Диссертации по парвовирусному энтериту собак

? МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ КОНТРОЛЯ, СТАНДАРТИЗАЦИИ И СЕРТИФИКАЦИИ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ

ОЛЬШАНСКАЯ Алиса Алексеевна

Биологические свойства и диагностика коронавирусного энтерита собак

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в лаборатории препаратов, применяемых в звероводстве Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ).

Доктор ветеринарных наук В. И. Уласов

— заслуженный деятель науки РФ,

доктор биологических наук,

— кандидат ветеринарных наук,

Ведущая организация — Всероссийский научно-исслея вательский институт охотничьего хозяйства и зверовс им. проф.Б.М.Жидкова (601601 Г.Киров, ул.Энгельса, 1

Защита диссертации состоится » » ип^я 1997 г. в 1&»часов на заседании Специализированного совета Д 1Z(T85.01.

при Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) по адресу 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, 5, ВГНКИ.

Просим принять участие в работе совета или выслать Ваш отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенных печатью.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Ученый секретарь специализированного совета.

кандидат ветеринарных наук

В общей патологии заболеваний соСак энтеровирус-ные инфекции щенков продолжают занимать ведущее место. В России из-за сложности дифференциальной диагностики такие заболевания чаще объединяют под названием «парвовирусный энтерит». Вместе с тем распространенная практика профилактической обработки против парвовирусного энтерита с использованием отечественных й импортных биопрепаратов дает основание полагать, что в этиологии массовых диарей щенков собак имеются различия.

Симптомы проявления инфекционных болезней на практике часто имеют «стертый» характер, что затрудняет их правильную дифференциацию. Поэтому возрастает роль лабораторных’ методов диагностики инфекционных болезней.

За рубежом широкое распространение у собак имеет коронавирусный энтерит, возбудитель был впервые выделен в США в 1971 году из кала взрослой немецкой овчарки. Заболевание наступает через 3-7 дней после инфицирования. Волезнь характеризуется профузным-поносом, дегидратацией, общей интбксикацией, приводящих к гибели животных.

Вирус вьщеляетсй с калом в течение 15-16 дней, наиболее интенсивно — на 5-7-й день болезни. У выживших щенят развивается иммунитет, в крови появляются антитела ( Binn L.N. :et.al.,1974; Keeman et.al.,1976).

\ В нашей стране коронавирусная инфекция собак пока еще ни кем не изучена,-хотя массовые диареи у щенков в первые месяцы жизни имеют место, как в ведомствен-

ных питомниках, так и среди собак находящихся в личном владении граждан.

Таким образом, несмотря на широкое распространение болезни, она остается не изученной, чем и вызвана необходимость исследования биологических свойств коронавируса собак, поиска оптимального метода идентификации возбудителя и создания диагностического набора.

По настоянию руководителей ветелужОы ряда ведомств в плановую тематику научно-исследовательской работы ВГНКИ была включена тема по изучению биологических свойств коронавируса собак.

Цель работы. Получить штаммы коронавируса собак и изучить основные свойства вируса, особенности клинического проявления болезни, разработать средства лабораторной диагностики.

1. Изучить клинику и паталогоанатомические изменения при коронавирусной инфекции собак, выяснить некоторые эпизоотические данные.

2. Изучить некоторые биологические й физико-химические свойства полученных изолятов коронавируса.

3. Испытать диагностику коронавируса собак методом иммунофлуоресцентного анализа для практического применения.

Научная новизна. Впервые в отечественной практике от собак выделен и характеризован штамм «Карат» коронавируса собак.

Предложен режим лиофилиэациии и хранения штамма. Разработан способ получения активных и специфических диагностических сывороток к возбудителю коронавирус-иого энтерита собак.

Изучена возможность применения для диагностики инфекции люминесцентного метода, электронной и имму-ноэлэктронной микроскопии, реакции нейтрализации в культуре клеток.

Подана заявка на авторское свидетельство на штамм «Карат» коронавируса собак. Государственный регистрационный номер 96108623/13 от 29.04.1996 г.

Практическая цогшость. На основании проведенной работы выделен и депонирован в коллекцию микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского, института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов штамм мКарат» возбудителя коронавирусного энтерита собак. Справка о депонировании датирована на 7.07.1994 г. № 29 ДЕП.

Разработаны рекомендации по люминесцентной диагностике коронавирусной» инфекции собак. НТД одобрена 29.04.1996 научно-методической комиссией по вирусным инфекциям ВГНКИ ветпрепаратов и утверждена директором института 6.06.1996.

Материалы исследований доложены и обсуждены: 1.На методических комиссиях ВГНКИ по препаратам, применяемым в вирусологии в 1995 и 1996 годах.

2.Конференция «Актуальные проблемы болезней мелких домашних животных» г. Ленинград 1995 г..

3. Конференция « Состояние и перспективы развития научных исследований по профилактике и лечению болезней с.х. животных и птиц», посвященная 50-летию Краснодарской НИВС 1996 г.

По результатам исследований опубликовано 4 статьи.

Получено положительное решение на выдачу патента РФ.

ОО-тьем и структура работы.

Диссертация изложена на 104 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений. Список литературы содержит 107 источников, из них 17 отечественных и 90 зарубежных авторов. Работа содержит 10 таблиц и 9 рисунков. ‘ ‘■ .

Исследования выполнены в период 1992-1997 г.г в лаборатории контроля и стандартизации препаратов, применяемых в звероводстве ВГНКИ. Клинические наблюдения и анализ заболеваемости собак проведен в условиях ветстанций и ветеринарной лаборатории г. Москвы, а также в ряде ведомственных питомниках для собак.

При исследованиях использовали:

— штамм «Карат» возбудителя коронавирусного энтерита собак ( изолированного А. А. Ольшанской, В. И. Ула-совым и Е. Д. Захаровой в 1993 году из тонкого отдела кишечника щенка собаки, породы немецкая овчарка, в возрасте 4-х месяцев). Штамм «прошел» 15 пассажей в культуре клеток CRFK;

— коммерческий набор для диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней;

— положительную сыворотку к возбудителю коронавирусного перитонита кошек, полученную от доктора J.Chappius (Франция).

По данным ветеринарных отчетов из года в год в городе снижается количество и степень проявления чумы плотоядных и инфекционного гепатита, но возрастают болезни, протекающие с явлениями поражения кишечного тракта — свыше.54% от общего количества зарегистрированных случаев заболеваний, которые из-за сложности дифференциальной диагностики часто определяют под термином «парвоаирусный энтерит».

Благодаря разработкам, выполненным в ВГНКИ, ВНИИ-ИВВиМ’и НПО «Нарвак», в последние годы для профилактики болезней собак практически повсеместно применяются моно- и ассоциированные вакцины, содержащие в своем составе парвовирусный компонент.

Чувствительность штамма вируса изучали в экспериментах с использованием культур клеток: почки щенка собаки (ШЦ), почки эмбриона свиньи (ПЭС) и их субкультуры, клеток куриных эмбрионов (ККЭ), клетки эмбриона перепела (КЭП), тестикул бычка (ТВ), перевиваемой линии клеток почки собаки (МДСК), перевиваемой -линии клеток почки кошки(CRFK), перевиваемой ли-

нии клеток подкожной опухоли собаки А-72,перевиваемой линии клеток подкожной опухоли собаки СС-81, перевиваемой линии клеток почки зеленой мартышки «Vero».

Чувствительность культуры клеток к вирусу определяли по цитопатическому эффекту. Инфекционную активность вируса устанавливали методом титрования на культуре клеток CRFK. Плашки с инфицированной культурой помещали при 37°С, в условиях СОг инкубатора. Титр инфекционности рассчитывали по методу Рида и Менча и выражали в ТЦДзо/ыл.

Устойчивость вируса к хлороформу определяли по методу Мауг и Bogel (1981), pH — среды по методу Мауг (1977).

В процессе исследований использовали .собаки разных пород в возрасте от 3 до 6 месяцев, кроликов породы шиншилла массой 1,5-2,5 кг; морских свинок массой 250-300 г; белых мышей массой 10-12 г. Исследовали патологического материала от павших собак с клиникой вирусного энтерита. Исследовано 153 сыворотки крови собак. .

Гемагглютинирущую активность выделенного штамма возбудителя коронавирусного энтерита собак изучали в РГА при различных значениях pH и температуры с 1% эритроцитами морской свинки, крысы, кролика и свиньи.

Патогенность штамма определяли в опытах на белых мышах, морских свинках, -кроликах и сойаках разного возраста и иммунного статуса.

Элактродлел микроскопия проведена совместно с ведук.им научном сотрудником’лаборатории инструмен-

тальных’методов контроля и лиофилизацйи ВГНКИ Ю.И. Могильным. Вируссодержащую суспензию подвергали исследованию на электронном микроскопе JEM 100 СХ методом негативного контрастирования.

Гипериммунную сыворотку к коронавирусу собак получали на кроликах массой 2,5-3,0 кг по отработанной схеме, путем гипериммунйзации концентрированным ко-ронавирусом собак;.штаммом «Карат». Сыворотку крови получали методом.отстоя, через 2 недели после завершения цикла гипериммуниэации. Для определения титра вируснейтрализующих антител к коронавирусу собак а сыворотке крови использовали реакцию нейтрализации в культуре клеток CRFK.

Опыты по■йзученйю антигенного родстпа возбудителя коронавируса собак с вирусом трансмиссивного гастроэнтерита свиней осуществляли с помощью коммерческого набора для диагностики ТГЭ в реакции непрямой гем-маглютинации совместно со старшим научным сотрудником, к.в.н. .И.П.Скворцовой.

Для изготовления люминесцентной диагностической сыворотки использовали полученную нами кроличью сыворотку, обладающую специфической активностью с -титром 1:64-1:128. . •

Приготовление люминесцентной сыворотки к коронавирусу собак проводили в лаборатории К.Л.Шиханиной Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи РАМН РСФСР по существующей там технологии.

Полученные люминесцентные сыворотки имели еле-

дующие показатели: белок 15 мг/мл, метка 3 мг/мл.

При анализе и обобщении результатов исследований делали статистическую обработку по общепринятым в биологии методам. В качестве доверительного интервала был выбран уровень вероятности Р-0,95 (уровень значимости р- 0,05) . Учет совпадений результатов, чувствительности и специфичности .диагностических методов проводили по методу ГеасЫ1с1 (1968).

Анализ некоторых эпизоотических данных

По данным ветеринарной отчетов из года в год в Москве снижается количество и степень проявления чумы плотоядных и инфекционного гепатита, но возрастают болезни, протекающие с явлениями поражения кишечного тракта — свыше 54% от общего количества зарегистрированных случаев заболеваний, которые из-за сложности дифференциальной диагностики, часто определяют термином «парвовирусный энтерит».

Наибольшее количество заболеваний приходится на щенков в возрасте до года.

Для уточнения истинных причин возникновения диарей нами, при активном участии ряда практических ветеринарных специалистов города, была собрана 71 проба клинического и паталогоанатомического материала от собак (тонкий и толстый отдел кишечника, лимфатические узлы брыжейки кишечника, содержимое кишечника) . По анамнестическим данным, наблюдаемые собаки были ранее иммунизированы отечественными и импортными вакцинами против парвовируса собак и содержали в сыворотке крови специфические тормозящие гемагглютинацию антитела в титре не ниже 1:64,

Полученные результаты дают основания полагать, что этиология инфекционных энтеритов у собак более многообразна и одной из причин острых диарей может являеться коронавирус.

Выделение и идентификация коронавируса собак.

. Штамм «Карат» возбудителя коронавирусного энтерита собак был выделен из ткани тонкого отдела кишечника 4-х месячного щенка собаки, имеющей следующие клинические признаки: рвота, угнетенное состояние, диарея, дегидратация. С этой целью гомогенат кишечника, после специальной обработки, вносили на сформированный монослой культуры клеток СЯГК. Цитопати-ческое действие в этой культуре проявлялось на 3 сутки и характеризовалось округлением и увеличением эпителиоподобных клеток, а фибробластоподобные клетки удлинялись и образовывали своеобразные тяжи. Монослой принимал вид узорчатого кружева. На пятые сутки после заражения клетки полностью отделялись от стекла. . ,

Совместно с ведущим научным сотрудником лаборатории инструментальных методов исследования Ю.А. Могильным, методом негативного контрастирования, проводили электронно-микроскопические исследования культуральной вируссодержащей жидкости на уровне 5 пассажа, полученной на культуре клеток СКИС.

В результате электронно-микроскопического исследования были обнаружены частицы, схожие по морфологическим признакам .с коронавйрусом. Частицы имели сферическую форму, диаметр их колебался от 90 до 120 нм. Поверхность частиц была покрыта выступами.

образующими подобие солнечной короны, длина их составляла 15-20 нм.

Проведенные опыты показали, что выделенный нами изолят коронавируса соОак не обладает гемагглютини-рукадими свойствами.

Изолятом, прошедшим,5 пассажей в культуре клеток СйПС, заразили 7 беспородных шенков собак в, возрасте до 5 месяцев (алиментарным путем в объеме 3 см3, активность вируса составляла б, 5 1д ТЦДао/мл) • Два контрольных щенка получили таким же методом по 3 см3 незараженной клеточной суспензии. На третьи сутки у щенков первой группы отмечали угнетенное состояние, учащенную дефекацию, фекалии были жидкой консистенции. При исследовании морфологического состава крови животных, не наблюдали существенных изменений количества форменных элементов крови (эритроциты 6,5-7,3 млн./мл, лейкоцита 9,0-10,5 тыс./мл). Температура тела оставалась в пределах нормы (38,6-39,7°С). На 6-7-е сутки три щенка пали с признаками диареи, При вскрытии у них отмечали обезвоживание организма, слизистая оболочка тонкого отдела кишечника была утолщена, гиперемирована, с. точечными кровоизлияниями и участками некроза, селезенка увеличена.

Гомогенат, полученный из тонкого отдела кишечника, был внесен в моноелойную культуру клеток СИЕК, и в течение 3 пассажей наблюдали ЦПД в виде округления элителиоподобных клеток, и удлинения фибробластопо-добных.

Щенки контрольный группы в течение 14 дней оставались клинически здоровыми.

Полученные данные свидетельствуют о том, что выделенный возбудитель патогенен для щенков собак и вызывает заболевание, по клиническим, паталогоана-томическим признакам и характеру размножения в культуре клеток сходен с возбудителем коронавирусного энтерита.

Культуральныа свойства. При выборе чувствительной клеточной системы исследовали 10 видов первичных и перевиваемых культур клеток.

На сформированный клеточный монослой вносили вирус с активностью 1д 6,5 ТЦЦ 50/мп в дозе 0,1 ТЦД5о/ш! на клетку и после одного часа контакта при 37° С добавляли поддерживающую среду. Культивирование продолжали при•температуре 37-37,5″ С в течение 7 суток и зараженную культуру ежедневно просматривали под микроскопом. Размножение коронавируса собак в культуре клеток ПЩ, .МДСК, СЯГК, А-72 и СС-81 сопровождалось характерным цитопатическим эффектом.

Накопление вируса в чувствительных тест-культурах клеток после пятого пассажа составляло от 5,5 1д ТЦЦ 50/мл до 6,5 1д ТЦЦ’50/мл.

Данные этих опытов свидетельствуют, что выделенный возбудитель размножается в первичной культуре клетрк почки щенка, перевиваемых линиях клеток МДСК и СИГК и не размножается в культуре клеток почки эмбриона свиньи, что характерно для коронавируса собак. Наиболее высокое накопление вируса ( 6,5 1д ТЦЦ 50/мл) отмечали в перевиваемой культуре клеток

Размножение коронавируса совах в клеточных культурах

N п/п Наименование :Срок появ-! культуры клеток: ления ЦПЭ : (сутки) : Степень выраженности ЦПЭ : Титр инфекционной активности : (19)

1. CRFK 3 +++ 6,5 + 0,25 ТЦД50/МЛ

4. ПЩ(первичная культура) 7 +++ 5,75 + 0,5 ТЦД5о/«

5. ГОД(суй. Культура) 7 +++ 5,5 + 0,25 ТЦЦ5о/-л

Возможность лиофилиэации вируса была проверена с наиболее распространенными защитными средами: средой ВГНКИ № 3, обезжиренным молоком и сорОит-желатозной средой. Среды готовили на фосфатном буфере с рН •* 7,0. Стабилизирующие среды смешивали с вируссодержа-щей суспензией в соотношении 1:1.

Из изученых нами сред лучшей защитной средой для лиофилизации и хранения коронавируса собак является среда высушивания ВГНКИ № 3. Инфекционная активность после сушки с этой средой снижалась только на 1 1д и в течение 12 месяцев хранения активность вируса ос-‘ тавалась стабильной.

Сушка со средами № 2 и о приводила к снижению активности вируса на 1,75-1,51д, а хранение в течение 12 месяцев снижало активность еще на 2-2,51д.

Хранение культуральной вирусной суспензии при температуре -40°С является оптимальной и вирус сохраняет свойства 12 месяцев.

Изучение действия физико-химических факторов. При изучении влияния химических средств инактивации в вирусную суспензию коронавируса собак с исходной активностью 6,5 1д Т1Щ50/ил вносили 1%-й формалин. Флаконы с вируссодержащей суспензией выдерживали при 37°С 2, 4, 24 и 48 ч. В пробах с вирусом спустя 2 часа инфекционная активность снижалась на 2,5-3 1д, а через 4 часа происходила полная инактивация вируса.

В результате проведенных исследований установлено, что при воздействии формалином на штамм «Карат», последний : теряет способность вызывать цитопатиче-ское действие в культуре клеток.

Коронавирус.собак является кислотоустойчивым вирусом’ и. сохраняет свою инфекционную активность в среде с рН 7,0-5,0. Активность вируса значительно снижалась при рН 3,0-3,5. После 24 часов хранения вируса в среде срН 3,0 при 4°С потеря вирусной ин-фекционности составила 3 1д ТЦД5ол»п

ты Сьши получены с метанолом и охлажденным до -20° ацетоном при экспозиции 15 минут.

Окрашивающий титр флюоресцирующих коньюгатов был равен 1:2-1:4. • Чтобы установить специфичность свечения антигена коронавируса собак, обработанного люминесцирующей сывороткой были проведены контроли, которые мы считаем весьма показательными, а именно: обработка препаратов с парвовирусом собак, с вирусом трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГЭС), коронавирусом телят, вирусом чумы плотоядных, вирусом болезни Ауе-ски, аденовирусом плотоядных, а также мазков-отпечатков тканей органов от здоровых животных люми-несцирующими антителами к коронавирусу собак.

Данные этого опыта представлены в таблице № 3, При окрашивании коныогагом препаратов с коронавирусом собак в поле зрения наблюдали»изумрудно-зеленое свечение, окрашивание препарата с коронавирусом собак флюоресцирующей нормальной сывороткой свечения не дало. Обработка препаратов с вирусом чумы плотоядных, парвовирусом собак, вирусом болезни Ауески и аденовирусом плотоядных не приводила к свечению.антигенов этих вирусов. . >,

Препараты с вирусом ТГЭ и коронавирусом телят, просматриваемые под люминесцентным микроскопом, имели свечение, но болеа слабое по срааягм^е со свечением препаратов, содержащих коронавирус собак. Эти два вируса антигенно родственны коронавирусу собак и люминесцентное свечение препаратов подтверждает это.

Интенсивность свсчеяи» ютягемп, обработжныт люминеецнрумхчей сывороткой ккоромааарусу собак

Исследуемис вкруси Количество исследуемых препарат* Интенсивность саеченм Отсутствие свечеяя* пр обработке нормальной флюоресцирующей сыаоротеой

Короижвирзп собак штамм «Карат» 12 9 3 0 12

X Парвовирус собак штамм «Чин* 4 — 4 4

4. Корошкирус телят ппамм «КП-83» 4 а > 4

5. Вирус чумы плотоялшл штамм «Береговое’* 4 4 4

6. Вирус болезни Ауе-ска пггамм «Арский» 4 4 4

7. Аяеповврус шгатоад-т штамм «Ада* 4 — — 4 4

8. Препараты от здоровых животных 10 10 10

Опыты показали, что полученная люминесцирущая сыворотка к коронавирусу собак явилась специфической и не содержала свободного красителя.

Метод флюоресцирующих антител к коронавирусу собак был применен для: ;

— изучения локализации вирусного антигена в клетке на уровне световой микроскопии;

— изучения динамики накопления коронавируса собак в зараженной клетке.

Для приготовления препарата использовали суб.культуру клеток почки щенка собаки(ПЩ), трипси-низированную по общепринятой методике.

Было установлено, что через 24 часа после инфицирования в культуре клеток наблюдали округлые, отрос-чатые, хорошо.распластанные на стекле клетки с се-

ровато-зеленоватой цитоплазмой и ядром со слабо светящимися ядрышками. В пораженных клетках отмечали яркое свечение отдельных мелких гранул в цитоплазме вблизи ядра. Клетки Сыпи распластаны на стекле, ци-топатический эффект отсутствовал, а спустя 48 часов после заражения клетки становились веретеновидными и в цитоплазме -вокруг ядра йаблюдали более интенсивное свечение. Клеточное ядро хорошо просматривалось, но не флуоресцировало. Через 12 часа после заражения, при 50% поражении клеточного монослоя, клетки становились сильно вытянутыми, отделялись от стекла и имели яркую флюоресценцию всей клеточной цитоплазмы. В контрольной культуре клеток ПЩ Ш. наблюдали слабое зеленоватое свечение всей клетки, с более интенсивным свечением ядрышек.

Люминесцентный метод исследования зараженных клеток позволил установить, что репродукция вируса происходит в цитоплазме клетки, а это характерно для РНК-содержащйх вирусов, к которым относится корона-вирус собак.

Установлено, что ухе через 24 часа послё заражения коронавирус усиленно репродуцируемся в цитоплазме зараженной клетки и может быть визуально обнаружен при помощи флуоресцентного метода диагностики.

В процессе исследования биологических свойств ко-ронавируса собак, были использованы такие методы его идентификации, как электронная микроскопия, выделение в чувствительных культурах клеток и метод флуоресцирующих антител.

Методами электронной микроскопии, выделения вируса в культурах клеток почки щенка, перевиваемой

линии клеток СЯГК и методом флуоресцирующих антител бьши исследованы 40 образцов патматериала, полученные от собак с клиникой коронавирусного энтерита и давшие отрицательный результат при исследовании на

наличие парвовируса. Патматериал от больных.щенков, проявивших выраженные клинические признаки болезни после заражения их штаммом «Карат», служил контрольным.

Наряду с иммунофлуоресцентным методом выявления вируса проводилась работа по изучению- возможности выделения вируса в культуре клеток.

С помощью флюоресцирующих антител нами было диагностировано 11 случаев заболевания коронавирусом собак в питомнике служебного собаководства «Красная звезда» и собак частных владельцев.

Все электронномикроскопические исследования патматериала от с’обак проводили совместно с Ю.И.Могильным, применяя метод негативного контрастирования. Коронавирусные частицы были обнаружены только в 4 пробах.

Попытки выделения коронавируса собак в культурах клеток из патматериала не всегда были успешны, так как данный вирус очень трудно адаптируется к культуре клеток. . ■ ‘

Таким образом, применение меченых сывороток является более быстрым и точным методом индикации антигена коронавируса собак в тканевой культуре и в исследуемом материале. Иммунофлуоресцентным метод, по нашему мнению, можно использовать для изучения патогенеза коронавируса собак, так как он ппляется

достаточно точным и по эффективности превосходит вирусологический. ‘

1. Впервые в нашей стране у щенков соОак установлено заболевание с клиническими признаками диареи, вызываемое.коронавирусом.

2. От больного щенка в перевиваемой культуре клеток СЕШ Ольшанская, Алиса Алексеевна

кандидата биологических наук

Москва, 1997

ВАК 03.00.06

источник

ДАНИЛОВСКИЙ МИХАИЛ ВАСИЛЬЕВИЧ

ЛЕЧЕНИЕ ЧУМЫ И ПАРВОВИРУСНОГО ЭНТЕРИТА ПЛОТОЯДНЫХ ХИМИОПРЕПАРАТАМИ И ИММУНОСТИМУЛЯТОРАМИ

16.00.03. – ветеринарная микробиология, вирусология

эпизоотология, микология, иммунология

Диссертация на соискание ученой степени

кандидата ветеринарных наук

Работа выполнена в ветеринарной лечебнице «Айболит» г. Ульяновск

доктор биологических наук, профессор ВАСИЛЬЕВ Д.А.

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник ОБУХОВ И.Л.

РАХМАТУЛЛИН Э.К. –д.в.н., профессор УГСХА

СЕРЕДА А.Д.- д.б.н., ст. научный сотрудник ВНИИВВиМ

Ведущее учреждение – Всеросийский научно-исследовательский

институт защиты животных (ВНИИЗЖ)

Защита состоится «____» ___________2000 года в____часов на заседании диссертационного совета К 120.82.03 при Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.

Адрес: г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке УГСХА.

Автореферат разослан «____»___________2000г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы

Среди вирусных болезней плотоядных основное место принадлежит чуме и парвовирусному энтериту. Не отрицая ведущей роли вакцинопрофилактики в обеспечении защиты от названных болезней следует исходить из того, что снижение уровня распространения ряда инфекционных заболеваний плотоядных и летальности от них может быть достигнуто при активном научном поиске препаратов различной направленности.

Практика показывает, что хозяева домашних животных обращаются в ветеринарные учреждения, как правило, в период проявления клинических признаков инфекционных болезней. В этом случае ветеринарный врач приступает к лечению, не имея результатов лабораторного диагноза. Чем шире спектр действия применяемых препаратов, тем больше вероятность положительного результата лечения, поскольку в процессе развития вторичных иммунодефицитов при вирусных инфекциях начинают проявляться секундарные вирусные и бактериальные болезни. Поэтому, научный и практический интерес представляют комплексные препараты, блокирующие или тормозящие репродукцию вирусов и бактерий, стимулирующие иммунную систему животных.

Проблема неспецифической стимуляции системы иммунитета привлекает все больше и больше внимания. Это обусловлено рядом обстоятельств: снижением уровня кормления, контроля за инфекционными болезнями, экологическим загрязнением. Иммунодефицитные состояния сопровождаются, как правило, многими болезнями. Коррекция иммунной системы могла бы в значительной степени исправить положение. Одним из способов профилактики болезней животных, повышения их естественной резистентности является применение иммуностимулирующих препаратов.

Вещества, способные воздействовать на иммунитет, по происхождению можно разделить на три большие группы: экзогенные, эндогенные, синтетические. Экзогенные — включают препараты микробного происхождения, в основном бактериального и грибкового. Эндогенные — объединяют экстракты из органов иммунной системы, а также биологически активные белки, продуцируемые лимфоцитами и макрофагами. Синтетические — препараты микробного или животного происхождения; известные лечебные препараты, обладающие дополнительно иммунотропными свойствами; полученные в результате направленного химического синтеза.

Эффективность иммуностимулирующей терапии можно повысить сочетанным применением препаратов. Однако использованию иммуностимулирующей терапии препятствует отсутствие данных о сравнительной эффективности монотерапии иммуностимуляторами. Вышеизложенное свидетельствует, что поиск средств повышения иммунного статуса плотоядных и способов лечения вирусных инфекций является актуальной задачей ветеринарии.

В настоящее время спектр веществ, обладающих выраженной антивирусной активностью, как в профилактическом, так и терапевтическом аспектах весьма ограничен. Поэтому, помимо создания отечественных аналогов зарубежных препаратов научный и практический интерес представляет оценка применения противовирусных препаратов в практике.

Наиболее перспективными направлениями предупреждения и терапии инфекционный болезней являются следующие:

-блокирование или торможение репродукции вируса в очаге поражения, а также снижение уровня вирусемии с помощью высокоэффективных ингибиторов размножения вирусов;

-стимуляция иммунной реакции организма с помощью специфических вакцинных препаратов, а также неспецифических иммуностимуляторов.

1.2.Цель и задачи исследования

Целью данной работы было определить профилактический и лечебный эффект различных иммуностимуляторов и химиопрепаратов при чуме и парвовирусном энтерите плотоядных.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. определить эффективность противовирусных химиопрепаратов для лечения чумы и парвовирусного энтерита плотоядных;
2. исследовать влияние иммуностимуляторов на показатели неспецифической и специфической резистентности плотоядных животных, при экспериментальном иммунодефиците, вызванном вакцинацией;
3. изучить лечебную эффективность иммуностимуляторов на больных чумой и парвовирусным энтеритом собак;
4. оценить эффективность сочетанного применения вакцин с иммуностимуляторами;
5. дать рекомендации по лечению нервных форм чумы плотоядных с использованием иммуностимуляторов и химиопрепаратов.

1.3. Научная новизна

Установлено, что уровень вирусемии у леченных рибамидом животных резко снижался уже через сутки после начала лечения.

Впервые предложено использовать привитых вакциной Vanguard 5/L собак в качестве модели для изучения иммуномодуляторов при иммуносупрессивном состоянии.

Установлено, что из шести исследованных иммуностимуляторов только иммунофан и ГМДП стабилизирует бактерицидную активность крови и концентрацию IgG в сыворотке, сокращают срок лимфопении, т.е. реально обладают иммуностимулирующими свойствами.

Доказано, что иммуностимуляторы ГМДП и иммунофан повышают уровень поствакцинального гуморального иммунитета.

1.4. Практическая значимость

Предложено использовать иммунофан и ГМДП для лечения различных форм тяжести болезней, вызванных вирусами чумы плотоядных и парвовирусного энтерита плотоядных.

Разработаны оптимальные схемы лечения чумы и парвовирусного энтерита плотоядных химиопрепаратами ремантадин и риботан. Предложена схема лечения нервных форм чумы плотоядных комплексом этих препаратов и рекомендуется для внедрения в практику.

1.5. Апробация работы

Результаты исследования были доложены на республиканских и научно – практических конференциях с 1987 по 2000 г г.

1.6. Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 научные работы.

1.7. Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые на защиту

Разработанная схема фармакологического лечения инфекционных болезней плотоядных комплексом ремантадина и рибамида обеспечивает выздоровления более 90% животных.

Применение иммунофана и ГМДП повышает иммуногенность живых и инактивированных вакцин. Эти препараты можно рассматривать как адъюванты.

1.8. Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 118 листах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы (92 источников, в том числе 42 отечественных). Работа иллюстрирована 7 таблицами, 6 рисунками и дополнена приложениями.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы

Исследования проводили на собаках в возрасте от 3 месяцев до 8 лет.

В работе использовали вакцины Вакчум, Vanguard 5/L Мультикан-4; химиопрепараты ремантадин (-метил-1-аминометиладамантан хлоргидрат), виразол (1—D-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамид), продигиозан, мастим, риботан (1—D-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамид), миксоферон, иммунофан, N-ацетил-глюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланин-D-изоглутамин (ГМДП); глобулин против энтерита, гепатита, чумы.

Вакцинацию животных проводили согласно инструкциям изготовителей.

Фагоцитарную активность лейкоцитов крови учитывали по относительному количеству фагоцитирующих нейтрофилов и среднему количеству частиц поглощенных одним нейтрофилом.

Определение лизоцима осуществляли по способности лизоцима лизировать клеточную стенку Micrococcus lysodeikticus (Блумберг И.А. и Дундуре Б.Л., 1987).

Определение ВЧС-антигенов в крови и антител в сыворотке проводили с использованием реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) и реакции задержки пассивной гемагглютинации (РЗПГА), соответственно.

Антигены возбудителя парвовирусного энтерита определяли в реакции гемагглютинации (ГРА), а противовирусных антител — в реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

Определение концентрации сывороточных IgG проводили методом радиальной иммунодиффузии.

Статистическую обработку данных проводили с использованием персонального компьютера IBM PC/AT 486.

2.2. Результаты собственных исследований

2.2.1. Лечение чумы и парвовирусного энтерита плотоядных химиопрепаратами

Научный и практический интерес представляют препараты, блокирующие или тормозящие репродукцию вирусов. Нами исследовано действие ремантадина и рибамида в различных сочетаниях.

В первой серии экспериментов больных чумой плотоядных щенков собак по мере их поступления лечили по двум схемам. Всего в опыте было 26 животных, которых разделили на две группы (по 8 и 18 голов).

Первая, контрольная, группа животных (12 голов) была подвергнута лечению по традиционной схеме, направленной в первую очередь на устранение рвоты, обезвоживания организма, ацидоза и вторичных инфекций. Начинали с промывания желудка 0.1 %-ным раствором перманганата калия, затем внутримышечно инъецировали церукал в дозе 2 мл до прекращения рвоты, однократно — интерферон в дозе 1.5-2 мл и специфическую трехвалентную сыворотку — 2 мл два раза в день в течение 3-4 суток. Внутривенно вводили по 15-20 мл 5%-ного раствора глюкозы. Внутрь давали сульфадимезин в дозе 0.25 г три раза в день в течение 3-5 суток.

Второй, опытной, группе (18 голов) вместо интерферона вводили ремантадин внутримышечно в дозе 20 мкг/кг массы тела ежедневно в течение 5 суток и одновременно препарат задавали с водой в дозе 40 мг/кг массы тела ежедневно в течение 5 суток.

В первой группе пали 3 животных (25 %), остальные выздоровели, явные признаки улучшения клинического состояния наблюдали через 3-4 дня после начала терапии. Во второй группе пало 1 животное (5.6 %). Явные признаки улучшения клинического состояния наблюдали уже на 2-3 сутки после начала терапии. Побочного действия препарата не зарегистрировано.

В сравнительном аспекте была определена вирусемия у собак, больных чумой или парвовирусным энтеритом плотоядных, леченных без и с ремантадином. Было установлено, что ремантадин подавляет репродукцию возбудителя чумы плотоядных, но никак не репродукцию возбудителя парвовирусного энтерита.

Во второй серии экспериментов исследовали эффективность рибамида при лечении чумы и парвовирусного энтерита плотоядных.

Больные, ранжированные по возрасту животные были разделены на 6 групп в зависимости от предварительного диагноза болезни и применяемого для лечения химиопрепарата.

а) при парвовирусном энтерите лечение собак начинали с промывания желудка 0,1 %-ным раствором перманганата калия, затем внутримышечно инъеци­ровали церукал в дозе 2 мл до прекраще­ния рвоты, однократно интерферон в дозе 1,5-2 мл. Подкожно вводили по 10-20 мл физиологи­ческого раствора, внутривенно — по 10-20 мл 5 %-ного раствора глюкозы. Внутрь давали суль­фадимезин в дозе 0,25 г три раза в день в течение 3-5 суток;

б) при чуме плотоядных антибактериальных средств использовали внутримышечно ампициллин – 25 000 ед., гентамицин — 2,5 мг на 1 кг массы тела два раза в сутки. При нарушении функции желудочнокишечного тракта назначали церукал — по 0.25 г три раза в сутки. При диарее давали внутрь бифекол из расчета одна доза на 10 кг массы тела два раза в сутки. Кроме того, при необходимости осуществляли капельное введение смеси 0,5 %-ного раствора глюкозы с изотоническим раство­ром натрия хлорида.

Схема 2 – дополнительно к схеме 1 применяли рибамид в первый день двукратно 40 и 20 мг/кг, во второй – 20 мг/кг трехкратно, в третий и четвертый – по 20 мг/кг двукратно.

Схема 3 – дополнительно к схеме 1 применяли рибамид в первый и второй день по 40 мг/кг однократно.

Результаты представлены в табл. 1.

Таблица 1. Результаты лечения рибамидом собак, больных чумой или парвовирусным энтеритом плотоядных.

В рамках этого опыта у некоторых животных определяли уровень вирусемии возбудителя чумы и парвовирусного энтерита плотоядных. Установлено, что уровень вирусемии у леченных рибамидом животных резко снижался уже через сутки после начала лечения (рис. 1, 2). Через двое суток после начала лечения рибамидом в крови у собак вирсспецифические антигены практически не обнаруживаются, что свидетельствует об отсутствии репродукции вируса.

Полученные данные убедительно показывают, что рибамид оказывает защитный эффект при лечении собак, больных чумой и парвовирусным энтеритом плотоядных.

Однако введение больших доз рибамида (по схеме 2) вызвало у 4 собак (10 % от общего числа) побочный эффект (рвота, тахикардия). Представляло интерес применение комбинации рибамида и ремантадина, имеющих различия в механизме антивирусного действия.

В третьей серии экспериментов восемь больных чумой плотоядных щенков собак, начиная со 2-х суток после подъема температуры до 41 OС, лечили комплексом ремантадина (10 мкг/кг) и рибамида (20 мг/кг)

Рис. 1. Уровни вирусемии по данным РПГА у собак, больных чумой плотоядных, леченных по схеме 1 (А) и 2 (Б).

По оси абсцисс – сутки после начала лечения.

По оси ординат – титры вирусспецифических антигенов в крови больных животных (обратные значения).

Каждый вид штриховки соответствует одной особи.

Рис. 2. Уровни вирусемии по данным РГА у собак, больных парвовирусным энтеритом, леченных по схеме 1 (А) и 2 (Б).

По оси абсцисс – сутки после начала лечения.

По оси ординат – титры вирусспецифических антигенов в крови больных животных (обратные значения).

Каждый вид штриховки соответствует одной особи.

ежедневно в течение 5 суток. Дополнительно внутримышечно вводили ампициллин – 25 000 ед., гентамицин — 2,5 мг на 1 кг массы тела два раза в сутки. Церукал давали по 0.25 г три раза в сутки. В результате все животные выздоровели. Побочных эффектов от введения химиопрепаратов не установлено. Особого внимания заслуживают наблюдения, касающиеся эффективности применения ремантадина и рибамида для лечения нервных форм чумы плотоядных. Было обращено внимание, что у больных в острой

форме щенков, которых лечили с применением ремантадина или рибамидом, быстро исчезали признаки расстройства центральной нервной системы. Судорожные сокращения жевательных мышц и парезы задних конечностей прекращались через 16-24 часа от начала применения препаратов.

Нами наблюдались 7 собак (пять восточно-европейских овчарок, два сенбернара) в возрасте от 3 до 8 лет, у которых периодически проявлялись эпилептические припадки с обильным слюнотечением, клонически-тоническими судорогами. Все животные прошли длительное лечение: семь курсов введения ремантадина в дозе 10 мкг/кг и рибамина в дозе 20 мг/кг массы ежедневно течение 5 дней с интервалом 10 дней. В результате у 6 животных произошло улучшение состояния: припадки не проявлялись в течение 6-8 месяцев (срок наблюдения).

Таким образом, применение препаратов ремантадин и рибамид эффективно для лечения нервных форм чумы плотоядных.

2.2.1. Влияние иммуностимуляторов на иммунологические показатели интактных и вакцинированных собак

Использовали иммуностимуляторы: экзогенные — продигиозан и мастим, эндогенные — риботан и миксоферон, синтетические — иммунофан и N-ацетил-глюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланин-D-изоглутамин.

Для оценки действия препаратов на иммунную систему использовали доступные нам методы определения фагоцитарной активности лейкоцитов и бактерицидной активности сывороток крови, лизоцима в интраназальных смывах, концентрации лейкоцитов и лимфоцитов, а также иммуноглобулинов класса G в крови, активности антител, специфичных к возбудителям чумы и парвовирусного энтерита плотоядных.

У двух групп 3-х месячных щенков дога из одного помета (опытные – 4 головы, контрольные — 2 головы) мы определяли концентрацию лимфоцитов в крови до и после вакцинации опытной группы. Во избежании передачи вакцинного вируса группы содержали раздельно. Определение числа лимфоцитов крови и концентрации IgG в сыворотке у щенков собак, вакцинированных препаратом Vanguard 5/L, показало, что в течение 2 первых недель развивается иммуносупрессивное состояние, которое проявляется в развитии лимфопении и снижении концентрации IgG в сыворотке крови. Поэтому привитых этой вакциной животных можно использовать как модель для изучения иммуномодуляторов при иммуносупрессивном состоянии.

В следующей серии экспериментов привитым собакам в день вакцинации и последующие 2 суток вводили различные иммуностимуляторы и определяли иммунологические показатели. Группы животных формировали по 4-5 голов.

Прививка вакциной Vanguard 5/L приводила к снижению ряда показателей естественной резистентности собак в течение первых двух недель после вакцинации. В частности, снижались концентрации лимфоцитов и IgG в крови, бактерицидная активность сыворотки крови. Вместе с тем, достоверно не изменялись фагоцитарный индекс, фагоцитарное число, концентрация лизоцима в интраназальных смывах (табл. 2).

Таким образом, иммунофан и ГМДП положительно влияют на гуморальные и клеточные факторы естественной резистентности организма собак.

Иммуностимулирующий эффект данных препаратов был дополнительно изучен с отечественными вакцинами Вакчум и Мультикан-4. Щенков (по 6 голов в группе) в возрасте 3-3.5 месяцев прививали согласно наставлений по

Таблица 2. Иммунологические показатели у собак, получивших различные иммуностимуляторы

Таблица 3 (продолжение). Иммунологические показатели у собак, получивших различные иммуностимуляторы

применению и опытным группам однократно одновременно внутримышечно вводили по 1 мл иммунофана или 100 мкг/кг массы ГМДП. Определение титров вирусспецифических антител к возбудителям чумы и парвовирусного энтерита плотоядных осуществляли на 14, 28 и 112 сутки.

Полученные данные свидетельствуют, что иммуностимуляторы ГМДП и иммунофан повышают уровень поствакцинального гуморального иммунитета. Титры антител у животных, привитых с иммуностимуляторами были в 1.5-2 раза выше, чем у контрольных.

Иммунофан и ГМДП препараты были испытаны при лечении различных форм тяжести болезней, вызванных вирусами чумы плотоядных и парвовирусного энтерита плотоядных. Установлено, что препараты ГМДП и иммунофан при сочетанном применении с антибиотиками и специфическими глобулинами эффективны для лечения чумы, парвовирусного энтерита плотоядных. Препараты можно применять при лечении хронического течения чумы собак, а также в случаях поражения нервной системы.

1. Прививка вакциной Vanguard 5/L вызывает временное иммуносупрессивное состояние, которое проявляется в лимфопении и снижении концентрации IgG в период с 3 по 14 сутки. Щенков собак, привитых этой вакциной, можно использовать как модель для изучения вторичных иммунодефицитов.
2. Сочетанное с прививкой применение иммунофана или ГМДП в 3-4 раза увеличивает титры поствакцинальных антител к возбудителям парвовирусного энтерита и чумы плотоядных. Одновременно стабилизируется бактерицидная активность крови и концентрация сывороточных IgG, сокращается срок лимфопении.
3. Препараты ГМДП и иммунофан при сочетанном применении с антибиотиками и специфическими глобулинами эффективны для лечения чумы, парвовирусного энтерита плотоядных. Препараты можно применять для лечения хронического течения чумы собак, а также в случаях поражения нервной системы.
4. Лечение чумы плотоядных, предусматривающее в дополнение к традиционной схеме введение ремантадина внутримышечно в дозе 20 мкг/кг массы тела и с водой в дозе 40 мг/кг ежедневно в течение 5 суток, обеспечивает сокращение срока вирусемии и увеличивает процент выздоровевших животных.
5. Рибамид демонстрирует высокий лечебный эффект в рамках комплексной терапии болезней, развитие которых сопряжено с инфекцией, вызываемой патогенными вирусами. Разработанная схема фармакологического лечения инфекционных болезней плотоядных, предусматривающая инъекции рибамида в первый день двукратно 40 и 20 мг/кг, во второй – 20 мг/кг трехкратно, в третий и четвертый – по 20 мг/кг двукратно, обеспечивает выздоровление более 90% животных.
6. Комбинированное применение ремантадина и рибамида оказывает лечебный эффект на собак, больных нервными формами чумы плотоядных.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для лечения различных форм тяжести болезней, вызванных вирусами чумы плотоядных и парвовирусного энтерита плотоядных целесообразно иммунофан и ГМДП.

Разработаны оптимальные схемы лечения чумы и парвовирусного энтерита пл

«УТВЕРЖДАЮ С.В.Абламейко (подпись) 20 г. ЗАДАНИЕ на закупку(государственную закупку) товаров (работ,услуг) Раздел I 1. Предмет закупкиИзготовление печатной продукции № п/п Классификация по ОКРБ-007-2007 Наименование подлежащих закупкеуслуг Требования, предъявляе-мые к товарам Количество (объем),закупаемойпродукции-тираж, экз. Условия оплаты товаров Срок изготовления продукции Ориентировочнаягодовая стоимость закупки, бел. руб. »

«ЕГОРОВА Виктория Евгеньевна КАНОНИЧЕСКИЕ ФОРМАЦИИ И КЛАССЫ ФИТТИНГА КОНЕЧНЫХ ГРУПП Специальность 01.01.06 – математическая логика, алгебра и теория чисел АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва — 2010 Работа выполнена на кафедре алгебры математического факультета Московского педагогического государственного университета. Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор ВЕДЕРНИКОВ Виктор Александрович. »

«ЧЕРНОВ Александр Владимирович ЛЕЧЕНИЕ АБДОМИНАЛЬНЫХ ГРЫЖ И ДРУГИХ ДЕФЕКТОВ БРЮШНОЙ СТЕНКИ КОШЕК И СОБАК С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИМПЛАНТАТА ИЗ НИКЕЛИДА ТИТАНА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-КЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) 16.00.05 – ветеринарная хирургия АВТОРЕФЕРАТ Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Троицк – 2006 Работа выполнена в Южно-Уральском научном центре Российской академии медицинских наук, ГУ Клинический центр гастроэнтерологии, ФГОУ ВПО Уральская. »

«Приложение №1 к приказу ректора от 11.02. 2010 г. №461 Требования к оформлению статьи Рукопись объемом 4 полных страницы ф. А-4 (включая рисунки, графики, таблицы, библиографический список и т.д.) представляется отредактированная, в виде распечатанного текста с пронумерованными страницами с обязательным представлением диска (CD, DVD) со статьей. Правка текстов от руки не допускается. Сборник докладов будет издан способом оперативной печати непосредственно с оригиналов, подготовленных авторами. »

«Агеев Сергей Александрович Сохранение локальных исторических комплексов методами градостроительного регулирования 18.00.04 — Градостроительство, планировка сельских населенных пунктов АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата архитектуры Москва 2005 Диссертация выполнена на кафедре Основы теории градостроительства Московского архитектурного института (Государственной академии) Научный. »

«Вобленко С. В.1 Вобленко Н. А.2 О МЕСТНОМ САМОУПРАВЛЕНИИ И ЗАДАЧАХ ЭКОНОМИЧЕСКОЙ И ДРУГИХ ГУМАНИТАРНЫХ НАУК Идея статьи появилась в процессе рецензирования одним из авторов авторефератов диссертаций на соискание ученой степени кандидата экономических наук по специальностям Экономическая теория, Финансы, денежное обращение и кредит, Экономика и управление народным хозяйством, исследовавших проблемы местного самоуправления. Задачи статьи: 1) обобщить недостатки диссертационных исследований, 2). »

«Дмитриева София Леонидовна Развитие системы управления подразделениями промышленных предприятий топливно-энергетического комплекса Специальность 08. 00. 05. – Экономика и управление народным хозяйством (Специализация — 1. Экономика, организация и управление предприятиями, отраслями, комплексами (промышленность) Область исследования: 1.13 — Инструменты и методы менеджмента промышленных предприятий, отраслей и комплексов; 1.19 – Методологические и методические подходы к решению. »

«ОВСЯННИКОВА НАТАЛЬЯ ИГОРЕВНА ЗАДАЧА ОПТИМАЛЬНОГО УПРАВЛЕНИЯ В МОДЕЛИ ЭПИДЕМИИ Специальность 01.01.09 – Дискретная математика и математическая кибернетика АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук Москва – 2010 Работа выполнена на кафедре прикладной математики Поморского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова, г. Архангельск Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор Андреева Елена Аркадьевна. »

«Цветкова Евгения Геннадьевна ПОСТРОЕНИЕ ОПТИМАЛЬНЫХ ПРОСТРАНСТВЕННЫХ ФИГУР МЕТОДАМИ НЕЛИНЕЙНОГО ПРОГРАММИРОВАНИЯ 01.01.09 – Дискретная математика и математическая кибернетика Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Тверь – 2009 Работа выполнена на кафедре компьютерной безопасности и математических методов управления Тверского государственного университета Научный руководитель доктор физико-математических наук, профессор. »

«АЛЕКСЕЕВА ИРИНА ВЛАДИМИРОВНА Технологические и биофармацевтические основы создания лекарственных форм, содержащих местный анестетик анилокаин 15.00.01 – Технология лекарств и организация фармацевтического дела автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук Пермь – 2007 Диссертационная работа выполнена в ГОУ ВПО Пермская государственная фармацевтическая академия Росздрава Научные консультанты: