Возбудитель дифтерии относится к роду Corynebacterium (от лат. coryna — булава, diphthera — пленка). Бактерии имеют булавовидные утолщения на концах. К этому роду относятся патогенные для человека дифтерийные палочки и непатогенные виды — ложнодифтерийные палочки и дифтероиды, обнаруживаемые на слизистых оболочках и кожных покровах.
Возбудители дифтерии — Corynebacterium diphtheriae — были обнаружены Т. Клебсом (1883) и выделены в чистом виде Ф. Леффлером (1884).
Морфология. Возбудители дифтерии слегка изогнутые, тонкие палочки, размером 3-6 × 0,3-0,5 мкм, на концах которых имеются утолщения. В этих утолщениях имеются зерна волютина (зерна Бабеша — Эрнста). Бактерии дифтерии неподвижны, не имеют спор и капсул. Грамположительны. Они хорошо окрашиваются основными анилиновыми красителями, при этом волютиновые зерна окрашиваются интенсивнее. Для окраски обычно применяют щелочной метиленовый синий или кристаллический фиолетовый. Особенностью коринебактерий дифтерии является их полиморфность; в одной кулатуре встречаются различные по форме и размерам палочки: изогнутые, прямые, длинные, короткие, толстые, иногда коккобактерии. Характерно расположение бактерий в мазках — они обычно располагаются попарно под острым или тупым углом, в виде растопыренных пальцев и т. д. Расположение в мазках и наличие зерен волютина является дифференциально-диагностическим признаком при микроскопическом исследовании. Непатогенные представители рода коринебактерий — ложнодифтерийные палочки и дифтериоды чаще располагаются в виде частокола, зерна волютина у них могут отсутствовать либо быть на одном конце (см. рис. 4).
Культивирование. Коринебактерий дифтерии — факультативные анаэробы. Растут при температуре 35-37° С, рН среды 7,4-7,8. Они не размножаются на обычных питательных средах. Культивируют их на средах, содержащих кровь или сыворотку.
В конце XIX века французский ученый Э. Ру для культивирования бактерий дифтерии предложил использовать свернутую бычью или лошадиную сыворотку, а Ф. Леффлер рекомендовал добавлять к ней бульон (25%) и 1% глюкозу. На этих средах коринебактерий растут быстро, в течение 14-18 ч образуют несливающиеся выпуклые колонии кремового цвета (рост на скошенной среде напоминает шагреневую кожу). Однако отдифференцировать на этих средах дифтерийные палочки от ложнодифтерийных невозможно.
В настоящее время основными средами для выращивания являются среда Клауберга (содержащая сыворотку крови и теллурит калия), хинозольная среда Бунина, среда Тинсдаля и др. На основании культуральных и ферментативных свойств коринебактерий дифтерии делят на три биовара: гравис (gravis), ми тис (mitis), интермедиус (intermedins). Биовар гравис обычно находится в R-форме. На среде Клауберга бактерии этого биовара растут в виде крупных колоний 2-3 мм, серовато-черного цвета (так как восстанавливают теллурит в теллур), имеют изрезанные края, что придает им вид розетки. При прикосновении к колонии петлей она как бы рассыпается. На бульоне бактерии этого биовара образуют крошащуюся пленку и зернистый осадок.
Коринебактерии биовара митис (mitis) на среде Клауберга растут в виде небольших, гладких колоний (S-форма) черного цвета. На бульоне они дают равномерное помутнение.
Коринебактерии биовара интермедиус (intermedins) являются промежуточными. На среде Клауберга бактерии этого биовара чаще растут в виде блестящих, мелких, черных колоний (этот биовар встречается редко).
Ферментативные свойства. Все три биовара дифтерийных бактерий обладают ферментом цистиназой, расщепляющим цистин с образованием сероводорода. Эти свойства используются для дифференциации возбудителей дифтерии от непатогенных представителей этого рода (табл. 49).
Таблица 49. Свойства возбудителей дифтерии и близких к ним коринебактерий
Примечание. + положительная реакция (расщепляет); — отрицательная реакция (не расщепляет).
Возбудители всех трех биоваров расщепляют глюкозу и мальтозу до образования кислоты. С. gravis расщепляют крахмал. Это свойство отличает его от двух других биоваров. Коринебактерий дифтерии восстанавливают нитраты в нитриты, не образуют индол, не разлагают мочевину.
Коринебактерии дифтерии образуют нейраминидазу, гиалуронидазу и другие ферменты патогенности.
Токсинообразование. Вирулентные штаммы возбудителей дифтерии продуцируют экзотоксин. Химически он представляет собой термолабильный белок, состоящий из Двух фракций. Фракция В фиксирует токсин на чувствительных к нему тканях организма. Фракция А ответственна за токсическое действие. Силу токсина дифтерийных культур можно устанавливать «in vivo» на чувствительных к этому токсину морских свинках. Dim дифтерийного экзотоксина — минимальная смертельная доза, это минимальное количество яда, убивающее морскую свинку массой 250 г на 4-й день.
Наличие экзотоксина можно обнаружить также «in vitro» — на плотной питательной среде. Этот метод широко используется в практической работе. Дифтерийный экзотоксин малоустойчив. Он быстро разрушается под влиянием температуры, света и кислорода воздуха. После добавления к токсину формалина (0,3-0,4%) и выдерживания его при температуре 37-38° С в течение нескольких недель он переходит в анатоксин, который теряет ядовитость, но сохраняет антигенные свойства токсина. Токсины, образуемые различными штаммами, не различаются между собой и могут быть нейтрализованы дифтерийным антитоксином * .
* ( В настоящее время установлено, что все биовары коринебактерий могут быть токсигенными и нетоксигенными.)
Антигенная структура. У бактерий дифтерии имеется поверхностный термолабильный белковый антиген и типоспецифический полисахаридный О-антиген. Кроме этого, среди коринебактерий различают 19 фаговаров, которые учитываются при идентификации культур. С помощью фаговаров выявляют источник заболевания.
Устойчивость к факторам окружающей среды. Возбудители дифтериии сравнительно устойчивы. Температура 60° С убивает их через 10-15 мин, 100° С — через минуту. В пленке они выдерживают нагревание до 90° С. На свернутой сыворотке при комнатной температуре сохраняются до 2 мес, на детских игрушках — несколько суток. Низкие температуры коринебактерий переносят хорошо. К высушиванию возбудители дифтерии довольно устойчивы. Дезинфицирующие вещества (3% раствор фенола, 1% раствор сулемы, 10% раствор перекиси водорода) убивают эти бактерии в течение нескольких минут.
Восприимчивость животных. В естественных условиях животные дифтерией не болеют. Из экспериментальных животных наиболее восприимчивы морские свинки и кролики. При внутрикожном или подкожном заражении у них развивается картина токсикоинфекции с образованием на месте введения воспаления, отека, некроза. В надпочечниках наблюдаются кровоизлияния.
Источники заболевания. Больные люди и бактерионосители.
Пути передачи. Воздушно-капельный путь, контактно-бытовой (через посуду, игрушки, книги, полотенца и т. д.).
Заболевание у человека: 1) дифтерия зева; 2) дифтерия носа.
Реже возникает дифтерия трахеи, бронхов, глаз, уха, влагалища и дифтерия поврежденной кожи.
Патогенез. Входными воротами являются слизистые оболочки дыхательных путей и поврежденная кожа. Попав на слизистую оболочку, возбудители дифтерии размножаются в месте внедрения и вызывают некроз ткани. Образуется пленка, тесно связанная с подлежащими тканями. На поверхности слизистой появляются грязно-серые или желтоватые налеты, состоящие из разрушенного эпителия, фибрина, лейкоцитов и коринебактерий дифтерии. При снятии пленки ватным тампоном или шпателем поверхность слизистой может кровоточить.
В процессе размножения коринебактерий дифтерии в некротических участках накапливается экзотоксин, который может привести к отеку слизистой оболочки и клетчатки. Со слизистой оболочки отек может распространяться на гортань, бронхи и вызвать явления асфиксии. Токсин, циркулирующий в крови, избирательно поражает сердечную мышцу, надпочечники и клетки нервной ткани.
Дифтерия — это токсикоинфекция. Тяжесть процесса зависит от степени токсигенности штамма и от защитных сил организма.
Иммунитет. Невосприимчивость обусловливается антитоксическим и антибактериальным иммунитетом. Грудные дети не болеют, так как у них имеется пассивный иммунитет, переданный от матери.
О наличии антитоксического иммунитета судят по реакции Шика. Для постановки реакции 1 /40 Dlm (летальной дозы токсина для морской свинки), содержащегося в 0,2 мл изотонического раствора натрия хлорида, вводят внутрикожно в области предплечья. При отсутствии в крови антитоксина в месте введения через 24-48 ч появляется краснота и припухлость (до 2 см в диаметре). При наличии антитоксина припухлости и красноты нет (имеющийся в крови антитоксин нейтрализовал введенный токсин).
Перенесенное заболевание оставляет иммунитет. Однако в 6-7% случаев наблюдаются повторные заболевания.
Профилактика. Ранняя диагностика. Изоляция. Дезинфекция. Выявление носителей токсигенной дифтерийной палочки.
Специфическая профилактика осуществляется введением анатоксина. В СССР проводят обязательную вакцинацию детей вакциной АКДС — это комплексная вакцина, в которую входят дифтерийный и столбнячный анатоксин и взвесь убитых коклюшных палочек. Вакцинируют детей с 5-6 месяцев с последующей ревакцинацией. Для ревакцинации вводят вакцину без коклюшных палочек.
Специфическое лечение. Применяют противодифтерийную антитоксическую сыворотку. Доза и кратность определяется лечащим врачом, вводят также антимикробные препараты.
1. Какова морфология коринебактерий дифтерии и какие имеются биовары?
2. На каких средах выращивают бактерии дифтерии и каков характер роста?
3. Отношение к какому углеводу позволяет отличить биовар gravis от других биоваров дифтерии?
4. Каков путь передачи и где чаще локализуется возбудитель дифтерии у больного?
5. Каковы специфическая профилактика и специфическое лечение дифтерии?
Цель исследования: выделение возбудителя для постановки диагноза. Выявление бактерионосителей дифтерии по эпидемиологическим показаниям. Выявление экзотоксина у выделенной культуры.
1. Отделяемое слизистой оболочки зева.
2. Отделяемое слизистой оболочки носа.
3. Отделяемое слизистой оболочки глаза.
5. Отделяемое слизистой оболочки влагалища.
Материал для исследования зависит от локализации процесса.
Способы сбора материала
При любой локализации процесса обязательно исследует слизистую зева и носа. Материал собирают ватным тампоном, для чего используют металлическую проволоку, желательно алюминиевую, на один конец которой плотно накручивают вату, затем тампон монтируют в корковую пробку, помещают в пробирку и стерилизуют в печи Пастера при температуре 160° С 1 тампон течение часа или в автоклаве при температуре 112° С.
Примечания. 1. Материал собирают натощак либо не раньше чем через 2 ч после еды и не ранее чем через 4 дня после лечения антибиотиками или другими антибактериальными средствами. 2. Если материал берут из зева и носа, то пробирки с обоими тампонами надписывают и связывают вместе. Посевы делают раздельно и исследование материала из каждого тампона ведут как самостоятельную работу. 3 Материал, собранный сухим тампоном, должен быть посеян не позднее чем через 2-3 ч после забора. При необходимости транспортировки собранного материала тампон предварительно смачивают 5% раствором глицерина в изотоническом растворе натрия хлорида.
Первый день исследования
Чашки вынимают из термостата и просматривают. Рост бактерий на среде Клауберга может быть замедлен из-за наличия ингибиторов в среде. В этом случае чашки ставят в термостат еще на 24 ч.
Чашки вынимают из термостата, просматривают их с помощью лупы или стереоскопического микроскопа. При наличии подозрительных колоний часть их под контролем стереоскопического микроскопа выделяют на агар с 25% сывороткой и на столбик со средой Пизу для определения фермента цистиназы. Из другой части колоний ставят пробу на токсигенность.
При микроскопическом исследовании колоний, снятых со среды Клауберга, коринебактерии дифтерии теряют свою специфичность: отсутствует зернистость, изменяется величина, расположение сохраняется. При посеве их на среды с сывороткой морфологическая специфичность возбудителей дифтерии восстанавливается.
Проба на наличие фермента цистиназы и определение токсигенности являются обязательными при идентификации возбудителей дифтерии. Если результат этих опытов, проведенных с частью колоний со среды Клауберга, недостаточно четкий или отрицательный, то опыт повторяют, используя выделенную чистую культуру.
Проба на цистиназу. Проводят посев исследуемой культуры уколом в центр столбика среды Пизу. При положительной реакции через 18-24 ч по ходу укола наблюдается почернение, а вокруг черного стержня образуется темное облачко; почернение происходит в результате того, что фермент цистиназа расщепляет цистин, входящий в состав среды Пизу, и освободившаяся сера вступает в реакцию с ацетатом свинца — образуется сульфит свинца черного цвета. Дифтероиды и ложнодифтерийные палочки не содержат фермент цистиназу, поэтому при росте их на среде Пизу цвет среды не изменяется.
Определение экзотоксина. Проводят методом диффузной преципитации в геле. Метод основан на взаимодействии токсина с антитоксином. В тех участках агара, где эти компоненты взаимодействуют, образуется преципитат в виде закругленных линий.
Методика определения: в чашки Петри разливают растопленный и охлажденный до 50° С агар Мартена рН 7,8 (на агаре Мартена лучше продуцируется экзотоксин). Количество агара в чашке должно быть не более 12-15 мл, чтобы сохранить прозрачность, — в толстом слое линии преципитации плохо видны. После застывания агара накладывают полоску стерильной фильтровальной бумаги, смоченной противодифтерийной антитоксической сывороткой.
Испытуемую культуру засевают «бляшками». Посев производят петлей. Диаметр бляшек 0,8-1,0 см. Расстояние бляшек от края полосок бумаги 0,5-0,7 см, между двумя бляшками испытуемой культуры засевают бляшки заведомо токсигенного штамма. Испытуемую культуру считают токсигенной, если линии преципитации четки и сливаются с линиями преципитации контрольного (токсигенного) штамма. Если линии преципитации перекрещиваются с линиями контрольного штамма или отсутствуют, выделенную культуру считают нетоксигенной (рис. 50).
Рис. 50. Выявление экзотоксина C.Diphtheriae методом диффузной преципитации в агаре. 1 — бляшки нетоксигенного штамма (линии преципитации перекрещиваются); 2 — бляшки токсигенного штамма (линии преципитации соединяются)
Приготовление полосок бумаги. Из фильтровальной бумаги нарезают полоски размером 1,5×8 см, заворачивают по несколько штук в бумагу и стерилизуют в автоклаве при температуре 120° С в течение 30 мин. Перед постановкой опыта стерильным пинцетом вынимают одну полоску, укладывают ее в стерильную чашку Петри и смачивают противодифтерийной антитоксической сывороткой. Предварительно сыворотку разводят так, чтобы в 1 мл содержалось 500 АЕ (антитоксических единиц). Бумажку смачивают 0,25 мл сыворотки (125 АЕ) и помещают на поверхность среды. Затем делают посевы указанным выше способом. Все посевы ставят в термостат. Учет результатов производят через 18-24 и 48 ч.
Вынимают посевы из термостата, учитывают результат. Делают мазки из культуры, выросшей на среде с сывороткой, и окрашивают их синим Леффлера.
Наличие в мазках характерных по морфологии палочек, черного с облачком стержня в среде Пизу и линий преципитации в агаре позволяет дать предварительный ответ: «Обнаружены коринебактерии дифтерии». Исследование продолжают. При отсутствии линий преципитации в агаре или их недостаточной четкости исследование на токсигенность обязательно повторяют с выделенной чистой культурой.
Для окончательной идентификации выделенной культуры и определения биовара возбудителя производят посев на глюкозу, сахарозу, крахмал и бульон с мочевиной (для выявления фермента уреазы). Посев на среды делают обычным способом.
Проба на уреазу. Выделенную культуру засевают на бульон с мочевиной и индикатором (крезоловый красный) и ставят в термостат. Уже через 30-40 мин можно учитывать результат: при посеве истинных возбудителей дифтерии цвет среды не изменяется, так как они не содержат уреазу. Псевдодифтерийные палочки расщепляют мочевину и изменяют индикатор — среда приобретает малиново-красный цвет.
Производят учет результатов (табл. 50).
Таблица 50. Ферментативные свойства выделенных возбудителей
1. Какой материал исследуют для выявления возбудителя дифтерии?
2. Как собирают материал для исследования на дифтерию из зева и носа?
3. Что нужно сделать с тампоном, если собранный материал необходимо транспортировать?
4. При помощи какого прибора изучают колонии на среде Клауберга?
5. Какие исследования проводят для окончательной идентификации выделенной культуры?
6. Какими методами определяют токсигенность коринебактерий дифтерии?
1. Возьмите у преподавателя проволоку и вату и приготовьте 10 тампонов, вмонтируйте их в корковую пробку, вставьте в пробирку и простерилизуйте.
Внимание! Перед стерилизацией проверьте, достаточно ли плотно накручен тампон.
2. Возьмите у преподавателя стерильные тампоны и произведите забор материала друг у друга из зева и носа (разными тампонами).
3. Изучите по табл. 49 свойства возбудителей дифтерии и близких к ним коринебактерий.
4. Поставьте пробу на токсигенность. Бляшки сделайте петлей без культуры.
5. Зарисуйте ход исследования и положительный и отрицательный результат пробы на токсигенность.
Теллуровая среда Клауберга: первая смесь — предварительно за 1,5 мес готовят смесь из 20 мл бараньей или лошадиной крови и 10 мл глицерина. В день приготовления среды готовят две другие смеси; вторая смесь — 50 мл МПА рН 7,5 растапливают и охлаждают до температуры 50° С, после чего прибавляют 2,5 мл первой смеси; третья смесь — смешивают 17 мл бараньей крови и 33 мл дистиллированной воды (смесь приготавливают стерильно), подогревают на водяной бане до температуры 50° С. Соединяют вторую и третью смеси, прибавляют 4 мл 1% раствора теллурита калия К2ТеО3, быстро все перемешивают и разливают в чашки. Среда прозрачная, имеет цвет красного вина.
Среда Пизу. К 90 мл расплавленного 2% МПА (рН 7,6) добавляют 2 мл раствора цистина (1% раствор цистина в 0,1 н. растворе гидроксида натрия), тщательно перемешивают и добавляют такой же объем 0,1 н. раствора серной кислоты. Среду стерилизуют 30 мин при температуре 112° С. К расплавленной и охлажденной до 50° С среде добавляют 1 мл 10% раствора ацетата свинца, стерилизованного двукратно текучим паром, перемешивают и добавляют 9 мл нормальной лошадиной сыворотки. Среду стерильно разливают в маленькие пробирки по 2 мл. Посев производят уколом.
Среда Бунина. Сухую хинозольную среду добавляют к 100 мл холодной воды (рН 7,6-7,8), размешивают и нагревают на слабом огне до расплавления агара (по прописи на этикетке). Затем среду кипятят 2-3 мин до образования пены, после чего среду остужают до 50° С и добавляют 5-10 мл стерильной дефибринированной крови. Среду перемешивают и разливают в чашки Петри. Готовую среду можно сохранять 3-4 дня при температуре 4-10°.
Среда Тинсдаля. К 100 мл 2% питательного агара, расплавленного и охлажденного до 50° С, добавляют: 1) 12 мл 1% раствора цистина на 0,1 н. растворе серной кислоты; 2) 12 мл 1% раствора гидроксида натрия; 3) 1,8 мл 2% раствора теллурита калия; 4) 1,8 мл 2,5% раствора гипосульфита натрия, 20 мл нормальной лошадиной или бычьей сыворотки. После добавления каждого ингредиента среду тщательно перемешивают. Чашки со средой хранят 3-4 дня при 10° С.
источник
Справочные и теоретические материалы. Микробиологическая диагностика дифтерии складывается из бактериологического и серологического методов исследования
Микробиологическая диагностика дифтерии складывается из бактериологического и серологического методов исследования.
Бактериологическое исследование проводят с целью лабораторной диагностики дифтерийной инфекции, выявления источников инфекции, подтверждения эпидемиологических связей и наблюдения за распространением токсигенных коринебактерий дифтерии. Цель бактериологического исследования – выявление возбудителя дифтерии с помощью минимального количества диагностических тестов, необходимых, достаточных и специфичных для получения достоверного ответа в максимально сжатые сроки. Не менее трех суток – отрицательный ответ, трех-четырех суток – ответ о выделении токсигенных коринебактерий дифтерии (возбудителя дифтерии). Четырех-пяти суток – ответ о выделении нетоксигенных коринебактерий дифтерии или других представителей этого рода. Бактериологическое исследование проводится на основании МУК 4.2.3065-13. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции. Методические указания (Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор), Главным государственный санитарным врачом РФ Г.Г.Онищенко 14 июля 2013 года).
Эффективность проведения бактериологического исследования в значительной степени зависит от своевременного правильного взятия материала и соблюдения сроков доставки его в бактериологическую лабораторию.
Медицинским работникам лечебно-профилактических организаций (ЛПО), ответственным за взятие и транспортирование материала при обследовании на дифтерию, необходимо согласовывать методику взятия материала, условия транспортирования и возможности применения транспортной среды с врачами-бактериологами, проводящими эти исследования. Медицинским работникам ЛПО, допущенным к взятию и посеву материала, следует проходить инструктаж не реже 1 раза в год в баклаборатории, осуществляющей исследования на дифтерию. Для взятия материала используют коммерческие стерильные сухие ватные (или дакроновые) тампоны, также возможно их приготовление в лабораторных условиях с учетом требований нормативно-методической документации. Тампоны должны иметь форму «капли», а не «веретена».
Материал из ротоглотки и носа берут отдельными тампонами, натощак или не ранее чем через 2 ч после еды, а также до применения полоскания или других видов лечения. Взятие материала осуществляют при хорошем освещении, с использованием шпателя, не касаясь тампоном языка и внутренних поверхностей щек и зубов. Одним тампоном собирают материал с участков ротоглотки – миндалин, дужек мягкого неба, небного язычка, при необходимости – с задней стенки глотки. При наличии налетов патологический материал следует брать с границы пораженных и здоровых тканей, слегка нажимая на них тампоном. Для взятия материала из носа используют другой тампон, который вводят глубоко сначала в один, а потом в другой носовой ход, собирая материал со стенок и перегородки носа, при этом, не касаясь крыльев носа снаружи.
При дифтерии других локализаций (глаза, уши, кожа, раны, гениталии и пр.), помимо материала из пораженных участков, забирают материал из ротоглотки и носа. При показаниях к обследованию на дифтерию и одновременном наличии пораженных слизистых и кожи в углу рта («заеды») обследование этих участков проводят отдельным тампоном и параллельно берут материал из ротоглотки и носа.
При прямой ларингоскопии материал (слизь, пленка) собирают непосредственно из гортани. В случаях оперативного вмешательства для бактериологического исследования следует брать слизь из интубационной трахеотомической трубки.
При взятии материала с пораженного участка кожи необходимо протереть его поверхность промокательными движениями стерильной марлевой салфеткой или тампоном, смоченными стерильным физиологическим раствором, осторожно приподнять или отодвинуть струпы и корочки. После этого тампоном, предназначенным для взятия материала на дифтерию, взять секрет с пораженного участка. Одновременно забирают материал из ротоглотки и носа.
При постмортальном исследовании для выявления возбудителя дифтерии материал следует брать с миндалин, гортани и полости носа (слизь, пленки), при редких локализациях – со слизистой пищевода и желудка. Учитывая, что дифтерия является токсикоинфекцией, другие органы (сердце, печень и пр.) обследуют только для выявления токсических поражений.
Тампоны должны быть доставлены в лабораторию не позднее чем через 3 ч после взятия материала. В холодное время года для предотвращения замерзания исследуемый материал доставляют в бактериологическую лабораторию в сумках-термосах.
При невозможности доставки исследуемого материала в баклабораторию в установленные сроки (не позднее 3 ч) или проведения обследования в ЛПО во второй половине дня материал из ротоглотки (зева) и носа засевают «площадкой» с последующим рассевом на одну чашку Петри с питательной средой, разделенной пополам («чашечный метод»). После этого посевы помещают в термостат при 37 °C до утра следующего дня, после чего доставляют в сумках-термосах в баклабораторию (с указанием времени посева материала). При редких локализациях посев материала из каждого пораженного участка осуществляют на отдельную чашку Петри с питательной средой.
Медицинский персонал ЛПО должен проходить инструктаж в баклаборатории о правилах взятия и посева материала на питательные среды. При невозможности организовать посев материала «чашечным методом» допускается засевать материал в пробирки с транспортной средой для сохранения и подращивания возбудителя дифтерии, которая готовится в лабораторных условиях согласно существующим требованиям.
Не допускается использование коммерческих транспортных сред, предназначенных для исследования на микрофлору ротоглотки и носа, в связи с тем, что состав этих сред не удовлетворяет условиям культивирования возбудителя дифтерийной инфекции, что приводит к потере патологического материала.
В случае использования транспортной среды, приготовленной в лабораторных условиях, согласно нормативной документации, материал собирают сухим тампоном, опускают в пробирку со средой и следят за тем, чтобы пробка тампона не намокала. Следует учитывать, что применение транспортной среды увеличивает срок выдачи окончательного ответа на одни сутки, так как после подращивания в термостате при 37 °C на утро следующего дня материал доставляется в баклабораторию для последующего посева на чашки Петри с селективной питательной средой.
Незасеянные (чистые) чашки Петри с питательной средой и пробирки с транспортной средой доставляются в ЛПО из баклабораторий. Хранение питательных сред в ЛПО осуществляется в холодильнике при 4–6 °C: чашки со средой – не более трех дней; пробирки с транспортной средой – не более 10 дней. Перед взятием и посевом материала их необходимо достать из холодильника и согреть до комнатной температуры. При невозможности доставки материала в баклабораторию круглосуточно ЛПО оснащаются термостатами. В стационаре взятие патологического материала проводят круглосуточно, используя «чашечный метод».
Исследуемый материал из ротоглотки и носа, собранный сухими ватными тампонами и помещенный в пробирки (не менее двух пробирок от одного лица, при редких локализациях добавляются дополнительные пробирки). Материал, засеянный в пробирки с транспортной средой (также не менее двух пробирок от одного лица), или материал из ротоглотки и носа, а также из редких мест локализации, засеянный «чашечным методом», должен быть четко пронумерован и иметь сопроводительную документацию. Пробирки с материалом от одного лица скреплены вместе.
В сопроводительном документе указывают: фамилию, имя, отчество, возраст, адрес обследуемого лица, название учреждения, направляющего материал, локализацию взятия материала (нос, зев, кожа и др.). Дату и время взятия материала, цель обследования (диагностическая, с указанием диагноза, по эпидпоказаниям, с профилактической целью).
Первый день (посев материала)
Материал для исследования из ротоглотки (зева), носа или других пораженных мест засевают раздельно на поверхность одной из рекомендуемых плотных питательных сред — КТА или Клауберг II, разлитых в чашки Петри («чашечный метод посева»).
Лучшими питательными средами для первичного посева материала являются кровяные теллуритовые среды – КТА, Клауберг II. Питательные агары готовят по прописи на этикетке и ex tempore добавляют кровь или глицериновую смесь, теллурит калия. Кровяные теллуритовые среды являются также дифференциально-диагностическими, поскольку колонии коринебактерий на этих средах имеют серую или черную окраску (данные микроорганизмы способны восстанавливать теллурит калия до металлического теллура, вещества черного цвета, и накапливать его внутри клеток). Теллурит калия в определенной концентрации не препятствует росту представителей рода коринебактерий и практически полностью ингибирует рост посторонней микрофлоры. На питательных средах без крови значительно снижается высеваемость (в 2–3 раза), замедляется рост колоний (через 24 ч на чашках первичного посева колонии либо мелкие, либо отсутствуют, рост которых наблюдается только через 48 ч), изменяется морфология колоний, ингибирующая способность значительно ниже при замене теллурита калия на другие ингибиторы (например, хинозол). Для выделения коринебактерий дифтерии выпускается также коммерческая питательная среда Коринебакагар, в которую, согласно прописи по приготовлению, не нужно добавлять кровь. Однако данная среда уступает кровяным средам по ингибирующей активности и ростовым свойствам (образуются колонии меньшего размера на первые сутки или же они могут появляться только на вторые сутки роста).
Для определения токсигенных свойств коринебактерий дифтерии выпускается коммерческая сухая среда ОТДМ и Коринетоксагар. Коммерческие среды готовят по прописи на этикетке, добавляя ex tempore нужные ингредиенты.
В лабораторных условиях готовят транспортную среду для сохранения и накопления коринебактерий дифтерии, которую используют при транспортировании исследуемого материала. Коммерческого выпуска этой среды нет.
Питательные среды для первичного посева разливают по чашкам Петри слоем 3–4 мм. Они могут быть использованы в течение 3 суток при условии хранения при температуре 4–6 °C.
Посев от одного лица производят на одну чашку, используя при этом половину поверхности (1/2) чашки среды для посева материала из ротоглотки (зева), а вторую – для посева материала из носа. При посеве материала с кожи или других пораженных мест добавляют еще одну чашку (все чашки маркируются). Не допускается посев материала от нескольких лиц на одну чашку.
При посеве материал тщательно втирают в среду со всех сторон тампона на участке площадью 2×1 кв. см у края чашки, стараясь оставить весь патологический материал на поверхности формируемой «площадки». Формирование такой «площадки» является обязательным, что позволяет сохранить исследуемый материал, находящийся на тампоне. Дальнейший рассев исследуемого патологического материала осуществляют этим же тампоном, не отрывая тампон от поверхности питательной среды, засевая оставшуюся поверхность 1/2 чашки, что позволяет получить изолированные колонии (чистую культуру) для дальнейшей идентификации непосредственно с чашки первичного посева. Такой метод сохраняет весь патологический материал на поверхности питательной среды и позволяет работать с отдельными изолированными колониями, исключая этап накопления на агаровом косяке чистой культуры, что сокращает длительность проведения исследования на одни сутки.
Засеянные чашки с плотной питательной средой или пробирки с транспортной средой помещают в термостат для инкубации при 37 °C.
Высев из транспортной среды производят описанным выше способом на следующие сутки, используя дифференциально-диагностическую плотную питательную среду, тампоном, отжатым о стенки пробирки, или петлей, забирая материал из осадка.
Чашки со средой предварительно согревают при комнатной температуре или в термостате при 37 °C (15–20 мин.). Если на поверхности чашки со средой есть конденсат, то ее подсушивают на крышке, повернув чашку вверх дном. Нельзя использовать для посева материала «охлажденные» чашки с питательной средой.
1. Колонии, выросшие на чашках, просматривают через 24 ч после посева материала (если материал засевали во второй половине дня, то просмотр осуществляется ровно через 24 ч, т.е. во второй половине дня) визуально или с помощью микроскопа бинокулярного стереоскопического (МБС).
2. Чашки с колониями, «подозрительными» на дифтерийные, отбирают для дальнейшей идентификации культуры по всем тестам. «Подозрительные» колонии на кровяно-теллуритовых средах (КТА) через 24 ч роста – темно-серого или серо-черного цвета, выпуклые, округлой формы, непрозрачные, с ровными краями или с легкой изрезанностыо края или радиальной исчерченностью, мягкой, маслянистой консистенции. Через 48 ч окончательно формируется типичная морфология (архитектоника) колоний – серо-черного или черного цвета с металлическим оттенком («цвет мокрого асфальта»), непрозрачные, матовые, приподнятые с выпуклым центром или выпуклые, округлой формы, гладкие с ровными краями и мягкой консистенции (S-форма) или шероховатые, с радиальной исчерченностью (напоминающие форму «маргаритки»), с приподнятым центром (R-форма), иногда крошащиеся при прикосновении петлей.
3. Микроскопию препаратов-мазков из «подозрительных» колоний можно не проводить, так как все эти колонии подлежат обязательному изучению в пробе на токсигенность и в пробе Пизу.
4. Из «сомнительных» колоний готовят препараты-мазки. В препаратах-мазках, как «подозрительных», так и «сомнительных» колоний, клетки C. diphtheriae из культуры, выросшей на средах первичного посева с ингибиторами роста (теллурит калия), могут быть укорочены, утолщены, однако присущее им расположение и полиморфизм сохраняются. Оценка морфологических признаков не позволяет установить видовую принадлежность микроорганизмов, но дает возможность при обнаружении коринеформных микроорганизмов предположительно отнести их к роду Corynebacterium и подвергнуть дальнейшей идентификации по всем тестам. В случае обнаружения других форм микроорганизмов (кокков, дрожжей, споровых палочек) дальнейшее изучение этих колоний прекращается.
5. В случае роста «подозрительных» по морфологии колоний, похожих на колонии коринебактерий, необходимо сразу через 24 ч роста приступить к изучению их токсигенных свойств. Токсигенные свойства изучают не менее чем у 2 изолированных колоний путем посева одной половины каждой колонии на среду для определения токсигенности и «необожженной» петлей – на среду Пизу, а другой половины колонии – в пробирку со скошенным сывороточным агаром для сохранения и накопления чистой культуры.
6. При невозможности снять 1/2 колонии в первые 24 ч роста для посева на токсигенность и на среду Пизу используется материал целой колонии. Посев на скошенный агар исключается и в дальнейшем используется культура, выросшая через 24 ч в пробирке с пробой Пизу. Учитывая, что через 24 ч роста колонии имеют небольшие размеры и материала 1/2 или 1 колонии может быть недостаточно для накопления дифтерийного токсина в пробе на токсигенность, а также то, что в исследуемом материале могут находиться одновременно токсигенные и нетоксигенные разновидности C. diphtheriae, крайне важно изучить токсигенные свойства по возможности у максимального числа выросших колоний (20 и более), смешивая по 5–7 однотипных колоний в одну бляшку. При невозможности постановки пробы на токсигенность классическим способом из-за недостаточного количества и малого размера колоний, выросших через 24 ч, изучают, смешивая однотипные по морфологии и размеру колонии в нескольких бляшках, и, не прожигая петли, производят посев в среду Пизу. Чашки с пробами на токсигенность и Пизу помещают в термостат.
Определение токсигенных свойств коринебактерий дифтерии
Используют два способа постановки пробы на токсигенность:
1. Модифицированная проба Элека с бумажными полосками, утвержденная для бактериологической практики в нашей стране в 1961 г.
2. Проба Фельдмана Ю.Г. и соавторов с бумажными дисками, разработанная в нашей стране и утвержденная в 1988 г., получившая одобрение Международной рабочей группы ВОЗ по лабораторной диагностике дифтерийной инфекции к применению в зарубежных лабораториях. В основе методов определения токсигенности коринебактерий дифтерии лежит процесс встречной иммунодиффузии токсина и антитоксических антител в плотной питательной среде. В местах оптимального количественного соотношения между токсином, продуцируемым коринебактериями, и антитоксином, нанесенным на фильтровальную бумагу, происходит их взаимодействие с образованием преципитата в виде белой линии.
Токсигенность коринебактерий дифтерии определяют, как правило, в чистой культуре (отдельные колонии со среды первичного посева или культура со скошенного агара или с пробы Пизу). Смесь колоний или культуры, загрязненные посторонней микрофлорой, также могут быть испытаны на токсигенность. При отсутствии в этом случае преципитатов в агаровом геле опыт следует повторить с выделенными на скошенной сывороточно-агаровой среде или после рассева на КТА чистыми культурами.
Для постановки пробы на токсигенность необходимо иметь: стерильные чашки Петри с ровным дном (стеклянные или одноразовые пластиковые), питательную среду – сухую коммерческую питательную среду для определения токсигенности или агар Мартена, нормальную сыворотку крови крупного рогатого скота (СКРС), стерильные полоски из фильтровальной бумаги размером 0,7 см х 8,0 см или бумажные диски диаметром 0,6 см, очищенный ферментолизом и специфической сорбцией дифтерийный антитоксин (в дальнейшем именуется антитоксин), при отсутствии которого в исключительных случаях можно использовать противодифтерийную антитоксическую сыворотку лошадиную, лечебную (в дальнейшем именуется антитоксическая сыворотка). Лучше использовать коммерческие или приготовленные в лаборатории бумажные диски, пропитанные антитоксином. Обязательным является использование контрольного токсигенного штамма коринебактерий дифтерии биовара gravis 24– 48-часового роста.
Постановка пробы на токсигенность
На поверхность чашки Петри со средой для определения токсигенности дифтерийных микробов помещают четыре бумажных диска с дифтерийным антитоксином. Вокруг каждого диска с антитоксином формируют 5 «бляшек»: две «бляшки» – контрольного штамма и три – испытуемые (из одного анализа с подозрительными колониями формируют минимум две «бляшки» из изолированных колоний и одну – из смеси 3–6 однотипных колоний; материалом из этого же анализа можно занять места вокруг других дисков с антитоксином). Все пять «бляшек» располагают симметрично вокруг диска на расстоянии 0,7 см от его края. Диаметр каждой «бляшки» 0,6–0,7 см. На одной чашке Петри можно разместить до четырех дисков с антитоксином и, соответственно, до 20 «бляшек» с культурами (8 «бляшек» контрольных и 12 «бляшек» испытуемых). Бумажные диски расставляют на поверхности сывороточно-агаровой среды на максимально удаленном расстоянии между дисками, чтобы не произошло перекрестных реакций.
Чашки с посевами помещают в термостат при 37 °C.
Результат реакции учитывают через 18–24 ч, а также через 48 ч. Наличие линий преципитации между диском с антитоксином и испытуемой культурой свидетельствует о ее токсигенности. Исследуемая культура считается токсигенной, если линия преципитации данной культуры сливается под углом с линией преципитации контрольного штамма. Отсутствие линий преципитации у испытуемых культур через 48 ч, при наличии их у контрольных штаммов, указывает на отсутствие токсигенности у изучаемых культур. Линии преципитации у контрольных штаммов должны появляться через 18–24 ч. Более позднее появление линий преципитации требует проверки качества питательной среды, проверки чистоты контрольного штамма, или улучшения его фенотипических свойств при выращивании на кровяном агаре, или замены контрольного штамма.
1. Через 24 ч, при появлении специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности, положительной пробе на цистиназу, изучаемую культуру идентифицируют как коринебактерии дифтерии токсигенные и выдают документированный ответ о выделении C.diphtheriae токсигенных. При отсутствии специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности чашки инкубируют еще 24 ч.
2. Культуру, выросшую на скошенном сывороточном агаре или с пробы Пизу (после оценки ее чистоты), засевают на среды для определения биохимического варианта (глюкоза, сахароза, крахмал) и фермента уреазы (гидролиз мочевины).
Определение биохимических признаков
Определение цистиназной активности (проба Пизу).В отличие от C.pseudodiphtheriticum (ложнодифтерийной палочки Гофмана), C.pseudotuberculosis и многих других коринеформных бактерий C. diphtheriae и C.ulcerans обладают ферментом цистиназой.
Определение уреазной активности.C. pseudodiphtheriticum (ложнодифтерийная палочка Гофмана), C.ulcerans, C.pseudotuberculosis и некоторые другие микроорганизмы рода Corynebacterium обладают способностью продуцировать в процессе роста фермент уреазу и расщеплять мочевину. C.diphtheriae такой способностью не обладают.
Определение сахаролитической активности.Для идентификации C.diphtheriae используют также оценку сахаролитической активности выделенных культур на средах Гисса с углеводами – глюкозой, сахарозой, растворимым крахмалом.
Определение нитратредуктазной активности.Способность C.diphtheriae восстанавливать соли азотной кислоты (нитраты) в соли азотистой кислоты (нитриты) является дополнительным признаком, позволяющим отличать их от C.ulcerans и C.pseudotuberculosis, которые не обладают нитратредуктазой.
3. Чашки с первичным посевом исследуемого материала просматривают визуально или с помощью микроскопа бинокулярного стереоскопического (МБС) повторно через 36–48 ч инкубации в термостате. При наличии «подозрительных» колоний изучают их токсигенные свойства, цистиназную активность и выделяют чистую культуру на скошенном сывороточном агаре, если эти процедуры не были выполнены через 24 ч роста первичного материала.
4. Если вырастает только одна колония через 48 ч роста на чашках первичного посева, ее засевают на среду для определения токсигенности и, не обжигая петли, в столбик среды Пизу для определения цистиназы. Для дальнейшей идентификации можно использовать культуру из пробирки с пробой Пизу, или с бляшки через 48 ч роста в пробе на токсигенность, или через 24 ч роста в случае выявления токсигенных свойств идентифицируемой культуры.
5. При отсутствии колоний, подозрительных на коринебактерии дифтерии, выдают окончательный ответ, что коринебактерии дифтерии не выявлены.
6. При отсутствии роста микроорганизмов на «площадках» в чашках первичного посева через 48 ч инкубации в ряде случаев требуется повторное взятие и исследование материала. Отсутствие роста чаще всего свидетельствует о нарушении правил проведения бактериологического исследования (взятия, транспортирования, посева и культивирования исследуемого материала и качества питательных сред для первичного посева).
1. При появлении специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности (через 24 ч инкубации пробы на токсигенность 48-часового роста первичного посева) положительной пробе на цистиназу выдают документированный ответ о выделении токсигенных коринебактерий дифтерии.
2. Культуру, выросшую на скошенном сывороточном агаре или с пробы Пизу, после определения ее чистоты засевают на среды для изучения биохимических свойств (среды Гисса с сахарозой, глюкозой, крахмалом, проба Заксе или бульон с мочевиной), если эта процедура не была сделана ранее.
3. Повторно (через 48 ч) учитывают результаты пробы на токсигенность, поставленной во 2 день исследования. Одновременно производят учет сахаролитических свойств и уреазной активности в пробах, поставленных в 3 день исследования.
При отсутствии специфических линий преципитации через 48 ч после постановки пробы на токсигенность, но при положительных результатах проб на цистиназу, глюкозу, отрицательных результатах проб на уреазу и сахарозу, только на 4–5 сутки культуру идентифицируют как C.diphtheriae нетоксигенные, с указанием биохимического варианта.
4. При выделении токсигенных C.diphtheriae на 3–4 сутки от начала исследования дополнительно ответ о биохимических свойствах может быть выдан на 4–5 сутки (через 72 или 96 ч с момента первичного посева исследуемого материала).
Заключение осуществляется следующим образом.
1. Наличие специфических линий преципитации при определении токсигенных свойств, положительная проба на цистиназу, отрицательная проба на уреазу, характерные морфологические, культуральные и биохимические свойства (отсутствие ферментации сахарозы, ферментация глюкозы и крахмала или неферментация крахмала) позволяют заключить, что выделенная культура является C.diphtheriae, токсигенная, биохимического варианта гравис или митис.
2. Отсутствие специфических линий преципитации при определении токсигенных свойств, положительная проба на цистиназу, отрицательная проба на уреазу, характерные морфологические, культуральные и биохимические свойства (отсутствие ферментации сахарозы, ферментация глюкозы и крахмала или неферментация крахмала) позволяют заключить, что выделенная культура является C.diphtheriae, нетоксигенная, биохимического варианта гравис или митис.
3. При выделении C.pseudodiphtheriticum (ложнодифтерийной палочки Гофмана) или других дифтероидов бактериологический ответ считают отрицательным.
4. При наличии линий преципитации (чаще «размытых» в виде «облачка»), идентичных специфическим линиям контрольного штамма коринебактерий дифтерии, положительных проб на уреазу, цистиназу, ферментации глюкозы и крахмала, отсутствии ферментации сахарозы, отсутствии редукции нитратов в нитриты культуру относят к виду C. ulcerans, токсигенный вариант.
При отсутствии линий преципитации при определении токсигенных свойств и наличии всех других признаков, характерных для C. ulcerans, нетоксигенный вариант, бактериологический ответ считают отрицательным.
5. C.pseudotuberculosis идентифицируется по положительной реакции в пробе на уреазу. Тест восстановления нитратов в нитриты у этих микроорганизмов является вариабельным признаком, поэтому дифференциацию от C.ulcerans проводят по крахмалу (C.pseudotuberculosis не способны разлагать крахмал – отрицательный результат). Необязательный тест для практических бактериологов – для дифференциальной диагностики C.ulcerans и C.pseudotuberculosis вводят дополнительную пробу ферментации трегалозы и гидролиз желатина. Возможно выделение токсигенных C.pseudotuberculosis.
6. При выделении C. ulcerans и C. pseudotuberculosis необходимо подтверждение подобной идентификации в Референс-центре ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, чтобы исключить ошибки при возможном выделении C. diphtheriae.
7. Предварительный ответ при обследовании с диагностической целью и по эпидпоказаниям может быть выдан при наличии множественного роста однотипных «подозрительных» колоний на чашках первичного посева после 24 или 48 ч инкубации (на 2–3 сутки). Выявляют наличие фермента цистиназы и отсутствие фермента уреазы путем внесения в пробирки большого количества колоний. Предварительный ответ может быть изменен после окончания бактериологического исследования.
При нативной микроскопии (по просьбе инфекционистов) требуется дополнительный материал на тампонах из ротоглотки и носа. Однако чаще всего микроорганизмы в виде «палочек» не обнаруживают, что делает этот способ практически непригодным.
Серологическая диагностика.Для оценки состояния противодифтерийного иммунитета проводят определение антитоксических противодифтерийных антител в сыворотке крови человека методом постановки реакции пассивной гемагглютинации. Зарисовать схему постановки РНГА.
РПГА – двухкомпонентная реакция, предполагающая взаимодействие диагностикума эритроцитарного дифтерийного антигенного, который представляет собой эритроциты, сенсибилизированные дифтерийным анатоксином, и антитоксических противодифтерийных антител, находящихся в сыворотке крови обследуемых. При наличии в исследуемой сыворотке антитоксина образуется специфический комплекс: антитоксин + сенсибилизированные анатоксином эритроциты. В результате формируется осадок в виде агглютината эритроцитов.
РПГА рекомендуется ставить одновременно с двумя диагностикумами – дифтерийным и столбнячным. Несмотря на возможность использования коммерческих наборов, необходимо соблюдать основные требования, предъявляемые при постановке РПГА, чтобы устранить ошибки, некоторые неточности и даже ошибочные сведения, встречающиеся в Инструкциях по применению от производителей
Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:
источник
Использование: медицинская микробиология, лабораторная диагностика возбудителя дифтерии. Сущность изобретения: питательная среда содержит следующие компоненты, г/л панкреатический гидролизат рыбной муки 20 25; ферментативный гидролизат черного альбумина 8 12; хлористый натрий 4 6; агар 10 15; теллурит калия (2%-ный раствор) 5 20 мл. В отличие от кровяного теллуритового агара среда прозрачна, что значительно облегчает обнаружение дифтерийного микроба на поверхности агара. По ростовым свойствам предлагаемая среда превосходит известные. 1табл.
Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при лабораторной диагностике возбудителя дифтерии.
Известны питательные среды для выделения дифтерийного микроба из инфицированного материала, содержащие в своем составе гидролизаты белкового сырья (килька, кровь убойных животных), в качестве стимуляторов роста дрожжевой экстракт, L-цистеин солянокислый, глицериновую смесь и стерильную кровь, а для ингибирования роста посторонней микрофлоры теллурит калия [1] Наиболее близким к предлагаемой среде является кровяной теллуритовый агар [2] Основным недостатком этой среды является использование в ее составе стерильной дефибринированной или гемолизированной крови, что исключает возможность стерилизации среды, а получаемая плотная питательная среда непрозрачна. Сложный состав кровяного теллуритового агара приводит к многоэтапности приготовления питательной среды: приготовлению раствора питательного агара, расплавлению и охлаждению агара, добавлению раствора теллурита калия и стерильному внесению гемолизированной крови.
Существенным недостатком этой среды как диагностического препарата является малое количество образующихся колоний: при засеве 100 микробных клеток вырастает не более 5 колоний.
Цель изобретения обеспечение возможности стерилизации и повышение ростовых свойств питательной среды для выделения дифтерийного микроба.
Цель достигается тем, что предлагается питательная среда, содержащая панкреатический гидролизат рыбной муки, ферментативный гидролизат черного альбумина, хлористый натрий, теллурит калия и агар, при следующем соотношении компонентов, г/л: Панкреатический гидролизат рыбной муки 20-25 Ферментативный гидролизат черного альбумина 8-12 Хлористый натрий 4-6 Агар 10-15 Теллурит калия (2%-ный раст- вор) 5-20 мл Отличием предлагаемой среды является использование панкреатического гидролизата рыбной муки и ферментативного гидролизата черного альбумина, причем их соотношение в среде находится в пределах от 3:1 до 2:1 соответственно.
Питательную среду готовят следующим образом.
П р и м е р 1. Для приготовления предлагаемой сухой питательной среды смешивают 20 г панкреатического гидролизата рыбной муки (ТУ оп. 64-15-120-90), 8 г ферментативного гидролизата черного альбумина (ТУ оп. 64-15-114-89), 4 г хлористого натрия и 10 г агара в смесителе барабанного типа. Полученный сухой препарат расфасовывают в ламинированные пакеты или стеклянные банки с завинчивающейся крышкой. Сухая среда может храниться в течение 2 лет (срок наблюдений). Для приготовления плотной питательной среды содержимое пакета или банки (42 г) растворяют в 1 л дистиллированной воды, тщательно размешивают, доводят до кипения и кипятят 1-2 мин при перемешивании и стерилизуют при 1 атм (121 о С) 20 мин. После охлаждения до 45-60 о С добавляют 20 мл 2% -ного процентного раствора теллурита калия и разливают в чашке Петри. Односуточную культуру дифтерии выращивают на сывороточно-агаровой среде, смывают физиологическим раствором, готовят 1 млрд клеток в 1 мл взвеси и путем 10-кратных разведений готовят необходимую посевную дозу. Для контроля сред используют два последних разведения (6 и 7), что соответствует 500 и 100 микробным клеткам в 0,1 мл.
В таблице приведены экспериментальные данные по ростовым свойствам питательных сред при культивировании трех штаммов Corynebacterium dipheriaemitis 143, Corynebacterium diphteriae gravis 3689 и Corynebacterium xerosis 1911. Рост стафилококка (St. aureus Biomico 209p) отсутствует.
П р и м е р 2. Для приготовления сухой питательной среды смешивают 25 г панкреатического гидролизата рыбной муки, 12 г ферментативного гидролизата черного альбумина, 6 г хлористого натрия и 15 г агара. Далее аналогично примеру 1. Ростовые свойства среды представлены в табл.1. Теллурита калия (2% -ный раствор) добавляют 5 мл.
П р и м е р 3. Для приготовления плотной питательной среды берут навеску сухого питательного агара СПА (питательную основу среды прототипа) в количестве 40 г, добавляют навеску 10 г ферментативного гидролизата черного альбумина, заливают 1 л дистиллированной воды. Далее аналогично примеру 2. Ростовые свойства представлены в таблице.
Анализ результатов биологической проверки питательных сред показывает (таблица), что по количеству и размеру вырастающих колоний C. mitis, C. gravis, C. xerosis предлагаемая среда превосходит известные.
Так, при выращивании этих штаммов из 10 -6 и 10 -7 разведений число колоний на предлагаемой среде в 1,5-2,0 раза больше, чем на известных питательных средах.
Диаметр образующихся колоний через 48 ч культивирования на предлагаемой среде на 0,5-1,0 мм больше, чем на известных. Морфология выросших колоний типичная, черного цвета с приподнятым центром.
Увеличения размера и количества колоний на предлагаемой среде удается достичь за счет оптимального соотношения двух компонентов ферментативного гидролизата черного альбумина и панкреатического гидролизата рыбной муки. Такого эффекта не удается получить при использовании в качестве белковой основы панкреатического гидролизата каспийской кильки (пример 3). Ростовые свойства последней остаются на уровне кровяного теллуритового агара.
Большая скорость роста дифтерийных микробов на предлагаемой среде проявляется и при меньших временах культивирования. Через 19 ч культивирования на предлагаемой среде визуально наблюдаются колонии дифтерийного микроба, тогда как на прототипе за это время рост возбудителя дифтерии можно наблюдать с помощью бинокуляра.
Предлагаемая питательная среда прозрачна в отличие от непрозрачного кровяного теллуритового агара, что также значительно облегчает обнаружение дифтерийного микроба на поверхности агара.
За счет теллурита калия (1,5-2,0 мл на 100 мл среды) на всех вариантах сред рост посторонней микрофлоры (St. aureus, E. coli, Pr. vulgaris) подавлен.
Смыв из носоглотки через 20-24 ч культивирования на предлагаемых средах дает более пышный рост дифтероидов по сравнению с известными средами.
ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ДИФТЕРИЙНОГО МИКРОБА, содержащая питательную основу, хлористый натрий, агар, теллурит калия и воду, отличающаяся тем, что в качестве основы она содержит панкреатический гидролизат рыбной муки и дополнительно ферментативный гидролизат черного альбумина при следующем соотношении компонентов: Панкреатический гидролизат рыбной муки, г 20 25 Ферментативный гидролизат черного альбумина, г 8 12 Хлористый натрий, г 4 6 Агар, г 10 15 Теллурит калия (2%-ный раствор), мм 5 20 Вода, л До 1
источник
С целью раннего выявления дифтерии и определения носителей дифтерийной палочки необходимы выделение и идентификация возбудителя, а также определение его способности к токсинообразованию. Материалом для исследования служат дифтеритические плёнки, слизь из носоглотки или отделяемое из подозрительных поражений кожных покровов.
Забор материала на дифтерию проводят двумя стерильными тампонами: один используют для посева, с другого делают мазки и окрашивают их по Граму и Найссеру. Взятый материал следует доставлять в лабораторию не позднее чем через 3 ч.
Окраска по Граму не является специфичной, так как дифтерийные палочки сравнительно плохо воспринимают красители, но позволяет косвенно идентифицировать непатогенные коринебактерии, располагающиеся в виде палисада (параллельно) или в виде китайских иероглифов. Окраска по Найссеру позволяет выявить характерные зёрна Бабеша-Эрнста и отличить дифтерийную палочку от ложнодифтерийной палочки С. pseudodiphtheriticum (С. hofmannii), часто обитающей в носоглотке.
Бактерии дифтерии выделяют посевом на элективные среды с теллуритом (например, Клауберга II или Маклёода), ложнодифтерийная палочка (палочка Хофманна) теллур не восстанавливает (см. рис. 8 на вклейке). Для выделения чистой культуры дифтерии часть подозрительной колонии засевают на скошенный агар (или среду Ру), вторую часть — на твёрдую питательную среду для определения токсигенности и (не обжигая петли) проводят определение цистиназной активности (проба Пизу). При положительном результате наблюдают образование коричневого облачка вокруг линии укола. Чистую культуру идентифицируют на средах Хйсса, пользуясь укороченным пёстрым рядом (глюкоза, мальтоза, сахароза, мочевина), что позволяет отличить С. diphtheriae от непатоген пых коринебактерии (рис. 14-3).
Для идентификации биоваров дифтерии используют «длинный» ряд углеводов, включающий крахмал и гликоген. Для полной идентификации можно исследовать способность бактерий расти в анаэробных условиях посевом уколом в столбик 0,5% сахарного агара (растёт только С. diphtheriae).
Определение токсигенности дифтерийной палочки in vivo. Проводят подкожным или внутрикожным заражением 0,5-1,0 мл бактериальной культуры морских свинок массой 250 г. За 24 ч до заражения одно животное иммунизируют дифтерийным антитоксином. При положительном результате неиммунизированные животные погибают в течение 3-5 сут.
Определение токсигенности дифтерийной палочки in vitro. Способность к образованию токсина можно определять заражением куриных эмбрионов или культур клеток с регистрацией последующего цитопатнческого эффекта. Можно использовать твердофазный ИФА с использованием антитоксинов, меченных пероксидазой. Также предложены ПЦР и ДНК-зонды для обнаружения гена tox в бактериальной хромосоме. Однако наибольшее распространение получил тест иммунодиффузии Илека. На среду с пониженным содержанием Fe2+ (для более интенсивного токсинообразования) проводят посев исследуемого изолята и эталонных токсигенного и нетокси-генного штаммов параллельными штрихами. На выросшие колонии накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной дифтерийным антитоксином. Образующийся токсин и антитоксин диффундируют в агар и в месте встречи образуют линии преципитации, так называемые «усы» или стрелы. На практике используют модификацию метода. Полоску бумаги, пропитанную антитоксином (500 ME в 1 мл), наносят на чашку, а исследуемые культуры засевают бляшками по обе стороны бумажной полоски. Контролем служит заведомо токсигенная культура, также посеянная «бляшкой». В результате встречной диффузии токсина и антитоксина в месте их контакта выпадает линия преципитации, сливающаяся с линией преципитации токсигенного штамма.
Для дифференциальной диагностики возбудителей используют набор из 9 кори нефагов. С его помощью можно типировать большинство токсигенных и нетоксигенных штаммов биовара gravis.
источник