Вакцинация при лихорадке западного нила

Лихорадка Западного Нила представляет собой острое вирусное заболевание. Его переносят комары, а в ряде стран, куда входит и Россия, еще и клещи. В Греции вирус был впервые выявлен в 2010 году. Столь высоких показателей заболеваемости здесь раньше не наблюдали. Среди заболевших у 183 пациентов медики зафиксировали нарушения в работе центральной нервной системы. За месяц число жертв выросло в 2,5 раза — еще в конце августа сообщалось лишь об 11 погибших.

Это одно из самых опасных вирусных заболеваний по количеству летальных исходов — больше 10%, если не предпринимать никаких действий, рассказал «360» доктор медицинских наук, врач-иммунолог и специалист по особо опасным инфекциям Владислав Жемчугов.

«Поражается мозг в первую очередь — таких тяжелых случаев примерно 10 из 100. Остальные могут переносить болезнь как обычную простуду или вообще не ощущать. Вакцин от этого вируса — нет, специфического лечения — нет», — отметил врач.

В России эта болезнь поражает в основном жителей юга: Ставропольского и Краснодарского краев, Волгоградской и Ростовской областей, юга Западной Сибири и прочих регионов, где тепло в сезон активности комаров и клещей.

Новые штаммы гриппа «атакуют» россиян

«У нас считается, что эта лихорадка не очень распространена, хотя в начале двухтысячных вместе с конго-крымской геморрагической лихорадкой на юге европейской части России были немало летальных исходов. В Краснодарском крае была высокая смертность, в Волгоградской области. Периодически эти волны набегают, поэтому мониторинг надо вести», — сказал «360» профессор НИИ вирусологии имени Ивановского Михаил Щелканов.

По словам эксперта, проблема заключается в том, что многие арбовирусы, в группу которых входит и лихорадка Западного Нила, начинают менять свой ареал из-за изменения климатических условий. Такая ситуация требует комплексных мониторинговых исследований, которые гораздо дороже стандартных и проводятся далеко не всегда.

«Сейчас пик в Греции, но, полагаю, зона риска куда шире. У нас как считается: лучший способ борьбы с инфекцией — не диагностировать ее. Следовало бы изучить ситуацию более пристально во всей Южной Европе: Италии, Испании, Франции, всей зоне бывшей Югославии. Это все группа риска», — отметил профессор-вирусолог.

В то же время Щелканов подчеркнул, что жителям России паниковать нет причины — в стране ведется мониторинг, и ситуация более-менее стабильная.

Поскольку вакцины от лихорадки Западного Нила до сих пор не разработано, единственная профилактика вируса заключается в предотвращении укусов комаров. Для этого подойдут всяческие москитные сетки, аэрозоли и мази.Также стоит внимательно отнестись к симптомам гриппа в летние месяцы. Не стоит полагать, что вас просто продуло, следует сразу же обратиться к врачу, отмечает вирусолог.

«Если у вас летом наблюдаются гриппоподобные симптомы — головная боль, температура, ломота в мышцах — скорее всего, это именно арбовирусная инфекция», — пояснил Щелканов.

Врач-иммунолог Владислав Жемчугов советует всем, у кого наблюдается высокая температура, сразу начинать противовоспалительную терапию любыми препаратами, вызвать врача и дождаться постановки лабораторного диагноза.

«Анальгин, аспирин, парацетамол — все что угодно. И нужно, чтобы врач сразу же взял кровь», — подчеркнул медик.

Несмотря на участившиеся летальные случаи в Греции, в России пока не было зарегистрировано ни одного случая отказа от тура в эту страну по причинам безопасности, заявил «360» вице-президент Российского союза Туриндустрии (РСТ) Юрий Барзыкин.

«Не было еще случаев отказа от путевок по этой причине. Также не было зарегистрировано случаев заражения этим вирусом ни среди отправленных туристов, ни среди прибывших в Россию», — сказал Барзыкин.

Названы самые раздражающие привычки российских туристов

Он отметил, что туроператоры проинформированы об угрозе, однако российских туристов почти нет в регионах, где зафиксировано наибольшее число заражений. «Сейчас хоть и бархатный сезон, но там такой регион, в котором российских туристов практически нет. Да, опасность есть, но она есть и на других территориях. Надо иметь это в виду, но турист всегда решает сам», — добавил вице-президент РСТ.

По словам Барзыкина, несмотря на стереотип о бесстрашии российских путешественников, сегодня безопасность — один из приоритетов при выборе путевки, уступающий по значимости только стоимости тура и ожидаемому уровню сервиса.

«Миф о безбашенных россиянах за границей, которые ничего не боятся и готовы „идти на грозу“, не соответствует реальности. Сейчас наши туристы выясняют риски. Если они присутствуют, то россияне стараются не ехать в такие страны. Однако если опасность не явная, купленные путевки сдают редко. Тут турист уже всегда решает сам», — заключил он.

В Российском союзе туриндустрии всем путешественникам рекомендуют перед планированием отдыха проверять сайты Министерства иностранных дел РФ и Роспотребнадзора. Если там есть информация об опасностях в интересующей стране, стоит проявить особую бдительность и осторожность в поездке, а в ряде случаев и вовсе пересмотреть свои планы.

источник

Лихорадка Западного Нила (ЛЗН) – зоонозная природно-очаговая трансмиссивная инфекция, вызываемая арбовирусами семейства Flaviviridae, характеризующаяся острым интоксикационным синдромом с поражением центральной нервной системы.

Трансмиссивными инфекциями называется группа заболеваний, возбудители которых передаются кровососущими членистоногими. В данном случае роль переносчиков вируса играют комары рода Culex, реже – Aedes и Anopheles, не исключается участие в передаче вируса иксодовых и аргасовых клещей. Естественный резервуар для вируса лихорадки Западного Нила – дикие птицы.

Вирус довольно устойчив во внешней среде: погибает при температуре выше 55 ºС с экспозицией не менее получаса, долго сохраняет жизнеспособность в высушенном или замороженном виде.

Изначально лихорадка Западного Нила наиболее широко была представлена в Африке, Южной Америке, Азии. С конца прошлого столетия нозоареал заболевания значительно расширился: выявляются случаи инфицирования в странах не только с жарким, но и с умеренным климатом (в Европе, России), – что обусловлено сезонной миграцией инфицированных птиц.

В регионах с умеренным климатом отмечается характерная сезонность; пик заболеваемости (более 90% всех выявленных случаев) приходится на период с июля по октябрь, что коррелирует с максимальной численностью кровососущих насекомых в эти месяцы.

Группы риска инфицирования вирусом лихорадки Западного Нила составляют люди, работающие или отдыхающие на приусадебных участках, а также охотники, рыбаки – лица, проводящие много времени в излюбленных местах членистоногих (на водоемах, тенистых участках с массивной растительностью, в болотистой или лесистой местности).

Причиной заболевания в подавляющем большинстве случаев становится укус инфицированного комара или клеща.

Вирус попадает с кровью в организм кровососущего (где циркулирует в течение нескольких дней) после укуса зараженной птицы. В дальнейшем возбудитель лихорадки Западного Нила концентрируется в слюнных железах насекомого или клеща, откуда при укусе человека или животного перемещается в его кровоток, вызывая цепь патологических изменений.

Помимо укуса насекомых, вирус может передаваться вертикально (от матери к ребенку), а также при переливании инфицированной крови или трансплантации зараженных органов, однако случается это крайне редко.

Лихорадка Западного Нила может протекать в 2 формах:

манифестная – развивается типичная клиническая картина с бурной симптоматикой;
бессимптомная – в таком случае проявления заболевания отсутствуют (по данным Всемирной организации здравоохранения, частота названной формы приближается к 80% от общего числа заболеваемости).

Естественный резервуар для вируса лихорадки Западного Нила – дикие птицы.

Манифестная форма заболевания представлена двумя клиническими вариантами:

ЛЗН без поражения центральной нервной системы (протекает в гриппоподобной форме либо в гриппоподобной форме с нейротоксикозом);
ЛЗН с поражением ЦНС (менингеальная и менингоэнцефалитическая формы).

Инкубационный период заболевания длится до 3 недель, чаще – 5-6 дней. В дальнейшем, если имеет место манифестная форма заболевания, возникает характерная для конкретного варианта инфекции симптоматика.

Проявления лихорадки Западного Нила, не сопровождающейся поражением ЦНС:

острое начало заболевания;
подъем температуры тела до 39-40 ºС, в исключительных случаях – выше 40 ºС (длительность лихорадочного периода может достигать 12 суток, хотя в среднем ограничивается 2-3 днями);
потрясающий озноб;
проливной пот;
полиморфная пятнисто-папулезная сыпь (отмечается достаточно часто);
головная боль;
болезненность при движении глазных яблок;
повышенная чувствительность к свету, фотофобия;
мышечные и суставные боли;
увеличение и болезненность лимфатических узлов головы и шеи при пальпации;
гиперемия слизистых оболочек зева;
длительный период астенизации после купирования интоксикационных симптомов (общая слабость, сонливость, снижение работоспособности, чувство разбитости).

В случае протекания инфекции с явлениями нейротоксикоза головная боль приобретает интенсивный характер, возможны эпизоды головокружения, характерны тошнота, рвота на высоте лихорадки, шаткость походки, ригидность затылочных мышц. Каких-либо изменений при анализе спинномозговой жидкости в данном случае не регистрируется.

При вовлечении в инфекционный процесс центральной нервной системы (при менингеальной форме) симптомы следующие:

острое начало со стремительным повышением температуры тела до критических цифр, ознобом, потливостью;
интенсивная головная боль, на 3-4-е сутки приобретающая мучительный характер;
ригидность затылочных мышц;
светобоязнь;
тошнота, рвота с выявлением менингеальных симптомов.

По результатам проведения люмбальной пункции определяются изменения в спинномозговой жидкости, характерные для серозных вирусных менингитов.

При менингоэнцефалитической форме заболевания состояние пациентов тяжелое или крайне тяжелое, отмечается грубая общемозговая симптоматика на фоне явлений менингоэнцефалита (нарушений сознания, головной боли, головокружений, рвоты, генерализованных судорожных приступов), в дальнейшем развивается мозговая кома. Летальность при данной форме заболевания составляет 5–10%, в крайне тяжелых случаях – до 40%.

Диагностика лихорадки Западного Нила затруднена, что связано с большим количеством бессимптомных случаев заболевания, отсутствием специфических проявлений при гриппоподобных формах.

Основные диагностические мероприятия:

сбор эпидемиологического анамнеза (связь с предшествующим пребыванием в зонах повышенного риска, укусами кровососущих насекомых, сезонность заболевания);
проведение твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА) для выявления специфических IgM, IgG (титр, подтверждающий диагноз, – 1:800 или более);
проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) с целью обнаружения РНК вируса лихорадки Западного Нила;
вирусологическое исследование для идентификации возбудителя;
при наличии менингеальных симптомов – люмбальная пункция с последующим исследованием спинномозговой жидкости.

Группы риска инфицирования вирусом лихорадки Западного Нила составляют люди, работающие или отдыхающие на приусадебных участках, а также охотники, рыбаки.

Лечение ЛЗН медикаментозное. Назначаются:

индукторы интерферона;
диуретические средства;
глюкокортикостероидные гормоны;
ингаляции увлажненного кислорода.

Проводятся дезинтоксикационная терапия, коррекция электролитных нарушений и осмолярности крови. В случае необходимости применяются противосудорожные, седативные препараты, антиоксиданты, средства, улучшающие мозговой кровоток, антибиотики широкого спектра действия.

Осложнения лихорадки Западного Нила весьма серьезны:

острое нарушение мозгового кровообращения;
отек головного мозга;
кома, летальный исход.

При своевременной диагностике и комплексном лечении прогноз благоприятный. Вероятность благополучного исхода заболевания снижается при инфекции менингоэнцефалитической формы тяжелого или крайне тяжелого течения.

Летальность при менингоэнцефалитической форме заболевания составляет 5–10%, в крайне тяжелых случаях – до 40%.

Профилактические меры состоят в следующем:

Проведение мероприятий, направленных на снижение популяции кровососущих насекомых.
Снижение популяции диких птиц, образ жизни которых связан с непосредственным обитанием рядом с человеком.
Использование репеллентов при длительном пребывании в природных очагах с высоким риском укусов членистоногих.

Видео с YouTube по теме статьи:

Образование: высшее, 2004 г. (ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет»), специальность «Лечебное дело», квалификация «Врач». 2008-2012 гг. – аспирант кафедры клинической фармакологии ГБОУ ВПО «КГМУ», кандидат медицинских наук (2013 г., специальность «фармакология, клиническая фармакология»). 2014-2015 гг. – профессиональная переподготовка, специальность «Менеджмент в образовании», ФГБОУ ВПО «КГУ».

Информация является обобщенной и предоставляется в ознакомительных целях. При первых признаках болезни обратитесь к врачу. Самолечение опасно для здоровья!

источник

Каждую весну, когда снаружи теплеет, комары выходят из зимней спячки и/или вылупляются из яиц. Как только температура окружающей среды ночью начинает удерживаться на +10 °С, кровососы начинают активизироваться. Это значит, что если вы будете в это время часто находиться на улице, эти вредители уже будут искать себе жертв.

Комары — это больше, чем простая неприятность, они переносят заболевания! Лихорадку Западного Нила обычно переносят именно комары. Этому заболеванию подвержены не только люди, но и домашние животные. Это заболевание развивается не у каждого укушенного, но оно может быть смертельным (летальность: от 5,5% до 7,5% заражённых), и самое опасное в нём то, что от лихорадки Западного Нила нет специфичного лекарства.

Впервые вирус Западного Нила был обнаружен в 1937 году в Уганде, в США — в 1999 году, в России примерно в то же время. Природные очаги этого вируса находятся в южных странах бывшего СССР, а также на юге России, хотя и завозные случаи имеют место. Человеку этот вирус передают комары, но распространяют его на большие расстояния обычно птицы. Последние заражаются как раз от комаров или от поедания заражённых птиц (если птицы хищные).

Большинство птиц продолжают жить после заражения, но некоторые, например, вороны и сойки, зачастую умирают. Нет доказательств, что человек может заразиться вирусом от птицы, но во избежание лучше не трогайте мёртвых птиц голыми руками.

Комары передают вирус человеку при укусе. Этим занимаются только самки, им нужна кровь для производства яиц. Ротовой аппарат у самок специально для этого адаптирован, они протыкают кожу своим хоботком и впрыскивают сперва немного своей слюны. Благодаря этого кровь сразу не свёртывается и комариха с лёгкостью может пить кровь. Именно эта смесь слюны и крови передаёт человеку вирус Западного Нила.

Через пару дней после укуса инфицированного комара у человека могут развиться первые симптомы, но, по данным центра по контролю и профилактике болезней, бывает, что на это уходит до 2 недель. Только у одного из пяти человек, укушенных комаром, инфицированным вирусом Западного Нила, вообще развиваются симптомы. Обычно появляется жар, но важно знать, какие симптомы следует отслеживать. Только у одного процента укушенных людей развивается тяжёлая реакция, которая приводит к развитию лихорадки Западного Нила, а у неё есть длительные симптомы:

Слабость
Депрессия
Тремор
Быстрая усталость
И другие признаки повреждения мозга

Симптомы варьируются от человека к человеку, в зависимости от индивидуальной реакции на вирус. Вирус Западного Нила не заразен, но может передаваться от человека к человеку некоторыми редкими путями:

Переливание крови
От матери к ребёнку во время беременности и грудном кормлении
Трансплантация органов

Как только вас укусил заражённый комар, независимо от того, разовьются у вас симптомы или нет, вы получаете иммунитет к этому вирусу и больше вы им не заразитесь.

У большинства заражённых симптомы не развиваются, но у небольшого процента людей могут развиться лёгкие симптомы, как например:

Быстрая усталость
Головная боль
Боль в теле
Жар
Боль в спине
Рвота
Диарея

Иногда могут развиться другие симптомы:

Боль в глазах
Сыпь
Набухшие лимфоузлы

Специфического лечения лёгкого течения болезни нет.

Возраст, текущее состояние здоровья и другие факторы могут сыграть роль в индивидуальной реакции на вирус. Дети и пожилые люди наиболее подвержены этому заболеванию, поэтому важно знать, на какие симптомы следует обращать особенное внимание.

Симптомы лихорадки Западного Нила у детей не отличаются от тех, что проявляются у взрослых, и несут за собой точно такой же риск, что и у взрослых. У детей чаще развивается лёгкая лихорадка, сыпь и лёгкие симптомы, похожие на простуду.

У пожилых или у людей со слабым иммунитетом риск развития энцефалита Западного Нила значительно выше, а он может привести необратимому повреждению мозга.

Если вы находитесь в регионе, где возможно заражение вирусом Западного Нила, или собираетесь туда поехать, нужно обращать особенное внимание на следующие симптомы (особенно, у пожилых, помните, вакцины от этой лихорадки для людей пока нет):

Сильная головная боль
Ригидность затылочных мышц
Сильный жар
Неясность сознания
Тремор
Судороги
Внезапная мышечная слабость
Паралич

Любому, у кого появились такие симптомы, необходимо срочно обратиться к врачу. Это симптомы энцефалита Западного Нила. Лихорадка Западного Нила обычно не смертельна, лишь у некоторых развиваются серьёзные неврологические состояния, которые могут привести к смерти.

Врач может поставить диагноз «лихорадка Западного Нила» тремя путями:

Проанализировать кровь на предмет антител к вирусу
Проверить мозговую активность с помощью ЭЭГ и МРТ
Взять на анализ спинномозговую жидкость, чтобы проверить, не повысилось количество белых кровяных телец в ней

Лихорадку Западного Нила лечат в зависимости от тяжести состояния. Большинство людей выздоравливают дома, просто принимая обезболивающие, достаточное количество жидкости и отдыхая.

В случаях осложнений, например при энцефалите и менингите, лечения, как такового нет, но без госпитализации эти состояния могут быть смертельными. В больнице проводят поддерживающую терапию, проводят профилактику других инфекций, внутривенные вливания, подключают аппарат искусственной вентиляции лёгких и иногда используют иммуноглобулин.

Исследователи работают над тем, чтобы создать вакцину и разработать другой вид лечения, но на сегодняшний день нет ни специфической терапии, ни вакцины от лихорадки Западного Нила.

Комары могут передавать вирус Западного Нила собакам, кошкам, лошадям и другим домашним животным. Если знать симптомы лихорадки Западного Нила у животных, вы сможете их защитить. У разных животных лихорадка проявляется по-разному, но, как и у людей, более старые звери и те, у которых иммунитет ослаблен, более подвержены заражению и осложнениям.

Симптомы Западного Нила у собак часто путают с простудой или с респираторным заболеванием. Симптомы включают в себя:

Сыпь
Жар на несколько дней
Мышечная слабость и боль
Набухшие лимфоузлы

Симптомы могут появиться уже через день после укуса и могут стать более или менее тяжёлыми, в зависимости от состояния иммунной системы вашей собаки и того, как её организм отреагирует на вирус. У собак, как и у людей тоже есть риск развития энцефалита, который без лечения может привести к смерти.

Если вы находитесь в регионе, где случаются вспышки лихорадки Западного Нила, ваш ветеринар при признаках энцефалита у вашей собаки может провести анализ крови, чтобы диагностировать вирус Западного Нила. Собаки обычно выздоравливают через несколько дней, но если этого не происходит, собаке нужна будет ветеринарная помощь, включая внутривенные вливания.

Кошки могут заразиться вирусом Западного Нила от укусов комара и от поедания инфицированных птиц. Обычно у них развиваются лишь лёгкие симптомы, такие как вялость и жар, но и более серьёзные проявления тоже бывают. Но вы вряд ли поймёте, что кошка заразилась именно вирусом Западного Нила, так как никаких специфичных проявлений у них не бывает.

У лошадей симптомы проявляются через 5-15 дней после укуса инфицированным комаром. Как у людей и собак, симптомы разнятся от особи к особи и зависит от реакции на вирус.

Самые обычные симптомы лихорадки Западного Нила у лошадей включают следующие:

Слабость в конечностях
Подёргивания мышц
Ухудшение координации
Частые спотыкания
Частичный паралич
Жар (иногда)

Большинство лошадей могут полностью выздороветь дома при поддержке ветеринара. В тяжёлых случаях лошадям требуется госпитализация. Во время нахождения в больнице лошади могут понадобиться внутривенные вливания и лекарства для контроля лихорадки. Также лечение может включать:

Переворачивание во избежание пролежней
Защита головы и ног
Инфузионная терапия
Внутривенное питание

Вакцина от лихорадки Западного Нила для лошадей существует, но её нужно использовать до инфицирования. Если вы находитесь в регионе, где бывают вспышки лихорадки Западного Нила, возможность вакцинации следует обсудить с ветеринаром до начала «сезона комаров». Иногда вакцинация не столько обязательна, ведь только у 17% инфицированных лошадей развиваются рецидивы и другие осложнения поле выздоровления.

Чаще всего инфицирование происходит с июня по сентябрь. В Америке вспышки заболеваний происходят практически в каждом штате, кроме Гаваев и Аляски. В России первые случаи были зарегистрированы в 1999 году в Волгоградской и Астраханской областях. С тех пор помимо завозных случаев, нередки заражения на территории России, причём с годами это количество росло. В 2008 году в Волгограде был создан референс-центр по мониторингу за возбудителем лихорадки Западного Нила. В 2016 году по всей России было зафиксировано 135 случаев заражения, а в 2017 уже всего 12. Есть факторы, которые влияют на количество случаев заражений:

Количество птиц в области «обитания» вируса
Погодные условия (температура окружающей среды и влажность, подходящая для комаров)
Поведение людей
Размер комариной популяции

Не все комары переносят вирус Западного Нила. В мире существуют сотни видов комаров, но известными переносчиками является лишь маленький процент, например:

Азиатский тигровый комар (не так давно этот комар появился в России в алтайском крае, но пока они не опасны)
Комар обыкновенные, обитает практически во всех регионах России, но переносчиками Западного Нила могут быть лишь некоторые из них в южных регионах страны

Не важно, какой вид комара живёт на вашем дворе, лучший путь профилактики лихорадки Западного Нила — это не давать им себя кусать. Это значит, что вам нужно эффективный, долговременный способ уменьшения популяции комаров на вашем дворе.

Что нужно для профилактики? Не допускать укусов инфицированных комаров! То же касается вашей семьи и домашних животных. С таким огромным количеством методов защиты от комаров, нужно решить, какой из них будет самым эффективным для вашей семьи.

Можно купить репелленты, использовать свечи с цитронеллой и даже сделать свой дом устойчивым к комарам. Репелленты с ДЭТА могут быть эффективными против комаров, но их постоянно нужно обновлять, чтобы они продолжали работать.

Вы можете (и это даже обязательно) попробовать защитить от комаров ваш дом, чтобы они не залетали к вам и не кусались ночью. Для этого нужно:

Установите или почините москитные сетки на окнах и дверях.
Уберите всю стоячую воду вокруг вашего дома (птичьи поилки, старые шины, миски для животных, пруды и подобное)
Сообщайте о найденных мёртвых птицах в ваш департамент здравоохранения или природоохранительный орган. Не трогайте их!
Используйте лаврициды, чтобы уничтожить личинки комаров в прудах и фонтанах рядом с вашим домом

Эти методы помогут вам снизить риск быть укушенным инфицированным комаром, но это не слишком долговременные решения, да и никто не захочет постоянно сидеть дома. Чтобы полноценно насладиться занятиями на улице и снизить вероятность заражения лихорадкой Западного Нила, лучшая защита — это долговременное решение с доказанной эффективностью и безопасностью, такое как ловушки от компании Mosquito Magnet.

Ловушки превращают пропан в углекислый газ, потом нагревают его, увлажняют (чтобы сделать его похожим на дыхание человека) и добавляют дополнительный аттрактант (имитирующий запах человеческий кожи). Такая комбинация привлекает комаров, они подлетают ближе к ловушке, и тогда их засасывает внутрь, где они высыхают и умирают в течение 24 часов.

Обслуживать ловушку очень просто, нужно всего лишь совершать несколько действий каждый 21 день:

Заново наполнять баллон с пропаном
Менять аттрактант

Важно также следить за чистотой и целостностью сетки для насекомых, даже если количество отлавливаемых комаров не слишком велико. Загрязнённые и повреждённые сетки снижают эффективность ловушек от компании Mosquito Magnet.

Уничтожители комаров от Mosquito Magnet начинают работать сразу, но может потребоваться около 4 недель, чтобы прервать цикл размножения комаров рядом с вашим домом. Эти ловушки привлекают комаров с территории до 40 соток, но эффективно защищают (уничтожают до 90% популяции) от 6-14 соток в зависимости от модели:

Ловушка Pioneer работает от 15-ти метрового шнура питания и защищает территорию до 6 соток *
Модель Executive — беспроводная, работает от аккумулятора и защищает территорию до 14 соток *
Ловушка Independence тоже беспроводная и работает от аккумулятора и защищает территорию до 10 соток *

* при условии, что участок окружёно достаточно высоким непроницаемым забором

За спиной у ловушек от компании Mosquito Magnet 18 лет исследований и больше 15 патентов, что сделало эти уничтожители технологически революционными.

Уничтожители комаров Mosquito Magnet довольно дорогие, но вы сможете использовать их защиту многие годы и помогут вам уменьшить популяцию комаров на вашем дворе. В нашем магазине ловушки от Mosquito Magnet идут с двухлетней гарантией. Они являются отличным способом контроля популяции инфицированных комаров. Они покрывают достаточную область для защиты вашей семьи и домашних животных от укусов комаров, которые могут привести к лихорадке Западного Нила.

Ловушки Mosquito Magnet зарегистрирована агентством по охране окружающей среды США, и их эффективность научно доказана. Если вы хотите снизить вероятность заражения лихорадкой Западного Нила, стоит подобрать для себя наиболее подходящую ловушку для комаров. Чтобы эффективно контролировать популяцию комаров, такие уничтожители следует разместить сразу, как температура воздуха ночью начинает удерживаться на уровне +10 °С, тогда будут уничтожены самые первые проснувшиеся или родившиеся комары.

Защитите свою семью, домашних животных и гостей от болезней, переносимых комарами с ловушкой Mosquito Magnet — длительное, научно доказанное решение.

источник

Изобретение относится к области вирусологии и молекулярной биологии. Предложены генетическая конструкция для стимуляции иммунного ответа против вируса Западного Нила, а также химерный флавивирус, способ индукции иммунного ответа, способ получения химерной флавивирусной вакцины и применение химерного флавивируса для вакцинации. Изобретение может быть использовано для профилактики или лечения инфекции, вызванной вирусом Западного Нила. 5 н. и 15 з.п. ф-лы, 8 табл., 1 ил.

Настоящее изобретение относится к вакцинам против вируса лихорадки Западного Нила.

Предпосылки создания изобретения

Вирус Западного Нила (WN) начиная с самого раннего его обнаружения в северном полушарии продолжал быстро распространяться по Северной Америке. Первые случаи в районе Нью-Йорка были диагностированы в 1999 г., и до 2002 г. человеческая смертность возросла до более 150 случаев, и вирус продолжал распространяться, достигнув Калифорнии. Появление инфицированных/мертвых птиц показывает, что существует большой резервуар инфицированных москитов в географических областях, где встречается данная инфекция. К настоящему времени не существует эффективного лекарственного лечения от вируса Западного Нила, и методы сдерживания заболеваемости и профилактики не оказывают значительного влияния на число случаев инфекции у людей. Таким образом, риск миграции вируса на Южно-Американский континент, а также эпидемий в слаборазвитых странах чрезвычайно велик.

Вирус Западного Нила является представителем семейства флавивирусов. Эти вирусы являются мелкими, оболочечными РНК-вирусами с положительной цепью, которые являются причиной многих случаев заболеваний у человека и животных по всему миру. Примеры флавивирусов, кроме вируса Западного Нила, включают вирус желтой лихорадки, вирус японского энцефалита и вирусы Денге.

Белки флавивирусов продуцируются трансляцией единственной длинной открытой рамкой считывания с образованием полипротеина, который подвергается сложной серии посттрансляционных протеолитических расщеплений комплексом протеаз хозяина и вирусных протеаз с образованием зрелых вирусных белков (Amberg et al., J. Virol. 73: 8083-8094, 1999; Rice, Flavivir /> , In Virology, Fields (ed.), Raven-Lippincott, New York, 1995, Volume I, p.937). Структурные белки вирусов собираются в полипротеин по порядку С-рrМ-Е, где «С» является капсидом, «рrМ» (или предмембранный) является предшественником вирусного, связанного с оболочкой М (мембранного) белка, и «Е» является оболочечным белком. Эти белки присутствуют в N-концевой области полипротеина, тогда как неструктурные белки (NS1, NS2А, NS2 В, NS3, NS4А, NS4 В и NS5) расположены в С-концевой области полипротеина.

Краткое изложение изобретения

Данное изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые включают последовательности, кодирующие предмембранные и оболочечные белки вируса Западного Нила и капсидные и неструктурные белки вируса желтой лихорадки. Предмембранные и оболочечные белки вируса Западного Нила этих химер включают одну аттенуирующую мутацию или несколько, которые могут быть, например, заменой аминокислоты в положениях 107, 316 и/или 440 оболочечного белка. В качестве конкретных примеров заменой аминокислоты в положении 107 может быть замена лейцина на фенилаланин (или его консервативную аминокислоту); заменой аминокислоты в положении 316 может быть замена аланина на валин (или его консервативную аминокислоту); и заменой аминокислоты в положении 440 может быть замена лизина на аргинин (или его консервативную аминокислоту).

Данное изобретение также относится к химерным флавивирусам, кодируемым молекулами нуклеиновых кислот, описанных здесь, а также способам индукции иммунного ответа против вируса Западного Нила у субъекта путем введения таких химерных флавивирусов. Кроме того, данное изобретение относится к использованию таких химерных флавивирусов в способах вакцинации и их применению в способах изготовления лекарственных препаратов для использования для таких способов. Способы, описанные здесь, могут применяться для субъектов, которые подвергаются риску развития, но у них нет инфекции, вызываемой вирусом Западного Нила, а также для субъектов, которые инфицированы вирусом Западного Нила. Данное изобретение также относится к способам получения химерных флавивирусов, описанных здесь.

Данное изобретение имеет несколько преимуществ. Например, как описано более детально ниже, аттенуирующие мутации вирусов данного изобретения дают в результате сниженную нейровирулентность, и, кроме того, не оказывают значительного побочного действия на способность вирусов вызывать эффективный иммунный ответ. Таким образом, вирусы по настоящему изобретению обеспечивают эффективный и безопасный подход к профилактике и лечению инфекции, вызываемой вирусом Западного Нила.

Другие признаки и преимущества данного изобретения будут очевидны из следующего далее подробного описания и формулы изобретения.

На фиг.1 представлен график, показывающий титр соответствующих нейтрализующих антител (PRNT 50 ), получаемый у мышей IСR, вакцинированных вирусом YF/WN wt или YF/WN FVR . Показаны индивидуальные титры нейтрализующих антител против вируса YF/WN wt. Белые символы обозначают мышей, которые не выжили после внутрибрюшинного заражения штаммом WNV NY-99. 100%-ное выживание было получено в группах, вакцинированных дозой 10 3 БОЕ (бляшкообразующая единица) YF/WN wt и дозой 10 5 БОЕ YF/WN FVR . В группе, вакцинированной 10 3 БОЕ YF/WN FVR , после заражения выжили только 40% мышей.

Данное изобретение относится к вакцинам и способам их применения для профилактики и лечения инфекции, вызываемой вирусом Западного Нила (WN). Способы данного изобретения включают вакцинацию субъектов живым аттенуированным химерным флавивирусом, который состоит из вируса желтой лихорадки, у которого предмембранный и оболочечный белки были заменены белками вируса Западного Нила. Белки вируса Западного Нила у химер данного изобретения включают одну или более аттенуирующих мутаций, которые дополнительно описаны ниже.

Основные способы конструирования и применения химерных флавивирусов, которые можно использовать в данном изобретении, подробно описаны, например, в патентных заявках США с серийными номерами 09/007664, 09/121587 и 09/452638; в международных заявках РСТ/US 98/03894 (WО 98/37911) и РСТ/US00/32821 (WО 01/39802) и в Chambers et al., J. Virol. 73: 3095-3101, 1999, каждая из которых включена здесь в качестве ссылки в полном объеме. Как описано дополнительно ниже, эти способы модифицированы для использования по данному изобретению путем включения стадии введения одной или нескольких аттенуирующих мутаций во вставочные последовательности вируса Западного Нила. Методы, которые можно использовать для получения вирусов по данному изобретению, также описаны в РСТ/US03/01319 (WО 03/060088 А2), который приведен здесь в качестве ссылки.

В одном из примеров химерного вируса по данному изобретению аттенуирующая мутация расположена в положениях 107, 316 или 440 (или их сочетания) оболочечного белка вируса Западного Нила. Мутации, таким образом, могут быть, например, в одной или нескольких аминокислотах 102-112, 311-321 и/или 435-445 оболочечного белка вируса Западного Нила. В качестве конкретного примера, используя в качестве исходной последовательность штамма вируса Западного Нила NY99-flamingo-382-99 (инвентарный номер в GenBank АF196835), лизин в положении 107 можно заменить фенилаланином, аланин в положении 316 можно заменить валином и/или лизин в положении 440 можно заменить аргинином. Кроме указанных выше аминокислот можно производить замены другими аминокислотами, такими как аминокислоты, которые давали бы в результате консервативное изменение аминокислот, указанных выше.

Консервативные замены обычно включают замены в следующих группах: глицин, аланин, валин, изолейцин и лейцин; аспарагиновая кислота, глютаминовая кислота, аспарагин и глютамин; серин и треонин; лизин и аргинин и фенилаланин и тирозин. В конкретном примере химера данного изобретения включает каждую из специфических замен, указанных выше. Кроме того, как обсуждается дополнительно ниже, в химерных вирусах по данному изобретению могут быть также изменены другие остатки (например, в положениях 138, 176 и/или 280).

Вакцины по данному изобретению можно вводить в количестве и с использованием методов, которые легко могут быть определены специалистами в данной области. Вакцины могут применяться и быть получены, например, в виде жидкости, собираемой из клеточных культур, инфицированных химерным вирусом. Живой аттенуированный химерный вирус может быть получен в виде стерильного водного раствора, содержащего от 10 2 до 10 8 , например от 10 6 до 10 7 , инфицирующих единиц (например, бляшкообразующих единиц ( БОЕ ) или инфекционных доз тканевой культуры) в объеме дозы от 0,1 до 1,0 мл для введения, например, подкожным, внутримышечным или внутрикожным путем. Кроме того, может быть выбран путь введения через слизистые оболочки, такой как пероральный путь введения. Выбор соответствующего количества химеры для введения может быть осуществлен специалистами в данной области, и это количество может изменяться в зависимости от многих факторов, например массы и общего состояния здоровья субъекта, которому вводят эту химеру. Субъект может быть вакцинирован один раз, или, если необходимо, может иметь место дополнительная иммунизация.

Как отмечено выше, вакцины можно вводить в качестве первичных профилактических средств субъекту, который подвергается риску инфицирования вирусом Западного Нила. Вакцины можно также использовать как вторичные средства для лечения инфицированных вирусом Западного Нила субъектов путем стимуляции иммунного ответа к инфицирующему вирусу. Также, хотя и не требуется, для усиления иммуногенности химерных вакцин против вируса Западного Нила можно использовать адъюванты. Выбор соответствующих адъювантов может быть легко осуществлен специалистом в данной области.

Изобретение частично основано на следующих экспериментальных результатах.

Чтобы улучшить характеристики безопасности химерной вакцины из вирусов Западного Нила/ желтой лихорадки заявители изобретения исследовали, снизят ли нейровирулентность аттенуирующие точечные мутации в оболочечном белке. Как подробно описано ниже, авторами была сконструирована химера YF/WN, у которой отсутствует нейроинвазивность вируса Западного Нила, на мышах, и которая менее нейровирулентна, чем вакцинный штамм желтой лихорадки 17D YF, на моделях с мышами и обезьянами. Ниже приведено описание мутагенеза оболочечного белка и оценка безопасности, иммуногенности и эффективности этого и родственных вирусов на моделях с мышами и макаками-резусами.

Химерные конструкции YF/WN и молекулярные методики

Химерные флавивирусы были сконструированы с использованием технологии ChimeriVax , которая включает использование двухплазмидной системы, которая была описана ранее (смотри, например, патентные заявки США № № 09/007664, 09/121587 и 09/452638; международные заявки РСТ/US98/03894 (WО 98/37911) и РСТ/US00/32821 (WО 01/39802); и Chambers et al., J. Virol. 73: 3095-3101, 1999). Двухплазмидная система обеспечивает стабильность плазмиды в E.coli и удобный способ манипулирования клонированной основной цепью вируса желтой лихорадки (YF), облегчающий замену генов желтой лихорадки (YF) рrМ и Е генами целевого флавивируса. Используемые гены рrМ и Е вируса Западного Нила (WN) клонировали из изолята 383-99 flamingo WNV, последовательность с инвентарным номером GenBank АF196835. Вирусную кДНК рrМЕ получали с помощью ОТ-ПЦР (RT-PCR) (набор XL-PCR, Perkin Elmer). 5′-конец гена рrМ WN клонировали точно на 3′-конце капсидного гена 17D YF методом удлинения перекрывающихся участков с применением ПЦР с использованием полимеразы Рwо (Roche). Эта стадия клонирования сохраняет целостность сигнала расщепления/процессинга, кодируемого на 3′-конце капсидного гена вируса YF. 3′-конец Е гена также клонировали точно на 5′-конце кодирующей последовательности NS1 YF методом удлинения перекрывающихся участков с применением ПЦР. Использование этой двухплазмидной системы для клонировании области рrМЕ вируса Западного Нила в основную цепь 17D YF описано ранее (Arroyo et al., Trends in Molecular Medicine 7(8): 350-354, 2001). Молчащие мутации вводили в последовательность рrМ и Е, чтобы создать уникальные сайты рестрикции Вsр ЕI и Еаg I. Расщепление двух плазмид этими ферментами давало фрагменты ДНК, которые очищали на геле и лигировали in vitro с получением химерной кДНК полной длины. Эту кДНК линеаризировали с помощью Хhо I, чтобы облегчить транскрипцию in vitro полимеразой SР6 (Epicentre). Продукт РНК вводили в линии клеток эукариот, что делало возможным осуществление трансляции вирусной РНК и репликации вируса.

Точечные мутации вводили в разные кодоны гена Е для получения вариантов первоначальной химеры, кодирующей рrМЕ WN дикого типа. В таблице I показаны целевые сайты мутаций и олигонуклеотидные последовательности, использованные для создания химер YF/WN, описанных ниже. Сайты мутаций подтверждали секвенированием оболочечных белков (область рrМЕ), полученных вирусов. Образцы вирусной кДНК для секвенирования получали из РНК, экстрагированной из супернатантов вирусов (Trizol LS, Invitrogen) c последующими ОТ-ПЦР (набор XL-PCR, Perkin Elmer) и секвенированием с использованием синтетических праймеров (Invitrogen) и секвенатора CEQ 2000 (Beckman).

Химерные вирусы YF/WN (т.е. ChimeriVax -West Nile) получали трансфекцией РНК (вирус пассажа I, РI) в клетки линии Vero E6 (ATCC, CIDVR UMASS Medical Center Worcester, MA). Основной исследуемый посевной материал (RMS) получали путем дополнительного амплифицирования (пассаж либо 2, либо 3 при 0,001 МОI (множественность заражения) в клетках Vero E6. Клетки Vero E6 поддерживали в МЕМ (Invitrogen), 10% FВS (Hyclone). Получение предварительного основного посевного материала (РМS) для производства вакцины начнали трансфекцией в бессывороточные клетки линии Vero (SF-Vero) (ATCC, Baxter/Immuno Orth, Austria) c последующим амплификационным пассажем в той же самой линии клеток SF-Vero для получения PMS Р2 или предварительного основного посевного материала. Клетки клеточной линии SF-Vero делились и их сохраняли в препарате бессывороточной, безбелковой среды VT-Media (Baxter/Immuno, Austria). Используемый вирус WN дикого типа был штаммом NY-99 (изолят NY99-35262-11 flamingo), полученным из CDC, Fort Collins, CO (инвентарное обозначение СDС В82332W) с помощью двух дополнительных пассажей в клетках Vero E6 c получением основного банка вируса. 17D YF является коммерческой вакциной (YF-VAX®, Aventis Pasteur, Swiftwater, PA), используемой здесь после восстановления лиофилизированного продукта и после одного пассажа в клетках Vero E6 (АТСС, Acambis Inc., Cambridge, MA).

Нейроинвазивность и нейровирулентность у взрослых мышей и мышат на грудном вскармливании; методы определения иммуногенности и титров заражения (методика иммунизации, анализа бляшек, PRNT)

Мышам делали внутрибрюшинную прививку (в/б) для испытания на нейроинвазию или при заражении вирусом WN дикого типа. Объемы для внутрибрюшинной прививки составляли 100-200 мкл, вводимых шприцом 25G. Взрослым мышам и мышатам на грудном вскармливании вакцину вводили внутрицеребрально для испытания на нейровирулентность. Для внутрицеребрального введения использовали объем прививки, равный 20 мкл, вводимый в правую сторону фронтальной доли мозга. Вирусы разводили в М199 буфером HEPES (Invitrogen) и 20%-ным FBS (Hyclone), если не указано иначе. Исследование бляшек в клетках Vero осуществляли для подтверждения титра иммунизиующей дозы вируса (Monath et al., J. Virol. 74(4): 1742-1751, 2000).

За мышами наблюдали в течение срока, равного 21 дню, чтобы определить нейроинвазию, нейровирулентность или выживание после заражения вирусом Западного Нила. Наблюдали/оценивали заболеваемость и смертность, и выживших подвергали эвтаназии.

Чтобы определить титры нейтрализующих антител мышей обескровливали ретроорбитальным путем, и сыворотку отделяли центрифугированием. Исследование нейтрализации по снижению числа бляшек (РRNТ) использовали для определения титров нейтрализующих антител в сыворотке.

Исследование нейровирулентности у резусов

Испытание на обезьянах-резусах для определения нейровирулентности вакцин от желтой лихорадки (YF), как описано в руководстве ВОЗ, использовали для определения безопасности химер YF/WN (Monath et al., J. Virol. 74(4): 1742-1751, 2000). Животным внуртрицеребрально вводили вакцину, и ежедневно получали образцы крови для определения уровней вирусемии, используя бляшечную методику исследования. Животных осматривали ежедневно на признаки связанных с заболеванием симптомов, таких как лихорадка или тремор. Животных подвергали эвтаназии через 30 дней после инфицирования, и ткани головного и спинного мозга затем забирали на гистопатологию. Нейропатологию оценивали по предписанной ВОЗ системе, и значения анализировали на патологию, сравнимую с патологией, связанной со стандартной вакциной 17D YF.

Иммуногенность у макак-резусов и заражение

Макак-резусов вакцинировали подкожным введением единственной 0,5-мл дозы вакцины, номинально содержащей 4 log 10 БОЕ. Вирусемию определяли исследованием на бляшкообразование разбавленной сыворотки на клетках Vero с использованием образцов сыворотки, которые ежедневно собирали с 0 по 10 день (Monath et al., J. Virol. 74(4): 1742-1751, 2000). Уровни нейтрализующих антител определяли исследованием титров нейтрализации по снижению бляшек (РRNТ) (Monath et al., J. Virol. 74(4): 1742-1751, 2000). Животных заражали через 64 дня после вакцинации вирусом NY99 WN дикого типа.

Генетическая стабильность (in vivo и in vitro пассажи) и секвенирование

Конструкцию YF/WN wt (например, ChimeriVax -WN 01 ) без аттенуирующих мутаций в белке Е пассировали шесть раз в клетках Vero E6 с последующими шестью пассажами на мышатах на грудном вскармливании при введении внутрицеребральным путем. Конструкции предосновного посевного материала и основного исследуемого посевного материала YF/WN FVR (например, ChimeriVax -WN 02 ) с тремя аттенуирующими мутациями, введенными в белок Е, пассировали 12 и 10 раз, соответственно в бессывороточном, безбелковом субстрате клеток SF-Vеrо. Все пассажи выполняли первоначальными 0,01 МОI с последующим сбором на третий день, и продолжая без титрования для определения активности вируса. Титры вируса, использованные при каждом пассаже, позднее подсчитывали бляшечным исследованием. Нейровирулентность пассированных вирусов определяли внутрицеребральным введением взрослым мышам и мышатам на грудном вскармливании. Вирусную ДНК затем секвенировали.

Фенотип вирулентности YF/WN wt по сравнению с 17D YF (YF-VАХ®)

Первоначальная химера вируса Западного Нила кодировала гены оболочечного и предмембранного белков штамма NY99 WN дикого типа (т.е. YF/WN wt или ChimeriVax -WN 01 ). У этого химерного вируса отсутствовала способность вызывать энцефалит после внутрицеребрального заражения при дозах 10 6 БОЕ на мышь IСR (таблица 2). Энцефалит оценивали ежедневным наблюдением изменений двигательного поведения, ведущего к параличу и смерти. Отсутствие нейроинвазии YF/WN wt у взрослых мышей наблюдалось также другими исследователями у мышей, которым вводили вакцину 17D YD (Ryman et al., Virology 230(2):376-380, 1997). Напротив, вирус NY99 WN дикого типа был летальным для мышей при введении внутрибрюшинным путем в таком небольшом количестве, как 1-4 БОЕ (Beaslеy et al., Virology 296:17-23, 2002). Как установлено здесь, внутрицеребральный LD 50 YF/WN wt находится между 10 3 и 10 5 БОЕ. Фенотип по нейровирулентности YF/WN wt ниже фенотипа вируса 17D YF, когда внутрицеребральный LD 50 для мышей IСR находится между 10 1 и 10 2 БОЕ. Однако с вирусом YF/WN wt не выявлено четкого пограничного момента у 21-дневных мышей (таблица 3).

Подходы с многосайтовым мутагенезом

Аминокислоты в оболочечном белке заменяли, чтобы определить, будут ли эти замены снижать вирулентность химер YF/WN. Изменения вирулентности оценивали на модели на мышах и сравнивали с нейровирулентностью исходной химеры YF/WN wt. Аминокислотные остатки, картируемые в положениях оболочечного гена (Е) YF/WN wt 107, 138, 176 и 280, все были изменены в единственной конструкции с шифровкой аминокислотных остатков как F, К, V и М соответственно. Новый химерный вирус определяли как YF/WN FКVМ . Затем конструировали химеры, в которых каждый аминокислотный остаток в группе FКVМ, один, изменяли, чтобы оценить его особую роль в нейровирулентности (таблица 4). Кроме того, мутации аминокислотных остатков 316 и 440 изменяли на V и R соответственно на основе предшествующих данных, показывающих, что мутации в Е-белке, которые картировали в этих областях, могут воздействовать на биологию третьего домена белка Е (Rey et al., Nature 375(6529): 291-298, 1995; Allison et al., J. Virol. 75(9):4268-4275, 2001). Наблюдения за нейровирулентностью химер, имеющих модифицированные аминокислоты в белке Е, показали, что остатки 107, 316 и 440 являются наиболее важными аминокислотами, отвечающими за нейровирулентность вируса WN. На основе этой информации была создана многосайтная конструкция YF/WN FVR и выбрана в качестве кандидата на вакцину. Все многосайтные химеры растили до титров 10 7 БОЕ /мл на бессывороточных клетках SF Vеrо.

Исследования нейровирулентности на мышах и макаках-резусах

Нейровирулентность вирусов с единственной или многосайтными мутациями в гене оболочечного белка YF/WN wt у мышей определяли на 21-дневных мышах, которым вводили внутрицеребрально путем дозы вируса между 10 4 и 10 5 БОЕ. Эта оценка определила остатки 107 и 280 (таблица 4) и сочетание 316/440 (таблица 5) как более доминантные аттенуирующие мутации, что определено по гибели мышей и относительному среднему времени выживания (АSТ). Химера, выбранная в качестве кандидата на данную вакцину, которая имеет комбинацию мутаций F, V и R остатков 107, 316 и 440 соответственно, была авирулентной у взрослых мышей (таблица 6). Однако некоторая нейровирулентность наблюдалась у двухдневных мышат на грудном вскармливании, подобно вакцине ChimeriVax -JЕ, которая является безопасной для людей (Monath et al., Vaccine 20:1004-1018, 2002).

Фенотип нейровирулентности химер вируса Западного Нила для макак-резусов оценивали с конструкцией YF/WN wt и сравнивали с нейровирулентностью вакцины 17D YF. Макакам-резусам вводили внутрицеребрально YF/WN wt и сравнивали с введением доз вакцины 17D YF. Химера давала титры вирусемии и продолжительность, сходные с показателями для вакцины 17D YF. Этот вирус был не более нейровирулентен, чем вакцина YF, указывая на то, что химеры YF/WN являются такими же безопасными, как и вакцина 17D YF.

Исследование иммуногенности на мышах и макаках-резусах

Сравнивали иммуногенность химеры YF/WN wt и конструкции YF/WN FVR , которая имеет мутации остатков оболочечного белка 107, 316 и 440. Мышам подкожно вводили дозы вакцины в интервале между 2 и 5 log 10 БОЕ. Сыворотку собирали четыре недели после иммунизации и титровали на нейтрализующие антитела. Данные на чертеже показывают, что сайт-нацеленное аттенуирование конструкции YF/WN wt в результате дает менее иммуногенный вирус. Внутрибрюшинное заражение иммунизированных мышей вирусом NY99 WN дикого типа выявило у конструкций корреляцию активности вакцины с эффективностью. Все мыши, иммунизированные дозой 10 5 БОЕ/мл любой из химер YF/WN, были защищены от заражения вирулентным вирусом.

У макак-резусов иммуногенность кандидатов в вакцины с одной, двумя или тремя аттенуирующими мутациями, YF/WN 107 F, YF/WN 316 V 440 R или YF/WN FVR , была одинаковой. Не было значительных различий в титрах соответствующих антител, когда животные получали дозу вакцины 10 4 БОЕ. Исследования эффективности, определяемой путем заражения вирусом WN NY99 дикого типа после иммунизации, ясно показали, что вероятные вакцины WN, испытанные на модели макак-резусов обладали 100%-ной эффективностью по сравнению с контрольными животными (таблица 7).

Вирусемия после вакцинации у макак-резусов была одинаковой продолжительности по сравнению с продолжительностью, вызываемой вакциной 17D YF, но более низкой по значению, с линейной корреляцией с числом аттенуирующих одиночных мутаций в химерах (таблица 8). Тем не менее оценка безопасности на основе висцеротропизма (или вирусемии после вакцинации) показывает, что любой из кандидатов в вакцины, испытанных на модели макак, является более безопасным, чем 17D YF.

Последующее внутрицеребральное заражение иммунизированных макак-резусов 5,8 log 10 БОЕ WN NY99 не вызывало обнаруживаемой вирусемии, и не наблюдалось клинических признаков заболевания или гибели животных, вакцинированных конструкциями YF/WN. Значительная вирусемия в результате репликации WNV была обнаружена при вакцинации 17D YF. Уровни вирусемии, обнаруживаемые у животных в этой группе, имели средний титр log 10 БОЕ, равный 2,25±0,62 со средней продолжительностью, равной 3,5 дням. Эти уровни вирусемии сходны с уровнями, наблюдаемыми в вакцинированной контрольной группе (n=2) со средним титром log 10 БОЕ, равным 2,33±0,47, и средней продолжительностью 4,5 дня. Две из четырех макак-резусов, вакцинированных 17D YF, выжили после внутрицеребрального заражения штаммом WN NY99. Выжившие теряли аппетит, и у них проявлялись симптомы оцепенения с повышенной температурой после заражения. У животных, которых подвергали эвтаназии после заражения штаммом WNV NY99, были представлены симптомы, включающие лихорадку и тремор.

Для определения генетической стабильности конструкций при выращивании на стационарных культурах осуществляли субстрат-пассажные исследования in vitro и in vivo с химерами YF/WN wt или YF/WN FVR . После шести пассажей YF/WN wt in vitro в клетках Vero E6 с последующими шестью пассажами in vivo в головном мозге взрослых мышей IСR не обнаружено нежелательных мутаций в области гена оболочечного белка (рrМ, Е) этой химеры. Гетерозиготная мутация в белке Е в положении Е336, приводящая к замене цистеина на серин, была установлена после десяти пассажей in vitro вируса YF/WN FVR в клетках Vero E6. В отдельном исследовании пассаж YF/WN FVR в клетках SF-Vero приводил к селекции мутации в положении Е 313, которая изменяла аминокислоту в этом положении с глицина на аргинин. Во время всех серийных пассажей вируса в клетках Vero не обнаружено реверсий/мутаций целевых остатков 107F, 316V или 440R, которые участвуют в нейровирулентности вируса.

Праймеры для сайт-направленного мутагенеза для создания мутантного аттенуированного вируса желтой лихорадки/ Западного Нила. Изменения нуклеотидов, которые вводят новую аминокислоту, указаны жирным шрифтом. Введенные молчащие сайты рестрикции подчеркнуты. Праймеры, указанные *(звездочкой), являются клонирующими праймерами, использованными для субклонирования фрагмента. Один включает изменение нуклеотида, тогда как другие — нет.

Классы МПК:	C12N15/40 белки из РНК вирусов, например flaviviruses C12N7/00 Вирусы, например бактериофаги; их композиции; приготовление или очистка их A61K39/12 вирусные антигены
Автор(ы):	АРРОЙО Хуан (US) , МИЛЛЕР Чарльз М. (US) , КАТАЛАН Джон Аврам (US) , МОНАТ Томас П. (US)
Патентообладатель(и):	ЭКЭМБИС, ИНК. (US)
Приоритеты:

Таблица 2 Нейроинвазивность YF/WN wt (ChimeriVax -West Nile 01) по отношению к 17D YF, реакция на дозу у мышей IСR 1
Вирус в/б	Доза (log 10 БОЕ )	% гибели (число погибших/ число испытуемых)	СВВ 2
YF/WN wt	0,89	0(0/5)	—
(Р2)	2,23	0(0/5)	—
	3,24	0(0/5)	—
	4,06	0(0/5)	—
	5,45	0(0/5)	—
	6,51	0(0/5)	—
YF17D	2,78	0(0/3)	—
(ATCC)	4,48	0(0/3)	—
Имитация	N/A	0(0/3)	—
1 Использовали 3-4-недельных мышей-самок линии Harlan-Sprague ICR. СВВ = Среднее время выживания. YF/WN wt Р2 указывает вирус пассажа второго поколения в клетках Vero. Штаммы вируса Западного Нила обычно являются нейроинвазивными после второго внутрибрюшинного заражения.

Таблица 3 Нейровирулентность YF/WN wt (ChimeriVax -West Nile 01) по отношению к 17D YF, реакция на дозу (3-4-недельные самки мышей линии Harlan-Sprague ICR)
Вирус в/ц	Доза 1 (log 10 БОЕ)	% гибели (число погибших/число испытуемых)	СВВ
YF/WN wt	-2	0(0/5)	—
(Р2)	-0,30	0(0/5)	—
	0,89	20(1/5)	11
	2,23	0(0/5)	—
	3,24	20(1/5)	10
	4,06	60(3/5)	9
	5,45	20(1/5)	9
YF17D		20(1/5)	9
(ATCC)		60(3/5)	10,3
	0,9	100(5/5)	9,2
	0,98	100(5/5)	8,2
	2,78	100(5/5)	8
Имитация	N/A	0(0/3)	—
1 Действительную дозу, доставляемую внутрицеребрально, принимали за равную 20 мкл для показанных расчетов обратного титрования.

Таблица 4 Нейровирулентность вариантов ChimeriVax -WN 01 после сайт-направленного мутагенеза в протеиновых остатках 107, 138, 176 и 280, испытанных на взрослых мышах 1
Вирус (пассаж в Vero)	Намеченная доза (log 10 БОЕ)	Доза по обратному титрованию (log 10 БОЕ)	% гибели (число погибших/ число испытуемых)	СВВ
YF/WN wt	4	4,87	100(5/5)	8,6
(P3)	5	6,09	60(3/5)	9
YF/WN 107 F	4	4,22	0(0/5)	—
(P2)	4	4,42	0(0/8)	—
	5	4,99	0(0/5)	—
YF/WN 138 K	4	4,26	60(3/5)	10,33
(P3)	4	4,41	63(5/8)	11,4
	5	5,48	60(3/5)	9,33
YF/WN 176 V	4	4,42	80(4/5)	12,5
(P3)	5	5,54	80(4/5)	11
YF/WN 280 M	4	4,14	40(2/5)	9
(P3)	4	4,55	89(7/8)	11,86
	5	5,14	0(0/5)	—
YF/ 107 F 138 K 280 M	4	3,70	0(0/5)	—
(P2)	5	4,81	0(0/5)	—
YF/ 107 F 138 K 176 V 280 M	4	4,13	0(0/5)	—
(P3)	5	5,10	20(1/5)	7
YF-VAX	3	2,77	100(5/5)	9
WN NY99	4	3,90	100(5/5)	5
1 Мыши, заражаемые внутрицеребрально, были 3-4-недельными самками Taconic ICR. P2 и P3 указывают второе и третье поколение вируса при пассажах на клетках Vero соответственно.

Таблица 5 Нейровирулентность вариантов ChimeriVax -WN 01 после сайт-направленного мутагенеза в протеиновых остатках 316 и 440, испытанных на взрослых мышах 1
Вирус (пассаж в Vero)	Доза по обратному титрованию (log 10 БОЕ)	% гибели (число погибших/ число испытуемых)	СВВ
YF/WN wt	4,11	83(10/12)
(P3)	4,74	60(3/5)
	4,83	100(8/8)
YF/WN 316 V	4,09	25(3/12)
(P3)	4,67	38(3/8)
	4,57	38(9/24)
YF/WN 440 R	4,17	83(10/12)
(P3)	4,60	38(3/8)
	4,35	56(14/25)
YF/WN 316 V 440 R	3,9	17(2/12)
(P3)	4,12	40(2/5)
	3,71	36(9/25)
1 Мыши, заражаемые внутрицеребрально, были 3-4-недельными самками Taconic ICR. Представлены результаты трех независимых экспериментов.

Таблица 6 Нейровирулентность вариантов ChimeriVax -WN 02 (YF/WN 107 F 316 V 440 R) для взрослых мышей по отношению к YF/WN wt
Вирус (пассаж в Vero)	Доза по обратному титрованию (log 10 БОЕ)	% гибели (число погибших/ число испытуемых)	СВВ
YF/WN wt	3,62	42(5/12)	9,4
(P2)
YF/WN 107 F 136 V 440 R	5,54	0(0/12)	—
(P4)
YF/WN 107 F 316 V 440 R	3,72	0(0/12)	—
(P4)
1 Мыши, заражаемые внутрицеребрально, были 3-4-недельными самками Taconic ICR.

Таблица 7
Титры соответствующих нейтрализующих антител (TCHA 50 ; PRNT 50 ) против вируса YF/WN wt. Макакам-резусам вводили 17D YF или описанных кандидатов на вакцину, подкожно
Обезьяна	Вакцина	Доза Log 10 БОЕ	День после иммунизации (дпи)	День после заражения (дпз)
14 дпи	30 дпи	63 дпи	15 дпз	31-34 дпз
М017	YF17D	4,49	NT	NT	640	NT
R286	YF17D	4,49	NT	NT	—	—
Т081	YF17D	4,49	NT	NT	640	NT
N313	YF/WN 107 F (P2)	4,19	160	>640	>640	2560	5120
Р367	YF/WN 107 F (P2)	4,19	107 F (P2)	4,19	б40	2560	1280
АЕ81	YFAVN 107 F (P2)	4,19	640	160	>10240	>20480
GMT a			57	640	453	4305	4305
R918	YF/WN 316 V 440 R (P3)	4,0	640	>1280	2560
N577	YF/WN 316 V 440 R (P3)	4,0	160	320	>1280	2560
М233	YF/WN 316 V 400 R (P3)	4,0	160	320	640	1280
Т757	YF/WN 316 V 440 R (P3)	4,0	640	>1280	>5120
GMT			40	135	453	1076	2560
J729	YF/WN FVR (P4)	3,92	5120	>5120
T445	YF/WN FVR (P4)	3,92	80	640	160	640	>5120
T086	YF/WN FVR (P4)	3,92	160	>320	>640	1280	>5120
T491	YF/WN FVR (P4)	3,92	80	320	160	2560	>5120
GMT			80	381	190	1280	5120
a СГЗТ (GMT), среднее геометрическое значение титра; когда конечное значение не определено, при расчете использовали ограничивающий исследование титр (например, >640 принято как 640, и b НО (NT) = не испытан; с — животное подвергали эвтаназии после развития симптомов, связанных с инфекцией, вызванной вирусом Западного Нила.

1. Генетическая конструкция для стимуляции иммунного ответа против вируса Западного Нила, содержащая последовательности, кодирующие предмембранные и оболочечные белки вируса Западного Нила и капсидные и неструктурные белки вируса желтой лихорадки, где указанные предмембранные или оболочечные белки содержат аттенуирующую мутацию, и где указанная аттенуирующая мутация содержит аминокислотную замену в одном или нескольких положениях, выбранных из группы, состоящей из положений 107, 316 и 440 оболочечного белка вируса Западного Нила.

2. Генетическая конструкция по п.1, где указанная аминокислотная замена находится в положении 107.

3. Генетическая конструкция по п.1, где указанная аминокислотная замена находится в положении 316 и положении 440.

4. Генетическая конструкция по п.1, где указанная аминокислотная замена находится в положениях аминокислот 107, 316 и 440.

5. Генетическая конструкция по п.1, где указанная аминокислотная замена в положении 107 представляет собой замену лейцина на фенилаланин или консервативную аминокислоту.

6. Генетическая конструкция по п.1, где указанная аминокислотная замена в положении 316 представляет собой замену аланина на валин или консервативную аминокислоту.

7. Генетическая конструкция по п.1, где указанная аминокислотная замена в положении 440 представляет собой замену лизина на аргинин или консервативную аминокислоту.

8. Химерный флавивирус, содержащий генетическую конструкцию по п.1, для применения в вакцинации и получения лекарственных средств для вакцинации.

9. Химерный флавивирус по п.8, где указанная аттенуирующая мутация включает аминокислотную замену в одном или нескольких положениях, выбранных из группы, состоящей из положений 107, 316 и 440 оболочечного белка вируса Западного Нила.

10. Химерный флавивирус по п.9, где указанная аминокислотная замена находится в положении 107.

11. Химерный флавивирус по п.9, где указанная аминокислотная замена находится в положении 316 и положении 440.

12. Химерный флавивирус по п.9, где указанная аминокислотная замена находится в положениях аминокислот 107, 316 и 440.

13. Химерный флавивирус по п.9, где указанная аминокислотная замена в положении 107 представляет собой замену лейцина на фенилаланин или консервативную аминокислоту.

14. Химерный флавивирус по п.9, где указанная аминокислотная замена в положении 316 представляет собой замену аланина на валин или консервативную аминокислоту.

15. Химерный флавивирус по п.9, где указанная аминокислотная замена в положении 440 представляет собой замену лизина на аргинин или консервативную аминокислоту.

16. Способ индукции иммунного ответа на вирус Западного Нила у пациента, где указанный способ включает введение пациенту химерного флавивируса по п.8.

17. Способ по п.16, где указанный пациент не инфицирован, но подвергается риску инфицирования вирусом Западного Нила.

18. Способ по п.16, где указанный пациент инфицирован вирусом Западного Нила.

19. Способ получения химерной флавивирусной вакцины, который включает:
(i) введение генетической конструкции по п.1 в клетки;
(ii)сбор вируса из клеток; и
(iii) получение композиции вместе с собранным вирусом для введения в виде вакцины.

20. Применение химерного флавивируса по п.8 для вакцинации против вируса Западного Нила.

источник

Вакцинация при лихорадке западного нила

<img src="https://mosquitomagnet.spb.ru/images/companies/1/pages/Kartinki-dlya-ychebnogo-tsentra/lihoradka-zapadnogo-nila-2.jpg">