаревым), увеличение ×76000;

фиг.3 — хроматограмма результатов видовой дифференциации каприпоксвирусов, полученных методом мультиплексной ПЦР с видоспецифическими праймерами, на которой:

1 — отрицательный контроль;

2 — маркер (снизу вверх — 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 п.н. и т.д.);

3 — BOO, вакцинный штамм «ВНИИЗЖ»;

4 — BOO, эпизоотический штамм «Афганский»;

5 — BOO, эпизоотический штамм «Приморский»;

6 — BOO, эпизоотический штамм «ЕАО»;

7 — BOO, эпизоотический штамм «Таджикский»;

8 — ВОК, вакцинный штамм «ВНИИЗЖ 2003»;

9 — ВОК, эпизоотический штамм «Приморский 2003»;

10 — ВОК, эпизоотический штамм «Pellor»;

фиг.4 — хроматограмма результатов видовой дифференциации BOO и ВОК, полученных методом рестрикции гена «ankyrin-repeat», на которой:

1 — маркер (снизу вверх — 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 п.н. и т.д.);

2 — BOO, вакцинный штамм «ВНИИЗЖ»;

3 — BOO, эпизоотический штамм «Афганский»;

4 — BOO, эпизоотический штамм «Приморский»;

5 — BOO, эпизоотический штамм «ЕАО»;

6 — ВОК, вакцинный штамм «ВНИИЗЖ 2003»;

7 — ВОК, эпизоотический штамм «Приморский 2003»;

8 — ВОК, эпизоотический штамм «Таджикский»;

9 — ВОК, эпизоотический штамм «Pellor».

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают объем изобретения.

Технологический процесс изготовления вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз культуральной сухой состоит из двух этапов: получения посевного BOO штамма «ВНИИЗЖ» и посевного ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» и производственной серии предлагаемого препарата.

Посевной BOO штамма «ВНИИЗЖ» выращивают в культуре клеток Ch-91. Для этого клетки штамма Ch-91, хранящиеся в жидком азоте, размораживают путем оттаивания в водяной бане при (+37)÷(+38)°C и проводят 1÷2 пассажа для восстановления исходной скорости роста в монослое. Из культурального сосуда с монослоем клеток удаляют среду культивирования. Монослой клеток дважды обрабатывают диспергирующим раствором, содержащим 0,25%-ный раствор трипсина и 0,02%-ный раствор версена, взятые в соотношении 1:3, с добавлением 0,5% декстрозы, до начала отслаивания клеток. Диспергирующий раствор сливают, вносят среду Игла с 10% сыворотки КРС и 0,03% глутамина и суспензию клеток разливают в клинские матрасы. Культуру клеток инкубируют при 37°С в течение 48÷72 часов до момента формирования плотного монослоя. Для получения антигенного материала используют суспензию лиофилизированного или нативного BOO штамма «ВНИИЗЖ» с титром инфекционной активности от 5,0 до 6,0 lg ТЦД_50/см 3 . Средняя инфицирующая доза вируса должна составлять 0,1 ТЦД₅₀/кл. Внесенную вирусную суспензию экспонируют на предварительно отмытый от остатков ростовой среды раствором Хенкса монослой в течение 1 часа при (37±0,5)°С, после чего в необходимом объеме вносят поддерживающую питательную среду ПСП. Культивирование BOO проводят в течение 12 суток при указанной температуре. При поражении вирусом площади монослоя не менее 80% (округление и появления светопреломляющего эффекта) проводят сбор вируса. Для этого содержимое клинских матрасов замораживают при температуре минус 40°С и проводят оттаивание при комнатной температуре, энергично встряхивая для отделения монослоя. Из каждого матраса берут пробу по 3 см 3 для определения контаминирующих примесей и цитопатической активности. Полученный материал хранят при минус 20°С не более 6 месяцев. При активности BOO не ниже 5,5 lg ТЦД_50/см 3 стерильный вируссодержащий материал используют для составления производственной серии ассоциированной вирусвакцины против оспы овец и оспы коз культуральной сухой.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, был выделен в 2003 г. от больных оспой коз в Приморском крае Российской Федерации. Подготовку материала проводили общепринятым методом.

Биологические и вирусологические методы включали адаптацию вируса, выделенного от больных коз, к культурам первичнотрипсинизированных и перевиваемых линий клеток и его аттенуацию. Для выращивания ВОК были испытаны различные линии культур клеток: ПО, Ch-91, ПСГК, MDBK, СПЭВ, Vero, ВПК-21, Marc-145. В процессе адаптации было установлено, что перевиваемая линия клеток Ch-91 высокочувствительна к ВОК и оказалась оптимальной культурой для получения расплодки штамма для изготовления предлагаемой вирусвакцины.

В дальнейшем для получения расплодки вирусную суспензию вносили на освобожденный от ростовой среды монослой культуры клеток и экспонировали в течение часа в термостате при температуре (37±0,5)°С. После этого вносили поддерживающую среду ПСП или Игла с добавлением 1÷2% сыворотки крови КРС. Инфицированную культуру инкубировали при (37±0,5)°С до появления ЦПД вируса, которое характеризовалось округлением клеток, скоплением их в виде групп по 10÷20 клеток и в дальнейшем тотальной деструкцией монослоя клеток. При поражении площади монослоя не менее 70÷80% (округление и появление светопреломляющего эффекта, отслоение от стекла) 3-кратным промораживанием культуральных матрасов проводили сбор вируса с последующим отбором проб для исключения микробной контаминации и определения инфекционной активности вируса титрованием его в культуре клеток Ch-91.

Выделенный вирус обладал цитопатическим действием на культуре клеток Ch-91 с первоначальным титром 3,0÷4,0 lg ТЦД_50/см 3 . В последующих пассажах на этой же культуре клеток титр вируса повышался в 6÷7-м пассажах до 5,0÷5,5 lg ТЦД_50/см 3 , в 9÷10-м пассажах до 6,0 lg ТЦД_50/см 3 .

В зависимости от дозы заражения, составляющей 0,01÷1,0 ТЦД_50/кл., накопление аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК в культуре клеток Ch-91 обеспечивалось на уровне 5,33÷7,17 lg ТЦД_50/см 3 за 4÷7 суток при 50÷90% поражении клеточного монослоя. Оптимальной инфицирующей дозой вируса считали 0,01÷0,05 ТЦД_50/кл., вызывающей при стационарном культивировании в течение 5÷7 суток накопление вируса в титре от 6,67±0,08 до 7,17±0,10 lg ТЦД_50/см 3 при 80÷90% поражении клеточного монослоя. Результаты исследований представлены в таблице 1. Стабильность культуральных свойств лиофилизированного вируса при определении степени его накопления в течение 35 пассажей в культуре клеток Ch-91 при заражающей дозе 0,01÷0,05 ТЦД_50/кл. представлена на фиг.1.

Из данных, представленных на фиг.1, следует, что в процессе пассирования в условиях стационарного культивирования ВОК с дозой заражения 0,01÷0,05 ТЦД_50/кл. его инфекционная активность 6,0÷7,5 lg ТЦД_50/см 3 отмечалась в течение первых 13 пассажей. При увеличении количества пассажей инфекционная активность вируса постепенно снижалась. Результаты исследования сроков культивирования ВОК в культуре клеток Ch-91 представлены в таблице 2.

Инфекционная активность штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК при дозе заражения 0,01÷0,05 ТЦД_50/кл зависела от количества пассажей. На уровне 8÷13 пассажей продолжительность культивирования ВОК не превышала 7 дней. За это время достигалось наиболее выраженное 80÷90% ЦПД вируса и его максимальное накопление в культуре клеток Ch-91. В дальнейшем накопление вируса установлено на более низком уровне, и инфекционная активность вируса следующих пассажей характеризовалась меньшими значениями с увеличением продолжительности культивирования.

В результате осуществления 35 последовательных пассажей выделенного ВОК на культуре клеток Ch-91 был получен аттенуированный штамм «ВНИИЗЖ 2003», имеющий стабильные биотехнологические, антигенные и иммуногенные свойства, которые позволяют использовать его для получения антигенного материала при изготовлении диагностикумов и вирусвакцины против оспы коз.

В дальнейшем культуру клеток Ch-91 использовали для получения расплодки ВОК для изготовления вирусвакцины.

Полученный штамм ВОК был испытан сначала в лабораторных, а затем и в эпизоотических условиях. В результате проведенных исследований установлено следующее:

1. Проверку на стерильность осуществляли путем высева проб вируссодержащей жидкости на бактериальные питательные среды МПБ, МПА, МППБ, агар Сабуро (жидкий) и тиогликолев

источник

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении средств специфической профилактики оспы коз.

Оспа коз — высококонтагиозное вирусное заболевание, которое протекает в тяжелой форме, с характерными клиническими признаками, часто с летальным исходом, особенно среди молодняка. Экономический ущерб, причиняемый оспой козоводству, чрезвычайно велик. Прямые убытки слагаются из отхода животных (гибель молодняка при тяжелом течении болезни может достигать 50÷80%, а взрослого поголовья — 5÷10%), снижения продуктивности — удоев молока, качества и привеса мяса, потерь шерсти и пуха, снижения качества кожи.

В соответствии с классификацией, установленной Международной комиссией по таксономии вирусов (International Committee on Taxonomy of Vimses — ICTV), вирус оспы коз (ВОК) относится к роду 00.058.1.04 Capripoxvirus, принадлежащему к подсемейству 00.058.1 Chordopoxvirinae семейства 00.058 Poxviridae [1].

Род Capripoxvirus включает вирус оспы овец (BOO), ВОК и вирус кожной бугорчатки КРС (вирус нодулярного дерматита (ВБ)). Представители рода близкородственны, что доказывается иммунологическим анализом и структурой гена. Так ВОК является близкородственным BOO, но таксономически самостоятельным видом. BOO и ВОК не обладают четко выраженной хозяйской специфичностью: несмотря на то, что обычно вирусы вызывают наиболее выраженное заболевание либо у овец, либо у коз, некоторые штаммы патогенны для обоих видов животных-хозяев [2, 3].

В связи с этим на практике, как правило, не дифференцируют два этих заболевания, а обычно обозначают как единое заболевание — оспа овец и коз. Именно под таким названием заболевание оспа овец и коз приводится в перечне Международной организации здравоохранения животных (МЭБ) болезней, обязательных к декларированию, хотя это и затрудняет анализ реальной распространенности оспы овец и оспы коз как отдельных заболеваний.

По данным МЭБ это заболевание регистрируется на всех континентах, за исключение Австралии и Океании. В последние годы оспа получила широкое распространение и в тех странах, где раньше никогда не регистрировалась (Вьетнам, 2005; Монголия, 2006; Греция, 2007).

Напряженная ситуация остается в странах СНГ Среднеазиатского и Кавказского регионов (Казахстан, Таджикистан, Киргизия, Азербайджан, Грузия). В 1996-2003 гг. неблагополучными по этому заболеванию были 55 стран, в том числе 7 стран СНГ. Так, в Таджикистане оспу коз регистрировали в виде отдельных случаев, в 2001 г. — уже в 11 хозяйствах, а в 2002 г. — практически во всех зонах республики. Вначале заболевание выявилось только у коз ангорской породы, а в 2002 г. — и у коз местных пород.

В течение длительного времени Россия оставалась благополучной по данному заболеванию. В 2002 г. во время вспышки оспы овец на Дальнем Востоке отмечались единичные случаи заболевания коз, а в 2003 г. оспа коз проявила себя как самостоятельное заболевание.

В связи с тем, что Россия имеет общую границу и тесные экономические связи со многими неблагополучными по оспе государствами, заболевание представляет большую угрозу для нашей страны в отношении возможности заноса возбудителей болезни.

Создавшаяся эпизоотическая ситуация по оспе овец и оспе коз свидетельствует о необходимости иметь высокоэффективные диагностические препараты и средства специфической профилактики как против оспы овец, так и против оспы коз, которые в короткие сроки позволили бы идентифицировать возбудителей этих заболеваний и быстро купировать распространение инфекций.

Это обстоятельство вынуждает вести постоянный поиск новых штаммов ВОК, пригодных для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики оспы коз.

В странах, где отмечены вспышки этого заболевания, специфическая профилактика оспы коз проводится с помощью культуральных вирусвакцин из аттенуированных штаммов ВОК и инактивированных тканевых и культуральных вакцин. Однако инактивированные вакцины уступают вирус-вакцинам по иммуногенной активности.

Известна вирус-вакцина против оспы коз, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «Durg» ВОК, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде стабилизатора в эффективном соотношении [4].

Известна вирус-вакцина против оспы коз, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «GT₄-STV₄₂» ВОК, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде стабилизатора в эффективном соотношении [5].

Известна вирус-вакцина против оспы коз, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «Mysore» ВОК, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде стабилизатора в эффективном соотношении [6].

Известна вирус-вакцина против оспы коз, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «Gorgan» ВОК, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде стабилизатора в эффективном соотношении [7].

Известен также штамм культивируемых клеток гонады козы домашней Capra hircus L. — продуцент вирусов животных. Авторами данного изобретения определена чувствительность клеток Ch-91 к заражению вирусами ящура, болезни Ауески, болезни Гамборо и африканской чумы лошадей [8].

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существующих признаков является вирус-вакцина против оспы коз культуральная сухая, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «ОК/А-04» ВОК, репродуцированного в культуре клеток почки овцы ПО-ВНИИВВиМ с титром инфекционной активности 5,5÷6,0 lg ТЦД₅₀/см 3 , и целевую добавку в виде лактозо-пептонного стабилизатора в соотношении, мас.%, 50,0:50,0 [9].

Недостатки вышеуказанных вирусвакцин, в том числе и вирусвакцины-прототипа, состоят в том, что они обеспечивают эффективную защиту животных только от заражения гомологичным вирусом.

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в получении вирусвакцины против оспы коз культуральной сухой, создающей эффективную защиту восприимчивых животных от эпизоотического ВОК, циркулирующего на территории Российской Федерации.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения состоит в расширении арсенала вирусвакцин против оспы коз культуральных сухих, обладающих высокой антигенной и иммуногенной активностью и обеспечивающих эффективную защиту восприимчивых животных от эпизоотического возбудителя оспы коз, циркулирующего на территории России.

Указанный технический результат достигнут созданием вирусвакцины против оспы коз культуральной сухой, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.

Предлагаемая вирус-вакцина содержит активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» (авторское наименование) ВОК, репродуцированного в культуре клеток гонады козы Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД₅₀/см 3 , и целевую добавку в виде стабилизатора в соотношении, мас.%:

Вирусный изолят, послуживший источником для получения аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, был выделен в 2003 г. в Приморском крае Российской Федерации от больных оспой коз.

Для получения вируса, обладающего оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали различные системы культивирования, в том числе линии клеток: ПО, Ch-91, ПСГК, МДВК, СПЭВ, Vero, ВНК-21 и Marc-145. В процессе адаптации было установлено, что гомологичная система культивирования перевиваемая линия клеток гонады козы Ch-91 высокочувствительна к ВОК и оказалась оптимальной культурой для выращивания выделенного вируса. В результате осуществления 35 последовательных пассажей изолята на культуре клеток Ch-91 был получен аттенуированный штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, имеющий стабильные биотехнологические, антигенные и иммуногенные свойства.

В зависимости от дозы заражения и количества пассажей в условиях стационарного культивирования накопление ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» в культуре клеток Ch-91 обеспечивалось на уровне от 6,0 до 7,5 lg ТЦД₅₀/см 3 .

По сравнению с исходным изолятом штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК имеет генетические и фенотипические отличия. По результатам сравнительного изучения иммунобиологических характеристик различных штаммов ВОК установлено, что штамм «ВНИИЗЖ 2003» является авирулентным, обладает хорошей антигенной и иммуногенной активностью и защищает от контрольного заражения гомологичным эпизоотическим вирусом.

Преимущество штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК по сравнению со штаммом «ОК/А-04» ВОК заключается в стабильно высоком накоплении вируса в культуре клеток Ch-91 и его высокой биологической, антигенной и иммуногенной активности.

Штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК депонирован 6 июня 2006 г. во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») под регистрационным номером (ссылкой) — производственный вакцинный штамм «ВНИИЗЖ 2003» — ДЕП ВОК.

Для изготовления вирусвакцины против оспы коз культуральной сухой в качестве чувствительной биологической системы используют культуру клеток Ch-91 с хорошо сформировавшимся монослоем 2÷3 суточного возраста в клинских матрасах.

В качестве активного вещества используют суспензию лиофилизированного или нативного ВОК аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» с титром инфекционной активности от 5,0 до 6,0 lg ТЦД₅₀/см 3 . Для заражения культуры клеток Ch-91 используют вирус в дозе 0,1 ТЦД₅₀/кл. Внесенную вирусную суспензию экспонируют на монослой культуры клеток Ch-91 в термостате в течение часа при (37±0,5)°С. Культивирование вируса проводят в течение 12 суток при указанной температуре. При поражении вирусом площади монослоя не менее 80% (округление и появление светопреломляющего эффекта) проводят сбор вируса.

Для изготовления вирусвакцины против оспы коз культуральной сухой используют антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученного в культуре клеток Ch-91 с титром инфекционной активности не менее 5,5 lg ТЦД₅₀/см 3 .

Вирусвакцину против оспы коз кульуральную сухую получают путем смешивания антигенного материала из аттенуировнного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК и стабилизатора в соотношении, мас.%, 80:20÷90:10 соответственно. В качестве стабилизатора используют растворы сахарозы, желатозы и гидролизата лактальбумина.

Содержание антигенного материала и стабилизатора в прививной дозе вирусвакцины против оспы коз культуральной сухой в соотношении, мас.%, 80:20÷90:10 является оптимальным, так как обеспечивает толерантную презентацию антигена в организме иммунизированного животного.

Полученную вирусвакцину фасуют в ампулы по 2,0 см 3 или во флаконы по 2,0 см 3 или по 4,0 см 3 , замораживают при температуре минус 50°С и подвергают лиофильному высушиванию.

Вирус-вакцина против оспы коз культуральная сухая, расфасованная во флаконы или ампулы, представляет собой однородную пористую массу цилиндрической формы светло-желтого цвета, растворяющуюся в течение 1-1,5 минут в физрастворе. В одной ампуле содержится 2,0 см 3 , а во флаконе — 2,0 см 3 или 4,0 см 3 сухой вирусвакцины, что соответствует в ампуле 50 и во флаконе 50 или 100 прививным дозам препарата для коз.

Полученный препарат подвергают контролю на стерильность, специфичность и иммунобиологическую активность в соответствии с показателями, установленными стандартом организации-изготовителя.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:

1. Вирус-вакцина против оспы коз культуральная сухая.

2. Активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК в эффективном количестве.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:

1. Вирус-вакцина против оспы коз культуральная сухая.

По сравнению с вирусвакциной-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемой вирусвакцины является то, что в качестве активного вещества она содержит антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, обладающего высокой антигенной и иммуногенной активностью, в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, репродуцированного в культуре клеток гомологичного происхождения.

2. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, репродуцированного в культуре клеток гонады козы Ch-91.

3. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, репродуцированного в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД₅₀/см 3 .

4. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, репродуцированного в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД₅₀/см 3 , в количестве 80-90 мас.%.

5. Из целевых добавок стабилизатор.

6. Стабилизатор в количестве 10-20 мас.%.

7. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, репродуцированного в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД₅₀/см 3 , и стабилизатор в соотношении, мас.%:

Предлагаемое изобретение расширяет арсенал вирусвакцин против оспы культуральных сухих, обладающих высокой антигенной и иммуногенной активностью и обеспечивающих эффективную защиту восприимчивых животных от эпизоотического возбудителя оспы коз, циркулирующего на территории России.

Достижение технического результата от использования предлагаемого изобретения объясняется тем, что в качестве активного вещества оно содержит антигенный материал из нового авирулентного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, обладающего высокой антигенной и иммуногеной активностью.

Экспериментально подтверждена возможность его использования в составе вирусвакцины против оспы коз. Штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК обеспечивает получение эффективной вирусвакцины против оспы коз, создающей защиту восприимчивых животных от возбудителя оспы коз, циркулирующего на территории России.

Сущность изобретения пояснена на графических материалах, на которых на:

фиг.1 представлено графическое изображение изменения титра ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» при его пассировании в культуре клеток Ch-91 (доза заражения 0,01÷0,05 ТЦД₅₀/кл);

фиг.2 — фотографическое изображение под электронным микроскопом характерной морфологии ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» (фото получено д.б.н. А.П.Пономаревым), увеличение х76000;

фиг.3 — хроматограмма результатов видовой дифференциации каприпоксвирусов, полученных методом мультиплексной ПЦР с видоспецифическими праймерами, на которой:

1 — отрицательный контроль;

2 — маркер (снизу вверх — 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 п.н. и т.д.);

3 — BOO, вакцинный штамм «ВНИИЗЖ»;

4 — BOO, эпизоотический штамм «Афганский»;

5 — BOO, эпизоотический штамм «Приморский»;

6 — BOO, эпизоотический штамм «ЕАО»;

7 — BOO, эпизоотический штамм «Таджикский»;

8 — ВОК, вакцинный штамм «ВНИИЗЖ 2003»;

9 — ВОК, эпизоотический штамм «Приморский 2003»;

10 — ВОК, эпизоотический штамм «Pellor»;

фиг.4 — хроматограмма результатов видовой дифференциации BOO и ВОК, полученных методом рестрикции гена «ankyrin-repeat» белка, на которой:

1 — маркер (снизу вверх — 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 п.н. и т.д.);

2 — BOO, вакцинный штамм «ВНИИЗЖ»;

3 — BOO, эпизоотический штамм «Афганский»;

4 — BOO, эпизоотический штамм «Приморский»;

5 — BOO, эпизоотический штамм «ЕАО»;

6 — ВОК, вакцинный штамм «ВНИИЗЖ 2003»;

7 — ВОК, эпизоотический штамм «Приморский 2003»;

8 — BOO, эпизоотический штамм «Таджикский»;

9 — ВОК, эпизоотический штамм «Pellor».

Штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК характеризуется следующими признаками и свойствами.

Штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК относится к роду Capripoxvirus, семейства Poxviridae и обладает морфологическими признаками, характерными для ВОК.

Вирион ВОК состоит из вирусной сердцевины (нуклеоида), овальных латеральных тел и наружной оболочки. Нуклеоид окружен гладкой мембраной толщиной 5 нм. Внутри него находится нуклеопротеин (ДНК, связанная с белком), имеющий S — образную или более сложную форму. Чувствительные к трипсину структуры, называемые боковыми телами, сдавливают нуклеоид, придавая ему форму двояковогнутого диска, имеющего на срезе вид гантели. Нуклеоид и боковые тела окружены наружной оболочкой, состоящей из липидов и трубчатых белковых структур (10×5 нм).

Геном представлен двухцепочечной ДНК. Две цепи ДНК соединены шпилькообразными петлями, в результате чего образуется одна непрерывная, ковалентно связанная полинуклеотидная цепь. Флип-флоп формы ДНК (т.н. «шпильки») образованы инвертированными концевыми повторами: идентичными, но противоположно ориентированными последовательностями ДНК, длина которых варьирует даже в пределах одного рода (Классификация и номенклатура вирусов позвоночных, 2002).

По своим антигенным свойствам штамм «ВНИИЗЖ 2003» относится к ВОК.

Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой в реакции нейтрализации (РН) на культуре клеток Ch-91, в реакции диффузионной преципитации (РДП) и в реакции длительного связывания комплемента (РДСК). Штамм проявляет антигенную активность в РДП 1:16÷1:32, в РДСК 1:120÷1:160 и в иммуноферментном анализе (ИФА) 1:1000÷1:4000.

Испытания вирусвакцины против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» в лабораторных условиях показали, что иммунизация коз сопровождается образованием вируснейтрализующих антител в крови животных в титре не менее 2,0 log₂.

Штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК проявляет высокую биологическую, антигенную и иммунологическую активность в лиофилизированном виде и в виде культуральной вируссодержащей суспензии. Штамм предназначен для изготовления вакцинных и диагностических препаратов. Вирус штамма «ВНИИЗЖ 2003» репродуцируется в монослойных культурах клеток: первичнотрипсинизированной культуре клеток почки овцы и перевиваемой культуре клеток Ch-91 и в течение 5÷7 суток инкубирования накапливается в титре не менее 5,5 lg ТЦД₅₀/см 3 . Сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 35 пассажей.

Геном ВОК не обладает инфекционностью и представлен молекулой линейной двухцепочечной ДНК с центральным менее вариабельным участком длиной около 145 kb и более вариабельными концами.

При электронной микроскопии штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК были выявлены вирусные частицы, структура и размеры которых характерны для каприпоксвирусов.

Вирионы оспы имеют линейную двухспиральную ДНК длиной 45÷60 мкм, молекулярной массой 80÷240 МДа. Плавучая плотность ДНК вирусов оспы в хлористом цезии и сахарозе равна 1,676÷1,723 г/см 3 . Важной особенностью ДНК вируса оспы является необычно прочная структура двухспиральной молекулы. Обе нити молекулы ДНК связаны между собой ковалентно.

Устойчивость к внешним факторам

ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» устойчив к высушиванию, эфиру, не стоек к воздействию высокой температуры, различных химических веществ, например формалину (0,5-1%), слабым растворам йода (1:10000), соляной, серной кислот (2,5%), спирту, его инфекционная активность сохраняется при рН 6,0÷7,4.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность — иммуногенен в составе живой лиофилизированной вакцины.

Реактогенность — в месте подкожного введения нативного вируса в объеме 5 см 3 образуется кожный тяж длиной до 4 см.

Патогенность — при внутримышечном введении животным заболевания не вызывает. При испытании вирусвакцины против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» на козах было установлено, что она не вызывала ответной местной реакции на подкожное введение в объеме 5 см 3 (125 прививных доз), была безвредна и ареактогенна для коз.

Вирулентность — авирулентен для мелких жвачных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Антигенные свойства — вирус индуцирует у коз и овец образование вируснейтрализующих антител.

Стабильность биологических свойств. Сохраняет исходные характеристики при пассировании на культуре клеток гонады козы Ch-91 в течение 35 пассажей. Штамм нереверсибелен в течение 5 пассажей на козах.

Сущность предложенного изобретения пояснена примерами его исполнения и использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма «ВНИИЗЖ 2003», был выделен в 2003 г. от больных оспой коз в Приморском крае Российской Федерации. Подготовку материала проводили общепринятым методом.

Биологические и вирусологические методы включали адаптацию вируса, выделенного от больных коз, к культурам первично трипсинизированных и перевиваемых линий клеток и его аттенуацию. Для выращивания ВОК были испытаны разные линии культур клеток: ПО, Ch-91, ПСГК, MDBK, СПЭВ, Vero, BHK — 21, Marc-145. В процессе адаптации было установлено, что перевиваемая линия клеток Ch-91 высокочувствительна к ВОК и оказалась оптимальной культурой для получения расплодки штамма для изготовления вирусвакцины.

В дальнейшем для получения расплодки вирусную суспензию вносили на освобожденный от ростовой среды монослой культуры клеток и экспонировали час в термостате при температуре (37±0,5)°С. После этого вносили поддерживающую среду ПСП или Игла с добавлением 1÷2% сыворотки крови КРС. Инфицированную культуру инкубировали при (37±0,5)°С до появления ЦПД вируса, которое характеризовалось округлением клеток, скоплением их в виде групп по 10÷20 клеток и в дальнейшем тотальной деструкцией монослоя клеток. При поражении площади монослоя не менее 70÷80% (округление и появление светопреломляющего эффекта, отслоение от стекла) 3-кратным промораживанием культуральных матрасов производили сбор вируса с последующим отбором проб для исключения микробной контаминации и определения инфекционной активности вируса титрованием в культуре клеток Ch-91.

Выделенный вирус обладал цитопатическим действием на культуре клеток Ch-91 с первоначальным титром 3,0÷4,0 lg ТЦД₅₀/см 3 . В последующих пассажах на этой же культуре клеток титр вируса повышался в 6÷7-м пассажах до 5,0÷5,5 lg ТЦД₅₀/см 3 , в 8÷10-м пассажах до 6,0 lg ТЦД₅₀/см 3 .

В зависимости от дозы заражения, составлявшей 0,01÷1,0 ТЦД₅₀/кл, накопление аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ-2003» ВОК в культуре клеток Ch-91 обеспечивалось на уровне 5,33÷7,17 lg ТЦД₅₀/см 3 за 4÷7 суток при 50÷90% поражении клеточного монослоя. Оптимальной инфицирующей дозой вируса считали 0,01÷0,05 ТЦД₅₀/кл, вызывающей при стационарном культивировании в течение 5÷7 суток накопление вируса в титре от 6,67±0,08 до 7,17±0,10 lg ТЦД₅₀/см 3 при 80÷90% поражении клеточного монослоя. Результаты исследований представлены в таблице 1. Стабильность культуральных свойств лиофилизированного вируса при определении степени его накопления в течение 35 пассажей в культуре клеток Ch-91 при заражающей дозе 0,01-0,05 ТЦД₅₀/кл представлена на фиг.1.

Из данных, представленных на фиг.1, следует, что в процессе пассирования в условиях стационарного культивирования ВОК с дозой заражения 0,01-0,05 ТЦД₅₀/кл его инфекционная активность на уровне 6,0÷7,50 lg ТЦД₅₀/см 3 отмечалась в течение первых 13 пассажей. При увеличении количества пассажей инфекционная активность вируса постепенно снижалась. Результаты исследования сроков культивирования ВОК в культуре клеток Ch-91 представлены в таблице 2.

Инфекционная активность штамма «ВНИИЗЖ-2003» ВОК при дозе заражения 0,01÷0,05 ТЦД₅₀/кл зависела от количества пассажей. На уровне 8÷13 пассажей продолжительность культивирования ВОК не превышала 7 дней. За это время достигалось наиболее выраженное (80÷90%) ЦПД вируса и его максимальное накопление в культуре клеток Ch-91. В дальнейшем, накопление вируса установлено на более низком уровне и инфекционная активность вируса следующих пассажей характеризовалась меньшими значениями с увеличением продолжительности культивирования.

В результате осуществления 35 последовательных пассажей выделенного ВОК на культуре клеток Ch-91 был получен аттенуированный штамм «ВНИИЗЖ 2003» (авторское наименование), имеющий стабильные биотехнологические, антигенные и иммуногенные свойства, которые позволяют использовать его для получения антигенного материала при изготовлении диагностикумов и вирусвакцины против оспы коз.

В дальнейшем культуру клеток Ch-91 использовали для получения расплодки ВОК при изготовлении вирусвакцины.

Полученный штамм ВОК был испытан в лабораторных, а затем и в эпизоотических условиях. В результате проведенных исследований установлено следующее:

1. Проверку на стерильность осуществляли путем высева проб вируссодержащей жидкости на бактериальные питательные среды МПБ, МПА, МППБ, агар Сабуро (жидкий) и тиогликолевую среду, а также среды Эдварда или Мартена для выявления микоплазм. Бактериальные или грибковые загрязнения штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК отсутствовали, как и контаминация другими вирусами.

2. При электронной микроскопии штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК были выявлены вирусные частицы, структура и размеры которых характерны для каприпоксвирусов (фиг.2).

3. Видовая принадлежность штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК подтверждена двумя молекулярно-генетическими методами: мультиплексной ПЦР с видоспецифичными праймерами (фиг.3) и рестрикционным анализом фрагмента гена «ankyrin-repeat» белка (фиг.4).

4. Специфичность штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК была подтверждена в РДП, РДСК и ИФА.

Полученный штамм депонирован 6 июня 2006 года во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером (ссылкой) — производственный вакцинный штамм «ВНИИЗЖ 2003» — ДЕП ВОК.

В ходе разработки мультиплексной ПЦР для индикации и видовой дифференциации каприпоксвирусов в результате анализа полных нуклеотидных последовательностей генома каприпоксвирусов, представленных в базе данных GenBank, были установлены видоспецифичные участки для BOO, ВОК и ВБ. На основе этих данных были сконструированы видоспецифичные праймеры S1 и S2 — для BOO, G1 и G2 -для ВОК, L1 и L2 — для ВБ. Видоспецифичные праймеры были рассчитаны таким образом, что чтобы синтезируемые с их участием ампликоны имели разную длину: 415 п.н. для ВОК, 311 п.н. для BOO и 254 п.н. для ВБ. Это позволило использовать все три пары праймеров в одной реакции и различать продукты мПЦР по размеру с помощью электрофореза в агарозном геле.

В ходе видовой дифференциации каприпоксвирусов было исследовано 11 проб вируссодержащих клеточных культур с вакцинным штаммом «ВНИИЗЖ» и с эпизоотическими штаммами «Афганский», «Приморский», «EAO» BOO, с вакцинным штаммом «ВНИИЗЖ 2003» и с эпизоотическими штаммами «Приморский 2003», «Pellor» ВОК, с ВБ, а также с изолятами «ЕАО»и «Таджикский» в виде суспензии кожи больных животных.

На фиг.3 отражены результаты ПЦР с видоспецифичными праймерами. В пробах, содержащих ДНК штамма «ВНИИЗЖ 2003», синтезировался фрагмент длиной 415 п.н., в амплификации которого участвуют видоспецифичные для ВОК праймеры.

С помощью метода рестрикционного анализа можно также дифференцировать BOO и ВОК и определять штаммовую принадлежность BOO. С использованием родоспецифических праймеров проводится амплификация участка гена «ankyrin-repeat» белка длиной 564 п.н. Затем проводится обработка амплификонов рестриктазой Dra I. В пределах амплифицируемого фрагмента генома у эпизоотических изолятов BOO расположен один сайт рестрикции Dra I, у вакцинных штаммов BOO — два сайта, у ВОК таких сайтов нет. Анализ продуктов рестрикции в агарозном или полиакриламидном геле позволяет легко отличать BOO от ВОК и вакцинные штаммы BOO от эпизоотических изолятов по характерному набору фрагментов ДНК.

При проведении данного метода у вакцинного штамма «ВНИИЗЖ» BOO ампликон в результате обработки рестриктазой Dra I расщеплялся на три фрагмента, у всех эпизоотических изолятов BOO — на два фрагмента, а у вакцинного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК и двух эпизоотических изолятов ВОК расщепления ампликона не происходило (фиг.4).

Таким образом, при обработке эндонуклеазой Dra I фрагмента гена «ankyrin-repeat» белка штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК расщепления ДНК не наблюдалось, что указывает на принадлежность штамма к ВОК.

Дополнительно специфичность штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК была подтверждена и серологическими методами в РДП и РДСК. РДП и РДСК были положительными только между специфическим вирусом с гомологичной сывороткой (табл.3, табл.4).

Технологический процесс изготовления вирусвакцины против оспы коз включает два этапа: получение посевного ВОК и изготовление производственной серии вирусвакцины.

Для получения посевного вируса используют культуру клеток Ch-91 с хорошо сформировавшимся монослоем 2÷3 — суточного возраста в клинских матрасах и суспензию лиофилизированного или нативного ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» с инфекционным титром от 5,0 до 6,0 lg ТЦД₅₀/см 3 . Средняя инфицирующая доза вируса составляет 0,1 ТЦЦ₅₀/кл. Внесенную вирусную суспензию экспонируют на предварительно отмытый от остатков ростовой среды раствором Хенкса монослой в термостате в течение часа при (37±0,5)°С, затем в необходимом объеме вносят поддерживающую питательную среду ПСП. Культивирование вируса проводят в течение 12 суток при указанной температуре.

При поражении вирусом площади монослоя не менее 80% (округление и появление светопреломляющего эффекта) проводят сбор вируса. Для этого содержимое клинских матрасов замораживают при температуре минус 40°С и проводят оттаивание при комнатной температуре, энергично встряхивая.

Для получения одного миллиона доз вирусвакцины необходимо сорок литров вируссодержащей суспензии.

Вирусвакцину против оспы коз получают путем смешивания полученного антигенного материала из штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, репродуцированного в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД₅₀/см 3 , и стабилизатора в соотношении, мас.%: 80:20÷90:10 соответственно. В качестве стабилизатора используют растворы сахарозы, желатозы и гидролизата лактальбумина.

Из полученного антигенного материала готовят 2 серии вирусвакцины против оспы коз, отличающиеся процентным содержанием стабилизатора в препарате.

Серия №1 вирусвакцины против оспы коз из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК содержит, мас.%:

Серия №2 вирусвакцины против оспы коз из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК содержит, мас.%:

Полученную вирусвакцину фасуют в ампулы по 2,0 см 3 или во флаконы по 2,0 см 3 или 4,0 см 3 , замораживают при температуре минус 50°С и подвергают лиофильному высушиванию. После сублимации флаконы (ампулы) заполняют сухим стерильным воздухом или инертным газом, закрывают резиновыми пробками и закатывают металлическими колпачками, ампулы запаивают.

Вирус-вакцина против оспы коз культуральная сухая, расфасованная во флаконы или ампулы, представляет собой однородную пористую массу цилиндрической формы светло-желтого цвета, растворяющуюся в течение 1÷1,5 минут в физрастворе. В одной ампуле содержится 2,0 см 3 , а во флаконе 2,0 см 3 или 4,0 см 3 сухой вирусвакцины, содержащей соответственно в ампуле 50 и во флаконе 50 или 100 прививных доз препарата для коз.

Полученный препарат подвергают контролю на стерильность, специфичность и иммуногенную активность в соответствии с показателями, установленными стандартом организации-изготовителя.

Инфекционную активность штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК в вирусвакцине после лиофилизации определяют титрованием десятикратных разведений вирусной суспензии в культуре клеток Ch-91 во флаконах. Учет результатов проводят в течение 12 суток по наличию цитопатического действия. Результаты титрования 2-х серий вирусвакцины представлены в таблице 5.

Титр вируса в вакцине определен в значениях от 5,11±0,09 до 5,41±0,15 lg ТЦД₅₀/см 3 . При хранении в течение 1,0÷1,5 лет титр вируса снижался не более чем на 0,5 lg ТЦД₅₀/см 3 .

Однако следует отметить, что хранение вакцины в течение 2÷3 недель при комнатной температуре снижало инфекционную активность ВОК на 1,0÷1,5 lg ТЦД₅₀/см 3 . Поэтому транспортировка вирусвакцины против оспы коз должна осуществляться при низких температурах.

Для определения безвредности и реактогенности вирусвакцину против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» вводили козам по 5,0 см 3 в исходном разведении (125 прививных доз) подкожно в область бесшерстного участка внутренней поверхности передней конечности. За животными вели наблюдение в течение 21 суток.

При исследовании вакцины на безвредность и реактогенность в единичных случаях у животных на месте введения вакцины в исходном разведении установлено образование на 4÷6 сутки воспалительного отека в виде небольшого тяжа размером от 1 до 3 см, который исчезал на 3÷14 сутки после появления и никак не отражался на клиническом состоянии животных. На протяжении всего срока наблюдения (21 сутки) температура тела коз оставалась в пределах физиологической нормы. Это позволило заключить, что вирус-вакцина против оспы коз из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК является безвредным и нереактогенным препаратом.

Антигенную активность вирусвакцины против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» серии №1 и №2 определяли на 7, 14 и 21-е сутки после иммунизации коз различными разведениями препарата. От животных в указанные сроки отбирали пробы крови с целью получения сыворотки крови, которую исследовали в реакции нейтрализации (РН) в культуре клеток Ch-91 на наличие вируснейтрализующих антител (ВНА) с постоянной дозой ВОК 100 ТЦД₅₀/см 3 и последовательными двукратными разведениями сыворотки от 1:2 до 1:32. Учет результатов проводили в течение 12 суток со сменой поддерживающей среды через 3-4 суток. Титр антител определяли по методу Рида и Менча и выражали в логарифмах с основанием 2 (log₂).

Уровень антител в крови иммунизированных животных зависел от дозы введенной вакцины и сроков после вакцинации (таблицы 6 и 7). Так, титр ВНА после введения вакцины серии №1 в объеме 5 см 3 в исходном разведении, составлявшем 125 прививных доз, на 7-е сутки был 2,34±0,46 log₂, на 14-е сутки — 2,53±0,19 log₂ и на 21-е сутки — 3,00±0,50 log₂, в одной прививной дозе — 1,50±0,31, 2,02±0,30 и 2,50±0,12 log₂ соответственно. Во всех случаях наличие максимального уровня антител установлено на 21-е сутки после иммунизации животных. После иммунизации в дозе 0,00001 ПВД (разведение вакцины 1:100000) в крови животных выявлено по сравнению с другими разведениями наличие невысокого титра антител, который соответствовал на 21-е сутки 1,20±0,15 log₂.

После введения вакцины серии №2 на 7-е сутки титры антител в крови коз, привитых в дозах от 10 2 до 10 4 ТЦД₅₀ и в цельном виде, находились в пределах от 1,08±0,11 до 1,63±0,20 log₂; в дозах 10 и 1 ТЦД₅₀ от 0,20±0,18 до 0,63±0,32 log₂ соответственно. На 14-е сутки активность сывороток крови коз, привитых в указанных дозах, составляла от 0,75±0,35 до 1,96±0,19 log₂. На 21-е сутки после иммунизации коз вакциной в цельном виде титр антител в крови животных достигал 2,33±0,9, в разведении 1:25-2,54±0,22; 1:100-1,83±0,24; 1:1000-1,75±0,12; 1:10000-1,36±0,13 и 1:100000-1,13±0,18 log₂.

Иммуногенную активность вирусвакцины против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» проверяли методом контрольного заражения. На 21-е сутки после иммунизации животным, привитым различными разведениями препарата серии №1 и серии №2, а также контрольным козам вводили внутрикожно в область подхвостовой складки вирулентный штамм «Приморский 2003» ВОК в дозе 1000 ИД₅₀/см 3 . После заражения животных наблюдали 14 суток с ежедневной термометрией и осмотром.

В период иммунизации и после контрольного заражения температура тела коз, иммунизированных различными дозами вирусвакцины против оспы коз, оставалась на уровне физиологической нормы. Контрольно зараженные животные заболевали оспой в генерализованной форме и погибали на 8-10 день после заражения.

Результаты исследования иммуногенной активности вирусвакцины против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» представлены в таблицах 6 и 7.

Несмотря на различную специфическую активность сыворотки крови животных, привитых различными дозами вирусвакцины (от 10 4 до 1 ТЦД₅₀), все козы были предохранены от заболевания оспой при экспериментальном заражении вирулентным штаммом «Приморский 2003» ВОК в летальной дозе (1000 ИД₅₀/0,5 см 3 ).

Таким образом, получены данные, свидетельствующие о невосприимчивости к заболеванию животных, привитых вирусвакциной против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003».

Проведены испытания эффективности вирусвакцины против оспы коз культуральной сухой (серия №3) из штамма «ВНИИЗЖ 2003», полученной так, как описано в примере 3, и содержащей, мас.%:

в угрожаемых хозяйствах ряда районов Республики Таджикистан в связи с возникновением оспы коз.

Всего вирусвакциной против оспы коз иммунизировано 5000 коз. Коз иммунизировали в соответствии с Инструкцией по применению препарата. После применения вакцины клинических осложнений у животных не отмечали. Вакцинация коз в угрожаемых по оспе хозяйствах обеспечила образование активного иммунитета у животных и их полную защиту от заболевания оспой. Случаев прорыва иммунитета после иммунизации животных не было отмечено.

Для определения уровня поствакцинального иммунитета от 10 животных по каждой из групп животных перед иммунизацией, а также на 10, 20 и 30 дни после вакцинации были отобраны сыворотки крови, которые направлены в ФГУ «ВНИИЗЖ».

Было установлено, что вирус-вакцина против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003», примененная в угрожаемых по оспе хозяйствах Республики Таджикистан, обладала высокой иммунобиологической активностью, безвредна для животных и предохраняла привитых животных от заболевания оспой.

2. Kitching R.P. The control of sheep and goats pox // Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. — 1986. — V.5, №2. — Р.503-511.

3. Gershon P.O., Black D.N. A comparison of the genomes of capripoxvirus isolates of sheeps, goats and cattle // Virology. — 1988. — V.164. — P.341-349.

4. Joshi R.K. Physico-chemical characterization of «Durg» isolate of goat pox virus // Indian Vet. J. — 2001. — V.78, №5. — P.369-370.

5. Wang Shaohua et al. The pathomorphological studies on immunological effect of attenuated goat pox cellular virus // Acta vet. Zootechn. Sinica. — 1988. — V.19, №2. — P.111-116.

6. Kitching R.P., Cam V.M. Sheep pox and goat pox // OIE Manual of standarts for diagnostic test and vaccines; 4 th edn. — Paris: World organization for animal health, 2000. — P.168-177.

7. Tulman E.R. et al. The genomes of pox and goat pox viruses // J.of Virol. — 2000. — V.76, №12. — Р.6054-6061.

8. Пат. РФ №2061753; C12N 5/06, 7/00; 10.06.1996 г.

9. Грачев Д.В. Иммунобиологические свойства вируса оспы коз, выделенного в Республике Таджикистан // Автореф. дисс. на соискание уч. степ. канд. вет. наук. — Покров, 2006. — 26 с. (прототип).

источник