Меню Рубрики

Реакция преципитации в агаре дифтерия

Реакции агглютинации
В этих реакциях принимают участие антигены в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и другие корпускулярные антигены), которые склеиваются антителами и выпадают в осадок.
Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компонента: 1) антиген (агглютиноген); 2) антитело (агглютинин) и 3) электролит (изотонический раствор натрия хлорида).
Аг + АТ + электролит = агглютинат

1.Постановка ориентировочной реакции агглютинации (РА) на стекле с целью идентификации бактерий кишечной группы.

Рис. 2. РА на стекле.

На предметное стекло наносят каплями:

1-ая капля: — агглютинирующая сыворотка к возбудителям дизентерии;
2-ая капля: — агглютинирующая сыворотка к возбудителям брюшного тифа;
3-ья капля: — физиологический раствор (контроль).
Добавляют в каждую каплю исследуемую чистую культуру бактерий. Перемешивают.

Примечание: положительный результат — наличие хлопьев агглютината,
отрицательный — отсутствие хлопьев агглютината
Заключение: Исследуемые бактерии являются возбудителями брюшного тифа.

2.Учет результатов РНГА, поставленной с целью обнаружения ботулотоксина.

Возбудитель ботулизма — Clostridium botulinum вырабатывает токсины семи сероваров (А, B, C, D, E, F, G), однако чаще других встречаются серовары А, В, Е. Все токсины отличаются по антигенным свойствам и могут быть дифференцированы в реакциях типоспецифическими сыворотками. Для этой цели можно поставить реакцию пассивной (непрямой) гемагглютинации с сывороткой больного, в которой предполагается наличие токсина, и эритроцитами, нагруженными антителами антитоксических противоботулинических сывороток типов А, В, Е. Контролем служит нормальная сыворотка.

Рис. 3. Постановка и результат РНГА.

Учет. В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (перевернутый зонтик), в отрицательном — оседают в виде пуговки или колечка.

Вывод: В сыворотке больного обнаружен ботулотоксин тип Е.

Реакция преципитации –это формированиеи осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах. Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др.

3.Постановка и учет реакции кольцепреципитациидля определения видовой принадлежности кровяного пятна.

Постановка.В узкую пробирку №1 диаметром 0,5 см с неразведенной преципитирующей сывороткой против белков крови человека в количестве 0,3-0,5 мл, держа ее в наклонном положении, пастеровской пипеткой медленно по стенке наслаивается такой же объем антигена (экстракт кровяного пятна). В пробирку №2 приливают преципитационную сыворотку против белков барана, в пробирку №3 — физиологический раствор (контроль) и добавляют также, как в первую пробирку антиген. Пробирки осторожно, чтобы не смешать жидкости, ставят вертикально. При правильном наслоении преципитиногена на сыворотку четко обозначается граница между двумя слоями жидкости. Постановка реакции обязательно сопровождается контролями сыворотки и антигена.
Учет.Результаты реакции учитывают в зависимости от вида антигена и антител через 5-10 мин, 1-2 ч или через 20-24 ч. В случае положительнойреакции в пробирке на границе между сывороткой и исследуемым экстрактом появляется преципитат в виде кольца белого цвета.

Рис. 4. Реакция кольцепреципитации.

4.Определение токсигенности коринебактерий дифтерии в реакции преципитации в агаре.

Эта издавна используемая реакция преципитации, предложенная для определения токсичности коринебактерий дифтерии, ставится на фосфатно-пептонном агаре в чашке Петри. Вдоль ее посередине помещают полоску стерильной фильтровальной бумаги, смоченной антитоксической сывороткой. После подсушивания на расстоянии 1 см от края полоски бляшками диаметром 10 мм подсевают выделенные культуры. В одной чашке можно сеять от 3 до 10 культур, одна из которых, контрольная, должна быть заведомо токсигенной. Посевы помещают в термостат.

Учет реакций проводят через 24-48-72 ч. Если культура токсигенная, на некотором расстоянии от полоски бумаги возникают линии преципитата, совпадающие с линиями преципитата контрольной культуры. Они имеют вид «стрел-усиков», которые хорошо видны в проходящем свете.

Рис. 5. Реакция преципитации в агаре.

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ ВЫЯВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ

5. Постановка непрямой реакции гемагглютинации (РНГА) выявления титра специфических антител у больного.

В реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) в качестве носителя используют эритроциты. Нагруженные антигеном эритроциты склеиваются в присутствии специфических антител к данному антигену и выпадают в осадок. Сенсибилизированные антигеном эритроциты используют в РПГА как эритроцитарный диагностикум для обнаружения антител (серодиагностика).
Постановка. В лунках полистироловых планшетов готовят ряд последовательных разведений сыворотки. В предпоследнюю лунку вносят — 0,5 мл заведомо положительной сыворотки и в последнюю 0,5 мл физиологического раствора (контроли). Затем во все лунки добавляют по 0,1 мл разведенного эритроцитарного диагностикума, встряхивают и помещают в термостат на 2 ч.
Учет. В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (перевернутый зонтик), в отрицательном — оседают в виде пуговки или колечка.

Рис. 6. Результат РНГА. Титр антител — 1:100.

6. Постановка развернутой реакции агглютинации с целью выявления титра специфических антител у больного.

Развернутая РА для серодиагностики ставится в сыворотке больных. Ее разводят и изотоническом растворе натрия хлорида от 1:50 — 1:100 до 1:800 или 1: 1600. Так как в более низких титрах сыворотки могут находиться нормальные агглютинины, имеющиеся у здоровых людей или больных с другим диагнозом (диагностический титр). В качестве антигена в этой реакции используют диагностикумы — заведомо известные взвеси, как правило, убитых бактерий, с которыми безопасно работать.
Ставят реакцию следующим образом. В агглютинационные пробирки предварительно разливают по 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. В первую из них доливают 1 мл сыворотки, разведенной 1:100, и, смешав ее, 1 мл переносят во вторую, из второй — в третью и т.д. В полученные двухкратные разведения сывороток (от 1:100 до 1:1600 и более) вносят по 1-2 капли взвеси бактерий, содержащей 3 млрд микробных тел в 1 мл. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37°С на 2 часа, затем сутки выдерживают при комнатной температуре.

Учет реакции развернутой агглютинации производят, оценивая последовательно каждую пробирку, начиная с контрольных, при осторожном встряхивании. В контрольных пробирках агглютинации не должно быть. Интенсивность реакции агглютинации отмечают следующими знаками:++++ — полная агглютинация (хлопья агглютината в абсолютной прозрачной жидкости); +++ — неполная агглютинация (хлопья в слабоопалесцирующей жидкости); ++частичная агглютинация (хлопья четко различимы, жидкость слегка мутная); + — слабая, сомнительная агглютинация — жидкость очень мутная, хлопья в ней плохо различимы; — отсутствие агглютинации (жидкость равномерно мутная).
За титр сыворотки принимают последнее ее разведение, в котором интенсивность агглютинации оценивается не менее чем два плюса (++)

Рис. 7. Развернутая реакция агглютинации.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

Реакция преципитации в агаре как метод дифференцирования белков филогенетически близких видов животных

Кафедра судебной медицины (нач. — А.Р. Деньковский) Военно-медицинской ордена Ленина академии им. С.М. Кирова, Ленинград

Поступила в редакцию 15/VIII 1964 г.

библиографическое описание:
Реакция преципитации в агаре как метод дифференцирования белков филогенетически близких видов животных / Чарный В.И. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 1964. — №4. — С. 35-38.

Реакция специфической преципитации в геле (агаре) получила широкое распространение в иммунологии и в последние годы подверглась экспериментальному изучению с целью внедрения ее в судебно-медицинскую практику.

А.К. Туманов и И.С. Лазуренко, а также А.С. Гаркави считают, что эту реакцию можно использовать в судебной медицине для определения видовой принадлежности крови и белка различных биологических объектов. Основным ее преимуществом является возможность исследования мутных и загрязненных объектов. Она весьма специфична, что, в частности, установлено при исследовании вытяжек из костной ткани, подвергавшейся температурному воздействию.

Возможности применения в судебно-медицинской практике реакции преципитации в агаре не исчерпываются обычным установлением видовой специфичности крови или других белков животного происхождения.

Обычные преципитирующие сыворотки, применяемые в настоящее время при экспертизе пятен крови и других объектов, не являются специфичными только для одного вида животных. Так, например, сыворотка, преципитирующая белок рогатого скота, дает преципитат с белком как крупного рогатого скота (быка), так и мелкого (барана). Чтобы определить, какому именно виду рогатого скота принадлежит кровь на вещественном доказательстве, необходимы специальные сыворотки, преципитирующие белок крупного или мелкого рогатого скота. Однако и эти сыворотки не являются строго специфичными: они позволяют дифференцировать филогенетически близкие виды животных только по скорости наступления реакции. При этом нужно иметь в виду, что эта скорость в значительной степени зависит от концентрации исследуемого белка-антигена. Неточно выбранная концентрация может вызвать серьезные затруднения в оценке результатов реакции.

Для дифференцирования белков животных родственных видов рекомендуют также использовать обычные, но специально подобранные преципитирующие сыворотки. Естественно, что при этом трудности исследования еще более возрастают, и ответ, как правило, может быть лишь предположительным (А.С. Гаркави).

Наши исследования показали, что в судебно-медицинской практике для дифференцирования белков филогенетически близких видов животных можно использовать реакцию преципитации в агаре.

В 1953—1958 гг. Ouchterlony предложил модификацию реакции преципитации в геле, которая позволяет определять спектр антигенов в антигенных комплексах, непосредственно сравнивать 2 антигена, находить в них родственные и неродственные компоненты. Эта методика нашла широкое применение при иммунологическом анализе (Л.А. Зильбер и Г.И. Абелев; В.А. Парнес и др.). Реакцию проводят в плоской пластинке агара, в которой вырезают резервуары для антигенов и преципитирующих сывороток. Антигены и антитела диффундируют в агаре навстречу друг другу. Отдельные компоненты антигена и антисыворотки движутся с различной скоростью. В промежутках между резервуарами антигена и антисыворотки в зоне оптимальной концентрации формируются линии преципитата. Число линий преципитации зависит от спектра антигенного комплекса, выявляемого данной сывороткой, а также от количественного соотношения между антигеном и антителом.

Для сравнения двух систем антигенов в пластинке агара вырезают 3 резервуара, в которые помещают сравниваемые сложные антигены и соответствующую им преципитирующую сыворотку. Если в сравниваемых системах имеются общие компоненты, то их зоны диффузии соединяются и образуют общий фронт, который при встрече с фронтом антител дает дугообразную полосу преципитации (реакции идентичности; рис. 1,а). В случае, когда сравниваемые антигены различны, линии преципитации не сливаются, а перекрещиваются (реакция различия; рис. 1,6). И, наконец, при частичном сходстве антигенов образуется общая дуга преципитации, от которой отходит отросток («шпора»), формирующийся за счет компонента, имеющегося только у одного из двух сравниваемых антигенов (реакция неполной идентичности; рис. I, в).

Реакцию преципитации в агаре обычно проводят в чашках Петри или на стеклах различных размеров. Мы использовали чашки Петри.

Рис. 1. Виды сравнительной реакции преципитации в агаре.
А, Б., АX — сравниваемые антигены; С — преципитирующая сыворотка, а — реакция идентичности, б — реакция различия, в — реакция неполной идентичности.

Для проведения реакции прежде всего нужно приготовить агаровый гель. Лучшее разделение компонентов исследуемых антигенных комплексов достигается применением 1,5% агара, хотя диффузия в нем происходит несколько медленнее. Берут 3 г агар-агара, заливают дистиллированной водой до 100 мл, разогревают на водяной бане и наливают в ванночку слоем толщиной 1 — 1,5 см. После застывания агар разрезают на небольшие кубики, которые промывают в течение 2 дней проточной водопроводной водой, а затем в течение суток — дистиллированной водой, меняя ее I—6 раз. Воду сливают, агар снова разогревают на водяной бане и добавляют 100 мл 1,7% раствора хлористого натрия.. Горячий агар фильтруют через ватно-марлевый фильтр и разливают в колбочки по 25 — 30 мл. В каждую колбу вносят кристаллик тимола для консервации. Готовый агар можно хранить в холодильнике 4—5 недель.

Перед употреблением агар разогревают па водяной бане и разливают в чашки Петри слоем 4—6 мм. После застывания в нем металлическими пробойниками диаметром 5—8 мм в зависимости от условий опыта по определенному рисунку на бумаге вырезают отверстия в виде треугольника или шестиугольника с дополнительным отверстием в центре. Из отверстий агар удаляют специальной ложечкой или отсасыванием с помощью трубки несколько меньшего диаметра, чем отверстия в агаре. Расстояние между краями отверстий 5—8 мм. На дно их лучше поместить по одной капле расплавленного агара, чтобы реагенты не подтекали под слой геля. Исследуемые антигены и преципитирующую сыворотку заливают по 3—6 капель в отверстия в агаре, и чашки Петри ставят при комнатной температуре в эксикатор с ватой, смоченной водой. Результаты реакции периодически проверяют. Обычно полосы преципитации появляются на следующий день и достигают хорошей выраженности через 2—4 дня. Результаты опытов можно фотографировать с помощью фотоаппарата или, еще проще, контактным путем на особо контрастной бумаге. Для устранения бликов во время фотографирования в чашки Петри рекомендуется наливать небольшое количество воды.

По описанной методике мы провели несколько серий опытов. I серию поставили с кровью коровы и барана и сывороткой, преципитирующей белок рогатого скота. Брали как нативные сыворотки коровы и барана, так и пятна крови (давность до 10 месяцев) этих животных на различных тканях.

Полученные антигенные спектры нативной сыворотки коровы и барана оказались сходными между собой, число линий преципитации зависело от концентрации сывороток. Следует заметить, что преципитирующие сыворотки всегда вводили в неразведенном виде.

С цельными сыворотками коровы и барана образовывалось до 6 линий преципитата. При сравнительном исследовании выяснилось, что все полосы преципитации, образованные сывороткой коровы, сливаются с полосами, возникшими при реакции с сывороткой барана. Однако при слиянии некоторых полос образуются отростки («шпоры») за счет определенных компонентов, имеющихся в одном антигенном комплексе и отсутствующих в другом.

Затем было установлено, что с разведением исследуемых сывороток коровы и барана число полос преципитации уменьшается, а на оставшихся «шпоры» становятся более заметными. Оптимальной концентрацией, при которой наиболее ярко выявляются различия между белками коровы и барана, является разведение сыворотки в 10—100 раз. При этом отчетливо выявляются 2 полосы, на которых при сравнительном исследовании формируются «шпоры».

Читайте также:  После прививки от дифтерии шишка на спине

Рис. 2. Контактная фотография реакции преципитации в агаре.
В резервуарах по переферии — вытяжки из пятен крови коровы (/) и барана (//). В центре — сыворотка, преципитирующая белок рогатого скота.

Рис. 3. Контактная фотография реакции преципитации в агаре.
К — вырезка из пятна крови курицы, У — вырезка из пятна крови утки. В третьем резервуаре — сыворотка, преципитирующая белок птицы.

В дальнейшем опыты проводили с вытяжками из пятен крови коровы и барана. Картина была аналогична той, которая наблюдалась в опытах с нативными сыворотками. Это не должно удивлять, так как известно, что гемоглобин не принимает значительного участия в реакции преципитации, идущей главным образом за счет сывороточных белков; последние хорошо сохраняются при высушивании.

Таким образом, нам удавалось четко дифференцировать белки коровы и барана в пятнах крови давностью до 10 месяцев (рис. 2). Опытов с более «старыми» пятнами не проводили.

II серию опытов проводили с вытяжками из пятен крови курицы, индюка и утки и сывороткой, прецепитирующей белок птицы. Разведенные до желто-коричневого цвета (приблизительно в 10 — 100 раз) вытяжки из пятен крови курицы и индюка образовывали с преципитирующей сывороткой по 2 основные линии преципитации. То же наблюдалось и тогда, когда в резервуары в агаре помещали непосредственно вырезки из пятен размером приблизительно 0,25 см’ 2 , которые заливали несколькими каплями физиологического раствора. При сравнительном исследовании пятен крови курицы и индюка можно было наблюдать типичную реакцию неполной идентичности: «шпора» образовывалась на линии преципитации, расположенной ближе к резервуарам с антигенами, за счет компонента антигена, имеющегося в крови курицы и отсутствующего в крови индюка.

Еще более резкая разница установлена между антигенным составом белков крови курицы и утки. В опытах с кровью утки при тех же условиях образовывалась только одна практически заметная полоса преципитации, соответствующая одной из двух полос, образуемых белками крови курицы и индюка (рис. 3). При постановке же реакции с сильно концентрированной вытяжкой из пятна крови утки формировалась и вторая полоса преципитации, но в этом случае при сравнительном исследовании с вытяжкой из пятна крови курицы образовывалась отчетливо заметная «шпора».

При сравнительном исследовании пятен крови индюка и утки также образуется «шпора», но менее выраженная, чем при сравнительном исследовании крови курицы и индюка или курицы и утки. Это свидетельствует о том, что в применяемой в опыте преципитирующей сыворотке содержится недостаточное количество антител, необходимых для дифференцирования белков индюка и утки. Из этого можно сделать вывод, что для сравнительного исследования антигенов желательно иметь преципитирующие сыворотки с более широким спектром антител, т. е. менее специфичные в обычном нашем понимании.

Так как число преципитирующих полос и их интенсивность зависят от концентрации антигена, то при сравнительном исследовании желательно, чтобы сравниваемые вытяжки из пятен крови имели приблизительно одинаковую концентрацию белков. Учитывая простоту методики, опыты целесообразно ставить параллельно с различными разведениями вытяжек из пятен.

источник

В основе метода определения токсигенности коринебактерий дифтерии (тест Элека) лежит процесс встречной иммунодиффузии токсина и антитоксических антител в плотной питательной среде. В местах оптимального количественного соотношения между токсином, продуцируемым коринебактериями, и антитоксином, нанесенным на фильтровальную бумагу, происходит их взаимодействие с образованием преципитата в виде белой линии или «усов».

Токсигенность коринебактерий дифтерии определяют, как правило, в чистой культуре (отдельные колонии или культура со скошенного агара, или с пробы Пизу). Смесь колоний или культуры, загрязненные посторонней микрофлорой, также могут быть испытаны на токсигенность. При отсутствии, в этом случае, преципитатов в агаровом геле, опыт следует повторить с выделенными чистыми культурами.

Культуру засевают в виде «бляшек» диаметром 0,6-0,7 см на расстоянии 0,7-0,8 см друг от друга и 0,5 см от края полоски фильтровальной бумаги. На одну чашку следует засевать не более 10 «бляшек». Из них 6 «бляшек» испытуемой культуры, 4-контрольного штамма. При небольшом количестве испытуемого материала засевают 6 контрольных «бляшек» и 4 — испытуемых. Чашки с посевом помещают в термостат при 37 град. C.

Результат учитывают через 18-24 часа и 48 часов роста. Следует иметь в виду, что препарат антитоксической противодифтерийной сыворотки, помимо антител к дифтерийному антитоксину, содержит антитела к антигенам микробной клетки. Поэтому при постановке пробы на токсигенность с использованием данного препарата преципитаты могут образовываться не только в результате связывания токсина с антитоксином (специфические преципитаты), но и при взаимодействии антибактериальных антител с компонентами клетки коринебактерий дифтерии (неспецифические преципитаты). Последние могут формироваться как у токсигенных, в том числе и у контрольного штамма, так и у нетоксигенных коринебактерий дифтерии. Иногда отмечается появление множественных линий преципитации. Неспецифические преципитаты, как правило, слабо выражены, имеют нечеткие контуры, появляются чаще через 48-72 часа, в редких случаях могут появляться и на первые сутки. Критерием оценки специфичности преципитатов является слияние линий преципитации испытуемого штамма со специфическими линиями контрольного токсигенного штамма. В тех случаях, когда у контрольного штамма формируется несколько линий преципитации, специфическими следует считать более четкие и рано появляющиеся преципитаты. Поэтому просмотр чашек с пробой на токсигенность осуществляют через 18-24 часа от момента ее постановки. Если в течение данного времени у контрольного штамма линии преципитации не обнаруживаются, это свидетельствует о нарушении условий постановки реакции.

Варианты оценки результатов реакции:

  • 1. Испытуемые культуры коринебактерий дифтерии являются токсигенными, если образуемые ими линии преципитации сливаются или имеют тенденцию к слиянию с соответствующими специфическими линиями контрольного токсигенного штамма.
  • 2. Испытуемые культуры коринебактерий дифтерии являются нетоксигенными, если:
    • а) линии преципитации, образуемые испытуемой культурой, отсутствуют, при наличии специфических линий преципитации у контрольного штамма;
    • б) линии преципитации не могут слиться со специфическими линиями преципитации контрольного штамма, а скрещиваются или имеют тенденцию к скрещиванию с ними (неидентичные, неспецифические линии);
    • в) линии преципитации испытуемой культуры сливаются с неспецифическими линиями контрольного штамма;
    • г) линии преципитации испытуемой культуры перекрещиваются со специфическими линиями и сливаются с неспецифическими линиями контрольного штамма.

Очищенный ферментолизом и специфической сорбцией антитоксин не содержит антител к компонентам микробной клетки. При использовании этого препарата неспецифические линии преципитации не образуются.

источник

Данный вариант реакции преципитации применяется для обнаружения, например, токсина, вырабатываемого возбудителем при росте на агаре. Таким способом мы выявляем токсигенность коринебактерии дифтерии.

Для постановки данной реакции необходимо взять чашку с агаром, положить на ее середину полоску фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой, после чего провести перпендикулярно к полоске посев изучаемой культуры. Необходимо помнить, что на этой же чашке должен присутствовать посев заведомо токсигенной культуры, чтобы иметь положительный контроль.

При росте культуры токсин пропитывает агар, одновременно из фильтровальной бумаги противотоксические антитела пропитывают агар, и на месте их соединения образуется комплекс антиген-антитело, что становится видимым, как «усы» преципитации. Результат реакции представлен на рис. 13.

Рис. 13 Реакция преципитации в агаре.

РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ В ГЕЛЕ.

Этот метод еще имеет название иммунодиффузии в геле. Известны простая иммунодиффузия (по Удену), радиальная иммунодиффузия (по Манчини) и двойная (встречная) радиальная иммунодиффузия (по Оухтерлони).

Методы простой диффузии основаны на способности антигена, внесенного в лунки, диффундировать в гель. При постановке двойной диффузии антитела и антиген вносят в отдельные лунки. Обычно данные методы используют для выявления белковых антигенов в различных жидкостях и тканевых экстрактах.

Схема постановки и результаты реакции представлены на рис.

Диффузионный метод преципитации в геле. Принцип метода: вещества (антиген, антитела), диффундирующие в геле навстречу друг другу, реагируя между собой, образуют преципитат беловатого цвета разной конфигурации. В контроле он не наблюдается.

Ингредиенты и техника постановки реакции:

— Готовят 1 — 1,5 % голодный агар — агар, разливают его в горячем расплавлен­ном виде в любые стеклянные объекты: в чашки, на отмытые фотопластины, на предметные стекла (для микрометода). Дают застыть.

— Под объекты подкладывают бумажные расчерченные ориентиры и специальным пробойником делают на равном расстоянии друг от друга лунки. Дно их заливают 1 каплей жидкого агара для избегания затекания реагентов под агар.

— Вносят в лунки 0,1 — 0,5 мл испытуемого вещества (антигена) и напротив специфические преципитирующие сыворотки с антителами.

Рис.14 Реакция преципитации в геле.

— Выдержать в термостате 18 — 24 часа, накрыв реагенты крышкой или стеклом для предохранения от испарения.

— Учет результатов ведут по появлению линии преципитата между содержи­мым лунок.

— Метка позволяет дифференцировать родство между антигенами (рис. справа). Концевое слияние полос свидетельствует о полной идентичности антигенов; (а) при стыке полос — неполное родство (б) перекрест — разные антигены, но есть групповые антигены (в).

Капиллярная реакция преципитации подобна первым методам, но ставится в капиллярах из комплекта для определения СРБ (С реактивного белка).

Методика: В отличие от пробирочного метода первым набирают лёгкий по массе АГ, затем сюда же – сыворотку с тяжелым АТ. После этого оба капилляра вертикально фиксируют в пластине.

Учёт результата производят в опытной пробе по кольцу преципитации на границе АГ и АТ.

Рис. 15. Капиллярная реакция преципитации.

ИММУННОЭЛЕКТРОФОРЕЗ.

Метод объединяет реакцию преципитации в геле с электрофорезом. Для этого слой агара наносят на предметное стекло, на его разных краях вырезают две лунки, а в центре – разделяющую канавку. В лунки вносят смесь антигенов и проводят электрофорез в течение 1-2 часов. Различные антигены с разной скоростью перемещаются между катодом и анодом. Затем в канавку вносят преципитирующую сыворотку и через 5-7 суток в геле образуются зоны преципитации. Для лучшей визуализации агар окрашивают красителями (например, амидо черным).

Рис.16. Схема постановки иммуноэлектрофореза.

источник

Реакция Райта

Развернутая РА для определении АТ при бруцеллезе

1. Сыворотка, разведенная в физрастворе двукратно (АТ)

2. Единый бруцеллезный диагностикум (АГ) (голубой, единственный подкрашенный)

Механизм: при наличии АТ образуются хлопья агглютинации, оседающие на дно.

Титр АТ – наибольшее разведение, при котором еще есть агглютинация.

Реакция Манчини

Реакция преципитации в геле для определения уровня Ig – метод радиальной иммунодиффузии

Образцы исследуемых сывороток помещают в лунки агарового геля, который содержит АТ против IgG, IgM или IgA в известной концентрации. Диффундирующие в агар Ig образуют кольца преципитации с антиглобулиновыми антителами, размер которых зависит от содержания в сыворотке Ig соответствующего класса. . По разведениям стандартной сыворотки строится калибровочная кривая, по которой определяется уровень Ig в исслед.сыворотке. Уровень сывороточных Ig отражает функциональное состояние B-системы организма.

Постановка ориентировочной РА для определения неизвестного микроба

Компоненты: 1. Взвесь неизвестной культуры в физ.р-ре (АГ в электролите)

2. Диагностические аггл. сыворотки (АТ): н-р, 1) поливалентная эшерихиозная 2) типовые О-26, О-55, О-111.

Механизм: при соответствии антигена антителу – хлопья агглютинации.

Окраска по Граму (чистая культура)

Позволяет выявить особенности строения КС бактерий

Стекло обезжирить мылом. Капля 0,9% NaCl. Культуру бакпетлей в каплю. Сушим. Фиксируем (3 раза провести над пламенем горелки). Генцианвиолет (бумажки по Синеву) смочить водой 1-2 мин. Р-р Люголя – 1-2 мин. Стряхиваем и краситель, и Люголь. Этиловый спирт – 30-60 с, до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя (опустить 3 раза). Промывание водой. Фуксин Пфейффера – 3-5 мин. промыть водой. Грам(+) не обесцвечиваются спиртом и сохраняют окраску певрого красителя (многослойный пептидогликан КС взаимодействует с краской и задерживает её в комплексе с йодом), грам(-) обеспечиваются спиртом и окрашиваются вторым красителем.

Окраска по Гинса-Бури

Позволяет выявить капсулу бактерий (называется негативным, так как капсула не прокрашивается)

В каплю черной туши внести культуру, смешать и 2 стеклом со шлифованным краем приготовить мазок, как из крови. Высушить. Зафиксировать на воздухе. Фуксин Пфейффера – 1-2 мин. Капсула не воспринимает красители, поэтому окрашиваем бактерии и окружающий фон. Фон окрашивается тушью в черный цвет, а возбудитель фуксином в розовый цвет, при этом капсула видна в виде светлого ободка вокруг бактерий.

Окраска по Ожешко

Позволяет окрасить споры бактерий.

На нефиусированный мазок 0,5% HCl – 3 мин с прогреванием (протрава). промывание водой (осторожно). Фиксация в пламени спиртовки. Окраска по Цилю-Нильсену. Спора, как кислотоустойчивая структура красится в красный цвет, а цитоплазма клетки, как кислотонеустойчивая структура – в синий цвет.

Окраска по Цилю-Нильсену

Позволяет определить кислотоустойчивые бактерии.

Карболвый фуксин Циля 3-5 мин. Промывание водой. 5% H2SO4 1-2 мин (для обесцвечивания). промывание водой. Метиленовая синь 3-5 мин. Промывание водой. Кислотоустойчивые бактерии не обесцвечиваются после первого красителя, так как содержат больше липидов, воска, окислителей, поэтому окрашиваются в красный цвет. Кислотонеустойичвые бактерии и структуры обесцвечиваются после первого красителя, поэтому красятся в голубой цвет.

Тельца Бабеша-Негри

Цитоплазматические включения в нейронах (срезы аммонова рога и мозжечка), клетках слюнных желез при бешенстве – индикация вируса. Красные на голубом фоне.

Среда Эндо (диф.-диагн.) (МПА + 1% лактоза + осн.фуксин, обесцвеч. тиосульфитом натрия), Lac(+) – темно-красные колонии с металлич.блеском; для выявления энтеробактерий (сахаролитические свойства).

Среда Левина(диф.-диагн.) (МПА + 1% лактоза + метилен.синь и эозин), Lac (+) – насыщ. синего цвета; для выявления энтеробактерий (сахаролитические свойства).

Среда Плоскирева (диф.-электив.) (МПА + 1% лактоза + нейтр.красный + соли желч.к-т + бриллиант.зелен.) (для шигелл и сальмонелл); Lac (+) – красные.

Среда Раппопорта (желтая) (электив.-диф. для сальмонелл и шигелл) (МПБ + 1% желчь (электив.ф-р) + глю(диф.ф-р) + инд-р Андреде(кислый фуксин + NaOH): S.typhi –до кислоты (красный), S.paratyphi A,B – до кислоты и газа. Разливается в бутылки и колбы, т.к. в начале болезни сальмонеллы находятся в крови. Берут 5 мл крови и разбавляют в 10 раз (до 50 мл).

Читайте также:  Способы борьбы с дифтерией

ЩПВ — щелочно-пептонная вода (селектив) (1% пептонная вода + 0,5% NaCl + KNO3 + Nа2CO3; pH = 9,0). Щелочь – селективный фактер для холерного вибриона.

Сахарный бульон (универсальная) (триптоза + мясной экстракт + глю + NaCl )

КА (диф-диаг) (агар+эритроцитарная масса). Для определения гемолизирующих свойств бактерий. Гемолиз: α – Hb превращается в гемосидерин (зеленый), β – просветы вокруг колоний, γ – отсутствие гемолиза.

ЖСА (элективн)(МПА + желточная взвесь + 10% NaCl). Для выявления фермента патогенности лецитовиттелазы (лецитиназы). (+) помутнение вокруг колоний.

МПБ (универсальная)(мясная вода + пептон + 0,5% NaCl).

Китта-Тароцци (для анаэробов) (сахарный бульон + кусочки паренхиматозных органов (для адсорбции О2) + высокий столбик + слой вазелинового масла (для изоляции от атмосферного воздуха). Перед посевом среду прогревают на кипящей водяной бане в теч 10-15 мин для удаления воздуха

Вильсона-Блера (железосульфитный агар) (3% МПА + 1% глю + 20% сульфит натрия + 8% FeCl3) Разливают высоким столбиком, сверху – вазелиновое масло (для изоляции от атмосферного воздуха). Позволяет выявить сероводородную активность. Анаэробы образуют колонии черного цвета за счет восстановления сульфита натрия, который, соединяясь с FeCl3 дает осадок сульфата железа черного цвета.

Игла –синтетическая (13 АМК, 7 витаминов, на основе сбалансированного солевого раствора Эрла). Питательный раствор для культур клеток, используемых для культивирования вирусов.

199 – синтетическая(20 АМК, 17 витаминов, глюкоза, минеральные соли, пурины и пиримидины – всего 199 компонентов, на основе сбалансированного солевого р-ра Хенкса). Питательный раствор для культур клеток, используемых для культивирования вирусов.

· хроническая гонорея – кровь / серологическое

· острая гонорея — гной / бактериоскопическое, бактериологическое

· дизентерия – испражнения / бактериологическое

· холера – испражнения / бактериологическое

· брюшной тиф – кровь, испражнения / бактериологическое, серологическое

· коклюш – отделения из носоглотки / бактериологическое

· дифтерия – пленки / бактериологическое

· сибирская язва – содержимое карбункулов / бактериологическое

· корь – кровь / серологическое

· полиомиелит – кровь, ликвор / серологическое

Определение токсигенности дифтерийной палочки реакцией преципитации в геле

В чашку Петри с питат.агаром кладут полоску фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой. Засевают исследуемые культуры, в качестве контроля используют заведомо токсигенную культуру. При размножении токисгенной культуры в месте соединения токсина с антитоксином в плотной питательной среде образуется преципитат в виде белых линий – «усов».

Дата добавления: 2017-02-25 ; просмотров: 1602 | Нарушение авторских прав

источник

В основе метода определения токсигенности коринебактерий дифтерии (тест Элека) лежит процесс встречной иммунодиффузии токсина и антитоксических антител в плотной питательной среде. В местах оптимального количественного соотношения между токсином, продуцируемым коринебактериями, и антитоксином, нанесенным на фильтровальную бумагу, происходит их взаимодействие с образованием преципитата в виде белой линии или «усов».

Эпидемиология. Источником инфекции является больной человек, реконвалесцент и носитель токсигенных штаммов коринебактерий дифтерии. Наибольшее количество возбудителей выделяют больные с ярко выраженной клиникой.Опасными источниками инфекции являются также больные с атипичными формами, не распознанные и поэтому не госпитализированные.

Возбудитель дифтерии выделяется от больного с капельками слизи при кашле и чиханье, поэтому основной механизм передачи — воздушно-капельный, также возможно заражение через предметы, используемые больным, и инфицированные пищевые продукты (обычно молоко).

Восприимчивость неиммунных людей к возбудителю дифтерии всеобщая. Однако возможность развития не только тяжелых, но и легких форм болезни, а также носительства (бессимптомные формы инфекции) свидетельствует об определенной роли неспецифических факторов защиты организма, вирулентности и степени токсигенности возбудителя, но особенно — инфицирующих доз при заражении.

Общеизвестно, что чем теснее общение с источником дифтерии, тем более вероятно развитие манифестной формы инфекции, и наоборот, с увеличением расстояния между источником и реципиентом (восприимчивым человеком) растет вероятность развития бессимптомных форм инфекции.

Наблюдения в условиях естественно складывающегося обычного общения в достаточно крупных популяциях (города, страны и т. п.) показали, что в допрививочные времена болело дифтерией примерно 20% населения, остальные приобретали иммунитет за счет перенесения бессимптомных форм.

Масштабные наблюдения, таким образом, показывают сложившуюся вероятность получения дозы, приводящей к развитию манифестных форм дифтерии. Необходимо подчеркнуть, что остальное, незаболевшее, население (80%) — это тоже восприимчивые люди, но они заражались небольшими дозами и постепенно приобретали устойчивый иммунитет. Этот иммунитет в основном носит антитоксический характер, именно поэтому возможно вторичное (иммунное) носительство.

В недавнем прошлом дифтерия была одной из ведущих социальных проблем не только вследствие высокой заболеваемости, но и в связи с высокой последующей инвалидностью, летальностью и смертностью. В настоящее время за счет внедрения в широкую практику специфической профилактики заболеваемость либо исчезла вовсе (там, где прививки проводятся в строгом соответствии с современными требованиями науки и практики), либо — где имеются нарушения в принятой системе специфической профилактики — наблюдается заболеваемость, как правило, не достигающая уровня допрививочного времени.

В допрививочный период отмечалась высокая заболеваемость дифтерией, которая в наиболее неблагоприятные годы достигала в России показателя 150-170 на 100 тыс. населения в год. В 2001-2003 гг. в России показатели заболеваемости составили 0,2—0,4 на 100 тыс. населения.

Для дифтерии характерна своеобразная многолетняя динамика: подъемы заболеваемости чередовались без особой закономерности с интервалом 8, 10, 12 и даже 20 лет.

С введением специфической профилактики заболеваемость резко снизилась, и в некоторых странах и городах упала до нуля. Однако в связи с нарушениями в системе специфической профилактики, которые имели место в 90-х гг. XX в., произошел подъем заболеваемости. Таким образом, в современных условиях подъем заболеваемости происходит не в результате угасания естественно формируемого популяционного иммунитета, а вследствие нарушений в системе специфической профилактики.

Сезонность заболеваемости дифтерией также имеет определенное своеобразие: подъем начинается осенью с формированием детских коллективов, достигает максимума в конце осени — зимой (декабрь), затем наблюдается постепенное снижение заболеваемости. Весеннего подъема обычно не бывает.

Структура заболеваемости дифтерией.

В допрививочное время дифтерия справедливо включалась в группу «детских инфекций», поскольку страдали от этой нозоформы главным образом дети. Группой риска считались дети примерно 4-7 лет, хотя и в более старшем возрасте дети заболевали достаточно часто.

Такое возрастное распределение связано с постепенным после рождения угасанием иммунитета к дифтерии, полученного от матери, а также более активным включением в общественную жизнь (посещение детских учреждений, массовых зрелищ и т. д.).

С введением прививок, из-за нарушений при реализации специфической профилактики (необоснованные медицинские отводы и т. д.) заболеваемость среди детей сохраняет доминирующее положение, однако в ряде случаев взрослые болеют с той же частотой, что и дети: это также определяется характером нарушений в системе прививок.

источник

Полоска фильтровальной бумаги размером 1,5×8 см, простерилизованная в автоклаве, пропитывается антитоксической противодифтерий­ной сывороткой «Диаферм-3», разведенной физиологическим раствором до содержания 500 АЕ в I мл.

Смоченную сывороткой бумагу стерильным пинцетом переносят на поверхность питательной среды в чашке Петри. Чашку подсушивают в термостате 20 минут. Испытуемые культуры (колонии) засевают петлей бляшками диаметром в I см на расстоянии 0,5 см от бумаги. На одну чашку засевают несколько штаммов, в том числе один заведомо токсигенный. Рекомендуется каждую культуру засевать не менее чем четырьмя бляшками (по две с каждой стороны от бумаги). Посевы помещают в термостат. Учет производят через 24, 48, 72 часа. Определение токсигенности основано на следующем принципе: образующийся в процессе роста дифтерийных бактерий экзотоксин диффундирует в питательную среду. Одновременно в среду диффундирует специфическая антитоксическая противодифтерийная сыворотка. В тех местах среды, где токсин и антитоксин встречаются в оптимальных соотношениях, выпадает реакция преципитации в виде белой изогнутой линии. Исследуемые бактерии считаются токсигенными, если линии преципитата их сливаются с линиями преципитата контрольного штамма. Демонстрация опыта по определению токсина методом преципитации в агаре.

б)Для определения гемотоксина произвести посев золотистого, стафилококка на пластинки кровяного МПА. Для этого чашка с кровяным МПА делится на два сектора. На одном из них засевается культура золотистого стафилококка, а на другом — для контроля — культура нетоксигенного белого стафилококка.

в)Определение некротоксина производится путем внутрикожного введения лабораторному животному 0,2 мл бульонной культуры (или фильтрата бульонной культуры) испытуемого микроба.

Через сутки или двое суток на месте введения образуется очаг некроза. Демонстрация опыта. Зарисовать дермонекротическую пробу.

§ 5. Демонстрация опыта по выявлению брюшнотифозного эндотоксина внутрикожной пробы на кролике. 0,2 мл эндотоксина, полученного путем обработки культуры трихлоруксусной кислотой, вводят внутрикожно кролику. На месте введения эндотоксина через 24-48 часов отмечается воспалительная реакция. Зарисовать.

§ 6. а) Для выявления гиалуронидазы кролику в один участок депилированнои кожи вводят внутрикожно 0,2 мл туши в физиологическом растворе, а в такой же соседний участок — 0,2 мл туши с прибавлением фильтрата бульонной культуры стафилококка.

Пятно на месте инъекции туши с фильтратом бульонной культуры стафилококка через 24-48 часов в несколько раз превосходит по размерам пятно на месте введения туши без фильтрата за счет повышения проницаемости ткани в присутствии гиалуронидазы. Демонстрация опыта.

б)Для выявления фибринолитического фермента в чашки Петри с агаровой средой, содержащей плазму, засевают испытуемую культуру. После инкубации в течение 24-48 часов при 37 0 образуется зона про­ светления вокруг колоний бактерий, продуцирующих фибринолизин. Де­монстрация опыта.

в)Для выявления фермента плазмокоагулазы испытуемую культуру засевают в 0,2 мл цитратной кроличьей или человеческой плазмы. В случае выработки плазмокоагулазы через 2-4-6-18 часов инкубации при 37 0 происходит свертывание плазмы. В контроле плазма остается жидкой. Демонстрация опыта.

г)Для выявления лецитиназы изучаемую культуру засевают на желточный агар. При наличии лецитиназы вокруг колонии бактерий образу­ ется зона помутнения и радужного венчика. Демонстрация опыта.

источник

Возбудитель дифтерии относится к роду Corynebacterium (от лат. coryna — булава, diphthera — пленка). Бактерии имеют булавовидные утолщения на концах. К этому роду относятся патогенные для человека дифтерийные палочки и непатогенные виды — ложнодифтерийные палочки и дифтероиды, обнаруживаемые на слизистых оболочках и кожных покровах.

Возбудители дифтерии — Corynebacterium diphtheriae — были обнаружены Т. Клебсом (1883) и выделены в чистом виде Ф. Леффлером (1884).

Морфология. Возбудители дифтерии слегка изогнутые, тонкие палочки, размером 3-6 × 0,3-0,5 мкм, на концах которых имеются утолщения. В этих утолщениях имеются зерна волютина (зерна Бабеша — Эрнста). Бактерии дифтерии неподвижны, не имеют спор и капсул. Грамположительны. Они хорошо окрашиваются основными анилиновыми красителями, при этом волютиновые зерна окрашиваются интенсивнее. Для окраски обычно применяют щелочной метиленовый синий или кристаллический фиолетовый. Особенностью коринебактерий дифтерии является их полиморфность; в одной кулатуре встречаются различные по форме и размерам палочки: изогнутые, прямые, длинные, короткие, толстые, иногда коккобактерии. Характерно расположение бактерий в мазках — они обычно располагаются попарно под острым или тупым углом, в виде растопыренных пальцев и т. д. Расположение в мазках и наличие зерен волютина является дифференциально-диагностическим признаком при микроскопическом исследовании. Непатогенные представители рода коринебактерий — ложнодифтерийные палочки и дифтериоды чаще располагаются в виде частокола, зерна волютина у них могут отсутствовать либо быть на одном конце (см. рис. 4).

Культивирование. Коринебактерий дифтерии — факультативные анаэробы. Растут при температуре 35-37° С, рН среды 7,4-7,8. Они не размножаются на обычных питательных средах. Культивируют их на средах, содержащих кровь или сыворотку.

В конце XIX века французский ученый Э. Ру для культивирования бактерий дифтерии предложил использовать свернутую бычью или лошадиную сыворотку, а Ф. Леффлер рекомендовал добавлять к ней бульон (25%) и 1% глюкозу. На этих средах коринебактерий растут быстро, в течение 14-18 ч образуют несливающиеся выпуклые колонии кремового цвета (рост на скошенной среде напоминает шагреневую кожу). Однако отдифференцировать на этих средах дифтерийные палочки от ложнодифтерийных невозможно.

В настоящее время основными средами для выращивания являются среда Клауберга (содержащая сыворотку крови и теллурит калия), хинозольная среда Бунина, среда Тинсдаля и др. На основании культуральных и ферментативных свойств коринебактерий дифтерии делят на три биовара: гравис (gravis), ми тис (mitis), интермедиус (intermedins). Биовар гравис обычно находится в R-форме. На среде Клауберга бактерии этого биовара растут в виде крупных колоний 2-3 мм, серовато-черного цвета (так как восстанавливают теллурит в теллур), имеют изрезанные края, что придает им вид розетки. При прикосновении к колонии петлей она как бы рассыпается. На бульоне бактерии этого биовара образуют крошащуюся пленку и зернистый осадок.

Коринебактерии биовара митис (mitis) на среде Клауберга растут в виде небольших, гладких колоний (S-форма) черного цвета. На бульоне они дают равномерное помутнение.

Коринебактерии биовара интермедиус (intermedins) являются промежуточными. На среде Клауберга бактерии этого биовара чаще растут в виде блестящих, мелких, черных колоний (этот биовар встречается редко).

Ферментативные свойства. Все три биовара дифтерийных бактерий обладают ферментом цистиназой, расщепляющим цистин с образованием сероводорода. Эти свойства используются для дифференциации возбудителей дифтерии от непатогенных представителей этого рода (табл. 49).


Таблица 49. Свойства возбудителей дифтерии и близких к ним коринебактерий

Примечание. + положительная реакция (расщепляет); — отрицательная реакция (не расщепляет).

Возбудители всех трех биоваров расщепляют глюкозу и мальтозу до образования кислоты. С. gravis расщепляют крахмал. Это свойство отличает его от двух других биоваров. Коринебактерий дифтерии восстанавливают нитраты в нитриты, не образуют индол, не разлагают мочевину.

Коринебактерии дифтерии образуют нейраминидазу, гиалуронидазу и другие ферменты патогенности.

Токсинообразование. Вирулентные штаммы возбудителей дифтерии продуцируют экзотоксин. Химически он представляет собой термолабильный белок, состоящий из Двух фракций. Фракция В фиксирует токсин на чувствительных к нему тканях организма. Фракция А ответственна за токсическое действие. Силу токсина дифтерийных культур можно устанавливать «in vivo» на чувствительных к этому токсину морских свинках. Dim дифтерийного экзотоксина — минимальная смертельная доза, это минимальное количество яда, убивающее морскую свинку массой 250 г на 4-й день.

Читайте также:  Сестринские проблемы при дифтерии

Наличие экзотоксина можно обнаружить также «in vitro» — на плотной питательной среде. Этот метод широко используется в практической работе. Дифтерийный экзотоксин малоустойчив. Он быстро разрушается под влиянием температуры, света и кислорода воздуха. После добавления к токсину формалина (0,3-0,4%) и выдерживания его при температуре 37-38° С в течение нескольких недель он переходит в анатоксин, который теряет ядовитость, но сохраняет антигенные свойства токсина. Токсины, образуемые различными штаммами, не различаются между собой и могут быть нейтрализованы дифтерийным антитоксином * .

* ( В настоящее время установлено, что все биовары коринебактерий могут быть токсигенными и нетоксигенными.)

Антигенная структура. У бактерий дифтерии имеется поверхностный термолабильный белковый антиген и типоспецифический полисахаридный О-антиген. Кроме этого, среди коринебактерий различают 19 фаговаров, которые учитываются при идентификации культур. С помощью фаговаров выявляют источник заболевания.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Возбудители дифтериии сравнительно устойчивы. Температура 60° С убивает их через 10-15 мин, 100° С — через минуту. В пленке они выдерживают нагревание до 90° С. На свернутой сыворотке при комнатной температуре сохраняются до 2 мес, на детских игрушках — несколько суток. Низкие температуры коринебактерий переносят хорошо. К высушиванию возбудители дифтерии довольно устойчивы. Дезинфицирующие вещества (3% раствор фенола, 1% раствор сулемы, 10% раствор перекиси водорода) убивают эти бактерии в течение нескольких минут.

Восприимчивость животных. В естественных условиях животные дифтерией не болеют. Из экспериментальных животных наиболее восприимчивы морские свинки и кролики. При внутрикожном или подкожном заражении у них развивается картина токсикоинфекции с образованием на месте введения воспаления, отека, некроза. В надпочечниках наблюдаются кровоизлияния.

Источники заболевания. Больные люди и бактерионосители.

Пути передачи. Воздушно-капельный путь, контактно-бытовой (через посуду, игрушки, книги, полотенца и т. д.).

Заболевание у человека: 1) дифтерия зева; 2) дифтерия носа.

Реже возникает дифтерия трахеи, бронхов, глаз, уха, влагалища и дифтерия поврежденной кожи.

Патогенез. Входными воротами являются слизистые оболочки дыхательных путей и поврежденная кожа. Попав на слизистую оболочку, возбудители дифтерии размножаются в месте внедрения и вызывают некроз ткани. Образуется пленка, тесно связанная с подлежащими тканями. На поверхности слизистой появляются грязно-серые или желтоватые налеты, состоящие из разрушенного эпителия, фибрина, лейкоцитов и коринебактерий дифтерии. При снятии пленки ватным тампоном или шпателем поверхность слизистой может кровоточить.

В процессе размножения коринебактерий дифтерии в некротических участках накапливается экзотоксин, который может привести к отеку слизистой оболочки и клетчатки. Со слизистой оболочки отек может распространяться на гортань, бронхи и вызвать явления асфиксии. Токсин, циркулирующий в крови, избирательно поражает сердечную мышцу, надпочечники и клетки нервной ткани.

Дифтерия — это токсикоинфекция. Тяжесть процесса зависит от степени токсигенности штамма и от защитных сил организма.

Иммунитет. Невосприимчивость обусловливается антитоксическим и антибактериальным иммунитетом. Грудные дети не болеют, так как у них имеется пассивный иммунитет, переданный от матери.

О наличии антитоксического иммунитета судят по реакции Шика. Для постановки реакции 1 /40 Dlm (летальной дозы токсина для морской свинки), содержащегося в 0,2 мл изотонического раствора натрия хлорида, вводят внутрикожно в области предплечья. При отсутствии в крови антитоксина в месте введения через 24-48 ч появляется краснота и припухлость (до 2 см в диаметре). При наличии антитоксина припухлости и красноты нет (имеющийся в крови антитоксин нейтрализовал введенный токсин).

Перенесенное заболевание оставляет иммунитет. Однако в 6-7% случаев наблюдаются повторные заболевания.

Профилактика. Ранняя диагностика. Изоляция. Дезинфекция. Выявление носителей токсигенной дифтерийной палочки.

Специфическая профилактика осуществляется введением анатоксина. В СССР проводят обязательную вакцинацию детей вакциной АКДС — это комплексная вакцина, в которую входят дифтерийный и столбнячный анатоксин и взвесь убитых коклюшных палочек. Вакцинируют детей с 5-6 месяцев с последующей ревакцинацией. Для ревакцинации вводят вакцину без коклюшных палочек.

Специфическое лечение. Применяют противодифтерийную антитоксическую сыворотку. Доза и кратность определяется лечащим врачом, вводят также антимикробные препараты.

1. Какова морфология коринебактерий дифтерии и какие имеются биовары?

2. На каких средах выращивают бактерии дифтерии и каков характер роста?

3. Отношение к какому углеводу позволяет отличить биовар gravis от других биоваров дифтерии?

4. Каков путь передачи и где чаще локализуется возбудитель дифтерии у больного?

5. Каковы специфическая профилактика и специфическое лечение дифтерии?

Цель исследования: выделение возбудителя для постановки диагноза. Выявление бактерионосителей дифтерии по эпидемиологическим показаниям. Выявление экзотоксина у выделенной культуры.

1. Отделяемое слизистой оболочки зева.

2. Отделяемое слизистой оболочки носа.

3. Отделяемое слизистой оболочки глаза.

5. Отделяемое слизистой оболочки влагалища.

Материал для исследования зависит от локализации процесса.


Способы сбора материала

При любой локализации процесса обязательно исследует слизистую зева и носа. Материал собирают ватным тампоном, для чего используют металлическую проволоку, желательно алюминиевую, на один конец которой плотно накручивают вату, затем тампон монтируют в корковую пробку, помещают в пробирку и стерилизуют в печи Пастера при температуре 160° С 1 тампон течение часа или в автоклаве при температуре 112° С.

Примечания. 1. Материал собирают натощак либо не раньше чем через 2 ч после еды и не ранее чем через 4 дня после лечения антибиотиками или другими антибактериальными средствами. 2. Если материал берут из зева и носа, то пробирки с обоими тампонами надписывают и связывают вместе. Посевы делают раздельно и исследование материала из каждого тампона ведут как самостоятельную работу. 3 Материал, собранный сухим тампоном, должен быть посеян не позднее чем через 2-3 ч после забора. При необходимости транспортировки собранного материала тампон предварительно смачивают 5% раствором глицерина в изотоническом растворе натрия хлорида.


Первый день исследования

Чашки вынимают из термостата и просматривают. Рост бактерий на среде Клауберга может быть замедлен из-за наличия ингибиторов в среде. В этом случае чашки ставят в термостат еще на 24 ч.

Чашки вынимают из термостата, просматривают их с помощью лупы или стереоскопического микроскопа. При наличии подозрительных колоний часть их под контролем стереоскопического микроскопа выделяют на агар с 25% сывороткой и на столбик со средой Пизу для определения фермента цистиназы. Из другой части колоний ставят пробу на токсигенность.

При микроскопическом исследовании колоний, снятых со среды Клауберга, коринебактерии дифтерии теряют свою специфичность: отсутствует зернистость, изменяется величина, расположение сохраняется. При посеве их на среды с сывороткой морфологическая специфичность возбудителей дифтерии восстанавливается.

Проба на наличие фермента цистиназы и определение токсигенности являются обязательными при идентификации возбудителей дифтерии. Если результат этих опытов, проведенных с частью колоний со среды Клауберга, недостаточно четкий или отрицательный, то опыт повторяют, используя выделенную чистую культуру.

Проба на цистиназу. Проводят посев исследуемой культуры уколом в центр столбика среды Пизу. При положительной реакции через 18-24 ч по ходу укола наблюдается почернение, а вокруг черного стержня образуется темное облачко; почернение происходит в результате того, что фермент цистиназа расщепляет цистин, входящий в состав среды Пизу, и освободившаяся сера вступает в реакцию с ацетатом свинца — образуется сульфит свинца черного цвета. Дифтероиды и ложнодифтерийные палочки не содержат фермент цистиназу, поэтому при росте их на среде Пизу цвет среды не изменяется.

Определение экзотоксина. Проводят методом диффузной преципитации в геле. Метод основан на взаимодействии токсина с антитоксином. В тех участках агара, где эти компоненты взаимодействуют, образуется преципитат в виде закругленных линий.

Методика определения: в чашки Петри разливают растопленный и охлажденный до 50° С агар Мартена рН 7,8 (на агаре Мартена лучше продуцируется экзотоксин). Количество агара в чашке должно быть не более 12-15 мл, чтобы сохранить прозрачность, — в толстом слое линии преципитации плохо видны. После застывания агара накладывают полоску стерильной фильтровальной бумаги, смоченной противодифтерийной антитоксической сывороткой.

Испытуемую культуру засевают «бляшками». Посев производят петлей. Диаметр бляшек 0,8-1,0 см. Расстояние бляшек от края полосок бумаги 0,5-0,7 см, между двумя бляшками испытуемой культуры засевают бляшки заведомо токсигенного штамма. Испытуемую культуру считают токсигенной, если линии преципитации четки и сливаются с линиями преципитации контрольного (токсигенного) штамма. Если линии преципитации перекрещиваются с линиями контрольного штамма или отсутствуют, выделенную культуру считают нетоксигенной (рис. 50).


Рис. 50. Выявление экзотоксина C.Diphtheriae методом диффузной преципитации в агаре. 1 — бляшки нетоксигенного штамма (линии преципитации перекрещиваются); 2 — бляшки токсигенного штамма (линии преципитации соединяются)

Приготовление полосок бумаги. Из фильтровальной бумаги нарезают полоски размером 1,5×8 см, заворачивают по несколько штук в бумагу и стерилизуют в автоклаве при температуре 120° С в течение 30 мин. Перед постановкой опыта стерильным пинцетом вынимают одну полоску, укладывают ее в стерильную чашку Петри и смачивают противодифтерийной антитоксической сывороткой. Предварительно сыворотку разводят так, чтобы в 1 мл содержалось 500 АЕ (антитоксических единиц). Бумажку смачивают 0,25 мл сыворотки (125 АЕ) и помещают на поверхность среды. Затем делают посевы указанным выше способом. Все посевы ставят в термостат. Учет результатов производят через 18-24 и 48 ч.

Вынимают посевы из термостата, учитывают результат. Делают мазки из культуры, выросшей на среде с сывороткой, и окрашивают их синим Леффлера.

Наличие в мазках характерных по морфологии палочек, черного с облачком стержня в среде Пизу и линий преципитации в агаре позволяет дать предварительный ответ: «Обнаружены коринебактерии дифтерии». Исследование продолжают. При отсутствии линий преципитации в агаре или их недостаточной четкости исследование на токсигенность обязательно повторяют с выделенной чистой культурой.

Для окончательной идентификации выделенной культуры и определения биовара возбудителя производят посев на глюкозу, сахарозу, крахмал и бульон с мочевиной (для выявления фермента уреазы). Посев на среды делают обычным способом.

Проба на уреазу. Выделенную культуру засевают на бульон с мочевиной и индикатором (крезоловый красный) и ставят в термостат. Уже через 30-40 мин можно учитывать результат: при посеве истинных возбудителей дифтерии цвет среды не изменяется, так как они не содержат уреазу. Псевдодифтерийные палочки расщепляют мочевину и изменяют индикатор — среда приобретает малиново-красный цвет.

Производят учет результатов (табл. 50).


Таблица 50. Ферментативные свойства выделенных возбудителей

1. Какой материал исследуют для выявления возбудителя дифтерии?

2. Как собирают материал для исследования на дифтерию из зева и носа?

3. Что нужно сделать с тампоном, если собранный материал необходимо транспортировать?

4. При помощи какого прибора изучают колонии на среде Клауберга?

5. Какие исследования проводят для окончательной идентификации выделенной культуры?

6. Какими методами определяют токсигенность коринебактерий дифтерии?

1. Возьмите у преподавателя проволоку и вату и приготовьте 10 тампонов, вмонтируйте их в корковую пробку, вставьте в пробирку и простерилизуйте.

Внимание! Перед стерилизацией проверьте, достаточно ли плотно накручен тампон.

2. Возьмите у преподавателя стерильные тампоны и произведите забор материала друг у друга из зева и носа (разными тампонами).

3. Изучите по табл. 49 свойства возбудителей дифтерии и близких к ним коринебактерий.

4. Поставьте пробу на токсигенность. Бляшки сделайте петлей без культуры.

5. Зарисуйте ход исследования и положительный и отрицательный результат пробы на токсигенность.

Теллуровая среда Клауберга: первая смесь — предварительно за 1,5 мес готовят смесь из 20 мл бараньей или лошадиной крови и 10 мл глицерина. В день приготовления среды готовят две другие смеси; вторая смесь — 50 мл МПА рН 7,5 растапливают и охлаждают до температуры 50° С, после чего прибавляют 2,5 мл первой смеси; третья смесь — смешивают 17 мл бараньей крови и 33 мл дистиллированной воды (смесь приготавливают стерильно), подогревают на водяной бане до температуры 50° С. Соединяют вторую и третью смеси, прибавляют 4 мл 1% раствора теллурита калия К2ТеО3, быстро все перемешивают и разливают в чашки. Среда прозрачная, имеет цвет красного вина.

Среда Пизу. К 90 мл расплавленного 2% МПА (рН 7,6) добавляют 2 мл раствора цистина (1% раствор цистина в 0,1 н. растворе гидроксида натрия), тщательно перемешивают и добавляют такой же объем 0,1 н. раствора серной кислоты. Среду стерилизуют 30 мин при температуре 112° С. К расплавленной и охлажденной до 50° С среде добавляют 1 мл 10% раствора ацетата свинца, стерилизованного двукратно текучим паром, перемешивают и добавляют 9 мл нормальной лошадиной сыворотки. Среду стерильно разливают в маленькие пробирки по 2 мл. Посев производят уколом.

Среда Бунина. Сухую хинозольную среду добавляют к 100 мл холодной воды (рН 7,6-7,8), размешивают и нагревают на слабом огне до расплавления агара (по прописи на этикетке). Затем среду кипятят 2-3 мин до образования пены, после чего среду остужают до 50° С и добавляют 5-10 мл стерильной дефибринированной крови. Среду перемешивают и разливают в чашки Петри. Готовую среду можно сохранять 3-4 дня при температуре 4-10°.

Среда Тинсдаля. К 100 мл 2% питательного агара, расплавленного и охлажденного до 50° С, добавляют: 1) 12 мл 1% раствора цистина на 0,1 н. растворе серной кислоты; 2) 12 мл 1% раствора гидроксида натрия; 3) 1,8 мл 2% раствора теллурита калия; 4) 1,8 мл 2,5% раствора гипосульфита натрия, 20 мл нормальной лошадиной или бычьей сыворотки. После добавления каждого ингредиента среду тщательно перемешивают. Чашки со средой хранят 3-4 дня при 10° С.

источник