Цитопатическое действие вируса оспы

Культивирование вирусов в культурах тканей. Характеристики тканевых культур. Цитопатическое действие вирусов.

Для культивирования вирусов используют ряд методов. Это культивирование в организме экспериментальных животных, раз­вивающихся куриных вибрионах и культурах тканей (чаще — эмбриональные ткани или опухолевые клетки). Для выращива­ния клеток тканевых культур используют многокомпонентные питательные среды (среда 199, среда Игла и др.). Они содержат индикатор измерения рН среды и антибиотики для подавления возможного бактериального загрязнения.

Культуры тканей могут быть переживающими, в которых жиз­неспособность клеток удается сохранить лишь временно, и растущими, в которых клетки не только сохраняют жизнедея­тельность, но и активно делятся.

В роллерных культурах клетки ткани фиксированы на плотной основе (стекло) — чаще в один слой (однослойные), а в суспензированных —взвешены в жидкой среде. По количеству пассажей, выдерживаемых растущей культурой тканей, среди них различают:

• первичные (первично-трипсинизированные) культуры тканей, которые выдерживают не более 5—10 пассажей;
• полуперевиваемые культуры тканей, которые поддерживаются не более чем в 100 генерациях;
• перевиваемые культуры тканей, которые поддерживаются в те­чение неопределенно длительного срока в многочисленных ге­нерациях.

Чаще всего используются однослойные первично-перевиваемые и перевиваемые тканевые культуры.

О размножении вирусов в культуре ткани можно судить по ци-топатическому действию (ЦПД):

• деструкции клеток;
• изменению их морфологии;
• формированию многоядерных симпластов или синтиция в ре­зультате слияния клеток.
• в клетках культуры ткани при размножении вирусов могут об­разовываться включения — структуры, не свойственные нор­мальным клеткам.

Включения выявляются в окрашенных по Романовскому-Гимзе мазках из зараженных клеток. Они бывают эозинофильные и базофильные.

Характерные ядерные включения формируются в клетках, за­раженных вирусами герпеса (тельца Каудри), цитомегалии и полиомы, аденовирусами, а цитоплазматические включения — вирусами оспы (тельца Гварниери и Пашена), бешенства (тель­ца Бабеша-Негри) и др.

О размножении вирусов в культуре ткани также можно судить по методу «бляшек» (негативных колоний). При культивирова­нии вирусов в клеточном монослое под агаровым покрытием на месте пораженных клеток образуются зоны деструкции моно-сом — так называемые стерильные пятна, или бляшки. Это дает возможность не только определить число вирионов в 1 мл сре­ды (считается, что одна бляшка является потомством одного вириона), но и дифференцировать вирусы между собой по фе­номену бляшкообразования.

Следующим методом, позволяющим судить о размножении вирусов (только гемагглютинирующих) в культуре ткани, мож­но считать реакцию гемадсорбции. При культивировании виру­сов, обладающих гемагглютжирующей активностью, может происходить избыточный синтез гемагглютининов. Эти моле­кулы экспрессируются на поверхности клеток культуры ткани, и клетки культуры ткани приобретают способность адсорбиро­вать на себе эритроциты — феномен гемадсорбции. Молекулы гемагглютинина накапливаются и в среде культивирования, это приводит к тому, что культуральная жидкость (в ней нака­пливаются новые вирионы) приобретет способность вызывать гемагглютинацию.

Наиболее распространенным методом оценки размножения вирусов в культуре ткани является метод «цветной пробы». При размножении в питательной среде с индикатором незараженных

клеток культуры ткани вследствие образования кислых продук­тов метаболизма она изменяет свой цвет. При репродукции вируса нормальный метаболизм клеток нарушается, кислые продукты не образуются, среда сохраняет исходный цвет.

источник

Вирус вызывает особо опасное высококонтагиозное инфекционное заболевание, характеризующееся общим поражением организма и обильной сыпью на коже и слизистых оболочках. В прошлом отмечались эпидемии и пандемии заболевания, сопровождающиеся высокой летальностью. В 1892 г. Г.Гварниери, исследуя под микроскопом срезы роговицы зараженного кролика, обнаружил специфические включения, впоследствии названные тельцами Гварниери, представляющие собой скопления вирусов натуральной оспы. Возбудитель оспы впервые обнаружен в световом микроскопе Е. Пашеном (1906).

Таксономия. Вирус натуральной оспы – ДНК-содержащий; относится к семейству Poxviridae (от англ, рох – язва), роду Orthopoxvirus.

Морфология, химический состав, антигенная структура. Вирус натуральной оспы является самым крупным вирусом, при электронной микроскопии имеет кирпичеобразную форму с закругленными углами размером 250-400 нм. Вирион состоит из сердцевины, имеющей форму гантели, двух боковых тел, расположенных по обе стороны от сердцевины, трехслойной наружной оболочки. Вирус содержит линейную двунитчатую ДНК, более 30 структурных белков, включая ферменты, а также липиды и углеводы.В составе вируса обнаружено несколько антигенов: нуклео-протеидный, растворимые и гемагглютинин. Вирус натуральной оспы имеет общие антигены с вирусом осповакцины (коровьейоспы).

Культивирование. Вирусы хорошо размножаются в куриных эмбрионах, образуя белые плотные бляшки на хорионаллантоисной оболочке. Репродукция вируса в культуре клеток сопровождается цитопатическим эффектом и образованием характерных цитоплазматических включений (телец Гварниери), имеющих диагностическое значение.

Резистентность. Вирусы оспы обладают довольно высокой устойчивостью к окружающей среде. На различных предметах при комнатной температуре сохраняют инфекционную активность в течение нескольких недель и месяцев; не чувствительны к эфиру и другим жирорастворителям. При температуре 100ºС вирусы погибают моментально, при 60ºС – в течение 15 мин, при обработке дезинфицирующими средствами (фенол, хлорамин) – в течение нескольких часов. Длительно сохраняются в 50 % растворе глицерина, в лиофилизированном состоянии и при низких температурах.

Восприимчивость животных. Заболевание, сходное по клиническим проявлениям с болезнью человека, можно воспроизвести только у обезьян. Для большинства лабораторных животных вирус оспы малопатогенен.

Эпидемиология. Натуральная оспа известна с глубокой древности. В XVII-XVIII вв. в Европе оспой ежегодно болело около 10 млн человек, из них умирало около 1,5 млн. Оспа являлась также главной причиной слепоты. На основании высокой контагиозности, тяжести течения и значительной летальности натуральная оспа относится к особо опасным карантинным инфекциям.

Источником инфекции является больной человек, который заразен в течение всего периода болезни. Вирус передается воздушно-капельным и воздушно-пылевым путями. Возможен контактно-бытовой механизм передачи – через поврежденные кожные покровы.В начале 20-х годов текущего столетия в результате применения оспенной вакцины удалось ликвидировать натуральную оспу в Европе, Северной Америке, а также в СССР (1936). Отечественные ученые В. М. Жданов, М. А. Морозов и др. обосновали возможность осуществления глобальной ликвидации оспы. В 1958 г. по предложению СССР Всемирная организация здравоохранения приняла резолюцию и разработала программу по ликвидации оспы во всем мире, которая была успешно выполнена благодаря глобальной противооспенной вакцинации людей. В 1977 г. в Сомали был зарегистрирован последний случай оспы в мире. Таким образом, оспа исчезла как нозологическая форма.

Патогенез и клиническая картина. Вирус оспы проникает в организм через слизистую оболочку дыхательных путей и реже через поврежденную кожу. Размножившись в регионарных лимфатических узлах, вирусы попадают в кровь, обусловливая кратковременную первичную вирусемию. Дальнейшее размножение вирусов происходит в лимфоидной ткани (селезенка, лимфатические узлы), сопровождается повторным массивным выходом вирусов в кровь и поражением различных систем организма, а также эпидермиса кожи, так как вирус обладает выраженными дерматотропными свойствами. Инкубационный период составляет 8-18 дней. Заболевание начинается остро, характеризуется высокой температурой тела, головной и поясничной болью, появлением сыпи. Для высыпаний характерна последовательность превращения из макулы (пятна) в папулу (узелок), затем в везикулу (пузырек) и пустулу (гнойничок), которые подсыхают с образованием корок. После отпадения корок на коже остаются рубцы (рябины). По тяжести течения различают тяжелую форму («черная» и сливная оспа) со 100% летальностью, среднюю с летальностью 20-40% и легкую с летальностью 1-2%. К числу легких форм натуральной оспы относится вариолоид – оспы у привитых. Вариолоид характеризуется отсутствием лихорадки, малым количеством оспенных элементов, отсутствием пустул или сыпи вообще.

Иммунитет. У переболевших людей формируется стойкий пожизненный иммунитет, обусловленный выработкой антител, интерферона, а также клеточными факторами иммунитета. Прочный иммунитет возникает также в результате вакцинации.

Лабораторная диагностика. Работа с вирусом натуральной оспы проводится в строго режимных условиях по правилам, предусмотренным для особо опасных инфекций. Материалом для исследования служит содержимое элементов сыпи на коже и слизистых оболочках, отделяемое носоглотки, кровь, в летальных случаях – кусочки пораженной кожи, легкого, селезенки, кровь. Экспресс-диагностика натуральной оспы заключается в обнаружении: а) вирусных частиц под электронным микроскопом; б) телец Гварниери в пораженных клетках; в) вирусного антигена с помощью РИФ, РСК, РПГА, ИФА и других специфических реакций. Выделение вируса осуществляют в куриных эмбрионах или клеточных культурах. Идентификацию вируса, выделенного из куриного эмбриона, проводят с помощью РН (на куриных эмбрионах), РСК или РТГА. Вирус, выделенный на культуре клеток, обладает гемадсорбирующей активностью по отношению к эритроцитам кур, поэтому для его идентификации используют реакцию торможения гемадсорбции и РИФ. Серологическую диагностику осуществляют с помощью РТГА, РСК, РН в куриных эмбрионах и на культурах клеток.

Специфическая профилактика и лечение. Живые оспенные вакцины готовят накожным заражением телят или куриных эмбрионов вирусом вакцины (осповакцины). Повсеместная вакцинация населения привела к ликвидации натуральной оспы на земном шаре и отмене с 1980 г. обязательного оспопрививания. Поэтому оспенные вакцины необходимо использовать только по эпидемическим показаниям с целью экстренной массовой профилактики. Методы введения вакцин – накожно или через рот (таб-летированная форма). После вакцинации формируется прочный иммунитет.

Для лечения натуральной оспы, помимо симптоматической терапии, применяли химиотерапевтический препарат – метисазон.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

В большинстве случаев перед обнаружением вируса в живой системе его следует освободить от компонентов клеток хозяина. Для этого предусмотрены следующие процедуры:

1) для разрушения клеток в материале используют трехкратное замораживание с последующим оттаиванием или растирание материала в гомогенизаторе со стерильным песком или стеклянными бусами;

2) для очистки от клеточного детрита и посторонних примесей полученный таким образом материал подвергают центрифугированию с последующим исследованием надосадочной жидкости или пропускают через бактериальные фильтры. При этом вирус ввиду малых размеров не осаждается при центрифугировании и не задерживается бактериальными фильтрами, оставаясь в жидкости;

3) полученный материал обрабатывают антибиотиками для деконтаминации и предотвращения бактериального загрязнения.

Полученный таким образом материал принято называть вируссодержащим материалом.

Для выявления вирусов в зараженном объекте в настоящее время применяют различные способы (рисунок 1).

Выявление по цитопатическому действию (ЦПД)

Обнаружение ЦПД вирусов в культуре клеток микроскопическим способом.ЦПД представляет собой дегенеративные изменения в клетках, которые появляются в результате репродукции в них вирусов. Одни вирусы проявляют ЦПД в первые дни после заражения культур клеток (вирус оспы, полиомиелита и др.), другие – значительно позже, иногда спустя 2 недели после заражения (аденовирусы, вирусы парагриппа и др.). Характер ЦПД зависит в основном от вида вируса (рисунок 2).

Рисунок 1 – Методы выявления вирусов в зараженном объекте

А – незараженный монослой; Б – зараженный монослой: видно разрушение монослоя и признаки клеточной дегенерации (а – сморщивание и образование звездчатых клеток; b – округление клеток; с – вздутие клеток; d – лизис и образование гранулярного детрита).

Рисунок 2 – Цитопатическое действие вируса полиомиелита на культуре клеток почки обезьяны в неокрашенных препаратах

Различают полную и частичную дегенерацию клеток монослоя. При полной дегенерации, вызываемой, например, вирусами полиомиелита, Коксаки и ECHO, клетки монослоя подвергаются значительным изменениям, большее их количество слущивается со стекла. Остающиеся единичные клетки сморщены (пикноз ядра и цитоплазмы), для них характерно двойное лучепреломление – сильное свечение при микроскопии. Частичная дегенерация культур клеток имеет несколько разновидностей:

а) по типу гроздеобразования – клетки округляются, увеличиваются, частично сливаются между собой с образованием особых гроздевидных скоплений (характерна для аденовирусов);

б) по типу очаговой деструкции – на фоне в целом сохранившегося монослоя появляются очаги пораженных клеток – микробляшки (характерна для некоторых штаммов вирусов оспы, гриппа);

в) по типу симпластообразования – под действием вирусов клетки сливаются между собой с образованием гигантских многоядерных клеток – симпластов, синцитиев (характерна для вирусов кори, паротита, парагриппа, респираторно-синцитиального, герпеса, иммунодефицита человека).

Пролиферативный тип изменений характерен для некоторых онкогенных вирусов, трансформирующих клетки в злокачественные, что проявляется в приобретении ими способности к неограниченному делению.

Если в инфицированных культурах клеток ЦПД отсутствует или слабо выражено, проводят «слепые пассажи», т.е. заражают культуральной жидкостью новые культуры клеток.

Выявление по цветной пробе. Принцип данного теста заключается в следующем. В результате жизнедеятельности клеток в питательной среде накапливаются кислые продукты. В результате цвет входящего в состав среды индикатора (фенолового красного) становится оранжевым. При заражении культуры клеток такими цитопатогенными вирусами, как энтеровирусы или реовирусы, метаболизм клеток подавляется, рН среды и ее цвет не изменяются (она остается красной).

Выявление по образованию бляшек (РБО).Репродуцируясь в культурах клеток, вирусы вызывают разного рода ЦПД, выражающееся в округлении, сморщивании, уменьшении или, наоборот, увеличении размеров клеток, слиянии их и образовании симпластов, деструкции цитоплазмы и ядра. Наконец, в монослое клеток, зараженных вирусами в результате разрушения ими отдельных участков клеточного пласта, могут появляться «стерильные пятна», или бляшки, представляющие собой клон вирусной частицы, что дает возможность не только изолировать вирус, но и определить его титр. Для этого из флакона с монослойной культурой клеток удаляют питательную среду и заражают ее вирусом. После адсорбции вируса на клетках через промежуток времени от 30 до 60 минут культуру клеток быстро покрывают 3 % расплавленным агаром, содержащим лошадиную сыворотку, солевые добавки и индикатор нейтральный красный. В монослое, где происходит нормальный рост клеток, среда подкисляется, и индикатор окрашивает его в розовый цвет. Пораженные вирусом клетки прекращают метаболизм, рН не меняется, и в этих местах четко обозначаются островки неокрашенной среды в виде беловатых бляшек различных размеров и конфигураций.

Бляшки вирусов представляют собой очаги разрушенных вирусом клеток монослоя под агаровым покрытием. Вирусные бляшки подсчитывают для количественного анализа инфекционной активности вирусов.

Для получения бляшек разные разведения вирусной суспензии наносят на однослойные культуры ткани в плоских флаконах или чашках Петри и покрывают их слоем агарового покрытия. При этом репродукция вируса и ЦПД ограничиваются только первоначально инфицированными и соседними с ними клетками. Очаги клеточной дегенерации (бляшки) выявляют путем окрашивания культуры нейтральным красным, который либо включают в состав агарового покрытия, либо добавляют непосредственно перед учетом результатов. Бляшки состоят из погибших клеток, не окрашиваются нейтральным красным и поэтому выглядят в виде светлых пятен на фоне розово-красного монослоя.

Известны и другие способы выявления вирусных бляшек в культурах клеток. Так, например, используется определение бляшек под бентонитовым покрытием. Мелкодисперсный очищенный бентонит добавляют к жидкой питательной среде, и этой смесью заливают инфицированный монослой клеток. В результате адсорбции частиц бентонита на поверхности клеток монослой приобретает молочный цвет. В месте размножения вируса, где клетки частично или полностью слущены со стекла, бентонитовое покрытие нарушено (бляшки).

Для выявления вирусных бляшек под бентонитовым питательным покрытием применяют многослойные культуры перевиваемых клеток человека или животных, чувствительные к исследуемому вирусу, пригодны 2-суточные негустые монослои клеток. Готовят 10-кратные разведения из исследуемого материала, каждым разведением инфицируют не менее двух матрацев (колб Эрленмейера или пенициллиновых флаконов) с культурой клеток. После адсорбции вируса (от 30 до 40 мин) монослои от 3 до 4 раз отмывают стерильным ИХН и заливают бентонитовым питательным покрытием: бидистиллированная вода – 415 мл, 6 %-й гель бентонита – 5 мл, раствор Эрла (десятикратный концентрат) – 50 мл, нативная бычья сыворотка – 15 мл, 7,5 %-й раствор гидрокарбоната натрия – 15 мл, пенициллин – 200 ЕД/мл, стрептомицин или линкомицин – 100 ЕД/мл. Монослой зараженных клеток в колбах Эрленмейера емкостью 50 мл заливают от 20 мл до 30 мл бентонитового покрытия, а монослой клеток на дне пенициллинового флакона – от 5 мл до 6 мл.

Гель бентонита получают из сухого минерала. Чтобы улучшить сорбционные свойства бентонита, его насыщают катионами натрия. Затем его стерилизуют 40 мин при 111 °С. Сорбционные свойства геля бентонита не изменяются в процессе хранения при комнатной температуре в течение ряда лет.

Время бляшкообразования под бентонитовым покрытием для различных вирусов неодинаково. Результаты образования бляшек для энтеровирусов, например, учитывают через промежуток времени от 36 до 48 ч. Культуральные сосуды переворачивают монослоем вверх, смывая средой дегенерировавшие клетки. Бляшки, образуемые различными типами энтеровирусов, отличаются по величине, интенсивности развития и характеру краев. Поскольку одна вирусная инфекционная частица (вирион) образует одну бляшку, метод бляшкообразования позволяет точно определить количество инфекционных единиц в материале, а также измерить нейтрализующую активность вирусных антител.

Выявление по реакции гемадсорбции (РГАд)

Реакцию гемадсорбции (РГАд) применяют для индикации в зараженных культурах клеток вируса, обладающего гемагглютинирующей активностью. Сущность реакции заключается в том, что на поверхности клеток, зараженных вирусами, адсорбируются эритроциты, чувствительные к гемагглютинирующему действию вирусов. Так, например, на клетках, зараженных вирусом натуральной оспы, адсорбируются эритроциты кур; вирусом кори – эритроциты обезьян; аденовирусами – обезьян и крыс и др. (рисунок 3).

1 – островковый тип адсорбции эритроцитов на зараженных клетках; 2– незаряженные клетки.

Рисунок 3 –Реакция гемадсорбции

Методика РГадс следующая. Из пробирок с зараженными и незараженными культурами клеток удаляют питательную среду и вносят по 0,2 мл 0,4 % взвеси в изотоническом растворе хлорида натрия трижды отмытых эритроцитов. Пробирки оставляют в наклонном положении на промежуток времени от 20 до 30 мин при температуре 37 °С, 22 °С или 4 °С. Затем пробирки осторожно встряхивают и исследуют под малым увеличением микроскопа. На клетках монослоя, зараженных вирусом, наблюдается диффузная или локальная адсорбция эритроцитов в виде скоплений, гроздей и розеток. При отрицательном результате на монослое адсорбируются лишь единичные эритроциты. Гемадсорбция предотвращается обработкой зараженного вирусами монослоя специфической сывороткой.

Эта реакция позволяет выявить вирусы до развития ЦПД благодаря адсорбции эритроцитов на поверхности клеток, инфицированных гемадсорбирующими вирусами. Эти сложные вирусы имеют в составе супер-капсида специфические гликопротеиды – гемагглютинины (например, орто- и парамиксовирусы). Для воспроизведения РГАд в культуру клеток (контрольную и зараженную вирусом) после определенного для каждого вируса срока инкубации добавляют 0,2 мл 0,5 %-й взвеси эритроцитов так, чтобы был покрыт монослой и оставляют ее на время от 15 до 20 мин при 4 °С, 20 °С или 37 °С (в зависимости от свойств вируса). Затем пробирки встряхивают для удаления неадсорбированных эритроцитов и учитывают под малым увеличением микроскопа скопление их на отдельных клетках или на всем монослое. На незараженных клетках эритроцитов не должно быть. Следует отметить, что не все вирусы, агглютинирующие эритроциты in vitro, способны вызывать гемадсорбцию в культуре клеток. Гемадсорбция наблюдается лишь в том случае, если в процессе взаимодействия вируса с клеткой вирусный гемагглютинин встраивается в структуру наружной клеточной мембраны и тем самым изменяет ее свойства.

Дата добавления: 2015-04-25 ; Просмотров: 4269 ; Нарушение авторских прав? ;

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

источник

Методы культивирования. Внутриклеточные включения при вирусных инфекциях. Цитопатическое действие вирусов.

Для культивирования вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных. Эти же методы используют и для культивирования риккетсий и хламидий — облигатных внутриклеточных бактерий, которые не растут на искусственных питательных средах. Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Их подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые. Количество вирусных частиц определяют методом титрования по цитопатическому действию (ЦПД) в культуре клеток. Для этого клетки культуры заражают десятикратным разведением вируса. Характер ЦПД вирусов используют как для их обнаружения (индикации), так и для определения их видовой принадлежности. Один из методов индикации вирусов основан на способности поверхности клеток, в которых они репродуцируются, адсорбировать эритроциты — реакция гемадсорбции. Для ее постановки в культуру клеток, зараженных вирусами, добавляют взвесь эритроцитов и после некоторого времени контакта клетки промывают изотонич. р-ром NaCl. На поверхности пораженных вирусами клеток остаются прилипшие эритроциты. Другой метод — реакция гемагглютинации (РГ). Применяется для обнаружения вирусов в культуральной жидкости культуры клеток, либо амниотической жидкости куриного эмбриона. Культивирование вирусов в куриных эмбрионах: используют эмбрионы в возрасте от 8 до 14 дней в зависимости от вида вируса, способа заражения и задач исследования. Вирусы гриппа культивируются в 9-10, осповакцины — в 12, паротита — в 7-дневных куриных эмбрионах. Более точным количественным методом учета отдельных вирусных частиц является метод бляшек. Его также используют для дифференциации, селекции вирусов, а также для определения их концентрации в исследуемом материале. Некоторые вирусы можно обнаружить и идентифицировать по включениям, которые они образуют в ядре или цитоплазме зараженных клеток. Выбор экспериментальных животныхопределяется целью работы и видовой чувствительностью к изучаемому вирусу. Для заражения используют обезьян, кроликов, морских свинок, хомячков, белых крыс и мышей. Лабораторных животных заражают различными способами в зависимости от тропизма вируса к определенным тканям. Так, например, для культивирования нейротропных вирусов заражение производят преимущественно в мозг (вирусы бешенства, клещевого энцефалита и др.), культивирование респираторных вирусов осуществляется при интраназальном инфицировании животных (вирусы гриппа), дерматотропных (вирус оспы) — путем накожного и внутрикожного заражения. Формирование включений: включения наиболее часто формируются при вирусных и хламидиозной инфекциях. Они могут состоять или из собранных вирусных частиц, или из остатков вирусных нуклеиновых кислот. Включения могут образовываться в ядре и цитоплазме клеток. Их присутствие может помогать в установлении правильного диагноза при гистологическом исследовании. Цитомегаловирус— увеличение клеток (цитомегалия).Эозинофильные большие внутриядерные включения, окруженные светлым ободком. Вирусы герпеса— большие эозинофильные внутриядерные включения, окруженные светлом ободком. Ядра в виде матового стекла. Гигантские клетки с 3-8 ядрами. Вирус натуральной оспы -большие, зернистые, округлые эозинофильные цитоплазматические включения (тельца Гарньери). Вирус бешенства-округлые, 2-10 мкм в диаметре, эозинофильные цитоплазматические включения (тельца Негри). Вирус гепатита В-цитоплазма в виде матового стекла. Вирус кори— многоядерные (10-1000 ядер) гигантские клетки Вартина-Финкельдея. Маленькие эозинофильные внутриядерные включения. Вирус контагиозного моллюска-гомогенные эозинофильные цитоплазматические включения, заполняющие клетку и оттесняющие ядро.

Репродукция большинства вирусов сопровождается подавлением синтеза клеточных ДНК, РНК и белков, чтобы предотвратить или ограничить выработку интерферона и обеспечить собственную репродукцию прежде, чем в организме разовьется полноценный иммунный ответ. Чаще всего вирусы специфически угнетают синтез клеточных белков, нарушая образование инициаторного комплекса трансляции, поскольку для трансляции вирусных мРНК этот комплекс обычно не нужен. Например, протеаза вируса полиомиелита расщепляет компонент инициаторного комплекса трансляции. У вируса простого герпеса один из белков матрикса вызывает быстрое разрушение клеточных мРНК.

101.Взаимодействие вируса с клеткой. Формы вирусной инфекции.

Взаимодействие идет в единой биологической системе на генетическом уровне.Существует четыре типа взаимодействия:1) продуктивная вирусная инфекция (взаимодействие, в результате которого происходит репродукция вируса, а клетки погибают);2) абортивная вирусная инфекция (взаимодействие, при котором репродукции вируса не происходит, а клетка восстанавливает нарушенную функцию);3) латентная вирусная инфекция (идет репродукция вируса, а клетка сохраняет свою функциональную активность);4) вирус-индуцированная трансформация (взаимодействие, при котором клетка, инфицированная вирусом, приобретает новые, ранее не присущие ей свойства).После адсорбции вирионы проникают внутрь путем эндоцитоза (виропексиса) или в результате слияния вирусной и клеточной мембран. Образующиеся вакуоли, содержащие целые вирионы или их внутренние компоненты, попадают в лизосомы, в которых осуществляется депротеинизация, т. е. «раздевание» вируса, в результате чего вирусные белки разрушаются. Освобожденные от белков нуклеиновые кислоты вирусов проникают по клеточным каналам в ядро клетки или остаются в цитоплазме.Нуклеиновые кислоты вирусов реализуют генетическую программу по созданию вирусного потомства и определяют наследственные свойства вирусов. С помощью специальных ферментов (полимераз) снимаются копии с родительской нуклеиновой кислоты (происходит репликация), а также синтезируются информационные РНК, которые соединяются с рибосомами и осуществляют синтез дочерних вирусных белков (трансляцию).После того как в зараженной клетке накопится достаточное количество компонентов вируса, начинается сборка вирионов потомства. Процесс этот происходит обычно вблизи клеточных мембран, которые иногда принимают в нем непосредственное участие. В составе вновь образованных вирионов часто обнаруживаются вещества, характерные для клетки, в которой размножается вирус. В таких случаях заключительный этап формирования вирионов представляет собой обволакивание их слоем клеточной мембраны.Последним этапом взаимодействия вирусов с клетками является выход или освобождение из клетки дочерних вирусных частиц. Простые вирусы, лишенные суперкапсида, вызывают деструкцию клетки и попадают в межклеточное пространство. Другие вирусы, имеющие липопротеидную оболочку, выходят из клетки путем почкования. При этом клетка длительное время сохраняет жизнеспособность. В отдельных случаях вирусы накапливаются в цитоплазме или ядре зараженных клеток, образуя кристаллоподобные скопления — тельца включений. Вирусные инфекции подразделяют на антропонозные, присущие только человеку (например, полиомиелит), и зоонозные, являющиеся болезнями животных, к которым восприимчив также человек (например, бешенство). Выделяют природно-очаговые Вир.инф., наблюдающиеся только в их природных очагах, существование которых обусловлено поддержанием вируса в природе независимо от человека. Возбудители большинства этих болезней передаются человеку и животным кровососущими насекомыми — клещами, комарами, москитами. Инфицируя человека, вирусы могут поражать различные органы и системы, и по этому признаку их удобно разделять на кишечные (например, ротавирусы), респираторные (например, вирус гриппа), поражающие ц.н.с. (например, вирусы энцефалитов), внутренние органы (например, вирусы гепатитов), кожу и слизистые оболочки (например, вирус ветряной оспы), сосудистую систему (например, вирусы геморрагических лихорадок), иммунную систему (например, вирус иммунного дефицита человека, вызывающий ВИЧ-инфекцию.

102.Особенности противовирусного иммунитета. Интерфероны, мех-мы дей-ия.

Особенности противовирусного иммунитета:1)Противовирусный иммунитет начинается со стадии презентации вирусного антигена Т-хелперами.2)Иммунитет направлен на нейтрализацию и удаление из организма вируса, его антигенов и зараженных вирусом клеток. Особенностью противовирусного иммунитета является и то, что фагоцитарная реакция в защите от вирусной инфекции не играет такой роли, как при защите макроорганизма от бактериальных инфекций. Неспособность фагоцитовсправиться с вирусамиобъясняется прежде всего биологическими особенностями последних. Интерфероны— общее название, под которым в настоящее время объединяют ряд белков со сходными свойствами, выделяемые клетками организма в ответ на вторжение вируса. Благодаря интерферонам клетки становятся невосприимчивыми по отношению к вирусу. «Определяемый в качестве интерферона фактор должен быть белковой природы, обладать антивирусной активностью по отношению к разным вирусам, по крайней мере, в гомологичных клетках, опосредованной клеточными метаболическими процессами, включающими синтез РНК и белка» Интерферон– низкомолекулярный белок, обладающий выраженными антивирусными, а также высокими иммуномодулирующими и другими биологическими свойствами, в том числе и противоопухолевой активностью. Механизм действия интерферона заключается в подавлении процесса транскрипции вирусной РНК и синтеза вирусного белка. Интерферон не действует на вирион, он может лишь подавлять репродукцию вируса в клетке. Этим объясняется наибольший эффект применения интерферона с профилактической целью. Интерферон — единственное универсальное средство, действующее против многих вирусов; кроме того, оно не вызывает никаких побочных явлений. Все это открывает широкие перспективы для практического применения интерферона, особенно с профилактической целью или для лечения в самом начале заболевания

103. Вирусы гриппа, парагриппа. Св-ва. Изменчивость вируса, ее эпидемическое значение, особенности иммунитета. Принципы для специфического лечения и профилактики.Вир.гриппа-РНК сод.вирус,относится к сем.Ортомиксовируса. Им-т округлую форму. В сост. оболочки вир. Гриппавход.геммаглютинины и нейраминидаза. Вир. Гриппа подразд. На3 типа:АВС. Они сод-т 2 антигена:S антиген связан с нуклеокапсидом-общ.для всех типов и V антиген-геммаглютенин, определяющий типы и штаммоспецифичность. Вирус гриппа, вызываетаглютинацию эритроцитов у более 20 видов животных. Вирус гриппа обладает общими антигенами с изоантигенами эритроцитов человека. Это обуславл. Неспособность нек-х людей продуцировать против него антитела. Вир гриппа хор.размн.в амниотической и аллантоической оболочках куриных эмбрионов. Вир.В активно репродуцир.в клудьтурах почек обезьян, при комнt°иннактивир-яс ч/з неск-ко часов, нагревание до 65° погибает в течении 5-10 мин. Чуствителен к высушиванию, бычтро разрушается в кислой и щелочной среде по дей-м УФО-луч, эфиров, хлораминов. Вир.гриппа передается возд.кап. путем при чихании и кашле, разговоре.Он вызыв.ч/з опред эпидемию и эндемии. Проникнув в орг.восприимчив.человека ч/з носоглотку, вир.гриппа внедряется в кл.поверхн.эпителия,сл.обл.верхн.дых. путей. Важн. Ролдь в развитии заб-ия пренадл.интоксикации,к-ая развив. в рез-те всасыв.в кровь вируса и его токсичн.белков. Постинфекционный иммунететобусл.антителами АТ к гемагглютинину и нейраминидазе,к-ые быстр.образ.в выс.титрах больных гриппом. Он носит типа и штаммоспецифический хар-р и обеспеч.невосприимч.людей к вирусу. Если тип А-в теч 1-2 лет, В-3-5 лет, С-пожизненно.Профилактика:Иммунизация: д/я акт.иммунизации примен.живые и инактив-ые вакцины, при вакцинации иннактивир-ой вакц.эффект. 60-70%. Для пассивной профилактики примен.противогрипозные Igчел-ка(из крови доноров иммунизир.гриппозн.вакциной). Для профилактики и купирования симптомов применяют производные аммантадина(ремантадин). Симпт.профил-ка-интерфероон.Лечение: Иммуно-стимулирующие препараты(витамина С); Противовирусные препараты(Существуют два класса препаратов: ингибиторы нейраминидазы и ингибиторы M2 (производные адамантана); Симптоматическое лечение: для облегчения носового дыхания действенны нафтизин, санорин, галазолин.

Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций.

источник

E. человеческий вирус герпеса 6 типа

266. К гамма-герпесвирусам принадлежит

B. Epstein Barr virus

C. Herpes simplex virus type 1

D. Herpes simplex virus type 2

267. Вирус Эпштейна-Барр относится к семейству

C. Herpesviridae

268. Цитомегаловирус относится к семейству

B. Herpesviridae

269. Вирус Эпштейна-Барр относится к роду

B. Lymphocryptovirus

270. Основные клетки, поражаемые вирусом Эпштейна-Барр:

B. В-лимфоциты

271. Цитопатическое действие вируса простого герпеса связано с образованием в поражаемых клетках телец

272. Цитопатическое действие цитомегаловируса связано с образованием в поражаемых клетках телец

B. в виде «совиных глаз»

273. Вирус ветряной оспы относится к семейству

B. Herpesviridae

274. Ветряная оспа — распространенное детское инфекционное заболевание, возбудителем которого является

E. Varicella-zoster virus

275. У студента из Африки выявлена лимфома Беркитта. Какой из перечисленных герпесвирусов является наиболее вероятным этиологическим фактором заболевания

A. вирус опоясывающего лишая

B. вирус простого герпеса 1 серотип

C. вирус простого герпеса 2 серотип

E. вирус Эпштейна-Барр

276. Врач заподозрил у больного инфекционный мононуклеоз. Какой вирус вызывает это заболевание

C. вирус Эпштейна-Барра

277. Выберите герпесвирус, который является возбудителем саркомы Капоши

A. вирус простого герпеса типа 1

B. вирус ветряной оспы – опоясывающего герпеса

C. вирус простого герпеса типа 2

D. герпесвирус, тип 8

278. Выберите семейство, к которому относится возбудитель ВИЧ-инфекции

E. Retroviridae

279. Вирус иммунодефицита человека относится к роду

B. Lentivirus

280. Выберите клетки, которые избирательно поражает вирус иммунодефицита человека

A. клетки поджелудочной железы

B. полиморфно-ядерные лейкоциты

E. Т-лимфоциты-хелперы

281. Выберите основную мишень в организме человека для ВИЧ:

A. пищеварительная система

B. сердечно-сосудистая система

C. иммунная система

282. Основные факторы передачи при ВИЧ-инфекции

B. воздух, предметы обихода

C. плазма и сыворотка крови

283. Выберите основной материал для микробиологической диагностики при ВИЧ-инфекции

E. сыворотка крови

284. Вирус иммунодефицита человека принадлежит к семейству Retroviridae. Основным признаком, характеризующим представителей данного семейства, является

A. внешняя оболочка содержит HBs-Ag

B. геном представлен двух цепочечной ДНК

C. геном представлен минус-РНК

E. наличие фермента обратной транскриптазы

A. контроль размножения вируса

B. поверхностные гликопротеиды вируса(gp 41, gp 120 )

C. синтез капсидных белков (р17,24)

E. синтез обратной транскриптазы(р51-56)

A. контроль размножения вируса

B. поверхностные гликопротеиды вируса(gp 41, gp 120 )

C. синтез капсидных белков (р17,24)

D. синтез обратной транскриптазы(р51-56), синтез интегразы(р32)

E. упаковку вирусных РНК к капсид

287. Выберите семейство, к которому относится РНК-геномный вирус, обладающий онкогенными свойствами

D. Retroviridae

288. Выберите путь передачи вируса бешенства человеку

E. укус и ослюнение животным

289. Цитопатическое действие вируса бешенства связано с образованием в поражаемых клетках телец

E. Бабеша-Негри

290. Вирус натуральной оспы относится к семейству

C. Poxviridae

291. Цитопатическое действие вируса натуральной оспы связано с образованием в поражаемых клетках телец

C. Гварниери

292. Какая вирусная инфекция ликвидирована в мире благодаря усилиям медицины

D. натуральная оспа

293. Источник инфекции при натуральной оспе

B. кровососущие членистоногие

C. больной человек

294. Основной путь передачи инфекции при натуральной оспе

B. воздушно-капельный

295. В Кзыл-Ординской области зарегистрировано несколько случаев геморрагической лихорадки Крым-Конго. Какой вирус вызывает данное заболевание

C. Nairovirus

296. Выберите группу микроорганизмов, к которой принадлежит возбудитель Конго-крымской геморрагической лихорадки

A. арбовирусы

297. Эпидемиологи изучают арбовирусные инфекции в природном очаге. Выберите путь передачи арбовирусов

E. трансмиссивный

298. Оппортунистические инфекции – это инфекции, вызываемые условно-патогенными микроорганизмами у людей с

B. иммунодефицитами

C. инфекции, вызываемые патогенными микроорганизмами

D. рецидивирующие инфекции

299. Выберите из перечисленных инфекцию, которая относится к оппортунистическим инфекциям

300. Внутрибольничные инфекции — это

A. заболевания, которые передаются от животных

B. заболевания, связанные с оказанием медицинской помощи

C. инфекционные заболевания , которые требуют особых методов диагностики

D. особоопасные инфекционные заболевания

E. эндемичные инфекционные заболевания

301. При исследовании мокроты 52-летнего пациента с воспалением легких и легочныхм абсцессом обнаружены аэробные, оксидаза положительные бактерии. Культуральные признаки: зеленоватые колонии с «фруктовым» запахом. Какой из перечисленных возбудителей наиболее вероятен

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте:

источник

48. Цитопатическое действие вирусов. Внутриклеточные включения при вирусных инфекциях. Симпласты. Синцитий

Цитопатическое действие вируса (ЦПД), имеет три основных типа:

— кругло- или мелкоклеточная дегенерация;

-образование многоядерных гигантских клеток (симпластов);

— развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих из нескольких слоев клеток;

Включения выявляются в окрашенных по Романовскому-Гимза мазках из зараженных клеток. Они бывают эозинофильные и базофильные.

По локализации в клетке различают:

Характерные ядерные включения формируются в клетках, зараженных вирусами герпеса (тельца Каудри), цитомегалии и полиомы, аденовирусами, а цитоплазматические включения — вирусами оспы (тельца Гварниери и Пашена), бешенства (тельца Бабеша-Негри) и другие. По форме, размерам, структуре, отношению к красителям вирусные включения строго специфичны. Например, тельца Гуарниери имеют округлую, серповидную или амебоидную форму диаметром 1-10 мкм, тельца Бабеша-Негри -овальные или эллипсоидные, достигающие 20 мкм, включения реовирусов серповидные, наполовину охватывающие клеточное ядро, коревые включения — в виде почкующихся мелких дрожжей.

Симпласты представлены гигантскими многоядерными клетками (например, клетки Цапка, выявляемые при герпетических поражениях), образующимися в результате модификации ЦПМ лизосомальными ферментами. Реже наблюдают образование синцитиев— больших конгломератов цитоплазмы, содержащих сотни и тысячи ядер связанных между собой клеток. Образование синцитиев обусловлено модификацией ЦПМ поверхностными гликопротеинами и характерно для парамиксовирусов.

Типы взаимодействия вируса с клеткой. Различают три типа взаимодействия вируса с клеткой: продуктивный, абортивный и ин-тегративный.

Продуктивный тип — завершается обра­зованием нового поколения вирионов и ги­белью (лизисом) зараженных клеток (цитоли-тическая форма). Некоторые вирусы выходят из клеток, не разрушая их (нецитолитическая форма).

Абортивный тип — не завершается обра­зованием новых вирионов, поскольку инфек­ционный процесс в клетке прерывается на одном из этапов.

Интегративный тип, или вирогения — характеризуется встраиванием (интеграцией) вирусной ДНК в виде провируса в хромосому клетки и их совместным сосуществованием (совместная репликация).

Репродукция вирусов осуществляется в несколько стадий, последовательно сменяющих друг друга: адсорбция вируса на клетке; проникновение вируса в клетку; «раздевание» вируса; биосинтез вирусных компонентов в клетке; формирование вирусов; выход вирусов из клетки.

Адсорбция. Взаимодействие вируса с клеткой начинается с процесса адсорбции, т. е. прикрепления вирусов к поверхности клетки. Это высокоспецифический процесс. Вирус адсорбирует­ся на определенных участках клеточной мембраны — так назы­ваемых рецепторах. Клеточные рецепторы могут иметь разную хи­мическую природу, представляя собой белки, углеводные ком­поненты белков и липидов, липиды. Число специфических ре­цепторов на поверхности одной клетки колеблется от 10 4 до 10 5 . Следовательно, на клетке могут адсорбироваться десятки и даже сотни вирусных частиц.

Проникновение в клетку. Существует два способа проникнове­ния вирусов животных в клетку: виропексис и слияние вирусной оболочки с клеточной мембраной. При виропексисе после адсорб­ции вирусов происходят инвагинация (впячивание) участка кле­точной мембраны и образование внутриклеточной вакуоли, ко­торая содержит вирусную частицу. Вакуоль с вирусом может транс­портироваться в любом направлении в разные участки цитоплаз­мы или ядро клетки. Процесс слияния осуществляется одним из поверхностных вирусных белков капсидной или суперкапсидной оболочки. По-видимому, оба механизма проникновения вируса в клетку не исключают, а дополняют друг друга.

«Раздевание». Процесс «раздевания» заключается в удалении защитных вирусных оболочек и освобождении внутреннего ком­понента вируса, способного вызвать инфекционный процесс. «Раздевание» вирусов происходит постепенно, в несколько этапов, в определенных участках цитоплазмы или ядра клетки, для чего клетка использует набор специальных ферментов. В случае проникновения вируса путем слияния вирусной оболочки с кле­точной мембраной процесс проникновения вируса в клетку со­четается с первым этапом его «раздевания». Конечными продук­тами «раздевания» являются сердцевина, нуклеокапсид или нук­леиновая кислота вируса.

Биосинтез компонентов вируса. Проникшая в клетку вирусная нуклеиновая кислота несет генетическую информацию, которая успешно конкурирует с генетической информацией клетки. Она дезорганизует работу клеточных систем, подавляет собственный метаболизм клетки и заставляет ее синтезировать новые вирус­ные белки и нуклеиновые кислоты, идущие на построение ви­русного потомства.

Реализация генетической информации вируса осуществляет­ся в соответствии с процес­сами транскрипции, трансляции и репликации.

Формирование (сборка) вирусов. Синтезированные вирусные нуклеиновые кислоты и белки обладают способностью специфи­чески «узнавать» друг друга и при достаточной их концентра­ции самопроизвольно соединяются в результате гидрофобных, со­левых и водородных связей.

Существуют следующие общие принципы сборки вирусов, имеющих разную структуру:

1. Формирование вирусов является многоступенчатым процессом с образованием промежуточных форм;

2. Сборка просто устроенных вирусов заключается во взаимодей­ствии молекул вирусных нуклеиновых кислот с капсидными белками и образовании нуклеокапсидов (например, вирусы полиомиелита). У сложно устроенных вирусов сначала форми­руются нуклеокапсиды, с которыми взаимодействуют белки суперкапсидных оболочек (например, вирусы гриппа);

3. Формирование вирусов происходит не во внутриклеточной жидкости, а на ядерных или цитоплазматических мембранах клетки;

4. Сложно организованные вирусы в процессе формирования включают в свой состав компоненты клетки-хозяина (липиды, углеводы).

Выход вирусов из клетки. Различают два основных типа выхо­да вирусного потомства из клетки. Первый тип — взрывной — характеризуется одновременным выходом большого количества вирусов. При этом клетка быстро погибает. Такой способ выхода характерен для вирусов, не имеющих суперкапсидной оболочки. Второй тип — почкование. Он присущ вирусам, имеющим суперкапсидную оболочку. На заключительном этапе сборки нук­леокапсиды сложно устроенных вирусов фиксируются на клеточ­ной плазматической мембране, модифицированной вирусными белками, и постепенно выпячивают ее. В результате выпячива­ния образуется «почка», содержащая нуклеокапсид. Затем «поч­ка» отделяется от клетки. Таким образом, внешняя оболочка этих вирусов формируется в процессе их выхода из клетки. При та­ком механизме клетка может продолжительное время продуци­ровать вирус, сохраняя в той или иной мере свои основные функции.

Время, необходимое для осуществления полного цикла реп­родукции вирусов, варьирует от 5—6 ч (вирусы гриппа, нату­ральной оспы и др.) до нескольких суток (вирусы кори, адено­вирусы и др.). Образовавшиеся вирусы способны инфицировать новые клетки и проходить в них указанный выше цикл репро­дукции.

источник

Типы проявления цитопатического действия вирусов. Изучение круглоклеточной дегенерации. Практическое значение цитопатического действия для выявления вирусов в биологическом материале и объектах окружающей среды. Испытание контрольной клеточной культуры.

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

ФАКУЛЬТЕТ ПРОМЫШЛЕННОЙ ТЕХНОЛОГИИ ЛЕКАРСТВ

на тему: Цитопатическое действие вирусов

Педченко Евгения Александровна

Цитопатическое действие вирусов

О размножении вирусов в культуре ткани можно судить по цитопатическому действию (ЦПД):

· формированию многоядерных симпластов или синцития в результате слияния клеток;

· возможному образованию включений — структур, не свойственных нормальным клеткам.

Таким образом, цитопатическое действие вирусов — деструктивные изменения отдельных клеток и клеточного монослоя, возникающие в результате продуктивной вирусной инфекции клеток и цитотоксического действия вирионов.

Типы проявления цитопатического действия вирусов

Цитопатическое действие вирусов имеет четыре основных типа проявления:

· образование многоядерных гигантских клеток (симпластов);

· развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих из нескольких слоёв клеток;

Круглоклеточная дегенерация — образование скоплений больших округлых клеток, которые напоминают гроздья, возникает вследствие утраты внеклеточных связей и округления клеток.

Рис.1. Круглоклеточная дегенерация, вызванная цитомигаловирусом

Симпласты представлены гигантскими многоядерными клетками (например, клетки Цапка, выявляемые при герпетических поражениях), образующимися в результате модификации ЦПМ лизосомальными ферментами. Реже наблюдают образование синцитиев — больших конгломератов цитоплазмы, содержащих сотни и тысячи ядер связанных между собой клеток. Образование синцитиев обусловлено модификацией ЦПМ поверхностными гликопротеинами и характерно для парамиксовирусов.

Образование симпласта (синцития)

Феноменология сводится к слиянию нескольких клеток с образованием поликариона — многоядерной нежизнеспособной клетки. Образование симпласта характерно для сложных (оболочечных) вирусов и обусловлено рецепторзависимой цитотропностью суперкапсидных белков. Симпласт образуется двумя способами — внешним и внутренним (Рис. 2).

Рис.2. Внешний (а) и внутренний (б) механизмы вирусиндуцированного образования симпласта

Слияние снаружи описано для парамиксовирусов (возбудители кори, парагриппа, паротита, респираторно-синцитиальный вирус) и наблюдается при множественном заражении благодаря одновременному взаимодействию вируса (вириона) с несколькими клетками. Это вызывает их агрегацию, а затем слияние клеточных мембран. И то и другое не требует синтеза вирусных белков, проявляясь в первые часы после заражения клеточных культур.

Слияние изнутри — более универсальный процесс, известный для многих оболочечных вирусов. В этом случае образованию симпласта предшествует синтез и включение вирусных белков в клеточные мембраны. Такие белки рецептируются соседними клетками, индуцируя их агрегацию. Феномен возникает при низкой дозировке инфекта и выявляется на поздних этапах репликации.

Под пролиферацией понимают процесс деления клеток, приводящий к увеличению объема ткани.

Наиболее часто пролиферация служит проявлением воспалительного процесса, повреждений, опухоли. Усиление пролиферации лежит в основе разрастания тканей в новообразованиях, при гиперпластических процессах. Предраковые изменения, в том числе дисплазия, также сопровождаются повышенной пролиферацией клеток.

Если при воспалительных изменениях или травматических повреждениях пролиферация носит обычно преходящий характер и призвана восстановить ткань до нормы, то в случае опухолей она приобретает иное значение. При новообразованиях пролиферация не только избыточна, но и безостановочна, клетки делятся непрерывно, приводя к появлению и росту опухоли. Предела такой пролиферации не существует, как нет предела и клеточному делению в опухоли.

Рис.3. Пролиферация (размножение) клеток

Пролиферация нередко сопровождается атипией, то есть размножающиеся клетки обретают несвойственные им черты, изменяются внешне и функционально. Атипия говорит о возможной предраковой трансформации. Появление у клеток нехарактерных черт при усиленной пролиферации неудивительно: быстрое размножение создает условия для генетических мутаций, а клетки не успевают как следует созреть. В этом случае количество не означает качество, и в стремительно размножающемся клоне клеток рано или поздно появляются аномальные, мутировавшие элементы.

Факт высокой вероятности атипии при клеточной пролиферации делает этот процесс потенциально опасным, поэтому врачи относятся к нему настороженно. Если клетки изменили свой вид или свойства, можно говорить о предраковом состоянии и нужно срочно принимать меры по ликвидации патологического очага.

Включения выявляются в окрашенных по Романовскому-Гимзе мазках из заражённых клеток. Они бывают эозинофильные и базофильные.

Рис.4. Выявление включений при помощи окрашивания по Романовскому-Гимзе

По локализации в клетке включения различают на цитоплазматические, ядерные и смешанные.

Характерные ядерные включения формируются в клетках, заражённых вирусами герпеса (тельца Каудри), цитомегалии и полиомы, аденовирусами, а цитоплазматические включения — вирусами оспы (тельца Гварниери и Пашена), бешенства (тельца Бабеша-Негри) и другими.

По форме, размерам, структуре, отношению к красителям вирусные включения строго специфичны. Например, тельца Гварниери имеют округлую, серповидную или амебоидную форму диаметром 1-10 мкм, тельца Бабеша-Негри — овальные или эллипсоидные, достигающие 20 мкм, включения реовирусов серповидные, наполовину охватывающие клеточное ядро, коревые включения — в виде почкующихся мелких дрожжей.

Выявление вирусного заражения культуры ткани

О размножении вирусов в культуре ткани также можно судить по методу «бляшек» (негативных колоний). При культивировании вирусов в клеточном монослое под агаровым покрытием на месте поражённых клеток образуются зоны деструкции моносом, так называемые «стерильные пятна» или бляшки. Это даёт возможность не только определить число вирионов в 1 мл среды (считается, что одна бляшка является потомство одного вириона), но и дифференцировать вирусы между собой по феномену бляшкообразрования.

Следующим методом, позволяющим судить о размножении вирусов (только гемагглютинирующих) в культуре ткани, можно считать реакцию гемадсорбции. При культивировании вирусов, обладающих гемагглютинирующей активностью, может происходить избыточный синтез гемагглютининов. Эти молекулы экспрессируются на поверхности клеток культуры ткани, и клетки культуры ткани приобретают способность адсорбировать на себе эритроциты — феномен гемадсорбции. Молекулы гемагглютинина накапливаются и в среде культивирования, это приводит к тому, что культуральная жидкость (в ней накапливаются новые вирионы) приобретёт способность вызывать гемагглютинацию.

Наиболее распространённым методом оценки размножения вирусов в культуре ткани является метод «цветной пробы». При размножении в питательной среде с индикатором незаражённых клеток культуры ткани вследствие образования кислых продуктов метаболизма она изменяет свой цвет. При репродукции вируса нормальный метаболизм клеток нарушается, кислые продукты не образуются, среда сохраняет исходный цвет.

Внешние проявления и механизмы цитопатического эффекта

В его основе лежит повышение проницаемости плазматической мембраны. Открывая доступ Са2+, это ведёт к внутриклеточному ионному дисбалансу, пассивному вхождению воды, разбуханию клетки, разрыву мембраны и вытеканию цитоплазмы. В клеточных культурах этому соответствуют зоны так называемых негативных колоний — бляшек (рис. 9). Гибели клеток предшествует появление цитоплазматических или ядерных включений, которые возникают в местах сборки вирусных нуклеокапсидов и иногда заметны под микроскопом (рис. 10).

Рис. 9. Цитопатическое действие вируса полиомиелита: бляшки (колонии) в культуре клеток почки обезьяны: а — незараженный монослой клеток; б — вирус в разведении 10-4; в — вирус в разведении 10-5

Рис. 10. Кристаллоподобные скопления вирионов аденовируса в ядре инфицированной клетки

Формально цитолиз можно представить как взрыв изнутри, когда плазматическая мембрана лопается под напором вирусных частиц, скапливающихся в клетке. Высвобождение оболочечных (сложных) вирусов происходит путём почкования. В этом случае вирусный нуклеокапсид покрывается наружной оболочкой (суперкапсидом), отбирая у клетки фрагмент модифицированной мембраны. Здесь возможен феномен решета: при множественном почковании клетка не успевает ликвидировать «дыры» в мембране и предупредить вытекание цитоплазмы. Допускается и вероятность аутолиза в связи с повреждением лизосом и высвобождением из них деструктивных ферментов.

Но всё это выглядит слишком прямолинейно. Клетке отдаётся роль пассивного полигона, где вирус беспрепятственно воспроизводит своё потомство, не встречая сопротивления. События, которые предшествуют и, возможно, способствуют цитолизу, остаются за кадром. Между тем, количество зрелых вирионов, накапливающихся в клетках, не всегда коррелирует с литическим эффектом. Известны примеры, когда клетка гибнет, не дождавшись гиперпродукции вируса. Это означает, что должны быть иные (возможно, главные) причины цитолиза, связанные с более тонким вмешательством вируса в жизнь клетки.

Вирусная инфекция — яркий пример молекулярной патологии, которая формируется под влиянием конкурентного вмешательства вирусных белков в жизненно важные процессы клетки. Жить — значит непрерывно обновлять свои функциональные и структурные элементы. Клетка, лишённая такой возможности, погибает.

Отсюда наиболее общим условием цитопатического эффекта следует считать подавление обновляющего синтеза макромолекул, стабилизирующих клеточный гомеостаз. Вирусологи называют это дискриминацией, подразумевая, что вирус вынуждает клетку переключиться на синтез своих нуклеиновых кислот и белков; самообновление клетки прекращается или задерживается. За этим скрывается множество механизмов, большинство из которых не раскрыты, хотя ряд примеров убеждает в их удивительной изящности. Так, вирус полиомиелита блокирует белок, необходимый для взаимодействия клеточных мРНК с рибосомами (кэп-связывающий белок); полиовирусная мРНК не нуждается в этой реакции, получая возможность для селективной трансляции. Действие вируса бешенства на нейроны определяется поверхностным гликопротеином G. Секвенирование (анализ нуклеотидной последовательности) клонированного гена G двух аттенуированных авирулентных штаммов показало, что лишение вируса нейротропности связано с заменой единственной аминокислоты в одном из участков гликопротеина G. Не ясно, чем обусловлен механизм аттенуации (нарушением связывания вируса нейронами или особенностями вирусной репликации), но это говорит о высокой специфичности факторов, вовлекаемых во взаимодействие вируса и клетки. Одной из универсальных мишеней для вирусов являются клеточные тирозин-протеинкиназы. Благодаря сопряжению с ключевыми звеньями метаболизма их экранирование вирусными белками не только подавляет важнейшие функции клеток, но и возбуждает реакции, обслуживающие вирусную репликацию.

В отличие от цитолиза, который всегда пассивен, возникая при грубых повреждениях плазматической мембраны, апоптоз является активным, генетически запрограммированным отмиранием клеток. Есть факты, позволяющие думать, что изменение соотношений между ростовыми и апоптозными потенциями клеток влияет на цитопатический эффект вирусов. Гиперэкспрессия апоптозных генов усиливает гибель, тогда как блокада апоптозной программы стимулирует рост и размножение, вызывая гиперпролиферацию (онкогенную трансформацию) клеток.

Известно более десятка вирусных генов, которые кодируют факторы, усиливающие апоптозный процесс. Обнаружены они и у вирусов человека (аденовирусы, герпесвирусы, папилломавирусы, вирусы гриппа, ВИЧ-вирусы, вирус гепатита В и др.). В ряде случаев апоптоз коррелирует с усилением экспрессии р53 — гена, претендующего на одну из ключевых позиций в индукции апоптоза. Гибель клеток удается предотвратить при помощи продукта протоонкогена bcl-2, усиливающего клеточную пролиферацию.

Предложена гипотеза, согласно которой гибель CD4 Т-лимфоцитов при ВИЧ-инфекции связана с апоптозом. Пусковым фактором служит взаимодействие вирусного суперкапсидного гликопротеина gp120 с CD4-рецепторами лимфоцитов — сигнал, запускающий апоптозный механизм подобно рецепторзависимому апоптозу в системах Fas-FasL и ТНФ-ТНФR. Пока это единственный пример такого рода; в остальных случаях для индукции апоптоза требуется проникновение вируса в клетку и хотя бы частичная экспрессия его генома.

Опережающая смерть клетки, несущей зачаток вируса — исход, выгодный скорее хозяину, чем вирусу. Неслучайно об этом говорят как об альтруистическом самоубийстве, подразумевая, что клетка предпочитает погибнуть, исключив возможность размножения потенциально опасного вируса. Логика подсказывает, что вирусы должны обладать и альтернативным механизмом, который, продлевая жизнь клеток, создавал бы условия для воссоздания как можно более многочисленного вирусного потомства в литическом цикле или обеспечивал переход вируса в латентное состояние (персистенцию). Действительно, некоторые вирусы способны блокировать апоптозный ответ на собственную инфекцию. Это достигается разными способами, но их принцип сводится к двум механизмам — повышение экспрессии антиапоптозных (ростстимулирующих) генов клетки и инактивация эффекторных молекул апоптоза. К первой группе можно отнести стимуляцию протоонкогенов типа bcl-2 (это, в частности, наблюдается при персистенции вируса Эпстайна—Барр в В-лимфоцитах), ко второй — блокаду Р53, продукта апоптозного гена р53 (Е6 протеин вируса папилломы человека).

Гибель клеток связана не только с прямым воздействием вируса. В этом могут быть повинны и эффекторы иммунитета, атакующие заражённые клетки. Сложные (оболочечные) вирусы образуют суперкапсид из клеточных мембран, заблаговременно встраивая в них собственные компоненты. Но экспрессируются и антигены, представляющие глубинные элементы вириона, и даже функциональные белки, которые не входят в состав вирусных частиц. Они выныривают на поверхность клеток в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости — HLA. Клетки, экспрессирующие вирусные эпитопы, несут на себе отпечаток чужеродности, превращаясь в мишень для антител и Т-лимфоцитов. Фиксируясь на заражённых клетках, антитела подключают к цитолизу комплемент и клетки-эффекторы, располагающие рецепторами к иммуноглобулинам (макрофаги, естественные киллеры, нейтрофилы). Это хорошо моделируется in vitro, но действительное отношение антителозависимых реакций к поражению вирусинфицированных клеток остается неясным. Впрочем, антитела реально претендуют на участие в патогенезе вирусных инфекций благодаря другому механизму — иммунокомплексному воспалению. При гиперпродукции вирионов (антигенов) и антител образуется избыток циркулирующих иммунных агрегатов, которые оседают на базальных мембранах микрососудов и, активируя комплемент, вызывают острое воспаление. Особенно опасно поражение почек — гломерулонефрит, который иногда осложняет вирусные инфекции.

В этом отношении поучительна история с вирусом лимфоцитарного хориоменингита (ЛХМ). Его главный природный резервуар — мелкие грызуны, а самый распространённый источник инфекции для человека — мыши. ЛХМ взрослых мышей не отличается от ЛХМ человека, протекая как острая инфекция с преимущественным поражением ЦНС. Иной результат даёт заражение новорождённых мышей. В большинстве они не только не погибают, но остаются внешне здоровыми, поддерживая персистенцию вируса. Лишь позже (не ранее 6-месячного возраста) у части мышей появляются признаки заболевания, но совсем иного, чем у остроинфицированных взрослых животных. В этом случае доминируют симптомы хронического иммунокомплексного поражения почечных клубочков — смертельного гломерулонефрита. Дело в том, что новорождённый организм иммунологически толерантен к вирусу, позволяя ему беспрепятственно размножаться. Вирус ЛХМ лишён прямой цитотоксичности, и его репликация сама по себе не ведёт к патологии. Но образование антител, которое постепенно набирает силу, ведёт к появлению иммунных комплексов, запускающих патологический процесс. Мыши, которые после рождения сохраняют ареактивность к вирусу, превращаются в пожизненный резервуар инфекции.

Изучение ЛХМ преподнесло ещё один сюрприз. Если взрослых мышей заразить в мозг высокой дозой вируса ЛХМ, а через несколько дней ввести иммунодепрессант (например, циклофосфамид), большинство из них выживает, хотя размножение вируса продолжается. Напротив, если новорожденным мышам-вирусоносителям инокулировать в брюшную полость лимфоциты мышей, иммунных к ЛХМ, они быстро погибают от острого менингита в результате Т-опосредованного цитопатического эффекта. Т-лимфоциты вызывают гибель заражённых клеток, индуцируя цитолиз или апоптоз. При активации они секретируют цитокины (гамма-интерферон и др.), которые привлекают и стимулируют макрофаги, побуждая их к разрушительным действиям.

Всё это необходимо для реализации противовирусной резистентности. Здесь мы лишь вновь обращаем внимание на диалектику подобных реакций. При гиперболизации (особенно если вирус обладает слабой вирулентностью) они обретают болезнетворность, поддерживая цитопатический процесс. Значение этого механизма реально при вирусных инфекциях, патогенез которых не удаётся связать с прямой цитотоксичностью возбудителя, как это было продемонстрировано на модели вируса ЛХМ.

Под трансформацией понимается появление клеток с опухолевыми (онкогенными) потенциями. Такие клетки обретают бессмертие (возможность неограниченно долго перевиваться in vitro) и склонность к бесконтрольной пролиферации. В классическом варианте трансформация обусловлена активацией генов пролиферации (онкогенов, или протоонкогенов) — нормального атрибута генетического аппарата всех клеток. Некоторые вирусы несут собственные онкогены, хотя в анамнезе многие из них тоже имеют клеточное происхождение.

Большинство трансформирующих вирусов человека и животных относятся к ДНК-вирусам, обладая способностью встраивать свои гены в хромосомы инфицированной клетки. Это характерно для непермиссивных клеток, которые благодаря этому избегают деструктивного действия вирусов. Другим вариантом является заражение дефектными вирионами (см. ниже). В таких условиях экспрессируется ограниченное число вирусных генов, в том числе таких, продукты которых нарушают регуляцию клеточного цикла, инактивируя один или несколько супрессорных белков (например, Rb, p53). Именно в этот момент, т.е. в период ослабления митотического процесса, наиболее вероятны спонтанные и индуцированные мутации.

В действительности такие действия предназначены не для туморогенеза, а для вирусной репродукции. Дело в том, что большинство ДНК-вирусов используют для репликации ДНК механизмы клетки-хозяина. Это рационально, но проблема в том, что клеточные факторы, задействованные в данном процессе, экспрессируются обычно во время синтеза собственной ДНК (S-фаза клеточного цикла).

Вирусам невыгодно дожидаться начала митоза, тем более что многие клетки-мишени дифференцированы и не делятся (например, поверхностные эпителиальные клетки). Чтобы преодолеть это, ДНК-вирусы научились продуцировать факторы, побуждающие к вхождению заражённых клеток в митотический цикл. К ним, в частности, относятся ранние (т.е. синтезируемые первыми) вирусные белки, блокирующие ингибиторы митоза. Например, аденовирусный белок Е1b (так же, как белки папилломавирусов и герпесвирусов) связывается с клеточным белком р53, который препятствует началу S-фазы. Это выводит клетку из-под негативного контроля, позволяя экспрессировать факторы, необходимые для репликации. По аналогии другие вирусные белки связывают клеточный белок pRB, высвобождая фактор транскрипции, усиливающий образование белков, необходимых для деления клеток.

Нарушая нормальную регуляцию митотического цикла, такие вирусы обладают онкогенным потенциалом. Это особенно характерно при интеграции вирусного генома в клеточную ДНК, когда транскрипции подвергаются прежде всего ранние гены вируса. Действительно, два упомянутых клеточных фактора (р53 и pRB) известны как супрессоры опухолевого роста, а канцерогенными (для человека) ДНК-вирусами являются папилломавирусы, герпесвирусы (вирус Эпстайна—Барр) и гепаднавирусы (вирус гепатита В). Впрочем, об этом принято говорить более осторожно: их эффект ассоциирован с развитием строго определенных форм рака.

Из РНК-вирусов лишь ретровирусы вызывают феномен трансформации, являясь причиной ряда злокачественных опухолей животных и одной из редких форм Т-клеточного лейкоза человека (вирусы HTLV-1 и HTLV-2). Впрочем, такое исключение скорее подтверждает общее правило: для репликации ретровирусы используют смешанную ДНК-РНК-стратегию, внедряя в хромосомы свой ДНК-прогеном, который образуется путем обратной транскрипции вирионной РНК. Интеграция с вирусными генами может дестабилизировать геном клетки, возбуждая онкогены. Есть подозрение, что к трансформации предрасполагает и вирусиндуцированное ослабление апоптозного процесса, создающее дисбаланс между пролиферацией и гибелью клеток. Парадоксально, но именно вирусогенетическая теория рака привела к обобщающей концепции об эндогенных онкогенах, продукты которых, являясь физиологическими стимулами пролиферации, способны выходить из-под негативного контроля, возбуждая избыточный рост клеток. Вирусы вписываются сюда как один из возможных коиндукторов клеточных онкогенов, а также как фактор, нарушающий равновесие между пролиферацией и апоптозом.

Клинический облик многих вирусных инфекций связан с персистенцией — длительным присутствием возбудителя в организме. В основе персистенции лежит способность вирусов закрепляться в клеточных популяциях, используя для этого разнообразные приемы — от «замораживания» собственных генов в хромосомах клетки-хозяина (вирогения) до агрессивного вмешательства в систему индукторов и эффекторов иммунитета.

Развитие (онтогенез) вирусов включает две фазы — внеклеточную и внутриклеточную. Вне клеток вирус представлен структурно зрелой частицей — вирионом. Попадая в чувствительные клетки, вирион распадается (дизъюнкция), высвобождая нуклеиновую кислоту, которая заставляет клетку реплицировать вирусные субкомпоненты, необходимые для сборки новых вирионных частиц. Такой цикл, нередко ведущий к гибели клеток, называется продуктивной, или репликативной, инфекцией. Именно этот процесс имел в виду М. Бернэт, рассуждая о фатальных исходах острых вирусных заболеваний. Он говорил о них как об экологической катастрофе не только для хозяина, но и для вируса. Действительно, чтобы существовать, вирусу выгодно избегать или хотя бы сглаживать конфликты с хозяином. Следуя логике, для этого он должен найти относительно устойчивый организм, с которым мог бы вступить в симбиоз в виде продуктивной инфекции или вирогении.

Имеется множество наблюдений, доказывающих способность вирусов длительно сохраняться в клетках in vitro и in vivo. У человека персистируют герпесвирусы, вирусы гепатитов В и С, кори, полиомиелита, ретровирусы и др. Из клеточных культур от бессимптомных носителей были случайно выделены не известные ранее вирусы человека и животных — аденовирусы, риновирусы и пр. Открытие ряда опасных вирусов явилось результатом случайных внутрилабораторных заражений при работе с культурами клеток здоровых животных, прежде всего обезьян. Именно так были обнаружены вирусы геморрагических лихорадок Ласса и Марбург. Вирус бешенства сохраняется в летучих мышах, выделяется от здоровых собак и песцов. Арбовирусы персистируют в кровососущих членистоногих и, попадая к человеку, вызывают тяжелейшие заболевания — энцефалиты и геморрагические лихорадки. До сих пор не исключена вероятность «внечеловеческих» резервуаров гриппозного вируса, где, подвергаясь генетическим перестройкам, он готовит себя к очередным эпидемиям.

Высокочувствительные методы иммунохимического и молекулярно-генетического анализов значительно расширили возможности изучения персистентных инфекций. Если вирусологи прошлого теряли вирус тотчас после его проникновения в клетку и не видели вплоть до образования новых вирионов, то сегодня за вирусом ведется непрерывное наблюдение, так как зараженные клетки всегда содержат вирусные гены и белки. Словом, как бы ни старался спрятаться вирус, он, подобно герою-невидимке Г. Уэлса, обязательно оставляет следы, пусть незначительные, но уловимые современными методами.

Лет тридцать назад французский вирусолог О’Дюруа говорил о персистенции как о джентльменском соглашении между вирусом и клеткой, подписи которого известны, но условий которого мы не знаем. Сегодня можно говорить и об условиях, т.е. о механизмах вирусного симбиоза.

Персистенция на уровне изолированных клеток

Персистенция вирусов имеет глубокие эволюционные корни. Её классической моделью является фаговая лизогения, по сути симбиоз между бактериями и их вирусами. Большинство лизогенных (умеренных) фагов длительно сохраняются в бактериях, внедряя свои гены в хромосому и подавляя их транскрипцию при помощи репрессорного белка, закодированного в собственном (фаговом) геноме. Инактивация гена-репрессора снимает блокаду, индуцируя репликативную инфекцию.

Аналогичный механизм (интегративная вирогения) для вирусов человека и животных был постулирован Л.А. Зильбером в рамках вирусогенетической теории рака. Действительно, подобно лизогенным фагам, они могут длительно персистировать в составе клеточных хромосом в полностью или частично законсервированном виде. В этом им помогают не только собственные репрессоры, но и заражённые клетки, которые продуцируют факторы, контролирующие транскрипцию вирусных генов. Для некоторых вирусов (ретровирусы, гепаднавирусы) интегративная вирогения является обязательным условием продуктивной инфекции. На этой основе возникло даже представление об интеграционных болезнях, признающее патогенетическую значимость интегративного процесса, т.е. включения вирусных генов в клеточные хромосомы.

Но вирогения возможна и без интеграции. Это характерно для РНК-вирусов, лишённых механизма обратной транскрипции (переписывания генетической информации с РНК на ДНК), т.е. в принципе не способных к объединению с ДНК. Так ведёт себя, например, вирус гепатита С. Вирус кори (представитель семейства парамиксовирусов) сохраняется после острой инфекции в центральной нервной системе. Подавление его репродукции объясняется тем, что в нейронах не синтезируется М-белок, необходимый для сборки вирионов. Это ведёт к медленному накоплению вирусных субкомпонентов (нуклеокапсидов) и развитию подострого склерозирующего энцефалита. Впрочем, и ДНК-вирусы способны персистировать автономно от хромосом, подобно бактериальным плазмидам. Это, в частности, характерно для герпетической инфекции нейронов.

Другой механизм уклонения от острого конфликта связан с дефектными вирусами. Возникая в результате мутационных делеций, некоторые из них (так называемые дефектные интерферирующие частицы — ДИ-частицы) не только сохраняют способность к самовоспроизведению, но реплицируются быстрее полноценных вирусов, используя их в роли помощников. Накопление ДИ-частиц препятствует избыточному размножению вирулентных вирусных клонов, предрасполагая к персистенции: цитопатический вирус и ДИ-частицы размножаются, регулируя друг друга. Многочисленными исследованиями разных вирусов показано, что ДИ-частицы могут накапливаться в организме зараженных животных, защищая от вирулентного вируса. Последний не элиминируется, а переходит в латентное состояние, иногда полностью прекращая репликацию. В связи с тем, что в различных клеточных системах скорость накопления ДИ-частиц неодинакова, степень загрязнения вирусных препаратов ДИ-частицами сильно варьирует. Например, для получения определяемого количества ДИ-частиц пикорнавирусов требуются десятки последовательных пассажей, тогда как вирус бешенства продуцирует большое количество ДИ-частиц уже при первых посевах. С этим, в частности, связан парадокс, отмеченный Л. Пастером при разработке антирабической вакцины: эффективность воспроизведения бешенства снижается при заражении животных большими дозами инфицированного материала (мозговой эмульсии от больных животных), когда повышается вероятность засорения вирулентного вируса ДИ-частицами.

Разновидностью дефектных вирусов являются так называемые температурозависимые мутанты, которые не реплицируются при 37?С (т.е. нормальной температуре тела), но размножаются при повышенных температурах. Альтернативой являются риновирусы — главные возбудители малых простудных заболеваний (острого катара верхних дыхательных путей). Они тоже температурозависимы, но предпочитают пониженную температуру. Персистируя в назальном эпителии, где и без того «холодно», риновирусы активируются при дополнительном охлаждении (простуда!).

Проблема вирусной персистенции получила отражение и в концепции апоптоза. Подразумевается, что при так называемом альтруистическом самоубийстве, реагируя на вирусную инвазию, клетки предпочитают погибнуть, чтобы опередить репликацию вируса, опасного для своих соседей и организма в целом. Некоторые вирусы блокируют клеточный апоптоз, создавая условия для продуктивной инфекции или персистенции. Они добиваются этого, повышая экспрессию ростстимулирующих генов (протоонкогенов) либо инактивируя эффекторы апоптоза.

Персистенция на уровне организма

Чтобы закрепиться в организме, вирусу недостаточно «договориться» с клеткой. Как чужеродный (антигенный) объект он подвергается иммунной атаке, нацеленной на уничтожение вируса и заражённых им клеток. Это означает, что на уровне организма персистенция предполагает еще одно условие: вирус должен избежать элиминирующих реакций в системе иммунологического надзора. Главное здесь — выживание не свободного вируса, а заражённых клеток, т.е. персистенция не самого вируса, а содержащих его клеток.

Персистенция затрагивает практически все факторы антивирусной защиты. Многие обобщения гипотетичны и служат скорее ориентиром для дальнейших исследований, которые могут утвердить их или опровергнуть. Но они представляют несомненный интерес, отражая стремление расшифровать одно из базисных понятий вирусологии. Мы сконцентрируем внимание на взаимоотношениях вирусов с Т-лимфоцитами, так как именно от них больше всего зависит судьба инфицированных клеток. Антитела предупреждают заражение клеток, но не спасают от внутриклеточного вируса. Они необходимы для успешного завершения острого конфликта, но не эффективны против утвердившейся инфекции.

О противовирусном иммунитете говорится в специальном очерке (см. «Механизмы противоинфекционного иммунитета»). Здесь мы лишь напомним о том, что необходимо знать для обсуждения антииммунитетной стратегии вирусов (Рис. 11.). Ключевым является представление вирусных антигенов Т-лимфоцитам в комбинации с молекулами главного комплекса гистосовместимости (у человека — HLA) на поверхности заражённых клеток или клеток, поглотивших вирусные антигены. На этом этапе происходит селекция антигенчувствительных клонов, которые, подвергаясь дифференцировке и пролиферации, превращаются в Т-эффекторы, настроенные (коммитированные) против HLA-презентируемых эпитопов.

Рис. 11. Индукция и реализация противовирусного иммунитета.

Центральным событием является активация CD4 Т-лимфоцитов (Т-хелперов). На этом этапе вирус поглощается и разрушается антигенпредставляющей клеткой (АПК, например, макрофагом) с образованием пептидов (HLA-пептидов), которые представляются на поверхности АПК рецепторам CD4 Т-лимфоцитов в виде комплекса с молекулами главного комплекса гистосовместимости класса 2 (HLA-2). Макрофаг секретирует интерлейкин-1 (ИЛ-1), помогающий проактивировать CD4 Т-лимфоцит. Активированный CD4 Т-лимфоцит является источником костимулирующих цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5 и др.), которые активируют предшественники Т-эффекторов и В-лимфоциты. Т-эффекторы атакуют клетки, экспрессирующие антигены в комплексе с HLA-1 (CD8) и HLA-2 (CD4), антитела реагируют со свободными вирусными антигенами и частицами.

Для созревания Т-эффекторов необходимы дифференцировочные и ростстимулирующие сигналы хелперных CD4 Т-лимфоцитов. Но перед этим T-хелперы сами подвергаются активации, превращаясь в источник разнообразных цитокинов. Главная роль принадлежит Тh1. Они помогают активации цитотоксических Т-лимфоцитов и других эффекторных клеток, прежде всего макрофагов.

Реализация иммунного ответа против внутриклеточных вирусов связана с цитотоксическими Т-лимфоцитами (СТL). Неспецифические клетки-эффекторы дополняют их антивирусную активность.

Из сказанного вытекают два правила, следуя которым вирус может избежать уничтожения. Во-первых, этому способствует слабый иммунный ответ, недостаточный для элиминации вируса и вирусинфицированных клеток. Во-вторых, вирус может пассивно или активно уклоняться от взаимодействия с эффекторами иммунитета, прежде всего с цитотоксическими Т-лимфоцитами. Иными словами, антииммунитетная стратегия вирусов может иметь профилактическую направленность (подавление индукции иммунного ответа) или проявляется после того, как хозяин уже накопил определенный запас антивирусных средств (подавление реализации иммунного ответа).

Подавление индукции иммунного ответа

Идеальный способ для исключения иммунного ответа — полная блокада вирусных генов, персистирующих внутри клетки: молчащие гены не вызывают синтеза белков, и, следовательно, клетка не будет мечена вирусными антигенами. Но в таком случае вирус лишился бы экологического пресса, перестав эволюционировать. Отсюда любой вирус, претендующий на закрепление в природе, обязан полностью или частично реплицироваться, а персистенция — лишь хорошее подспорье для того, чтобы рано или поздно проявить свой репликативный потенциал.

Одним из примеров стабилизации вирусного инфекта на фоне ослабления иммунной реакции является внутриутробное инфицирование, создающее прецедент для негативной селекции (элиминации) незрелых Т-лимфоцитов, коммитированных против вируса. Это вызывает толерантность, т.е. иммунологическую ареактивность против вируса. Такая возможность обсуждается в связи с трансплацентарным заражением вирусом гепатита В (HBV), которое в 90% случаев ведет к хроническому вирусоносительству; у взрослых острый гепатит В завершается персистенцией вируса лишь в 10% случаев. Врожденная HBV-инфекция сочетается с ослаблением ответа на нуклеокапсидные HBV-эпитопы; cпособность к образованию антител против поверхностного антигена (HBsAg) сохраняется.

Относительная толерантность к вирусным антигенам возникает и у взрослых. Замечено, например, что при хроническом гепатите В количество анти-HBV CTL гораздо меньше, чем у больных острым гепатитом, а их противоантигенный (точнее, противоэпитопный спектр) значительно сокращён. Причиной может быть истощение антивирусных Т-клонов избытком вирусных антигенов или разрушительная аутоагрессия против СТL с фиксированными на их поверхности вирусными пептидами (результат связывания свободных HBV-пептидов молекулами HLA-1).

Другим механизмом может быть недостаточная презентация вирусных антигенов в системе главного комплекса гистосовместимости. Обладая высоким полиморфизмом, молекулы HLA отличаются по сродству к различным пептидам и способности представлять их Т-лимфоцитам. Это означает, что индивиды с разным HLA-фенотипом могут неодинаково реагировать на один и тот же вирус. В реальных ситуациях, когда в реакцию втягивается множество антигенных эпитопов и Т-клонов, влияние подобного фактора на иммунный ответ маловероятно, но это может иметь значение, если речь идет о реактивности к наиболее важным (протективным) антигенам. Значимость такого механизма возрастает и при слабом иммунном ответе, для которого характерна олигоклональность, т.е. вовлечение в реакцию ограниченного числа лимфоцитарных клонов на лимитированный спектр эпитопов. Это довольно типично для хронических вирусных инфекций. цитопатический вирус биологический клеточный

Но вирусы способны и активно блокировать презентацию собственных антигенов. Они добиваются этого, снижая экспрессию HLA и других иммуновспомогательных молекул на поверхности заражённых клеток. По примерным подсчетам, для индукции Т-ответа требуется 200 HLA-пептидов; за этим порогом клетки незаметны для Т-лимфоцитов. Способность к сокращению числа молекул HLA обнаружена у аденовирусов, цитомегаловируса, вируса Эпстайна—Барр. Эффект может быть непрямым. В этом случае он опосредован через подавление секреции или блокаду цитокинов, стимулирующих экспрессию антигенпредставляющих молекул, а также через ослабление чувствительности вирусинфицированных клеток к такого рода медиаторам. Это установлено для вируса гепатита В: его кор-антиген (HBcAg) снижает синтез альфа-интерферона, а ДНК-полимераза подавляет клеточные реакции на альфа- и гамма-интерфероны. То же самое известно для нуклеокапсидного белка вируса гепатита С, который вызывает значительное подавление альфа-интерферона у больных хроническим гепатитом С.

Наконец, вирусы обладают способностью снижать активность Т-лимфоцитов. Существует масса экспериментальных и клинических данных, полученных для разных вирусов (герпесвирусы, аденовирусы, орто- и парамиксовирусы и др.). Они носят фактологический характер и лишь с большой натяжкой могут быть экстраполированы на персистенцию. Примером патогенетически значимой иммунодепрессии служит антихелперная (анти-CD4) активность вируса иммунодефицита человека. Но и этот механизм, срабатывающий с большим опозданием (когда вирус уже закрепился в организме), вряд ли может быть главной причиной стабилизации ВИЧ-инфекции, которой на первых порах сопутствует выраженный иммунный ответ.

Подавление реализации иммунного ответа

За редким исключением вирусам не удается избежать иммунной реакции. Поэтому они вынуждены персистировать на фоне более или менее значительного накопления эффекторов иммунитета — антител и Т-лимфоцитов. Если антитела порой даже способствуют вирусоносительству, сдерживая чрезмерную агрессивность свободных вирусов, то клетки, меченные вирусными антигенами, служат отличной мишенью для СТL и, казалось бы, подлежат обязательному уничтожению. Тем не менее очищение организма от вирусов часто запаздывает, а в ряде случаев остается незавершенным. В идеале вирус должен стать незаметным для антител и Т-эффекторов, а реально — избежать с ними острого конфликта, обрывающего инфекцию. Вирусы добиваются этого разными способами, от простых и очевидных до весьма изощрённых. Впрочем, не более изощренных, чем способы, которыми пользуется хозяин, чтобы избавиться от поселившихся в его организме инфекционных агентов.

Во-первых, вирусы могут персистировать, сокращая экспрессию своего генома ниже порога видимости Т-эффекторов либо инфицируя иммунологически привилегированные ткани, т.е. участки тела, труднодоступные для Т-лимфоцитов или наделенные способностью возбуждать их апоптоз при помощи Fas-Fasl-зависимого механизма.

Например, главным резервуаром латентной ВИЧ-инфекции служат макрофаги, которые в отличие от CD4 Т-лимфоцитов не поддерживают активной репликации вируса. Вирусы простого герпеса и ветряной оспы замораживают большинство своих генов в нейронах регионарных ганглиев чувствительных нервов. Цитомегаловирус персистирует в макрофагах и слюнных железах, укрываясь за гематосаливарным барьером. Вирус кори прячется в нейронах головного мозга. Символично выражение: мозг как мусоросборник вирусов. Во-первых, гематоэнцефалический барьер — надёжная преграда для лимфоцитов, а, во-вторых, нейроны, лишённые пролиферативных потенций, малопригодны для вирусной репликации. Альтернативой являются гепатоциты, которые, минуя микроваскулярные (гематотканевые) барьеры, напрямую контактируют с кровью и легко доступны для Т-лимфоцитов. Отсюда понятно, почему персистирующие гепатотропные вирусы (HBV, HCV) прячутся не только в гепатоцитах, но и в других клетках, включая иммунологически привилегированные зоны. Возможно, что, выходя из укрытия, они реинфицируют гепатоциты и одновременно активируют Т-клетки памяти, тонизируя патогенетический механизм хронического гепатита.

Парадоксально, но фактором, способствующим персистенции, могут быть интерфероны, исходно нацеленные на уничтожение внутриклеточного вируса. Это связано с отбором вирусных мутантов, резистентных к интерфероновой блокаде вирусной репликации. Повышенной устойчивостью к интерферонам обладают мутанты по пре-С-гену вируса гепатита В. Больные, инфицированные такими штаммами, хотя и отвечают на интерферонотерапию, но чаще дают обострения. Не одинаковы по чувствительности к интерферону и генотипические разновидности вируса гепатита С. Это также влияет на эффективность лечения его хронических форм.

Устойчивость к интерферонам — не единственный пример иммунорезистентности вирусов. Уклонению от антител и Т-лимфоцитов способствует изменчивость вирусных антигенов, которая ведет к образованию так называемых ускользающих мутантов (англ. escape mutants). Это связано с высокой скоростью точечных мутаций по протективным эпитопам и HLA-пептидам, представляющим антигены в системе Т-клеточного иммунитета. Появление антигенных мутантов в ходе инфекционного процесса обнаружено для вирусов иммунодефицита человека, гепатита В и С, простого герпеса, полиомиелита. В таких случаях вирус представлен в организме совокупностью неоднородных клонов (квази-видов), которые подвергаются селекции под давлением иммунологического пресса.

Крайним проявлением эпитопной изменчивости служит полная потеря базисной специфичности, когда мутантный антиген не связывается с антителами и рецепторами Т-лимфоцитов против исходных (диких) вирусных клонов. Это обеспечивает выживание вируса даже в условиях жесткой иммунной атаки. У больных HBeAg-позитивным хроническим гепатитом В почти все HBV-клоны обновляются через 5—6 лет, мутируя по пре-S-гену и меняя соответствующие эпитопы. Это позволяет вирусу персистировать после элиминации дикого штамма. Известны наблюдения, когда поверхностный антиген (HBsAg) вируса гепатита В циркулировал в крови, но не улавливался стандартными анти-HBs-антителами из-за мутаций всего по 1—2 аминокислотам. Такие случаи квалифицировались как ни А—В гепатит, и лишь по генетическим маркерам ставился правильный диагноз. Нейтрализующая активность антител, полученных на ранней стадии хронического гепатита С, прогрессивно падает по отношению к вирусным штаммам, изолированным в более поздние сроки. Чем меньше разрыв между получением вируса и антител от одного и того же больного, тем сильнее их антивирусный эффект. Мутанты, ускользающие от эффекторов иммунитета, чрезвычайно характерны для ВИЧ-инфекции. Скорость мутирования ВИЧ (особенно по главному протективному антигену, gp120) необыкновенно высока, обеспечивая широкие возможности для селекции иммунорезистентных вирусных клонов.

Интригующую разновидность Т-эпитопных модификаций представляют вирусные мутанты-антагонисты. Сохраняя способность связываться с Т-клеточными рецепторами, они вместо активации вызывают частичную или полную анергию CTL. Ее отношение к вирусной персистенции становится реальным, если учесть, что такая анергия может быть длительной, а зараженные клетки способны экспрессировать на поверхности дикие и мутантные вирусные эпитопы. Последние, интерферируя с СТL, защищают не только свой, но и родительский (немутантный) вирус. Т-антагонизм (он обнаружен у вирусов гепатита В и иммунодефицита человека) не связан с физической блокадой Т-рецепторов, так как для его воспроизведения требуется ничтожная дозировка мутантных Т-эпитопов, которая явно недостаточна для экранирования антигенных рецепторов. Следует скорее думать о фармакологическом эффекте, т.е. о блокаде образования медиаторов, транслирующих сигналы с Т-рецепторов.

Ещё один механизм антииммунитетной вирусной стратегии — нейтрализация цитокинов и их рецепторов. К числу цитокинов относятся важнейшие регуляторы индукции и реализации иммунного ответа, большинство из которых продуцируется активированными макрофагами и Т-лимфоцитами. Отсюда вряд ли случайно, что некоторые вирусы (прежде всего ДНК-вирусы с крупным геномом) научились дискриминировать этот механизм, перехватывая цитокины структурными аналогами их рецепторов (вироцепторы) или экранируя цитокиновые рецепторы при помощи пептидов, сходных с их естественными лигандами — цитокинами (вирокины). Так, поксвирусы кодируют пептиды, гомологичные рецепторам для туморонекротического фактора, интерлейкина-1, гамма-интерферона, альфа-/бета-интерферонов. Они (вироцепторы) выделяются из инфицированных клеток и, связывая цитокины, опережают их эффекты в системе антивирусной защиты. Герпесвирусы кодируют структурные аналоги рецепторов хемокинов — мощных хемоаттрактантов для клеток-эффекторов воспаления и иммунитета. Хемокиновые вироцепторы экспрессируются на поверхности зараженных клеток и, отвлекая на себя часть хемокинов, снижают интенсивность антивирусной реакции. Аденовирусы синтезируют белки, интерферирующие с цитотоксической активностью туморонекротических факторов CТL, естественных киллеров и макрофагов. Фактор, сходный с интерлейкином-1, обнаружен у вируса Эпстайна—Барр; одна из его функций связана с ослаблением реакций в системе Т-клеточного иммунитета.

Резюмируя, можно сказать, что благодаря необыкновенно плотной коэволюции вирусов и их хозяев возникли удивительно изящные формы симбиотических взаимоотношений, которые прослеживаются на всех уровнях организации вирусной материи — от бактериофагов до вирусов высших животных. Персистенция сочетает в себе элементы пассивной и активной самозащиты. Они неодинаково используются разными вирусами, имеют различную адаптивную силу и неравноценные патогенетические последствия.

Активация персистентных вирусов

Вирусная латенция динамична. Равновесие между вирусом и клеткой, вирусом и организмом может сдвигаться в пользу хозяина или паразита, создавая для каждого из них более или менее серьезные проблемы. По этому поводу А. Львов (французский генетик и вирусолог русского происхождения) остроумно заметил, что взаимоотношения между умеренными (т.е. персистентными) фагами и бактериями подобны брачному союзу: он кажется прочным, но под давлением обстоятельств рушится, и бывшие друзья становятся врагами. Нечто подобное справедливо и для медицинских вирусов. Подвергаясь активации, они реализуют свою болезнетворность, внося существенный вклад в инфекционную патологию.

Причины активации латентных вирусов (так же, как корни самой персистенции) следует анализировать по двум направлениям — на уровне клеток и на уровне организма. И в том и другом случае могут быть виновны вирус или хозяин, но в основе всегда лежит ослабление контроля над вирусом. Это переводит латенцию на рельсы продуктивной инфекции или хотя бы дерепрессирует вирусные гены, продукты которых приносят прямой или опосредованный вред хозяину. Вирусы меняются в результате мутаций, генетических рекомбинаций, генотипического или фенотипического смешивания с вирусами-помощниками. Отсюда толчком к активации может быть воздействие физических и химических факторов, оксидантного стресса, суперинфекции. Например, температурозависимые мутанты оживают при повышении температуры, а риновирусы активируются при охлаждении. Для репликации вируса гепатита D требуется присутствие вируса гепатита В, некоторые из парвовирусов нуждаются в помощи аденовирусов или вирусов простого герпеса. Иногда латенцию удается нарушить при сокультивировании с чувствительными (пермиссивными) клетками.

Одним из общих условий для патогенетически значимой активации вирусов является ослабление резистентности хозяина. С наибольшей очевидностью это проявляется у больных с ятрогенной и ВИЧ-иммунодепрессией. Одной из серьезных проблем в таких случаях являются эндогенные рецидивы герпетических инфекций на фоне подавления Т-клеточного иммунитета. Впрочем, и нормально работающая иммунная система не только не гарантирует защиты от клинически значимой персистенции вирусов, но и участвует в реализации ее патогенетического потенциала. Это совершенно необходимо для вирусов, которые лишены собственной цитотоксичности, формально безвредны для изолированных клеток, но обретают болезнетворность, подключая эффекторы иммунитета.

Активация персистентных вирусов ведет к разнообразным клиническим последствиям, которые, как и при обычных инфекциях, отражают избирательную цитотропность и особенности взаимоотношений в системе «вирус-клетка». Памятуя об этом, их можно объединить в несколько групп (Рис. 12). Рецидивы острых поражений типичны для вирусов с прямой цитотоксичностью (вирусы простого герпеса, ветряной оспы, опоясывающего лишая, цитомегаловирус). Хроническое течение имеет обычно иммунопатогенетическую основу (например, гепатит В). Опасность внутриутробного инфицирования возникает при вирусемии беременных, предрасполагающей к трансплацентарной (вертикальной) передаче возбудителя (цитомегаловирус, вирус гепатита В, ВИЧ). Онкогенность обычно связана с интегративными инфекциями, когда вирусы, дестабилизируя клеточный геном, способствуют экспрессии его онкогенов (точнее — протоонкогенов).

Рис. 12. Патогенетически значимые последствия вирусной персистенции.

Особой категорией являются медленные нейроинфекции — подострые спонгиозные (губчатые) вирусные энцефалопатии. Они характеризуются длительным (несколько лет) инкубационным периодом и, прогрессируя без ремиссий, неизбежно ведут к смерти на фоне необратимой дегенерации нейронов. Возбудители некоторых из них совершенно уникальны: это инфекционные белки, лишенные генетического материала (ДНК или РНК). Именно поэтому они получили название прионов (сокращение двух слов — протеин и инфекционный).

Но этиология медленных нейроинфекций не ограничивается прионами. Их причиной могут быть и обычные, канонические вирусы, персистирующие в ЦНС. Кстати, именно с них началось изучение этой удивительной патологии. Начало положил Б. Сигурдсон, доказавший инфекционную природу болезни висны-мэди овец, завезенных в Исландию из Германии для развития каракулеводства. Эти исследования начались в конце 1930-х гг., но лишь в 1954 г. Б. Сигурдсон сформулировал основные положения концепции о медленных инфекциях. Возбудителем висны-мэди (исл. «чахнущий» и «одышка») оказался ретравирус, чем поставил немало вопросов. Неожиданным, например, явилось то, что он отлично размножается в клеточных культурах, вызывая острый (т.е. быстрый) цитопатический эффект. Иными словами, отсроченное и медленное поражение ЦНС связано с особенностями поведения вируса в инфицированном организме, а не с его биологической уникальностью. Было установлено, что возбудитель бессимптомно персистирует в макрофагах, а его распространение сдерживается антителами. В вирусной популяции вызревают ускользающие мутанты, и не исключено, что именно они обеспечивают эволюцию процесса.

источник