Тест системы для лихорадки западного нила

Инфицирование вирусом Западного Нила может протекать бессимптомно (80% случаев), в форме лихорадки (до 20%) или тяжелой нейроинвазивной болезни (менее 1% случаев).

Природными резервуарами инфекции являются птицы, переносчиками – комары рода Culex. Инфекцию могут приобретать люди, лошади и другие млекопитающие. Инфицирование человека чаще всего происходит в результате укусов инфицированных комаров, которые инфицируются во время питания кровью инфицированных птиц. Вирус может также передаваться при контакте с инфицированными животными, их кровью или тканями, при трансплантации органов, переливании крови и грудном вскармливании. Зарегистрирован случай трансплацентарной передачи вируса. Тот факт, что в 80% случаев инфекция протекает бессимптомно, в том числе, и в стадии виремии, обусловливает риск участия в донорстве крови лиц, инфицированных вирусом лихорадки Западного Нила, и передачи вируса реципиенту.

В позднелетний-осенний период в Российской Федерации возникают крупные вспышки лихорадки Западного Нила, в том числе с летальными исходами. Природные очаги этого заболевания имеются в большинстве регионов РФ. В последние годы отмечается раннее начало и позднее окончание эпидсезона и расширение ареала распространения лихорадки Западного Нила на север. Встречаются завозные случаи заболевания (из Узбекистана, Египта, Доминиканской Республики).

Ведущий метод диагностики инфекции, вызванной вирусом Западного Нила, у людей – выявление IgM. Ввиду наличия перекрестных реакций с другими флавивирусами, результат серологического исследования может быть ложноположительным. Выявление вируса методами амплификации нуклеиновых кислот (в частности – ПЦР) высоко информативно при диагностике инфекции, вызванной вирусом Западного Нила, у людей и является оптимальным методом выявления возбудителя в природных очагах (у комаров, птиц). Метод ПЦР также используется для тестирования донорской крови на наличие вируса Лихорадки Западного Нила; например, в США с 2003 года это исследование обязательно для всех донаций.

Набор реагентов АмплиСенс WNV-FL предназначен для выявления РНК вируса Западного Нила в клиническом и аутопсийном материале от людей, материале от животных, в комарах и клещах. Реакции обратной транскрипции и ПЦР совмещены в одном этапе (one step), что обеспечивает простоту и высокую скорость анализа.

Биоматериалы: от людей (плазма и сыворотка крови, лейкоцитарная фракция крови, спинномозговая жидкость, моча); аутопсийный материал от людей (ткани мозга, печени, селезенки, лимфоузлов); материал от животных (ткани мозга); комары и клещи.

Рекомендации по пробоподготовке клещей рода Hyalomma:

Дополнительно приобрести: набор реагентов для экстракции РНК/ДНК АмплиПрайм РИБО-преп. Для экстракции РНК из 1 мл плазмы, сыворотки крови или СМЖ рекомендуется использовать набор реагентов МАГНО-сорб.

Для гомогенизации аутопсийного материала, комаров и клещей рекомендуется использовать гомогенизаторы TissueLyser LT или TissueLyser II.

Прогноз эпидемиологической ситуации по лихорадке Западного Нила на 2014 год (читать на сайте Ростпотребнадзора)

West Nile Virus in the United States: Guidelines for Surveillance, Prevention, and Control (2013) (Скачать)

МУ 3.1.3.2600-10 Мероприятия по борьбе с Лихорадкой Западного Нила на территории Российской Федерации (Скачать)

МУК 4.2.3009-12 Порядок организации и проведения лабораторной диагностики лихорадки Западного Нила (Скачать)

Особенности эпидемической ситуации по лихорадке Западного Нила в 2012 г на территории Российской Федерации (2013) (Скачать)

«Новые» гемотрансмиссивные инфекции и их профилактика (2012) (читать на сайте transfusion.ru)

Главный офис г. Москва
+7 (495) 664-28-84

источник

* – препараты экспериментально-производственных серий

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Только сон приблежает студента к концу лекции. А чужой храп его отдаляет. 8602 — | 7408 — или читать все.

195.133.146.119 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно

источник

Набор реагентов ИФА-ЗН-антиген: Тест-система иммуноферментная для выявления антигена вируса лихорадки Западного Нила 48 определений

по применению набора реагентов «ИФА-ЗН-антиген»

Тест-система иммуноферментная для выявления антигена вируса лихорадки Западного Нила

Выявление антигена вируса лихорадки Западного Нила (ЗН) в полевых и клинических материалах: комарах, спинно-мозговой жидкости (СМЖ) и в тканях органов погибших людей.

Иммуносорбент – мышиные антитела класса G к вирусу ЗН (IgG_ЗН) и нормальный мышиный иммуноглобулин класса G (IgG_N), сорбированные на поверхности лунок 96-луночного разборного полистиролового плоскодонного планшета. IgG_ЗН сорбированы в нечетных рядах лунок, IgG_N – в четных рядах 2 шт.

К + – контрольный положительный образец – антиген вируса ЗН, инактивированный 0,004% бетапропиолактоном; прозрачная бесцветная или светло-желтого цвета жидкость 1 флакон (0,1 мл).

К – – контрольный отрицательный образец – нормальный антиген, приготовленный из ткани мозга неинфицированных мышей; инактивированный 0,004% бетапропиолактоном; прозрачная бесцветная или светло-желтого цвета жидкость 1 флакон (0,1 мл).

Коньюгат – антитела к вирусу ЗН из асцитной жидкости мышей, инфицированных вирусом ЗН, меченые пероксидазой хрена; прозрачная бесцветная или светло-желтого цвета жидкость 1 флакон (0,5 мл).

РБР(х10) – 10-кратный концентрат раствора для разведения образцов – концентрат раствора для разведения исследуемых образцов, антигенов, конъюгата; прозрачная красного цвета жидкость 1 флакон (10 мл).

ФСБ-Т(х25) – 25-кратный концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином – концентрат раствора для промывания планшетов; слегка опалесцирующая бесцветная пенящаяся жидкость, возможно выпадение осадка солей белого цвета, растворяющегося при температуре 37 о С в течение 30 мин 1 флакон (80 мл).

ТМБ – хромоген – 0,25 % раствор 3,3′,5,5′-тетраметилбензидина; прозрачная бесцветная жидкость 1 флакон (1,5 мл).

ЦР – цитратный раствор – раствор для приготовления рабочего раствора хромогена; прозрачная бесцветная жидкость 2 флакона (по 12 мл).

Стоп-реагент – серная кислота в концентрации 0,5 моль/л; прозрачная бесцветная жидкость 1 флакон (25 мл).

При наличии в исследуемом образце антигена вируса ЗН, антиген связывается с антителами класса G к вирусу ЗН, сорбированными в лунках планшета. Образующийся при этом комплекс (антитело-антиген) связывается затем с конъюгатом – мышиными антителами к вирусу ЗН, меченными пероксидазой хрена, и выявляется в реакции с индикаторным раствором, содержащим хромоген – тетраметилбензидин, в результате которой меняется цвет (оптическая плотность) реакционной смеси в лунке планшета; изменение регистрируется спектрофотометрически.

Набор рассчитан на проведение 96 определений, включая контрольные.

Предусмотрено дробное использование набора.

Набор «ИФА-ЗН–антиген» является биологически безопасным, т.к антиген вируса ЗН полностью инактивирован. Однако при обследовании полевых и клинических материалов необходимо соблюдать меры предосторожности и обращаться с ними как с материалами, потенциально инфицированными вирусом, в соответствии с требованиями СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I — II групп патогенности (опасности)».

• Работать в резиновых (латексных) перчатках.
• Не пипетировать ртом.

Утилизацию или уничтожение, дезинфекцию наборов реагентов следует проводить в соответствии с СанПин 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами» и МУ-287-113 «Методические указания по дезинфекции, предстерилизационной очистке и стерилизации изделий медицинского назначения».

Нельзя использовать реагенты из наборов разных серий или смешивать их в процессе приготовления растворов, а также использовать реагенты по истечении срока годности. Перед использованием все реагенты набора необходимо выдержать 30 мин при температуре от 18 до 25 о С.

• Для приготовления растворов и проведения ИФА следует использовать чистую мерную посуду и автоматические пипетки с погрешностью измерения объемов не более 5%.
• Сразу после постановки реакции плотно закрытые флаконы с исходными реагентами необходимо поместить в холодильник (при температуре от 2 до 8 о С), использовать в течение 1 мес.
• Растворы хромогена и конъюгата в рабочем разведении готовить непосредственно перед использованием. Исключить воздействие света на раствор хромогена.
• При промывке планшета лунки заполнять полностью (370 мкл промывочного раствора) и не касаться лунок наконечниками пипетки.
• Не допускать высыхания лунок планшета между отдельными операциями.
• Наконечники для пипеток, используемые для работы с исследуемыми сыворотками и контрольными образцами использовать однократно.
• Для отбора исследуемых образцов и реагентов тест-системы использовать автоматические пипетки с погрешностью измерения объёмов не более 5%.

– Дозаторы (пипетки полуавтоматические одно– и многоканальные переменного объема) для внесения реагентов в лунки планшета с погрешностью дозирования не более
5 %.

– Автоматические промыватели или восьми– и двенадцатиканальные пипеточные дозаторы для промывания лунок планшета.

– Перчатки резиновые или латексные.

– Вода очищенная (дистиллированная или деионизированная).

Реакцию проводят с надосадочной жидкостью суспензий гомогенатов комаров, тканей органов погибших людей, а также со спинно-мозговой жидкостью (СМЖ) больных людей.

Приготовление суспензии комаров

Поступивших комаров (20 особей) промывают однократно 70% раствором спирта, затем 0,9% раствором хлорида натрия с антибиотиками (1000 ед. пенициллина и 500 мг стрептомицина на 1 мл среды), раскладывают в пластиковые пробирки, типа Эппендорф, по 1 экземпляру, маркируют и погружают в жидкий азот до обследования.

Перед обследованием готовят суспензию, растирая замороженных комаров пестиком, добавляют на каждого комара по 0,2 мл раствора для разведения образцов (РБР).

Напитавшихся комаров растирают в фарфоровых ступках пестиком и добавляют небольшое количество стеклянного песка.

Суспензии комаров центрифугируют 5 мин при 2 тыс. об/мин.

В ИФА обследуют надосадочную жидкость.

Приготовление суспензий из тканей органов погибших людей

Для исследования тканей органов погибших людей необходимо приготовить 1% суспензию на РБР. Суспензию центрифугируют при 3000-6000 об/мин в течение 20-30 мин, надосадочную жидкость переносят в стерильную пробирку, маркируют и исследуют немедленно.

Приготовление рабочего разведения спинно-мозговой жидкости (СМЖ)

СМЖ развести РБР в соотношении 1:10.

Пробы, подготовленные для ИФА, в случае необходимости, можно хранить в замороженном состоянии при температуре не выше минус 20 о С.

Подготовка рабочих растворов и реагентов для ИФА

Все реагенты до начала анализа выдержать 30 мин при температуре от 18 до 25 о С

Приготовление рабочего промывающего раствора (ФСБ-Т)

ФСБ-Т(х25) интенсивно перемешать (в случае выпадения осадка – прогреть при температуре 37 о С в течение 30 мин до полного растворения солей), развести водой очищенной в соотношении 1:25. В зависимости от числа используемых стрипов, отобрать необходимое количество концентрата и довести водой очищенной до объёма, указанного в табл. 1.

РБР(х10) развести в 10 раз водой очищенной (1,0 мл концентрата на 9,0 мл воды).

Раствор хранить при температуре от 2 до 8 о С не более 1 сут.

Приготовление рабочего разведения конъюгата

Готовить не более чем за 10 мин до использования!

При постановке на целом планшете к 12 мл РБР добавить 240 мкл конъюгата; тщательно перемешать.

При использовании меньшего количества стрипов необходимый объем РБР перенести в чистую емкость (желательно одноразовую) и добавить конъюгат в количестве, указанном в табл. 2.

Раствор хранить при температуре от 2 до 8 о С не более 1 ч.

Готовить непосредственно перед использованием в защищенном от прямого солнечного света месте.

При исследовании на целом планшете во флакон с ЦР добавить 600 мл ТМБ.

При постановке на меньшем числе стрипов необходимый объем ЦР перенести в чистую (желательно одноразовую) емкость и добавить ТМБ в количестве, указанном в табл. 4.

Раствор хранению не подлежит.

Иммуносорбент, К + , К – , стоп-реагент готовы к использованию.

Извлечь из пакета планшет или необходимое количество стрипов. Оставшиеся стрипы хранить в плотно закрытом пакете не более 1 мес при температуре от 2 до 8 о С.

Лунки А1 и А2 оставить пустыми для измерения уровня «бланк» (оптический нуль фотометра), в остальные внести по 90 мкл РБР.

В лунки B1, В2 внести по 10 мкл К + , в лунки С1, С2 – по 10 мкл К – , в остальные лунки, кроме А1 и А2, внести по 100 мкл исследуемых образцов. Каждый образец вносить в 2 лунки (1 лунка – в четном ряду (IgG_N), 1 лунка – в нечетном (IgG_ЗН)). Содержимое лунок перемешивать пипетированием при внесении образцов.

Планшет заклеить пленкой или закрыть крышкой и инкубировать 60 мин в термостате при температуре 37 о С.

С помощью промывающего устройства удалить содержимое лунок в контейнер с дезраствором. В каждую лунку внести ФСБ-Т, заполняя ее до краев (следует вносить не менее 370 мкл раствора), процедуру промывки выполняют 3 раза. По окончании промывки удаляют влагу из лунок, постукивая планшетом по фильтровальной бумаге, положенной на полиэтиленовую пленку.

Во все лунки планшета, кроме лунок А1 и А2, внести по 100 мкл рабочего разведения конъюгата. Планшет закрыть крышкой и выдержать при температуре 37 о С в течение 60 мин.

6 раз промыть планшет, как указано выше.

В каждую лунку планшета внести по 100 мкл свежеприготовленного субстратно-индикаторного раствора. Планшет поместить в защищенное от света место при комнатной температуре на 10 мин.

В каждую лунку внести по 100 мкл стоп-реагента и сразу же учесть результаты реакции.

Результаты ИФА регистрировать спектрофотометрически немедленно после остановки реакции, измеряя оптическую плотность (ОП) при длине волны 450 нм. В качестве уровня «бланк» используют ОП содержимого лунки А1.

Результаты ИФА учитываются при следующих условиях:

ОП в лунке А2 – не более 0,2;

ОП К + в лунке с IgG_ЗН – не менее 0,6;

ОП К + в лунке с IgG_N – не более 0,2;

ОП К – в лунках с IgG_ЗН и с IgG_N – не более 0,2.

В противном случае исследование необходимо повторить.

Исследуемые образцы считаются положительными, т.е. содержат антиген вируса ЗН, если ОП в лунке с IgG_ЗН составляет не менее 0,3, а ОП в лунке с IgG_N – не более 0,2.

Исследуемые образцы считаются отрицательными, т.е. не содержат антигена вируса ЗН, если ОП в лунке с IgG_ЗН и в лунке с IgG_N составляет не более 0,2.

В случае необходимости определения титра антигена вируса ЗН готовится ряд двукратных разведений образца в РБР, каждое разведение исследуется, как указано выше. Титром антигена вируса ЗН считается максимальное разведение, в котором получены положительные результаты.

Срок годности набора – 6 мес. Набор с истекшим сроком годности применению не подлежит.

ХРАНЕНИЕ И ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ

Хранение — в упаковке предприятия-изготовителя в соответствии с СП 3.3.2.1248-03 при температуре от 2 до 8 о С. Замораживание не допускается.

Транспортирование — в соответствии с СП 3.3.2.1248-03 при температуре от 2 до
8 о С. Замораживание не допускается. Допускается транспортирование при температуре от 9 до 25 о С в течение 72 ч. На дальние расстояния — только авиатранспортом.

источник

Лихорадка Западного Нила (ЛЗН) – зоонозная природно-очаговая трансмиссивная инфекция, вызываемая арбовирусами семейства Flaviviridae, характеризующаяся острым интоксикационным синдромом с поражением центральной нервной системы.

Трансмиссивными инфекциями называется группа заболеваний, возбудители которых передаются кровососущими членистоногими. В данном случае роль переносчиков вируса играют комары рода Culex, реже – Aedes и Anopheles, не исключается участие в передаче вируса иксодовых и аргасовых клещей. Естественный резервуар для вируса лихорадки Западного Нила – дикие птицы.

Вирус довольно устойчив во внешней среде: погибает при температуре выше 55 ºС с экспозицией не менее получаса, долго сохраняет жизнеспособность в высушенном или замороженном виде.

Изначально лихорадка Западного Нила наиболее широко была представлена в Африке, Южной Америке, Азии. С конца прошлого столетия нозоареал заболевания значительно расширился: выявляются случаи инфицирования в странах не только с жарким, но и с умеренным климатом (в Европе, России), – что обусловлено сезонной миграцией инфицированных птиц.

В регионах с умеренным климатом отмечается характерная сезонность; пик заболеваемости (более 90% всех выявленных случаев) приходится на период с июля по октябрь, что коррелирует с максимальной численностью кровососущих насекомых в эти месяцы.

Группы риска инфицирования вирусом лихорадки Западного Нила составляют люди, работающие или отдыхающие на приусадебных участках, а также охотники, рыбаки – лица, проводящие много времени в излюбленных местах членистоногих (на водоемах, тенистых участках с массивной растительностью, в болотистой или лесистой местности).

Причиной заболевания в подавляющем большинстве случаев становится укус инфицированного комара или клеща.

Вирус попадает с кровью в организм кровососущего (где циркулирует в течение нескольких дней) после укуса зараженной птицы. В дальнейшем возбудитель лихорадки Западного Нила концентрируется в слюнных железах насекомого или клеща, откуда при укусе человека или животного перемещается в его кровоток, вызывая цепь патологических изменений.

Помимо укуса насекомых, вирус может передаваться вертикально (от матери к ребенку), а также при переливании инфицированной крови или трансплантации зараженных органов, однако случается это крайне редко.

Лихорадка Западного Нила может протекать в 2 формах:

• манифестная – развивается типичная клиническая картина с бурной симптоматикой;
• бессимптомная – в таком случае проявления заболевания отсутствуют (по данным Всемирной организации здравоохранения, частота названной формы приближается к 80% от общего числа заболеваемости).

Естественный резервуар для вируса лихорадки Западного Нила – дикие птицы.

Манифестная форма заболевания представлена двумя клиническими вариантами:

• ЛЗН без поражения центральной нервной системы (протекает в гриппоподобной форме либо в гриппоподобной форме с нейротоксикозом);
• ЛЗН с поражением ЦНС (менингеальная и менингоэнцефалитическая формы).

Инкубационный период заболевания длится до 3 недель, чаще – 5-6 дней. В дальнейшем, если имеет место манифестная форма заболевания, возникает характерная для конкретного варианта инфекции симптоматика.

Проявления лихорадки Западного Нила, не сопровождающейся поражением ЦНС:

• острое начало заболевания;
• подъем температуры тела до 39-40 ºС, в исключительных случаях – выше 40 ºС (длительность лихорадочного периода может достигать 12 суток, хотя в среднем ограничивается 2-3 днями);
• потрясающий озноб;
• проливной пот;
• полиморфная пятнисто-папулезная сыпь (отмечается достаточно часто);
• головная боль;
• болезненность при движении глазных яблок;
• повышенная чувствительность к свету, фотофобия;
• мышечные и суставные боли;
• увеличение и болезненность лимфатических узлов головы и шеи при пальпации;
• гиперемия слизистых оболочек зева;
• длительный период астенизации после купирования интоксикационных симптомов (общая слабость, сонливость, снижение работоспособности, чувство разбитости).

В случае протекания инфекции с явлениями нейротоксикоза головная боль приобретает интенсивный характер, возможны эпизоды головокружения, характерны тошнота, рвота на высоте лихорадки, шаткость походки, ригидность затылочных мышц. Каких-либо изменений при анализе спинномозговой жидкости в данном случае не регистрируется.

При вовлечении в инфекционный процесс центральной нервной системы (при менингеальной форме) симптомы следующие:

• острое начало со стремительным повышением температуры тела до критических цифр, ознобом, потливостью;
• интенсивная головная боль, на 3-4-е сутки приобретающая мучительный характер;
• ригидность затылочных мышц;
• светобоязнь;
• тошнота, рвота с выявлением менингеальных симптомов.

По результатам проведения люмбальной пункции определяются изменения в спинномозговой жидкости, характерные для серозных вирусных менингитов.

При менингоэнцефалитической форме заболевания состояние пациентов тяжелое или крайне тяжелое, отмечается грубая общемозговая симптоматика на фоне явлений менингоэнцефалита (нарушений сознания, головной боли, головокружений, рвоты, генерализованных судорожных приступов), в дальнейшем развивается мозговая кома. Летальность при данной форме заболевания составляет 5–10%, в крайне тяжелых случаях – до 40%.

Диагностика лихорадки Западного Нила затруднена, что связано с большим количеством бессимптомных случаев заболевания, отсутствием специфических проявлений при гриппоподобных формах.

Основные диагностические мероприятия:

• сбор эпидемиологического анамнеза (связь с предшествующим пребыванием в зонах повышенного риска, укусами кровососущих насекомых, сезонность заболевания);
• проведение твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА) для выявления специфических IgM, IgG (титр, подтверждающий диагноз, – 1:800 или более);
• проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) с целью обнаружения РНК вируса лихорадки Западного Нила;
• вирусологическое исследование для идентификации возбудителя;
• при наличии менингеальных симптомов – люмбальная пункция с последующим исследованием спинномозговой жидкости.

Группы риска инфицирования вирусом лихорадки Западного Нила составляют люди, работающие или отдыхающие на приусадебных участках, а также охотники, рыбаки.

Лечение ЛЗН медикаментозное. Назначаются:

• индукторы интерферона;
• диуретические средства;
• глюкокортикостероидные гормоны;
• ингаляции увлажненного кислорода.

Проводятся дезинтоксикационная терапия, коррекция электролитных нарушений и осмолярности крови. В случае необходимости применяются противосудорожные, седативные препараты, антиоксиданты, средства, улучшающие мозговой кровоток, антибиотики широкого спектра действия.

Осложнения лихорадки Западного Нила весьма серьезны:

• острое нарушение мозгового кровообращения;
• отек головного мозга;
• кома, летальный исход.

При своевременной диагностике и комплексном лечении прогноз благоприятный. Вероятность благополучного исхода заболевания снижается при инфекции менингоэнцефалитической формы тяжелого или крайне тяжелого течения.

Летальность при менингоэнцефалитической форме заболевания составляет 5–10%, в крайне тяжелых случаях – до 40%.

Профилактические меры состоят в следующем:

1. Проведение мероприятий, направленных на снижение популяции кровососущих насекомых.
2. Снижение популяции диких птиц, образ жизни которых связан с непосредственным обитанием рядом с человеком.
3. Использование репеллентов при длительном пребывании в природных очагах с высоким риском укусов членистоногих.

Видео с YouTube по теме статьи:

Образование: высшее, 2004 г. (ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет»), специальность «Лечебное дело», квалификация «Врач». 2008-2012 гг. – аспирант кафедры клинической фармакологии ГБОУ ВПО «КГМУ», кандидат медицинских наук (2013 г., специальность «фармакология, клиническая фармакология»). 2014-2015 гг. – профессиональная переподготовка, специальность «Менеджмент в образовании», ФГБОУ ВПО «КГУ».

Информация является обобщенной и предоставляется в ознакомительных целях. При первых признаках болезни обратитесь к врачу. Самолечение опасно для здоровья!

источник

Вирусное заболевание – лихорадка Западного Нила впервые было обнаружено в Уганде в 1937 г. На сегодняшний день оно распространено на многих континентах – множество вспышек регистрируется в США, в странах побережья Средиземноморья, а также достаточно часто встречается современная форма вируса в Индонезии, бывших странах СНГ, на юге России. Возбудитель наиболее жизнеспособен в тропическом и субтропическом климате. Заболевание трансмиссивное – передается кровососущими членистоногим, в данном случае – комарами, иксодовыми и аргасовыми клещами. Имеет сезонный характер: инфицирование чаще всего происходит с мая до октября – в период, наиболее благоприятный для развития комаров.

Заболевание относится к острым зоонозам, по-другому еще называется западнонильским энецефалитом или утиной лихорадкой. Отличительными признаками является множественное воспаление лимфоузлов (полиаденит), серозное воспаление мозговых оболочек и кожные высыпания, в редких случаях – менингоэнцефалит.

Механизм заражения после попадания вируса в кровоток происходит по пути гематогенной диссеминации. В результате виремии возбудитель обнаруживается в тканях мозга. Выявлена тропность не только к нейроцитам, кардиомиоцитам, но и к эндотелиальным клеткам сосудов.

В ответ на инфекцию в организме формируется периваскулярный лимфоидный инфильтрат. Нейроциты подвергаются дистрофии и некрозу. В результате повреждения сосудов усугубляется отек и набухание мозга, местные и генерализованные проявления тромбогеморрагического синдрома.

Вирус способен к длительной персистенции в человеческом организме. После заболевания вырабатывается стойкий постинфекционный иммунитет и повторных случаев зарегистрировано не было.

В зависимости от клинических проявлений нильская лихорадка бывает:

• гриппоподобной формы;
• менингеальной формы;
• экзантематозной формы;
• бессимптомной (80% случаев).

Причина лихорадки Западного Нила – распространение РНК-содержащего флавивируса, сферической формы и размером всего 20-30 нм.

Возбудитель способен сохраняться в условиях мороза и сухости, губительной является температура свыше 56 градусов по Цельсию, для инактивации необходим эфир и дезоксихолат. Резервуаром являются птицы и грызуны.

Первый диагноз Нильской лихорадки был поставлен в 1999 г. в Уганде. До начала 70-х у жителей экваториальной Африки выработался иммунитет и вирус перекинулся на тропические регионы. В результате туризма заболевание распространилось и в нетропические регионы, в США его завезли в 1999 году. Сегодня природные очаги обнаружены в странах Средиземноморья, в Армении, в Азербайджане, в Молдове, на юге Украины, на южной европейской части России и других странах этой полосы.

В России первая существенная угроза была в 1999 г, когда нильская лихорадка Западного Нила в Волгограде поразила более 700 человек, преимущественно пострадали пожилые особы старше 60 лет, 9 случаев летального исхода.

К сентябрю 2018 года было зарегистрировано более 400 случаев, это в 2 раза больше, чем в предыдущие года, причем заболевание протекало без проявлений лихорадки.

Природные очаги чаще всего формируются в пригородных зонах, они были выявлены в Астраханской, Ростовской, Воронежской, Липецкой, Саратовской и Волгоградской области, Краснодарском и Ставропольском крае, а также в Татарстане.

Однако, в связи с изменениями климата отмечается рост очагов заболевания. Так, в Саратове из-за уменьшения холодного периода, увеличения количества осадков, повышения средних температур создалась благоприятные среда для развития очагов и циркуляции вирусов западнонильской лихорадки. В Саратовской области Роспотребнадзор предупреждает об опасности и сообщает о мерах профилактики – необходимости покоса сорной растительности, очистки и осушения подвальных помещений, ликвидации свалок, установки антимоскитных сеток.

От момента заражения до возникновения первых симптомов может пройти 3-21 сутки — это длительность инкубационного периода. Заболевание у людей начинается остро с гипертермии (держится температура тела 38-40°) и озноба. Лихорадка то обостряется, то затухает, может длиться всего 1-2 дня, но чаще 5-7. Её предвестниками часто становятся такие кратковременные явления как:

• общая слабость;
• отсутствие аппетита;
• повышенная потливость;
• миалгия (особенно боли в икроножных мышцах);
• головные боли.

В половине случаев возникает серозный менингит. У больных в результате развивается разрозненность слабовыраженных оболочечных симптомов в виде ригидности мышц затылка, симптомов Кернига и Брудзинского, воспалительных изменений в ликворе – развития плеоцитоза, небольшого повышения количества белка. Развивается очаговая рассеянная микросимптоматика со стороны нервной системы, в том числе горизонтальный нистагм, симптом пальмоментальный, рассеянное снижение тонуса мышц, ухудшение сухожильных и отсутствие брюшных рефлексов.

Редкие энцефалитические проявления заменяются признаками смешанной сомато-церебральной астении (наблюдается потливость, бессонница, общая слабость, подавленность психики, ослабление памяти), которые вызывает Лихорадка Западного Нила. Симптомы интоксикации выражаются в виде:

• сильной мучительной головной боли, особенно в области лба и глаз, а также боли шеи и поясницы;
• боли, дискомфорта и замирания сердца;
• боли и припухлости суставов;
• гиперемии кожных покровов и в 5% случаев – макулопапулезной сыпи;
• многократной рвоты, отсутствии аппетита, диареи и других диспептических нарушений;
• гиперемии конъюнктивы и равномерной инъекции сосудов глазных яблок;
• гиперемии и зернистости слизистых оболочек ротовой полости;
• артериальной гипотензии;
• гепатолиенального синдрома;
• полилимфаденита – увеличены периферические лимфоузлы, их чувствительность и незначительная болезненность;
• в редких случаях закладывает нос и начинается сухой кашель.

Клиника сопровождается незначительными изменениями лабораторных показателей — увеличение СОЭ, незначительный лейкоцитоз.

Симптомы лихорадки Западного Нила у детей часто напоминают клещевой энцефалит. Заболевание переносится детьми значительно легче, чем пожилыми особами или лицами с ослабленным иммунитетом.

Причинами для подозрения на западнонильскую лихорадку является характерная клиническая картина и данные эпидемиологического анамнеза.

Серологические исследования не дают полностью достоверных результатов, так как у флавивирусов близкое антигенное родство и обнаружение в сыворотке крови антител бывает обусловлено циркуляцией другого вида вируса.

Диагностика проводится путем выделения из культур клеток МК-2 и внутримозгового заражение мышей. Для идентификации вируса Западного Нила используют флюоресцирующие антитела и видоспецифические люминесцирующие иммуноглобулины.

В результате лабораторных исследований спинномозговой жидкости обнаруживается:

• плеоцитоз лимфоцитарный 100-2000×106/л;
• незначительное увеличение количества белков.

Лечение лихорадки Западного Нила предполагает госпитализацию в инфекционные стационары, где должен быть обеспечен контроль за функциональным состоянием сердечно-сосудистой, дыхательной и выделительной системы. Для этого постоянно мониторят уровень АД и ЧСС, ритм, глубину и частоту дыхания, суточный и почасовой диурез, температуру тела и другие показатели.

В ходе лечения проводят патогенетическую терапию с пошаговым купированием синдромов:

• дезинтоксикационное лечение;
• устранение отека мозга;
• оксигенотерапия;
• нормализация температуры тела;
• применение антиконвульсантов (противосудорожных препаратов).

источник

Автореферат и диссертация по медицине (14.02.02) на тему: Лихорадка Западного Нила на Юге России: современные эпидемиологические проявления и совершенствование методов выявления возбудителя

Автореферат диссертации по медицине на тему Лихорадка Западного Нила на Юге России: современные эпидемиологические проявления и совершенствование методов выявления возбудителя

АФАНАСЬЕВА Екатерина Евгеньевна

ЛИХОРАДКА ЗАПАДНОГО НИЛА НА ЮГЕ РОССИИ: СОВРЕМЕННЫЕ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

доктор биологических наук Василенко Надежда Филипповна

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ

Ющенко Галина Васильевна; кандидат медицинских наук Гренкова Татьяна Аркадьевна

Ведущая организация: ФГУЗ «Волгоградский научно-

исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора

Защита состоится «18» июня 2010 года в_часов на заседании диссертационного совета Д 001.007.02 в ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Автореферат разослан «_»_2010 года

доктор медицинских наук, профессор

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В современном мире неуклонно растет понимание высокой социально-экономической значимости широкого распространения различных инфекционных болезней. Особенностью современной эпидемиологической обстановки является не только активизация многих инфекционных заболеваний, которые традиционно находятся под контролем санитарно-эпидемиологических служб, но и возникновение очагов новых и возвращающихся инфекций бактериальной и вирусной природы (Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., Кривуля С.Д и соавт., 2006; Локтев В.Б., 2007; Кутырев В.В., 2008: Львов Д.К., Савченко С.Т., Алексеев В.В. и соавт., 2008; Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Жаркенов А.Ф. и соавт., 2009; Онищенко Г.Г., Смоленский В.Ю., 2009).

Проблема лихорадки Западного Нила (ЛЗН) в настоящее время остается актуальной в связи с постоянным расширением ареала этой инфекции. Крупные вспышки ЛЗН (Онищенко Г.Г., 2000, 2001; Бутенко A.M., 2007; Львов Д.К., Савченко С.Т., Алексеев В.В. и соавт., 2008; Платонов А.Е., Карань Л.С., Гаранина С.Б. и соавт., 2009), тяжелое течение болезни с преобладанием серозных менингитов, документированная передача вируса лихорадки Западного Нила (ВЛЗН) при переливании крови являются новыми фактами в изучении этой актуальной арбовирусной инфекции. Вспышки и эпидемии ЛЗН и даже единичные случаи рассматриваются в Международных медико-санитарных правилах ВОЗ (2005) как чрезвычайная ситуация здравоохранения международного масштаба. Сезонные миграции птиц способствуют трансконтинентальному переносу ВЛЗН (Львов Д.К.,2002; Бутенко A.M., Вышемирский О.И. и соавт., 2002; Забашта М.В., Москвитина Э.А., Забашта A.B., 2006 и др.).

Не возникает сомнений в том, что территория Юга России является эндемичной по широкому спектру природно-очаговых инфекций бактериальной и вирусной природы, требующих особого внимания в силу того, что этиологические агенты большинства из них относятся к возбудителям I-II групп патоген-ности, а обострение обстановки по некоторым из них может привести к чрезвычайной эпидемической ситуации международного значения (Малецкая О.В., Грижебовский Г.М., Бейер А.П. и соавт., 2009).

Ставропольский край (CK) в силу своего географического положения и природных условий (жаркий засушливый климат, обилие водоемов, комаров и клещей, большое количество перелетных птиц и др.) представляет большой интерес в отношении изучения циркуляции вируса ЛЗН и его роли в патологии человека. Такие исследования на территории Ставропольского края ранее не проводились.

Сложившаяся ситуация диктует необходимость широкомасштабного реального мониторинга вируса ЛЗН в антропогенных и природных биоценозах с привлечением современных методов экспресс-диагностики. Мониторинг инфекционных болезней является одной из наиболее важных составляющих комплекса мер по предотвращению и борьбе с эпидемиями (Онищенко Г.Г., 2006). Один из блоков мониторинга — сбор, доставка и лабораторное исследование полевого материала — необходим как для прямого обнаружения компонентов воз-

будителя (антигенов или фрагментов генома), так и для последующей изоляции и идентификации инфекционного агента. Однако часто низкие концентрации возбудителя инфекции и его компонентов в полевом материале, а также огромное количество примесей не позволяют обнаруживать антигены вирусов и бактерий или их генетический материал непосредственно в исследуемых пробах. Разработка высокоэффективных способов концентрирования патогенов с последующей детекцией их антигенов или нуклеиновых кислот, либо их селективной сепарацией для бактериологических или вирусологических исследований — одно из приоритетных направлений совершенствования их лабораторной диагностики (Ефременко В.И., Василенко Н.Ф., Жарникова И.В. и соавт., 2009).

Актуальность проблем, изложенных выше, послужила основанием для проведения данной работы.

Цель исследования: совершенствование эпидемиологического мониторинга за лихорадкой Западного Нила и методов выявления её возбудителя.

Для достижения цели были определены основные задачи:

1. Изучить на примере Ставропольского края условия, способствующие формированию природных очагов лихорадки Западного Нила на Юге Российской Федерации.

2. Провести анализ результатов эпизоотологического обследования и заболеваемости ЛЗН на территории Юга РФ.

3. Провести обследование территории Ставропольского края на наличие переносчиков и резервуаров вируса ЛЗН.

4. Изучить иммунную прослойку выборочных групп здорового населения, проживающих в Ставропольском крае, и провести исследования сывороток крови больных с лихорадкой неизвестной этиологии на наличие специфических антител к вирусу ЛЗН.

5. Усовершенствовать методы изучения распространения возбудителя лихорадки Западного Нила за счет использования иммуномагнитной сепарации при эпидемиологическом мониторинге вируса ЛЗН в объектах окружающей среды.

• Впервые на территории Ставропольского края при исследовании объектов внешней среды выявлено наличие вируса ЛЗН и установлены его основные переносчики — комары рода Aedes.

• Впервые установлена инфицированность ВЛЗН клещей Н. marginatum, что указывает на возможность их вовлечения в паразитарные системы природных очагов ЛЗН на территории Ставропольского края.

• Изучены показатели гуморального иммунитета больных с лихорадками неясной этиологии и здоровых людей (доноров крови) и установлено наличие антител класса IgG к вирусу ЛЗН в обеих группах, что свидетельствует об инфицировании этим вирусом населения Ставропольского края и является дополнительным критерием в оценке эпидемической значимости природных очагов этой инфекции.

• Впервые использованная иммуномагнитная сепарация при исследовании полевого материала методами иммуноферментного анализа

(ИФА) и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) повысила их эффективность и увеличила число положительных находок в 2 — 3 раза, что позволяет более достоверно оценивать эпидемиологический потенциал территорий.

• Получены данные о достаточно высоком эпидемиологическом потенциале природных очагов ЛЗН на территории Юга Российской Федерации, выражающиеся в ежегодной регистрации случаев заболеваний людей и зараженности комаров и клещей ВЛЗН. Практическая значимость.

Установление факта циркуляции возбудителя J13H на территории Ставропольского края является предпосылкой для разработки комплекса мероприятий по эпидемиологическому и эпизоотологическому мониторингу, диагностике и профилактике ЛЗН. Применение иммуномагнитной сепарации в сочетании с методами лабораторной экспресс-диагностики (ИФА и ОТ-ПЦР) позволяет увеличить их чувствительность и специфичность, повышая возможность выявления возбудителя в 3 — 3,5 раза в ИФА ив 1,8-2 раза в ОТ-ПЦР, одновременно сокращает время проведения исследования с 20-21 часа до 1-3 часов за счет ускорения манипуляций и исключения ряда этапов при проведении анализов.

По результатам выполненных исследований получено 2 патента РФ: «Способ проведения иммуноферментного анализа (ИФА)», № 2290641, Бюл. № 36 от 27.12. 2006 г.; «Способ получения иммуносорбента», № 2363732, Бюл. № 22 от 10.08. 2009 г.

Материалы научных разработок легли в основу методических рекомендаций: «Магноиммуносорбенты в микробиологических и клинических исследованиях», утвержденных директором СтавНИПЧИ ( протокол Ученого совета СтавНИПЧИ № 9 от 27.10.2005 г.), «Применение органокремнеземного аффинного сорбента для селективного концентрирования возбудителя ЛЗН и последующего проведения экспресс-анализов (ИФА и ПЦР)», утвержденных директором СтавНИПЧИ (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ № 2 от 28 февраля 2007 г.); «Исследование полевого материала на наличие арбовирусов методами иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции», утвержденных директором СтавНИПЧИ (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ № 8 от 09.07.2009 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Территория Юга Российской Федерации характеризуется наличием природных очагов ЛЗН с высоким эпидемическим потенциалом, при этом основным резервуаром и переносчиком вируса являются комары рода Culex, Anopheles, Aedes, Coquillettidia и иксодовые клещи Н. marginatum, Rh. rossicus.

2. Установленная зараженность вирусом ЛЗН комаров рода Aedes, ик-содовых клещей Hyalomma marginatum, синантропных врановых, обнаружение специфических антител к ВЛЗН в сыворотках крови людей с лихорадками неизвестной этиологии и у доноров крови свидетельствуют о циркуляции данного вируса на территории Ставропольского края.

3. Применение иммуномагнитной сепарации позволяет максимально сконцентрировать ВЛЗН в исследуемом материале, что увеличивает чувствительность методов на несколько порядков по сравнению с традиционными

ИФА и ПЦР. Разработанные сочетанные методы МИС + ИФА и МИС + ПЦР могут использоваться при проведении мониторинга за JI3H.

Апробация работы. Результаты диссертации доложены, обсуждены, опубликованы в материалах научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2006); VII Межгосударственной научно-практической конференции государств — участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств — участников содружества Независимых Государств (Оболенск, 2006); второго съезда военных врачей медико-профилактического профиля Вооруженных сил Российской Федерации «Современные проблемы военной профилактической медицины, пути их решения и перспективы развития» (Санкт-Петербург, 2006); расширенного пленума проблемной комиссии «Арбовирусы» РАМН и научно-практической конференции «Арбовирусы и арбовирусные инфекции» (Астрахань, 2006); Всероссийской научной конференции, посвященной 210-й годовщине основания Военно-медицинской академии (Санкт-Петербург,2008); научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора (Оболенск, 2009).

Апробация диссертации состоялась 6 августа 2009 г. на межлабораторной конференции ФГУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена самостоятельно.

Отдельные этапы работы были выполнены совместно с д.б.н. Жарнико-вой И.В., к.б.н. Орловой Т.Н., д.х.н. Брыкаловым А.В.

Публикация научных исследований. По теме диссертации опубликовано 25 научных работ, в том числе 4 работы — в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 161 листе и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы и приложение. Работа иллюстрирована 17 рисунками и 19 таблицами. Список использованной литературы включает 279 источников, из них 209 отечественных и 70 — зарубежных авторов.

При выполнении работы использован клинический и полевой материал, собранный нами на 23 из 26 административных территориях Ставропольского края и в краевом центре — г. Ставрополе: 268 сывороток крови лихорадящих больных и 1302 сыворотки крови доноров; 8626 объектов окружающей среды, в том числе 3573 имаго орнитофильных комаров (230 пулов) родов Culex, Aedes, Anopheles, Coquillettidia\ 4853 особи иксодовых клещей (454 пула) — Нуа-

lomma marginatum, Dermacenter marginatus, Ixodes ricinus, Rhipicephalus rossicus, Boophilus annulatus и 61 особь аргасовых клещей Argas persicus (2 пула); 139 проб головного мозга птиц и грызунов.

По родам и видам собранных клещей и комаров систематизировали согласно определителям Б.И. Померанцева (1950), A.B. Гуцевич, A.C. Мончадского, A.A. Штикельберга (1970), H.H. Плавилыцикова (1994). Комплектацию комаров в пробы (пулы) проводили с учетом вида и места сбора в количестве 25 — 50 экземпляров. Иксодовых клещей объединяли по виду, месту сбора, виду хозяина (прокормителя), упитанности и фазе развития (имаго, нимфы, личинки). Голодных имаго объединяли по 10 — 30 особей, нимф — по 20 — 50 особей, личинок — от 50 до 200 в пробе. Каждая напитавшаяся особь исследовалась индивидуально.

Проведен анализ материалов по заболеваемости лихорадкой Западного Нила и исследованию проб из объектов внешней среды на наличие возбудителя J13H, предоставленных Территориальными управлениями Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека субъектов Юга России за 2001-2006 гг.: Астраханской, Волгоградской, Ростовской областей, Краснодарского края, Кабардино-Балкарской, Карачаево-Черкесской, Чеченской Республик, Республик Северная Осетия-Алания, Калмыкия, Адыгея.

Антиген вируса Западного Нила, мышиная иммунная асцитическая жидкость (ИАЖ) к вирусу J13H с высоким титром специфических антител класса G получены в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

При проведении ИФА для индикации антигена вируса J13H использовали тест-системы, изготовленные в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН; ЗАО «ЭКОлаб» (г. Электрогорск, Московской обл.); ЗАО «Биосервис» (г. Боровск, Калужской обл.); тест-система иммуноферментная для выявления антител класса IgM к вирусу лихорадки Западного Нила производства ЗАО «ЭКОлаб» (г. Электрогорск, Московской обл.); тест-система иммуноферментная «ВектоНил — IgG» производства ЗАО «ВекторБест» (п. Кольцово, Новосибирская обл.); тест-система иммуноферментная для выявления индекса авидности иммуноглобулинов класса G к вирусу лихорадки Западного Нила «ВектоНил -IgG — авидность» производства ЗАО «ВекторБест» (п. Кольцово, Новосибирской обл.); набор реагентов для иммуноферментного выявления антигена вируса клещевого энцефалита «ВектоВКЭ-антиген» производства ЗАО «ВекторБест» (п. Кольцово, Новосибирской обл.); набор реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса G к вирусу клещевого энцефалита «ВектоВ-КЭ-IgG» производства ЗАО «ВекторБест» (п. Кольцово, Новосибирской обл.). Выявление РНК вируса J13H в пробах проводили методом ОТ-ПЦР, используя тест-систему «ГенНил», изготовленную в ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (г. Саратов). Анализы проводили согласно инструкциям по применению.

Сорбент для иммуномагнитной сепарации получали на основе природного алюмосиликата, химическую модификацию поверхности которого осуществляли в присутствии карбоксиметилированного лигнина и карбодиимида. В качестве магнитного компонента при синтезе применяли магнетит (Рез04). Микроструктуру сорбентов исследовали на сканирующем электронном устройстве IMZ-T3000 (Япония) как описано в работе Я. Фрайфельдер (1980). Удельную

поверхность магносорбента (MC) определяли по методу A.A. Клячко-Гурвича (1961), основанному на низкотемпературной адсорбции азота. Суммарный объем и диаметр пор определяли методом ртутной порометрии на приборе AYTO PORE — 9200 (Кельцев Н.В., 1984).

Экспериментальные данные обработаны методами вариационной статистики, изложенными в работах И.П. Ашмарина и A.A. Воробьева (1962), Т.Н. Зайцева (1991). Для обработки картографических изображений применяли программу Map Info Professional 8.5. 2.2.Результаты исследований и их обсуждение.

Г. Условия, способствующие формированию природного очага JI3H, и основные эпидемиологические особенности лихорадки Западного Нила на Юге Российской Федерации.

На территории Юга РФ выделяют следующие ландшафтные зоны: пустынные северного подтипа, полупустынные южного подтипа (в Республике Калмыкия и Астраханской области); луговые незатопленного подтипа, пойменные и пойменно-дельтовые, лесные умеренного пояса пойменного подтипа — в пределах Астраханской области; степные, полупустынные — в пределах Волгоградской области, Ставропольского края; лесостепные — в Ставропольском крае; предгорная — в Ставропольском крае; а также зоны полусухих и влажных субтропиков в пределах Краснодарского края (Новороссийск, Сочи). Разнообразие ландшафта, богатый растительный мир, многочисленность популяций членистоногих, благоприятные климатические условия на территории Юга РФ могут обеспечивать циркуляцию вируса JI3H в пустынном, степном и лесостепном зональных поясах. Через территории Юга России пролегают восточноевропейские пути пролета птиц из стран Центральной и Восточной Африки, Центральной, Юго-Западной и Южной Азии, эндемичных по JI3H. Особенности гидрологического режима на этой территории приводят к образованию узлов концентрации гнездящихся и мигрирующих птиц, в том числе водного и околоводного комплекса. В этих же районах создаются благоприятные условия для массового выплода комаров — основных переносчиков вируса JI3H, и клещей, выполняющих функции резервных хозяев. Среди комаров по видовому составу доминирует род Aedes. A. vexans и A. dorsalis — многочисленные виды в лесах и речных долинах степной зоны. Практически повсеместно обилен тропический род Culex, в частности, С. pipiens.

Ареал распространения клещей рода Hyalomma на территории Юга России в основном ограничен южными районами Волгоградской области, севером Астраханской области, Республикой Калмыкией, Ставропольским краем. Однако, в связи с тем, что основными прокормителями личиночных и нимфальных стадий этих иксодовых клещей являются птицы, а период пребывания на хозяине премагинальных фаз иксоид весьма продолжителен, все это способствует транспортировке личинок и нимф клещей рода Hyalomma птицами во время их весенних миграций на значительные расстояния. Масштабы заноса и адаптации паразитов к местным условиям свидетельствуют о возможности формирования за пределами ареала псевдопопуляций клещей рода Hyalomma.

Таким образом, основными факторами, способствующими формированию на территории Юга России природных очагов ЛЗН и ее эпидемическому проявлению, являются: климатические условия — свыше 100 дней в году со среднесуточной температурой более 20 °С, до 30 дней — более 30 °С, сумма эффективных температур (температура выше 10 °С) составляет 3200-3500°; весьма разнообразный спектр кровососущих членистоногих (комаров, клещей) и птиц — основных переносчиков и носителей вируса ЛЗН; наличие большого числа миграционных русел перелетных птиц, способствующих заносу на территорию Юга России вируса ЛЗН из стран Азии и Африки.

Слежение за эпизоотическим процессом является одним из основных компонентов эпиднадзора за ЛЗН. Используя результаты исследований методом ИФА кровососущих членистоногих, мелких млекопитающих и птиц на наличие антигена вируса ЛЗН, осуществленных Территориальными управлениями Роспотребнадзора субъектов Юга России, нами проведен комплексный анализ этих данных с целью оценки эпидемиологической напряженности природных очагов ЛЗН на Юге РФ, а также д тя уточнения видового состава основных переносчиков и носителей ВЛЗН, их распространения и территориальной приуроченности.

В период с 2001 по 2006 гг. в регионах Юга РФ методом иммунофермент-ного анализа было исследовано 16111 проб, в том числе 3230 проб, полученных от птиц (20,0 %), 2341 проба органов грызунов (14,5 %), 2675 проб комаров (16,6 %) и 7865 проб клещей (48,8 %). При этом общее количество положительных проб равнялось 295 (1,8 %). В целом на Юге РФ у грызунов антиген вируса ЛЗН выявлен в 1,0 % проб, среди птиц положительные пробы составили 1,9 %, у клещей ВЛЗН обнаружен в 0,9 % случаев; наибольший процент заражения вирусом ЛЗН отмечен у комаров (2,2 %). Анализ лабораторных данных показал, что основными переносчиками ВЛЗН являются комары родов Aedes, Anopheles, Culex, Coquillettidia и иксодовые клещи Н. marginatum и Rh. rossicus.

Как показал анализ, в Краснодарском крае, Кабардино-Балкарской, Карачаево-Черкесской, Чеченской республиках, Республиках Северная Осетия-Алания и Адыгея при исследовании объектов внешней среды антиген вируса ЛЗН не выявлен.

О степени активности природных очагов ЛЗН, распространения возбудителя на территории Юга РФ можно сделать достоверное заключение по результатам изучения уровня иммунной прослойки к вирусу ЛЗН у населения, проживающего на этой территории. Сыворотки крови доноров, проживающих в Астраханской области, исследовали в ИФА и установили высокий уровень се-ропозитивных (47,0 %) среди населения. Уровень иммунной прослойки к вирусу ЛЗН у жителей Краснодарского края составил 2,8 %. За период с 2001 г. по 2006 г. ЛЗН зарегистрирована в трех из 13 субъектов Южного федерального округа (ЮФО): в Астраханской, Ростовской и Волгоградской областях. За эти шесть лет заболели лихорадкой Западного Нила 293 человека. Наибольшая эпидемиологическая активность отмечалась в Астраханской области, где за указанные годы выявлены 205 больных, что составило 69,9 % от числа всех больных, зарегистрированных в ЮФО. В Ростовской области число заболевших ЛЗН составило 43 (14,7 %), в Волгоградской области — 45 (15,4 %).

В 2006 г. эпидемиологическая обстановка по ЛЗН изменилась: на Юге России зарегистрированы 39 больных в трех субъектах, что на 42,4 % меньше по сравнению с 2005 г. (92 больных). При этом существенно снизилась заболеваемость в Астраханской области (в 5,2 раза), незначительно — в Ростовской области (в 1,2 раза). В Астраханской области выявлены 14 больных в трех районах: Икрянинском — 1, Камызякском — 1, Приволжском — 1 и в г. Астрахани -11. Один случай заболевания ЛЗН закончился смертельным исходом (7,1 %). В Ростовской области зарегистрированы 13 больных в двух районах (Азовском -1, Сальском — 1) и в трех городах (Ростове-на-Дону — 7, Каменск-Шахтинском -1, Сальске — 3). В Волгоградской области заболеваемость возросла в 4 раза, всего отмечены 12 больных в г. Волгограде, в 2007 г. заболеваемость в этом регионе повысилась в 5,3 раза, а в 2008 г. снизилась в 31,5 раза. У всех больных диагноз в 100 % случаев подтвержден лабораторно (рисунок 1).

Рис. 1. Заболеваемость лихорадкой Западного Нила на Юге РФ в 2001-2007 гг.

В Краснодарском крае, Кабардино-Балкарской, Карачаево-Черкесской и Чеченской республиках, Республиках Северная Осетия-Алания, Адыгея, Калмыкия за период 2001-2006 г.г. случаи заболевания лихорадкой Западного Нила в официальных сводках не зарегистрированы.

Приведенные выше данные свидетельствуют о том, что эпидемиологическая обстановка по J13H на территории Юга РФ продолжает оставаться нестабильной. Как показывают результаты полевых наблюдений, прогноз эпидемиологической обстановки по ЛЗН следует признать неблагоприятным.

В Ставропольском крае подобных исследований никогда не проводили. Исходя из реальной эпидемиологической ситуации, сложившейся на сопредельных к С К территориях, совершенно очевидна своевременность и необходимость проведения эпидемиологического мониторинга за ЛЗН на территории Ставропольского края с привлечением современных методов исследования. II. Совершенствование мониторинга за лихорадкой Западного Нила на примере Ставропольского края.

На наличие антигена ВЛЗН нами исследованы 3573 экземпляра кровососущих комаров, представленных четырьмя родами: Culex- 1948 экз. (43 пула), Aedes — 1253 (138), Anopheles — 200 (36), Coquillettida — 172 (13). Сбор комаров осуществляли в июне — июле 2005 — 2008 гг. в Александровском, Благодар-ненском, Георгиевском, Грачевском, Изобильненском, Кировском, Красногвардейском, Курском, Нефтекумском, Петровском, Советском, Степновском, Шпаковском районах Ставропольского края и окресностях г. Ставрополя. Антиген ВЛЗН в ИФА обнаружен в девяти суспензиях комаров рода Aedes: А. cantans — семь проб, A. vexans — одна проба; A. diantaeus — одна проба; положительные пробы составили 6,5 % от всего количества проб рода Aedes. При анализе результатов исследования кровососущих комаров обращает на себя внимание высокая зараженность ВЛЗН орнитофильного вида A. cantans, обнаруженного, главным образом, во влажной лесопарковой зоне. Три пробы приготовлены из комаров, собранных в г. Ставрополе (парк Победы, лиственный лес), две — из комаров, отловленных на опушке леса х.Молочного (пригородная зона г. Ставрополя), одна проба — в 2-х км от леса в с. Красном Грачевского района, одна проба — в Изобильненском районе. Оба района граничат с краевым центром. Инфицированная проба комаров A. diantaeus также обнаружена в г. Ставрополе. Зараженные ВЛЗН комары A.vexans доставлены из Нефтекумского района, расположенного в полупустынной ландшафтной зоне.

Исследование 4853 особей иксодовых и 61 особи аргасовых клещей на зараженность ВЛЗН, собранных нами в различных районах Ставропольского края, позволило обнаружить в ИФА восемь положительных проб Hyalomma marginatum (2,7 %) из 299 исследованных и одну положительную пробу Boophi-lus annulatus (3,8 %) из 26 исследованных. Антиген ВЛЗН выявлен в двух пробах мозга грачей, с которых были сняты инфицированные клещи. При исследовании этих же проб комаров и клещей молекулярно-генетическим методом (ОТ-ПЦР) РНК вируса ЛЗН обнаружена в 14 пробах суспензий комаров рода Aedes , что составило 6,0 % от общего количества исследованных проб и 10,1 % от количества проб Aedes . В пробах клещей методом ОТ-ПЦР положительные результаты получены в 13 пулах, что составило 3,1 % от исследованного количества клещей Н. marginatum (414 проб) и 2,9 % от общего количества (454 пула) иксодовых клещей (таблица 1).

Положительные результаты по JT3H (2005-2008 гг.) при исследовании членистоногих и птиц в ИФЛ и ОТ-ПЦР

Район Точка (населенный пункт) Дат сбора Вид насекомого, птипы Кол-во исследованных особей (абс.) Кол-во nviOB (абс.) Метод выяления

г. Ставрополь Парк Победы, лиственный лее Июль. 2005 г. Комар Aedes camans 36 11 2 18,2 3 27,8

Шпаковский х. Молочный, опушка леса Июль. 2005 т. Комар Aedes eantans 14 2 1 50.0 2 100,0

1 рачеиский с. Красное, 2 км от леса Июль, 2005 г. Комар Aedes eantanл 10 1 1 100,0 1 100.0

Нсфзскумский с. Каясула Мюль. 2006 г. Комар Aedes vexans 118 1 50.0 1 50.0

г. Ставрополь парк 1(обеды. лиственный лес Июль, 2006 г. Комар Aedes diantens 54 3 1 33,3 1 33.3

г. Ставрополь лес, вблизи пересохших дренажных канав Июль. 2006 г. Комар Aedes eantans 58 3 1 33,3 3 100,0

Шпаковский х. Молочный, опушка леса Июль. 2006 г. Комар Aedes eantans 15 2 1 50,0 2 100,0

Июбильненский х. Смыков, лесополоса Мюль. 2006 г. Комар Aedes eantans 29 3 1 33,3 1 33,3

Курский с. Привольное, кошара Июль. 2005 г. Клещ Boophflus imnulatus 353 26 1 3.8 1 3.8

Сонетекий г. Зеленокумск, фермерское хозяйство Июнь, 2008 г. Клеш Hyaiomma marginatum 219 27 1 3,7 -> 7,4

Советский г. Зелснокумск Июнь, 2008 г. Клеш Hyaiomma marginatum 225 32 2 6.25 3 9,4

Стспновский с. Иргаклы. кошара Июнь. 2008 г. Клеш Ilyalamnm marginatum 561 62 2 3.2 3 4.8

1 1овоеелипкий с. Чсрнолссскос. кошара Июль. 2008 г. Клещ Hyaiomma Marginatum 263 40 2 5.0 3 7.5

Пефзекумский п. Ьейсей Мюль. 2008 1. Клеш Hyaiomma Marginatum 251 45 1 2.2 1 2,2

11ефтекумский п. Ьейсей Июль. 2008 г. Грач (головной мои) 23 1 1 100,0 н.и н.и.

Ьлагодарнепский с. Каменная Валка Июль. 2008 т. Грач(головной мозг) 10 1 1 100,0 H.H. н.и.

Итот 2039 261 20 7.7 27 10.4

С целью обнаружения специфических антител класса О к ВЛЗН исследованы 268 сывороток крови больных людей с лихорадками неустановленной этиологии, доставленных из районов Ставропольского края. Выявлены девять положительных проб, из них четыре — с титрами 1:6400 — 1:12800. При исследовании положительных проб на авидность оказалось, что высокотитражные сыворотки содержали низкоавидные антитела, свидетельствующие о недавно перенесенной болезни. Для оценки уровня естественной иммунизации населения исследовались сыворотки крови доноров, при этом из 1302 проб положительной оказалась 21 (1,6 %). Полученные нами результаты свидетельствуют о циркуляции ВЛЗН (рисунок 2), и это требует расширенных исследований с применением новых современных экспрессных, информативных лабораторных методов для проведения эпидемиологического надзора за этой инфекцией.

Эффективность ряда методов индикации возбудителей инфекционных заболеваний и их антигенов может быть значительно увеличена после предварительного концентрирования вирусов и их антигенов с отделением от контами-нирующей микрофлоры и ингибирующих примесей. Эта цель может быть достигнута путем применения методов иммуносорбции, особое место среди которых занимают методы с использованием сорбентов с магнитными свойствами. Магносорбенты служат твердой фазой при селективном концентрировании на их поверхности патогенов.

Нами впервые для синтеза твердофазной матрицы сорбента использован природный алюмосиликат, представляющий собой продукт, содержащий в своем составе, по данным проведенного нами химического анализа, двуокись кремния (массовая доля) — 78%. Химическое модифицирование сорбента с целью образования функционально активных групп, способных к взаимодействию с лигандами белковой природы, осуществляли в присутствии карбоксиме-тилированного лигнина и карбодиимида. В качестве магнитного компонента при синтезе применяли магнетит. На основе проведенных исследований определены оптимальные параметры получения алюмосиликатного магносорбента: соотношение компонентов синтеза 1,5:1:1, соответственно 8Ю2, Ре304, карбок-симетилированный лигнин; время гелеобразования — 2 часа, значение рН геле-образования — 7,0. Для придания магносорбенту биоспецифических свойств и получения магноиммуносорбента (МИС) на поверхность МС иммобилизовали специфические , выделенные фракционированием ПЭГ-6000 из мышиной ИАЖ против ВЛЗН.

ЛЗН — магноиммуносорбент имел следующие характеристики: у образцов МИС наблюдалась ярко выраженная губчатая, пористая микроструктура с участками аморфной массы, удельная поверхность сорбента — 63,0 ±0,84 м2/г, объем пор — 1,23 ±0,009 см3/г, радиус пор — 29,7 ± 0,29 нм.

НО ВОАП ЕКСАН Д РО ВС КИ ЯЛ

Кабардини балкарская Республика

^—Административные I. I территории Юга РФ

Границы районов РайонысА1к ВЛЗН у доноров Районы с положительными результатами исслед. на ЛЗН Доноры с А1 к ВЛЗН

Рис.2. Результаты исследования полевого материала и сывороток крови доноров в Ставропольском крае на ЛЗН

С целью упрощения и удешевления постановки иммуноферментного анализа, повышения его специфичности и чувствительности в качестве твердой фазы вместо полистироловых микроплат, традиционно применяемых при постановке ИФА, мы применили разработанные нами МИС при постановке «сэндвич» — варианта этого метода для обнаружения вируса JI3H. При этом были определены оптимальные параметры постановки ИФА с использованием МИС, чувствительность и специфичность сочетанного метода, проведено сравнение модифицированного метода МИС+ИФА с методом постановки реакции в полистироловых планшетах. Лабораторные испытания полученных нами трех серий алюмосиликатных лигнинсодержащих МИС к вирусу ЛЗН проводили с инакти-вированным антигеном, полученным в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН. Для проверки специфичности использовали антиген вируса клещевого энцефалита (инактивированный контрольный образец из набора реагентов для иммуноферментного выявления антигена вируса клещевого энцефалита «ВектоВКЭ-антиген»), Антиген вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) выбран нами в связи с тем, что он относится, так же как и вирус ЛЗН, к экологической группе арбовирусов, семейству Flaviviridae, роду Flavivirus. Большая часть флавивирусов передается комарами, некоторые -клещами, ряд вирусов обладает очень высокой экологической пластичностью, в частности, способностью к трансмиссивной передаче и комарами, и клещами (например, вирус Западного Нила) (Львов Д.К., Дерябин П.Г., 2008).

Время постановки ИФА с применением МИС составило 50-60 мин, а традиционным методом, учитывая 18-ти часовую сенсибилизацию микропланшетов — 20 — 21 час. При этом показания оптической плотности (ОП) пробы превышали величину ОП отрицательного контроля в 2,0 — 2,2 раза, что свидетельствовало о более высокой чувствительности ИФА с применением МИС. При раститровке нативных антигенов показано, что чувствительность традиционного ИФА составила 15 мкг/мл (по белку), а чувствительность ИФА с МИС — 100 — 50 нг/мл. С антигеном ВКЭ окрашивание раствора не наблюдалось, что свидетельствовало об отсутствии перекрестных реакций и подтверждало специфичность имуноферментного конъюгата и МИС.

Таким образом, при использовании МИС в ИФА для проведения реакции не требовались полистироловые планшеты, сокращалось время сенсибилизации твердой фазы в 15 раз, значительно увеличивался срок хранения сенсибилизированной твердой фазы ( с 20 дней до 2 лет и более); время проведения анализа сокращалось в 1,5 раза, а чувствительность повышалась на несколько порядков по сравнению с общепринятым ИФА.

При исследовании в модифицированном ИФА с применением иммуно-магнитной сепарации 3573 имаго комаров (230 пулов), собранных в 13 районах Ставропольского края и окрестностях г. Ставрополя в июне — июле 2005 -2008 гг., получены следующие результаты: использование селективного концентрирования на МИС дало возможность обнаружить антиген вируса ЛЗН в 27 пробах, в то время как в ИФА без применения МИС выявлено девять ан-тигенсодержащих проб. Таким образом, нами подтверждено наличие антигена ВЛЗН в девяти суспензиях комаров и дополнительно выявлено 18 положи-

тельных проб комаров Ае. cantans, отловленных в Георгиевском, Грачевском, Изобильненском, Курском, Нефтекумском, Петровском, Шпаковском районах, г. Ставрополе, причем, в Георгиевском, Курском и Петровском районах положительных находок в традиционном ИФА ранее не было. Применение МИС позволило повысить выявляемость инфекционного агента в 3 раза.

При исследовании 4853 особей иксодовых клещей (454 пула) модифицированным ИФА удалось обнаружить антиген BJI3H в 32 пробах, а традиционным ИФА — лишь в девяти пулах. Таким образом, дополнительно выявлены 23 положительных пробы клещей Н. marginatum, из них из Благодарненского, Грачевского, Ипатовского и Алекасандровского районов положительных проб традиционная постановка ИФА не обнаруживала. Тем самым выявляемость В ЛЗН увеличена в 3,5 раза.

Эффективность применения метода полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией для диагностики, изучения молекулярной эпидемиологии лихорадки Западного Нила и анализа структуры генома возбудителя JI3H подтверждена целым рядом работ (Гаранина С.Б., Щербакова A.M., Куличенко А.Н. и соавт., 2001; Журавлев В.И., 2002; Львов Д.К., Писарев В.Б., Петров В.А. и соавт., 2004; Петров В.А., 2004 и др.).

При использовании в качестве проб клинического материала особых трудностей в подготовке образцов для постановки ПЦР не возникает. Более сложной задачей представляется подготовка проб из объектов внешней среды, в частности, клещей и комаров, так как в этом случае необходимо использовать особые методические приемы, позволяющие избавиться от контаминирующих примесей и максимально сконцентрировать искомую РНК. Для этого мы объединили два метода: высокоэффективное избирательное концентрирование инфекционного агента на магноиммуносорбенте с последующей постановкой полимеразной цепной реакции, проведя многочисленные серии опытов по адаптации этих методов друг к другу. Результаты наших исследований свидетельствовали о том, что применение МИС при проведении ПЦР позволяет на этапе подготовки пробы путем многократных промываний сорбента с фиксированным на нем вирусом освобождаться от всевозможных примесей, тем самым исключая их отрицательное влияние на реакцию, максимально концентрируя искомый патоген, что повысило выявляемость РНК вируса ЛЗН в 1,8-2 раза. РНК вируса ЛЗН сочетанным методом выявлена в 29 пробах комаров, из них 14 проб подтверждено и дополнительно выявлено 15, при этом в Изобильненском, Курском и Петровском районах — по четыре пробы, в Нефтекумском -две и Георгиевском — одна положительная проба (рисунок 3).

1 — ladder 100 bp; 2-7 — без МИС;

8-13 — после концентрирования на МИС;

Рис. 3. Результаты выявления РНК вируса J13H методом ОТ-ПЦР до и после селективного концентрирования проб суспензии комаров на МИС.

При исследовании иксодовых клещей РНК вируса ЛЗН выявлена в 27 пробах, из них подтверждено 13 полученных ранее положительных результатов и дополнительно выявлено еще 14 положительных проб: Александровском, Грачевском, Ипатовском, Курском, Новоселецком, Нефтекумском -по две пробы, а Благодарненском и Степновском — по одной пробе.

При сопоставлении результатов, полученных в ИФА и ОТ-ПЦР, и результатов сочетанных методов экспресс-анализов МИС + ИФА и МИС +ПЦР установлено закономерное повышение чувствительности традиционных методов за счет селективного концентрирования вируса на иммуномагнитном сорбенте (таблицы 2, 3).

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о распространении и циркуляции вируса ЛЗН в 17 из 23 обследованных административных районов Ставропольского края и г. Ставрополе. Обнаружение специфических IgG к вирусу ЛЗН у лихорадящих больных и здоровых людей (доноров) в целом ряде районов Ставропольского края сигнализирует об инфицированно-сти населения и реальной угрозе возникновения как единичных случаев заболевания, так и вспышек ЛЗН. При этом иксодовые клещи Н. marginatum и комары рода Aedes могут служить индикаторами потенциального природного очага ЛЗН в Ставропольском крае. Обнаружение вируса ЛЗН в организме птиц (грачи) позволяет отнести их к числу активных сочленов природного очага ЛЗН и подтверждает индикационное значение массовых видов птиц, в частности, врановых.

Положительные результаты по ЛЗН (2005-2008 гг.) при исследовании членистоногих в ИФА и ОТ-НЦР в сочетании

с пммуномагншной сепарацией

Район Вид насекомого Кол-во исследованных особей (абс.) Кол-во пулов (абс.) Метол выявления

г. Ставрополь Комар Aedes cantam 148 17 7 41,2 2 41.2

Шпаковский Комар Aedes cantam 29 4 2 50,0 4 100.0

Грачевекий Комар Aedes cantons 20 1 1 100.0 1 100.0

11ефтекумский Комар Aedes vermis, Aedes cantans 298 32 4 12.5 3 9,4

Изобильнснекнй Комар Aedes cantans 49 8 4 50.(1 5 62,5

Георгиевский Комар Aedes cantans 13 1 1 100,0 1 100,0

Петровский Комар Aedes cantans и 4 4 100,0 4 100,0

Курский Комар Aedes canians 374 30 4 13,3 4 13,3

Советский Клещ Hvakmma marginatum 290 76 4 5.3 5 7,9

Курский Клещ Hyalomma marginatum, Boophilux annularis 640 55 3 5,5 3 5,5

Степновский Клещ Hyalomma marginatum 361 62 4 6,5 4 6.5

Новоселецкий Клещ Hyalomma marginatum 661 60 4 6,7 5 8,3

Нефтекумекий Клещ Hyalomma marginatum 591 62 4 6.5 л л 8,8

Благ одариепский Клещ Hyalomma marginatum 731 64 4 6,3 1 1.6

^Грачевекий Клеш li d mma marginatum 181 9 3 33,3 2 22 2

Инатовский Кл щИ> ¡omnia marginatum 291 15 3 20,0 2 13.3

Александровски й Kji щ thai типа marginatum 287 33 3 9.1 2 6,1

Итого 5465 533 63 11,9 56 10.5

Результаты сравнительного исследования комаров и клещей с целью детекции возбудителя ЛЗН

Метод исследования Количество исследованных проб Количество положительных результатов

МИС+ИФА 456 230 32 7,0 27 11,7

ОТ-ПЦР 456 230 13 2,9 14 6,0

МИС+ ОТ-ПЦР 456 230 27 5,9 29 12,6

1. Впервые показано наличие важнейших переносчиков и резервуаров вируса лихорадки Западного Нила, которыми являются комары рода Aedes и птицы семейства врановых; иксодовые клещи Н. marginatum вовлекаются в паразитарную систему ВЛЗН на территории Ставропольского края, что свидетельствует о наличии природных очагов ЛЗН на данной территории.

2. Впервые при исследовании сывороток крови лихорадящих больных с неустановленным диагнозом и доноров крови из районов Ставропольского края методом ИФА обнаружены специфические иммуноглобулины класса G к ВЛЗН, что свидетельствует об инфицированности населения и позволяет выделить следующие территории наибольшего риска заражения людей: Благодар-ненский, Изобильненский, Кочубеевский, Красногвардейский, Курский, Александровский, Нефтекумский, Туркменский, Шпаковский районы Ставропольского края и г. Ставрополь. Опасность возникновения заболевания ЛЗН существует также в Георгиевском, Грачевском, Новоселицком, Петровском, Советском, Степновском районах Ставропольского края, в которых выявлены носители и переносчики ВЛЗН.

3. Наличие природных очагов ЛЗН на сопредельных и близлежащих к Ставропольскому краю территориях Юга России, ландшафтно-географические, климатические, фаунистические особенности Ставропольского края, расположенного на восточно-европейском пути миграции перелетных птиц из эндемичных по ЛЗН стран Азии и Африки, а также установленная методами ИФА и ОТ-ПЦР зараженность ВЛЗН собранных на территории Ставропольского края комаров, иксодовых клещей и синантропных врановых свидетельствуют о формировании природных очагов на его территории и необходимости проведения широкомасштабного эпидемиологического мониторинга за лихорадкой Западного Нила.

4. Применение иммуномагнитной сепарации с разработанным алюмо-силикатным аффинным ЛЗН-сорбентом в сочетании с ИФА и ОТ-ПЦР позволя-

ет увеличить их чувствительность и специфичность, тем самым повышая выявляемое™ инфекционного агента в 3 -3,5 раза в ИФА ив 1,8-2 раза в ОТ-ПЦР, одновременно сокращает время проведения исследования с 20 — 21 часа до 1 -3 часов за счет ускорения манипуляций и исключения ряда этапов в ходе анализов, что повышает их экспрессность, достоверность, информативность и, как следствие, эффективность эпидемиологического мониторинга за JI3H.

5. Показано, что сформировавшиеся природные очаги на территории Волгоградской, Ростовской, Астраханской областей характеризуются ежегодными заболеваниями людей с преобладанием среди заболевших городского населения (87,2 %) и средне-тяжелой формы без поражения ЦНС (84,6 %), при этом в трансмиссивном механизме передачи вируса ЛЗН (79,5 %) в основном принимают участие комары родов Culex, Anopheles, Aedes, Coquilletti-dia и иксодовые клещи H.marginatum, Rh.rossicus.

Список опубликованных работ

1. Афанасьева, Е.Е. Разработка сочетанного метода детекции вируса лихорадки Западного Huna (ЛЗН) путем избирательного концентрирования на магноимму-носорбенте с последующей постановкой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией / Е.Е. Афанасьева //Вестник Российской военно-медицинской академии. — СПб, 2006. -№ 1(15). — Приложение. — С. 486.

2. Алиева, Е.В. Аффинные сорбенты для экспресс-диагностики различных заболеваний /Е.В.Алиева, И.С. Тюменцева, E.H. Афанасьев, Н.Е. Афанасьев, М.П. Лаврешин, Е.Е. Афанасьева, Т.Н. Орлова //Курский научно-практический вестник « Человек и его здоровье». — 2008. — №1. — С.5-9.

3. Жарникова, И.В. Разработка и применение иммобилизованных систем для экспресс-диагностики различных заболеваний /И.В.Жарникова, И.С. Тюменцева, E.H. Афанасьев, В.И. Ефременко, Е.В. Жданова, Т.В. Жарникова, Е.Е. Афанасьева, Т.Н. Орлова, Д. В. Ефременко, Н.Е. Афанасьев, М.П. Лаврешин, Н.В. Левченко, A.A. Семирчева, С.А. Курчева, A.M. Бабий //Вестник Российской военно-медицинской академии. — Санкт-Петербург, 2008. — Приложение №2(22). — 4.1. — С. 180-181.

4. Тюменцева, И.С. Иммуномагнитные сорбенты для экспресс-диагностики опасных инфекционных заболеваний: аспекты биотехнологии и опыт применения /И.С.Тюменцева, E.H. Афанасьев, Л.В. Ляпустина, О.И. Коготкова, И.В. Жарникова, В.И. Ефременко, Д.А. Будыка, Н.Ф. Василенко, Е.Е. Афанасьева, А.Н. Куличенко //Проблемы особо опасных инфекций. — Вып. 3, №101. — Саратов, 2009. — С. 59-61.

5. Василенко, Н.Ф. Изучение циркуляции вируса лихорадки Западного Нила в Ставропольском крае / Н.Ф. Василенко, Е.Е. Афанасьева, Д.А. Грядских, Е.А. Горобец, Т.В. Марьева, Л.В. Дегтярева // Опыт работы учреждений Роспотребнадзора в Ставропольском крае по обеспечению санэпидблагопо-лучия и защите прав потребителей. 9-я Ежегодная Неделя Медицины Ставрополья: Материалы науч.-практ. конф.- Ставрополь, 2005. — С. 173-177.

6. Афанасьева, Е.Е. Эпидемиологический мониторинг ЛЗН на территории Ставропольского края / Е.Е. Афанасьева, Н.Ф. Василенко, Т.В. Марьева, И.В. Чумакова; Ставропольский н.-и. противочумный ин-т. — Ставрополь, 2006. — 7 с. — Деп. в ВИНИТИ 13.04.2006, № 477 В-2006.

7. Чумакова, И.В. Орнитофильные комары (Diptera, Culicidae) Ставропольского края / И.В. Чумакова, Н.Ф. Василенко, Т.В. Марьева, Е.Е. Афанасьева, И.Э. Ляпин // Проблемы энтомологии Северо-Кавказского региона: Материалы 1-й Всероссийской науч.-практ. интернет — конференции. — Ставрополь: «Агрус», 2006. — Вып.2. — С. 33-35.

8. Афанасьева Е.Е. Эпидемиологический надзор за лихорадкой Западного Нила в Ставропольском крае /Е.Е, Афанасьева, Н.Ф. Василенко, Т.В Марьева //Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: Сб. тезисов науч.-практ. конф. молодых ученых. — СПб.: Издательский дом СПб МАПО, 2006. — С.289-290.

9. Ефременко, В.И.О значении птиц в заносе и циркуляции патогенных для человека вирусов в природных и антропогенных биоценозах Юга России / В.И. Ефременко, Г.М. Грижебовский, А.П. Бейер, И.В. Чумакова, Н.В. Ефременко, Н.Ф. Василенко, Т.Н. Орлова, Е.Е. Афанасьева; Ставропольский н.-и. противочумный ин-т. — Ставрополь, 2006. — 15 с. — Деп. в ВИНИТИ 26.07.2006, №1008- В2006.

10. Чумакова, И.В. Освоение комарами урбаценозов городов Ставропольского края /И.В. Чумакова, С.А. Сироткина, Н.Ф. Василенко, Т.В. Марьева, Е.Е.Афанасьева // Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней: Сб. науч. трудов. — М., 2006. — Вып. 8. — С. 676-678.

11. Афанасьева, Е.Е. Разработка метода селективного концентрирования на магноиммуносорбенте с последующей постановкой ИФА для детекции возбудителя лихорадки Западного Нила / Е.Е. Афанасьева // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территорий государств-участников СНГ: Матер. VII Межгосударственной конференции государств-участников СНГ (3-5 октября 2006 г., Оболенск, Московская обл.) /Под ред. академика РАМН Г.Г.Онищенко, член. — корр. РАМН В.В. Кутырева, докт. мед. наук, профессора И.А. Дятлова. -Протвино: А-ПРИНТ ЗАО, 2006,- С. 178-179.

12. Афанасьева, Е.Е. Разработка биотехнологии получения магноиммуно-сорбентов для экспресс-диагностики лихорадки Западного Нила /Е.Е.Афанасьева, Д.А.Грядских //Там же. — С. 179-180.

13. Алиева, Е.В. Унификация и разработка тест-систем диагностических для мониторинга возбудителей бактериальной (кампилобактериоз, туляремия, лептоспироз) и вирусной (лихорадка Западного Нила) природы / Е.В. Алиева, A.B. Таран, Е.Е. Афанасьева, С.А. Курчева, Т.В. Жарникова, И.С. Тюменце-ва, И.В. Жарникова, И.В. Самарина // Вестник СГУ. — Ставрополь, 2006. -Вып. 47. — С. 292-298.

14. Пат. РФ № 2290641. МПК8 G 01N 33/551, С 12 Q 1/04. Способ проведения иммуноферментного анализа (ИФА) / Д.И. Ефременко, И.В. Жарникова,, A.A. Ефременко, И.В.Гаркуша, Е.В.Жданова, И.В. Юркина, Е.В. Алиева,

Е.Е. Афанасьева. — №200510921/13 заявлено 30.03.2005; опубл. 27.12.2006, Бюл. №32. — 4с.

15. Афанасьева, Е.Е. Разработка биотехнологии получения магноиммуно-сорбентных тест-систем для экспресс — диагностики лихорадки Западного Нила и детекции ее возбудителя / Е.Е. Афанасьева, В.И. Ефременко, И.С. Тюменцева, Н.Ф. Василенко; Ставропольский н.-и. противочумный инт. — Ставрополь, 2007. — 20 с. — Деп. в ВИНИТИ 23.01.2007, № 66 — В2007.

16. Афанасьева, Е.Е. Совершенствование экспресс-диагностики лихорадки Западного Нила / Е.Е. Афанасьева // Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на Юге России: Материалы научно-практ. конференции (21-22 марта 2007 г.). — Ставрополь, 2007. — 4.1. — С. 29-32.

17. Василенко, Н.Ф. Эпидемиологическая обстановка по лихорадке Западного Нила в Южном Федеральном округе в 2006 г. /Н.Ф.Василенко, О.В.Малецкая, А.П.Бейер, И.В.Чумакова, Е.Е.Афанасьева // Там же. — С.64-67.

18. Ефременко, В.И. Применение тест-систем магноиммуносорбентных для вьивления возбудителей инфекционных заболеваний / В.И. Ефременко,

A.A. Зуенко, О.И. Коготкова, Н.В. Чурикова, И.С. Тюменцева, И.В. Жарни-кова, Е.С. Шиянова, В.Д. Майская, Е.Е. Афанасьева, Т.В. Жарникова, С.А. Курчева; Ставропольский н.-и. противочумный ин-т. — Ставрополь, 2007. — 28 с. — Деп. в ВИНИТИ 18.07.07. — №741-В2007.

19. Афанасьева, Е.Е. Опыт применения аффинного сорбента для экспресс-диагностики лихорадки Западного Нила / Е.Е. Афанасьева, Н. Ф. Василенко,

B.И. Ефременко, И.В. Чумакова, Т.В. Марьева, А.М. Бутенко, Т.Ю. Крассов-ская, С.А. Щербакова, И.Н. Шарова // Материалы IX съезда Всерос. науч.-практ. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, 26-27 апреля, 2007. — М.: Санэпидемия, 2007. — Т.З. — С. 9-10.

20. Василенко, Н.Ф. Цируляция некоторых арбовирусов на территории Ставропольского края /Н.Ф. Василенко, А.П. Бейер, И.В. Чумакова, В.И. Ефременко, О.В. Малецкая, М.П. Григорьев, Е.Е. Афанасьева, Т.В. Марьева, В.М. Мезенцев //Научно-практический журнал «РЭТ-ИНФО». — Москва, 2007. -№1.-С.15-18.

21. Василенко, Н.Ф. Распространение некоторых арбовирусов на территории Ставропольского края /Н.Ф. Василенко, А.П. Бейер, И.В. Чумакова, В.И. Ефременко, О.В. Малецкая, М.П. Григорьев, Е.Е. Афанасьева, Т.В. Марьева, В.М. Мезенцев //Арбовирусы и арбовирусные инфекции: Материалы расширенного пленума проблемной комиссии «Арбовирусы» и на-уч.-практ. конф. «Арбовирусы и арбовирусные инфекции», Астрахань, 17 -20 окт. 2006. — Москва, 2007. — С.165-168.

22. Орлова, Т.Н. Получение ферромагнитного кремнезема, модифицированного карбонизированным лигнином и карбодиимидом, и его характеристика /Т.Н.Орлова, Е.Е. Афанасьева, E.H. Афанасьев, И.С. Тюменцева, Н.Ф. Василенко /Вестник Московского ун-та. Серия 2. — Химия, 2008. — Т.49, №3. — С.213-216.

23. Афанасьева, Е.Е. Мониторинг за лихорадкой Западного Нила в Ставропольском крае (2005-2008 гг.) /Е.Е.Афанасьева, Н.Г. Варфоломеева, Г.П. Шкарлет, Н.Ф. Василенко // Материалы науч.-практ. конф. молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотреб-надзора (21-22 апреля 2009, Оболенск, Московская обл.) Биологическая безопасность в современном мире. — Оболенск, 2009. — С.37-39.

24. Варфоломеева, Н.Г. Изучение циркуляции некоторых арбовирусов на территории Ставропольского края в 2008 г. /Н.Г.Варфоломеева, Г.П. Шкарлет, Е.Е. Афанасьева, Н.Ф. Василенко, Т.Н. Орлова, Л.И. Шапошникова, О.В. Малецкая //Там же. — С.10-12.

25. Пат. РФ № 2363732 МПК8 C12N 11/14, G 01 N 35/551. Способ получения иммуносорбента /Е.Е. Афанасьева, А.В.Брыкалов, И.С. Тюменцева, В.И.Ефременко, Д.А. Грядских, E.H. Афанасьев, М.П. Лаврешин. -№2008110836/13 заявлено 18.03.2008; опубл. 10.08.2009, Бюл. № 22. — 5 с.

Печать офсетная. Бумага офсетная. Формат 60>£4/16 Физ. печ. л. — 1,5 Усл. печ. л. — 1,39

Заказ-205 Тираж-100 Отпечатано в оперативной полиграфии отдела информации и региональной статистики Ставропольстата г. Ставрополь, ул. Пушкина,4

1.1. Лихорадка Западного Нила: современные аспекты эпидемиологии и лабораторной диагностики

1.2. Применение иммуномагнитных сорбентов при санитарно-эпидемиологическом мониторинге патогенов во внешней среде.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы, взятые в работу.

2.1.1 Клинический и полевой материал.

2.1.3. Диагностические тест-системы, использованные 35 при проведении лабораторных исследований

2.1.4. Оборудование и аппаратура (основные).

2.2.1. Эпидемиологический анализ заболеваемости.

2.2.2. Места сбора полевого материала.

2.2.3. Сбор и хранение полевого материала.

2.2.4. Подготовка проб полевого материала к исследованию.

2.3. Выявление РНК вируса ЛЗН методом ОТ-ПЦР

2.4. Методы выделения иммуноглобулинов.

2.5. Получение иммунопероксидазного конъюгата.

2.6. Физико-химические методы.

2.7. Лиофилизация биологического материала.

2.8. Методы математической и статистическо обработки полученных результатов.

Глава 3. ОСНОВНЫЕ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ

ОСОБЕННОСТИ ЛИХОРАДКИ ЗАПАДНОГО НИЛА НА ТЕРРИТОРИИ ЮГА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

3.1. Условия, способствующие формированию природных очагов лихорадки Западного Нила.

3.2. Результаты исследования полевого материала на

ЛЗН, собранного на территории Юга России

3.3. Эпидемическая обстановка по заболеваемости лихорадкой Западного Нила на Юге России

Глава 4. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МОНИТОРИНГА ЗА ЛИХОРАДКОЙ ЗАПАДНОГО НИЛА НА ПРИМЕРЕ СТАВРОПОЛЬСКОГО КРАЯ

4.1. Исследование клинического и полевого материала в ИФА и ПЦР, собранного на территории Ставропольского края.

4.2. Разработка иммуномагнитного сорбента для мониторинга вируса лихорадки Западного Нила в объектах внешней среды в ИФА и ОТ-ПЦР.

4.2.1. Получение иммуномагнитного сорбента.

4.2.2. Изучение эффективности применения иммуно-магнитной сепарации при исследовании объектов внешней среды на наличии вируса лихорадки Западного Нила в ИФАи ПЦР.

Введение диссертации по теме «Эпидемиология», Афанасьева, Екатерина Евгеньевна, автореферат

Актуальность темы. В современном мире неуклонно растет понимание высокой социально-экономической значимости широкого распространения различных инфекционных болезней. Особенностью современной эпидемиологической обстановки является не только активизация многих инфекционных заболеваний, которые традиционно находятся под контролем санитарно-эпидемиологических служб, но и возникновение очагов новых и возвращающихся инфекций бактериальной и вирусной природы (Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., Кривуля С.Д и соавт., 2006; Локтев В.Б., 2007; Кутырев В.В., 2008: Львов Д.К., Савченко С.Т., Алексеев В.В. и соавт., 2008; Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Жаркенов А.Ф. и соавт., 2009; Онищенко Г.Г., Смоленский В.Ю., 2009).

Проблема лихорадки Западного Нила (ЛЗН) в настоящее время остается актуальной в связи с постоянным расширением ареала этой инфекции. Крупные вспышки ЛЗН (Онищенко Г.Г., 2000, 2001; Бутенко A.M., 2007; Львов Д.К., Савченко С.Т., Алексеев В.В. и соавт., 2008; Платонов А.Е., Ка-рань Л.С., Гаранина С.Б. и соавт., 2009), тяжелое течение болезни с преобладанием серозных менингитов, документированная передача вируса лихорадки Западного Нила (ВЛЗН) при переливании крови являются новыми фактами в изучении этой актуальной арбовирусной инфекции. Вспышки и эпидемии ЛЗН и даже единичные случаи рассматриваются в Международных медико-санитарных правилах ВОЗ (2005) как чрезвычайная ситуация здравоохранения международного масштаба. Сезонные миграции птиц способствуют трансконтинентальному переносу ВЛЗН (Львов Д.К.,2002; Бутенко A.M., Вышемирский О.И. и соавт., 2002; Забашта М.В., Москвитина Э.А., За-башта А.В., 2006 и др.).

Не возникает сомнений в том, что территория Юга России является эндемичной по широкому спектру природно-очаговых инфекций бактериальной и вирусной природы, требующих особого внимания в силу того, что этиологические агенты большинства из них относятся к возбудителям I-II групп патогенности, а обострение обстановки по некоторым из них может привести к чрезвычайной эпидемической ситуации международного значения (Малецкая О.В., Грижебовский Г.М., Бейер А.Г1. и соавт., 2009).

Ставропольский край (СК) в силу своего географического положения и природных условий (жаркий засушливый климат, обилие водоемов, комаров и клещей, большое количество перелетных птиц и др.) представляет большой интерес в отношении изучения циркуляции вируса JI3H и его роли в патологии человека. Такие исследования на территории Ставропольского края ранее не проводились.

Сложившаяся ситуация диктует необходимость широкомасштабного реального мониторинга вируса JI3H в антропогенных и природных биоценозах с привлечением современных методов экспресс-диагностики. Мониторинг инфекционных болезней является одной из наиболее важных составляющих комплекса мер по предотвращению и борьбе с эпидемиями (Они-щенко Г.Г., 2006). Один из блоков мониторинга — сбор, доставка и лабораторное исследование полевого материала — необходим как для прямого обнаружения компонентов возбудителя (антигенов или фрагментов генома), так и для последующей изоляции и идентификации инфекционного агента. Однако часто низкие концентрации возбудителя инфекции и его компонентов в полевом материале, а также огромное количество примесей не позволяют обнаруживать антигены вирусов и бактерий или их генетический материал непосредственно в исследуемых пробах. Разработка высокоэффективных способов концентрирования патогенов с последующей детекцией их антигенов или нуклеиновых кислот, либо их селективной сепарацией для бактериологических или вирусологических исследований — одно из приоритетных направлений совершенствования их лабораторной диагностики (Ефременко В.И., Василенко Н.Ф., Жарникова И.В. и соавт., 2009).

Актуальность проблем, изложенных выше, послужила основанием для проведения данной работы.

Цель исследования: совершенствование эпидемиологического мониторинга за лихорадкой Западного Нила и методов выявления её возбудителя.

Для достижения цели были определены основные задачи:

1. Изучить на примере Ставропольского края условия, способствующие формированию природных очагов лихорадки Западного Нила на Юге Российской Федерации.

2. Провести анализ результатов эпизоотологического обследования и заболеваемости J13H на территории Юга РФ.

3. Провести обследование территории Ставропольского края на наличие переносчиков и резервуаров вируса JT3H.

4. Изучить иммунную прослойку выборочных групп здорового населения, проживающих в Ставропольском крае, и провести исследования сывороток крови больных с лихорадкой неизвестной этиологии на наличие специфических антител к вирусу JI3H.

5. Усовершенствовать методы изучения распространения возбудителя лихорадки Западного Нила за счет использования иммуномагнитной сепарации при эпидемиологическом мониторинге вируса JT3H в объектах окружающей среды.

• Впервые на территории Ставропольского края при исследовании объектов внешней среды выявлено наличие вируса JI3H и установлены его основные переносчики — комары рода Aedes.

• Впервые установлена инфицированность BJI3H клещей Н. marginatum, что указывает на возможность их вовлечения в паразитарные системы природных очагов JI3H на территории Ставропольского края.

• Изучены показатели гуморального иммунитета больных с лихорадками неясной этиологии и здоровых людей (доноров крови) и установлено наличие антител класса IgG к вирусу JI3H в обеих группах, что свидетельствует об инфицировании этим вирусом населения

Ставропольского края и является дополнительным критерием в оценке эпидемической значимости природных очагов этой инфекции.

• Впервые использованная иммуномагнитная сепарация при исследовании полевого материала методами иммуноферментного анализа (ИФА) и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) повысила их эффективность и увеличила число положительных находок в 2 — 3 раза, что позволяет более достоверно оценивать эпидемиологический потенциал территорий.

• Получены данные о достаточно высоком эпидемиологическом потенциале природных очагов JI3H на территории Юга Российской Федерации, выражающиеся в ежегодной регистрации случаев заболеваний людей и зараженности комаров и клещей ВЛЗН. Практическая значимость.

Установление факта циркуляции возбудителя ЛЗН на территории Ставропольского края является предпосылкой для разработки комплекса мероприятий по эпидемиологическому и эпизоотологическому мониторингу, диагностике и профилактике ЛЗН. Применение иммуномагнитной сепарации в сочетании с методами лабораторной экспресс-диагностики (ИФА и ОТ-ПЦР) позволяет увеличить их чувствительность и специфичность, повышая возможность выявления возбудителя в 3 — 3,5 раза в ИФА ив 1,8-2 раза в ОТ-ПЦР, одновременно сокращает время проведения исследования с 20-21 часа до 1-3 часов за счет ускорения манипуляций и исключения ряда этапов при проведении анализов.

По результатам выполненных исследований получено 2 патента РФ: «Способ проведения иммуноферментного анализа (ИФА)», № 2290641, Бюл. № 36 от 27.12. 2006 г.; «Способ получения иммуносорбента», № 2363732, Бюл. № 22 от 10.08. 2009 г.

Материалы научных разработок легли в основу методических рекомендаций: «Магноиммуносорбенты в микробиологических и клинических исследованиях», утвержденных директором СтавНИПЧИ ( протокол Ученого совета СтавНИПЧИ № 9 от 27.10.2005 г.), «Применение органокремнеземно-го аффинного сорбента для селективного концентрирования возбудителя ЛЗН и последующего проведения экспресс-анализов (ИФА и ПЦР)», утвержденных директором СтавНИПЧИ (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ № 2 от 28 февраля 2007 г.); «Исследование полевого материала на наличие арбовирусов методами иммупоферментного анализа и полимеразной цепной реакции», утвержденных директором СтавНИПЧИ (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ № 8 от 09.07.2009 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Территория Юга Российской Федерации характеризуется наличием природных очагов ЛЗН с высоким эпидемическим по1енциалом, при этом основным резервуаром и переносчиком вируса являются комары рода Culex, Anopheles, Aedes, Coquillettidia и иксодовые клещи Н. marginatum, Rh. rossicus.

2. Установленная зараженность вирусом ЛЗН комаров рода Aedes, иксодовых клещей Hyalomma marginatum, синашропных врановых, обнаружение специфических антител к В ЛЗН в сыворотках крови людей с лихорадками неизвестной этиологии и у доноров крови свидетельствуют о циркуляции данного вируса на территории Ставропольского края.

3. Применение иммуномагнитной сепарации позволяет максимально сконцентрировать ВЛЗН в исследуемом материале, что увеличивает чувствительность методов на несколько порядков по сравнению с традиционными ИФА и ПЦР. Разработанные сочетанные методы МИС + ИФА и МИС + ПЦР могут использоваться при проведении мониторинга за ЛЗН.

Апробация работы. Результаты диссертации доложены, обсуждены, опубликованы в материалах научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2006); VII Межгосударственной научно-практической конференции государств — участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств — участников содружества Независимых Государств (Оболенск, 2006); второго съезда военных врачей медико-профилактического профиля Вооруженных сил Российской Федерации «Современные проблемы военной профилактической медицины, пути их решения и перспективы развития» (Санкт-Петербург, 2006); расширенного пленума проблемной комиссии «Арбовирусы» РАМН и научно-практической конференции «Арбовирусы и арбовирусные инфекции» (Астрахань, 2006); Всероссийской научной конференции, посвященной 210-й годовщине основания Военно-медицинской академии (Санкт-Петербург,2008); научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора (Оболенск, 2009).

Апробация диссертации состоялась 6 августа 2009 г. на межлабораторной конференции ФГУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена самостоятельно.

Отдельные этапы работы были выполнены совместно с д.б.н. Жарни-ковой И.В., к.б.н. Орловой Т.Н., д.х.н. Брыкаловым А.В.

Публикация научных исследований. По теме диссертации опубликовано 25 научных работ, в том числе 4 работы — в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Заключение диссертационного исследования на тему «Лихорадка Западного Нила на Юге России: современные эпидемиологические проявления и совершенствование методов выявления возбудителя»

1. Впервые показано наличие важнейших переносчиков и резервуаров вируса лихорадки Западного Нила, которыми являются комары рода Aedes и птицы семейства врановых; иксодовые клещи Н. marginatum вовлекаются в паразитарную систему ВЛЗН на территории Ставропольского края, что свидетельствует о наличии природных очагов ЛЗН на данной территории.

2. Впервые при исследовании сывороток крови лихорадящих больных с неустановленным диагнозом и доноров крови из районов Ставропольского края методом ИФА обнаружены специфические иммуноглобулины класса G к ВЛЗН, что свидетельствует об инфицированности населения и позволяет выделить следующие территории наибольшего риска заражения людей: Благодарненский, Изобильненский, Кочубеевский, Красногвардейский, Курский, Александровский, Нефтекумский, Туркменский, Шпаковский районы Ставропольского края и г. Ставрополь. Опасность возникновения заболевания ЛЗН существует также в Георгиевском, Грачевском, Новоселицком, Петровском, Советском, Степновском районах Ставропольского края, в которых выявлены носители и переносчики ВЛЗН.

3. Наличие природных очагов ЛЗН на сопредельных и близлежащих к Ставропольскому краю территориях Юга России, ландшафтно-географические, климатические, фаунистические особенности Ставропольского края, расположенного на восточно-европейском пути миграции перелетных птиц из эндемичных по ЛЗН стран Азии и Африки, а также установленная методами ИФА и ОТ-ПЦР зараженность ВЛЗН собранных на территории Ставропольского края комаров, иксодовых клещей и синантропных врановых свидетельствуют о формировании природных очагов на его территории и необходимости проведения широкомасштабного эпидемиологического мониторинга за лихорадкой Западного Нила.

4. Применение иммуномагнитной сепарации с разработанным алю-мосиликатным аффинным ЛЗН-сорбентом в сочетании с ИФА и ОТ-ПЦР позволяет увеличить их чувствительность и специфичность, тем самым повышая выявляемость инфекционного агента в 3 -3,5 раза в ИФА ив 1,8-2 раза в ОТ-ПЦР, одновременно сокращает время проведения исследования с 20 -21 часа до 1 — 3 часов за счет ускорения манипуляций и исключения ряда этапов в ходе анализов, что повышает их экспрессность, достоверность, информативность и, как следствие, эффективность эпидемиологического мониторинга за ЛЗН.

5. Показано, что сформировавшиеся природные очаги на территории Волгоградской, Ростовской, Астраханской областей характеризуются ежегодными заболеваниями людей с преобладанием среди заболевших городского населения (87,2 %) и средне-тяжелой формы без поражения ЦНС (84,6 %), при этом в трансмиссивном механизме передачи вируса ЛЗН (79,5 %) в основном принимают участие комары родов Culex, Anopheles, Aedes, Coquillettidia и иксодовые клещи Н. marginatum, Rh.rossicus.

В настоящее время лихорадка Западного Нила среди вновь возникающих вирусных инфекций человека является актуальной проблемой для здравоохранения России и других государств, в том числе членов ШОС (Львов Д.К., 2000; Львов Д.К., Савченко С.Г., Алексеев В.В. и соавт., 2008). В социально-экономическом отношении лихорадка Западного Нила — наиболее значимая арбовирусная инфекция для Юга России. Значимость данной нозологической формы определяется её широким распространением среди населения, вовлечением в эпидемический процесс трудоспособной части населения, возможностью возникновения вспышек, выраженной сезонностью, полиморфизмом клинических проявлений («агрессивностью болезни»), о чем свидетельствует значительный удельный вес тяжелых форм (40 %) и высокая летальность ( более 10 %) (Львов Д.К., Писарев В.Б., Петров В.А. и соавт., 2004).

Наличие эндемичных по ЛЗН территорий в странах Азии и Африки, возможность переноса вируса ЛЗН перелетными птицами, которые в эволюционном плане среди других позвоночных являются одним из древнейших резервуаров арбовирусов, в том числе ВЛЗН, его способность реплицироваться в новых видах млекопитающих, птиц и насекомых, высокая генетическая изменчивость, легкая адаптация к новым природным условиям обеспечивают формирование новых природных очагов ЛЗН, в которые вовлекается и проживающее на этой территории население (Локтев В.Б., Вышемир-ский О.И., Гуторов В.В. и соавт., 2009; Москвитина Э.А., Пичурина Н.Л., Орехов И.В. и соавт., 2009).

Юг Российской Федерации расположен на восточно-европейском пути пролета птиц из стран Центральной и Восточной Африки, Центральной, Юго-Западной и Южной Азии, в том числе эндемичных по ЛЗН.

На территории Юга РФ выделяют следующие ландшафтные зоны: пустынные северного подтипа, полупустынные южного подтипа (в Республике

Калмыкия и Астраханской области); луговые незатопленного подтипа, пойменные и пойменно-дельтовые, лесные умеренного пояса пойменного подтипа — в пределах Астраханской области; степные, полупустынные — в пределах Волгоградской области, Ставропольского края; лесостепные — в Ставропольском крае; предгорная — в Ставропольском крае; а также зоны полусухих и влажных субтропиков в пределах Краснодарского края (Новороссийск, Сочи). Разнообразие ландшафта, богатый растительный мир, многочисленность популяций членистоногих, благоприятные климатические условия на территории Юга РФ могут обеспечивать циркуляцию вируса ЛЗН в пустынном, степном и лесостепном зональных поясах. Особенности гидрологического режима на этой территории приводят к образованию узлов концентрации гнездящихся и мигрирующих птиц, в том числе водного и околоводного комплекса. В этих же районах создаются благоприятные условия для массового выплода комаров — основных переносчиков вируса ЛЗН, и клещей, выполняющих функции резервных хозяев. Среди комаров по видовому составу доминирует род Aedes. A. vexans и A. dorsalis — многочисленные виды в лесах и речных долинах степной зоны. Практически повсеместно обилен тропический род Culex, в частности, С. pipiens.

Ареал распространения клещей рода Hyalomma на территории Юга России в основном ограничен южными районами Волгоградской области, севером Астраханской области, Республикой Калмыкией, Ставропольским краем. Однако, в связи с тем, что основными прокормителями личиночных и нимфальных стадий этих иксодовых клещей являются птицы, а период пребывания на хозяине премагинальных фаз иксоид весьма продолжителен, все это способствует транспортировке личинок и нимф клещей рода Hyalomma птицами во время их весенних миграций на значительные расстояния. Масштабы заноса и адаптации паразитов к местным условиям свидетельствуют о возможности формирования за пределами ареала псевдопопуляций клещей рода Hyalomma.

Таким образом, основными факторами, способствующими формированию на территории Юга России природных очагов ЛЗН и ее эпидемическому проявлению, являются: климатические условия — свыше 100 дней в году со среднесуточной температурой более 20 °С, до 30 дней — более 30 °С, сумма эффективных температур (температура выше 10 °С) составляет 3200-3500 ; весьма разнообразный спектр кровососущих членистоногих (комаров, клещей) и птиц — основных переносчиков и носителей вируса ЛЗН; наличие большого числа миграционных русел перелетных птиц, способствующих заносу на территорию Юга РФ вируса ЛЗН из стран Азии и Африки.

Слежение за эпизоотическим процессом является одним из основных компонентов эпиднадзора за ЛЗН. Используя результаты исследований методом ИФА кровососущих членистоногих, мелких млекопитающих и птиц на наличие антигена вируса ЛЗН, осуществленных Территориальными управлениями Роспотребнадзора субъектов Юга России, нами проведен комплексный анализ этих данных с целью оценки эпидемиологической напряженности природных очагов ЛЗН на Юге РФ, а также для уточнения видового состава основных переносчиков и носителей ВЛЗН, их распространения и территориальной приуроченности.

В период с 2001 по 2006 гг. на территории Юга РФ методом иммуно-ферментного анализа было исследовано 16111 проб, в том числе 3230 проб, полученных от птиц (20,0 %), 2341 проба органов грызунов (14,5 %), 2675 проб комаров (16,6 %) и 7865 проб клещей (48,8 %). При этом общее количество положительных проб равнялось 295 (1,8 %). В целом на Юге РФ у грызунов антиген вируса ЛЗН выявлен в 1,0 % проб, среди птиц положительные пробы составили 1,8 %, у клещей ВЛЗН обнаружен в 1,9 % случаев; наибольший процент заражения вирусом ЛЗН отмечен у комаров (2,2 %).

Анализ лабораторных данных показал, что основными переносчиками ВЛЗН являются комары родов Aedes, Anopheles, Culex, Coquillettidia и иксо-довые клещи II. marginatum и Rhipicephalus rossicus, при этом циркуляция вируса ЛЗН имеет выраженную сезонность, совпадающую с пиками активности основных преносчиков.

Как показал анализ, в Краснодарском крае, Кабардино-Балкарской, Карачаево-Черкесской и Чеченской республиках, Республиках Северная Осетия-Алания и Адыгея при исследовании объектов внешней среды антиген вируса ЛЗН не выявлен.

О степени активности природных очагов ЛЗН, распространенности возбудителя на территории Юга России можно сделать достоверное заключение по результатам изучения уровня иммунной прослойки к вирусу ЛЗН населения, проживающего на этой территории. Сыворотки крови доноров, проживающих в Астраханской области, исследовали в ИФА и установили высокий уровень иммунной прослойки (47,0 %) среди населения. Уровень иммунной прослойки к вирусу ЛЗН у жителей Краснодарского края составил 2,8 %. За период с 2001 г. по 2006 г. ЛЗН зарегистрирована в трех из 13 субъектов Южного федерального округа: в Астраханской, Ростовской и Волгоградской областях. За эти шесть лет заболели лихорадкой Западного Нила 293 человека. Наибольшая эпидемиологическая активность отмечалась в Астраханской области, где за указанные годы выявлены 205 больных, что составило 69,9 % от числа всех больных, зарегистрированных в ЮФО. В Ростовской области число заболевших ЛЗН составило 43 (14,7 %), в Волгоградской области — 45 (15,4%).

В 2006 г. эпидемиологическая обстановка по ЛЗН изменилась: на Юге России зарегистрированы 39 больных в трех субъектах, что на 42,4 % меньше по сравнению с 2005 г. (92 больных). При этом резко снизилась заболеваемость в Астраханской области (в 5,2 раза), незначительно — в Ростовской области (в 1,2 раза). В Астраханской области выявлены 14 больных в трех районах: Икрянинском — 1, Камызякском — 1, Приволжском — 1 и в г. Астрахани — 11. Один случай заболевания ЛЗН закончился смертельным исходом (7,1 %). В Ростовской области зарегистрированы 13 больных в двух районах (Азовском — 1, Сальском — 1) и в трех городах (Ростове-на-Дону — 7, Каменск-Шахтинском — 1, Сальске — 3). В Волгоградской области заболеваемость возросла в 4 раза, всего отмечены 12 больных в г. Волгограде, в 2007 г. заболеваемость в этом регионе повысилась в 5,3 раза, а в 2008 г. снизилась в 31,5 раза. У всех больных диагноз в 100 % случаев подтвержден лабораторно.

В Краснодарском крае, Кабардино-Балкарской, Карачаево-Черкесской и Чеченской республиках, Республиках Северная Осетия-Алания, Адыгея, Калмыкия за период 2001-2006 г.г. случаи заболевания лихорадкой Западного Нила в официальных сводках не зарегистрированы (рисунок 16).

Приведенные выше данные свидетельствуют о том, что эпидемиологическая обстановка по ЛЗН на территории Юга РФ продолжает оставаться нестабильной. Как показывают результаты полевых наблюдений, прогноз эпидемиологической обстановки по ЛЗН следует признать неблагоприятным.

В Ставропольском крае подобных исследований никогда не проводили. Исходя из реальной эпидемиологической ситуации, сложившейся на сопредельных к СК территориях, совершенно очевидна своевременность и необходимость проведения эпидемиологического мониторинга за ЛЗН на территории Ставропольского края с привлечением современных методов исследования.

На наличие антигена ВЛЗН нами исследованы 3573 экземпляра кровососущих комаров, представленных четырьмя родами: Culex — 1948 экз. (43 пула), Aedes — 1253 (138), Anopheles — 200 (36), Coquillettida — 172 ( 13). Сбор комаров осуществляли в июне — июле 2005 — 2008 гг. в Александровском, Благодарненском, Георгиевском, Грановском, Изобильненском, Кировском, Красногвардейском, Курском, Нефтекумском, Петровском, Советском, Степ-новском, Шпаковском районах Ставропольского края и окресностях г. Ставрополя. Антиген ВЛЗН в ИФА обнаружен в девяти суспензиях комаров рода Aedes: A. cantans — семь проб, A. vexans — одна проба; A. diantaeus — одна проба; положительные пробы составили 6,5 % от всего количества проб рода Aedes. При анализе результатов исследования кровососущих комаров обра

Ольховский^ t’V Среднеахтубинский

Атыраусская область ‘ — • J у fXf-, Сальскии’

Граница административных f территорий Юга РФ

Ш Зарегистрированы больные ЛЗН

Зарегистрированы антитела к ВЛЗН у доноров, антиген фрагменты РНК

Рис. 16. Результаты лабораторных исследований на ЛЗН на территории Юга России щает на себя внимание высокая зараженность BJI3H орнитофильного вида А. cantans, обнаруженного, главным образом, во влажной лесопарковой зоне. Три пробы приготовлены из комаров, собранных в г. Ставрополе (парк Победы, лиственный лес), две — из комаров, отловленных на опушке леса х. Молочного (пригородная зона г.Ставрополя), одна проба — в 2-х км от леса в с. Красном Грачевского района, одна проба — в Изобильненском районе. Оба района граничат с краевым центром. Инфицированная проба комаров A. dian-taeus также обнаружена в г. Ставрополе. Зараженные В ЛЗН комары A.vexans доставлены из Нефтекумского района, расположенного в полупустынной ландшафтной зоне.

Исследование 4853 особей иксодовых и 61 особи аргасовых клещей на зараженность ВЛЗН, собранных нами в различных районах Ставропольского края, позволило обнаружить в ИФА восемь положительных проб Hyalomma marginatum (2,7 %) из 299 исследованных и одну положительную пробу Boophilus anmdatus (3,8 %) из 26 исследованных. Антиген ВЛЗН выявлен в двух пробах мозга грачей, с которых были сняты инфицированные клещи. При исследовании этих же проб комаров и клещей молекулярно-генетическим методом (ОТ-ПЦР) РНК вируса ЛЗН обнаружена в 14 пробах суспензий комаров рода Aedes , что составило 6,0 % от общего количества исследованных проб и 10,1 % от количества проб Aedes . В пробах клещей методом ОТ-ПЦР положительные результаты получены в 13 пулах, что составило 3,1 % от исследованного количества клещей Н. marginatum (414 проб) и 2,9 % от общего количества (456 пулов) иксодовых клещей.

С целью обнаружения специфических антител класса G к ВЛЗН исследованы 268 сывороток крови больных людей с лихорадками неизвестной этиологии, доставленных из районов Ставропольского края. Выявлены девять положительных проб, из них четыре — с титрами 1:6400 — 1:12800. При исследовании положительных проб на авидность оказалось, что высокотит-ражные сыворотки содержали низкоавидные антитела, свидетельствующие о недавно перенесенной болезни. Для оценки уровня естественной иммунизации населения исследовались сыворотки крови доноров, при этом из 1302 проб положительными оказались 21 ( 1,6 %). Полученные нами результаты свидетельствовали о циркуляции BJ13, и это требует расширенных исследований с применением новых современных экспрессных, информативных лабораторных методов для проведения эпидемиологического надзора за этой инфекцией.

Эффективность ряда методов индикации возбудителей инфекционных заболеваний и их антигенов может быть значительно увеличена после предварительного концентрирования вирусов и их антигенов с отделением от контаминирующей микрофлоры и ингибирующих примесей. Эта цель может быть достигнута путем применения методов иммуносорбции, особое место среди которых занимают методы с использованием сорбентов с магнитными свойствами. Магносорбенты служат твердой фазой при селективном концентрировании на их поверхности патогенов.

Нами впервые для синтеза твердофазной матрицы сорбента использован природный алюмосиликат, представляющий собой продукт, содержащий в своем составе, по данным химического анализа, двуокись кремния (массовая доля) — 78%. Химическое модифицирование сорбента с целью образования функционально активных групп, способных к взаимодействию с ли-гандами белковой природы, осуществляли в присутствии карбоксиметилиро-ванного — лигнина и карбодиимида. В качестве магнитного компонента при синтезе применяли магнетит (Fe3C>4). На основе проведенных исследований определены оптимальные параметры получения алюмосиликатного магно-сорбента: соотношение компонентов синтеза 1,5:1:1, соответственно SiCb, Fe304 , карбоксиметилированный лигнин; время гелеобразования — 2 часа, значение рН гелеобразования — 7,0. Для придания магносорбенту биоспецифических свойств и получения магноиммуносорбента (МИС) на поверхность МС иммобилизовали специфические IgG , выделенные фракционированием ПЭГ-6000 из мышиной ИАЖ против ВЛЗН.

ЛЗН — магноиммуносорбент имел следующие характеристики: у образцов МИС наблюдалась ярко выраженная губчатая, пористая микроструктура с участками аморфной массы, удельная поверхность сорбента — 63,0 ±0,84 м

/г, объем пор — 1,23 ±0,009 см /г, радиус пор — 29,7 ± 0,29 нм.

С целью упрощения и удешевления постановки иммуноферментного анализа, повышения его специфичности и чувствительности в качестве твердой фазы вместо полистироловых микроплат, традиционно применяемых при постановке ИФА, мы применили разработанные нами МИС при постановке «сэндвич» — варианта этого метода для обнаружения вируса ЛЗН. При этом были определены оптимальные параметры постановки ИФА с использованием МИС, чувствительность и специфичность сочетанного метода, проведено сравнение модифицированного метода МИС+ИФА с методом постановки реакции в полистироловых планшетах. Лабораторные испытания полученных нами трех серий алюмосиликатных лигнинсодержащих МИС к вирусу ЛЗН проводили с инактивированным антигеном, полученным в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН. Для проверки специфичности использовали антиген вируса клещевого энцефалита (инактивированный контрольный образец из набора реагентов для иммуноферментного выявления антигена вируса клещевого энцефалита «ВектоВКЭ-антиген»). Антиген вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) выбран нами в связи с тем, что он относится, так же как и вирус ЛЗН, к экологической группе арбовирусов, семейству Flavivi-ridae, роду Flavivirus. Большая часть флавивирусов передается комарами, некоторые — клещами, ряд вирусов обладает очень высокой экологической пластичностью, в частности, способностью к трансмиссивной передаче и комарами, и клещами (например, вирус Западного Нила) (Львов Д.К., Дерябин П.Г., 2008).

Время постановки ИФА с применением МИС составило 50-60 мин, а традиционным методом, учитывая 18-ти часовую сенсибилизацию микропланшетов — 20 — 21 час. При этом показания оптической плотности (ОП) пробы превышали величину ОП отрицательного контроля в 2,0 — 2,2 раза, что свидетельствовало о более высокой чувствительности ИФА с применением МИС. При раститровке нативных антигенов показано, что чувствительность традиционного ИФА составила 15 мкг/мл (по белку), а чувствительность ИФА с МИС — 100 — 50 нг/мл. С антигеном ВКЭ окрашивание раствора не наблюдалось, что свидетельствовало об отсутствии перекрестных реакций и подтверждало специфичность имуноферментного конъюгата и МИС.

Таким образом, при использовании МИС в ИФА для проведения реакции не требовались полистироловые планшеты, сокращалось время сенсибилизации твердой фазы в 15 раз, значительно увеличивался срок хранения сенсибилизированной твердой фазы ( с 20 дней до 2 лет и более); время проведения анализа сокращалось в 1,5 раза, а чувствительность повышалась на несколько порядков по сравнению с общепринятым ИФА.

При исследовании в модифицированном ИФА с применением иммуномагнитной сепарации 3573 имаго комаров (230 пулов), собранных в 13 районах Ставропольского края и окрестностях г. Ставрополя в июне — июле 2005 — 2008 гг., получены следующие результаты: использование селективного концентрирования на МИС дало возможность обнаружить антиген вируса ЛЗН в 27 пробах, в то время как в ИФА без применения МИС выявлено девять антигенсодержащих проб. Таким образом, нами подтверждено наличие антигена ВЛЗН в девяти суспензиях комаров и дополнительно выявлено 18 положительных проб комаров Ае. cantans, отловленных в Георгиевском, Гра-чевском, Изобильненском, Курском, Нефтекумском, Петровском, Шпаков-ском районах, г. Ставрополе, причем, в Георгиевском, Курском и Петровском районах положительных находок в традиционном ИФА ранее не было. Применение МИС позволило повысить выявляемость инфекционного агента в 3 раза.

При исследовании 4853 особей иксодовых клещей (454 пула) модифицированным ИФА удалось обнаружить антиген ВЛЗН в 32 пробах, а традиционным ИФА — лишь в девяти пулах. Таким образом, дополнительно выявлены 23 положительных пробы клещей Н. marginatum, из них из Благодар-ненского, Грачевского, Ипатовского и Алекасандровского районов положительных проб традиционная постановка ИФА не обнаруживала. Тем самым выявляемость В ЛЗН увеличена в 3,5 раза.

Эффективность применения метода полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией для диагностики, изучения молекулярной эпидемиологии лихорадки Западного Нила и анализа структуры генома возбудителя ЛЗН подтверждена целым рядом работ (Гаранина С.Б., Щербакова A.M., Куличенко А.Н. и соавт., 2001; Журавлев В.И., 2002; Львов Д.К., Писарев В.Б., Петров В.А. и соавт., 2004; Петров В.А., 2004 и др.).

При использовании в качестве проб клинического материала особых трудностей в подготовке образцов для постановки ПЦР не возникает. Более сложной задачей представляется подготовка проб из объектов внешней среды, в частности, клещей и комаров, так как в этом случае необходимо использовать особые методические приемы, позволяющие избавиться от кон-таминирующих примесей и максимально сконцентрировать искомую РНК. Для этого мы объединили два метода: высокоэффективное избирательное концентрирование инфекционного агента на магноиммуносорбенте с последующей постановкой полимеразной цепной реакции, проведя многочисленные опиты по адаптации этих методов друг к другу. Результаты наших исследований свидетельствавали о том, что применение МИС при проведении ПЦР позволяет на этапе подготовки пробы путем многократных промываний сорбента с фиксированным на нем вирусом освобождаться от всевозможных примесей, тем самым исключая их отрицательное влияние на реакцию, максимально концентрируя искомый патоген, что повысило выявляемость РНК вируса ЛЗН в 1,8-2 раза. РНК вируса ЛЗН сочеганным методом выявлена в 29 пробах комаров, из них 14 проб подтверждено и дополнительно выявлено 15, при этом в Изобильненском, Курском и Петровском районах — по четыре пробы, в Нефтекумском — две и Георгиевском — одна положительная проба.

При исследовании иксодовых клещей РНК вируса ЛЗН выявлена в 27 пробах, из них подтверждено 13 полученных ранее положительных результатов и дополнительно выявлено еще 14 положительных проб: Александровском, Грачевском, Ипатовском, Курском, Новоселецком, Нефтекумском — по две пробы, а Благодарненском и Степновском — по одной пробе.

При сопоставлении результатов, полученных в ИФА и ОТ-ПЦР, и результатов сочетанных методов экспресс-анализов МИС + ИФА и МИС +ПЦР установлено закономерное повышение чувствительности традиционных методов за счет селективного концентрирования вируса на МИС.

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о распространении и циркуляции вируса ЛЗН в 17 из 23 обследованных административных районов Ставропольского края и г. Ставрополе (рисунок 17).

Условные обозначения оАслеаоммныс районы с жшжпечышша л яыгдгоий ми .lilt j районы не обследованы районы оЛслелонаны

3 — littilHVdttfMtlil t- — Wiimuiiiawv.-aHapniu.ujitit: — lilimpiwuiNiit |Ц)КМ1МЛНИН|> Vp .1 u|)i i.ui)i 14 • lUiiiiKimt-uilli 111 — |lj)n>HII№Hll( 1С U fiif«»4H||lueiW.441

-fewifi ЧУМШ»! 114′- lit.Mt-Veoi^wuti

Г — Ml*«4ri« AHlMtii’ IA— fcvflBllUiUMIlil

— l1b|tl«jN»nu.Vhl№ 3*1- ШН^ЬИКНЧШЖП’. -‘II — CluiplUHUHlWIHl 22-«C, по медицине, диссертация 2010 года, Афанасьева, Екатерина Евгеньевна

1. О лихорадке Западного Нила в Ростовской области / Г.Т. Айдинов и др. . // Материалы IX съезда Всерос. науч.-практ. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, 26-27 апреля, 2007. Т.З. — М.: Санэпидемия, 2007. — Т.З.-С. 146.

2. Алиева, Е.В. Разработка кампилобактериозных аффинных магносор-бентов для обследования объектов внешней среды / Е.В. Алиева //Вестник СГУ. Ставрополь, 2005.- Вып. 42.- С. 163-166.

3. Алиева, Е.В. Разработка лабораторных экспресс-методов и технологии производства иммунодиагностических препаратов для выявления возбудителей листериоза и кампилобактериоза: Автореф. дис. . д-ра мед. наук: / Е.В. Алиева. Москва, 2008. — 30 с.

4. Аффинные сорбенты для экспресс-диагностики различных заболеваний / Е.В. Алиева и др. // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». 2008. — №1. — С.5-9.

5. Афанасьев, Е.Н. Научно-методические аспекты экспресс-диагностики возбудителей особо опасных зоонозных инфекций (чума, бруцеллез, сибирская язва): Автореф. дис. . докт. мед. наук: / Е.Н. Афанасьев. -Ростов, 2000,- 45с.

6. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев А.А. JI: Медгиз, 1962. — 180 с.

7. Базиков, И.А. Разработка новых препаратов для экспрессных методов диагностики сифилиса: Дис. . д-ра мед. наук: / И.А. Базиков. Ставрополь, 2000. — 200 с.

8. Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности): Санитарные правила СП 1.3.21285-03 //Бюллетень нор-мат. и метод, документов Госсанэпиднадзора. М., 2003. — Вып. 3(13). -С.61 — 144.

9. Беклемишев, В.Н. К изучению зараженности клещей переносчиков энцефалита методом биопробы / В.Н. Беклемишев // Вопросы вирусологии. — 1963. — №2. — С.240-232

10. Значение птиц в естественном цикле арбовирусов, передаваемых комарами в дельте реки Волги / В.В. Березин и др. // Тез. докл. Новосибирск, 1969.-С. 11.

11. Блашкович, Д. Птицы хозяева арбовирусов в Европе. Трансконтинентальные связи перелетных птиц и их роль в распространении арбовирусов / Д. Блашкович, Э. Эрнек. — Новосибирск: «Наука», 1972. — С. 161-167.

12. Брыкалов, А.В. Сорбенты на основе кремнеземов и активированных углей в биотехнологии и медицине /А.В.Брыкалов // Материалы конф. химиков Сев. Кавказа. Нальчик, 1991. — С. 185-186.

13. Брыкалов, А.В. Получение биопрепаратов на основе методов аффинной сорбции и иммобилизации: Дис. . д-ра хим. наук: / А.В. Брыкалов. Санкт-Петербург, 1993. — 330 с.

14. Брыкалов, А.В. Способ получения иммобилизованных протеолитиче-ских ферментов / А.В. Брыкалов, В.И. Ковальков, В.П. Тельбух, С.И. Кольцов: Описание изобретения к авторскому свидетельству № 1084300 от 07.04.1984, Бюл. №3.

15. Брыкалов, А.В. Новые композиционные носители для иммобилизации ферментов / А.В. Брыкалов, О.В. Воробьева // Современные достижения биотехнологии: Материалы Всерос. конф. Ставрополь, 1996. -С.279.

16. Выявление РНК вируса лихорадки Западного Нила в комарах Urano-taenia unguiculata и лягушках Rana ridibunda / Т.А. Булгакова и др. //

17. Материалы IX съезда Всерос. науч.-практ. об-ва эпидемиол., микробио. и паразитол., 26-27 апреля, 2007. М.: Санэпидемия, 2007. — Т.З. -С.157-158.

18. Бутенко, A.M. История изучения арбовирусных инфекций в Астраханской области / A.M. Бутенко, Д.Н. Столбов // Вопр. риккетсиол. и ви-русол. Астрахань, 1996. — С. 51.

19. Эпидемиологическая характеристика лихорадки Западного Нила в Астраханской области / A.M. Бутенко и др. // Вопр. вирусологии. -2001. №4.-С. 34-35.

20. Выделение штамма Аст 901 вируса Западного Нила из крови больного человека в Астраханской области в 2000 г. / A.M. Бутенко и др. //Вопр. вирусологии. -2001. № 4. — С. 31-32.

21. Заражаемость сельскохозяйственных животных вирусом Западного Нила в Астраханской области по данным серологического обследования (2001-2004 гг.) / А.В. Васильев и др. // Вопр. вирусологии. -2005.- №6. -С. 36-41.

22. Эпидемиологический мониторинг вируса гепатита А с помощью магнитных сорбентов / Н.Ф. Василенко // Материалы докл. Всерос. науч. -практ. конф. Пермь, 1993. — С. 32.

23. Клинико-патогенетические особенности лихорадки Западного Нила /Ю.Я. Венгеров и др. // Материалы VI Российского съезда врачей -инфекционистов, 29-31 октября 2003 г. СПб., 2003. — С. 65-66.

24. Инфекция, вызываемая вирусом лихорадки Западного Нила, как клиническая и эпидемиологическая проблема / Ю.Я. Венгеров и др. //Эпидемиология и инфекционные болезни. 2000. — № 4. — С. 27-31.

25. Венгеров, Ю.Я. Лихорадка Западного Нила /Ю.Я. Венгеров, А.Е. Платонов //Санитарный врач. 2009. — №2. — С. 12-15.

26. Ворошилова О.И. Киселев А.В. Синтез и исследование кремнеземных носителей с поверхностью, модифицированной аминопропилтри-этоксисиланом / О.И. Ворошилова, А.В. Киселев // Коллоидный журнал. 1980. — Т.42, № 2. — С. 223-229.

27. Выделение вируса лихорадки Западного Нила от больного менингоэн-цефалитом в Волгоградской области в 2000 г. / О.И. Вышемирский и др. // Вопр. вирусологии. 2001. — № 4. — С. 33-34.

28. Выделение арбовирусов из группы А и В в Азербайджане / С.Я. Гай-дамович и др. // Материалы 15-й научной сессии Института полиомиелита и вирусных энцефалитов. М., 1968.-С. 165.

29. Выделение вируса Западного Нила от черных дроздов и поползней в Азербайджане / С.Я. Гайдамович и др. // Новосибирск, 1972. С.27

30. Галкина И.В. Распространение арбовирусов в Поволжье: Автореф. дис. . канд. мед. наук / И.В. Галкина. -М., 1991. 24 с.

31. Гинцбург, A.JI. Молекулярно-биологические методы диагностики инфекционных заболеваний / A.JI. Гинцбург, H.JI. Нестеренко // Материалы VII съезда Всерос. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М., 2002. — Т.З. — С. 242-243.

32. Го, Н.Н. Иммун о ферментный анализ / Н.Н. Го. М., 1988. — 131 с.

33. Гурцевич, А.В. Комары. Семейство Culicidae. Фауна СССР / А.В. Гур-цевич, А.С. Мончадский, А.А. Штакельберг. Л.: Наука, 1970. — T.III, Вып.4. — 383 с.

34. Изучение сорбционной способности полистирольных планшетов, используемых в иммуноферментном анализе / Л.И. Ванеева и др. // Журнал микроб. № 9. — 1989. — С.86-89.

35. Гусева, Е.В. Трансмиссивные нейроинфекции: энцефалит клещевой, Крымская-Конго геморрагическая лихорадка, лихорадка Западного Нила: Обзор литературы / Е.В. Гусева, Н.С. Дудникова. Владимир,2002.-С. 77-93.

36. Птицы Советского Союза / Т.П. Дементьев и др.. М.: Советская наука, 1951. — T.III. — 480 с.

37. Дзантиев, Б.Б. Современное состояние и перспективы развития имму-иоферментного анализа / Б.Б. Дзантиев, A.M. Егоров // Жури. Всесоюз. хим. об-ва им. Д.И.Менделеева. 1982. — Т.27, № 4. — С.442-447.

38. Ефременко, В.И. Новые методы исследования холерного вибриона /В.И. Ефременко // Актуальные вопросы микробиологии, лабораторной диагностики и профилактики холеры: Тез. Всесоюз. конф. Ростов-н/Д, 1988.-С. 145-151.

39. Ефременко, В.И. Магносорбенты в микробиологических исследованиях / В.И. Ефременко. Ставрополь: «Ставрополье», 1996. — 131 с.

40. Получение и применение магнитных сорбентов в методах иммуноана-лиза микроорганизмов / В.И. Ефременко и др. // Журнал микробиол. 1989. — № 12.-С.100-106.

41. Новый метод выделения возбудителей холеры из воды / В.И. Ефременко и др. // Особо опасные инфекционные заболевания: диагностика, профилактика и биологические свойства возбудителей: Сб. науч. работ. Волгоград, 1990. — Вып. 4. — С.213-220.

42. Ефременко, Д.В. Совершенствование экспрессивных методов индикации микробактерий туберкулеза: Автореф. дис. . канд. мед. наук: /Д.В. Ефременко. Ставрополь, 2005. — 20 с.

43. Разработка и применение иммобилизованных систем для экспресс-диагностики различных заболеваний / И.В. Жарникова и др. // Вестник Российской военно-медицинской академии. — Санкт-Петербург, 2008. Приложение №2(22). — Ч. 1. — С. 180-181.

44. Жибурт, Б.Б. Гемотрансмиссивная передача вируса Западного Нила /Б.Б. Жибурт, М.Н. Губанова, В.А. Максимов //Эпидемиология и инфекционные болезни. 2007. — № 3. — С. 29-32.

45. Жизнь животных. Т.6. Птицы / Под ред. Ильичева В.Д., Михеева А.В. — М.: Просвещение, 1986. — С.74-75.

46. Журавлев, В.И. Эпидемиологические и экологические аспекты циркуляции арбовирусов на территории Астраханской области: Автореф. дис. . канд. мед. наук: /В.И. Журавлёв. Саратов, 2002.- 20 с.

47. Жувалова, Е.П. Западнонильский энцефалит / Е.П. Жувалова // Инфекционные болезни. М., 1976. — С. 318.

48. Иванов, А.И. Каталог птиц СССР/ А.И. Иванов. JL: Наука, 1976. -275 с.

49. Касторная, М.Н. Конструирование диагностических препаратов для экспрессных методов лабораторной диагностики бруцеллеза и детекции его возбудителей: Автореф. дис. .канд. биол. наук / М.Н. Касторная Краснодар, 2003. — 20 с.

50. Кельцев, Н.В. Основы адсорбционной техники / Н.В. Кельцев. М.: Химия, 1984. — С.280.

51. Киселев, А.В. Инфракрасные спектры поверхностных соединений /А.В. Киселев, В.И. Лыгин. -М.: Наука, 1972.- 459 с.

52. Клименко, Е.П. Эпидемиологический анализ / Е.П. Клименко, В.Ф. Попов, Г.П. Степанов. М.: Медицина, 1983. — С. 34-99.

53. Клячко-Гурвич, А.А. Методы определения удельной поверхности /А.А. Клячко-Гурвич //Изд. АН СССР. 1961. — № 10. — С. 1885.

54. Заболеваемость и заражаемость населения Астраханской области лихорадкой Западного Нила в 2002 г. / А.И. Ковтунов и др. // Вопр. вирусологии. 2003. — № 5. — С. 9 -11.

55. Rana ridibunda, один из хозяев кровососущих комаров в Таджикистане, как резервуар вируса Западного Нила / М.А. Костюков и др. // Экология вирусов. М., 1985. — № 3. — С. 49-50.

56. Котельникова, Г.М. О сохранении вируса лихорадки Западного Нила в экспериментально зараженных иксодовых клещах / Г.М. Котельникова // Вирусологические исследования на Дальнем Востоке: Труды биолого-почвенного института. 1975. — С. 33-36.

57. Краснова, Е.М. Эпидемиологические особенности лихорадки Западного Нила в Волгоградской области и совершенствование ее профилактики: Автореф. дис. . канд. мед. наук / Е.М. Краснова. -Волгоград, 2001.-21с.

58. Эпидемиологический мониторинг лихорадки Западного Нила в Волгоградской области / Е.М. Краснова и др. // Вопр. вирусол,- 2001. № 4.- С. 27-32.

59. Кутырев, В.В. Актуальные проблемы особо опасных инфекционных болезней и санитарная охрана территорий в современных условиях /В.В. Кутырев //Журн. Микробиол. № 1. — 2008. — С.17-23.

60. Лапач, С.М. Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием Exel: Экспериментальные исследования. Клинические испытания. Анализ фармацевтического рынка / С.М. Лапач, А.В. Чубенко, П.Н. Бабич. Киев: Морион, 2001. — 407 с.

61. Показатели специфических антител у реконвалесцентов перенесших лихорадку Западного Нила / В.Ф. Ларичев и др. // Вопр. вирусологии. 2002.-№ 6. — С. 11-13.

62. Противовирусная активность индуктора интерферона амиксина при экспериментальной форме лихорадки Западного Нила / С.Я. Логатино-ва и др. // Вопр. вирусологии. 2004. — № 2. — С. 8-11.

63. Коллоидно-химические основы получения устойчивых золей ферромагнетитов в различных средах / М.А. Лунина и др. // Гидродинамика и теплофизика магнитных жидкостей: Всесоюз. симпозиум. Юрмала, 1980. — С. 13-20.

64. Львов, Д.К. Природные очаги, связанные с птицами арбовирусов в СССР / Д.К. Львов // Миграции птиц и перенос возбудителей инфекции (эколого-географические связи птиц с возбудителями инфекций). -М.: Наука, 1979. С. 37-102; 137-157.

65. Львов, Д.К. Лихорадка Западного Нила / Д.К. Львов // Вопр. вирусологии.-2000. №2. — С. 4-10.

66. Львов, Д.К. Значение вновь возвращающихся инфекций в биобезопасности / Д.К. Львов // Вопр. вирусологии. 2002. — № 5. — С. 4-7.

67. Эпидемия менингоэнцефалита в Краснодарском крае и Волгоградской области, вызванная вирусом Западного Нила / Д.К. Львов и др. //Вопр. вирусологии. 2000. — № 1. — С. 37-38.

68. Атлас распространения возбудителей природно-очаговых вирусных инфекций на территории Российской Федерации / Д.К. Львов и др. -М., 2001. 119 с.

69. Выделение вируса лихорадки Западного Нила от больных людей в период эпидемиологической вспышки в Волгоградской и Астраханской областях / Д.К. Львов и др. // Вопр. вирусологии. 2002. — № 3. — С. 9-12.

70. Лихорадка Западного Нила / По материалам вспышек в Волгоградской области в 1999 2000 гг. / Д.К. Львов и др. // Вестник Волгоградского медицинского университета. 2003. — Т. 59, Вып. 9. — Приложение №1. — Волгоград, 2004. — 101 с.

71. Эпидемиологическая ситуация и прогноз заболеваемости лихорадкой Западного Нила на территории Российской Федерации / Д.К. Львов и др. // Проблемы особо опасных инф. — Вып. 95. 2008. — С. 10-12.

72. Львов Д.К., Дерябин П.Г. Флавивирусы (.Flaviviridae). В кн.: Медицинская вирусология. Под ред. Д.К. Львова.- М.,2008.- С.228-235.

73. Мавзютов, А.Р. Ингибиторы полимеразной цепной реакции /А.Р. Мав-зютов, В.М. Бондаренко, А.Т. Латкин //ЖМЭИ. 2003. — № 3. — С. 93 -98.

74. Роль комаров в передаче арбовирусов в Армении / Д.В. Манукян и др. // Мед. паразитология и паразитарные болезни. 2006. — № 2. — С. 38 -39.

75. Маркин, В.А., Вирусные геморрагические лихорадки: проблемы и размышления / В.А. Маркин, А.А. Махлай, Н.Д. Ющук // Эпидемиология и инфекционные болезни. 1999. — №6. — С. 4-6.

76. Маркин В.А., Марков В.И. Вирусные геморрагические лихорадки -эволюция эпидемического потенциала / В.А. Маркин, В.И. Марков //Журн. микробиол. -2002. №1. — С. 91-98.

77. Международные медико-санитарные правила (2005 г.) — Женева: ВОЗ, 2006. 79 с.

78. Эпидемиологический надзор за лихорадкой Западного Нила в Астраханской области, специфическая диагностика заболевания, меры общественной и личной профилактики: Методические указания 3.1.3.0022000 / А.И. Ковтунов и др. Астрахань, 2000. — 19 с.

79. Методические рекомендации: Мероприятия по борьбе с лихорадкой Западного Нила на территории Российской Федерации эпидемиологический надзор, диагностика, клиника, лечение и профилактика). М., 2001.-18 с.

80. Мешандин, А.Г. Проблемы потери активности сорбированых лигандов в гетерогенном иммуноферментном анализе / А.Г. Мешандин, Л.И. Ванеева, Т.А. Даргеева // Журн. микробиол. № 4. — 1994. — С.52-55.

81. Миграция птиц Восточной Европы и Северной Азии. Листообразные -пластинчатоклювые. М., 1979. — 217 с.

82. Результаты серологического и вирусологического обследования птиц на арбовирусы в Азербайджане / Н.М. Мирзоева и др. // Материалы VI симпозиума по изучению вирусов, экологически связанных с птицами. Омск, 1971. — С.88-89.

83. Некоторые особенности клиники лихорадки Западного Нила в Азербайджане / Н.М. Мирзоева и др. // Экология вирусов. М., 1976. -Вып. 4.-С. 77-82.

84. Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности: Методические указания 1.3.1794 03. -М., 2004. -38 с.

85. Муромец, В.И. Иммобилизованные олигомерные ферменты /В.И. Муромец, Е.К. Наградова. М.: Наука, 1984. — С. 10.

86. Неймарк, Н.Е. Синтетические минеральные адсорбенты и носители катализаторов / Н.Е. Неймарк . Киев: Наукова думка, 1982. — С. 15-19.

87. Онищенко, Г.Г. Об эпидемиологической ситуации и заболеваемости природноочаговыми инфекциями в Российской Федерации и мерах по их профилактике / Г.Г. Онищенко // Журн. микробиол. 2001. — № 3. -С. 23-28.

88. Онищенко, Г.Г. Распространение вирусных природно-очаговых инфекций в Российской Федерации и меры по их профилактике / Г.Г. Онищенко // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2000. — № 4. — С. 4-8.

89. Онищенко, Г.Г. Контроль и ликвидация инфекционных заболеваний -стратегическое направление здравоохранения / Г.Г. Онищенко // Журн. микробиол. 2002. — № 4. — С. 3-16.

90. Онищенко, Г.Г. Борьба с инфекционными болезнями приоритетная тема председательства Российской Федерации на саммите «Группы восьми» в 2006 г. / Г.Г. Онищенко // Журн. микробиол. — 2006 — №7. -С.3-7.

91. Стратегия борьбы с инфекционными болезнями и санитарная охрана территорий в современных условиях / Г.Г. Онищенко и др. //Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 2006. — Вып. 2(92). -С.5-9.

92. Получение ферромагнитного кремнезема, модифицированного карбонизированным лигнином и карбодиамидом, и его характеристика / Т.Н. Орлова и др. // Вестник Московского ун-та. Серия 2. Химия, 2008.- Т.49, №3. — С.213-216

93. Петров, В.А. Лихорадка Западного Нила (клиника, эпидемиология, диагностика, патоморфология и лечение): Автореф. дис. . доктора мед. наук / В.А. Петров. Москва, 2004. — 48 с.

94. Клиника и эпидемиология лихорадки Западного Нила в Волгоградской области (1999 и 2000 гг.) / В.А. Петров и др. // Вопр. вирусологии. -2001.-№4.-С. 22-26.

95. Писарев, В.Б. Моделирование лихорадки Западного Нила / В.Б. Писарев, A.M. Бутенко // Проблемы морфологии: Тез. докл. общерос. конф. с междунар. участием. М., 2002. — С. 61.

96. Гепатотропное действие вируса лихорадки Западного Нила / В.Б. Писарев и др. // Вопр. вирусологии. 2005. — № 1. — С. 37-38.

97. Морфологические изменения в ткани легких, миокарда и почек при экспериментальной лихорадке Западного Нила / В.Б. Писарев и др. //Вопросы вирусологии. — 2005а. №2. — С. 37-38.

98. Писарев, В.Б. Морфологические изменения в головном мозге мышей / В.Б. Писарев, Н.В. Григорьев, Т.А. Велик // Проблемы морфологии: Тез. докл. общерос. конф. с междунар. участием. М., 2002. — С. 61.

99. Плавильщиков, Н.Н. Определитель Насекомых. Краткий определитель наиболее распространенных насекомых Европейской части России /Н.Н. Плавильщиков. М.: Топикал, 1994. — 544 с.

100. Природно-очаговые инфекции в XXI веке в России / А.Е. Платонов и др. // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2009. — № 2. — С.30-35.

101. Плаченов, Т.Г. Разработка конструкции поромеров для изучения структуры пористых тел методом вдавливания ртути / Т.Г. Плаченов //Журн. практ. химии. 1965. — Т.28, № 3. — С. 245-253.

102. Применение количественной иммунофлуоресценции для определения адсорбционной способности магнитных иммуносорбентов / Г.Г. Под-золкова и др. // Журн. микробиол. 1988. — № 5. — С.56-58.

103. Покровский, В.И. Иммуноферментный анализ: современное состояние и тенденции развития / В.И. Покровский // Медицинская генетика и иммунология. -М., 1986. С. 4-5.

104. Померанцев, Б.И. Паукообразные иксодовые клещи (Ixodidae). Фауна СССР/ Б.И. Померанцев. М.-Л.: Изд-во Академии наук, 1950. — T.IV, Вып. 2. — 223 с.

105. Практическая химия белка. М: Мир, 1989. — С. 22-23.

106. Птицы Советского Союза. 1954. — Т.4. — 803 с.

107. Птицы России и сопредельных регионов: Совообразные, Козодоеобраз-ные, Стрижеобразньге, Ракшеобразные, Удодообразные, Дятлообразные. М., 2005. — 487 с.

108. Решетников, И.А. Изучение роли птиц в экологии арбовирусов Западного Нила и Синдбис в дельте реки Кубани / И.А. Решетников, В.В. Березин // Материалы VI симпозиума по изучению вирусов, экологических связанных с птицами. Омск, 1971. — С.92-93.

109. Изоляция вируса Западного Нила из иксодовых и аргасовых клещей, собранных в аридных районах Узбекистана / Г.А. Сиденко и др. // Экология вирусов. М., 1973. — Вып. 1. — С. 87-90.

110. Смородинцев, А.А. Реакция нейтрализации / А.А. Смородиицев //Современные методы иммунологической диагностики вирусных инфекций (научный обзор) / Под ред. А.А. Смородинцева и Н.А. Чайки. -М.: ВНИИМИ, 1981.-№4.-С. 3-7.

111. Обнаружение антител к арбовирусам у пролетных птиц южного Казахстана / А.В. Сурвилло и др. // Материалы VI симпозиума вирусов, экологически связанных с птицами. Омск, 1971. — С.73-74.

112. Сухоруков, A.M. Изучение сорбционных свойств поли стироловых планшетов, используемых в иммуноферментном анализе / A.M. Сухоруков, A.M. Пономарева // Журн. микробиол. 1987. — № 9. — С. 18-22.

113. Выявление вируса Западного Нила у птиц на территории Барабинской и Кулундинской низменностей (Западно-Сибирский пролетный путь) в летне-осенний период 2002г. / В.А. Терновой и др. // Вопр. вирусологии. 2004. — №3. — С. 52-55.

114. Генотипирование вируса Западного Нила, выявленного у птиц на юге Приморского края в течение 2002 2004 годов /В.А. Терновой и др. //Молекулярная генетика и микробиол. и вирусол. — 2006. — №4. — С. 30 -35.

115. Тертых, В.А. Особенности хемосорбции спиртов на поверхности кремнеземов / В.А. Тертых // Адсорбция и адсорбенты. 1983. — Вып. 11. — С. 3-11.

116. Тертых, В.А. Химические реакции с участием поверхности кремнезема / В.А. Тертых // Кремнеземы в медицине и биологии: Сб. науч. трудов. -Киев-Ставрополь, 1993. С.41-51.

117. Тертых, В.А. О размещении структурных гидроксильных групп на поверхности аэросила / В.А. Тертых , В.В. Павлов, К.И. Ткаченко // Тео-рет. и эксперим. химия . 1975. — Т 11, № 3.- С. 415-420.

118. Основные закономерности взаимодействия силанольных групп кремнезема с алкилхлорсиланами ряда Cln(CH3)4.n (N = О : 4) / В.А. Тертых и др. // Теорет. и эксперим. химия. 1975. — Т. 11, № 3. — С. 174-181.

119. Тертых, В.А. Химические аспекты иммобилизации ферментов на неорганической матрице / В.А. Тертых, В.В. Янишпольский // Адсорбция, Адсорбенты. Киев: Наукова Дума, 1980. — № 8. — С. 3-27.

120. Выделение вирусов Батан и Укуниеми и штаммов, близких к вирусу Западного Нила в Краснодарском крае /Ю.А.Тинкер и др. //Вестник Всесоюззного микробиологического общества. 1989. — Вып.1. — С.96-97.

121. Тюменцева, И.С. Индикация возбудителей особо опасных инфекций с помощью композиционных магноиммуносорбентов / И.С. Тюменцева,

122. C.72-77. Деп. в ВИНИТИ 25.01.95, № 221-В95.

123. Птицы СССР / В.Е. Флинт и др. М.: Мысль, 1968. — 637 с.

124. Фрайфельдер, Д. Физическая биохимия / Д. Фрайфельдер. М.: Мир, 1980. — 73 с.

125. Современные представления о защите организма от инфекций / P.M. Хайтов и др. // Иммунология. 2000. — №1. — С. 61-64.

126. Хохлов, А.Н. Сравнительная экология и практическое значение массовых видов врановых птиц в антропогенных ландшафтах Ставропольского края: Автореф. дис. . канд. биол. наук /А.Н. Хохлов. М., 1983. -16 с.

127. Хохлов, А.Н. Животный мир Ставрополья / А.Н. Хохлов. Ставрополь, 2000. — 196 с.

128. Хохлов, А.Н., Илыох М.П. Позвоночные животные Ставрополья и их охрана: Учебное пособие к спецкурсу / А.Н. Хохлов, М.П. Ильюх. -Ставрополь, СГУ, 1997. 103 с.

129. Хохлов, А.Н. Зимующие птицы Ставропольского края и сопредельных территорий / А.Н. Хохлов, З.И. Хохлова, М.П. Илыох. //Учебное пособие к спецкурсу. Ставропольспецсервисшкола. Изд-во 2-е. — 2005. -94 с.

130. Генетическое разнообразие инфекционных агентов, переносимых ик-содовыми клещами в г. Томске и его пригородах /Е.В. Чаусов и др. //Паразитология, 2009. Т. 43. — Вып. 5. — С.374-388.

131. Черкасский, Б.Л. Особо опасные инфекции. Справочник / Б.Л. Черкасский. М.: Медицина, 1996. — С. 105-106.

132. Освоение комарами урбаценозов городов Ставропольского края / И.В. Чумакова и др. // Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней: Сб. науч. трудов. М., 2006. — Вып. 8. — С. 676-678.

133. Орнитофильные комары (Diptera, Culicidae) Ставропольского края / И.В. Чумакова и др. // Проблемы энтомологии Северо-Кавказского региона: Материалы 1-й Всероссийской науч.-практ. интернет конференции. — Ставрополь: «Агрус», 2006. — Вып.2. — С. 33-35.

134. Шальнев, В.А. Ландшафты Северного Кавказа: эволюция и современность / В.А. Шальнев. Ставрополь: Изд-во СГУ, 2004. — 265 с.

135. Выбор критериев пригодности твердофазных носителей на основе полистирола для проведения иммуноферментного анализа / К.Л. Шаха-нина и др. // Журн. микробиол № 9. — 1987. — С.8-11.

136. Изучение иммуноструктуры населения Астраханской области к вирусу Западного Нила в 1998 и 1999 гг. / Е.О. Шишкина и др. // Вопр. вирусологии. 2002. — №6. — С. 13-17.

137. Экология и распространение арбовирусов на территории Саратовской области / С.А Щербакова и др. // Журн. микробиол. 2005. — №5. -С. 27-30.

138. Результаты исследования сывороток крови населения Саратова на антитела к арбовирусам / С.А Щербакова и др. // Вопр. вирусологии. -2002. №3. — С. 32-34.

139. Диагностическая значимость метода ПЦР при обследовании больных с HCV инфекцией / Н.Д. Ющук и др. // Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний. М., 1998. — С. 70-79.

140. К изучению участия перелетных птиц в распространении арбовирусов и вирусов гриппа в лесостепи Западной Сибири / В.К. Ястребов и др. // Вирусологические исследования на Дальнем Востоке: Труды биолого-почвенного института. 1975. — Вып.2. — С. 8-12.

141. Alexiou, C.R. Medical applications of magnetic nanoparticles /C.R. Alexiou C.R., R. Jurgons, C. Seliger // J. Nanosci Nanothenol. 2006. — Vol. 6, N 9-10.-P. 2762-2768.

142. Bangs, L.B. New developments in particle-based immunoassays:.В introduction / L.B. Bangs // Pure & Appl. Chem. 1996.- Vol. 68, N 10. — P. 1873 -1879.

143. Berncopf H., LevinS., Nerson R. Isolat of West Nile virus in Israel / H. Berncopf, S. Levin, R. Nerson // J. infect. Dis. Vol. 93. — P. 207-218.

144. Biggerstaff B.T., Peterson L.R. //Trastusion. 2002. — Vol.43. — P.1007-1026.

145. Detectin andenrichmentof disseminated renal carcinoma cells from peripheral blood by immunomagneticell separation / U.H. Bilkenroh et al. //Int. J. Cancer. 2000. — Vol. 92(4). — P. 577-582.

146. Identification of a Kunjin/West Nile-like flavivirus in Brains of patients with New York encephalitis (letter) / T. Briese et al. // Lancet. 1999. — Vol. 354.-P. 1261-1262.

147. Detection and manipulation of biomolecules by magnetic carriers / M. Brzeska et al. // J. Biotechnol. 2004. — Vol. 112, N 1-2. — P. 25 — 23.

148. Bumey, M.I. Role of arthropod born viruses in humen diseases in Rawalpindi and Peshawar area. II. Isolation of West Nile virus from area. Pakistan /М.1. Bumey, A.H. Munir//J. Med. Res. 1966. — N 5. — P. 271-284.

149. Centers for Disease Control and Prevention. Donations Update: of West Nile virus in blood detection — United Stats 2003 ||Morbid. Mortal. Wkly Rep. — 2003a. — Vol. 52. — P. 769-772.

150. Clinical and neuropathological features of West Nile virus equine encephalomyelitis in Italy / C. Cantile et al. // Equine vet. L 2000. — N 32 (1). -P. 31-35

151. New trends in immunoassays /Y.C. Cheung et al. //Adv Biochem Eng Biotechnol. 2008. -Vol. 109. — P. 123 — 154.

152. Clark, M.F. Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant virus / M.F. Clark, A.N. Adams // J. Gen. Virol. 1977. — Vol.36, N 3. — P. 475-483.

153. Clarke D.H. нет названия статьи / D.N. Clarke, J. Casals // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1958. — Vol. 7. — Р/ 561-573.

154. Cornel, A.J. Environmental temperature on the vector competence of Culex univittatus (Diptera, Culicidac) for West Nile virus / A. J. Cornel, P.G. Jupp, N.K. Blackburn // J. Med. Entomol.- 1993. Vol. 30. — P. 449-456

155. Detection of West Nile virusin blood donations-Umted States 2002 ||Morbid. Mortal. Wkly Rep. 2003. — Vol. 52. — P. 769-772.

156. Справочник биохимика / Досон P. и др.. М.: Мир, 1991. — С. 326.

157. Dodin, A. Diagnostic du vibrion Cholerique au laboratoire / A. Dodin, B. Goud // Bull. Soc. Patol. Exot. 1989. — Vol.76. — P. 644-651.

158. Engvall, E. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)/ III. Quantitation of specific antibodies by enzyme-labelled antiimmunoglobulin in antigen-coated tubes / E. Engvall, P. Perlmann // J. Immunol. — 1972. -Vol.1009, N9.-P.129-135.

159. Fanquet, C.M. Taxonomy and classification-general / C.M. Fanquet //Encyclopedia of Virology / Ed. R.G. Webster, A. Granoff. London, 1994,-Vol.3.-P. 1396-1410.

160. Gijs, M.A. Magnetic particle handling Microsystems for miniaturized analytical applicatons / M.A. Gijs // Conf. Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. -2007. P.4088 -4089.

161. Grinde, B. Sensitive detection of group A rotaviruses by immunomagnetic separationand reverse transcription-polimerase chain / B. Grinde, Т.О. Jo-nanssen, H. Ushijima // J. Virol. Methods. 1995. — Vol. 55, N 3. — P. 32738.

162. Gnyka, G. Inhibition of passive hemagglutination a sensitive test for host antigen detection and evaluation of virus purity / G. Gnyka, A. Pascaru // Rev. Roum. Med. Ser. virol. — 1976. — Vol. 27, N 3. — P. 167-172.

163. West Nile virus infection of Thoroughbred horses in South Africa (2000 -2001) /АJ.Guthrie et al. // Equine Vet. Journ. 2003. — Vol.35 (6). — P. 601-605.

164. Hammam, H.M. Further observation on gegraphic variation it the antigenic character of West Nile and Japanese B. viruses / H.M. Hammam, W.H.

165. Price//Amer. J. Epidemiol. 1966. — Vol. 83 — P. 113-122.

166. Hayes, C.G. West Nile fever. In the arboviruses: epidemiology and ecology. CRC Press, Boca Raion / C.G. Hayes. Florida, 1989. — Vol. V. (T.P. Mo-nath. ed.). — P. 59-88.

167. Haukanes, B.I. Application of magnetic beads in bioassays / B.I. Haukanes, C. Kvam//Biotechnology (NY). 1993. Vol. 11, N 1. — P. 60-63.

168. Hubalek, Z. West Nile fever a reemerging mosquito-born viral disease in Europe / Z. Hubalek, J. Halouzka // Emerg. Infect. Dis. — 1999. — Vol. 5, N 5.-P. 643-650.

169. Hurbut, H.S. West Nile infections in arthropods / H.S. Hurbut //Amer. J. Trop. Med. Hyg. 1956. — Vol. 5. — P. 76-85.

170. Experimental studies on the susceptibility of domestic pigs to West Nile virus followed by Japanese encephalitis virus infection and vice versa / M.A. Iekal et al. // Acta virol. 1994. — №.38 (3). — P. 157-161.

171. Viral Load at Crimean-Congo Hemorrhagic Fever and Its Clinical Significance / L.S. Karan et al. // Int. Conf. on Emerging Infect. Dis, Feb. 29-March 3, 2004. Atlanta, 2004. — P. 125.

172. Kemshead, J.T. Magnetic separation techniques: their application to medicine / J.T. Kemshead, J. Ugelstad // Mol. Cell. Biochem. 1985. — Vol. 67, N l.-P. 11-18.

173. Complete genome sequences and phylogenetic analysis of West Nile virus strains isolated from the United States, Europe, and the Middle East. /R.S. Lanciotti et al. //Virology. 2002. — Vol. 298 (1). — P. 96-105.

174. Lange , W. Der Nachweis von Hepatitis В (Surface) Antigen mit den He-patest / W. Lange, H. Kohler, J. Apodaca // Dtsch. med. Wschr. 1976. -Vol. 101, N35.-P. 1273-1276.

175. Magnetic monosired polymer pasticles for fast and specific fractionation of human mononuclear cells / T. Lea et al. // Scand. J. Immunol. 1985. -Vol. 22, N2. — P. 207-216.

176. Lindenbach, B.D. Fundamental Virology 4-th ed. Flaviviridae: The virusesand their replication / B.D. Lindenbach, C.M. Rice //Eds. Knippe D.M., Howley P.M. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins Press. 2001. -P. 589-641.

177. Isolation of two strains of West Nile virus during an outbreak in Southern Russia / D.K. Lvov et al. // Ibid. 2002. — Vol. 6 — P.373-376.

178. West Nile and other zoonotic viruses as examples of emerging-reemergig situations in Russia / D.K. Lvov et al. //Arch. Virol. 2004. — Suppl. 18. -P. 85-86.

179. Luby, I.P. St. Louis encephalitis, Rocio encephalitis and West Nile fever / LP. Luby // Exotic virus Infections. Kaas Handbook of Infectious Diseases / Ed. J.S. Porterfild. London, 1995. — P. 193-202.

180. Mackenzie, G.S. Complete genome sequences and phylogenetic ana- lysis of West Nile virus strains isolated from United States, Europe, and the Middle East /G.S. Mackenzie, D.W. Smith, R.A. Hall //Virology. 2002. — Vol. 298(1).-P. 96-105.

181. Magnani, M. The use of magnetic nanoparticles in the development jf new molecular detections system / M. Magnani, L. Galluzzi, I.J. Bruce // J. Na-nosci Nanotechnil. 2006. — Vol. 6, N 8. — P.2302 — 2311.

182. Manuelidis, E.E. Neuropathology of experimental West Nile virus infection in monkeys / E.E. Manuelidis // J. Neuropathol. experim. Neurol. 1956. -N15(4).-P. 448-460.

183. Recovery of Cryptosporidium oocysts and cysts from source water concentrates using immunomagnetic separation / R.M. McCuin et al. // J. Microbiol. Methods. 2001. — Vol. 45, N 2. — P. 69-76.

184. Mcintosh. B.M. Susceptibility of some African wild rodents to infection with various arthropod-born viruses / B.M. Mcintosh // Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg.- 1961.-Vol. 55.-P. 63-68.

185. Mcintosh, B.M. Ecological studies on Sindbis and West Nile viruses in South Africa. 5. The response of birds to inoculation of virus / B.M. Mcintosh, D.B. Dickinson, J.M. McGillivray // S. Afr. J. Med. Sci 1969.1. Vol. 34.-P. 77-82.

186. Isolation from humansera in Egypt of a virus apparently identical to West Nile virus / J.L. Melnick et al. // Proc. Soc. Exp. Biol. (N.Y.). — 1951. — Vol. 77.-P. 661-665.

187. West Nile virus isolation from equines in Argentina / M.A.Morales et al. //Emerg. Infect. Dis.- 2006.-Vol. 12.-P. 1559-1561.

188. Muller, J. Factors affecting the activity of immobilized enzymes. I. Diffu-sional limitation / J. Muller, G. Pfleiderer // Hoppe-Seylers Ztschr.physiol. Chem- 1980. Vol. 361, N 5. — P. 675-680.

189. Virus taxonomy classification and Nomenclature of viruses / F.A. Murphy et al. // Arch, virol. 1970. — Vol. 10. — P. 320-325.

190. Rapid diagnosis of enterovirus infection by magnetic bead extraction and polymerase chain reaction detection of enterovirus RNA in clinical specimens / P. Muir et al. //J. Clin. Microbiol. 1993. — Vol. 31, N 1. — P. 31-38.

191. Nakane, P.K. Peroxidase-labelled antibody a new method of conjugation / P.K. Nakane, A. Kawaoi // J. Histochem. Cytochem. 1974. — Vol.22, N 4. -P. 506-508.

192. Magnetic separation techniques in diagnostic microbiology / O. Olsvik et al. // Clin. Microbiol. Rev. 1994. — Vol. 7, N 1. — P. 43 — 54.

193. Isolation of the West Nile virus in a Camargue horse stricken with encephalomyelitis / R. Pantier et al. // Presse med. 1966. — Vol. 74. — P. 2495.

194. Peirs J.S.M., Amerasighe F.P. West Nile fever / J.S.M. Peirs, F.P. Amera-sighe // Handbook of Zoonoses / Ed. J. Beran. — 2-nd Ed. Boca Raton, 1994.-Sect. В.-P. 139-148.

195. Peruski, A.H. Immunological methods for detection and identification of infectious disease and biological warfare agents / A.H. Peruski, L.E. Peruski // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2003 — Vol. 10, N 4. — P. 506-513.

196. The fractionation of protein mixtures by linear polymers of higth molecular weigh / A. Poison et al. // Biochem. Biophis. Acta. 1964. — Vol. 82. — P. 463-475.

197. Detection of West Nile virus by the polymerase chain reaction and analysis of nucleotide sequence variation / K.R. Poner et al. // Am. J. trop. Med. Hyg. 1993.-N. 48(3). — P. 440-446.

198. Porterfield, J.S. Encephalitis viruses and related viruses causing hemorrhagic disease / J.S. Porterfield // Encyclopedia of Virology // Ed. R.G. Webster, A. Granoff. 1994.-Vol.1.-P. 361-367.

199. Pilot scale affininity chromatography: purification of beta-galactosidase / P.J. Robinson et al. // Biotechnol. Bioeng. 1974. — Vol. 16, N 8. -P.1103-1112.

200. Roitt, Ivan (Ройт А.) Иммунология. Пер. с англ./ I. Roitt. M.: Мир, 2000.-592 с.

201. Phylogeny of the genus Flavivirus / G. Runo et al. // J. Virol. 1998. — Vol. 72.-P. 73-83.

202. Schmidt, J.R. West Nile fever. A. review of its clicical, epidemiological and ecologic features / J.R. Schmidt // S. Afr. Med. J. 1965. — Vol. 42. — P. 207-212.

203. Schmidt, J.R. Isolation of West Nile virus from the African birds Argasid Argas reflexus hermanni in Egypt / J.R. Schmidt, M.I. Saul // J. med. Ento-mol.- 1964.-Vol.1.-P. 83-86.

204. Shinkai, M. Functional magnetic particles for medical application / M. Shin-kai, 1. Ito //And. Biochem. Eng. Biotechnol. 2004. — Vol. 91. — P. 191220.

205. Sladaugh, W.H., Parson T.D. (Слейбо У, Персонс Т.) Полимерные ионы / W.H. Sladaugh, T.D. Parson // Общая химия. М., 1979. — С. 375-386.

206. Smith, К.О. Magnetic transfer devices for use in solid-phase radioimmunoassays and enzym-linked immunosorbent assay / K.O. Smith, W.D. Gehl // J. Infect. Diss. 1977. — Vol.136. — P.5328-5336.

207. A neurotropic virus isolatet from the blood of a native in Uganda / K.C. Smithburn et al. // Amer. J. Trop. Med. 1940. — Vol.20. — P.471-492.

208. A study of the ecology of West Nile virus in Egypt / R.V. Taylor et al. //Q

209. Amer. J. Trop. Med. Hyg. 1956. — Vol. 5. — P. ^/9-620.

210. West Nile encephalitis epidemic in southeastern Romania / T.F. Tsai et al. //Lancet. 1998. — №0/352 (9130). — P. 767-771.

211. Varma, M.G.R. Preliminary studies on the infection of Culicinae mosquitoes with the Tamilnadu strain of West Nile virus / M.G.R. Varma //Indian J. Med. Res. 1960. — Vol. 48. — P. 537-538.

212. Warburg, O. Isolierung und Kristallisation des Garugsterments Enolase / O. Warburg, W. Christian // Biochem. Z. 1941. — Vol.310. — P.384-421.

источник