Лабораторные животные при оспе

вирусология шпоры / Характеристика вирусов оспы млекопитающих и птиц. Лабораторная диагностика, иммунитет и специфическая профилактика

Вирусы оспы вызывают острую контагиозную болезнь с папулезно-пустулезными поражениями кожи и иногда слизистых оболочек.

Возбудитель. Большая группа вирусов оспы относится к семейству Poxviridae. Bвирионы поксвирусов — овальные или прямоугольные частицы размером до 450 нм со сложной структурой. Они состоят из центральной части — нуклеотида, овальных боковых тел и наружной оболочки. Нуклеотид содержит двуспиральную ДНК, связанную с белком. Нуклеотид и боковые тела окружены оболочкой из липидов и трубчатых белковых структур. Репродукция происходит в цитоплазме клетки.

Устойчивость. Во внешней среде устойчивость оспенных вирусов высокая. Они сохраняют жизнеспособность в сухих корочках оспин до 1,5 лет. Чувствительны к высоким температурам, солнечным лучам и кислотам; кипячение убивает их моментально.

Культивирование. Вирус оспы культивируется на молодняке естественно-восприимчивых животных и птиц, культуре клеток и развивающихся птичьих эмбрионах.

Антигенные свойства. Семейство поксвирусы включает восемь родов: ортопоксвирусы, пара-, ави-, карпи-, лепо-, суи-, моллуси-, и ятапоксвирусы. Роды включают различные виды вирусов оспы, которые отличаются в антигенном и иммуногенном отношении. Вирусы оспы птиц антигенно близки между собой. Каждыйвид возбудителя оспы характеризуется определенной инфекционностью в отношении культуры клеток и куриных эмбрионов. В организме образуются вируснейтрализующие, комплиментсвязывающие,преципитирующие антитела и агглютинины, в тканях (коже) — специфическая невосприимчивость.

Эпизоотологические особенности. Оспой болеют почти все виды животных и птиц. Но в связи со сложностью этиологической структуры оспы у животных и способностью каждого вида возбудителя вызывать самостоятельную болезнь при анализе эпизоотического процесса необходимо учитывать вид вируса, вызвавшего конкретную вспышку оспы. Источниками возбудителя инфекции являются больные животные и вирусоносители. Факторы передачи вируса — предметы ухода и корма, контаминированные вирусами, а также кровососущие насекомые. Основной путь заражения — аэрогенный. Летальность 20-90%, особенно среди молодняка, зимой и при осложнениях.

Патогенез. Особенность инфекционного процесса при оспе обусловливается эпителиотропностью возбудителей и их способностью вызывать на коже своеобразную оспенную экзантему. Патологический процесс состоит из нескольких стадий:

розеолы — появление красных пятен в течение 1-2 суток

папулы — превращение пятен в узелки в течение 1-3суток

везикулы-папулы — превращение в пузырьки, наполненные серо-желтоватой жидкостью, в течение 5-6 суток; лихорадочные явления угасают

пустулы — содержимое везикул мутнеет и становится гнойным в течение 3 суток

крусты — на месте высохших пустул образуется бурый струп

Проникновение вируса через кожу, как правило, вызывает лишь местный оспенный процесс и легкое переболевание животных. Если возбудитель попадает в организм респираторным или алиментраным путями, то возникает септицемия и оспенный процесс на коже и слизистых приобретает генерализованную форму, что сопровождается высокой температурой; процесс нередко осложняется гноеродными и гнилостными микробами, которые могут вызвать глубокие поражения тканей и даже вторичный сепсис.

Клинические признаки. Тяжесть проявления и широта распространения оспенной экзантемы зависят от видовой и индивидуальной устойчивости животных, вирулентности возбудителя,способа заражения и состояния кожных покровов. Поэтому оспа может проявляться в абортивной, сливной и геморрагических формах.

абортивная форма: на теле животного появляется небольшое число оспин, которые, не претерпевая всех стадий процесса, быстро исчезают

сливная форма: отдельные везикулы на обширных участках кожи сливаются между собой и образуют большие пузыри, а в дальнейшем — струпья, под которыми скапливается гной; процесс сопровождается высокой температурой и сильным угнетением общего состояния.

геморрагическая(черная) форма: множественные кровоизлияния внутри пустул и в коже, кровотечения из носа, кровавая рвота, понос с примесью крови. Животные быстро худеют и погибают.

Патолого-анатомические изменения. В трупахнаходят картину геморрагического диатеза, на серозных- покровах — множественные кровоизлияния, слизистые оболочки геморрагически воспалены, с наличие эрозий, иногда и язы. В легких — признаки крупозной пневмонии, гангренозные участки, лимфоузлы увеличены и гиперемированы; печень, сердце и почки с признаками дегенерации.

Диагноз. Основан на клинико-эпизоотологических, патолого-анатомических данных и результатх лабораторных исследований. Необходимо исключать:

у КРС ящур, везикулярный стоматит, кормовые сыпи

у овец контагиозную эктиму, паршу, чесотку и инфекционные экземы

у свиней ящур, везикулярную болезнь, оспоподобную экзантему незаразного происхождения

у коз ящур и контагиозную эктиму

у птиц инфекционный ларинготрахеит, респираторный микоплазмоз, авитаминоз А, кандидамикоз

Лабораторные исследования. Пат.материал: содержимое везикул и пустул,измененные участки кожи,папулы, розеолы, кровь.

экспресс-методы: обнаружение элементарных телец (по Морозову), РГА, РИФ, электронная микроскопия

— выделение в культуре клеток, куриных эмбрионах,на молодняке восприимчивых животных

— серологическая идентификация в РДП, РИФ, РН

ретроспективная диагностика (РДП)

Иммунитет. После естественного переболевания независимо от тяжести заболевания формируется стойкий и продолжительный иммунитет.

Лечение. Сыворотки крови реконвалесцентов и гипериммунных животных слабоэффективны; наиболее действенны гаммаглобулины.

Специфическая профилактика. Для вакцинации овец используют гидроксидалюминиевую формолвакцину и сухую культуральную вирусвакцину. Иммунизацию коров проводят (редко) медицинской осповакциной. Птиц прививают сухой эмбрионвирусвакциной 7 из штамма 27-А Ш.

Характеристика вируса лейкоза КРС. Патогенез инфекции. Лабораторная диагностика, пути заражения, профилактика.

Лейкоз крупного рогатого скота – хроническая инфекционная болезнь опухолевой природы, основной причиной которой – злокачественное разрастание клеток кроветворных органов с нарушением их созревания, в результате чего происходит диффузная инфильтрация органов этими клетками или появляются опухоли. Вирус открыт в 1969 году Миллером.

Возбудитель — вирус семейства Retroviridae, подсемейства онковирусы. Вирионы имеют специфическую форму; состоят из плюс нитивойРНК, внутренней белковой мембраны и липидсодержащей наружной оболочки, со спиральным типом симметрии, округлой формы, размеры 60-125.

Устойчивость: во внешней среде выживаемость невысокая — погибает при нагревании до 60 С за 1 минуту,быстро обезвреживается 2-35 растворами едкого натра. Инактивируется в молоке при нагревании до 74Св течение 17 секунд или при pH 4, 57.

Культивирование: онковирусы можно культивировать на животных и в культуре клеток. В культурах клеток не образуется ЦПД, но происходит трансформация. В настоящее время получены и широко используются перевиваемые хронически инфицированные ВЛКРС линии клеток: фибробласты легкого эмбриона коровы (АИД-15), почки эмбриона коровы (ПЭК); почки эмбриона овцы (FLK-BLV); легкого эмбриона летучей мыши (T61-Lu); легкого макаки-резус (BLV-Simian); селезенки овцы (FLS, J-1228); тимуса эмбриона коровы (ТЭК-МВА-766 LmTT).

Антигенный свойства: инфицированные вирусом животные вырабатывают антитела к нескольким вирионным антигенам. В сыворотке кровибольных животных обнаружены комплементсвязывающие антитела,направленные на четыре вирусных полипептида: р15, р24, р30 и р51. Антитела вырабатываются преимущественно на структурный белок 51 и принадлежат к иммуноглобулинам G, A, M. Наличие антител не предотвращает развития опухолей. Антитела к гликопротеидному антигену выявляют в РДП, они не защищают организм животного от заражения. Вирус лейкоза вызывает хроническую инфекцию опухолевой природы.

Эпизоотологические данные. Болеют как молодые, так и взрослые животные различных пород, но чаще в возрасте 4-8лет. На ранних стадиях болезни онковирус выделяется из организма коров с молозивом и молоком. Внутри стада возможны вертикальный и горизонтальный механизмы передачи возбудителя. Основной фактор его распространения — завоз животных из неблагополучных хозяйств. Заболеваемость — 3-20%, смертность — до 15%.

Патогенез. Патогенез лейкоза определяется взаимоотношение вируса и клетки. Болезнь чаще протекает в латентной форме. Основным признаком лейкоза является нарушение нормального процесса пролиферации и дифференциации клеток кроветворной ткани. Чаще поражаются лейкобластические клетки, что приводит к интенсивной пролиферации различных типов лейкоцитов в кроветворных органах, костном мозге, селезенке, лимфоузлах. Размножающиеся клетки крови неконтролируемо распространяются по организму и попадают в различные органы и ткани. Образующиеся опухоли вызывают изменение структуры и функции пораженных органов вследствие атрофии специфических клеток. Появляются нарушения на молекулярном, клеточном и органном уровнях, что приводит к расстройству кроветворения, увеличению количества лейкоцитов.

Клинические признаки. Инкубационный период при экспериментальном заражении — 60-750 суток, при спонтанном — 2-6 лет. В течении лейкозов выделяют предлейкозную, начальную, развернутую и терминальную стадии болезни. С развитием патологического процесса указанные стадии следуют одна за другой. В начальный период болезни при лейкемическом течении отмечают увеличение числа лейкоцитов в периферической крови(лейкоцитоз), а в дальнейшем — системное и регионарное увеличение лимфатических узлов, селезенки, нередко развивается геморрагический синдром. Характерны изменения картины крови — увеличение в крови незрелых кроветворных клеток, или лейкемия, лейкоцитоз и др.

Патолого-анатомические изменения. Системное увеличение лимфатических узлов, селезенки, разрастание опухолевой ткани в сердце, сычуге. Поражения костного мозга, печени, почек, легких, кишечника и до. При гистологическом исследовании пораженных органов устанавливают системной размножение кроветворных клеток различной степени зрелости, вплоть до недифференцированных,что характерно для опухолевого процесса.

Диагноз. Ставят на основании эпизоотологических данных, клинических признаков, патолого-анатомических изменений и результатов лабораторных исследований.

Лабораторная диагностика. Пат.материал: прижизненно — кровь с антикоагулянтом и без коагулянта, посмертно — кусочки пораженных органов.

экспресс-методы: электронная микроскопия, реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ основана на феномене активации лимфоцитов под влиянием стимулов (митогенов или антигенов) с последующей трансформацией их в бласты (большие делящиеся клетки). Эта реакция определяет пролиферативный потенциал изучаемых клеток.

Реакцию осуществляют следующим образом. К суспензии лимфоцитов или лейкоцитов крови (в последнее время чаще используют разведенную в 10-20 раз цельную кровь) приливают раствор митогена или антигена в концентрации, нетоксичной для клеток, но способной вызывать бласттрансформацию. Инкубируют в среде СО при 370С. По окончании культивирования эритроциты (в тех случаях, когда для реакции используют цельную кровь) лизируют и подсчитывают количество клеток, трансформировавшихся в бласты. Подсчет можно вести визуально в окрашенных мазках, однако морфологический метод учета может давать субъективные ошибки. Поэтому чаще учет результатов ведут по изменению радиоактивности культуры клеток в результате включения радиоактивного изотопа в клетки, входящие в митотический цикл (например, ^-тимидина), используя для этого автоматический сцин-тилляционный счетчик.

В качестве активаторов РБТЛ обычно используют фитогемагглютинин (ФГА), конканавалин А (Кон А), митоген лаконоса (МЛ), бактериальные липополисахариды (ЛПС), ферменты, стафилококковый экстракт и др.), РИФ, гематологический метод, РИД

серологический (РИФ, РИД), гематологический, патоморфологический и гистологический методы.

Иммунитет. Малоизучен. В организме зараженных животных с гематологическими и клиническими признаками болезни выявляют преципитирующие и комплементсвязывающие антитела.

Специфическая профилактика и лечение. Не разработаны.

источник

1. БОЛЕЗНИ, ОБЩИЕ ДЛЯ ВСЕХ ИЛИ НЕСКОЛЬКИХ ВИДОВ ЖИВОТНЫХ

1.6. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ОСПЫ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, ОВЕЦ, КОЗ, СВИНЕЙ И ВЕРБЛЮДОВ

УТВЕРЖДЕНЫ 12 ноября 1985 г., N 115-6а

1.1. Оспа — контагиозная болезнь животных, протекающая с признаками аутоинтоксикации, лихорадки и узелково-пустулезной сыпи на коже (экзантемы) и на слизистых оболочках (энантемы), проходящей определенные стадии формирования: розеола — везикула — папула — пустула — струп.

1.2. Оспа у разных видов животных вызывается следующими вирусами:

— крупный рогатый скот — оспы коров или осповакцины;

— овцы — оспы овец;

— козы — оспы коз;

— свиньи — оспы свиней, оспы коров или осповакцины;

— верблюды — оспы верблюдов, оспы коров или осповакцины.

1.3. Лабораторная диагностика оспы животных включает в себя:

— обнаружение в патологическом материале оспенных частиц (вирионов) методом вирусоскопии;

— обнаружение цитоплазматических ацидофильных включений в пораженных участках кожи больного или зараженного животного гистологическим методом;

— выделение вируса на куриных эмбрионах (КЭ) с последующей его идентификацией;

— биологическую пробу (в сомнительных случаях) на естественновосприимчивых животных.

2.1. Патологический материал отбирают не менее чем с 5 участков пораженной кожи. Для сбора и консервирования материала используют стерильные инструменты, посуду и консервирующие растворы.

Материал от больных животных, обработанных моющими или дезинфицирующими растворами (едкого натра и др.), к исследованию не пригоден.

2.2. Для исследования в лабораторию направляют:

— мазки, сделанные из содержимого везикул больного животного, и мазки-отпечатки с оспенных поражений кожи;

— патологический материал от больных животных (содержимое везикул, целые папулы и пустулы, иссеченные вместе с субэпидермальной отечной тканью).

2.3. Мазки высушивают на воздухе, складывая так, чтобы они не соприкасались между собой, и упаковывают в целлофан.

2.4. Везикулярную жидкость собирают в капилляры пастеровских пипеток, которые затем помещают в пробирки с резиновыми пробками.

2.5. Папулы и пустулы иссекают ножницами вместе с отечной тканью и помещают в два стерильных флакона: один — с 50%-ным раствором глицерина, второй — с 10%-ным раствором формалина.

2.6. Отобранный материал (пробирки и флаконы с патологическим материалом предварительно обрабатывают снаружи 3%-ным раствором хлорамина) упаковывают в металлические коробки или пеналы и направляют с нарочным в лабораторию. Неконсервированный материал доставляют в термосе со льдом в день отбора.

3.1. Для обнаружения вирусных оспенных частиц (вирионов) исследуют мазки и мазки-отпечатки из патологического материала окрашенные по методу Морозова или Пашена (см. приложение 1).

При микроскопии в препаратах обнаруживают множество мелких частиц кокковидной формы, расположенных поодиночке, парами или в виде скоплений. При окраске по Морозову оспенные частицы имеют темно-коричневый цвет, по Пашену — темно-красный.

3.2. Результат исследования считают положительным только при обнаружении вирионов в массовом количестве (в виде россыпей). При отрицательном результате вирусоскопического исследования, а также при обнаружении единичных вирионов проводят дальнейшие исследования.

4.1. Из фиксированных формалином проб кожи на замораживающем микротоме готовят срезы, которые окрашивают гематоксилин-эозином.

Ознакомиться с документом вы можете, заказав бесплатную демонстрацию систем «Кодекс» и «Техэксперт».

источник

Цель занятия: изучить методы диагностики оспы, систему профилактических и оздоровительных мероприятий.

Материалы и оборудование: плакаты, схемы, вакцины. Место проведения занятия: аудитория кафедры эпизоотологии.

Оспа — контагиозная вирусная болезнь млекопитающих и птиц многих видов, вызываемая представителями семейства Poxviridae.

Возбудитель оспы коров —ДНК-содержащий вирус из семейства Poxviridae, рода Orthopoxvirus. У коров оспу может вызывать как вирус истинной коровьей оспы, так и вирус осповакцины (вирус натуральной оспы человека).

Возбудитель оспы овец.ДНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Poxviridae, роду Capripoxvirus.

Диагностика и дифференциальная диагностика оспы коров.Диагноз ставят на основании эпизоотологических, эпидемиологических данных, клинических признаков и результатов лабораторного исследования. Для оспы коров характерны спорадическое проявление, локализация оспин, образующихся стадийно на коже вымени, совпадение во времени заболевания коров, людей и иммунизации населения против оспы.

В лабораторию для вирусологического исследования направляют содержимое папул или формирующихся везикул. Материал культивируют в развивающихся куриных эмбрионах или в культурах клеток, выделяют и идентифицируют возбудитель. Для гистологических исследований готовят тонкий мазок с поверхности срезанной папулы, подсушивают его на воздухе и окрашивают по Морозову. Обнаружение элементарных телец в окрашенных препаратах имеет диагностическое значение, а их отсутствие не служит основанием для исключения оспы. В этом случае испытуемым материалом заражают кроликов в роговицу (проба Пауля). При гистологическом исследовании пораженных участков роговицы обнаруживают тельца-включения Гварньери. В качестве экспресс-диагностики применяют РДП на предметном стекле с использованием содержимого оспенной сыпи и иммунной антивакцинальной кроличьей сыворотки.

Обнаружение элементарных частиц вируса в оспинах и телец Гварньери в пораженных участках роговицы экспериментально зараженных кроликов подтверждает диагноз на оспу коров.

При дифференциальной диагностике необходимо исключить ящур и паравакцину.

Иммунитет, специфическая профилактика.Постинфекционный иммунитет при оспе тканево-гуморальный и сохраняется пожизненно. Для специфической профилактики применяют живую вирус-осповакцину.

Профилактика.Для предупреждения возникновения оспы не допускают ввод (ввоз) в хозяйства крупного рогатого скота, а также кормов и инвентаря из хозяйств, неблагополучных по оспе коров. Поступающих из благополучных хозяйств животных карантинируют и подвергают клиническому осмотру. Постоянно содержат в надлежащем ветеринарно-санитарном состоянии животноводческие помещения, пастбища, места поения. Работников ферм, иммунизированных против оспы, освобождают от работы на животноводческих фермах сроком на 2 нед при нормальном течении прививочной реакции и до полного выздоровления при появлении осложнений.

Все поголовье крупного рогатого скота в хозяйствах и населенных пунктах угрожаемой по оспе коров зоны прививают живой вирус-осповакциной в соответствии с наставлением по ее применению.

Лечение.Больных животных изолируют в сухие теплые помещения и обеспечивают полноценное кормление. Специфические средства лечения при оспе коров не разработаны. Оспины размягчают нейтральными жирами и кремами (борная, цинковая, стрептоцидовая, синтомициновая и другие мази), молоко осторожно выдаивают. Язвенные поверхности обрабатывают прижигающими средствами и антисептическими растворами (настойка йода, буровская жидкость, 3%-ный раствор хлорамина). Слизистые оболочки промывают антисептическими и вяжущими растворами.

Меры борьбы.При установлении диагноза у крупного рогатого скота хозяйство объявляют неблагополучным и извещают об этом медицинскую службу и вышестоящие ветеринарные органы. В неблагополучном хозяйстве проводят специальные общесанитарные и ограничительные мероприятия, направленные на ликвидацию болезни. Больных животных изолируют, лечат и для ухода за ними закрепляют людей, вакцинированных и ревакцинированных против натуральной оспы и соблюдающих правила личной гигиены.

Через каждые 5 дней и после каждого случая выделения больного животного тщательно очищают и дезинфицируют помещения, используя для этого одно из средств: 4%-ный горячий раствор гидроксида натрия, 2%-ный раствор формальдегида, 20%-ный раствор свежегашеной извести (гидроксид кальция). Навозную жижу обезвреживают хлорной известью, смешивая в соотношении 5 : 1, а навоз — биотермическим способом или сжигают.

Молоко от больных и подозреваемых в заражении коров после пастеризации скармливают молодняку в том же хозяйстве. Молочную посуду, автоцистерны дезинфицируют 1%-ными растворами хлорамина или ги-похлорита натрия.

Ограничения при оспе коров снимают через 21 день после полного выздоровления больных животных и проведения заключительных ветеринарно-санитарных мероприятий.

Диагностика и дифференциальная диагностика оспы овец.Диагноз на оспу овец ставят на основании анализа эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных и результатов лабораторных исследований, включая биопробу.

При оценке эпизоотологических данных необходимо учитывать, что из домашних животных болезнь поражает только овец независимо от возраста и породы, а из диких — сайгаков и козерогов. Для подтверждения диагноза на оспу необходимо взять биоматериал — участок пораженной кожи, имеющий свежие папулы, пораженные легкие и лимфатические узлы.

При гистологическом исследовании в пораженных участках кожи находят серозно-клеточный экссудат, в котором преобладают лимфоциты, макрофаги со специфическими включениями, а также гранулоциты. Деструктивные изменения наиболее сильно выражены в подэпидермальном слое, граница между дермой и эпидермисом неразличима. При окрашивании специальными методами выявляют внутриклеточные включения Пашена.

При абортивном течении болезни ставят биопробу на овцах. Для этого исследуемый материал вводят в кожу подхвостовой складки.

При дифференциальной диагностике необходимо исключить экзему, грибной дерматит, чесотку и контагиозный пустулезный дерматит.

Иммунитет, специфическая профилактика.Переболевшие животные приобретают иммунитет не менее чем на 2 года. Для специфической профилактики оспы овец применяют культуральную вирус-вакцину из атте-нуированного штамма НИСХИ, которая создает у привитых животных иммунитет длительностью до 12мес.

Профилактика.Для предупреждения возникновения оспы овец необходимо: 1) не допускать ввода (ввоза) в хозяйство овец, а также кормов и инвентаря из хозяйств, неблагополучных по оспе овец; 2) всех вновь поступивших в хозяйство овец содержать изолированно в течение 30 дней; 3) поддерживать в надлежащем ветеринарно-санитарном состоянии пастбища, места поения, животноводческие помещения; 4) овцепоголовье хозяйств и населенных пунктов, находящихся в угрожаемой по оспе овец зоне, необходимо регулярно прививать противооспенной вакциной.

Лечение.Специфические средства лечения больных оспой овец не разработаны.

Меры борьбы.При возникновении оспы овец на хозяйство накладывают карантин, по условиям которого запрещаются: ввод и ввоз в неблагополучный пункт, вывод и вывоз из него животных всех видов, перегруппировка животных внутри хозяйства, а также выпас, водопой и содержание больных овец вместе со здоровыми животными всех видов; вывоз из неблагополучного пункта фуража, с которым соприкасались больные овцы; стрижка овец; торговля животными и продуктами животноводства, проведение выставок, ярмарок, базаров и других мероприятий, связанных со скоплениями животных на карантинированнои территории; проезд всех видов транспорта; доступ людей, не связанных с обслуживанием животных неблагополучных групп; использование овечьего молока в необез-зараженном виде.

В неблагополучных по оспе овец хозяйствах берут на учет все поголовье овец независимо от их принадлежности и подвергают их 1 раз в 10 дней клиническому осмотру. Выявляемых больных овец изолируют и при необходимости подвергают лечению симптоматическими средствами. Трупы овец, павших при наличии клинических признаков оспы, сжигают. Всех клинически здоровых овец прививают против оспы. В течение 14 дней привитые животные должны находиться под наблюдением ветеринарных специалистов. При выявлении среди привитого поголовья больных их переводят в отдельную группу и лечат.

После каждого случая падежа овец и уборки трупов, а также по окончании иммунизации овец все животноводческие помещения, загоны и другие места нахождения животных подвергают механической очистке с последующей дезинфекцией. Учитывая высокую устойчивость вируса оспы во внешней среде и неодновременное переболевание животных, дезинфекцию повторяют через каждые 5 дней в течение всего периода карантина. Для дезинфекции помещений используют горячие растворы щелочи, серно-карболовой смеси, 20%-ный раствор свежегашеной извести (гидроксид кальция), осветленный раствор хлорной извести или гипохлорита натрия, раствор формальдегида. Стены, заборы и различные деревянные ограждения следует обеззараживать свежеприготовленным раствором негашеной хлорной извести. Навоз обеззараживают в течение 3 нед. биотермическим способом.

В случае появления оспы овец в местностях, где ее не регистрировали в течение 3 лет и более, необходим немедленный убой всех овец неблагополучной группы (больных, подозрительных по заболеванию и подозреваемых в заражении). Убой производят на специально оборудованной убойной площадке с соблюдением ветеринарно-санитарных правил.

Санитарную оценку мяса и других продуктов убоя осуществляют согласно требованиям ветеринарно-санитарной экспертизы. Кожи, полученные при убое овец, дезинфицируют в растворе карболовой кислоты или эмульсии креолина в течение 24 ч, после чего просушивают. Вывоз овчин разрешается только после снятия карантина.

Шерсть и другое сырье животного происхождения, заготовленные до установления карантина, обеззараживают в паровой дезкамере при температуре 110 °С, а затем, после снятия карантина, в таре из плотной ткани вывозят на перерабатывающие предприятия.

Перед снятием карантина проводят заключительную дезинфекцию всех животноводческих помещений и территории выгульных дворов и загонов, где находились больные оспой овцы.

Карантин снимают в установленном порядке по истечении 20 дней после полного выздоровления, падежа или убоя последней больной овцы в неблагополучном пункте.

Контрольные вопросы к разделу «Оспа коров и овец».1. Дайте этиологическую классификацию оспы и оспоподобных болезней. 2. Охарактеризуйте стадии развития инфекционного процесса при оспенных болезнях. 3. Опишите клинические признаки оспы у животных разных видов (оспа коров, паравакцина, оспа овец и коз, оспа свиней, контагиозная эктима, миксоматоз кроликов). 4. Какой биоматериал необходимо отправить в лабораторию для вирусологической и серологической диагностики оспы животных? 5. Когда диагноз на оспу считают установленным? 6. Каковы особенности дифференциальной диагностики оспы и оспоподобных болезней от ящура, везикулярного стоматита и везикулярной болезни свиней? 7. Каковы лечение и специфические средства профилактики оспы у животных разных видов? 8. Назовите основные направления борьбы с оспой овец и коз.

ЗАДАНИЕ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

Решить эпизоотологические задачи.

Задача 1. В овцеводческом хозяйстве в одной отаре в осеннюю дождливую погоду среди овец всех возрастов возникло массовое заболевание, которое наиболее тяжело проявилось у молодняка. Болезнь начиналась угнетением, анорексией и лихорадкой. Одновременно отекали веки, появлялись серозно-слизистые и серрозно-гнойные выделения из глаз и носа. Через 2-3 дня с начала болезни обнаруживали сыпь на коже головы, губах и крыльях носа, вокруг глаз, на внутренних поверхностях передних и задних конечностей.

1. Установить диагноз, организовать лечение больных овец.

2. Разработать мероприятия по охране других отар от заноса

3. Составить план мероприятий по ликвидации данной инфекции в хозяйстве.

Задача 2. На птицеферме в одной секции возникло массовое заболевание птиц со следующими клиническими признаками: катаральное воспаление слизистых оболочек верхних дыхательных путей и ротовой полости. Через 2-.3 дня появились беловатые возвышающиеся наложения округлой формы и желто-белой окраски, которые, сливаясь друг с другом, образовывали наложения, напоминающие сыр и глубоко проникающие в слизистые оболочки.

2. Разработать план мероприятий по профилактике болезни в остальных птичниках и ликвидации эпизоотического очага.

Дата добавления: 2017-02-28 ; просмотров: 969 | Нарушение авторских прав

источник

Оспа млекопитающих и птиц – острая контагиозная болезнь, протекающая с характерными стадийными поражениями кожи различных участков тела и слизистых оболочек.

Особенностью патологических изменений при оспе является их стадийность: розеола (локальное покраснение участка кожи), папула (уплотнение участка кожи за счет клеточной инфильтрации), везикула (наполнение его везикулярной серозной жидкостью), пустула (переход серозного воспаления в гнойное) и круста (появление корочек на месте поражения). У птиц, кроме того, выделяют дифтеритическую форму с фибринозным поражением слизистой оболочки носовой и ротовой полостей.

Возбудителями оспы животных являются вирусы из семейства Poxviridae, подсемейства Chordopoxvirinae различных родов: Orthopoxvirus – возбудители оспы у коров, человека, лошадей, кроликов и др., Avipoxvirus – птиц (прежде всего кур), Capripoxvirus – овец и коз, Suipoxvirus – свиней, Leporipoxvirus – вирусы миксомы и фибромы кроликов, Parapoxvirus – параоспенные вирусы. Вирусы различных родов отличаются по биологическим свойствам, главным из которых является спектр патогенности – первый из названных считается полиэтиологическим, то есть способным вызывать оспу у широкого спектра хозяев.

Все оспенные вирусы являются ДНК-геномными и содержат в составе вириона фермент для собственной транскрипции. В этой связи все вирусы данного семейства, не нуждаясь в клеточных ферментах транскрипции, реплицируются в цитоплазме клеток. Другими отличительными особенностями вирусов оспы является их большой размер, сопоставимый с размерами мельчайших бактерий, и они могут быть обнаружены световой вирусоскопией. Для вирусов оспы характерно наличие сложного типа симметрии, который обусловлен присутствием двух дополнительных структур, входящих в состав вириона. Они представляют собой мембраны, наружная из которых большей толщины и имеющая большое количество полых винтообразных филаментов. Нуклеоид в центре вириона имеет характерную двояковогнутую форму. Все вышеотмеченные особенности строения придают зрелому вириону оспы характерную кирпичеобразную форму (обнаруживается в электронном микроскопе).

Вирусы млекопитающих довольно сложно культивировать в лабораторных условиях: на ХАО развивающихся куриных эмбрионов они с трудом культивируются после предварительной адаптации с образованием характерных оспин, способны репродуцироваться в культурах клеток почек и тестикул эмбриона. Лучшим объектом для культивирования вирусов оспы млекопитающих являются естественно восприимчивые животные.

В антигенном отношении различные вирусы оспы млекопитающих идентичны в пределах родов. В основном вирусы оспы млекопитающих гемагглютинирующими свойствами не обладают; вирусы оспы птиц способны агглютинировать эритроциты кур отдельных пород, однако РТГА и РГА в практике используют очень редко.

Диагноз на оспу ставят клиническим методом, однако для его подтверждения проводят лабораторное исследование.

Отбор патматериала. Для исследования берут содержимое везикул и пустул, поверхность которых предварительно очищают ватным тампоном, смоченным в эфире или спирте. Прокол и отбор везикулярной жидкости проводят с помощью пастеровской пипетки, после чего конец ее запаивают. Папулы соскабливают скальпелем. Патологический материал должен быть доставлен в лабораторию в замороженном или охлажденном (4-6ºС) виде. Также его допускается консервировать в 10%-ном растворе глицерина.

Одновременно с отбором патматериала на месте готовят мазки из везикулярной и пустулезной жидкости для последующего вирусоскопического исследования. Для этого поверхности везикул или пустул осторожно срезают бритвой и внутренней поверхностью среза однократным движением проводят по предметному стеклу. После приготовления мазки высушивают на воздухе.

Также отбирают материал из измененных участков кожи на границе с неизмененной для гистологического исследования, который помещают в 10%-ный раствор формалина.

Подготовка материала заключается в получении суспензии для заражения животных. Готовят 10%-ную суспензию на физиологическом растворе, после чего ее центрифугируют при 2 тыс об/мин в течение 15 мин. Затем к надосадочной жидкости добавляют 500 ЕД/мл пенициллина, 250 мкг/мл стрептомицина, 50 ЕД/мл нистатина и выдерживают 12 часов при 4ºС.

Лабораторная диагностика оспы заключается в:

— обнаружении возбудителя в мазках методом световой микроскопии;

— постановке биопробы на животных (в случае получения отрицательного или сомнительного результата первого метода).

Обнаружение вируса в патматериале осуществляют методом световой вирусоскопии препаратов-отпечатков, окрашенных по Морозову. В положительном случае в мазках из пораженных участков кожи обнаруживают характерно расположенные вирионов в виде россыпи.

Одновременно с обнаружением элементарных телец параллельно проводят гистологическое исследование материала из пораженных участков. При этом обнаруживают цитоплазматические оксифильные (оспа овец и коз) или ацидофильные (оспа свиней) включения, внутриядерные вакуоли, гиперплазию эпидермиса кожи.

Положительный результат вирусоскопического исследования дает основание на постановку окончательного диагноза на оспу. При получении сомнительного или отрицательного результатов вирусоскопии проводят постановку биопробы на естественно восприимчивых животных.

Биопроба в диагностике оспы млекопитающих заключается в заражении естественно восприимчивых животных, причем выбор объекта заражения зависит от вида животных, у которых диагностируют болезнь. В качестве тест- объекта для постановки биопробы используют молодых неиммунных овец и коз, поросят 2-3- месячного возраст или кроликов. Экспериментальных животных заражают внутрикожно в бесшерстную поверхность хвоста в дозе 0,1-0,15 мл (овцы, козы) или путем скарификации надосадочной жидкостью в объеме 0,6 мл в кожу живота (свиньи) или на поверхность роговицы глаза (кролик). Биопробу считают положительной в случае развития на месте введения местного оспенного процесса через 6-8 дней. Специфичность патологического процесса в ходе постановки биопробы подтверждают вирусоскопическим исследованием мазков, приготовленных из срезанного оспенного узелка.

Кроме вирусоскопического метода в практике рекомендовано использование РИД для обнаружения вирусного антигена в патматериале.

Серодиагностику и ретроспективную диагностику оспы проводят редко.

Лабораторная диагностика оспы птиц. Для исследования в лабораторию направляют свежие оспенные поражения с лицевой части головы (гребень, бородки, сережки) или свежие дифтеритические поражения гортани и трахеи. Одновременно с отбором патматериала для вирусологического исследования готовят мазки из пораженных участков для вирусоскопического исследования. Фиксацию мазков проводят на месте, помещая их в смесь спирта и эфира на 3 мин.

Лабораторная диагностика оспы птиц включает:

— обнаружение вирионов в мазках из патматериала;

— выделение вируса на РКЭ и курах с последующей его идентификацией;

— выявление специфических антител в крови переболевшей птицы.

Обнаружение вирионов оспы птиц (элементарные тельца Борреля) проводят при исследовании вирусоскопическим методом мазков, окрашенных по Морозову. Параллельно с обнаружением вирионов оспы исследуют мазки, получаемые путем раздавливания оспенных поражений между двумя стеклами и окрашенные суданом III в течение 10-15 мин. В положительных случаях обнаруживают специфические тельца-включения (тельца Боллингера) в цитоплазме клеток.

Выделение вируса оспы птиц осуществляют путем заражения 10%-ной суспензией, свободной от микрофлоры, развивающихся куриных эмбрионов. Для этого предварительно готовят разведения суспензии (10 -2 и 10 -3 ) и заражают четырех эмбрионов на ХАО в объеме 0,2 мл. Погибшие эмбрионы на 3-е сутки, а также выжившие на 6-е сутки охлаждают и вскрывают. В положительных случаях на ХАО обнаруживают отдельно расположенные или слившиеся оспины.

Выделение вируса оспы птиц также осуществляют путем постановки биопробы на курах 3-4- месячного возраста, которых заражают путем втирания суспензии в скарифицированную поверхность гребня, бородок, а также свободные от перьев фолликулы голени. Специфичность оспенных поражений у экспериментально зараженной птицы подтверждают вирусоскопическим методом.

Идентификацию вируса проводят в РИД или РИФ. Указанные серологические реакции могут также быть использованы для обнаружения и идентификации вируса непосредственно в патматериале.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика оспы птиц заключается в обнаружении специфических антител реакцией иммунодиффузии в агаровом геле. Антигеном в реакции служат хорион-аллантоисные оболочки, собранные на 4-5-й день после заражения развивающихся куриных эмбрионов.

Лейкоз крупного рогатого скота — хроническая инфекционная болезнь опухолевой природы, при которой происходит злокачественное размножение клеток кроветворных органов, в результате чего наблюдается диффузная инфильтрация внутренних органов инфицированными клетками. Лейкоз в основном встречается у взрослых животных, наиболее часто в возрасте 5-8 лет. При этом развитие болезни характеризуется стадийностью: инкубационный период, бессимптомная стадия (серологическая), гематологическая и опухолевая. Инкубационный период при лейкозе варьирует в больших временных промежутках. На клеточном уровне представляет собой период инфекции после заражения до появления антител. В этот период происходит инфицирование лимфоцитов и нахождение провируса в интегрированном состоянии.

Серологическая стадия характеризуется выработкой антител со стороны организма и продолжается до момента начала усиленного размножения инфицированных лимфоцитов. При опухолевой стадии происходит инфильтрация внутренних органов инфицированными лимфоцитами – диффузно или локально с появлением опухолей. При этом в патологический процесс может вовлекаться костный мозг или лимфоидная ткань, что дало возможность разделять две группы лейкозов. В связи с тем, что неопластической трансформации подвержены различные популяции лимфоцитов, выделяют несколько форм лейкозов. К первой группе лейкозов (с локализацией патологического процесса в костном мозге) относят лимфоидный, миелоидный, слабодифференцированный и недифференцированный лейкозы. К болезням второй группы (с локализацией патологического процесса в лимфоидной ткани) относят лимфосаркому, ретикулосаркому и лимфогранулематоз.

Возбудителем лейкоза КРС является вирус из семейства Retroviridae рода Deltaretrovirus. Все вирусы, входящие в данное семейство, имеют в составе вириона фермент — обратную транскриптазу — обеспечивающий синтез молекулы ДНК на молекуле РНК. Другой отличительной особенностью ретровирусов является их репликация через стадию образования двунитчатой молекулы ДНК (провирус) на вирусной РНК при участии вышеотмеченного фермента с последующей ее интеграцией в клеточный геном клетки-мишени. Созревание вирионов происходит путем почкования на клеточных мембранах, чаще без разрушения клеток-хозяев.

В жизненном цикле вируса лейкоза КРС (ВЛКРС) выделяют две его формы: эндогенную и экзогенную. Первая из них представляет собой интегрированный вирусный геном в геном клетки (состояние провируса). Распространение эндогенной формы вируса в организме животного происходит при делении инфицированной клетки и представляет собой передачу вирусного генетического материала дочерним клеткам. Данный путь распространения называется вертикальным неинфекционным путем распространения. Экзогенный онковирус представляет собой зрелую вирусную частицу, распространяющуюся горизонтальным путем (от животного к животному) и вертикальным инфекционным, который в отличие от вертикального неинфекционного характеризуется заражением половых клеток или клеток эмбриона от матери.

В составе вириона присутствуют несколько групп белков, наиболее важными из которых в антигенном отношении является внутренний вирионный белок р24, а также наружный структурный гликопротеин gp51. На наличие внутреннего антигена в организме формируются преципитирующие антитела, а поверхностного гликопротеидного антигена – вируснейтрализующие антитела. Клеткой-мишенью для ВЛКРС является В-лимфоцит, реже – Т-лимфоцит, в геном которых одновременно интегрируется около трех копий ДНК-провируса Провирус изменяет экспрессию клеточных генов, в частности onc гена, вблизи которого происходит интеграция вирусной нуклеиновой кислоты. В результате активизации onc гена начинается усиленное размножение лимфоцитов (трансформация). Кроме того, провирус способен длительно персистировать в организме в интегрированном состоянии. В этом виде вирус обычно защищен от действия антител. Защита организма от инфицирования обусловлена выработкой на поверхностные вирионные гликопротеиды (главным образом gp51) вируснейтрализующих антител. Однако даже при их наличии возможно сохранение и размножение вируса в лимфоцитах, инфильтрирующих ткани в местах, не доступных для действия противовирусных антител.

Лабораторная диагностика лейкоза КРС включает в себя серологическое, гематологическое и гистологические исследования.

Отбор патматериала. Для гематологического исследования берут пробы крови из яремной вены, стабилизированные 10%-ным раствором ЭДТА из расчета 0,02 мл (1 капля) на 1 мл крови. Для гематологического исследования отбирают пробы крови от животных старше 2 лет. Не разрешается брать кровь от животных 15 дней до отела и 15 дней после него.

Для серологического исследования отбирают пробы сывороток крови от животных старше 6-месячного возраста. При этом в лабораторию направляют 5-6 мл сыворотки в термосе со льдом. Для гистологического исследования отбирают пробы пораженных органов и посылают в свежем виде в термосе со льдом или консервируют 10%-ным формалином.

Серологический метод заключается в постановке РИД в агаровом геле, с помощью которой выявляются противолейкозные антитела в сыворотке крови. Животных, сыворотки которых дали положительный результат в РИД, считают инфицированными вирусом лейкоза, после чего их дополнительно исследуют гематологическим методом.

Гематологический метод основан на обнаружении в периферической крови повышенного количества лейкоцитов, главным образом, лимфоидного ряда и слабо дифференцированных клеток.

Повышенное количество лейкоцитов устанавливается путем их подсчета в камере Горяева после обработки крови жидкостью Тюрка по обычной методике. При обнаружении лейкоцитоза из этой же пробы крови готовят мазок на стекле, окрашивают одним из методов (по Романовскому-Гимзе, Паппенгейму, Нохту) и выводят лейкограмму. После этого высчитывают абсолютное число лимфоцитов в крови путем умножения количества лейкоцитов на процент лимфоцитов в лейкограмме. Интерпретацию результатов проводят с использованием лейкозного ключа.

Гистологический метод является вспомогательным в диагностике лейкоза и основан на обнаружении инфильтрации внутренних органов лимфоцитами различных популяций. Гистологический метод дает возможность дифференцировать различные формы лейкоза.

Животное считается больным лейкозом при наличии:

— положительного результата однократного гематологического исследования;

— клинических признаков болезни;

— положительного результата гистологического исследования патологического результата.

источник

Использование в вирусологии лабораторных животных. Устройство вивариев, правила техники безопасности при работе с лабораторными животными.

4.1 Виды лабораторных животных. Наиболее широко в вирусологических лабораториях применяют мышей, бе­лых крыс, кроликов, морских свинок, хомяков, цыплят. У молодых мышей экс­периментально воспроизводят грипп, альфа- и флавивирусные инфекции, ящур (на новорожденных мышатах) и др. Они восприимчивы ко многим вирусам, их легко разводить и с ними удобно работать. Лучше использовать мышей инбредных линий, так как они почти одинаково реагируют на тот или иной вирус. У крыс также создают инбредные линии, но эти животные более устойчивы к оп­ределенным вирусным инфекциям, чем мыши. Онкогенность некоторых виру­сов широко изучают на золотистых хомячках. Для вирусологических опытов обычно используют гладкошерстных морских свинок массой 250–300 г.

Ту или иную инфекцию иногда изучают на животных нескольких видов, об­ладающих разной чувствительностью к данному вирусу, что позволяет диффе­ренцировать вирусы, вызывающие клинически сходные симптомы болезни (на­пример, ящур, везикулярный стоматит, везикулярная экзантема и везикулярная болезнь свиней).

По генетическим качествам лабораторных животных делят на четыре группы:

1) животные смешанного происхождения, полученные от разных животноводов, такие животные гетерогенны;

2) животные, полученные непосредственно из од­ного источника, однако генетически такие животные вариабельны;

3) инбредные линии животных. Их получают в результате спаривания брата с сестрой или родителей с детьми по крайней мере не менее 20 поколений. При таком методе разведения достигается все возрастающая степень гомозиготности.

4) однородные гибриды F₁. Высокая степень гетерозиготности, характерная для каждого гибрида, связана здесь с генетическим однообразием, которое соответствует степени гомозиготности родительских линий. Как правило, однородные гибриды F₁ менее изменчивы, чем обе родительские ли­нии. Животные-мутанты имеют отдельно выраженный наследственный фактор, который обусловливает видимое отклонение от нормальной формы.

Отрицательная сторона выделения вируса на лабораторных животных – воз­можность диагностических ошибок вследствие активации скрытого вирусоносительства. В этом случае развитие симптомов болезни после введения матери­ала не следствие действия введенного вируса, а результат самой процедуры, на­рушающей предшествующее равновесие в организме. В это время проявляется вирус или другой инфекционный агент, длительно персистирующий в организ­ме. Выражается это резкими неврологическими симптомами (повороты вдоль длинной оси тела).

Наличие скрытой вирусной инфекции может также выражаться уменьшени­ем или исчезновением чувствительности животных к исследуемому вирусу вслед­ствие явления интерференции. Возможен и противоположный эффект, а имен­но – явление синергизма в действии вирусов, что дает иногда результаты, труд­ные для правильной интерпретации.

Для некоторых вирусологических работ, например при выделении вируса с невыясненными болезнетворными свойствами, необходимо использовать гнотобиотов. Термин «гнотобиоты» объединяет две категории животных: безмик­робных (стерильных), не содержащих никаких жизнеспособных микробов, и гнотофор – носителей одного (моногнотофоры), двух (дигнотофоры) или более (полигнотофоры) микроорганизмов. В настоящее время безмикробные животные по динамике роста делятся на три группы: I – обезьяны, поросята, цыплята растут лучше обычных животных или наравне с ними; II – крысы, мыши, собаки, кошки растут наравне с обычными животными; III – морские свинки, кролики, козлята, ягнята растут хуже обычных животных.

Стерильных птиц получают посредством инкубации яиц со стерильной скор­лупой в стерильном инкубаторе, лабораторных животных – путем кесарева се­чения или гистерэктомии. Содержат животных в стерильных изоляторах. Воз­дух, вода и корм должны быть стерильными.

Особое значение среди гнотобиотов занимают СПФ-животные (Specific pathogen free), которые свободны только от патогенных микроорганизмов. В их организме имеются все необходимые для нормальной жизнедеятельности бактерии и ви­русы, которые в совокупности создают группу так называемой резидентной (по­лезной) микрофлоры. В настоящее время получены лабораторные СПФ-живот­ные – крысы, морские свинки, кролики, поросята, птицы и др.

4.2 Цели использования лабораторных животных. В настоящее время лабораторных животных используют в вирусологии для:

– обнаружения вируса в патматериале;

– первичного выделения вируса из патматериала;

– накопления вирусной массы;

– поддержания вируса в лаборатории в активном состоянии;

– получения гипериммунных сывороток;

– в качестве тест-объекта в реакции нейтрализации.

В вирусологии используют кроликов, морских свинок, белых крыс, белых мышей, золотистых хомячков. Однако только некоторые вирусы удается культивировать на животных перечисленных видов. Во многих случаях для тех же целей используют других чувствительных к данному вирусу животных: кур, голубей, котят, щенков и т. д. Так, биопробу при диагностике оспы птиц ставят на курах, оспы овец – на овцах, чумы свиней – на подсвинках.

4.3 Требования к лабораторным животным.Комплектуя группы животных для вирусологических исследований, необходимо выполнять следующие требования:

– животное должно быть чувствительным к данному вирусу;

– возраст его имеет большое значение для культивирования многих вирусов. Большинство вирусов лучше размножается в организме молодых и даже новорожденных животных. Например, для биопробы на бешенство и ящур используют мышей-сосунов, на ларинготрахеит птиц – цыплят. Но в то же время заражение взрослых кроликов вирусом болезни Ауески ведет к появлению ярких и специфичных клинических признаков заболевания;

– стандартная чувствительность достигается подбором животных определенного возраста и одинаковых по массе;

– лабораторные животные должны быть здоровы. Животные, поступающие в виварий вирусологической лаборатории, должны быть привезены из благополучного по инфекционным заболеваниям хозяйства. Их содержат изолированно, т. е. в карантине (белых мышей и крыс 14 дней, а остальных животных 21 день). В этот период за животными ведут ежедневное клиническое наблюдение. При подозрении на наличие инфекционной болезни животных подвергают лабораторному исследованию. В случае установления инфекционного заболевания среди животных всю поступившую партию уничтожают.

4.4 Содержание лабораторных животных. Виварий для лабораторных животных должен иметь основное помещение для животных, моечную (с боксом, сушиль­ными и стерилизационными установками), кухню для приготовления корма с одним по крайней мере столом, оборудованным для приготовления корма, и холодильником для скоропортящихся продуктов, кладовую, операционную, гар­дероб и санитарное помещение для обслуживающего персонала. Помещения должны быть чистыми. Стены и полы легко дезинфицируемыми. Запасы корма следует хранить в специальных помещениях. В местах содержания опытных животных желательно иметь гигрометр и термометр.

Мышей, крыс, хомяков и морских свинок в период опыта рекомендуется содержать в стеклянных банках с крышкой из проволочной сетки или перфори­рованного листового железа. Это облегчает наблюдение за ними, а банки легко чистить и дезинфицировать. Можно содержать животных в металлических клет­ках, которые также легко дезинфицировать.

В качестве подстилки применяют материалы, которые адсорбируют влагу и могут быть использованы животными для постройки гнезда: стружку для мы­шей, крыс, хомяков, морских свинок, хорьков, кур; опилки для крупных мы­шей, крыс, хомяков, хорьков, кур; солому для хомяков, морских свинок, кроли­ков, собак, кур; мякину для мышей, крыс; сено для мышей, крыс, хомяков, хорьков, кур; песок для кур. Следует использовать такую подстилку, которая образует как можно меньше пыли, так как последняя может привести к заболева­нию органов дыхания. Любую подстилку необходимо предварительно стерили­зовать при 100 °С в течение 30 мин.

Помещения для лабораторных животных периодически дезинфицируют, осо­бенно перед размещением новой партии животных. Это относится и к предме­там ухода за животными (лопаты, скребки, метелки и др.), которые соприкаса­ются с навозом и различными отбросами из помещения. После окончания каж­дого опыта клетки обязательно обрабатывают дезинфицирующими растворами, чему должна предшествовать чистка как клеток, так и помещения.

Посуду для корма и воды ежедневно смачивают дезинфицирующим раствором, после чего моют и споласкивают чистой водой. Помещения обрабатывают 1% раствором едкого натра, который используют в течение суток. Дезковрики пропитывают свежим раствором каждые 2 дня. Для дезинфекции предме­тов ухода, мытья полов и посуды рекомендуется использовать 3% раствор хлорамина, который должен быть применен в течение 2 ч. В виварии необходи­мо уничтожать вредителей: мух, комаров, блох, власоедов, клещей, вшей, му­равьев, мышей, крыс.

Лабораторных животных размещают так, чтобы, с одной стороны, было обеспечено функционирование всех систем организма в пределах физиологической нормы, с другой – исключено взаимное перезаражение и распространение инфекции за пределы вивария. Животных содержат в виварии с учетом их физиологической потребности в освещенности и температуре. Так, мышам, крысам нужны полумрак и температура воздуха около 20 °С, морским свинкам, кроликам и курам – дневной свет и температура в пределах 16–23, 14–18 и не ниже 0°С соответственно. Плотность посадки должна составлять примерно 1 г массы лабораторных животных на 1 см 2 дна клетки. Животных обеспечивают регулярным и полноценным кормлением и постоянно питьевой водой.

Если виварий один, зараженных животных содержат изолированно от здоровых и с последних начинают уборку помещения и кормление. Для ухода за зараженными животными используют отдельный инвентарь и кормушки. Лучше иметь два вивария: для содержания здоровых и зараженных животных.

Обслуживающий персонал при работе в виварии пользуется спецодеждой: халатом, резиновыми перчатками, фартуком, непромокаемой обувью. В виварии ежедневно дезинфицируют инвентарь и проводят влажную уборку с применением дезинфицирующих веществ. По окончании эксперимента клетки дезинфицируют, погибших животных обезвреживают сжиганием в печах или автоклавированием.

В группу для проведения опыта подбирают животных с одинаковыми показа­телями массы, температуры, состава крови и т. д. От этого в значительной степени зависит успех выделения, титрования и пассирования вируса. При этом учитывают восприимчивость животных к различным вирусам. Отобранных животных метят, распределяют по банкам или клеткам, отмечают дату постановки опыта, его номер, заражающую или профилактическую дозу препарата и, если необходимо, как мечены животные. Последнее важно, когда в одной банке или клетке находятся животные нескольких групп.

Масса животных в разном возрасте

* Масса кроликов зависит от величины помета: первые цифры при помете из 8 кроликов, вторые – при помете из 3 кроликов.

Выписывая из питомника беременных животных, особенно мышей, следует учитывать, что самки первое потомство нередко уничтожают. Поэтому лучше брать животных, беременных 2–3-й раз. Беременных белых мышей и крыс сле­дует брать в виварий не позже чем за 2–3 дня до родов, а кроликов и морских свинок – за 15 – 20 дней. Перемещение животных в более поздние сроки бере­менности приводит к аборту.

Для предупреждения каннибализма и аборта беременных мышей размешают по 2 – 3 в банку, а белых и хлопковых крыс, морских свинок и кроликов – по одной. Клетки для морских свинок должны быть размером 0,3 х 0,5 м. а для кроликов – 0,75 х 1,0 м. Маток, проявляющих каннибализм, надо немедленно удалять из гнезда. На каждую матку (белую мышь, белую крысу) должно приходиться не более 10–12 новорожденных Большая нагрузка способствует канни­бализму. При проведении с молодыми животными длительных опытов (особен­но зимой) в пищу мышей необходимо добавлять витаминизированный рыбий жир, а в рацион хлопковых и белых крыс – молоко и мясо.

Температура тела, пульс и число дыханий у здоровых животных

Состав крови некоторых лабораторных животных (по В.Н.Никитину)

Проявлению каннибализма в значительной мере способствуют посторонние запахи, приобретаемые новорожденными в ходе манипулирования с ними экс­периментатора Новорожденных животных следует брать только прокипячен­ным пинцетом Экспериментатор должен работать в перчатках, с которых смы­ты следы антисептика (йода, фенола и др.) Заражать новорожденных животных лучше на весу или на толстом слое стерильной фильтровальной бумаги.

В группу для проведения опыта подбирают животных с одинаковыми показа­телями массы, температуры, состава крови и т. д. (табл. 1-3). От этого в значительной степени зависит успех выделения, титрования и пассирования вируса. При этом учитывают восприимчивость животных к различным вирусам Отобранных животных метят, распределяют по банкам или клеткам, отмечают дату постановки опыта, его номер, заражающую или профилактическую дозу препарата и, если необходимо, как мечены животные Последнее важно, когда в одной банке или клетке находятся животные нескольких групп.

4.5 Техника безопасности при работе с лабораторными животными.Прежде всего, сотрудники должны быть защищены от естественных инфекционных болезней животных и от воспроизводимых на них экспериментальных инфекций, возбудители которых патогенны для человека.

Наиболее часто встречается среди лабораторных животных такая естественная инфекция, как сальмонеллез. Заразившиеся люди переносят заболевание в гастроинтестинальной или тифоподобной (генерализованной) форме. Опасность для людей представляют также листериоз, псевдотуберкулез, туберкулез, туляремия.

Поскольку многие инфекционные болезни животных протекают в бессимптомной персистирующей форме, животных необходимо периодически обследовать.

Источником инфицирования людей могут служить экспериментально зараженные животные и их эктопаразиты. Профилактика заражения людей от животных проводится с учетом возможного пути передачи данного возбудителя. Состояние здоровья сотрудников лаборатории находится под медицинским контролем с учетом особенностей инфекции, с возбудителем которой работают сотрудники.

При работе в лаборатории с вирусами бешенства, клещевого энцефалита, инфекционного гепатита и некоторыми другими инфекциями сотрудникам делают прививки против этих болезней. В случае необходимости проводят экстренную профилактику специфическим иммуноглобулином или сывороткой реконвалесцентов. Одновременно осуществляют весь комплекс противоэпидемических мероприятий, необходимый при данной инфекционной болезни.

4.6 Метка лабораторных животных.Метка является непременным условием использования животных в эксперименте. На клетке, в которой помещены зараженные животные, укрепляют бирку с надписью, отражающей использованный для заражения вирус (или номер экспертизы исследуемого патологического материала), количество зараженных животных, дату заражения и, если надо, другие сведения.

Для животных разных видов применяют разные способы индивидуальной метки. Для крупных животных и кур используют металлические бирки со штампованным номером. Бирки надевают на корень уха (кроликам), вставляют в ушную раковину по типу серьги (морским свинкам), надевают на ногу – окольцовывают (курам).

При использовании в эксперименте небольшой группы животных и при непродолжительном сроке его можно выстригать шерсть знаками на спине, бедрах (у кроликов). Морских свинок можно различать по окраске, которую регистрируют в рабочем журнале.

Метка белых мышей, белых крыс может быть проведена ампутацией отдельных пальцев на передних или задних конечностях, каждый из которых соответствует тому или другому порядковому номеру: на передних лапах – единицам, на задних – десяткам. Однако чаще пользуются методом нанесения цветных пятен на непигментированную шерсть. Насыщенный раствор пикриновой кислоты лучше других красителей (растворов фуксина, бриллиантовой зелени) удерживается на шерсти и коже животных. Цветные метки ставятся в местах, соответствующих определенному порядковому номеру животного. Так, если тело животного мысленно разделить на три продольные части (левый бок, спина, правый бок), то нанесение цветных пятен начинают с левого верхнего угла, т. е. лопатки, и это будет соответствовать 1 (рис. 8). Тогда, двигаясь назад, левый бок соответствует 2, а левое бедро – 3, далее затылок – 4, спина – 5, область репицы – 6, правое плечо – 7, правый бок – 8, правое бедро – 9. Используя два цвета красителей, можно дать обозначения одним из них – единиц, другим – десятков.

Рисунок 8. Метка лабораторных животных

14. Использование в вирусологии куриных эмбрионов. Строение куриного эмбриона.

.1 Достоинства и недостатки куриных эмбрионов как биологических объектов. Культивирование вирусов в куриных эмбрионах – наиболее доступный и удобный метод как для первичного выделения вирусов от больных животных и из объектов внешней среды, так и для последующего культивирования вирусов в лаборатории. Этот метод широко применяется для идентификации вирусов и антител, а также для приготовления вакцин и диагностикумов. Практика приме­нения показала ряд преимуществ этого метода перед культивированием вирусов на лабораторных животных. Известно, что белые мыши, которых широко ис­пользуют при вирусологических исследованиях, могут быть спонтанно зараже­ны рядом вирусных инфекций: эктромелией, лимфоцитарным хориоменингитом, энцефалитом Тейлора, вирусной пневмонией, вирусом Сендай и другими, что крайне осложняет работу и нередко приводит к ошибочным выводам при оценке получаемых результатов. Культивирование вирусов на куриных эмбрио­нах в значительной мере устраняет указанные выше трудности. Наряду с этим от куриного эмбриона можно получить значительно большее количество вируса, чем от лабораторных животных. Куриный эмбрион обладает большей жизнеспо­собностью и устойчивостью к разного рода воздействиям, неизбежным при вве­дении исследуемого материала. При известном навыке работы с эмбрионами и соблюдении правил асептики гибель их незначительна. Наибольший отход эмб­рионов бывает при введении материала в амниотическую полость и желточный мешок, но и в этих случаях она не превышает 10–15%, если соблюдены необхо­димые условия инкубирования.

Куриные эмбрионы как живая система вошли в вирусологическую практику в 30-х годах XX в. Их использование расширило спектр культивируемых в лабораторных условиях вирусов, позволило более успешно решать стоящие перед вирусологией задачи в связи с тем, что куриные эмбрионы имеют ряд преимуществ перед лабораторными животными: 1)скорлупа и подскорлупная оболочка надежно защищают эмбрион от бактериального заражения со стороны внешней среды; 2) важным преимуществом эмбрионов является также их высокая чувствительность к широкому спектру вирусов, что объясняется недостаточным развитием защитных механизмов; 3) куриные эмбрионы легкодоступный объект в связи с развитием широкой сети птицефабрик и инкубаториев; 4) куриные эмбрионы экономичны, не требуют ухода и кормления.

Основными недостатками являются: 1) невозможность полностью гарантировать стерильность этой живой системы, так как эмбрионы могут нести в своем содержимом вирусы и другие патогенные агенты (вирусы инфекционного бронхита кур, ньюкаслской болезни, гриппа, лейкоза, хламидии и микоплазмы). Их присутствие может искажать результаты исследования; 2) куриные эмбрионы чувствительны не ко всем вирусам.

7.2 Цели использования куриных эмбрионов. Используют куриные эмбрионы в вирусологии в основном для тех же целей, что и лабораторных животных, а именно:

– обнаружения в патматериале активного вируса биопробой;

– первичного выделения вируса. Эффективно выделяют и культивируют на куриных эмбрионах вирусы, вызывающие заболевания у птиц, а также некоторые вирусы млекопитающих;

– поддержания вирусов в лаборатории;

– накопления вируса для лабораторных исследований и получения вакцин;

– как тест-объект в реакции нейтрализации.

7.3 Требования к куриным эмбрионам.Яйца необходимо получать из благополучных по вирусным болезням хозяйств. В оплодотворенных яйцах даже от клинически здоровых кур могут находиться различные встречающиеся у этих птиц вирусы: ньюкаслской болезни, инфек­ционного бронхита, инфекционного ларинготрахеита, энцефаломиелита, парагриппа-2, полиартрита, оспы, арбовирусы, аденовирусы и др. Присутствие этих вирусов может, с одной стороны, привести к диагностическим ошибкам, а с другой, на основе явления интерференции, – к подавлению размножения виру­са, находящегося в исследуемой пробе. Эмбрионы, не содержащие вируса, но полученные от кур, бессимптомно за­раженных определенными вирусами, также могут быть менее чувствительны или абсолютно нечувствительны к действию данного вируса благодаря наличию специ­фических антител, полученных от матери с желтком. Для удачного выделения вируса необходимо, чтобы куры, эмбрионы которых используют в работе, не были вакцинированы против болезни, возбудителя ко­торой ищут. Скорлупа яиц должна быть непигментированной, чистой (мыть нельзя). Возраст эмбриона должен соответствовать избранному методу заражения.

Для обеспечения нормального развития зародышей в оплодотворенных яй­цах в период инкубации необходимо соблюдать определенную температуру и влажность. Развивающиеся эмбрионы переносят перегрев значительно хуже, чем охлаждение. Поэтому кратковременная (в течение нескольких часов) поломка в системе обогрева не приносит большого вреда. При более длительном перерыве необходим подогрев.

Инкубируемые яйца нуждаются в свободном доступе свежего воздуха, кото­рый поступает через отдушины. Они должны быть всегда открытыми. Одно яйцо, как принято считать, расходует 1 л кислорода в день, что неудивительно, если вспомнить о бурном развитии зародыша в течение 21 дня инкубации. Именно поэтому яйца нельзя класть вплотную, а также одно на другое. Для инкубации яиц непригодны обычные термостаты. Лишь в случае крайней необходимости их можно использовать для этих целей, но при этом часто проветривать ипоста­вить внутрь сосуд с водой для обеспечения требуемой влажности.

Заложенные на инкубацию яйца через 3–5 дней просвечивают с помощью специальной настольной или ручной (если яйца не вынимают из лотка инкуба­тора) лампы, чтобы отобрать неоплодотворенные. Наиболее удобны для вирусо­логических работ яйца леггорнов, так как их тонкая белая скорлупа позволяет лучше рассмотреть содержимое. Неоплодотворенные или содержащие погибших зародышей яйца из инкубатора удаляют. Доля оплодотворенных яиц колеблется в значительных пределах в зависимости от многих факторов, в том числе от времени года: весной она самая высокая, зимой самая низкая.

Второй раз зародыши просвечивают в день запланированного заражения. Срок этот зависит от вида вируса, а также пути его введения. На скорлупе обычным (не чернильным) карандашом отмечают место заражения.

7.4 Строение куриного эмбриона.Обычно курица откладывает оплодотворенное яйцо, в котором зародыш находится на стадии бластулы или ранней гаструлы. При нагревании яйца до температуры, близкой к температуре тела курицы, происходит дальнейшее развитие зародыша (рис. 14). В период с 5-го по 12-й день инкубации куриные эмбрионы могут быть использованы для заражения вирусами.

Рисунок 14.Схематический разрез куриного эмбриона на 8-й день инкубации: 1 – скорлупа; 2 – подскорлупная оболочка; 3 – хорионаллантоисная оболочка; 4 – аллантоисная полость; 5 – желточный мешок; 6 – белок; 7 – воздушная камера; 8 – тело зародыша; 9 – амниотическая полость

Яйцо с развивающимся куриным эмбрионом покрыто снаружи твердой пористой скорлупой, к которой плотно прилегает подскорлупная оболочка. Последняя в тупом конце яйца разделяется на два листка, между которыми образуется воздушная камера. Тело зародыша лежит в яйце эксцентрично, спиной ближе к скорлупе, голова направлена в сторону воздушной камеры. Зародыш погружен в околоплодную жидкость, заполняющую амниотическую полость, и пуповиной связан с желтком. Желток также располагается эксцентрично и относительно зародыша как бы по другую сторону продольной оси.

Непосредственно под подскорлупной оболочкой находится аллантоисная полость, покрывающая амнион и желточный мешок, а к 10-11-му дню замыкающаяся в остром конце яйца. В процессе развития аллантоисная оболочка срастается с хорионом, образуя единую хорионаллантоисную оболочку (ХАО). В остром конце яйца находится остаток белка.

Заражение в ту или другую часть эмбриона проводится в период ее максимального развития, когда количество чувствительных клеток будет наибольшим.

В процессе инкубации меняются размеры зародышевых структур, что во многом объясняется их функциональным назначением и определяет оптимальный для заражения возраст эмбриона.

Так, желточный мешок как резервуар питательных веществ имеет наибольший объем в начале инкубации, а затем (после 12-го дня) по мере развития зародыша он уменьшается. Заражают в желточный мешок с 5-го по 7-й день инкубации.

Амниотическая полость, являясь буферной средой развития зародыша, покрывает его уже на 5-й день инкубации. Среднее количество жидкости к середине периода инкубации составляет около 1 мл.

Для заражения в амниотическую полость используют эмбрионы в возрасте 6-10 дней.

Аллантоисная полость служит для сбора продуктов обмена, в ней скапливаются мочекислые соли, фосфорные и азотистые соединения. В процессе роста и развития зародыша аллантоисная жидкость приобретает кислую реакцию. Максимальных размеров аллантоисная полость достигает на 9-12-й день развития эмбриона, поэтому заражение в аллантоисную полость проводят преимущественно на 9-11-й день инкубации.

Хорионаллантоисная оболочка богата кровеносными сосудами, которые, тесно прилегая к внутренней поверхности пористой скорлупы, насыщаются кислородом и снабжают им тело зародыша, выполняя функцию органа дыхания эмбриона. Максимального развития ХАО достигает на 11-13-й день. Заражение на хорионаллантоисную оболочку проводят на 10-12-й день инкубации.

7.5 Подготовка куриных эмбрионов к заражению.Эмбрионы доставляют из инкубатория, не допуская их охлаждения в пути. В лаборатории эмбрионы инкубируют в термостате при температуре 37 °С и влажности 60-70 %, что достигается установлением в термостате открытых широкогорлых сосудов с водой. Вентиляционные отверстия термостата должны быть открыты. Эмбрионы размещают воздушной камерой вверх в специальных штативах. Рекомендуется до момента заражения дать возможность эмбрионам в течение суток адаптироваться к новым условиям и нормализовать свои функции после транспортного стресса. Если лаборатория располагает собственным инкубаторием, то снесенные курицей оплодотворенные яйца пригодны для закладки в него в течение 10 дней.

Подготовка куриных эмбрионов к заражению включает овоскопирование и дезинфекцию скорлупы, а также соответствующую подготовку рабочего места. Овоскопирование представляет собой просмотр яиц против достаточно яркого источника света (овоскоп), в результате чего на неосвещенной стороне скорлупы образуются тени от внутренних структур (рис. 15). Овоскопирование проводят в затемненном помещении. При этом на скорлупе графитным карандашом отмечают границу воздушной камеры, место расположения зародыша и участок бессосудистой зоны размером 0,5×0,5 см. Эти отметки служат ориентиром при выборе места введения вируссодержащего материала. При овоскопировании также определяют, жив зародыш или погиб. Зародышей, проявляющих активные движения при хорошей кровенаполненности сосудов ХАО, считают живыми.

Рисунок 15. Овоскопирование куриного эмбриона на 10-е сутки инкубации. Видны тени:

1 – зародыша; 2 – желточного мешка; 3 – кровеносных сосудов ХАО; 4 – воздушной камеры; 5 – белка

Куриные эмбрионы заражают в асептических условиях (лучше в боксе). В предбокснике скорлупу эмбрионов обрабатывают йодированным спиртом, затем уже в боксе повторно протирают, а иногда еще и фламбируют – обрабатывают пламенем смоченного спиртом тампона.

Эмбрионы фиксируют в специальных подставках, установленных в эмалированной кювете на 3–4-слойной марлевой салфетке, смоченной дезинфицирующим раствором.

В работе используют инструменты, стерилизованные кипячением. Их ставят в баночку со спиртом и обжигают пламенем горелки перед каждым повторным использованием.

источник