Меню Рубрики

Лабораторная диагностика оспы животных

Лабораторная диагностика оспы овец

Оспа овец — острая контагиозная болезнь, протекающая с характерными папулезно-улезными поражениями кожи морды и других мест со слабым волосяным покровом (экзантема) и слизистых оболочек. В 1964 г. на XII сессии Генерального Комитета МЭБ оспу овец внесли в список наиболее опасных (конвенционных) болезней животных. Она широко распространена в соседних странах, занимающихся овцеводством. Эпизодически в результате заноса из неблагополучных соседних стран бывают вспышки в южных регионах России.

Диагноз ставят с учетом эпизоотологических данных, результатов клинического обсле­дования, биопробы и вирусоскопии мазков из свежеразвившихся первичных оча­гов поражения или мест инокуляции вируса при постановке биопробы. В этих случаях необ­ходимо найти животных с характерными оспинами гнездно-сетчатого строения с кратерообразными углублениями, чего при других экземах, как правило, не бывает. При типичном течении диагностировать оспу не трудно. При тщательном обследовании овец пораженной отары всегда можно найти отдельных животных с типичными оспинами на разных стадиях формирования. У одного и того же животного оспины образуются не од­новременно, одни находятся в стадии розеол, другие — в стадии папул.

Лабораторная диагностика оспы основана на выделении вируса, вирусоскопии мазков препаратов из срезанного эпителия розеолы, на присутствие элементарных телец, постановке биопробы, РИФ, РДП.

Выделение вируса.Для исследования берут содержимое везикул или пустул, поверх­ность которых предварительно очищают ватным тампоном, смоченным эфиром или спир­том. Для гистологического исследования вырезают измененные участки кожи на границе с неизмененными. Патологический материал для вирусологических исследований следует пе­ресылать в замороженном или охлажденном (до 4-6°С) виде. Обычно при абортивном и не­ясном течении болезни ставят биопробу на неиммунных молодых овцах. Испытуемую сус­пензию, приготовленную общепринятым методом в разведениях 1:20 и 1:200, инокулируют внутрикожно в бесшерстную поверхность хвоста в дозе 0,1-0,15 мл. Наблюдение ведут в те­чение 10 дн. В положительных случаях на месте инъекции развивается местный оспенный процесс (розеола, папула, везикула, пустула, некроз), специфичность которого подтвержда­ют методом вирусоскопии мазков, приготовленных из срезанного эпителия розеолы, на при­сутствие элементарных частиц.

ИФ.Исследование (прямой метод) проводят общепринятым методом. При наличии ВОО в клетках инфицированной культуры с 6-8-го ч после заражения в отдельных участках цитоплазмы появляются светящиеся очаги. Позже начинают светиться обширные участки.

РДП.Для получения сыворотки, годной для использования в РДП, иммунизируют кро­ликов овиной, делают 2-4 внутривенные инъекции в объеме 2; 1; 0,5 и 0,25 мл с интервалом в 5 дн. Через 7 дн после последней инъекции у кроликов берут кровь для получения сыво­ротки. Полученные кроличьи сыворотки необходимо истощить культурой фибробластов эм­бриона овцы. РДП ставят общепринятым методом.

Дифференциальная диагностика.Оспу овец и коз в стадии образования пустул и ко­рок следует дифференцировать от чесотки, пустулезной экземы и контагиозного пус­тулезного дерматита (эктимы) овец и коз.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: При сдаче лабораторной работы, студент делает вид, что все знает; преподаватель делает вид, что верит ему. 9070 — | 7214 — или читать все.

источник

вирусология шпоры / Характеристика вирусов оспы млекопитающих и птиц. Лабораторная диагностика, иммунитет и специфическая профилактика

Вирусы оспы вызывают острую контагиозную болезнь с папулезно-пустулезными поражениями кожи и иногда слизистых оболочек.

Возбудитель. Большая группа вирусов оспы относится к семейству Poxviridae. Bвирионы поксвирусов — овальные или прямоугольные частицы размером до 450 нм со сложной структурой. Они состоят из центральной части — нуклеотида, овальных боковых тел и наружной оболочки. Нуклеотид содержит двуспиральную ДНК, связанную с белком. Нуклеотид и боковые тела окружены оболочкой из липидов и трубчатых белковых структур. Репродукция происходит в цитоплазме клетки.

Устойчивость. Во внешней среде устойчивость оспенных вирусов высокая. Они сохраняют жизнеспособность в сухих корочках оспин до 1,5 лет. Чувствительны к высоким температурам, солнечным лучам и кислотам; кипячение убивает их моментально.

Культивирование. Вирус оспы культивируется на молодняке естественно-восприимчивых животных и птиц, культуре клеток и развивающихся птичьих эмбрионах.

Антигенные свойства. Семейство поксвирусы включает восемь родов: ортопоксвирусы, пара-, ави-, карпи-, лепо-, суи-, моллуси-, и ятапоксвирусы. Роды включают различные виды вирусов оспы, которые отличаются в антигенном и иммуногенном отношении. Вирусы оспы птиц антигенно близки между собой. Каждыйвид возбудителя оспы характеризуется определенной инфекционностью в отношении культуры клеток и куриных эмбрионов. В организме образуются вируснейтрализующие, комплиментсвязывающие,преципитирующие антитела и агглютинины, в тканях (коже) — специфическая невосприимчивость.

Эпизоотологические особенности. Оспой болеют почти все виды животных и птиц. Но в связи со сложностью этиологической структуры оспы у животных и способностью каждого вида возбудителя вызывать самостоятельную болезнь при анализе эпизоотического процесса необходимо учитывать вид вируса, вызвавшего конкретную вспышку оспы. Источниками возбудителя инфекции являются больные животные и вирусоносители. Факторы передачи вируса — предметы ухода и корма, контаминированные вирусами, а также кровососущие насекомые. Основной путь заражения — аэрогенный. Летальность 20-90%, особенно среди молодняка, зимой и при осложнениях.

Патогенез. Особенность инфекционного процесса при оспе обусловливается эпителиотропностью возбудителей и их способностью вызывать на коже своеобразную оспенную экзантему. Патологический процесс состоит из нескольких стадий:

розеолы — появление красных пятен в течение 1-2 суток

папулы — превращение пятен в узелки в течение 1-3суток

везикулы-папулы — превращение в пузырьки, наполненные серо-желтоватой жидкостью, в течение 5-6 суток; лихорадочные явления угасают

пустулы — содержимое везикул мутнеет и становится гнойным в течение 3 суток

крусты — на месте высохших пустул образуется бурый струп

Проникновение вируса через кожу, как правило, вызывает лишь местный оспенный процесс и легкое переболевание животных. Если возбудитель попадает в организм респираторным или алиментраным путями, то возникает септицемия и оспенный процесс на коже и слизистых приобретает генерализованную форму, что сопровождается высокой температурой; процесс нередко осложняется гноеродными и гнилостными микробами, которые могут вызвать глубокие поражения тканей и даже вторичный сепсис.

Клинические признаки. Тяжесть проявления и широта распространения оспенной экзантемы зависят от видовой и индивидуальной устойчивости животных, вирулентности возбудителя,способа заражения и состояния кожных покровов. Поэтому оспа может проявляться в абортивной, сливной и геморрагических формах.

абортивная форма: на теле животного появляется небольшое число оспин, которые, не претерпевая всех стадий процесса, быстро исчезают

сливная форма: отдельные везикулы на обширных участках кожи сливаются между собой и образуют большие пузыри, а в дальнейшем — струпья, под которыми скапливается гной; процесс сопровождается высокой температурой и сильным угнетением общего состояния.

геморрагическая(черная) форма: множественные кровоизлияния внутри пустул и в коже, кровотечения из носа, кровавая рвота, понос с примесью крови. Животные быстро худеют и погибают.

Патолого-анатомические изменения. В трупахнаходят картину геморрагического диатеза, на серозных- покровах — множественные кровоизлияния, слизистые оболочки геморрагически воспалены, с наличие эрозий, иногда и язы. В легких — признаки крупозной пневмонии, гангренозные участки, лимфоузлы увеличены и гиперемированы; печень, сердце и почки с признаками дегенерации.

Диагноз. Основан на клинико-эпизоотологических, патолого-анатомических данных и результатх лабораторных исследований. Необходимо исключать:

у КРС ящур, везикулярный стоматит, кормовые сыпи

у овец контагиозную эктиму, паршу, чесотку и инфекционные экземы

у свиней ящур, везикулярную болезнь, оспоподобную экзантему незаразного происхождения

у коз ящур и контагиозную эктиму

у птиц инфекционный ларинготрахеит, респираторный микоплазмоз, авитаминоз А, кандидамикоз

Лабораторные исследования. Пат.материал: содержимое везикул и пустул,измененные участки кожи,папулы, розеолы, кровь.

экспресс-методы: обнаружение элементарных телец (по Морозову), РГА, РИФ, электронная микроскопия

— выделение в культуре клеток, куриных эмбрионах,на молодняке восприимчивых животных

— серологическая идентификация в РДП, РИФ, РН

ретроспективная диагностика (РДП)

Иммунитет. После естественного переболевания независимо от тяжести заболевания формируется стойкий и продолжительный иммунитет.

Лечение. Сыворотки крови реконвалесцентов и гипериммунных животных слабоэффективны; наиболее действенны гаммаглобулины.

Специфическая профилактика. Для вакцинации овец используют гидроксидалюминиевую формолвакцину и сухую культуральную вирусвакцину. Иммунизацию коров проводят (редко) медицинской осповакциной. Птиц прививают сухой эмбрионвирусвакциной 7 из штамма 27-А Ш.

Характеристика вируса лейкоза КРС. Патогенез инфекции. Лабораторная диагностика, пути заражения, профилактика.

Лейкоз крупного рогатого скота – хроническая инфекционная болезнь опухолевой природы, основной причиной которой – злокачественное разрастание клеток кроветворных органов с нарушением их созревания, в результате чего происходит диффузная инфильтрация органов этими клетками или появляются опухоли. Вирус открыт в 1969 году Миллером.

Возбудитель — вирус семейства Retroviridae, подсемейства онковирусы. Вирионы имеют специфическую форму; состоят из плюс нитивойРНК, внутренней белковой мембраны и липидсодержащей наружной оболочки, со спиральным типом симметрии, округлой формы, размеры 60-125.

Устойчивость: во внешней среде выживаемость невысокая — погибает при нагревании до 60 С за 1 минуту,быстро обезвреживается 2-35 растворами едкого натра. Инактивируется в молоке при нагревании до 74Св течение 17 секунд или при pH 4, 57.

Культивирование: онковирусы можно культивировать на животных и в культуре клеток. В культурах клеток не образуется ЦПД, но происходит трансформация. В настоящее время получены и широко используются перевиваемые хронически инфицированные ВЛКРС линии клеток: фибробласты легкого эмбриона коровы (АИД-15), почки эмбриона коровы (ПЭК); почки эмбриона овцы (FLK-BLV); легкого эмбриона летучей мыши (T61-Lu); легкого макаки-резус (BLV-Simian); селезенки овцы (FLS, J-1228); тимуса эмбриона коровы (ТЭК-МВА-766 LmTT).

Антигенный свойства: инфицированные вирусом животные вырабатывают антитела к нескольким вирионным антигенам. В сыворотке кровибольных животных обнаружены комплементсвязывающие антитела,направленные на четыре вирусных полипептида: р15, р24, р30 и р51. Антитела вырабатываются преимущественно на структурный белок 51 и принадлежат к иммуноглобулинам G, A, M. Наличие антител не предотвращает развития опухолей. Антитела к гликопротеидному антигену выявляют в РДП, они не защищают организм животного от заражения. Вирус лейкоза вызывает хроническую инфекцию опухолевой природы.

Эпизоотологические данные. Болеют как молодые, так и взрослые животные различных пород, но чаще в возрасте 4-8лет. На ранних стадиях болезни онковирус выделяется из организма коров с молозивом и молоком. Внутри стада возможны вертикальный и горизонтальный механизмы передачи возбудителя. Основной фактор его распространения — завоз животных из неблагополучных хозяйств. Заболеваемость — 3-20%, смертность — до 15%.

Патогенез. Патогенез лейкоза определяется взаимоотношение вируса и клетки. Болезнь чаще протекает в латентной форме. Основным признаком лейкоза является нарушение нормального процесса пролиферации и дифференциации клеток кроветворной ткани. Чаще поражаются лейкобластические клетки, что приводит к интенсивной пролиферации различных типов лейкоцитов в кроветворных органах, костном мозге, селезенке, лимфоузлах. Размножающиеся клетки крови неконтролируемо распространяются по организму и попадают в различные органы и ткани. Образующиеся опухоли вызывают изменение структуры и функции пораженных органов вследствие атрофии специфических клеток. Появляются нарушения на молекулярном, клеточном и органном уровнях, что приводит к расстройству кроветворения, увеличению количества лейкоцитов.

Клинические признаки. Инкубационный период при экспериментальном заражении — 60-750 суток, при спонтанном — 2-6 лет. В течении лейкозов выделяют предлейкозную, начальную, развернутую и терминальную стадии болезни. С развитием патологического процесса указанные стадии следуют одна за другой. В начальный период болезни при лейкемическом течении отмечают увеличение числа лейкоцитов в периферической крови(лейкоцитоз), а в дальнейшем — системное и регионарное увеличение лимфатических узлов, селезенки, нередко развивается геморрагический синдром. Характерны изменения картины крови — увеличение в крови незрелых кроветворных клеток, или лейкемия, лейкоцитоз и др.

Патолого-анатомические изменения. Системное увеличение лимфатических узлов, селезенки, разрастание опухолевой ткани в сердце, сычуге. Поражения костного мозга, печени, почек, легких, кишечника и до. При гистологическом исследовании пораженных органов устанавливают системной размножение кроветворных клеток различной степени зрелости, вплоть до недифференцированных,что характерно для опухолевого процесса.

Диагноз. Ставят на основании эпизоотологических данных, клинических признаков, патолого-анатомических изменений и результатов лабораторных исследований.

Лабораторная диагностика. Пат.материал: прижизненно — кровь с антикоагулянтом и без коагулянта, посмертно — кусочки пораженных органов.

экспресс-методы: электронная микроскопия, реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ основана на феномене активации лимфоцитов под влиянием стимулов (митогенов или антигенов) с последующей трансформацией их в бласты (большие делящиеся клетки). Эта реакция определяет пролиферативный потенциал изучаемых клеток.

Реакцию осуществляют следующим образом. К суспензии лимфоцитов или лейкоцитов крови (в последнее время чаще используют разведенную в 10-20 раз цельную кровь) приливают раствор митогена или антигена в концентрации, нетоксичной для клеток, но способной вызывать бласттрансформацию. Инкубируют в среде СО при 370С. По окончании культивирования эритроциты (в тех случаях, когда для реакции используют цельную кровь) лизируют и подсчитывают количество клеток, трансформировавшихся в бласты. Подсчет можно вести визуально в окрашенных мазках, однако морфологический метод учета может давать субъективные ошибки. Поэтому чаще учет результатов ведут по изменению радиоактивности культуры клеток в результате включения радиоактивного изотопа в клетки, входящие в митотический цикл (например, ^-тимидина), используя для этого автоматический сцин-тилляционный счетчик.

В качестве активаторов РБТЛ обычно используют фитогемагглютинин (ФГА), конканавалин А (Кон А), митоген лаконоса (МЛ), бактериальные липополисахариды (ЛПС), ферменты, стафилококковый экстракт и др.), РИФ, гематологический метод, РИД

серологический (РИФ, РИД), гематологический, патоморфологический и гистологический методы.

Иммунитет. Малоизучен. В организме зараженных животных с гематологическими и клиническими признаками болезни выявляют преципитирующие и комплементсвязывающие антитела.

Специфическая профилактика и лечение. Не разработаны.

источник

Лабораторная диагностика оспы. Включает микроскопическое выявление в патологическом материале элементарных телец, заражение куриных эмбрионов, а в сомнительных случаях — проведение биопроби на чувствительных животных.

В лабораторию для исследования присылают везикулярную жидкость, набранную в капилляры пастеровських пипеток, и целые папулы, вырезанные ножницами на границе с непораженной тканью, которые вмещают в флакон с 50 %-г раствором глицерина. Для вирусоскопии готовят тонкие мазки и мазки-отражения оспенных поражений кожи и пустул, которые после высушивания исследуют в нативному состоянии или окрашивают за методом Морозова ли Пашена. Во время микроскопического исследования окрашенных за Морозов мазков на світло-брунатному фоне препарата вирусные частички имеют вид мелких округлых элементарных телец черного цвета, размещенных поодиночке, попарно, короткими цепочками или сосредоточениями. В окрашенных за Пашеном мазках мелкие округлые элементарные тельца имеют темно-красный цвет.

Для диагностики оспы в Птицы Осуществляют заражение патологическим материалом 10 — 12-дневных куриных эмбрионов. В случае положительных результатов на ХАО погибших (или забитых) вдоль первых

3-6 пор куриных эмбрионов находят размещенные в отдельности мелкие оспинки или собранные вместе значительные ячейки оспенных поражений.

При атиповой форме оспы у Овец Для диагностики применяют биопробу. Исследуемый патологический материал в объеме 0,1 мл вводят внутрикожно в бесшерстную поверхность хвоста неиммунной молодой овцы. В положительных случаях вдоль 10 пор на месте инокуляции развивается специфический местный оспенный процесс, который подтверждается нахождением в мазках элементарных телец. Для диагностики оспы у Свиней Патологический материал вытирают в надрезы кожи на внешней поверхности уха или внутренней поверхности бедра 2 — 3-месячных поросят. В положительных случаях через 6-8 ч на месте надрезов наблюдаются характерные оспенные поражения, специфичность которых подтверждается выявлением в мазках элементарных телец. Идентификацию вируса оспы, что способствовало заболевание свиней, осуществляют на двух переболевших поросятах, которым в свежоскарификованую поверхность кожи на тыльной стороне уха или на внутренней поверхности бедра вытирают вісповакцину. Отсутствие зажигательной реакции на месте введения вакцины свидетельствует про інфікованість свиней вирусом оспы коров или осповакцини. Положительная зажигательная реакция на месте введения вакцины свидетельствует про инфицырованость свиней оригинальным вирусом оспы свиней. Для диагностики оспы Коров Исследовательским патологическим материалом заражают кроликов в роговицу глазу (проба Рафаэля). При гистологическом исследовании пораженных участков роговицы обнаруживаются специфические тельца-включения Гварни-ери. В случае необходимости ставят биопробу на телятах.

Дифференциальная диагностика. Предусматривает необходимость отличать оспу овец и коз от парши и чесотки; оспу большого рогатого скота — от ящуру и нодулярного дерматита; оспу свиней — от висипу при сальмонеллезе, лептоспирозе и ящуре, а также при затронутом обмене веществ; оспу коней — от везикулярного стоматита. Парш в диагностируют выявлением в патологическом материале микроскопических грибков, чесотку — нахождением в корках специфических клещей. Ящур большого рогатого скота отличают от оспы за специфическими афтозно-ерозийными поражением слизистой оболочки ротовой пустоты и языка, на вымени не проявляют характерных для оспы «пупкообразных вдавливаний». В случае необходимости ставят очень показательную биопробу на морских свинках. Н в — дулярний дерматит большого рогатого скота не сопровождается характерной стадийностю развития поражений кожи, наблюдаются лишь узелковые высыпания. У свиней кожные поражения при сальмонеллезе и лептоспирозе не имеют характерной для оспы стадийности развития, бактериологическими исследованиями определяют соответствующий возбудитель болезни. У коней везикулярный стоматит проявляется характерным везикулярным висипом на слизистой оболочке ротовой пустоты, коже венчика межкопытнойщели. Вирус идентифицируется за РЗК и РН.

Лечение. Специфических средств лечения оспы не предложен. Больных животных изолируют в сухие, чистые, хорошо проветриваемые помещения, обеспечивают мягким питательным кормом. Проводят симптоматичное лечение. Слизистые оболочки сращивают антисептическими и вяжущими жидкостями, оспенные поражения кожи обрабатывают разными мазями (борная, прополисная, цинковая, салициловая), эмульсиями (стрептоцидовая, синтомициновая) и антисептическими жидкостями. Кожные покриви больных свиней через каждые 6-7 пор к отпадению корок смачивают непрочным раствором креолина, лизола или ‘едкого луга. При конюнктивитах у коней глаза промывают 1 %-г раствором цинка, 0,5 %-г раствором танину. Для профилактики и лечения осложнений бактериальной микрофлорой применяют антибиотики широкого спектра действия.

Иммунитет. В переболевших на оспу коров, верблюдов и коз формируется стойкий иммунитет на все жизнь, у овец и кур — на 2-3 года, у свиней и коней — на несколько месяцев. Для специфической профилактики применяют гидроксидалюминиеву формолвакцину против оспы овец, сухую культуральну вирус-вакцину против оспы овец и гидроксидалюминиеву формолглицеринову вакцину против оспы коз.

Гидроксидалюминиеву Формолвакцину против оспы овец Применяют с профилактической целью в неблагополучных или угрожающих хозяйствах. Прививают клинически здоровых животных независимо от их физиологического состояния и века. Ягнят, привитых к 2-месячному веку, ревакцинують через 2-3 мес, в дальнейшем их прививают дважды на год. Невосприимчивость у овец наступает на 15-ту пору после вакцинации и сохраняется в течение 6-8 мес.

Вирус-вакцину против оспы овец сухую Культуральну применяют для профилактической иммунизации клинически здоровых овец в епизоотичных ячейках и угрожающих относительно оспы районах. Молодняк вакцинируют из месячного века, ревакцинують в 6-месячном веку. Взрослых овец прививают единовременно через каждые 12 мес. Иммунитет наступает через 4-5 пор после вакцинации и сохраняется в течение 12 мес.

Гидроксидалюминиеву Формолглицериновую вакцину против оспы коз Применяют с профилактической целью во всех неблагополучных хозяйствах без любых ограничений. Молодняк ревакцинируют через 3-4 мес. Иммунитет сохраняется до 6 мес.

Профилактика и мероприятия борьбы. Предусматривают охрану хозяйств от занесения и распространения вируса оспы; защита животных от заражения оспой; своевременное установление диагноза; выявление, изоляцию и лечение больных животных и вакцинацию здоровых; ликвидацию болезни в неблагополучном пункте и предотвращение распространению инфекции в другие хозяйства; уничтожение возбудителя болезни в ячейки инфекции.

Чтобы предотвратить занесению оспы Овец И Коз, Не допускается завозка животных, кормов и инвентаря из неблагополучных относительно оспы хозяйств. Всех новоприбывших овец и коз вдоль 30 пор удерживают на карантине, во время которого за ними устанавливают постоянный ветеринарный надзор. Перед введением к общей отаре овец купают в креолиновых ваннах. За каждой отарой закрепляют постоянные пастбища, водопой и пути перегона. Не допускаются контакты с отарами других хозяйств и индивидуальных собственников; обеспечивается постоянный надзор за состоянием здоровья животных. С целью профилактики оспы все поголовье овец в угрожающей зоне регулярно вакцинируют.

В случае возникновения оспы овец или коз и подтверждение диагноза хозяйство объявляют неблагополучным относительно оспы, вводят карантин, выставляют охранно-карантинный ветеринарно-милицейский пост с круглосуточным дежурством. В неблагополучном пункте запрещается введение и вывод всех видов животных; перегруппировка животных внутри хозяйства, а также выпас, поение и удержание больных овец вместе с здоровыми животными всех видов; вывоз из неблагополучного пункта фуража; использование овечьего молока и полученных из него продуктов в необеззараженном виде; стрижка овец неблагополучных отар к снятию карантина; торговля животными и продуктами животноводства; проведение выставок, ярмарок, базаров; проезд всех видов транспорта по неблагополучной территории. За неблагополучной отарой закрепляют постоянных надсмотрщиков, транспорт, пастбища.

Трупы погибших животных сжигают, запрещается снимать шкуры и использовать шерсть из трупов. Больных и подозреваемых относительно заболевания животных изолируют и лечат. Всех клинически здоровых овец и коз прививают против оспы одной из существующих вакцин в соответствии с действующей инструкцией. Проводят также вакцинацию животных в угрожающих относительно оспы хозяйствах.

Вдоль всего периода карантина через каждые 5 пор осуществляют механическое очищение и дезинфекцию помещений и других мест удержания овец. Карантин снимают через 20 пор после полного выздоровление, гибели или забоя последней больной овцы, а также после проведения окончательной дезинфекции помещений, выгульных дворов и отрядов, где находились больные на оспу овцы. Овец и животных других видов, которые находились в ячейки оспы, в теплую пору года нужно выкупать в 1 %-и эмульсии креолина. После снятия карантина всех овец, которые поступают в хозяйство, в период 30-дневного карантина привмвают против оспы. В дальнейшем на территории неблагополучного в минувшем пункте проводят ежегодную вакцинацию овец против оспы в течение трех следующих лет.

В случае появления оспы овец в местностях, где она не регистрировалась три года и большее, осуществляют немедленный забой всех овец неблагополучной группы на специально оборудованной забойной площадке с соблюдением соответствующих ветеринарно-санитарных правил. После установления диагноза на оспу Свиней Хозяйство объявляют неблагополучным относительно оспы и вводят в нем карантинные ограничения. Больных на оспу свиней изолируют и лечат; здоровых свиней прививают вакциной. Свиней, которые погибли с имеющимися клиническими признаками оспы, утилизируют вместе с шкурой. В ячейки оспы каждые 5 пор проводят дезинфекцию помещений, оснащений, инвентаря. Спецодежда и обуви дезинфицируют каждый день в параформалиновой камере или обрабатывают 3 %-г раствором хлорамина, 3 %-г раствором хлорной извести; руки дезинфицируют 1 %-г раствором хлорамина. Карантинные ограничения из неблагополучного относительно оспы свиней хозяйства снимают через 21 пору после полного выздоровление, гибели или забоя больных на оспу животных, обработки кожных покровов свиней 1-1,5 %-г раствором креолина или лизола, 0,3 %-г раствором едкого луга, а также проведение окончательных мероприятий.

Для дезинфекции помещений и предметов ухода применяют горячие 2-4 %-ой растворы едкого натра и калу; 20 %-ом смесь свежогашеной извести; просветленный раствор хлорной извести, которая содержит не менее чем 2 % активного хлора; горячий 3 %-и раствор сульфатно-карболовой смеси; 2 %-и раствор формальдегида. Гной обеззараживают вдоль Из недель биотермическим методом, гноивку — путем засыпания в гноєзборники негашегого или хлорной извести из расчета 1 часть извести на 5-6 частей гноивки. Одежда и обувь обслуживающего и ветеринарного персонала дезинфицируют в параформалиновой камере.

В случае появления оспы у Большого рогатого скота Больных животных изолируют и лечат. Молоко от больных коров пастеризуют.

Больных на оспу Коней Изолируют и лечат. В ячейках оспы проводят надлежащие ветеринарно-санитарные мероприятия.

Оспа у человека. У людей различают натуральную оспу, источником возбудителя которой есть больной человек, коровью оспу как профессиональную болезнь доярок. Особой злокачественной формой болезни есть геморагичная (черная) оспа человека. Возможная также «вакцинная» оспа.

Натуральная оспа распространяется путем контактов с клинически больными людьми, а также через одежду, постельное белье, посуда. Инкубационный период длится 12-13 пор. Ранними симптомами болезни есть трясучка, головная боль, состояние прострации. В первые 2-4 поры в 10 % случаев наблюдается появление нестойкого еритематозного или петехиального высыпание на боковых поверхностях живота, в подпахных впадинах, паховому участку. На 3 — 4-ту пору на слизистой оболочке рта и глотки, на коже лица, предплечье и кистях рук появляются оспенные высыпания, температура снижается, состояние больного улучшается. В следующие 5-6 пор высыпания проходят все специфические стадии развития, распространяясь по всему телу. В конце 3-ей недели наступает выздоровление, хотя рубцы остаются на все жизнь.

При злокачественной форме оспы высыпания приобретают сливного характера, в основе пустул развиваются геморагии. Прогноз неблагоприятный. Больную наиболее заразные на 3 — 10-ту пору болезни.

Коровья оспа наблюдается у доярок, рабочих животноводческих ферм, которые обслуживают инфицированный скот, ветеринарных специалистов. Поражение отмечаются на кистях рук, в особенности на пальцах и в первому межпальцевом промежутках, а также на предплечьях, лице. Возможное генерализованое высыпание, которое сопровождается трясучкой, регионарным лимфаденитом. Прогноз благоприятный. Оспенные высыпания проходят все стадии развития и исчезают вдоль 2-4 недель.

Вакцинная оспа есть следствием прививки человека против оспы. Может также возникнуть у лабораторных работников, которые изготовляют вакцину из телячьей лимфы. На 3 — 4-ту пору после заражения появляется небольшая красная папула, которая постепенно увеличивается, на 6 — 7-му пору превращается в везикулу, со временем на пустулу, которая подсыхает и образовывает корочку, которая в течение 3 недель облущивается, оставляя рубец.

Благодаря невероятным усилиям медицинских работников вдоль последнего столетия оспу человека ликвидирован на сегодня почти во всем мире.

источник

Цель занятия: изучить методы диагностики оспы, систему профилактических и оздоровительных мероприятий.

Материалы и оборудование: плакаты, схемы, вакцины. Место проведения занятия: аудитория кафедры эпизоотологии.

Оспа — контагиозная вирусная болезнь млекопитающих и птиц многих видов, вызываемая представителями семейства Poxviridae.

Возбудитель оспы коров —ДНК-содержащий вирус из семейства Poxviridae, рода Orthopoxvirus. У коров оспу может вызывать как вирус истинной коровьей оспы, так и вирус осповакцины (вирус натуральной оспы человека).

Возбудитель оспы овец.ДНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Poxviridae, роду Capripoxvirus.

Диагностика и дифференциальная диагностика оспы коров.Диагноз ставят на основании эпизоотологических, эпидемиологических данных, клинических признаков и результатов лабораторного исследования. Для оспы коров характерны спорадическое проявление, локализация оспин, образующихся стадийно на коже вымени, совпадение во времени заболевания коров, людей и иммунизации населения против оспы.

В лабораторию для вирусологического исследования направляют содержимое папул или формирующихся везикул. Материал культивируют в развивающихся куриных эмбрионах или в культурах клеток, выделяют и идентифицируют возбудитель. Для гистологических исследований готовят тонкий мазок с поверхности срезанной папулы, подсушивают его на воздухе и окрашивают по Морозову. Обнаружение элементарных телец в окрашенных препаратах имеет диагностическое значение, а их отсутствие не служит основанием для исключения оспы. В этом случае испытуемым материалом заражают кроликов в роговицу (проба Пауля). При гистологическом исследовании пораженных участков роговицы обнаруживают тельца-включения Гварньери. В качестве экспресс-диагностики применяют РДП на предметном стекле с использованием содержимого оспенной сыпи и иммунной антивакцинальной кроличьей сыворотки.

Читайте также:  Ветряная оспа диспансерное наблюдение

Обнаружение элементарных частиц вируса в оспинах и телец Гварньери в пораженных участках роговицы экспериментально зараженных кроликов подтверждает диагноз на оспу коров.

При дифференциальной диагностике необходимо исключить ящур и паравакцину.

Иммунитет, специфическая профилактика.Постинфекционный иммунитет при оспе тканево-гуморальный и сохраняется пожизненно. Для специфической профилактики применяют живую вирус-осповакцину.

Профилактика.Для предупреждения возникновения оспы не допускают ввод (ввоз) в хозяйства крупного рогатого скота, а также кормов и инвентаря из хозяйств, неблагополучных по оспе коров. Поступающих из благополучных хозяйств животных карантинируют и подвергают клиническому осмотру. Постоянно содержат в надлежащем ветеринарно-санитарном состоянии животноводческие помещения, пастбища, места поения. Работников ферм, иммунизированных против оспы, освобождают от работы на животноводческих фермах сроком на 2 нед при нормальном течении прививочной реакции и до полного выздоровления при появлении осложнений.

Все поголовье крупного рогатого скота в хозяйствах и населенных пунктах угрожаемой по оспе коров зоны прививают живой вирус-осповакциной в соответствии с наставлением по ее применению.

Лечение.Больных животных изолируют в сухие теплые помещения и обеспечивают полноценное кормление. Специфические средства лечения при оспе коров не разработаны. Оспины размягчают нейтральными жирами и кремами (борная, цинковая, стрептоцидовая, синтомициновая и другие мази), молоко осторожно выдаивают. Язвенные поверхности обрабатывают прижигающими средствами и антисептическими растворами (настойка йода, буровская жидкость, 3%-ный раствор хлорамина). Слизистые оболочки промывают антисептическими и вяжущими растворами.

Меры борьбы.При установлении диагноза у крупного рогатого скота хозяйство объявляют неблагополучным и извещают об этом медицинскую службу и вышестоящие ветеринарные органы. В неблагополучном хозяйстве проводят специальные общесанитарные и ограничительные мероприятия, направленные на ликвидацию болезни. Больных животных изолируют, лечат и для ухода за ними закрепляют людей, вакцинированных и ревакцинированных против натуральной оспы и соблюдающих правила личной гигиены.

Через каждые 5 дней и после каждого случая выделения больного животного тщательно очищают и дезинфицируют помещения, используя для этого одно из средств: 4%-ный горячий раствор гидроксида натрия, 2%-ный раствор формальдегида, 20%-ный раствор свежегашеной извести (гидроксид кальция). Навозную жижу обезвреживают хлорной известью, смешивая в соотношении 5 : 1, а навоз — биотермическим способом или сжигают.

Молоко от больных и подозреваемых в заражении коров после пастеризации скармливают молодняку в том же хозяйстве. Молочную посуду, автоцистерны дезинфицируют 1%-ными растворами хлорамина или ги-похлорита натрия.

Ограничения при оспе коров снимают через 21 день после полного выздоровления больных животных и проведения заключительных ветеринарно-санитарных мероприятий.

Диагностика и дифференциальная диагностика оспы овец.Диагноз на оспу овец ставят на основании анализа эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных и результатов лабораторных исследований, включая биопробу.

При оценке эпизоотологических данных необходимо учитывать, что из домашних животных болезнь поражает только овец независимо от возраста и породы, а из диких — сайгаков и козерогов. Для подтверждения диагноза на оспу необходимо взять биоматериал — участок пораженной кожи, имеющий свежие папулы, пораженные легкие и лимфатические узлы.

При гистологическом исследовании в пораженных участках кожи находят серозно-клеточный экссудат, в котором преобладают лимфоциты, макрофаги со специфическими включениями, а также гранулоциты. Деструктивные изменения наиболее сильно выражены в подэпидермальном слое, граница между дермой и эпидермисом неразличима. При окрашивании специальными методами выявляют внутриклеточные включения Пашена.

При абортивном течении болезни ставят биопробу на овцах. Для этого исследуемый материал вводят в кожу подхвостовой складки.

При дифференциальной диагностике необходимо исключить экзему, грибной дерматит, чесотку и контагиозный пустулезный дерматит.

Иммунитет, специфическая профилактика.Переболевшие животные приобретают иммунитет не менее чем на 2 года. Для специфической профилактики оспы овец применяют культуральную вирус-вакцину из атте-нуированного штамма НИСХИ, которая создает у привитых животных иммунитет длительностью до 12мес.

Профилактика.Для предупреждения возникновения оспы овец необходимо: 1) не допускать ввода (ввоза) в хозяйство овец, а также кормов и инвентаря из хозяйств, неблагополучных по оспе овец; 2) всех вновь поступивших в хозяйство овец содержать изолированно в течение 30 дней; 3) поддерживать в надлежащем ветеринарно-санитарном состоянии пастбища, места поения, животноводческие помещения; 4) овцепоголовье хозяйств и населенных пунктов, находящихся в угрожаемой по оспе овец зоне, необходимо регулярно прививать противооспенной вакциной.

Лечение.Специфические средства лечения больных оспой овец не разработаны.

Меры борьбы.При возникновении оспы овец на хозяйство накладывают карантин, по условиям которого запрещаются: ввод и ввоз в неблагополучный пункт, вывод и вывоз из него животных всех видов, перегруппировка животных внутри хозяйства, а также выпас, водопой и содержание больных овец вместе со здоровыми животными всех видов; вывоз из неблагополучного пункта фуража, с которым соприкасались больные овцы; стрижка овец; торговля животными и продуктами животноводства, проведение выставок, ярмарок, базаров и других мероприятий, связанных со скоплениями животных на карантинированнои территории; проезд всех видов транспорта; доступ людей, не связанных с обслуживанием животных неблагополучных групп; использование овечьего молока в необез-зараженном виде.

В неблагополучных по оспе овец хозяйствах берут на учет все поголовье овец независимо от их принадлежности и подвергают их 1 раз в 10 дней клиническому осмотру. Выявляемых больных овец изолируют и при необходимости подвергают лечению симптоматическими средствами. Трупы овец, павших при наличии клинических признаков оспы, сжигают. Всех клинически здоровых овец прививают против оспы. В течение 14 дней привитые животные должны находиться под наблюдением ветеринарных специалистов. При выявлении среди привитого поголовья больных их переводят в отдельную группу и лечат.

После каждого случая падежа овец и уборки трупов, а также по окончании иммунизации овец все животноводческие помещения, загоны и другие места нахождения животных подвергают механической очистке с последующей дезинфекцией. Учитывая высокую устойчивость вируса оспы во внешней среде и неодновременное переболевание животных, дезинфекцию повторяют через каждые 5 дней в течение всего периода карантина. Для дезинфекции помещений используют горячие растворы щелочи, серно-карболовой смеси, 20%-ный раствор свежегашеной извести (гидроксид кальция), осветленный раствор хлорной извести или гипохлорита натрия, раствор формальдегида. Стены, заборы и различные деревянные ограждения следует обеззараживать свежеприготовленным раствором негашеной хлорной извести. Навоз обеззараживают в течение 3 нед. биотермическим способом.

В случае появления оспы овец в местностях, где ее не регистрировали в течение 3 лет и более, необходим немедленный убой всех овец неблагополучной группы (больных, подозрительных по заболеванию и подозреваемых в заражении). Убой производят на специально оборудованной убойной площадке с соблюдением ветеринарно-санитарных правил.

Санитарную оценку мяса и других продуктов убоя осуществляют согласно требованиям ветеринарно-санитарной экспертизы. Кожи, полученные при убое овец, дезинфицируют в растворе карболовой кислоты или эмульсии креолина в течение 24 ч, после чего просушивают. Вывоз овчин разрешается только после снятия карантина.

Шерсть и другое сырье животного происхождения, заготовленные до установления карантина, обеззараживают в паровой дезкамере при температуре 110 °С, а затем, после снятия карантина, в таре из плотной ткани вывозят на перерабатывающие предприятия.

Перед снятием карантина проводят заключительную дезинфекцию всех животноводческих помещений и территории выгульных дворов и загонов, где находились больные оспой овцы.

Карантин снимают в установленном порядке по истечении 20 дней после полного выздоровления, падежа или убоя последней больной овцы в неблагополучном пункте.

Контрольные вопросы к разделу «Оспа коров и овец».1. Дайте этиологическую классификацию оспы и оспоподобных болезней. 2. Охарактеризуйте стадии развития инфекционного процесса при оспенных болезнях. 3. Опишите клинические признаки оспы у животных разных видов (оспа коров, паравакцина, оспа овец и коз, оспа свиней, контагиозная эктима, миксоматоз кроликов). 4. Какой биоматериал необходимо отправить в лабораторию для вирусологической и серологической диагностики оспы животных? 5. Когда диагноз на оспу считают установленным? 6. Каковы особенности дифференциальной диагностики оспы и оспоподобных болезней от ящура, везикулярного стоматита и везикулярной болезни свиней? 7. Каковы лечение и специфические средства профилактики оспы у животных разных видов? 8. Назовите основные направления борьбы с оспой овец и коз.

ЗАДАНИЕ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

Решить эпизоотологические задачи.

Задача 1. В овцеводческом хозяйстве в одной отаре в осеннюю дождливую погоду среди овец всех возрастов возникло массовое заболевание, которое наиболее тяжело проявилось у молодняка. Болезнь начиналась угнетением, анорексией и лихорадкой. Одновременно отекали веки, появлялись серозно-слизистые и серрозно-гнойные выделения из глаз и носа. Через 2-3 дня с начала болезни обнаруживали сыпь на коже головы, губах и крыльях носа, вокруг глаз, на внутренних поверхностях передних и задних конечностей.

1. Установить диагноз, организовать лечение больных овец.

2. Разработать мероприятия по охране других отар от заноса

3. Составить план мероприятий по ликвидации данной инфекции в хозяйстве.

Задача 2. На птицеферме в одной секции возникло массовое заболевание птиц со следующими клиническими признаками: катаральное воспаление слизистых оболочек верхних дыхательных путей и ротовой полости. Через 2-.3 дня появились беловатые возвышающиеся наложения округлой формы и желто-белой окраски, которые, сливаясь друг с другом, образовывали наложения, напоминающие сыр и глубоко проникающие в слизистые оболочки.

2. Разработать план мероприятий по профилактике болезни в остальных птичниках и ликвидации эпизоотического очага.

Дата добавления: 2017-02-28 ; просмотров: 967 | Нарушение авторских прав

источник

Цель занятия: изучить методы диагностики оспы, систему профилактических и оздоровительных мероприятий.

Материалы и оборудование: плакаты, схемы, вакцины. Место проведения занятия: аудитория кафедры эпизоотологии.

Оспа — контагиозная вирусная болезнь млекопитающих и птиц многих видов, вызываемая представителями семейства Poxviridae.

Методы диагностики. При типичном течении оспы для постановки диагноза вполне достаточно анализа эпизоотологических данных и клинической картины болезни. В сомнительных случаях исследуют под микроскопом мазки из свежих папул, окрашенные по методу Морозова. При световой микроскопии на желтом фоне препарата видны темно-коричневые элементарные тельца размером 2…20 • 10

При атипичном течении болезни для идентификации возбудителя прибегают к биопробе. Материалом от коров заражают кроликов, от свиней — поросят, от овец и коз — ягнят и козлят. Суспензию (1 : 10) вируссодержащего материала вводят подопытному животному в дозе 0,2…0,5 мл.

Дополнительными методами диагностики служат РИФ и РИД. Вирус выделяют, заражая культуру клеток и куриные эмбрионы.

Профилактические и оздоровительные мероприятия. Чтобы предупредить возникновение болезни, необходим ряд ветеринарно-санитарных мер: карантин вновь поступающих животных, исключение контакта животных разных хозяйств, ветеринарный контроль за поступлением кормов.

При возникновении оспы среди овец, коз, верблюдов и птиц на хозяйство накладывают карантин, при оспе коров, лошадей, свиней и других млекопитающих животных вводят ограничения. Больных и подозрительных по заболеванию животных изолируют и лечат. Клинически здоровых овец и коз переводят в другое помещение или на другой участок пастбища и вакцинируют. Для активной иммунизации овец против оспы применяют сухую культуральную вирусвакцину из штамма НИСХИ, живую сухую вакцину из штамма ВНИИЗЖ и сухую культуральную вакцину из штамма ВНИИВВиМ. Помещения дезинфицируют 3%-м раствором каустической соды, 2%-м раствором формальдегида.

Карантин с хозяйства снимают через 20 дней после полного выздоровления, падежа или убоя больных оспой овец и коз, заключительной дезинфекции и обработки кожного покрова всех животных. Ограничения при оспе коров и свиней снимают через 21 день. В птицеводческих хозяйствах больное поголовье убивают, мясо используют после проварки, условно благополучное — прививают против оспы сухой эмбрионвирусвакциной из штамма 27-AlU. Карантин с хозяйства снимают через 2 мес после ликвидации болезни и заключительной дезинфекции.

ЗАДАНИЕ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

Решить эпизоотологические задачи.

Задача 1. В овцеводческом хозяйстве в одной отаре в осеннюю дождливую погоду среди овец всех возрастов возникло массовое заболевание, которое наиболее тяжело проявилось у молодняка. Болезнь начиналась угнетением, анорексией и лихорадкой. Одновременно отекали веки, появлялись серозно-слизистые и серрозно-гнойные выделения из глаз и носа. Через 2…3 дня с начала болезни обнаруживали сыпь на коже головы, губах и крыльях носа, вокруг глаз, на внутренних поверхностях передних и задних

1. Установить диагноз, организовать лечение больных овец.

2. Разработать мероприятия по охране других отар от заноса

3. Составить план мероприятий по ликвидации данной инфекции в хозяйстве.

Задача 2. На птицеферме в одной секции возникло массовое

Заболевание птиц со следующими клиническими признаками: катаральное воспаление слизистых оболочек верхних дыхательных путей и ротовой полости. Через 2…3 дня появились беловатые возвышающиеся наложения округлой формы и желто-белой окраски, которые, сливаясь друг с другом, образовывали наложения, напоминающие сыр и глубоко проникающие в слизистые оболочки.

2. Разработать план мероприятий по профилактике болезни в остальных птичниках и ликвидации эпизоотического очага.

источник

1. Обнаружение в патологическом материале вирусных оспенных частиц;

2. Выделение вируса на куриных эмбрионах;

4. Микроскопическое выявление в патологическом материале элементарных телец;

5. Заражение куриных эмбрионов, а в сомнительных случаях — проведение биопробы на чувствительных животных;

6. Индикацию вирионов оспы методом световой микроскопии;

7. Выделение вируса на куриных эмбрионах или на цыплятах;

8. Идентификацию выделенного вируса методом световой микроскопии, вирусоскопии, РИФ и РДП [1].

В ветеринарную лабораторию направляют 5…6 клинически больных или павших птиц (куры, индейки, голуби, канарейки и др.)

Из свежих оспин или с мест поражений слизистых оболочек птиц готовят на предметных стеклах тонкие мазки – отпечатки для микроскопического исследования. Одновременно отбирают патологический материал (эпителиомы, дифтерические наложения) для выделения вируса.

Отобранный патологический материал тщательно растирают в ступке со стерильным битым стеклом и готовят 10% — ную суспензию на стерильном физиологическом растворе с рН 7,2…7,4, которую затем обрабатывают в течение 12 ч при 4 градусах смесью в составе 500 ЕД/мл пенициллина, 250 мкг/мл стрептомицина и 50 ЕД/мл нистатина. После указанной обработки суспензию центрифунгируют 10 мин при 1500 об/мин и делают высевы на МПБ, МПА с целью исключения бактериальной контаминации.

Для обнаружения вирусных оспенных частиц приготовленные мазки – отпечатки подсушивают на воздухе, перед окраской выдерживают 10…15 мин в дистиллированной воде и окрашивают методом серебрения по Морозову или по методу Пашена. При микроскопическом исследовании мазков (окраска по Морозову) на светло – коричневом фоне препарата обнаруживают вирусные оспенные частицы в виде мелких круглых образований темно – коричневого или черного цвета, расположенных поодиночке, парно, короткими цепочками или скоплениями; при окрашивании препаратов по Пашену при наличии вирусных оспенных частиц в поле зрения микроскопа видны мелкие округлые образования темно – красного цвета.

Также вирус оспы птиц выделяют на 10…12 – суточных КЭ, полученных из хозяйства, благополучного по инфекционным болезням птиц. Из полученной и обработанной 10% — ной суспензии, свободной от контаминации микрофлорой, дополнительно готовят суспензию на физиологическом растворе 10-2 и 10-3 и затем каждым разведением в объеме по 0,2 мл заражают на хорионаллантоисную оболочку (ХАО) по 4 эмбриона. После заражения КЭ инкубируют в течение 6 сут в термостате при 36,5…36,7 о С и относительной влажности 60…70%. Эмбрионы ежедневно овоскопируют. КЭ, погибшие в первые 48 ч после заражения, не учитывают (неспецифическая гибель). Эмбрионы, погибшие на 3 – и сутки и позже и все оставшиеся живыми на 6 – е сутки после заражения, охлаждают в холодильнике при 4оС в течение 4…5ч, затем их вскрывают и просматривают состояние ХАО. В положительных случаях на ХАО обнаруживают отдельно расположенные или слившиеся оспины. При обнаружении на ХАО оспин надо учитывать, что вирус оспы кур вызывает образование на ХАО мелких плоских поражений, иногда обширных, беловатого цвета. Из оспенных поражений ХАО делают тонкие мазки или мазки – отпечатки на предметных стеклах и окрашивают методом серебрения по Морозову или по методу Пашена для выявления в них вирусных (оспенных) частиц.

В случае неясности результатов, полученных при выделении вируса в первом пассаже, проводят второй последовательный пассаж испытуемого вируса.

Биологическую пробу ставят в случаях получения сомнительных результатов исследований мазков – отпечатков и при выделении вируса на КЭ.

Биопробу проводят на неиммунных к вирусу оспы цыплятах 3…4 – месячного возраста, полученных из хозяйств, благополучных по инфекционным болезням птиц. Суспензию исследуемого материала, приготовленную, как указано в п. 2.3, втирают в слегка скарифицированную поверхность гребня и в фолликулы голени сразу после выщипывания перьев. При наличии в исследуемом материале вируса оспы птиц на 5…6 – й день после заражения на гребне появляются характерные эпителиомы, а на голени – типичный для оспы фолликулит. При микроскопическом исследовании мазков – отпечатков, приготовленных из эпителиом гребня или из пораженных фолликулов голени и окрашенных методом серебрения по Морозову или по методу Пашена, обнаруживают вирусные оспенные частицы.

Лабораторный диагноз на оспу считают установленным в случаях: обнаружения в мазках – отпечатках из патологического материала вирусных оспенных частиц; выделения возбудителя оспы на КЭ; получения положительных результатов биологической пробы.

Сроки исследований: микроскопических – 1 день; выделение вируса на КЭ – 6 сут; при проведении второго пассажа – 12 сут; биологичкой пробы – 8 сут. [2].

Библиографический список

Барышников, П. И. Ветеринарная вирусология [Текст] : учебное пособие для студ. вузов, обучающихся по спец. 111201 — «Ветеринария» : рек. УМО по образованию / П. И. Барышников. — М. : ФОРУМ, 2009. – С. 14 – 16.

Барышников, П.И. Лабораторная диагностика вирусных болезней животных [Электронный ресурс] : учеб. пособие / П.И. Барышников, В.В. Разумовская. — Санкт-Петербург : Лань, 2015. — С. 443 – 446.

источник

1. БОЛЕЗНИ, ОБЩИЕ ДЛЯ ВСЕХ ИЛИ НЕСКОЛЬКИХ ВИДОВ ЖИВОТНЫХ

1.6. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ОСПЫ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, ОВЕЦ, КОЗ, СВИНЕЙ И ВЕРБЛЮДОВ

УТВЕРЖДЕНЫ 12 ноября 1985 г., N 115-6а

1.1. Оспа — контагиозная болезнь животных, протекающая с признаками аутоинтоксикации, лихорадки и узелково-пустулезной сыпи на коже (экзантемы) и на слизистых оболочках (энантемы), проходящей определенные стадии формирования: розеола — везикула — папула — пустула — струп.

1.2. Оспа у разных видов животных вызывается следующими вирусами:

— крупный рогатый скот — оспы коров или осповакцины;

— овцы — оспы овец;

— козы — оспы коз;

— свиньи — оспы свиней, оспы коров или осповакцины;

— верблюды — оспы верблюдов, оспы коров или осповакцины.

1.3. Лабораторная диагностика оспы животных включает в себя:

— обнаружение в патологическом материале оспенных частиц (вирионов) методом вирусоскопии;

— обнаружение цитоплазматических ацидофильных включений в пораженных участках кожи больного или зараженного животного гистологическим методом;

— выделение вируса на куриных эмбрионах (КЭ) с последующей его идентификацией;

— биологическую пробу (в сомнительных случаях) на естественновосприимчивых животных.

2.1. Патологический материал отбирают не менее чем с 5 участков пораженной кожи. Для сбора и консервирования материала используют стерильные инструменты, посуду и консервирующие растворы.

Материал от больных животных, обработанных моющими или дезинфицирующими растворами (едкого натра и др.), к исследованию не пригоден.

2.2. Для исследования в лабораторию направляют:

— мазки, сделанные из содержимого везикул больного животного, и мазки-отпечатки с оспенных поражений кожи;

— патологический материал от больных животных (содержимое везикул, целые папулы и пустулы, иссеченные вместе с субэпидермальной отечной тканью).

2.3. Мазки высушивают на воздухе, складывая так, чтобы они не соприкасались между собой, и упаковывают в целлофан.

2.4. Везикулярную жидкость собирают в капилляры пастеровских пипеток, которые затем помещают в пробирки с резиновыми пробками.

2.5. Папулы и пустулы иссекают ножницами вместе с отечной тканью и помещают в два стерильных флакона: один — с 50%-ным раствором глицерина, второй — с 10%-ным раствором формалина.

2.6. Отобранный материал (пробирки и флаконы с патологическим материалом предварительно обрабатывают снаружи 3%-ным раствором хлорамина) упаковывают в металлические коробки или пеналы и направляют с нарочным в лабораторию. Неконсервированный материал доставляют в термосе со льдом в день отбора.

3.1. Для обнаружения вирусных оспенных частиц (вирионов) исследуют мазки и мазки-отпечатки из патологического материала окрашенные по методу Морозова или Пашена (см. приложение 1).

При микроскопии в препаратах обнаруживают множество мелких частиц кокковидной формы, расположенных поодиночке, парами или в виде скоплений. При окраске по Морозову оспенные частицы имеют темно-коричневый цвет, по Пашену — темно-красный.

3.2. Результат исследования считают положительным только при обнаружении вирионов в массовом количестве (в виде россыпей). При отрицательном результате вирусоскопического исследования, а также при обнаружении единичных вирионов проводят дальнейшие исследования.

4.1. Из фиксированных формалином проб кожи на замораживающем микротоме готовят срезы, которые окрашивают гематоксилин-эозином.

Ознакомиться с документом вы можете, заказав бесплатную демонстрацию систем «Кодекс» и «Техэксперт».

источник

Методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, учреждений и структурных подразделений других федеральных органов исполнительной власти, выполняющих в установленном порядке работы по диагностике натуральной оспы и ее дифференциации от клинически сходных заболеваний, а также осложнений после прививки оспенной вакцины. Методические указания определяют правила организации и выполнения исследований при лабораторной диагностике натуральной оспы: взятие материала от заболевшего, подготовка проб для исследования, хранение, транспортирование проб, проведение диагностического исследования с помощью методов экспресс-диагностики и выделения возбудителя, учет и регистрация результатов.

Ф едеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей
и благополучия человека

Л абораторная диагностика
натуральной оспы

1. Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Ю.В. Демина, Е.Б. Ежлова, Н.В. Шеенков); ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (С.С. Маренникова, С.Н. Щелкунов, Е.И. Рябчикова, М.П. Богрянцева, Е.В. Гаврилова, А.П. Агафонов, А.Н. Сергеев); ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН (Г.Р. Мацевич, Н.Н. Янова); ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН (Э.Б. Гурвич).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 14 декабря 2011 г.

3. Введены в действие 14 декабря 2011 г.

4. Введены взамен Инструкции по лабораторной диагностике натуральной оспы, утвержденной Заместителем министра здравоохранения СССР П.Н. Бургасовым 4.04.1972.

Руководитель Федеральной службы

по надзору в сфере защиты прав

потребителей и благополучия человека,

Главный государственный санитарный

врач Российской Федерации

Дата введения: 14 декабря 2011 г.

Лабораторная диагностика натуральной оспы

1.1. Методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, учреждений и структурных подразделений других федеральных органов исполнительной власти, выполняющих в установленном порядке работы по диагностике натуральной оспы и её дифференциации от клинически сходных заболеваний, а также осложнений после прививки оспенной вакцины.

1.2. Методические указания определяют правила организации и выполнения исследований при лабораторной диагностике натуральной оспы (далее оспы): взятие материала от заболевшего, подготовка проб для исследования, хранение, транспортирование проб, проведение диагностического исследования с помощью методов экспресс-диагностики и выделения возбудителя, учет и регистрация результатов.

1.3. Методические указания разработаны в соответствии с Федеральным законом от 31 марта 1999 г. «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» № 52-ФЗ [1], Федеральным законом от 10 января 2002 г. «Об охране окружающей среды» № 7-ФЗ [2], постановлением Правительства Российской Федерации от 15 сентября 2005 г. № 569 «О положении об осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора в Российской Федерации» (Собрание законодательства Российской Федерации, 2005, № 39, ст. 3953) [3], требованиями Международных медико-санитарных правил (2005 г.) [4, 5].

1. Федеральный закон от 31.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».

8. СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I — II групп патогенности (опасности)».

9. СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I — IV групп патогенности».

10. МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I — IV групп патогенности».

11. МУ 3.3.1.2044-06 «Проведение вакцинопрофилактики натуральной оспы».

13. МУ 3.4.2552-09 «Организация и проведение первичных противоэпидемических мероприятий в случаях выявления больного (трупа), подозрительного на заболевания инфекционными болезнями, вызывающими чрезвычайные ситуации в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения».

3.1. Натуральная оспа — острое инфекционное высококонтагиозное особо опасное заболевание вирусной этиологии, относящееся к карантинным инфекциям. Возбудитель — ДНК-содержащий вирус, принадлежащий к семейству Poxviridae , роду Orthopoxviruses .

3.2. Естественным резервуаром вируса является больной (а также умерший) человек. Заболевший натуральной оспой человек заразен от начала болезни до полного освобождения от корок. Заражение происходит воздушно-капельным, воздушно-пылевым или контактно-бытовым путями; вирус может также передаваться внутриутробно. Наиболее заразительным является период с 4 по 9 день болезни, когда во внешнюю среду при разговоре, кашле и чихании больного с отделяемым слизистых полости рта и зева выделяется большое количество вируса. В дальнейшем источником вируса является в основном содержимое кожных элементов и вируссодержащая пыль из отпавших и подсыхающих корок. Помимо этого заражение может произойти за счет контаминированных вирусом воздуха, белья больного и предметов.

3.3. В результате успешно проведенной под эгидой Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) международной программы (1958 — 1980 гг.) натуральная оспа была искоренена во всем мире. По рекомендации глобальной комиссии по сертификации ликвидации оспы вакцинация против этой инфекции была отменена в 1980 г.

По решению ВОЗ, коллекции штаммов этого возбудителя сохраняются для научных целей в двух Сотрудничающих центрах ВОЗ, регулярно контролируемых этой организацией:

• по диагностике ортопоксвирусных инфекций и музей штаммов и ДНК вируса оспы на базе ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (Россия, Новосибирская область, р. п. Кольцово);

• по оспе и другим поксвирусным инфекциям на базе Центра контроля и предупреждения инфекционных заболеваний (США, Атланта).

3.4. В освобожденном от натуральной оспы мире при отсутствии природного резервуара возбудителя этой инфекции эпидемический процесс может возникнуть снова только при артифициальном заражении. В этом случае источником инфекции может служить вируссодержащий материал, привнесенный в окружающую среду в результате совершения акта биотерроризма или иных причин (внутрилабораторное инфицирование, вскрытие затерянных или забытых хранилищ вируса, а также захоронений умерших от оспы, в некоторых из которых благодаря особым условиям не исключено сохранение жизнеспособного вируса). В результате может возобновиться трансмиссия оспы с передачей инфекции от человека к человеку. При этом резкое падение коллективного иммунитета к оспе у населения и его полное отсутствие у лиц, родившихся после отмены оспопрививания, может привести к более агрессивному, чем ранее, распространению инфекции.

3.5. Опыт борьбы с завозными вспышками оспы в прошлом показал, что клинический диагноз у первых заболевших этой инфекцией в большинстве случаев оказывался неверным. На сегодняшний день эта ситуация усугубляется тем, что современное поколение инфекционистов не встречалось с оспой и знает о ней только по описанию в литературе. В этой связи лабораторная диагностика как никогда раньше становится важнейшим звеном в предупреждении распространения оспы.

В случае чрезвычайной ситуации санитарно-эпидемиологического характера диагностические исследования без выделения возбудителя натуральной оспы (молекулярно-генетические и иммунологические) по поручению Главного государственного санитарного врача Российской Федерации могут осуществлять лаборатории, имеющие лицензии на проведение экспериментальных и диагностических видов работ с возбудителями инфекционных заболеваний 1 группы патогенности.

Врач, выявивший на дому больного с подозрением на натуральную оспу, обязан незамедлительно организовать следующие первичные противоэпидемические мероприятия:

• изолировать больного, снабдив его бельем, посудой, приемником выделений, предметами ухода за больным, личной гигиены и прочими необходимыми вещами, закрыть окна и дверь;

• принять меры для исключения контактов больного с окружающими;

• организовать проведение текущей дезинфекции в помещении, где находится больной до момента его госпитализации;

• срочно известить доступными способами руководство своего учреждения о выявлении подозрительного на натуральную оспу больного;

• собрать предварительные сведения о возможном источнике заражения и круге контактировавших с больными лиц.

Далее информация о выявлении подозрительного на натуральную оспу больного должна быть незамедлительно передана в местные и вышестоящие органы и учреждения санитарно-эпидемиологического надзора по подчиненности, Федерального медико-биологического агентства, отделы и управления здравоохранением по подчиненности, территориальные органы власти и заинтересованные ведомства.

Указанные органы направляют в очаг по месту выявления (или госпитализации) больного группу в составе эпидемиолога, опытного инфекциониста и вирусолога для верификации диагноза и эпидемиологического расследования.

Порядок проведения противоэпидемических и дезинфекционных мероприятий, направленных на обеспечение общественной и личной безопасности граждан при локализации и ликвидации очага (очагов) натуральной оспы при ее появлении на территории Российской Федерации вследствие биотеррористических акций или иных обстоятельств определен в МУ 3.1/3.5.2497-09 «Организация и проведение противоэпидемических и дезинфекционных мероприятий при натуральной оспе» [12].

4.1. Взятие проб осуществляют врачи вирусологи, прошедшие специальную подготовку и имеющие недавнюю (в пределах 3 лет) успешную прививку против оспы. Если к взятию проб привлекается невакцинированный сотрудник, то это может быть только тот, который не имеет противопоказаний к вакцинации. Последняя может потребоваться при подтверждении диагноза оспы. Для взятия проб необходимо иметь с собой упаковку с соответствующими стерильными инструментами, одноразовой пластиковой лабораторной посудой и материалами, перечень которых см. в приложении 1. Процедура взятия проб должна выполняться в соответствии с правилами противоэпидемического режима: работа в защитной одежде, маске, очках и перчатках, соблюдение мер личной и общественной безопасности и др. (см. СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I — II групп патогенности (опасности)») [8].

• содержимое кожных поражений (в зависимости от стадии болезни — везикул, пустул, корочки, соскоб со дна пузырьков, макул или папул);

• мазки с задней стенки глотки и миндалин;

• в случае смерти — кусочки органов умерших.

4.2.1. Для вирусологического и других исследований содержимое везикул или пустул отсасывают туберкулиновым шприцем, прокалывая стенку пузырька у его основания; для этой цели может использоваться игла, конец которой помещают над открытой пробиркой и несколько наклоняют его вниз, что облегчает отток жидкости. При недостаточной наполненности пузырьков в периоде подсыхания пустул для получения пробы применяют два способа. После вскрытия пузырька скальпелем или другим острым инструментом сбор остатков жидкости производят небольшими ватными тампонами (на коротком стержне), которые помещают затем в сухую пробирку, отламывая при необходимости стержни. При затруднении в использовании вышеописанного способа скальпелем или маленькими ножницами срезают верхушки пузырьков и помещают их в отдельную пробирку. Корочки отделяют глазным пинцетом.

Собранный из 6 — 10 однородных кожных элементов больного материал, как уже указывалось, помещают в пластиковые пробирки или флаконы с герметически завинчивающимися крышками. Крышки дополнительно фиксируют — например, парафинизированным полиэтиленом (парафильмом), липкой лентой, расплавленным парафином [14].

Взятие пробы для электронноскопического исследования производят путем легкого прикосновения подготовленной электронноскопической сеточки к основанию вскрытого пузырька (везикулы или пустулы). Используя этот же прием, следует сделать отпечатки на не менее чем трех сеточках, каждый раз несколько меняя давление на основание пузырька. Материал на сеточках должен просохнуть на воздухе. Сетки помещают в специальную коробку или ячейку коробки и записывают, какая ячейка использовалась для данного образца. Коробку обертывают фольгой или адгезивной пленкой.

Помимо этого, на обезжиренных предметных стеклах делают мазки соскоба или содержимого пузырьков, а также мазки-отпечатки с основания кожных элементов и мест удаления плотно «сидящих» корочек (по 2 — 3 мазка). Мазки высушивают на воздухе в течение 20 мин. Затем стекла маркируют, складывают таким образом, чтобы они не соприкасались между собой той стороной, на которой сделан мазок, и помещают их в специальную пластиковую коробку для стекол. Коробку заворачивают в фольгу или обертывают адгезивной пленкой.

Внимание! Мазки на предметных стеклах и электронноскопических сеточках могут быть сделаны у постели больного только в том случае, если у берущего пробы вирусолога имеются соответствующие навыки.

В противном случае это делается в диагностической лаборатории, куда будут направлены пробы.

4.2.2. При отсутствии у больного кожных поражений, что может иметь место в ранней стадии болезни или при некоторых формах оспы (оспа без сыпи, ранняя геморрагическая оспа), берут мазки с задней стенки глотки и миндалин. Процедуру осуществляют с помощью ватных тампонов на стержне, который затем опускают в пластиковую пробирку или флакон, не добавляя жидкости, и герметически ее закрывают. Мазки из зева следует брать и при недостаточном количестве материала из кожных поражений.

4.2.3. Кровь для обнаружения вируса берут из локтевой вены в количестве 4,5 мл шприцем, в который предварительно набирают 0,5 мл стерильного антикоагулянта. Кровь выливают в пробирку, которую осторожно встряхивают, чтобы предотвратить свёртывание крови, и герметично закрывают. Одновременно берут кровь (5 — 10 мл) для получения сыворотки, необходимой для серологического исследования, и 1 мл для проведения МПЦР.

4.4. В случае смерти больного с подозрением на оспу при аутопсии берут фрагменты кожи с поражениями, кусочки лимфатических узлов и внутренних органов (легких, печени, почек, селезёнки) предпочтительнее с макроскопически видимыми поражениями отдельно для вирусологического и патогистологического исследования. В последнем случае кусочки органов размером до 1 ´ 2 ´ 3 см помещают в пластиковые флаконы, используя отдельный флакон для каждого кусочка, и заливают 8 мл 4 %-го раствора параформальдегида. Фиксация образцов в параформальдегиде обеспечивает их обеззараживание в течение 48 ч. Порядок обращения с образцами для вирусологического исследования аналогичен описанному в пп. 4.2, 4.3 и разделе 5.

4.5. После завершения сбора образцов от больного (больных) все инструменты и подсобные материалы, а также использованные средства индивидуальной защиты (перчатки, халат и пр.) дезинфицируют согласно требованиям СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I — II групп патогенности (опасности)» [8].

Упаковку и транспортировку проб для исследования осуществляют в соответствии с требованиями СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I — IV групп патогенности» [9], МУ 3.4.2552-09 «Организация и проведение первичных противоэпидемических мероприятий в случаях выявления больного (трупа), подозрительного на заболевания инфекционными болезнями, вызывающими чрезвычайные ситуации в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения» [13] и WHO/HSE/EPR/2008.10 «Рекомендации по правилам перевозки инфекционных материалов» [14].

Маркированные и герметично закрытые пробирки, флаконы с пробами и коробку с мазками от каждого больного помещают отдельно, перекладывая адсорбирующим материалом (например, ватой) в двойной пластиковый пакет, который затем заклеивают или запаивают. Количество адсорбирующего материала должно быть достаточным для того, чтобы поглотить всю жидкость в случае повреждения упаковки. Не допускается упаковка образцов материалов от разных людей в один и тот же пакет.

Заклеенные пакеты с образцами помещают в закрывающийся (с возможностью опломбирования) металлический или пластиковый контейнер, на дне которого размещают адсорбирующий материал (марлевая салфетка , ткань, вата и пр.), смоченный раствором дезинфицирующего средства.

Контейнер с материалом подписывают (фамилия, имя, отчество больного (больных), дата взятия и вид материала), опечатывают, помещают в специальный переносной термоизолирующий контейнер, укомплектованный охлаждающими элементами, и транспортируют в лаборатории, указанные выше (см. п. 3.6). Транспортирование осуществляется нарочным, информированным о правилах доставки материала.

Сопроводительные документы составляют в двух экземплярах: один отправляют вместе с пробами в лабораторию, второй (копия) остается у лица, направляющего пробы на исследование. В сопроводительном документе указывают фамилию, имя, отчество, возраст больного, диагноз, даты начала заболевания, появления сыпи, взятия материала, характера материала для исследования, фамилию врача, взявшего пробы. Указывают, был ли привит заболевший против оспы и примерную дату вакцинации, отмечают наличие или отсутствие рубцов после вакцинации, характер контакта с предполагаемым источником инфекции. Указывают адрес места назначения, адрес, фамилию и телефон отправителя. Делается надпись: «Инфекционный материал». Перед транспортированием срочно извещают специализированную лабораторию, в которую направляется материал.

Все работы по проведению исследования материала проводят с соблюдением требований СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I — II групп патогенности (опасности)» [8].

Схема проведения лабораторного исследования приведена на рис. 3 (прилож. 8).

6.1. Учитывая, что фактор времени при появлении оспы имеет огромное значение для эффективности противоэпидемических мероприятий, обработка и исследование взятых у больных (или подозреваемых на заболевание) проб должны начинаться немедленно после поступления материала в лабораторию. В ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» исследование начинают одновременно методами ускоренной диагностики, включая электронную микроскопию, и путем выделения возбудителя. В других лабораториях, имеющих соответствующую лицензию, используют молекулярно-генетические и иммунологические методы ускоренной диагностики.

К методам ускоренной диагностики относятся:

• электронная микроскопия содержимого кожных поражений и мазков из глотки;

• обнаружение ортопоксвирусного антигена в обработанных пробах с помощью соответствующей тест-системы ИФА;

• выявления антител к ортопоксвирусам в сыворотке крови в соответствующей тест-системе ИФА;

• полимеразно-цепная реакция (ПЦР), в т.ч. мультиплексная полимеразная цепная реакция (МПЦР).

Проведение исследования с помощью электронной микроскопии и иммуноферментного анализа позволяет дать ответ в течение 2 — 4 ч после начала исследования. (Если используется набор реагентов для ИФА с планшетами, требующими предварительной сенсибилизации, то время проведения ИФА увеличивается до 22 — 26 ч). Эти методы не позволяют дифференцировать вирус оспы от других патогенных для человека ортопоксвирусов (вирусов вакцины, оспы обезьян и оспы коров). МПЦР обеспечивает не только идентификацию ДНК вируса оспы, но и ее дифференциацию от близкородственных патогенных для человека ортопоксвирусов. Время проведения теста 5 — 6 ч.

6.2. Обнаружение при электронной микроскопии вирионов группы герпеса при отсутствии вирионов оспенной группы и ортопоксвирусного антигена позволяет дать заключение о герпетической природе заболевания. При наличии в исследуемом материале ортопоксвирусных вирионов и/или ортопоксвирусного антигена внутривидовая дифференциация осуществляется с помощью МПЦР.

6.3. Для подтверждения диагноза и всесторонней характеристики возбудителя проводят выделение возбудителя на куриных эмбрионах или в культуре клеток.

6.4. При необходимости установления диагноза при отсутствии соответствующих тест-систем ИФА и невозможности исследовать пробу с помощью МПЦР можно использовать вспомогательные методы, описанные в разделе 10.

При подготовке проб следует учесть необходимость сохранить часть материала для контрольных и повторных исследований.

7.1. Для электронной микроскопии везикулярную и пустулезную жидкости исследуют неразведенными и в разведении 1:5 (на дистиллированной воде). При исследовании корок, их (в количестве 1 — 2) растирают в маленькой фарфоровой ступке или помещают на часовое стекло, покрывают 1 — 2 каплями дистиллированной воды, через 5 — 10 мин измельчают скальпелем и слегка растирают. Жидкая фракция представляет собой материал для исследования.

Мазки-отпечатки или мазки соскобов со дня пузырьков, макул или папул смывают 1 — 2 каплями дистиллированной воды и полученную взвесь используют для приготовления препаратов для электронноскопического исследования (негативное контрастирование). Последние готовят следующим образом. На покрытое парафином предметное стекло помещают последовательно три капли: 1) исследуемого материала; 2) дистиллированной воды и 3) 2 %-го раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты с рН 7,0. Заранее подготовленную (покрытую формваром или парлодием и напыленную углем) сетку для адсорбции вируса опускают на 30 — 60 с в каплю исследуемого материала, затем (для промывки) на 3 с в каплю дистиллированной воды и для контрастирования препарата на 30 — 40 с в каплю фосфорно-вольфрамовой кислоты. После каждого погружения сетку просушивают лёгким прикосновением её края к фильтрованной бумаге * .

* Обычно используют сетки, предназначенные для исследований взвесей. Их приготовление описано в прилож. 2.

Электронноскопические сетки, на которые была нанесена проба у постели больного, следует обрабатывать, начиная с промывки * .

* Для негативного контрастирования может быть использован также насыщенный водный или спиртовый раствор уранилацетата.

Если в зоне повышенной безопасности нет электронного микроскопа, то перед выносом сеток для просмотра их обеззараживают парами 37 %-го формальдегида и ультрафиолетовым облучением. Один из способов описан ниже. В 60 мм чашку Петри, содержащую приготовленные сетки, помещают небольшой пластиковый контейнер (15 мм в диаметре) с 10 каплями концентрированного (37 %-го) раствора формальдегида. Чашку Петри закрывают и ставят в большую (150 мм) чашку Петри без крышки, куда налит тонкий слой 5 %-го раствора хлорамина. Все помещается в предназначенное окно под ультрафиолетовые лучи. Источник облучения 15W ультрафиолетовая лампа, расстояние до объекта 5 см, время облучения 30 мин.

7.2. Для выявления ортопоксвирусного антигена в ИФА используют корки, жидкость из пузырьков, соскобы с кожных элементов, кровь, мазки из зева, кусочки органов умерших: корки, соскобы и кусочки органов гомогенизируют и добавляют физиологический раствор или фосфатно-цитратный буфер Мак-Ильвейна (рН 7,2; см. прилож. 3) в количестве, необходимом для получения суспензий в разведении примерно 1:5 — 1:50. Везикулярную и пустулезную жидкости используют цельными или, в зависимости от количества материала, разведенными 1:5 — 1:50.

Взятую для выделения вируса кровь (со стерильным антикоагулянтом) центрифугируют при 450 g ; плазму и светлый (лейкоцитарный) слой отсасывают раздельно, каждую фракцию разводят 1:2 буферным раствором Мак-Ильвейна (рН 7,2) и исследуют по отдельности.

Тампоны с отделяемым зева смывают 1,0 мл физиологического раствора или фосфатно-солевого буфера и исследуют.

7.3. Эти же подготовленные материалы используют для молекулярно-биологического исследования, изоляции вируса в клеточной культуре или куриных эмбрионов и других тестов (см. далее).

Перед заражением эмбрионов или культуры клеток в исследуемые материалы добавляют антибиотики (пенициллин, гентамицин или другие) в везикулярную жидкость и кровь — в расчете 200 ед./мл, в остальные материалы — по 500 ед./мл.

7.4. Для выявления антител к ортопоксвирусам из взятой для этой цели порции крови отсасывается сыворотка, которая исследуется в соответствующей тест-системе ИФА.

Просмотр подготовленных сеток проводят при увеличении 15000 — 20000. Обнаружение ортопоксвирусов осуществляется по характерной форме, структуре и размеру вирионов. Форма ортопоксвирусов может быть кирпичеобразной, либо овальной, размер 200 ´ 300 нм. Следует иметь в виду, что иногда вирионы адсорбируются на сетку меньшей плоскостью (торцом), и тогда они имеют вид округлых частиц диаметром около 150 нм.

Как правило, у большинства вирионов внутренняя структура не выявляется. Вместе с тем, у некоторых обнаруживается двухслойная наружная мембрана, разделённая электроннооптически плотным пространством, заполненным фосфорно-вольфрамовой кислотой, у других — на поверхности видны характерные удлиненные трубчатые структуры. Во внутренней полости вириона находится нуклеоид, который выявляется как структура низкой электроннооптической плотности (светлое образование двояковогнутой формы на тёмном фоне перенуклеоидного пространства, заполненного фосфорно-вольфрамовой кислотой). Вирионы могут располагаться по одиночкам или группами. Главными критериями (кроме формы и размеров), облегчающими идентификацию ортопоксвирусов, являются наличие поверхностных трубочек и нуклео-ида характерной двояковогнутой формы (рис. 1).

При проведении диагностических электронноскопических исследований могут быть выявлены возбудители заболеваний, протекающих с кожными поражениями. К их числу относятся вирусы группы герпеса (ветряной оспы, простого герпеса) и парапоксвирусы (рис. 2). Первые имеют меньшие размеры (110 — 120 нм), округлую форму и сферический нуклеоид. Неповреждённые вирионы группы герпеса окружены внешней оболочкой, имеющей неправильную форму с выступами (рис. 2). Вирионы парапоксвируса имеют не кирпичеобразную, а овоидную форму, меньшие размеры и отличаются от ортопоксвирусов характером поверхностного рельефа. При обнаружении вирионов их детальное изучение проводят при увеличении 50000 и более.

На рис. 1 приведен вид ортопоксвирусов при негативном контрастировании.

Рис. 1. Вирионы ортопоксвирусов

Рис. 2. Вирионы вируса ветряной оспы (А и Б) и вирионы парапоксвируса (В)

А — вирус ветряной оспы с наружной оболочкой-конвертом при увеличении 100000;

Б — тот же вирус без наружной оболочки при увеличении 168000;

В — вирионы парапоксвирусов (паравакцины)

Заключение о результатах исследования основывается на данных просмотра не менее 2 сеток от больного. Обнаружение 3 и более вирионов с характерной для ортопоксвирусов морфологией считается достаточным для заключения о наличии в материале ортопоксвирусов. Для отрицательного заключения в каждой из двух сеток просматривают не менее 1/4 ячеек в течение 30 мин.

Иммунная электронная микроскопия

Эффективность выявления возбудителей вирусных инфекций многократно возрастает при обработке материала специфической сывороткой — использовании так называемой иммунной электронной микроскопии (ИЭМ). Метод позволяет увеличить количество выявляемых вирионов, обнаруживать их уже на первых минутах просмотра, а также выявлять вирус в препаратах с низкой его концентрацией. Приготовление препаратов для иммунной электронной микроскопии производится следующим образом. Готовят 4 %-й агар «Difco» на физиологическом растворе или фосфатно-солевом буфере (рН 7,2) путём нагревания флакона в кипящей водяной бане. Агар растапливают и охлаждают до 56 °С, затем смешивают с равным объёмом сыворотки кролика, гипериммунизированного вирусом вакцины, в разведении 1:12 и 1:24 (разведения делают на фосфатно-солевом буфере — рН 7,2). Полученные смеси после тщательного перемешивания разливают в лунки полистироловых пластин (до края лунки) и маркируют. После застывания агара на его поверхность наносится по 25 — 30 мкл исследуемого материала.

На каплю помещается две — три электронноскопических сеточки, покрытые формваровой подложкой, стабилизированной углеродом. В таком виде материал оставляют на 25 — 30 мин при комнатной температуре. Затем сеточки снимают, излишек жидкости удаляют фильтровальной бумагой и помещают в каплю раствора 2 %-й фосфорно-вольфрамовой кислоты (рН 7,0) на 1 — 2 мин.

Обычно при ортопоксвирусных инфекциях в первые 10 мин просмотра обнаруживаются скопления вирионов ортопоксвируса. Условия для отрицательного заключения те же (см. п. 8.1.1).

Иммуноферментный анализ (ИФА) основан на специфическом взаимодействии антигена и антитела с предварительной иммобилизацией (фиксацией) одного из компонентов реакции (антигена или антител) на твердофазном носителе (в лунках полистироловых планшетов, стрипов и др.) и выявления образовавшегося комплекса антиген-антитело посредством ферментной метки (конъюгата). Выявление образовавшегося комплекса осуществляется по изменению интенсивности окраски (оптической плотности) субстратной смеси, содержащей вещество, с которым реагирует фермент, и индикатор, изменяющий цвет под действием продуктов реакции фермент-субстрат.

Для детекции антигена ортопоксвирусов в материалах от больных используют иммуноферментные тест-системы для выявления антигена ортопоксвирусов, зарегистрированные в Российской Федерации в установленном порядке. Эти наборы реагентов предназначены для выявления антигена ортопоксвирусов (натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, вакцины и др.) в везикулярной и пустулёзной жидкостях, суспензии корок и других материалах, полученных от людей и животных, в культуральной жидкости инфицированных клеточных культур. Детальное описание постановки ИФА, учёта и оценки результатов приводится в соответствующей инструкции по применению наборов реагентов.

Этот тест, основанный на выявлении IgG антител, может оказаться полезным, начиная с 4 — 5 дня болезни. Обнаружение у ранее невакцинированных против оспы лиц даже невысоких титров антител (80 — 160) указывает на наличие ортопоксвирусной инфекции. У вакцинированных в прошлом только высокие титры антител (640 и выше) могут свидетельствовать о свежей ортопоксвирусной инфекции. Для подтверждения наличия свежей инфекции в неясных случаях проводят повторное исследование сыворотки, взятой спустя несколько дней после первой пробы. При этом 2 — 4-кратное нарастание титра антител подтверждает диагноз.

Осуществление данного исследования производится в соответствии с инструкциями по применению иммуноферментных тест-систем для определения антител к ортопоксвирусам, зарегистрированных в Российской Федерации в установленном порядке.

Для целей возможно более ранней серологической диагностики ортопоксвирусных инфекций используют выявление в ИФА IgM антител (так называемых «ранних»), появление которых в сыворотке крови предшествует IgG антителам.

8 .1.4. Выявление (индикация) вируса натуральной оспы и других патогенных для человека ортопоксвирусов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

ПЦР применима для ускоренной диагностики при исследовании клинических образцов на наличие ДНК вируса натуральной оспы и для идентификации культуры выделенного вируса.

В данных МУ приведена методика, которая позволяет идентифицировать ДНК вируса оспы в клинических образцах и дифференцировать её от таковой близкородственных патогенных для человека ортопоксвирусов: оспы обезьян, оспы коров и вакцины с помощью набора реагентов для выявления ДНК вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакцины методом мультиплексной полимеразной цепной реакции.

Методика мультиплексной полимеразной цепной реакции (МПЦР) является вариантом классической ПЦР с анализом продуктов амплификации с помощью гель-электрофореза в агарозном геле, однако позволяет в одном анализе идентифицировать ДНК четырех видов ортопоксвирусов, в том числе ДНК вируса оспы в клинических образцах и дифференцировать её от таковой близкородственных патогенных для человека ортопоксвирусов: оспы обезьян, оспы коров и вакцины. Мультипраймерная система состоит из пяти пар праймеров, один из которых является родоспецифичным. Остальные пары праймеров являются видоспецифичными и при амплификации дают продукты длины, характерной для вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакцины.

Требования к организации работ при проведении исследований с использованием МПЦР приведены в МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I — IV групп патогенности» [10] и СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I — II групп патогенности (опасности)» [8].

Сотрудники, выполняющие МПЦР с материалом, подозрительным на зараженность вирусом оспы, также как и другие, работающие с этим вирусом, подлежат обязательной вакцинации в соответствии с МУ 3.3.1.2044-06 «Вакцинопрофилактика натуральной оспы» [11].

Выявление ДНК ортопоксвирусов с помощью МПЦР включает три стадии. На первой стадии после первичной подготовки проб проводят выделение ДНК из клинических образцов методом фенольной экстракции после разрушения клеток и вирусных частиц протеиназой К. Работа по выполнению этой стадии проводится в помещениях «заразной» зоны при соблюдении условий, указанных в СП 1.3.1285-03 [8] и МУ 1.3.2569-09 [10]. На второй стадии проводят реакцию МПЦР с выделенной ДНК. На третьей стадии проводят детекцию амплифицированной ДНК после гель-электрофореза в агарозном геле с визуализацией полос в УФ-свете после окраски геля бромистым этидием. Обе последние стадии могут проводиться за пределами «заразной» зоны в ПЦР-боксе в защитном костюме IV типа, дополненном резиновыми перчатками, с соблюдением правил выноса предметов из «заразной» зоны (внешняя обработка контейнера).

МПЦР представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза (амплификацию) специфичной области ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ), соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок-праймеров, определяющих границы амплифицируемого участка ДНК. В ходе МПЦР происходит амплификация только с помощью той пары праймеров, которая видоспецифична к ДНК-мишени, присутствующей в клиническом образце. Одна пара праймеров в смеси обеспечивает родоспецифичную амплификацию фрагмента размером 294 п.н. на ДНК любых видов ортопоксвирусов (дополнительный внутренний контроль).

Каждый цикл состоит из трех стадий с различными температурными режимами. На первой стадии при 93 °С происходит разделение цепей ДНК, затем при 62 °С — присоединение (отжиг) праймеров к гомологичным последовательностям на ДНК-мишени, на третьей стадии при температуре 72 °С — синтез новых цепей ДНК путем удлинения праймеров в направлении 3 конца. В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, ограниченного парой выбранных праймеров, что позволяет за 30 циклов наработать ДНК в количестве, достаточном для ее детекции с помощью электрофореза.

Выделение ДНК, постановку МПЦР и оценку результатов проводят по соответствующей инструкции по применению диагностической тест-системы для проведения МПЦР, зарегистрированной в Российской Федерации установленным порядком.

Список рекомендованного оборудования для проведения МПЦР приведен в прилож. 4. После выделения ДНК материал передают для проведения МПЦР. Передача материала осуществляется с соблюдением правил выноса предметов из «заразной» зоны (внешняя обработка контейнера) согласно СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I — II групп патогенности (опасности)» [8].

Для анализа результатов используют трансиллюминатор. Фрагменты анализируемой ДНК должны проявиться в виде светящихся оранжево-красных полос.

1. Положительный контроль (К + ) — должны выявляться специфичные полосы размером 832, 581,492, 421, 294, 200 пар нуклеотидов:

Длина продукта амплификации, пар нуклеотидов (п.н.)

Вирус оспы обезьян (Monkeypox virus)

Вирус вакцины (Vaccinia virus)

Вирус оспы коров (Cowpox virus)

Родоспецифичный фрагмент (Orthopoxvirus)

Вирус натуральной оспы (Variola virus)

* ЗА — Западноафриканский вариант вируса оспы обезьян

** ЦА — Центральноафриканский вариант вируса оспы обезьян

2. Отрицательный контроль (К * ) — полосы должны отсутствовать.

3. Анализируемые пробы — отсутствие полос строго на уровне положительного контроля свидетельствует об отрицательном ответе. Наличие полосы, соответствующей по размеру специфичному фрагменту в положительном контроле для какого-либо вида ортопоксвируса, свидетельствует о наличии в пробе ДНК данного вида ортопоксвируса. Внимание! Наличие полос ампликонов, располагающихся выше или ниже контрольных полос, является неспецифичным ответом и результат реакции оценивается как отрицательный.

• если в положительном контроле отсутствуют специфичные полосы (ошибка в постановке ПЦР, неправильное хранение или загрязнение реактивов в процессе работы, сбой программы амплификатора). Требуется повторная постановка реакции!

• если в отрицательном контроле выявляются специфичные полосы на уровне положительного контроля (контаминация реактивов пробположительной ДНК или продуктами амплификации). Необходимо использовать дополнительные отрицательные контроли при повторной постановке ПЦР. Если результат повторяется — необходимо сменить реактивы!

При проведении ПЦР-анализа в случаях несоблюдения вышеуказанных требований возможно получение ложноположительных результатов. К их появлению ведет ДНК-контаминация — попадание в реакционную смесь положительно реагирующих в ПЦР нуклеиновых кислот (из исследуемых образцов, положительных контролей, продуктов амплификации — ампликонов). Ампликоны могут накапливаться на лабораторном оборудовании, одежде, поверхности кожи сотрудников и легко переноситься аэрозольным путем. О наличии контаминации свидетельствует положительный ответ в отрицательном контроле. В этом случае необходимо повторить анализ, начиная с этапа выделения ДНК.

В случаях повторных положительных ответов в отрицательном контроле производят замену всех используемых для данного анализа реактивов, как на этапе подготовки проб, так и при проведении ПЦР, обрабатывают рабочие поверхности столов, приборов, штативов, автоматических пипеток 1N раствором соляной кислоты; облучают помещение УФ в течение 1,5 л. Заменяют рабочую одежду, набор инвентаря для уборки и приостанавливают работу в данном помещении до проведения указанных мер.

Режимы обеззараживания различных объектов при лабораторной диагностике натуральной оспы методом МПЦР приведены в СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I — II групп патогенности (опасности)» [8] и МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I — IV групп патогенности» [10].

Может осуществляться на куриных эмбрионах или в культуре клеток.

Используют хорошо развитые эмбрионы 12-дневного возраста. Эмбрионы готовят к заражению следующим образом. Во время просмотра (осуществляется в затемнённой комнате, пучок света должен падать сверху на тупой конец яйца) делают отметку простым карандашом в центре воздушного мешка. Затем поворачивают яйцо острым концом вверх и замечают место, где белок занимает наибольшее пространство. На противоположной этому месту стороне делают отметку для пропиливания, выбирая участок между двумя сосудами и их ответвлениями. Метку ставят между ветвями соседних вен, но не на самих сосудах.

Пропиливание осуществляется сепарационным вулканитовым диском бормашины, а при её отсутствии — любым инструментом типа маленького напильника. Одно отверстие пропиливают в центре воздушного мешка, второе — очень осторожно во избежание кровоизлияний — по отметке и боковой стороне яйца. Необходимо следить, чтобы была пропилена скорлупа и не затронута подскорлупная оболочка. Величина отверстий: длина — 3 — 4 мм, ширина — 1,5 мм. После пропиливания отверстий яйца укладывают на бок таким образом, чтобы отверстие на боковой поверхности было обращено вверх.

Подскорлупную оболочку в отверстии в центре воздушного мешка прорывают изогнутой хирургической иглой. Затем на боковое отверстие наносят 0,1 мл буферного раствора, подогретого (в водяной бане) до 50° и той же иглой очень осторожно расслаивают (продавливают) подскорлупную оболочку для образования маленькой щели, через которую под подскорлупную оболочку проходит капля буферного раствора. Последняя частично отслаивает хориоаллантоисную оболочку (ХАО). Полное её опускание происходит после отсасывания воздуха с помощью резиновой груши через отверстие в центре естественного воздушного мешка. Для контроля наличия и величины искусственных воздушных мешков яйца снова просвечивают и отбрасывают все, имеющие кровоизлияния и с воздушным мешком под ХАО и без искусственных воздушных мешков.

Подготовленные яйца (с опущенной ХАО) должны находиться до заражения в термостате в течение 2 ч. Для заражения используют материал от больного в исходном разведении, а также в разведениях 10 -2 — 10 -5 .

После введения инокулята материал равномерно распределяют по оболочке осторожным круговым вращением яйца.

Отверстие на боковой стороне яйца заклеивают липким пластырем с таким расчетом, чтобы оставалась как бы склеенная петля, за которую можно было бы держать яйцо при вскрытии. Яйца укладывают на бок (вверх заклеенным отверстием).

Заражение производят с соблюдением правил асептики. На каждый материал, предварительно обработанный антибиотиками, используют по 2 — 3 эмбриона на разведение. Инкубацию зараженных эмбрионов проводят при температуре 34,5 — 35,0 °С в течение 72 ч.

Вскрытие производят над посудой с высокими краями на четверть заполненную 5 %-м раствором хлорамина. Одной рукой берут яйцо за петлю липкого пластыря, которым заклеено отверстие над искусственным воздушным мешком. В другую руку берут прямые глазные ножницы. Браншу ножниц вставляют в отверстие над воздушным мешком и осторожно удаляют половину скорлупы, противоположную месту инокуляции, а также все содержимое яйца, за исключением части ХАО, принадлежащей к искусственному мешку (место инокуляции). Последнюю отделяют пинцетом, промывают физиологическим раствором и просматривают в чашке Петри на наличие поражений (на чёрном фоне), отмечают также состояние эмбриона (живой или погибший).

При наличии вируса оспы на ХАО обнаруживаются мелкие (размером около 1 мм в диаметре к 72 ч) белые точечные резко ограниченные возвышающиеся оспины. Их своеобразный характер существенно отличается от поражений, вызываемых другими патогенными для человека ортопоксвирусами. Так, вирус вакцины образует более плоские поражения, имеющие большие размеры (до 3 — 4 мм в диаметре к 72 ч инкубации). Вирус оспы коров образует поражения, сходные с вакцинными, но отличающиеся резко геморрагическим характером («красные» оспины). Вирус оспы обезьян вызывает поражения, по размерам напоминающие оспенные, но имеющие геморрагии в центре. Кроме того, среди основной массы типичных для вирусов оспы коров и оспы обезьян поражений встречается около 1 % более крупных белых оспин без геморрагии.

Вирусы вакцины, оспы коров и оспы обезьян также более патогенны для куриных эмбрионов, чем вирус натуральной оспы: при введении на ХАО 10 6 — 10 7 ООЕ/0,1 мл этих вирусов они, как правило, вызывают гибель куриных эмбрионов. При отсутствии бактериального загрязнения зараженные вирусом оспы эмбрионы, как правило, не погибают. Если в качестве исследуемых проб используют материал из кожных поражений в указанных выше разведениях, положительный результат получают через 72 ч после заражения без проведения пассажа. Пассаж делают при малом количестве материала для исследования и отсутствии поражений на ХАО при первичном заражении. Для этого извлечённые ХАО измельчают и приготовляют суспензию на физиологическом или буферном растворе из расчёта 1:3 — 1:5. Суспензию центрифугируют 10 мин при 2000 об./мин, надосадочную жидкость используют для заражения куриных эмбрионов.

При отсутствии специфических поражений результат выделения признают отрицательным.

Вирус оспы может быть также выделен из лейкоцитарной фракции или плазмы крови (особенно при тяжёлом течении) в первые дни болезни. В отделяемом зева он обнаруживается в первые 1 — 2 дня болезни до появления сыпи нерегулярно и в последующем выделяется с момента появления до исчезновения элементов на слизистой. Выделение вируса оспы из крови и отделяемого зева при отсутствии кожных поражений чаше имеет место при проведении пассажа. Отрицательный результат выделения вируса из этих материалов не исключает заболевания.

Для выделения вируса оспы могут быть использованы первичные и перевиваемые клеточные культуры различного происхождения: полученные от человека (фибробласты эмбриона человека, почки, амниотическая ткань), обезьяны, свиньи и др. Предпочтительнее использовать первичные клеточные культуры эпителиального характера, медленнее дегенерирующие и с более наглядной картиной цитопатического действия вируса (ЦПД). Обработанный антибиотиками исследуемый материал вносят (по 0,1 мл) в 4 — 6 пробирок с образовавшимся клеточным монослоем, в том числе желательно в 2 — 3 пробирки со стеклянными пластинками * (для возможно более раннего выявления ортопоксвирусного антигена с помощью МФА). Часть пробирок с незараженной культурой оставляют в качестве контроля. Пробирки инкубируют при температуре 36 °С и ежедневно оценивают состояние монослоя при малом увеличении микроскопа.

* Метод обработки стеклянных пластин указан в прилож. 5.

При достаточной концентрации вируса оспы ЦПД в первичной культуре клеток отмечается, как правило, уже в первые сутки после заражения культуры. В сплошном клеточном монослое появляются очаги округлых клеток с чёткими границами и зеркальной поверхностью (сильно преломляют лучи света); такие клетки часто увеличены в размере («гигантские»). В последующем скопления округлых клеток увеличиваются, клетки обособляются, прорывая монослой; постепенно клеточный пласт превращается в скопления очагов округлых клеток при наличии участков неизмененных клеток монослоя между ними вплоть до полного поражения клеток всего пласта.

Клеточные культуры перевиваемых линий реагируют на заражение вирусом оспы пролиферативным типом поражений — вирус вызывает усиленное размножение клеток, что проявляется в образовании гиперпластических фокусов, участков многослойного роста. Они выглядят как компактные клеточные нагромождения, усиленно преломляющие свет («зеркальные»). Размеры пролиферативных очагов и их количество постепенно увеличиваются, округлые дегенеративные клетки становятся зернистыми, нарушается целостность монослоя и затем происходит деструкция всего пласта.

При нечётко выраженных цитопатических изменениях проводят пассаж — вторую партию клеточных культур заражают взвесью клеток в культуральной жидкости (после проведения трёхкратного цикла замораживания и оттаивания культур). Однако, длительное (до 7 дней) наблюдение за зараженной культурой более эффективно, чем проведение «слепых» пассажей.

ЦПД вируса оспы и вируса вакцины имеет специфические особенности, что позволяет дифференцировать их в клеточной культуре. Для вируса вакцины характерен ускоренный темп развития клеточных поражений при отсутствии очаговости (за исключением начальной стадии ЦПД при малых дозах заражения), с распространением ЦПД на весь клеточный пласт и быстрым наступлением тотальной дегенерации культуры (через 1 — 2 дня). Наблюдается стертость клеточных границ, образование симпластов, сохранение цитоплазматических мостиков и др.

Для подтверждения специфичности ЦПД (для ортопоксвирусов), а также дифференциации от ЦПД вируса герпеса, можно использовать реакцию гемадсорбции. Для этого надо удалить культуральную жидкость из части заражённых и контрольных пробирок (по 2 пробирки, которые после постановки реакции уничтожаются) и добавить к клеткам по 0,2 мл 0,5 % взвеси куриных эритроцитов * . Пробирки выдерживают в горизонтальном положении 10 мин, после чего их просматривают при малом увеличении микроскопа. При положительном феномене гемадсорбции наблюдаются скопления адсорбированных клетками эритроцитов («ожерелья» из эритроцитов по контурам и на поверхности клеток), которые не удаляются при промывании клеточного пласта физиологическим раствором хлористого натрия (1 мл). Феномен гемадсорбции отрицателен (отсутствие ортопоксвирусов), если эритроциты не оседают на клетках, а свободно перемещаются в поле зрения микроскопа и удаляются при промывании. Клеточный пласт в контрольной (незараженной) культуре клеток должен оставаться свободным от скоплений адсорбированных эритроцитов. Феномен гемадсорбции обычно опережает видимое ЦПД вируса оспы (в культурах человеческого происхождения и почек обезьян). Вирус герпеса не даёт феномена гемадсорбции. При отсутствии ЦПД в течение 7 дней наблюдения и отрицательной реакции гемадсорбции результат выделения вируса считается отрицательным.

* Для постановки этой и других реакций следует использовать петухов-доноров, эритроциты которых чувствительны к воздействию ортопоксвирусов.

Для быстрого обнаружения вируса в культуре клеток и его серологической идентификации используют метод флюоресцирующих антител (МФА). С этой целью стеклянные пластинки вынимают через 12 — 24 ч после заражения культуры, отмывают от среды фосфатно-буферным раствором и после заключительного промывания в дистиллированной воде производят их фиксацию и окраску противооспенным люминесцирующим иммуноглобулином, как это описано в разделе 10.

При этом контролем служит: 1) незараженная культура клеток, окрашенная смесью гомологичного конъюгата и бычьего альбумина и 2) зараженная культура клеток, окрашенная смесью гетерологичного конъюгата и бычьего альбумина.

Препараты просматривают в люминесцентном микроскопе с использованием объектива ´ 40 и ´ 90.

Положительный ответ дают на основании обнаружения в клеточном пласте, окрашенном в оранжево-коричневатый цвет, клеток с ярко-зеленой, перинуклеарной флюоресценцией в цитоплазме, обусловленной наличием антигена ортопоксвирусов. В контрольных препаратах зелёное свечение должно отсутствовать.

При выделении в культуре клеток дифференцировать ортопоксвирусы возможно при использовании дополнительных приёмов дифференциации (см. ниже). Отрицательный ответ дают при отсутствии специфического свечения в культурах при первичном заражении и пассаже.

9. Критерии дифференциации вируса оспы от вирусов, вызывающих заболевания, сопровождающиеся кожными проявлениями

Осуществляется при электронной микроскопии по характерной форме и размеру вирусных частиц. Кроме того, вирусы группы герпеса дают отрицательный результат в ИФА при выявлении антигена ортопоксвирусов. При наличии вирусов герпеса отсутствует ярко-зелёная флюоресценция при окраске препаратов противооспенным люминесцирующим иммуноглобулином.

При выделении на куриных эмбрионах вирус ветряной оспы не вызывает поражений на ХАО. Некоторые штаммы вируса герпеса простого вызывают поражения, трудно отличимые от оспенных. Дифференциация вирусов в таких случаях проводится на основании исследования суспензии пораженной оболочки в ИФА.

При выделении вируса в культуре клеток дифференциацию ортопоксвирусов от вирусов герпеса проводят на основе отсутствия гемадсорбции и/или свечения при использовании МФА с противооспенным люминесцирующим иммуноглобулином.

9.2. Дифференциация вируса натуральной оспы от других патогенных для человека ортопоксвирусов (вакцины, оспы коров, оспы обезьян)

Основным методом дифференциации (кроме МПЦР) является характер поражений (оспин) на ХАО куриных эмбрионов (см. выше п. 8.2.1).

При выделении вируса в культуре клеток или в случаях, когда характер поражений на ХАО куриных эмбрионов не позволяет решить вопрос, каким ортопоксвирусом они вызваны, прибегают к дополнительному приёму дифференциации. С этой целью выделенную культуру вируса исследуют на способность вызывать реакцию на коже кроликов (заражение на скарифицированный участок).

Заражение кроликов на скарифицированную кожу

Нанесение вируса оспы на скарифицированный участок выстриженной кожи кролика (размер участка 2,5 ´ 2,5 см, объём инокулюма — 0,2 мл) не приводит к развитию специфических элементов. На месте нанесения вируса к 3 — 5 дню после заражения остаются лишь сухие бледные царапины (след от скарификации кожи). В противоположность этому вирус вакцины вызывает образование сочных характерных специфических элементов (папул, пустул), зачастую сливающихся между собой и образующих к 3 — 5 дню после заражения как бы «подушку», выступающую над поверхностью незараженной кожи. Вирус оспы коров и оспы обезьян образует элементы, аналогичные вакцинным, но отличающиеся выраженным геморрагическим характером.

Речь идет о диагностических приемах, которые могут быть использованы при отсутствии ряда описанных выше приборов и реагентов.

Метод флюоресцирующих антител для выявления возбудителя непосредственно в материале от больных.

Метод используют для быстрого обнаружения антигена ортопоксвирусов на ранних стадиях заболевания (до появления пустул!). Содержимое кожных элементов — мазки соскобов или отпечатки со дна везикул, макул, папул, мазки везикулярной жидкости на предметных стеклах фиксируют в охлаждённом ацетоне (х.ч.) в течение 10 мин. После 5-минутного просушивания их окрашивают смесью равных объёмов люминесцирующего оспенного иммуноглобулина и бычьего альбумина, меченого фторидом сульфородамина (прилож. 6), разведенных предварительно до «рабочего» разведения (см. соответствующую инструкцию по применению).

Обнаружение многочисленных мелких, округлой формы образований, дающих ярко-зелёную флюоресценцию и расположенных на оранжево-коричневом фоне при отсутствии зелёной флюоресценции в контроле свидетельствует о наличии в материале ортопоксвируса.

Внеклеточный вирус может образовывать цепочки, скопления и располагаться попарно. В ряде случаев специфический антиген может обнаруживаться в цитоплазме попавших в мазок клеток спущенного эпителия.

Исследование осуществляется в соответствии с инструкцией по применению препарата люминесцирующего оспенного иммуноглобулина, зарегистрированного в Российской Федерации установленным порядком.

Метод неприменим для исследования материала от больного в стадии пустул из-за наличия аутофлюоресценции элементов белой крови.

В качестве дополнительного метода быстрого обнаружения в материале от больного антигена ортопоксвирусов может быть использована РМПА.

В водяной бане растапливают 1 %-й агар на фосфатно-солевом буфере (см. прилож. 7), затем охлаждают до 60 °С и прибавляют подогретый до этой же температуры мертиолят (0,01 %). Агар наносят тонким слоем на предметное стекло (2 мл агара на предметное стекло размером 2,6 ´ 7,6 см). После застывания агара полой металлической трубочкой в нём прорезывают 4 круглых лунки диаметром 4 мм, центры которых находятся друг от друга на расстоянии 5 — 6 мм. Лунки располагают по углам ромба. В одну из боковых лунок наливают диагностическую оспенную сыворотку, в другую — нормальную кроличью сыворотку. В качестве известного антигена используют сухой оспенный диагностикум, который наливают в верхнюю лунку. Испытуемый антиген (везикулярная, пустулезная жидкость, суспензия корок, органов и т.д.) закапывают в нижнюю лунку.

Стекло с налитыми в лунки реагентами помещают во влажную камеру, в качестве которой может быть использована чашка Петри с влажной фильтровальной бумагой. Камеру оставляют при комнатной температуре. Просмотр стёкол производят через 2 — 5 и 24 часа в проходящем свете.

Реакция считается положительной в случае появления полосы преципитации между лунками с известным антигеном и диагностической противооспенной сывороткой при одновременном появлении такой же полосы между испытуемым антигеном и этой сывороткой и отсутствии их между антигенами и нормальной сывороткой. Положительный результат исследования свидетельствует о наличии в исследуемом материале антигена ортопоксвирусов. Отрицательный результат не исключает заболевания.

Этот простой и доступный метод, дающий ответ в пределах 1,5 — 2,0 ч, основан на подавлении специфическими антителами феномена агглютинации чувствительных эритроцитов кур, вызываемого рядом ортопоксвирусов. Установлено, что у заболевших оспой обнаруживаются высокие титры антигемагглютининов (АГА), значительно превосходящие таковые у вакцинированных против оспы лиц. Максимальные титры АГА наблюдаются к 10 — 15 дню, после чего постепенно снижаются. Следует отметить, что у отдельных больных оспой титры АГА остаются невысокими (20 — 40), поэтому наличие низких титров АГА не позволяет исключить диагноз оспы. Реакцию обычно ставят с 4 и 2 АЕ (агглютинирующими единицами).

Обнаружение при электронной микроскопии ортопоксвирусных вирионов и/или ортопоксвирусного антигена в ИФА свидетельствует о наличии инфекции, вызванной представителем рода ортопоксвирусов. Дальнейшая идентификация возбудителя проводится по результатам МПЦР. При наличии в исследуемом материале ДНК вируса натуральной оспы ставится диагноз «натуральная оспа».

Серологическое исследование с большой долей определенности дает ответ в отношении невакцинированных против оспы людей. В этом случае наличие даже невысоких (80 — 160) титров антител свидетельствует об ортопоксвирусной природе болезни.

Окончательный диагноз «натуральная оспа» ставится после выделения и идентификации возбудителя.

1. Противочумный костюм II-го типа с защитным респиратором ШБ-1 (РБ) «Лепесток-200» или их аналогами отечественного или зарубежного производства.

2. Набор стерильных инструментов в упаковке:

пинцеты для электронноскопических сеток;

3. Пробирки пластиковые с завинчивающимися пробками вместимостью 1,5 — 3,0 мл.

4. Пробирки пластиковые с завинчивающимися пробками вместимостью 5 и 10 мл.

5. Обезжиренные предметные стекла (2 — 4 шт.).

6. Подготовленные для взятия проб электронноскопические сетки.

10. Маркер для стекол, пробирок.

11. Пластиковые флаконы вместимостью 10 мл с завинчивающейся крышкой.

12. Ватные тампоны на стержне (4 — 6 шт.).

13. Полиэтиленовые пакеты типа Zip- lock .

17. Дезинфицирующие средства, разрешенные к применению в установленном порядке.

Для приготовления опорных пленок используется 0,25 — 0,3 %-й раствор формвара на дихлорэтане, который хранят в холодильнике. Дихлорэтан должен храниться в холодильнике в плотно закрывающейся посуде и иметь квалификацию «хч» или «чда». Для приготовления пленок раствор нагревают до комнатной температуры и в него опускают чистое обезжиренное предметное стекло на 3/4 высоты на 20 — 30 с. Затем стекло просушивают и острым скальпелем или лезвием бритвы вырезают формваровую пленку, отступя от края стекла на 2 — 3 мм. Для отделения пленки стекло медленно погружают под углом 60° в сосуд с дистиллированной водой. На поверхность пленки выкладывают сетки. Затем пленку с сетками накрывают полоской газетной бумаги (без краски) или плотной фильтровальной бумаги. Бумагу вместе с сетками, покрытыми пленкой, вынимают из воды и укладывают в чашку Петри для просушивания.

Для приготовления опорных пленок может использоваться 1 %-й раствор парлодия в амилацетате. При этом каплю раствора наносят на поверхность дистиллированной воды. Через 10 — 15 с, после испарения амилацетата, на поверхность образовавшейся пленки укладывают сетки, которые затем снимают на бумагу, аналогично формваровым.

После просушки сетки, покрытые формваровой или парлодиевой пленкой, напыляют углем в вакуумной напылительной установке при давлении 10 -4 — 10 -5 мм ртутного столба. Визуально напыление контролируют по появлению на бумаге с сетками первых признаков видимого слоя угля светло-серого цвета. Формваровые пленки можно использовать без напыления.

Приготовление смолы для заливки образцов, предназначенных для исследования методом ультратонких срезов

Использование смеси эпоксидных смол эпона и аралдита позволяет получить заливочную среду, обеспечивающую хорошее пропитывание образца, оптимальную для резки твердость блоков и хорошее контрастирование срезов.

Исходный раствор готовится с использованием смол:

Смолы сливаются в стеклянный сосуд и тщательно перемешиваются до получения гомогенной смеси. Смесь хранится при комнатной температуре в плотно закрытой посуде неограниченное время и используется для пропитки образцов и полимеризации.

Раствор № 1 — 0,84 г лимонной кислоты растворяют в 1 л очищенной воды.

Раствор № 2 — 0,712 г Na 2 HPO 4 × 2Н2O растворяют в 1 л очищенной воды.

Для получения буферного раствора с рН — 7,2 следует смешать 130 мл раствора № 1 и 870 мл раствора № 2.

Состав фосфатно-буферного раствора (0,15 М, рН = 7,2 — 7,4), используемого для промывания препаратов, исследуемых МФА.

Раствор № 3 — 10,21 г КН2РO 4 растворяют в 500 мл воды очищенной.

Раствор № 4 — 26,85 г Na 2 HPO 4 × 2Н2O растворяют в 500 мл воды очищенной.

Для получения буферного раствора требуемой молярности и рН следует к 200 мл физиологического раствора добавить 172,0 мл раствора № 4 и 47,8 мл раствора № 3.

Наименование, тип и шифр средств испытаний

1. рН-метр типа РВ-11 Sartorius

Предел измерения (1 — 14) ед. рН

2. Холодильник бытовой типа ГОСТ 16317-87

Температура в холодильной камере от 0 до 10 °С

3. Малогабаритная высокоскоростная лабораторная микроцентрифуга типа «ЦиклоТемп-201»

16000 об./мин, со сменными роторами для микропробирок — 0,5/0,6 мл и 1,5/2,0 мл

4. Микроцентрифуга/встряхиватель типа ТЭТА 2

Скорость вращения гнезда до 2500 об./мин

5. Программируемый твердотельный термостат типа Т-2415

Диапазон рабочих температур от 20 до 120 °С

6. Морозильная камера типа «Kelvinator»

Температура в морозильной камере от -20 до -70 °С

7. Автоматические пипетки типа «Ленпипет» 1 — 10, 5 — 40, 20 — 200, 200 — 1000 мкл

8. Термостат программируемый четырехканальный типа ТП 4-ПЦР-01-«Терцик»

4 независимо управляемых блока, емкость каждого термоблока 10 ´ 0,5 мл, диапазон от 4 до 99 °С, скорость нагревания/охлаждения блока 2 °С/с

Предел взвешивания 15 кг, погрешность 5 г

Диапазон измерений от 0,2 до 60 мин. Класс точности 0,2

13. Набор для горизонтального электрофореза типа «Sub Cell GT»

Размер геля 15 ´ 10 см, заливочный столик

14. Источник тока типа «PowerPac Basic (300)»

Выход на 4 камеры, до 300 В и 400 мА

15. Трансиллюминатор типа «ТСР-20МС»

Длина волны 312 нм и 254 нм, экран 20 ´ 20 см, 6 ламп для каждой длины волны

Примечание . Могут использоваться средства измерения и контроля, имеющие характеристики не хуже приведенных.

Нарезанные из предметных стёкол пластинки (2,5 ´ 0,8 см) в сухом виде погружают в хромпик на 24 ч (на 1 л концентрированной серной кислоты 250 г двухромовокислого калия). Раствор хромпика используют через 24 ч. Стёкла после хромпика промывают сутки в проточной воде, после чего ополаскивают дистиллированной водой, вытирают и опускают в смесь Никифорова (спирт-эфир 1:1) на 6 — 24 ч. Затем каждое стекло протирают чистой марлей и пинцетом погружают в пробирки. Пробирки со стёклами подвергают стерилизации.

Готовят двукратные разведения альбумина на физиологическом растворе. На фиксированные препараты (по два на каждое разведение) наслаивают различные разведения альбумина. Последующую обработку препаратов проводят по методике, описанной в разделе 10.1. Яркость люминесценции оценивают по 3-крестовой шкале:

3+ — отчётливо выраженная люминесценция оранжево-красного цвета;

2+ — отчетливая люминесценция оранжево-коричневого цвета;

+ — заметная флюоресценция серовато-жёлтого цвета;

За «красящий» титр бычьего альбумина принимают его максимальное разведение, которое обусловливает оранжево-красноватое или оранжево-коричневатое свечение фона препарата на 2 — 3 креста. При правильно выбранных «рабочих» разведениях смесь люминесцирующего оспенного иммуноглобулина и меченого альбумина должна обеспечить при окраске препаратов, инфицированных вирусом вакцины, изумрудно-зелёное специфическое свечение на 3 — 4 креста внутриклеточно и внеклеточно расположенного вируса, чётко контрастируемое на фоне оранжево-красной или коричневатой флюоресценции окружающих клеток, клеточного дебриза или прочих гетерологичных частиц.

Берётся 1 весовая часть агара и 50 весовых частей воды. Агар в горячем состоянии осаждают 0,5 %-м раствором хлористого кальция (хлористый кальций добавляют из расчёта 5 г на 1 л агара) и тут же фильтруют через слой ваты. Затем затвердевший агар нарезают на куски и промывают в проточной воде в течение 72 ч. Агар опять расплавляют и добавляют в буфер из расчёта 10 г на литр буферного раствора. Состав фосфатно-солевого буфера (рН 7,2): Na 2 HPO 4 M /15 — 70 мл, КН2Р O 4 М/15 — 30 мл.

* Выявление ортопоксвируса непосредственно в материале от больного в ранние стадии болезни (до появления пустул).

источник

Обозначение: МУ 1.3.2970-11
Название рус.: Лабораторная диагностика натуральной оспы
Статус: действует
Заменяет собой: «Инструкция по лабораторной диагностике натуральной оспы» (Утверждена 04.04.1972)
Дата актуализации текста: 05.05.2017
Дата добавления в базу: 01.09.2013
Дата введения в действие: 14.12.2011
Утвержден: 14.12.2011 Главный государственный санитарный врач Российской Федерации
Опубликован: Роспотребнадзор (2012 г. )
Ссылки для скачивания: