Наставлением по диагностике паратуберкулеза паратуберкулезного энтерита животных от 2001

Инструкции о мероприятиях по профилактике и ликвидации паратуберкулезного энтерита (паратуберкулеза) крупного рогатого скота

НАСТАВЛЕНИЕ ПО ДИАГНОСТИКЕ ПАРАТУБЕРКУЛЕЗНОГО ЭНТЕРИТА (ПАРАТУБЕРКУЛЕЗА) КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Внутрикожный метод туберкулинизации

Приложение к “Инструкции о мероприятиях по профилактике и ликвидации паратуберкулезного энтерита (паратуберкулеза) крупного рогатого скота” от 18 августа 1975 г.
НАСТАВЛЕНИЕ ПО ДИАГНОСТИКЕ ПАРАТУБЕРКУЛЕЗНОГО ЭНТЕРИТА (ПАРАТУБЕРКУЛЕЗА) КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Для диагностики паратуберкулеза у крупного рогатого скота применяют клинический, аллергический, серологический, бактериологический и гистологический методы исследований.

1.1. Для аллергической диагностики паратуберкулеза применяют двойную внутрикожную пробу альттуберкулином для птиц.

1.2. Альттуберкулин для птиц представляет собой стерильный, выпаренный до 1 /₁₀ первоначального объема фильтрат убитых культур возбудителя туберкулеза птичьего типа, имеющий вид прозрачной жидкости темно-бурого цвета, вязкой консистенции, обладающей специфическим запахом.

1.3. Срок годности альттуберкулина для птиц – 5 лет со дня выпуска биофабрикой при условии хранения в темном прохладном помещении.

1.4. Каждую ампулу (флакон) с альттуберкулином перед применением просматривают. При обнаружении в них каких-либо примесей, плесени, хлопьев, трещин стекла, отсутствия этикетки ампулы (флаконы) выбраковывают. Использование остатков препарата из открытых ампул (флаконов) на следующий день не допускается.

1.5. Для введения туберкулина используют тонкие иглы для внутрикожных инъекций из нержавеющей стали и шприцы с бегунком емкостью 1 или 2 мл. Шприцы и иглы стерилизуют кипячением в дистиллированной или кипяченой воде без добавления дезинфицирующих средств.

1.6. Туберкулин вводят крупному рогатому скоту внутрикожно в области средней трети шеи. Перед введением туберкулина волосы в месте инъекции выстригают, кожу обрабатывают 70°С спиртом.

1.7. Туберкулин применяют в следующих дозах: животным в возрасте до 2 лет – 0,2 мл, от 2 до 3 лет – 0,3 мл, старше 3 лет – 0,4 мл.

1.8. Вводить туберкулин в кожу, имеющую травматические повреждения, уплотнения, абсцессы, пораженную грибами или клещами, запрещается.

1.9. Не разрешается исследовать аллергическим методом истощенных животных, маток за неделю до родов и в течение недели после родов, а также животных в течение 2 недель после вакцинации.

1.10. Учет и оценку реакций после первого введения туберкулина проводят через 48 часов. Положительно реагирующим животным повторно туберкулин не вводят. Остальным – сомнительно реагирующим и нереагирующим животным – туберкулин вводят повторно, в то же место и в тон же дозе. Учет реакций на повторное введение туберкулина проводят через 24 часа. Результаты исследования записывают в ведомости против каждого исследованного животного.

1.11. У крупного рогатого скота внутрикожная реакция на туберкулин проявляется в месте инъекции препарата в виде разлитого отека, напряженного в центре и тестоватой консистенции к краям, не имеющего, как правило, строгих границ, болезненного и горячего на ощупь.

Интенсивность проявления указанных признаков зависит от физиологического состояния животного. У животных с низкой упитанностью или клиническим проявлением болезни реакция может быть слабо выражена или отсутствовать.

1.12. Реакцию учитывают по наличию указанных признаков и по результатам измерения толщины кожной складки в месте введения туберкулина. Утолщение кожной складки измеряют штангенциркулем только у животных, имеющих реакцию на туберкулин, и сравнивают с толщиной кожи на другой стороне шеи или рядом с припухлостью. При наличии указанных признаков и утолщении кожной складки на 7 мм и более реакцию считают положительной. При наличии менее выраженных признаков воспаления и утолщении кожной складки от 5 до 7 мм реакцию считают сомнительной.

При отсутствии изменений или наличии безболезненных, холодных, отграниченных затвердений, если даже толщина кожной складки увеличивается более 5 – 7 мм, реакцию признают отрицательной.

источник

Приложение. Наставление по диагностике паратуберкулезного энтерита (паратуберкулеза) крупного рогатого скота

Приложение
к «Инструкции о мероприятиях по
профилактике и ликвидации
паратуберкулезного
энтерита (паратуберкулеза)
крупного рогатого скота»
от 18 августа 1975 г.

Наставление
по диагностике паратуберкулезного энтерита (паратуберкулеза) крупного рогатого скота

Для диагностики паратуберкулеза у крупного рогатого скота применяют клинический, аллергический, серологический, бактериологический и гистологический методы исследований.

1. Внутрикожный метод туберкулинизации

1.2. Альттуберкулин для птиц представляет собой стерильный, выпаренный до 1/10 первоначального объема фильтрат убитых культур возбудителя туберкулеза птичьего типа, имеющий вид прозрачной жидкости темно-бурого цвета вязкой консистенции, обладающей специфическим запахом.

1.3. Срок годности альттуберкулина для птиц — 5 лет со дня выпуска биофабрикой при условии хранения в темном прохладном помещении.

1.7. Туберкулин применяют в следующих дозах: животным в возрасте до 2 лет — 0,2 мл, от 2 до 3 лет — 0,3 мл, старше 3 лет — 0,4 мл.

1.10. Учет и оценку реакций после первого введения туберкулина проводят через 48 часов. Положительно реагирующим животным повторно туберкулин не вводят. Остальным — сомнительно реагирующим и нереагирующим животным — туберкулин вводят повторно в то же место и в той же дозе. Учет реакций на повторное введение туберкулина проводят через 24 часа. Результаты исследования записывают в ведомости против каждого исследованного животного.

1.11. У крупного рогатого скота внутрикожная реакция на туберкулин проявляется в месте инъекции препарата в виде разлитого отека, напряженного в центре, тестоватой консистенции к краям, не имеющего, как правило, строгих границ, болезненного и горячего на ощупь.

При отсутствии изменений или наличии безболезненных, холодных, отграниченных затвердений, если даже толщина кожной складки увеличивается более 5-7 мм, реакцию признают отрицательной.

2. Серологическая диагностика

2.1. Реакцию связывания комплемента (РСК) проводят в соответствии с временным наставлением по постановке реакции связывания комплемента для диагностики паратуберкулеза крупного рогатого скота и овец с антигеном Сибирского научно-исследовательского ветеринарного института.

3. Бактериологический и гистологический методы исследования

3.1. Лабораторный диагноз на паратуберкулез ставят на основании положительных результатов бактериоскопического и гистологического исследований. При необходимости проводят бактериологическое исследование.

3.2. От подозреваемых в заболевании паратуберкулезом животных собирают фекалии и пересылают их в лабораторию в закрытых пробирках или баночках.

Из фекалий выбирают комочки слизи или обрывки слизистой оболочки и, растирая их на предметных стеклах, готовят мазки.

3.3. Для посмертного бактериологического и гистологического исследований отбирают 3-5 различных участков тонкого отдела кишечника и 2-4 брыжеечных лимфатических узла, кусочек илеоцекальной заслонки с прилегающим лимфатическим узлом. При этом желательно отбирать измененные участки кишечника (с утолщенными стенками, с выраженной складчатостью слизистой оболочки) и увеличенные лимфатические узлы.

Для бактериологического исследования отобранный материал можно консервировать стерильным 30%-ном водным раствором глицерина или замораживанием. Для проведения бактериологического исследования отрезки кишечника и лимфатические узлы необходимо помещать в разные банки. Материал для гистологического исследования в обязательном порядке фиксируют в 10%-ном растворе формалина (одна часть продажного формалина на 9 частей воды).

3.4. Бактериоскопическое исследование. Для исследования готовят 4-6 мазков и окрашивают их по методу Циля-Нильсена. В каждом мазке просматривают до 50 полей зрения. При этой окраске темно-красные микобактерии паратуберкулеза располагаются на синем фоне палисадами (частоколом) или кучками по две, три и больше, что является характерным для возбудителя этой болезни. При обнаружении в мазках единичных и нетипично расположенных кислотоустойчивых бактерий из исследуемого материала повторно готовят и просматривают 4-6 мазков.

3.5. Гистологическое исследование. Для исследования вырезают кусочки из стенки кишечника шириной до 2 мм и лимфатических узлов не толще 2 мм. Отмывают их 2-3 часа в проточной воде от формалина. Проводят через серию спиртов и заливают в целлоидин, наклеивают на деревянные блоки и готовят срезы толщиной 10-15 микрометров. Часть препаратов окрашивают гематоксилин-эозином, а для обнаружения возбудителя — по Цилю-Нильсену.

Гистологические изменения при паратуберкулезном энтерите отличаются от других энтеритов наличием типичных разростов эпителиоидных клеток, располагающихся диффузно и в виде гранулем. Среди эпителиоидных клеток находятся и гигантские клетки типа Лангганса. Разросты эпителиоидных клеток располагаются в слизистой оболочке кишечника, а иногда и в подслизистом слое. При этом ворсинки слизистой оболочки увеличены, часто сливаются и имеют вид колбообразных вздутий. Некоторые ворсинки сдавлены и атрофированы. Либеркюновые железы также подвергаются атрофии.

В брыжеечных лимфатических узлах эпителиоидные клетки располагаются преимущественно в краевых и центральных синусах, а в лимфатических сосудах — в их стенках (продуктивный эндолимфангит).

В срезах, окрашенных по Цилю-Нильсену, микобактерии паратуберкулеза находятся в эпителиоидных и гигантских клетках и реже вне их.

3.6. Бактериологическое исследование. Кусочки лимфатических узлов и отдельно соскобы (ткань) слизистой оболочки и подслизистого слоя кишечника в количестве 4-5 г измельчают ножницами до 2-3 мм, помещают в разные стерильные ступки, покрытые стерильной пергаментной бумагой. Лимфатические узлы заливают 3%-ным раствором серной кислоты в соотношении 1:10, а слизистую оболочку кишечника — 6%-ным раствором этой кислоты и выдерживают 10-15 минут. Затем раствор серной кислоты сливают, а материал заливают в зависимости от концентрации серной кислоты на 5 или 10 минут соответственно стерильным физиологическим раствором в таком же объеме. Физиологический раствор сливают, кусочки материала растирают и суспендируют в небольшом количестве стерильного физиологического раствора. Высевают на модифицированную казеиновую среду Дюбо-Смита с добавлением фактора роста (экстракт из микобактерий тимофеевой травы) и для контроля — на среду Петраньяни. Посевы выдерживают в термостате при 38°С в течение 3-4 месяцев. Рост возбудителя паратуберкулеза на средах при сильном обсеменении тканей появляется через 18-20 дней, из слабо обсемененных — до 3 месяцев. Культуры вырастают в виде плоских колоний с неровными краями и ядром в центре. В дальнейшем они принимают бугристый вид. Для идентификации выделенную культуру высевают на казеиновую среду Дюбо-Смита с фактором роста и без него. Возбудитель паратуберкулеза в первых генерациях размножается на питательной среде только в присутствии фактора роста. Микобактерии паратуберкулеза непатогенны для лабораторных животных.

3.7. Приготовление питательной среды для бактериологического исследования.

а) Состав модифицированной казеиновой питательной среды Дюбо-Смита

источник

Для диагностики можно использовать подкожную пробу и внутрикожную двойную пробу. В том и другом случае используется птичий туберкулин.

К аллергической диагностике паратуберкулезного энтерита прибегают только в хозяйствах, в которых точно установлены случаи болезни, при помощи клинико-бактериологической или гистологической диагностики, а также в в соседних фермах, если не исключается возможность соприкосновения здоровых и больных животных.

Клинически больные предварительно удаляются из стада на убой, а затем скот неблагополучного хозяйства исследуется на паратуберкулез. Допускается одновременное исследование на туберкулез и паратуберкулезный энтерит. Если при этом используется внутрикожная проба, то последние производятся по обе стороны шеи.

Внутрикожная проба (двойная) производится на шее. Шерсть предварительно выстригается и кожа очищается и дезинфицируется. Нормальная толщина кожной складки у здоровых коров равна 5—7—9 мм, а у быков 10—15 мм и выше.

Птичий туберкулин вводится в толщу кожи в дозе: телятам до 3 месяцев 0,1 мл, от 6 до 12 месяцев 0,15 мл, от 1 до 2 лет 0,2 мл, от 2 до 3 лет 0,3 мл, и свыше 3 лет 0,4—0,5 мл, в зависимости от состояния животного. Если после введения препарата под пальцем не ощущается образования пузырька величиной с горошину, то это означает, что аллерген введен неправильно. Инъекция в этом случае повторяется.

Через 48 часов после введения аллергена учитываются результаты первой пробы: отмечается характер кожной реакции и измеряется штангенциркулем толщина кожной складки, причем утолщение должно быть на изгибе складки.

Животные, давшие положительную реакцию, дальнейшему испытанию не подвергаются. Всем остальным животным аллерген вводится вторично в то же самое место и в той же дозе. На этот раз реакция учитывается через 24 часа после введения аллергена. Первая инъекция в этом случае является сенсибилизирующей, а вторая—диагностической.

Положительная реакция характеризуется появлением разлитого, болезненного, горячего на ощупь отека и утолщением кожной складки более, чем на 7 мм сверх нормы, установленной до введения препарата. Сомнительная реакция считается при менее выраженных воспалительных явлениях со стороны кожи и увеличения складки по сравнению с нормой на 5—7 мм. Неспецифические отграниченные, безболезненные затвердения, превышающие 5— 7 мм, за типичную аллергическую реакцию не принимаются. Реакции, возникшие раньше 48 часов после введения туберкулина, также не учитываются.

При наличии сомнительных и неопределенных результатов через 5—10 дней производится повторное испытание туберкулиновой пробой на другом участке кожи или на другой стороне шеи. При вторичном неопределенном результате немедленно применяется подкожная проба, по результатам которой делается окончательное заключение о наличии паратуберкулеза у того или иного животного.

Следует иметь в виду, что двойная внутрикожная проба не препятствует применению подкожной пробы до и после нее. Телят можно испытывать внутри-кожной пробой начиная с месячного их возраста.

Подкожная проба. При подкожном применении птичьего туберкулина должны быть созданы условия покоя. Животные привязываются на базах к кормушкам, в жаркие дни под навесом или в хорошо вентилируемых Помещениях. Животные обеспечиваются сочными кормами.

Термометры закрепляются за определенными животными. Устанавливается среднесуточная температура путем троекратного измерения ее в 6,12 и 18 часов, обязательно до водопоя и не ранее чем через 2 часа после водопоя. Животные с нормальной температурой допускаются к подкожной туберкулинизации.

Птичий туберкулин для диагностики паратуберкулезного энтерита применяется в виде 20%-ного раствора его в 0,5%-ной карболовой воде. Приготовленный раствор фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют путем кипячения в течение часа или в автоклаве. Дозы для взрослых животных 10 мл, для молодняка в возрасте до 2 лет 6—8 мл. Туберкулин вводится подкожно на шее.

Непосредственно после туберкулинизации животных необходимо напоить и в дальнейшем, до окончания исследования водопоя не производится во избежание колебаний температуры.

У больных животных подкожное введение птичьего туберкулина вызывает повышение температуры, явления угнетения, потерю аппетита, усталость, дрожание мускулатуры и иногда появление поноса. На месте введения препарата отмечается появление воспалительного отека различной величины.

После введения туберкулина измерение температуры производится через каждые 2 часа на протяжении 12—20 часов, спустя 4 часа после введения препарата.

Положительной реакцией считается температурная с подъемом до 40,0° и выше, но превышающая нормальную температуру не менее, чем на 1°.

Сомнительная реакция характеризуется подъемом температуры от 39,7 до 40,0° и не менее 0,7° выше нормальной. Если температура начинает повышаться спустя 10—12 часов после введения птичьего туберкулина, то такая реакция считается отрицательной и дальнейшее измерение температуры прекращается. Отсутствие температурного подъема и подъем температуры до 0,7° говорит об отрицательной реакции.

Следует учесть, что у большинства животных в предклинической и клинической стадии болезни, а также у тяжело больных термической реакции на введение туберкулина не наблюдается.

Во избежание абортов нельзя производить подкожную туберкулинизацию у коров за 2 месяца до отела вследствие сильной термической реакции и спустя 1/2 месяца после отела, чтобы не сделать ошибочных выводов на основании колебаний температуры по случайным причинам.

Не следует применять подкожную пробу у телят до 6-месячного возраста, учитывая у них значительную лабильность нормальной температуры.

У овец аллергическое исследование на паратуберкулезный энтерит производится неразведенным птичьим туберкулином, который вводится в кожу на внутренней поверхности бедра в дозе 0,3 мл.

Согласно временной инструкции учет реакции производится через 48 часов после введения туберкулина. Появление на месте введения ясно выраженной болезненной отечности и гиперемии с местным повышением температуры рассматривается как положительная реакция. Неясно выраженные признаки расцениваются как сомнительная реакция. При отсутствии местных изменений реакция считается отрицательной.

Животные, давшие сомнительную реакцию, содержатся отдельно от здоровых животных и через месяц исследуются повторно. В неблагополучном хозяйстве повторный сомнительный результат расценивается как положительная реакция. Овцы, давшие отрицательную реакцию, возвращаются в отару здоровых. Клинически больные паратуберкулезом немедленно удаляются без аллергического исследования.

источник

МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ПАРАТУБЕРКУЛЕЗА

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО СТАНДАРТАМ

РАЗРАБОТАН Министерством сельского хозяйства СССР ИСПОЛНИТЕЛИ

Н. П. Овдиенко, В. А. Шаров, В. Е. Щуревский, Н. И. Данилова, Н. А. Ива нова, О. В. Якушева, А. Н. Шаров, Э. С Плотников

ВНЕСЕН Министерством сельского хозяйства СССР

Зам. начальника Главного управления ветеринарии Л- П, Рахманин

УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государст венного комитета СССР по стандартам от 9 января 1984 г. № 46

УДК 636.576.8.07 : 006.354 Группа С79

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

Методы лабораторной диагностики паратуберкулеза

Agricultural animals. Methods of laboratory diagnostics of paratuberculosis

Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 9 января 1984 г. Но 46 срок действия установлен

Несоблюдение стандарта преследуется по закону

Настоящий стандарт распространяется на крупный и мелкий рогатый скот и устанавливает методы лабораторной диагностики заболевания паратуберкулезом, вызываемого микобактериями М. paratuberculosis.

Стандарт применяют при диагностировании заболевания в лабораториях ветеринарных научно-исследовательских институтов, республиканских и областных (краевых) ветеринарных лабораториях.

Стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 3458—81.

1.1. Для бактериоскопического исследования берут от живых животных не менее 10 см 3 фекалий и соскобы слизистой оболочки прямой кишки.

От павших или убитых животных берут не менее трех-—пяти различных участков подвздошной кишки, два—четыре брыжеечных лимфатических узла, кусочек илеоцекальной заслонки с прилегающим лимфатическим узлом. При отборе патологического материала прежде всего берут измененные участки кишечника с утолщением, выраженной складчатостью слизистой оболочки и увеличенные лимфатические узлы.

1.2. Пробы патологического материала (отрезки кишечника, лимфатические узлы) для проведения культурального исследования замораживают или консервируют стерильным 30%-ным раствором глицерина.

Перепечатка воспрещена © Издательство стандартов, 1984

Отрезки кишечника и лимфатические узлы помещают в разные стерильные пакеты из пергаментной бумаги или банки.

1.3. Для гистологического исследования отрезки кишечника и лимфатические узлы фиксируют в 10%-ном растворе формалина.

1.4. Для серологического исследования берут из яремной вены 5—10 см 3 крови в стерильные пробирки или используют кровь, полученную при убое животного.

Из отобранных проб крови получают сыворотку методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают 30—60 мин при температуре 20—30°С, а затем при температуре 4—10°С. Сыворотка крови должна быть прозрачной, без признаков гемолиза.

Допускается консервировать сыворотку 5% -ным раствором карболовой кислоты (1—2 капли на 1 см 3 сыворотки) или сухой борной кислотой (2% кислоты к объему сыворотки).

Неконсервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 сут со дня взятия пробы, сыворотки консервированные — в течение 30 сут со дня консервирования при условии сохранения ее первоначального вида.

1.5. Пробы для исследования упаковывают в полиэтиленовые пакеты, помещают в ящик, опечатывают и вместе с сопроводительным документом направляют в лабораторию.

В сопроводительном документе указывают наименование и адрес отправителя, опись проб патологического материала, акт с эпизоотологическими данными.

2_Я МЕТОД БАКТЕРИОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Сущность метода заключается в обнаружении микобактерий паратуберкулеза в исследуемом материале и определении их морфологических и тинкториальных свойств путем микроскопии.

Аппарат для встряхивания (щутель-алпарат).

Центрифуга лабораторная с частотой вращения 2500— 3000 об/мин.

Стекла предметные по ГОСТ 9284—75.

Микроскоп биологический с иммерсионной системой по ГОСТ 8284—78.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962—67.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709—72.

Фуксин Циля карболовый; готовят следующим образом: 1 г основного кристаллического фуксина растирают в ступке с 5 г кристаллической карболовой кислоты и 0,5 см 3 глицерина, добав

ляя порциями 10 см 3 этилового спирта. После растворения краски добавляют при помешивании 100 см 3 дистиллированной воды. Раствор краски через 24 ч пропускают через бумажный фильтр. Фуксин Циля стойкий и его хранят во флаконах из темного стекла с притертой пробкой.

Спирт солянокислый 3%-ный; готовят следующим образом: 3 см 3 концентрированной соляной кислоты по ГОСТ 3118—77 добавляют к 97 см 3 96%-ного этилового спирта.

Синь метиленовая (метиленовый голубой), насыщенный раствор; готовят следующим образом: 8—9 г кристаллической метиленовой сини растворяют в 100 см 3 этилового спирта.

Синька Леффлера метиленовая, водно-спиртовой раствор; готовят следующим образом: 30 см 3 насыщенного раствора метиленовой сини пропускают через бумажный фильтр, добавляют 1 см 3 1%-ного раствора гидроокиси калия и разбавляют 100 см 3 дистиллированной воды. Раствор устойчив в течение длительного времени.

Масло иммерсионное для микроскопии по ГОСТ 13739—78.

2.2. Подготовка к исследованию

2.2.1. Готовят мазки из слизистой оболочки кишечника и брыжеечных лимфатических узлов растиранием материала между двумя предметными стеклами. Перед тем как сделать мазки, слизистую оболочку промывают водой или физиологическим раствором от фекалий.

Мазки высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем и окрашивают по методу Циль-Нильсена.

На мазки кладут полоску фильтровальной бумаги, наливают на нее раствор фуксина Циля и нагревают до появления пара (два-три раза) в течение 5 мин, не допуская краситель до кипения и добавляя каждый раз раствор краски.

Дают препарату остыть, удаляют пинцетом бумагу, сливают избыток красителя. Мазки промывают водой, после чего обесцвечивают 3%-ным солянокислым спиртом (20—30 с) до слабо-розового окрашивания.

Мазки промывают водой и окрашивают раствором метиленовой синьки Леффлера в течение 3—5 мин, -краску сливают, мазок промывают водой и высушивают на воздухе.

2.3.1. Мазки просматривают под микроскопом. Если бактерий не обнаруживают или наблюдают единичные, просматривают не менее 50 полей зрения.

2.4.1. Для микобактерий паратуберкулеза характерны палочки темно-красного цвета, которые располагаются на синем фоне палисадом (частоколом) или кучками по две, три и более.

Обнаружение бактерий с указанными признаками дает основание для предварительного заключения о наличии возбудителя этой болезни.

При обнаружении в мазках единичных и нетипично расположенных кислотоустойчивых бактерий из исследуемого материала повторно готовят и просматривают 4—6 мазков.

3. МЕТОД КУЛЬТУРАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Сущность метода заключается в выделении культуры микобактерий паратуберкулеза из исследуемого материала и их идентификации на специальных питательных средах.

3.1. Аппаратура, материалы и реактивы Центрифуга с частотой вращения 3000 об/мин.

Баня водяная с терморегулятором на 30—70°С.

Весы лабораторные по ГОСТ 24104—80.

Пипетки стеклянные мерные вместимостью на 1,5,10 см 3 по ГОСТ 20292—74.

Воронка делительная вместимостью 300 см 3 по ГОСТ 25336—82.

Эксикатор по ГОСТ 23932—82.

Чашки Петри по ГОСТ 10373—75.

Насос вакуумный (Камовского).

Кислота серная по ГОСТ 4204—77, концентрированная, 3 и 6%-ная.

Кислота соляная по ГОСТ 3118—77.

Кислота щавелевая по ГОСТ 22180—76, 5%-ный раствор. Калия гидроокись по ГОСТ 24363—80.

Натрий хлористый по ГОСТ 4233—77, 0,85%-ный раствор, pH 7,0.

Калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 245—76. Натрий фосфорнокислый двузамещенный по ГОСТ 4172—76. Магний сернокислый по ГОСТ 4523—77.

Кальций хлористый по ГОСТ 4209—77.

Цинк сернокислый по ГОСТ 4174—77.

Медь сернокислая по ГОСТ 4165—78.

Железо аммонийное лимоннокислое.

Хлороформ по ГОСТ 20015—74.

Спирт этиловый ректификованный 96%-ный по ГОСТ 5962—67, Вода дистиллированная по ГОСТ 6709—72.

Сыворотка инактивированная крупного рогатого скота. Микобактин (спиртовой экстракт из микобактерий флей по Смиту); готовят следующим образом: культуру микобактерий флей (тимофеезой травы) выращивают на мясопептонном бульоне, содержащем 4% пептона и 10% глицерина (среда Френсиса, pH 7,2). Через 3—4 недели при получении пышного роста культуры микробную массу отделяют от жидкости, пропуская через двойной бумажный фильтр. Культуру отжимают в воронке, промывают стерильной дистиллированной водой и нагревают при 80°С в течение 30 мин в аппарате Коха. Высушивают в эксикаторе в чашках Петри над серной кислотой или хлористым кальцием или в термостате при 45°С, а затем помещают в стерильную ступку и тщательно растирают в порошок;

20 г сухого порошка три раза экстрагируют кипячением в спирте в течение 20 мин в колбе с обратным холодильником, приливая каждый раз 150 см 3 спирта.

Все порции экстракта собирают и оставляют на ночь. Над-осадочную жидкость пропускают через бумажный фильтр и сливают в колбу, затем сгущают при пониженном давлении до образования вязкой красновато-оранжевой жидкости. Полученную жидкость смешивают с 80 см 3 50%-ного раствора глицерина, приготовленного на дистиллированной воде. Устанавливают pH 7,6. Жидкость прогревают в кипящей водяной бане в течение 10 мин. Горячую жидкость помещают в делительную воронку и оставляют на ночь.

Нижнюю светлую часть жидкости (pH 7,0) сливают, разливают в ампулы, запаивают и автоклавируют при 120°С в течение 20 мин. Экстракт хранят при комнатной температуре.

Модифицированная казеиновая питательная среда Дюбо— Смита (ВИЭВ А. П. Аликаева) следующего состава: однозамещенный фосфорнокислый калий — 1 г;

двузамещенный фосфорнокислый натрий —6,25 г;

сернокислый магний -— 0,01 г;

хлористый кальций — 0,0005 г;

лимоннокислое аммонийное железо

дистиллированная вода агар Дифко

стерильная инактивированная сыворотка крупного рогатого скота (нормальная) пенициллин

Среду готовят следующим образом:

приготовление гидролизата казеина: нагревают до 28°С 1 дм 3 водопроводной воды и добавляют 84 г казеина. Устанавливают раствором гидроокиси калия pH 8,0. Подогревают на водяной бане в течение 3 ч при комнатной температуре 28°С. Снова доводят pH до 8,0. Добавляют 2 г панкреатина и 25 см 3 хлороформа. Полученную смесь переливают в бутыль, закрывают резиновой пробкой и оставляют при комнатной температуре. Спустя 10 сут смесь фильтруют через полотно, устанавливают pH 7,4, разливают по флаконам и стерилизуют при 120°С в течение 30 мин. Гидролизат хранят при комнатной температуре;

приготовление солевых компонентов: взвешивают 1 г однозамещенного фосфорнокислого калия, 6,25 г двузамегцен-ного фосфорнокислого натрия, 0,01 г сернокислого магния и растворяют в 100—250 см 3 дистиллированной воды в колбе вместимостью 1 дм 3 . В другой колбе, в таком же объеме воды при подогревании поочередно растворяют 1 г аспарагина и 0,05 г лимоннокислого аммиачного железа. Полученный раствор смешивают с первоначально приготовленным раствором солей. Затем прибавляют хлористый кальций, сернокислый цинк и сернокислую медь. Сернокислый цинк и сернокислую медь дозируют следующим образом: взвешивают на торсионных или аналитических весах 10 мг вещества, которое растворяют в 10 см 3 воды. К 1 см 3 этого разведения приливают 9 см 3 воды и получают раствор, в 1 см 3 которого содержится 0,0001 г сернокислого цинка (меди).

Для приготовления нужной концентрации раствора хлористого кальция взвешивают 50 мг вещества, а затем поступают, как указано выше. На 1 дм 3 среды добавляют по 1 см 3 каждого конечного разведения соответствующего вещества;

порядок составления среды: в колбу с растворами солей и аспарагина добавляют 80 см 3 гидролизата казеина, 20 см 3 микобактина, доливают дистиллированной воды до 1 дм 3 и пропускают через бумажный фильтр.

Устанавливают соляной кислотой pH 6,5. Раствор разливают равномерно по флаконам, добавляют 1,5% агара и стерилизуют при 120°С в течение 20 мин или при 112°С — 30 мин. Такой полуфабрикат длительно хранится при комнатной температуре.

Перед употреблением к расплавленному в водяной бане полуфабрикату добавляют 20% стерильной, инактивированной при 50°С в течение 1 ч сыворотки крупного рогатого скота и пенициллин из расчета 50 ЕД на 1 см 3 среды.

Готовую среду разливают по пробиркам, скашивают, выдерживают при комнатной температуре в течение 24 ч. Для проверки на стерильность пробирки со средой помещают в термостат на 2—3 сут при температуре 38°С. При посевах используют свежую среду, приготовленную не более чем за 14 сут до исследования. Среды хранят в сухом прохладном месте.

3.2.1. Фекальные массы, измельченные и растертые в ступке (около 10 см 3 >, смешивают с 10 частями 5%-ного раствора щавелевой кислоты в стерильном флаконе с крышкой и встряхивают.

Флакон со смесью ставят на 20—30 мин при 37°С на водяную баню, а затем центрифугируют с частотой вращения 2500— 3000 об/мин в течение 15 мин.

После центрифугирования отделяют надосадочную жидкость, осадок отмывают стерильным физиологическим раствором, затем с поверхности его бактериологической петлей берут материал и высевают в 5—6 пробирок с питательной средой с микобактином и для контраста в среду Левенштейна—Иенсена.

3.2.2. Кусочки лимфатических узлов и отдельно соскобы (ткань) слизистой оболочки и подслизистого слоя кишечника (5— 6 кусочков) измельчают ножницами до 2—3 мм и помещают в разные стерильные ступки, покрытые пергаментной бумагой.

Лимфатические узлы заливают 3%-ным раствором серной кислоты в соотношении 1:10, а слизистую оболочку кишечника — 6%-ным раствором этой кислоты и выдерживают в течение 10—-15 мин.

Раствор серной кислоты сливают, а патологический материал заливают в зависимости от концентрации серной кислоты на 5 или 10 мин соответственно стерильным физиологическим раствором в таком же объеме.

Физиологический раствор сливают, кусочки материала растирают и суспензируют в небольшом количестве стерильного физиологического раствора, а затем высевают в 5—6 пробирок на питательную среду с микобактином и среду Левенштейна—Йенсена, как указано в п. 3.2.1.

Питательные среды после высева материала выдерживают в термостате при 38°С в течение 3—4 мес.

Рост возбудителя паратуберкулеза на средах с сильным обсеменением ткачей появляется через 18—20 сут, при слабом — в течение 3—4 мес. Культуры вырастают в виде плоских колоний с неровными краями и ядром в центре. В дальнейшем они принимают бугристый вид.

Для идентификации выделенную культуру высевают на среду с микобактином и без него. Возбудитель паратуберкулеза в первых генерациях размножается на питательной среде только в присутствии микобактина.

3.3.1. Результат исследования считают положительным, если культура выросла на среде с микобактином и отсутствует ее рост на средах без него.

4. МЕТОД СЕРОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Сущность метода заключается в выявлении комплемент— связывающих антител в сыворотке крови животных, инфицированных микобактериями паратуберкулеза, реакцией связывания комплемента (РСК).

Центрифуга с частотой вращения 3000 об/мин.

Термостат с регулированием температуры на 37—38°С.

Баня водяная с терморегулятором на 30—70°С.

pH-метр ЛПУ-01 или другого типа того же класса точности.

Антиген паратуберкулезный для РСК.

Сыворотка положительная контрольная.

Сыворотка отрицательная контрольная.

Сыворотка гемолитическая для РСК по ГОСТ 16445—78.

Комплемент сухой по ГОСТ 16446—78.

Эритроциты крови барана, 2,5%-ная взвесь.

Натрий хлористый по ГОСТ 4233—77, 0,85%-ный раствор,

Натрий лимоннокислый по ГОСТ 22280—76.

Кислота лимонная по ГОСТ 3652—69.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709—72.

Раствор Альсивера; готовят следующим образом: растворяют в 1 дм 3 дистиллированной воды 18,7 г глюкозы, 4,2 г хлористого натрия, 8,0 г лимоннокислого натрия, 0,5 г лимонной кислоты. Раствор доводят до кипения, охлаждают, пропускают через бумажный фильтр, разливают в колбы или флаконы и стерилизуют в автоклаве.

4.2.1. Для приготовления суспензии эритроцитов крови барана берут кровь из яремной вены барана (овцы) с соблюдением правил асептики в сосуд, содержащий стеклянные или фарфоровые бусы, и дефебринируют или в сосуд, содержащий раствор Альсивера (для консервирования) в количестве, равном количеству крови.

Свежедефебринированную кровь или кровь через 6—14 сут после ее консервирования два-три раза отмывают в течение 15 мин на центрифуге с частотой вращения 2000—3000 об/мин в физиологическом растворе до полного обесцвечивания надосадоч-ной жидкости. Для постановки реакции готовят из осадка взвесь эритроцитов в физиологическом растворе.

4.2.2. Для приготовления гемолитической системы, применяемой в РСК, смешивают равные объемы гемолитической сыворотки в удвоенном титре, указанном учреждением, ее изготовившим, и взвеси эритроцитов. Смесь оставляют на 15 мин для сенсибилизации.

4.3. Проведение исследования

4.3.1. Реакцию связывания комплемента (РСК) проводят в пробирках вместимостью 2,5 см 3 по 0,5 см 3 каждого компонента —сыворотки (испытуемой и контрольных), антигена, комплемента и 1 ом 3 гемолитической системы.

Предварительно испытуемую сыворотку, сыворотки отрицательную и положительную (контроли) разбавляют физиологическим раствором 1 : 10, инактивируют в водяной бане при температуре 61—62°С в течение 30 мин.

Реакцию связывания комплемента проводят в водяной бане при температуре 37—38°С. Время связывания комплемента 20 мин, время реакции после добавления гемолитической системы — 20 мин.

В качестве контроля вместо испытуемой сыворотки в РСК используют отрицательную, а также положительную паратуберкулезные сыворотки в разведениях 1 * 10 с антигеном и 1 : 10 без антигена.

Контролем гемолитической системы является 1,5 см 3 физиологического раствора и 1 см 3 гемолитической системы.

При постановке опыта проводят титрование комплемента в соответствии с ГОСТ 16448—78. В РСК берут комплемент в количестве на два интервала выше его титра (при титре 0,16—0,22; пентитре 0,22—0,28).

Титры каждой серии антигена и гемолитической сыворотки устанавливают предприятия-изготовители.

Реакцию связывания комплемента учитывают визуально один раз через 16—-18 ч выдерживания в прохладном месте.

Результаты реакции учитывают по следующей схеме:

+ + + + (4 креста) —отсутствие гемолиза, надосадочная жидкость прозрачная и бесцветная;

4- + 4- (3 креста) —25% гемолиза эритроцитов;

4-4- (2 креста) —50% гемолиза эритроцитов;

4- (1 крест) —75% гемолиза эритроцитов;

— (минус) — полный гемолиз, осадка эритроцитов нет,

жидкость интенсивно окрашена гемоглобином.

Реакцию связывания комплемента, оцененную в два креста и более при полном гемолизе эритроцитов в контрольном опыте без антигена, считают положительной.

Задержку гемолиза в «один крест» принимают за сомнительный результат и сыворотку крови от этого животного через 15— 20 сут исследуют повторно.

5. МЕТОД ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Сущность метода заключается в выявлении в тканях животных, больных паратуберкулезом, микобактерий возбудителя болезни и характерных морфологических изменений.

5.1. Аппаратура, материалы, реактивы

5.1.1. Аппаратура, материалы и реактивы, указанные в п. 2.1, и дополнительно:

микротом с микротомными ножами; блоки деревянные;

стекла покровные по ГОСТ 6672—75;

спирт этиловый ректификованный, 96%-иый по ГОСТ 5962—67; формалин по ГОСТ 1625—75, 10%-ный раствор; углекислота; эфир;

хлороформ по ГОСТ 20015—74;

ксилол (пара, орто, мета) по ГОСТ 9949—76;

бальзам пихтовый по ГОСТ 2290—76 или кедровый, или канадский.

5.2. Подготовка к исследованию

5.2.1. Кусочки ткани заливают в целлоидин или парафин и делают срезы. Срезы готовят также и на замораживающем микротоме. Препараты окрашивают гемотоксилин-эозином и по Циль-Нильсену в модификации для окраски срезов.

5.3. Проведение исследования

5.3.1. Срезы просматривают под микроскопом.

5.4.1. Обнаружение в стенке кишечника и брыжеечных лимфатических узлах пролиферации из эпителиоидных и гигантских клеток с микобактериями или без них (у ] /з животных гигантские клетки и микобактерии могут отсутствовать) свидетельствует о типичных для паратуберкулеза гистологических изменениях.

При дифференциальной диагностике паратуберкулеза учитывают сходные изменения, наблюдаемые при туберкулезе, неслеци-фическом катаре кишечника и паразитарных болезнях.

При туберкулезе кишечника находят обизвествленные казеозные очаги в стенке кишечника, брыжеечных и других лимфатических узлах и органах, отсутствующих при паратуберкулезе. При окраске срезов по Циль-Нильсену обнаруживают редко единичные микобактерии.

Паразитарные узелки дифференцируют по нахождению паразита и эозинофильноклеточной пролиферации.

При неспецифическом — банальном катаре кишечника отсутствуют эпителоидные пролифераты в стенке кишки и в регионарных лимфатических узлах.

Редактор P_t С. Федорова Технический редактор Г. Н. Макарова Корректор В. С. Черная

Сдано в наб. 18.01.84 Подп. в печ. 02.04.84 1,0 уел.

1,0 уел. кр.-отт. 0,77 уч.-изд. л. Тир. 16 000 Цена 5

Ордена «Знак Почета» Издательство стандартов, 123840, Москва, ГСП, НовопресненскнЙ пер., 3 Тип. «Московский печатник», Москва, Лялин пер., 6. Зак, 227

источник

доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий лабораторией микобактериозов, labmyc@mail.ru

Нина Гавриловна Толстенко

кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник лаборатории микобактериозов

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории микобактериозов

ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко», г. Москва

Марина Станиславовна Калмыкова

кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры радиобиологии и вирусологии им. академиков А.Д. Белова и В.Н. Сюрина

ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии

Паратуберкулёз, паратуберкулёзный энтерит, болезнь Йоне (Johnes disease – англ.; Paratuberculöse der Rinder, Johnesche Krankheit – нем.; Paratuberculeuse – франц.) – хроническая инфекционная болезнь, в основном, жвачных животных, чаще всего протекающая латентно, характеризующееся поражением кишечника, мезентериальных лимфатических узлов и, как следствие, – сопровождающаяся расстройством желудочно-кишечного тракта (диареей) с прогрессирующим истощением и потерей продуктивности до летального исхода.

Клинические признаки паратуберкулёза – медленно прогрессирующее истощение и диарея. В начале диарея носит перемежающий, скачкообразный характер, затем становится постоянной. Диарея более характерна для крупного рогатого скота, чем для других видов жвачных животных.

При заражении паратуберкулёзом, в первую очередь, поражается тонкий отдел кишечника. Поражения в кишечнике приводят к пониженному всасыванию белка и являются причиной утечки белка, что в конечном итоге ведёт к истощению мышц.

Паратуберкулёз крупного рогатого скота впервые был описан A. Johne и L. Frothingham в 1895 г. как особая форма туберкулеза кишок, вызываемая ослабленным возбудителем бычьего или птичьего вида туберкулеза.

B. Bang (1906) в связи с тем, что не смог выделить возбудителя болезни, а заражение патматериалом от больной коровы морских свинок и кроликов не удалось, предложил считать эту болезнь отличительной от туберкулёза и назвал её «хронический псевдотуберкулёзный энтерит».

В 1902 г. Mc. Fadilan назвал эту болезнь в честь первого автора, открывшего это заболевание, болезнь Ионе.

В 1912 г. T.W. Twort, Y.Z. Ingram из подвздошной кишки больной коровы на искусственных питательных средах выделили возбудителя и назвали его Mycobacterium enteritidis chronicae bovis. В дальнейшем, после исследования возбудителя как отдельного вида рода микобактерий, возбудитель заболевания был квалифицирован как Mycobacterium paratuberculosis, а болезнь названа паратуберкулёзом. После исследований с применением молекулярно-генетических методов было доказано, что гены M. avium и M. paratuberculosis на 99% гомологичны. В связи с тем, что в последние годы накопилось достаточно данных об общности протеинов, входящих в химическую структуру возбудителя паратуберкулёза и M. avium, в Manual Determinative Bacteriology Bergey (1989) возбудителем паратуберкулёза считается Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP). Поэтому возбудитель паратуберкулёза впоследствии стали считать подвидом микобактерий птичьего вида –Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) (M.F. Thorel et al., 1990).

Паратуберкулёз крупного рогатого скота регистрируется почти во всех странах мира. По данным МЭБ за 2001-2006 гг. паратуберкулёз крупного рогатого скота был зарегистрирован в 61 стране, на всех континентах земного шара (Б.Ф. Шуляк, 2005). По данным ООН, паратуберкулёз признан одной из самых серьезных болезней современности, со значительными экономическими последствиями. Экономический ущерб слагается из снижения производства продукции животноводства, потери молочной продуктивности, бесплодия, истощения, выбраковки или гибели больных паратуберкулёзом животных.

По данным Y. Benedictus et al. (1987), экономический ущерб от убоя каждой клинически больной коровы, по причине недополучения молока на 19,5% и снижения в нем жира и белка на 20%, составляет 279 фунтов стерлингов, а убыток от убоя коров, не имеющих клинических признаков паратуберкулёза, производится из-за снижения надоя молока на 16% и уменьшения содержания в нем жира и белка на 17,5%. В случаях задержки убоя больных коров на год, размер убытков увеличивается еще на 5-6%.

Кроме того, следует учитывать, что при убое клинически больных паратуберкулёзом коров потери более значительны, чем при многих других инфекциях, когда полностью используется туша больного животного. От клинически больного паратуберкулёзом животного туша бракуется и идет на утилизацию из-за атрофии мышц.

В настоящее время паратуберкулёз остается одной из недостаточно изученных, сложно контролируемых и диагностируемых инфекций. Инкубационный период может длиться от 6 месяцев до 15 лет, а может быть и самоизлечение, т.е. клиника может не проявиться за весь период жизни животного. При этом инфицированные животные, не проявляя клинических признаков болезни, являются носителями микобактерий и периодически выделяют возбудитель во внешнюю среду, что создает условия для заражения восприимчивых здоровых животных и как следствие этого –для распространения паратуберкулёза в стаде.

Поэтому, некоторые авторы сравнивают проблему паратуберкулёза с верхушкой айсберга (айсберг-эффект), когда на один клинический случай приходятся десятки случаев инфицированных животных в латентной форме.

Кроме того, в последние десятилетия ведутся дискуссии об общей этиологии паратуберкулёза животных и хронических воспалительных заболеваний кишечника других видов и человека, особенно о роли возбудителя паратуберкулёза в болезни Крона (Crohn`s disease) у людей. Это заболевание проявляется поражением желудочно-кишечного тракта, диареей и рвотой (R.J. Chiodini, 1989; C. Cocito et al., 1994). Гистопатологический анализ этой болезни показывал наличие гранулём и изменений в лимфатических узлах, напоминающие изменения при паратуберкулёзе животных (P. Schmitz-Moormann, P.M. Pittner, 1984).

В настоящее время существует предположение, что возбудитель паратуберкулёза является этиологическим агентом болезни Крона – хронического воспаления кишечника у человека. Болезнь Крона имеет две клинические формы: первая, «агрессивная», с наличием фистул (с перфорацией кишечника); вторая – вялотекущая (без перфорации). Существует и две теории патогенеза болезни: инфекционная и аутоиммунная. Обоснованием для предположения, что возбудитель паратуберкулёза вызывает у человека болезнь Крона, послужило выделение МАР из кишечника больных людей. Однако до настоящего времени причинно-следственные связи между возбудителем паратуберкулёза и патологией у людей не доказаны (В.И. Литвинов и соавт., 2008).

Возбудителя паратуберкулеза обнаруживали в кишечнике у пациентов с хроническими воспалительными поражениями в Италии, США, Великобритании и Чехии. Было отмечено выделение возбудителя паратуберкулеза из грудного молока больных (S.A. Naser et al., 2004).

При исследовании методом ПЦР биоматериала от людей с болезнью Крона характерная последовательность для МАР-гена IS900 была обнаружена у 65% больных людей (J.D. Sanderson et al., 1992).

D. Mishina et al. (1996), I. R.Grant et al. (1996; 1998), M. Meylan et al. (1996), J.R. Stabel et al (1997), J. Keswani, J.F. Frank (1998), N. Sung, M.T. Collins (1998, 2000), J.R. Grant (2003); J.A. Donaghy et al. (2004); U. Spahr, R. Schafroht (2005), W.Y. Ayele et al. (2005), J. Ikonomohonlos et al. (2005), T. Tasar, R. Stephan (2005), K. Hruska et al. (2005) показали, что в сборном молоке после высокотемпературной обработки обнаруживают МАР, которые могут быть фактором передачи возбудителя от больных животных человеку. Авторы считают этот вид микобактерий потенциальным этиологическим агентом болезни Крона человека.

Однако другие авторы, E.A. Rubbery (2001), R.J. Greenstein (2003), считают, что очевидных доказательств взаимосвязи между возбудителем паратуберкулёза и болезнью Крона не имеется.

Европейская комиссия здравоохранения и научный комитет по охране здоровья животных в 2000 г. также рассматривали связь между этими заболеваниями, но так и не пришли к единому мнению. Однако и не исключили предположение, что возбудитель заболевания у животных и человека один.

В 2003 г. группа американских ветеринарных и медицинских специалистов представила в национальный научный совет США отчёт о двухгодичных исследованиях о возможной связи паратуберкулёза с болезнью Крона (L. Hutchinson, 2004). Однако дальнейшими классическими методами исследований связь между паратуберкулёзом животных и болезнью Крона у людей не была доказана. Проходивший в США в 2009 г. 10-й международный симпозиум по паратуберкулёзу также не дал конкретный ответ на этот вопрос. Тем не менее, в связи с широким распространением инфекции, а также в связи с возможной причастностью M. paratuberculosis к возникновению болезни Крона у человека, в некоторых странах (Австралии, Норвегии, Исландии, Японии, Нидерландах и США) созданы национальные программы по контролю, искоренению и профилактике паратуберкулёза (А.И. Завгородний и соавт., 2010).

В Российской Федерации паратуберкулёз крупного рогатого скота регистрируется в единичных случаях. Так, по официальным статистическим данным в 2008 г. было зарегистрировано четыре неблагополучных пункта (н.п.), в 2009 г. – пять н.п., в 2010 г. – шесть н.п., в 2011 г. – четыре н.п., в 2012 г. – три н.п., в 2013 г. – пять н.п., в 2014 г. – пять н.п.

В соответствии с «Наставлением по диагностике паратуберкулёза (паратуберкулёзного энтерита) животных», утвержденного Департаментом ветеринарии МСХ РФ 05.04.2001 г., диагноз на паратуберкулёз считается установленным:

— при наличии у животных характерных клинических признаков болезни и получении одновременно положительных результатов бактериоскопического или гистологического исследования биоматериала от этих животных;

— при обнаружении характерных патологоанатомических изменений в кишечнике и мезентериальных лимфатических узлах животных с гистологическим или бактериоскопическим подтверждением болезни, независимо от наличия или отсутствия клинических признаков болезни.

В неблагополучных по паратуберкулёзу крупного рогатого скота хозяйствах считают больными животных:

— при слабовыраженных клинических признаках болезни, независимо от результатов аллергического и серологического исследований;

— при отсутствии клинических признаков, но совпадающих положительных результатах аллергического и серологического исследований.

При установлении диагноза на паратуберкулёз хозяйство (отделение, ферму) объявляют неблагополучным и проводят оздоровительные мероприятия. Животных с клиническими признаками болезни сдают на убой. У остального поголовья животных в возрасте 18 мес. и старше два раза в год (весной и осенью) исследуют сыворотку крови в РСК с паратуберкулёзным антигеном. Животным, реагирующим в РСК, проводят внутрикожную аллергическую пробу с туберкулином (ППД) для птиц. Всех животных, при исследовании которых получены совпадающие положительные результаты туберкулинизации и РСК, сдают на убой.

Если в течение последних 12 мес. больные животные не выявляются, то систематические исследования (аллергические и серологические) прекращают, проводят регулярный клинический осмотр и учитывают результаты патологоанатомического вскрытия трупов павших животных и ветсанэкспертизы убойного скота.

Молодняк в возрасте от 6 до 18 мес. исследуют на паратуберкулёз внутрикожной пробой с туберкулином (ППД) для птиц. Реагирующих на туберкулин через 45-60 дней исследуют повторно, и животных с положительной реакцией сдают на убой.

Патматериал от всех убитых животных направляют в лабораторию для бактериоскопического и гистологического исследования на паратуберкулёз.

Хозяйство признают благополучным по паратуберкулёзу через три года после последнего случая выявления больного животного и проведения комплекса заключительных ветеринарно-санитарных мероприятий.

Ретроспективный анализ эпизоотической ситуации показывает, что в СССР и РФ никогда не было широкого распространения паратуберкулёза крупного рогатого скота, как не было неблагополучных пунктов, где паратуберкулёз в «клинической форме» выявлялся у значительного числа животных.

Многолетний опыт работы сотрудников лаборатории микобактериозов ВИЭВ дает основание предполагать, что и в дальнейшем, при условии соблюдения положений утвержденных нормативных документов, паратуберкулёз крупного рогатого скота не получит широкого распространения. Тем более, что по технологии содержания высокопродуктивных животных, как правило, не содержат старых, больных и низкопродуктивных особей. Так, в хороших хозяйствах проводят ежемесячную выбраковку животных, а ежегодная выбраковка составляет до 30% поголовья крупного рогатого скота, т.е. за три-четыре года полностью обновляется все стадо.

Тем не менее, учитывая, что и на современном этапе борьбы с паратуберкулёзом нигде в мире нет достаточно эффективных средств диагностики (в соответствии с «Кодексом здоровья наземных животных» МЭБ от 2013 г. – при паратуберкулёзе нет рекомендуемых тестов, а в качестве альтернативных вариантов предлагается внутрикожная туберкулиновая проба и иммуноферментный анализ), необходимо совершенствование диагностики данного заболевания.

В «скрытости» инфекции, низкой чувствительности и специфичности прижизненных методов диагностики, сложности выделения, культивирования и идентификации возбудителя лабораторными методами и в отсутствии возможности воспроизведения паратуберкулёза на лабораторных животных – в этом заключаются основные причины сложности в установлении диагноза на паратуберкулёз.

Так, возбудитель паратуберкулёза культивируется на специальных питательных средах с добавлением фактора роста – микобактина, растет очень медленно, первичный рост появляется через 8-12 недель (А.И. Алиев и соавт., 1990; С.С. Нестреляев, 2013).

При микроскопии микобактерии всех видов окрашиваются одинаково, поэтому микобактерии паратуберкулёза невозможно отличить от множества других видов (А.И. Алиев и соавт., 1990).

При выделении и необходимости идентификации вида возбудителя туберкулеза (бычий, человеческий или птичий) можно использовать биопробу на морских свинках, кроликах и курах. При паратуберкулёзе биопроба не применяется, т.к. возбудитель не патогенен для лабораторных животных.

Кроме того, в последние годы на диагностику паратуберкулёза влияет и так называемый «человеческий фактор». В настоящее время в нашей стране осталось очень мало ветеринарных специалистов, которые видели паратуберкулёз или работали с болезнью. Часто при патологоанатомическом осмотре убитых, подозреваемых в заболевании коров нормальную складчатость кишечника принимают за паратуберкулезные изменения. Следует иметь в виду, что поперечная или продольная складчатость слизистой оболочки кишечника наблюдается у здоровых животных вследствие предсмертных сокращений поперечных и продольных мышц кишечника, а так как в подвздошной кишке эти мышцы наиболее сильные, то складчатость в этом отрезке проявляется наиболее выражено. Кроме того, при паратуберкулёзе утолщается и становится складчатой не только слизистая, но и стенки кишечника. В конечном итоге они так утолщаются, что пораженный участок напоминает плотную резиновую трубку с узким просветом (И.В. Поддубский и соавт., 1962; В.Е. Щуревский, 1972; Н.П. Овдиенко и соавт., 2007; С.С. Нестреляев, 2013; А.Х. Найманов и соавт., 2014).

С учетом указанного, изучение возможности применения новых, более современных методов в целях совершенствования диагностики паратуберкулёза было и остается актуальной проблемой.

В последние годы появились сообщения о возможности применения ПЦР при диагностике паратуберкулёза крупного рогатого скота. C.P. Vary et al. (1990), D. Cousins et al. (1999), C.A. Alinovi et al. (2009) предлагают использовать метод ПЦР для идентификации культур микобактерий и исследования сывороток крови и фекалий.

А.Х. Найманов, В.М. Калмыков (2012); В.М. Калмыков (2013) считают, что в связи с тем, что при паратуберкулёзе поражается желудочно-кишечный тракт, а возбудитель болезни в больших количествах выделяется во внешнюю среду вместе с фекальными массами, наиболее целесообразно использовать ПЦР для исследования фекалий у подозреваемых в заболевании животных.

На современном этапе борьбы с паратуберкулёзом крупного рогатого скота диагностика болезни должна быть комплексной с применением эпизоотологических, аллергических, серологических, молекулярно-генетических, патологоанатомических и бактериологических методов.

В комплекс необходимо включить и ПЦР для идентификации выделенных культур и исследования фекалий от подозреваемых в заражении животных.

В целях подтверждения диагноза на паратуберкулёз и в связи с отсутствием в арсенале метода биопробы на лабораторных животных, ПЦР должна занять достойное место в общем комплексе диагностических исследований на паратуберкулёз.

1. Алиев А.И., Фадеева Н.Г. Выделение микобактерий паратуберкулёза из патологического материала // Бюллетень ВИЭВ. 1990. №73-74. С. 71-76.

2. Завгородний А.И., Подмогова С.Д., Головко В.А. Паратуберкулёз сельскохозяйственных животных // Ветеринарная медицина. 2010. Выпуск 94. С. 171-173.

3. Калмыков В.М. Использование полимеразной цепной реакции в целях мониторинга благополучия по микобактериальным инфекциям зоопарковых, цирковых и сельскохозяйственных животных // Автореферат диссер. на соискание уч. ст. канд. вет. наук. 2013.

4. Кодекс здоровья наземных животных МЭБ. Двадцать второе издание. 2013. Том 1.

5. Литвинов В.И., Макарова М.В., Краснова М.А. Нетуберкулёзные микобактерии, МНПЦ борьбы с туберкулёзом / г. Москва. 2008. 254 с.

6. Найманов А.Х., Калмыков В.М. ПЦР при диагностике паратуберкулёза крупного рогатого скота // Российский ветеринарный журнал. 2012. № 3. С. 30-32.

7. Найманов А.Х., Толстенко Н.Г., Вангели Е.П., Букова Н.К., Калмыкова М.С. Паратуберкулёз крупного рогатого скота // Ветеринария. 2014. №1. С. 3-9.

8. Найманов А.Х., Толстенко Н.Г., Вангели Е.П., Устинова Г.И., Гулюкин М.И. Проблемы диагностики микобактериальных инфекций крупного рогатого скота // Ветеринария. 2014. №6. С. 3-9.

9. Найманов А.Х., Толстенко Н.Г., Вангели Е.П., Устинова Г.И., Сошникова Е.М., Кучерук О.Д. Проблемы диагностики паратуберкулёза крупного рогатого скота // Веткорм. 2014. №3. С. 10-12.

10. Найманов А.Х., Гулюкин М.И. Микобактериальные инфекции крупного рогатого скота (туберкулёз, паратуберкулёз) // Зооветкнига. Москва. 2014. 245 с.

11. Наставление по диагностике паратуберкулёза (паратуберкулезного энтерита) животных. Утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 05.04.2001. № 13-5-02/0050.

12. Нестреляев С.С. Особенности патоморфологического метода диагностики при паратуберкулёзе животных // Труды ВИЭВ. 2013. Т. 77. С.125-133.

13. Овдиенко Н.П., Найманов А.Х., Толстенко Н.Г., Якушева О.В., Устинова Г.И., Сидорчук В.А., Альбертян М.П., Суворов В.С. Профилактика и меры борьбы с паратуберкулёзом животных // Ветеринария. 2007. №12. С.3-7.

14. Поддубский И.В., Щуревский В.Е., Аликаева А.П. Материалы по изучению паратуберкулёза сельскохозяйственных животных // Труды ВИЭВ. 1962. Т. 26. С. 115-133.

15. Шуляк Б.Ф. 110 лет со дня открытия возбудителя паратуберкулёза // Российский ветеринарный журнал. 2005. № 9. С. 238-239.

16. Щуревский В.Е. Паратуберкуз сельскохозяйственных животных // Москва. — 1972. 127 с.

17. Alinovi C.A., Ward M.P., Lin Tsang Long, Moore G.E., Wu Ching Ching. Real-time PCR, compared to liquid and solid culture media and Elisa, for detection of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis // Veterinary Microbiology. 2009. 136 (1/2). P. 177-179.

18. Benedictus Y., Diykhuizen A.A., Stelwagen J. // Vet. Rec., 1987, 121, 7: 142-146.

19. Chamberlin W. Mycobacterium avium — Subsp. Paratuberculosis as one cause of Crohn’s disease / Chamberlin W., Yaran D. Y., Hulten K. // Aliment Pharmacol Ther. 2001:15:337-346.

20. Cousins D., Whittington R., Masters A., Evans R., Kluver P. Investigation off alse positives in the is 900 PCR for identification of M. paratuberculosis // Mol. Cell. Probes. 1999. 14. 431-442.

21. Ellingson J.L.E., Bolin C.A., Stabel J.R. Identification of a gene unigue to Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis and application to diagnosis of paratuberculosis // Mol. Cell. Probes. 1998. 12. 133-142.

22. Hermon-Taylor J. The Causation of Crohn’s Disease and Treatment Autimicrobial Drugs // Ital. J. Yastroenterology-Hepatology – 1998 Dec. – № 30(6). – P. 607-610.

источник