Диагностика дифтерии основана на клинических данных с последующим подтверждением диагноза бактериологическим исследованием. Лабораторная диагностика дифтерии включает в себя ряд исследований, основным из которых является микробиологическое.
- Зачастую для постановки диагноза бывает достаточно тщательно собранного анамнеза заболевания и осмотра ротоглотки. Всякая задержка при установлении диагноза и назначения адекватного лечения увеличивает вероятность неблагоприятного исхода заболевания.
- Выделение культуры возбудителей с последующим определением у выделенных возбудителей токсикогенности является основным и единственным методом микробиологической диагностики дифтерии. Предварительный результат получается через 24 часа, через 48 часов получается результат исследования дифтерийных палочек на токсикогенность, через 72 часа определяется биовар возбудителя.
- Микроскопическое исследование при дифтерии нерационально.
- Серологическая диагностика основана на определении роста титра антибактериальных антител. Результаты получаются на 2-й неделе заболевания.
- При диагностике дифтерии применяется генетический метод (ПЦР), позволяющий определить ДНК бактерий.
- Реакция латекс агглютинации относится к экспресс-методам. Результат получается уже через два часа.
- Иммунофлуоресцентный анализ результативен. Однако его проведение должно осуществляться только высококвалифицированным персоналом.
Рис. 1. Пленка грязно-белого цвета и выраженный отек подкожной жировой клетчатки шеи — «бычья шея» — классические признаки дифтерии.
Микробиологическое исследование является основным методом лабораторной диагностики дифтерии.
Бактериологическое исследование проводится в следующих случаях:
- с целью диагностики дифтерии зева, носа и глотки у взрослых и детей,
- с целью выявления возможного бактерионосительства у лиц, которые поступают в детские дошкольные учреждения и специализированные учреждения для взрослых,
- с целью выявления заболевания среди контактирующих лиц.
Материал для исследования (мазок на дифтерию) собирается натощак или спустя 2 часа после еды. Для исследования используются дифтерийные пленки или кусочки тканей, расположенных по соседству, отделяемое из мест поражения и носоглоточная слизь.
Забор материала (мазок на дифтерию) осуществляется ватным тампоном. Корень языка прижимается шпателем. Ватным тампоном необходимо коснуться слизистой оболочки миндалин на границе пленки, дужек и задней стенки глотки. Далее тампон опускается в стерильную пробирку, не касаясь ее стенок.
В течение первых 3-х часов должен быть отправлен в лабораторию. При невозможности произвести посев в ближайшие 3 — 4 часа, забор материала осуществляется стерильным ватным тампоном, который смачивают в 5% растворе глицерина в изотоническом растворе хлорида натрия или 2% растворе теллурита калия.
Забор материала (мазок на дифтерию) осуществляется двумя ватными тампонами, один из которых используется для посева, другой — для микроскопии.
При подозрении на дифтерию необходимо оповестить сотрудников лаборатории, чтобы собранный материал был посеян на соответствующие среды (кровяной агар, среда Леффлера или теллуритовая среда).
Посев осуществляется на питательные среды (кровяной агар, среда Леффлера или теллуритовая среда). Теллурит в большой концентрации подавляет рост сопутствующей микрофлоры.
Рис. 2. На фото рост колоний палочки дифтерии на разных средах — кровяном агаре и теллуритовой среде.
При росте бактерий на кровяном агаре колонии приобретают беловатую окраску, они непрозрачные, округлые, выпуклой формы, 1 — 2 мм в диаметре, чаще маслянистой консистенции.
При росте бактерий на теллуритовых средах колонии серого цвета, выпуклые, края ровные. Через двое суток колонии приобретают темно-серый или черный цвет, они имеют металлический блеск, ровные или фестончатые края, поверхность гладкая или радиально исчерчена.
Идентификации разновидностей штаммов возбудителей дифтерии основана на способности бактерий расщеплять гликоген и крахмал. Для этих целей используется методика «длинного» ряда углеводов.
Принимая во внимание ферментативные признаки возбудителей и структуру колоний при росте на теллуритовых средах, выделяют 4 биотипа коринебактерий дифтерии: Corynebacterium diphtheriae gravis, Corynebacterium diphtheriae mittis, Corynebacterium diphtheriae intermedius и Corynebacterium diphtheriae belfanti.
Рис. 3. На фото слева колонии коринебактерий дифтерии гравис (Corynebacterium diphtheriae gravis). Они имеют большой размер, выпуклые по центру, радиально исчерчены, с неровными краями. На фото справа Corynebacterium diphtheriae mittis. Они небольшого размера, темной окраски, гладкие и блестящие, с ровными краями.
Токсикогенность возбудителей дифтерии определяется после выделения культуры бактерий. Для этих целей используется методика диффузной преципитации в геле и методика определения токсикогенности бактерий в живом организме (на морских свинках).
Лабораторная диагностика с применением микроскопии является второстепенным по значимости. Ввиду того, что возбудители дифтерии плохо впитывают красители, окраска по Граму считается не специфичной, однако она позволяет косвенно определить непатогенные коринебактерии, которые в мазке располагаются параллельно друг другу.
При окраске по Нейссеру выявляются характерные для дифтерийных палочек зерна Бабеша-Эрнста, которые располагаются на полюсах клеток, придавая им вид булавы.
В мазках патогенные дифтерийные палочки располагаются под углом друг к другу.
Для выявления зерен Бабеша-Эрнста применяется методика люминесцентной микроскопии. При окрашивании мазков корифосфином в микроскопе можно увидеть желто-зеленые тела бактериальных клеток с оранжево красными зернами волютина.
Рис. 4. Дифтерийные палочки под микроскопом. Окраска по Граму.
Рис. 5. На фото слева ложнодифтерийные палочки Гоффмана. Они часто обнаруживаются в носоглотке. Они толстые, короткие, располагаются в мазках параллельно друг другу. На фото справа патогенные бактерии. В мазке располагаются под углом друг к другу.
Серологические исследования позволяют обнаружить антибактериальные и антитоксические антитела. Значимым является обнаружение антибактериальных антител, так как содержание антитоксина изменяется в связи с применением с первых дней антитоксической сыворотки. Наиболее распространенными в настоящее время является реакция пассивной гемагглютинации (РНГА и РПГА).
Иммуноглобулины G и M говорят об остроте инфекционного процесса.
Иммуноглобулины G говорят о недавно перенесенном заболевании.
Иммуноглобулины М говорят об остропротекающей дифтерии.
При дифтерии титр антител со временем повышается. Понижение концентрации антител свидетельствует о выздоровлении больного.
Противодифтерийные антитела образуются после вакцинации. В крови привитого человека они циркулируют многие годы.
Благодаря применению методики флуоресцирующих антител стало возможным проведение качественного и количественного анализа внутриклеточных и поверхностных антигенов в образцах клеточных суспензий. Антигены визуализируются с помощью специфических антител с флуоресцентными маркерами. Использование данной методики доверяется только высококвалифицированному персоналу.
Методика ПЦР применяется для раннего выявления дифтерийных палочек, подтверждения диагноза и в случаях атипичной ангины. Обнаружение гена токсикогенности методом ПЦР является наиболее быстрым и надежным методом лабораторной диагностики дифтерии.
Рис. 6. ПЦР является наиболее быстрым и надежным методом лабораторной диагностики дифтерии.
- При токсическом поражении сердечной мышцы отмечаются изменения на электрокардиограмме, фонокардиограмме и УЗИ сердца. Исследуется активность целого ряда ферментов (лактатдегодрогиназа, креатинфосфокиназа, аспартатаминотрансфераза).
- Поражение почек при дифтерии проявляется в виде токсического нефроза. При подозрении на это осложнение производится общий анализ крови и мочи, биохимические исследования (определение креатинина, мочевины, остаточного азота), производится УЗИ почек.
- Токсическое поражение печени протекает с явлениями гипогликемии (снижение уровня глюкозы в крови) и глюкозурии (наличие глюкозы в моче).
- Развитие анемии связано с гемолизом эритроцитов.
к содержанию ↑
Наличие или отсутствие противодифтерийного иммунитета устанавливается при помощи внутрикожной пробы Шика, которая проводится с дифтерийным токсином.
В случае отрицательной реакции говорят о невосприимчивости к дифтерии. Реакцию Шика сегодня используют только по эпидпоказаниям. На ее проведение уходит несколько дней. Однако несмотря на это она помогает определить степень восприимчивости к дифтерии лиц, находившихся в контакте с больным и уточнить их иммунный статус.
Рис. 7. Реакция Шика проводится с дифтерийным токсином. Стандартный дифтерийный токсин в дозе 0,2 мл вводится внутрикожно в среднюю треть предплечья туберкулиновым шприцом.
источник
Материалом для исследования при дифтерии могут быть пленки и слизь из зева и носа, а при редких локализациях дифтеритических воспалений — из глаза, уха, с поверхности раны и кожи. Отделяемое забирают сухим ватным тампоном или смоченным 5% раствором глицерина в физиологическом растворе с рН-8.
До этого уровня его доводят 20% раствором однозамещенного фосфорно-кислого натрия (Na2HPO4).
Исследование осуществляют не позднее 3-4 часов после забора, с поэтапной выдачей ответов о подтверждении диагноза.
Морфологические и тинкториальные признаки дифтерийных бактерий настолько своеобразны, что микроскопический метод может примениться как самостоятельный или предварительный к бактериологическому анализу. Кроме того, он дает представление и о сопутствующей микрофлоре.
Для выявления дифтерийных палочек могут быть использованы три метода окраски: Грама, Леффлера, Нейccера.
МЕТОД ГPAМA позволяет выявить способность дифтерийных бактерий вступить во взаимодействие с генцианвиолетом. Дифтерийные бактерии грампозитивиы, но это свойство непостоянно. При контакте с антибиотиками, при длительном пребывании в голодной среде резко изменяется обмен веществ и грамположительность микробов теряется. Поэтому ориентироваться на этот признак нельзя.
МЕТОД НЕЙССЕРА — наиболее ценный дифференциально-диагностический способ, позволяющий не только окрасить микроорганизмы, но и выявить полярно вкрапленные зерна волютина и характерное расположение бактериальных особей под углом.
РЕАКТИВЫ
- УКСУСНОКИСЛАЯ СИНЬКА НЕЙСЕРА: метиленовая синька -0,1 г, спирт 96° -2 мл; 5% раствор ледяной уксусной кислоты в дистиллированной воде — 50 мл.
- РАСТВОР ЛЮГОЛЯ: 2 г йодистого калия растворить в 10 г дистиллированной воды. Затем к этому раствору прибавить; 1 г кристаллического йода и добавить воды до 300 мл.
- РАСТВОР ХРИЗОИДИНА: 2 г хризоидина на 300 мл горячей дистиллированной воды.
Вместо раствора хризоидина можно использовать раствор везувина (краситель бисмаркбраун): везувин-1 г; 96° cпирт-10 мл; кипящая дистиллированная вода-100 мл.
ТЕХНИКА ОКРАСКИ
- Синька Нейссора- 1 минута
- Раствор Люголя — 30 секунд.
- Ополаскивание дистиллированной водой.
- Докраска расвором хризоидина или везувина — 10-15 секунд.
Тело микробной клетки окрашивается в желтый или желто-коричневый цвет, зерна волютина — коричнево-черного цвета.
ОКРАСКА ПО СПОСОБУ ЛЕФФЛЕРА
Метод Леффлера прост, но по своим дифференциально-диагностическим возможностям он не уступает сложному способу Нейссера. Поэтому он применяется значительно чаще.
Для окраски нужен один реактив — щелочная метиленовая синька Леффлера следующего состава: Дистиллированная вода — 99 мл; 1% раствор едкого калия (КОН) — 1 мл; профильтрованный спиртовой раствор метиленовой синьки (0,5 г синьки на 30 мл спирта) — 30 мл.
Окраска осуществляется 1-2 минуты. При этом тело бактерий приобретает бледно-голубой цвет, зерна волютина — синий или cине-черный.
При выполнении микроскопического исследования важно отличить истинные дифтерийные бактерии от дифтериеподобных палочек Гоффмана и бактерий ксерозис.
| Микроскопическая дифференциация дифтерийных бактерий и дифтероидов | ||
| Бактерии | Взаимное расположение особей в препарате | Наличие и количество зерен волютина |
| Дифтерии | Под углом в виде римской цифры V или кисти рук с разведенными пальцами | 2 зерна с полярной локализацией |
| Бактерии Гоффмана | Параллельное, в виде часткола | Зерен нет или единичные без типичной локализации |
| Бактерии Keepоза | Хаотичное | Зерен много, распределение беспорядочное |
II. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД
Дифтерийные бактерии требовательны к питательным средам. Для их выделения и накопления используется комплекс специальных элективных и дифференциально-диагностических сред.
СВЕРНУТАЯ СЫВОРОТКА РУ: 3 мл стерилыной сыворотки лошади (быка или человека) вносят в пробирку, укладывают с наклоном в 45-50° в свертывателе Коха, предварительно нагретом до +50 °C. Затем температуру доводят до 80° и прогревают в течение 1 часа. Готовую среду охлаждают, ставят в термостат для проверки стерильности. В случае прорастания среды последнюю повторно прогревают при + 80 °C в течение 2 часов.
На этой среде бактерии дают шероховатые R-формы, напоминающие в комплексе шагреневую кожу.
ТЕЛЛУРИТОВЫЕ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ СРЕДЫ
Дифтерийные бактерии обладают выраженной способностью восстанавливать теллуровокислый калий до металлического теллурита. Для выявления этой способности в среды добавляется дифференцирующий компонент-2% раствор теллурита калия следующего состава: дистиллированная вода-100 мл; теллурит калия (K2FeO4)-2 г. Раствор стерилизуют кипячением 30 минут. Для приготовления сред можно использовать также готовый 2% раствор теллурита калия в 40% глицерине, выпускаемый в ампулах для клинических теллуритовых проб.
СЫВОРОТОЧНО-ТЕЛЛУРИТОВЫИ АГАР: к 80 мл расплавленного и охлажденного до +50 °C 2% МПА добавляют 20 мл лошадиной или 30 мл бычьей сыворотки и 1 мл 2% раствора теллурита калия. Готовую среду разливают в стерильные чашки.
КРОВЯНО-ТЕЛЛУРИТОВЫЙ АГАР: к 100 мл расплавленного и охлажденного до +50 °C 2-3% МПА добавляют 5-10% дефибринированной крови человека (донорской, плацентарной) или животного (крупного рогатого окота, кролика, барана, морской свинки) и 1 мл 2% теллурита калия, смешивают и разливают в чашки.
СРЕДА КЛАУБЕРГА: 100 мл 3% МПА расплавляют, добавляют 3 мл 2% теллурита калия, 10 мл глицериновой смеси и 50 мл лаковой крови. Последнюю готовят следующим образом: к 34 мл дистиллированной стерильной воды добавляют 16 мл дефибринированной крови (любой). Состав глицериновой смеси: к 40 мл дефибринироваиной крови крупного рогатого скота или человека добавляют 20 мл химически чистого стерильного глицерина и выдерживают до употребления в холодильнике 3-6 недель.
По характеру роста на теллуритовых средах удается отдифференцировать дифтерийные бактерии как внутри вида, так и от других микроорганизмов.
| Дифференциация дифтерийных палочек от других микробов на теллуритовых и хинозольной средах | ||
| Бактерии | Характер роста на средах | |
| теллуритовых | хинозольной | |
| Дифтерийные бактерии | серые, розеткообразные | синие |
| тип гравис | с радиальностью | |
| тип митис | черные, матовые, гладкие | |
| тип интермедиус | серо-черные, гладкие | |
| Ложнодифтерийные бактерии Гофмана | серые, блестящие, выпуклые, конусовидные | голубоватые |
| Дифтериоиды Ксероза | серо-черные, как истинные дифтерийные | бесцветные |
| Стафилококки | черные, влажные, блестящие | — |
ХИНОЗОЛЬНУЮ СРЕДУ БУЧИНА готовят по следующей прописи: на 100 мл воды добавляют 3 г хлористого натрия, 1,5 г, глюкозы, 1 мл 3% раствора цистина в 1% растворе соды, 2 мл водного раствора хинозола (1:1000), 0,08 г индикатора водноголубого, 4,0 сухого питательного агара. Смесь растворяют при нагревании. Устанавливают pH = 7,4-7,6. Охлаждают до +50 °C, добавляют 5 мл дефибринированной крови и, соблюдая стерильность, разливают в чашки Петри.
СРЕДА ТИНСДАЛЯ-САДЫКОВОЙ является селективной средой для дифтерийных бактерий. Посторонняя микрофлора на ней не растет или развивается очень скудно. Другим преимуществом среды является то, что она не нуждается в добавлении крови. Ее состав следующий: 100 мл мартеновского или обычного мясопептонного агара, 15-20 мл нормальной лошадиной сыворотки, 12 мл 1% раствора цистина (сначала растворить в 0,1 N р-ре NaOH, потом в воде), 11-12 мл 0,1N HCl (для нейтрализации NaOH); 1,8 мл 2% раствора теллуристого калия и 1,8 мл 2,5% раствора гипосульфита натрия.
Дифтерийные бактерии обладают рядом характерных биохимических признаков. Они хорошо ферментируют глюкозу и крахмал, высвобождают значительные количества активной цистиназы, выявляемой в пробе Пизу. Вместе с тем, названные микроорганизмы инертны в отношении сахарозы и не имеют фермента уреазы, обнаруживая отрицательную пробу Закса. Очень важным видовым признаком этих микробов является токсигенность. С эпидемиологической точки зрения, весьма существенное значение имеет серологическая неоднородность дифтерийных бактерий и наиболее широкое участие в распространении инфекции I и VI серологических типов. Это необходимо учитывать при диагностике дифтерии.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ УГЛЕВОДОЛИТИЧЕСКОИ АКТИВНОСТИ дифтерийных бактерий производится на комплексе углеводных сред, состоящих из 1% пептонной воды с pH-7,6, в которую добавляют различные углеводы: 0,5% сахарозы, 0,5% глюкозы, 0,2% крахмала. В качестве индикатора используется реактив Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью).
Среды разливают по 2 мл и стерилизуют текучим паром 3 дня подряд :по 30 минут. До работы они бесцветны, при ферментации углеводов — краснеют.
На углеводных сывороточно-водных средах, основа которых состоит из дистиллированной воды (80 мл) и сыворотки (20 мл), углеводолитические свойства культур проявляются плохо и ферментация углеводов идет очень медленно.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
ПРОБА ПИЗУ — ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТА ЦИСТИНАЗЫ
К 90 мл расплавленного 2% МПА с pH -7,6 добавляют 2 мл раствора цистина (1% раствор цистина в 0,1N растворе NaOH). Среду стерилизуют при +112 °C 30 минут. K расплавленной и охлажденной до +50 °C среде добавляют 1 мл 10% уксуснокислого свинца (простерилизованного дважды текучим паром) перемешивают и добавляют 9 мл нормальной лошадиной сыворотки. Среду стерильно разливают в маленькие пробирки по 2 мл. Посев производится уколом.
Вместо МПА с цистином можно использовать 2% МПА, приготовленный на переваре Хоттингера, с содержанием аминного азота в 250 мг%.
Дифтерийные бактерии активно перерабатывают белки и цистин с высвобождением сероводорода, который, соединяясь с уксусным свинцом, переходит в сернистый свинец коричнево-черного цвета. Дифтероиды подобных изменений не дают.
ПРОБА ЗАКСА — ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТА УРЕAЗЫ
Проба Закса служит для отличия дифтериеподобных бактерий, обладающих уреазной активностью, от истинных дифтерийных палочек, не имеющих этого фермента.
- 1. ВАРИАНТ СРЕДЫ: к 100 мл МПБ или Хоттингеровского бульона добавляют 1 г мочевины и 0,2 мл 1,6% спиртового раствора крезолрот, разливают по 2-3 млв пробирки и стерилизуют текучим паром 10 минут. Результаты учитывают через 20-24 часа после посева. Покраснение среды свидетельствует о наличии уреазы.
- 2. ВАРИАНТ СРЕДЫ: готовят два реактива: А и В.
Реактив А: мочевина — 1 г, спирт 96°- 2 мл, дистиллированная вода — 4 мл.
Реактив В: 0,2% раствор фенолрота-1 мл, однозамещенный фосфат калия (КН2Р04)-0,1 г, двузамещенный фосфат калия (К2НРО4)-0,1 г, хлористый натрий — 0,5 г, дистиллированная вода — 100 мл.
Реактив А стерилизуют фильтрованием и хранят при + 4 °C, реактив В — в автоклаве текучим паром.
Перед работой оба реактива смешивают ex tempore из расчета 1 часть раствора А и 19 частей раствора В, смесь разливают по 0,1 мл в узкие пробирки. Испытуемые культуры вносят в количестве 2-6 капель, помещают в термостат на 30 минут. При положительной реакции смесь краснеет.
Дифференциация дифтерийных бактерий и дифтероидов по биохимическим признакам приведена ниже.
В отдельных случаях после определения биохимических свойств дифтерийных бактерий выясняется серотип штамма. Для этой цели используется ориентировочная агглютинация. Последнюю проводят на стекле с чистыми культурами, которые смывают со среды 1 мл солевого раствора и осторожно набирают стерильной пастеровской пипеткой. Агглютинирующие монотииовые сыворотки (I, II, III, IV, VI серотипы) разводят 1:25 солевым раствором с pH-7,6 (к 100 мл дистиллированной воды прибавляют 3,0 NaOH и устанавливают pH-7,6, доливая 5% раствор Na2HPO4). Для контроля испытуемой культуры ставят реакцию с выше указанным солевым раствором без сыворотки.
Положительная реакция характеризуется быстрым появлением хлопьев агглютината (2-3 минуты), особенно заметных при учете реакции над вотеутым зеркалом.
Неиспользованную сыворотку запаивают в ампулу или переливают в стерильную пробирку.
Агглютинирующие сыворотки хранятся в сухом месте при температуре от +4° до +10 °C.
При использовании высушенных сывороток последние перед употреблением растворяют в стерильной дистиллированной воде (1 мл на ампулу). Срок годности сухой сыворотки не ограничен.
УСКОРЕННЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ
ТЕЛЛУРНТОВАЯ ПРОБА — КЛИНИЧЕСКАЯ
Тампоном, смоченным 2% раствором теллуровокислого калия в 40% глицерине (выпускается в ампулах), смазывают пораженные миндалины и слизистую. При наличии дифтерийных бактерий тампон чернеет сразу или после 2-4-часовой инкубации в термостате.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОКСИГЕННОСТИ ДИФТЕРИЙНЫХ БАКТЕРИИ
Определение токсигенности дифтерийных бактерий осуществляется биологическим (в специализированных лабораториях) и диффузионным (на плотных средах) методами.
Рекомендуемая литература:
- Профилактика дифтерии. Методические материалы для практических работников. М., 1961, стр. 37.
- Сборник официальных материалов по лабораторному делу. Книга первая. Медгиз, 1961, стр. 331-337.
- Сборник схем бактериологического исследования при некоторых инфекционных заболеваниях. Методическое пособие для врачей-курсантов заочников, под ред. проф. П. Н. Кашкина, Л., 1965, стр. 17-20.
- Дяченко С. С. Микробиологические методы диагностики инфекционных заболеваний. Киев, 1962, стр. 224,
- Пяткин К. Д., Трофимова Н. Д., Маркова Н. С. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии, 1962, стр. 219.
- Руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных заболеваний, 1964, т. VI, стр. 375.
- Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней под ред. Матвеева К. И. и Соколова М. И. 1964, стр. 422-430.
Источник: Мотавкина Н.С., Пьянова Р.Е. Микробиологическая диагностика некоторых капельных инфекций и токсоплазмоза. Методическая разработка для студентов. ВГМУ, 1973
источник
Исследуют слизь или отделяемое из пораженных органов (нос, глотка, глаз). Материал собирают тампоном. Его делают из плотной, негнущейся проволоки длиной 15 см, которую прокалывают через пробку. На одном конце (его в последующем опускают в сухую, чистую пробирку), накручивают вату; на другом, наружном, проволоку загибают в колечко для удобства держания и предупреждения травм рук персонала.
Тампоны, погруженные в пробирки, завертывают в бумагу (по 10 штук) и стерилизуют сухим жаром. Запас тампонов должен быть в лаборатории, в детских учреждениях постоянно.
Чаще всего материал берут из зева и носа. Больной должен широко открыть рот, его язык фиксируют шпателем и стерильным тампоном снимают налет или слизь на границе пораженного участка. По возможности – посев проводить тотчас. Для пересылки в лабораторию следует оберегать тампон от высыхания (пред тем, как брать материал, тампон нужно смочить в стерильном 5 % растворе глицерина или в физиологическом растворе).
Приложение 5
Микробиологическое исследование при дифтерии
| Бактериоскопический метод Мазок, окраска по методу Грамма, Нейссера, Леффлера, РФ (люминесцентная микроскопия) | Бактериологический метод Посевы на: — кровяной агар, — свернутую сыворотку, -среду Клауберга (накопление изолированных колоний) — среду Бучина Изучение изолированных колоний: -характер колонии, наличие гемолиза, -мазки из колоний (окраска по Граму, Нейссеру), — посев на пестрый ряд, -определение протеолитической активности, — проба Пизу на цистиназу, — проба Закса на уреазу, — определение токсигенности (РП в агаре, ИФА, ПЦР – обнаружение tox гена) — реакция агглютинации с типовыми АТ на стекле. Учет результатов. Идентификация вида. Диагноз. |
Приложение 6
Дифференцирующие пробы
Проба Пизу для определения цистиназы
В столбик МПА с цистином уколом засевают изучаемую культуру. Пробирку ставят в термостат при + 370 С. Через 20 – 24 часа по ходу укола среда чернеет и на глубине 1 – 1,5 см от поверхности в среде появляется коричневое облачко (дифтерийные бактерии, расщепляя с помощью цистиназы цистеин, восстанавливают ацетат свинца, добавленный в среду, в сульфит свинца черного цвета).
Дифтероиды никогда не образуют «облачка», хотя могут обусловить (+) слабое почернение среды по ходу укола.
Проба Закса для выявления фермента уреазы.
— Готовят спиртовой раствор мочевины и индикатор феноловый красный.
Их смешивают перед употреблением и вносят в среду в соотношении 1 : 9;
— 1 петлю чистой культуры вносят в среду и тщательно растирают по стенке пробирки;
— После 20 – 30 минут инкубации при + 37 0 С наблюдают за изменением цвета среды.
Дифтерийные бактерии не изменяют цвета среды, не расщепляют мочевину, т.к. фермента уреазы не имеют.
Дифтероиды с помощью уреазы расщепляют мочевину с образованием аммиака, который щелочит среду и изменяет цвет среды (красный – за счет индикатора – фенолового красного.
Приложение 7
Биохимические свойства дифтерийной палочки и сходных с ней коринебактерий
Приложение 8
Схема лабораторной диагностики коклюша
(материал – слизь из верхних дыхательных путей)
Дата добавления: 2018-05-02 ; просмотров: 117 ; ЗАКАЗАТЬ РАБОТУ
источник
Дифтерия — острое инфекционное заболевание, вызываемое дифтерийной палочкой (Corynebacterium diphtheriae), характеризующеесяместным фибринозным поражением слизистых оболочек рото- и носоглотки (diphthera – пленка), а также тяжелой интоксикацией с поражением сердечно-сосудистой, нервной системы и надпочечников. Лабораторная диагностика дифтерии осуществляется в соответствии со схемой 14.
Схема 14.Микробиологическая диагностика дифтерии
Микроскопический метод в настоящее время фактически не применяется из-за его низкой информативности в связи с субъективизмом учета и выполняется только по требованию лечащего врача. Микроскопии подвергают мазки, окрашенные по Граму, метиленовым синим, по Нейссеру (для выявления включений волютина). Дифтерийные палочки (Corynebacteriumdiphtheriae) при окраске по Нейссеру содержат полярно расположенные темно-синие, почти черные, включения волютина и располагаются в виде римских цифр V или Х, тогда как сходные с ними дифтероиды и ложнодифтерийные бактерии (Corynebacteriumpseudodiphtheriae) зерен волютина не имеют и располагаются в виде частокола. Разработан также метод прямого флюорохромирования дифтерийных палочек корифосфином, окрашивающим включения волютина в красно-коричневый цвет, а цитоплазму в зеленый или желтый цвет, что позволяет повысить эффективность бактериоскопического метода.
Бактериологический метод-основной метод диагностики дифтерии. Исследуемый материал засевают на одну из специальных питательных сред для культивирования дифтерийных палочек, наиболее часто на среду Клауберга (МПА с глицерином, дефибринированной кровью и теллуритом натрия, задерживающим рост сопутствующей непатогенной микрофлоры). На среде Клауберга Corynebacterium diphtheriae образует 2 типа колоний:
а) серовато-черного цвета с радиальной исчерченностью поверхности, напоминающие цветок маргаритки или розетку (биовар gravis);
б) черные, круглые, выпуклые колонии колонии за счет восстановления теллурита (биовар mitis).
В мазке из типичной для дифтерийной палочки колонии обнаруживают грамположительные палочки булавовидной формы, расположенные в виде римских цифр V или Х, содержащие зерна волютина (рис. 16). Оставшуюся часть колонии пересевают на кровяной МПА для выделения чистой культуры.
Рис. 16. Возбудитель дифтерии — Corynebacteriumdiphtheriae. Окраска по Нейссеру. Расположение в виде римских цифр V или Х, включения волютина по полюсам. х900
Идентификацию выделенной культуры проводят с учетом, прежде всего, ключевых свойств (токсигенность, наличие цистиназы). Токсигенность обычно определяют с помощью реакции преципитации в геле («чашечный» метод). Для этого в чашку Петри с питательной средой (МПА, 15—20 % лошадиной сыворотки, 0,3 % мальтозы, 0,03 % цистина) накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой (5000 АЕ/мл), чашку подсушивают 30 минут в термостате, после чего засевают штрихами исследуемые культуры перпендикулярно полоске бумаги. В качестве контроля используют токсигенную культуру. Посевы инкубируют в термостате при 37 0 С в течение 18-20 часов. При наличии токсигенности в местах соединения токсина с антитоксическими антителами в питательной среде образуются белые линии преципитата, напоминающие усики. Для определения токсигенности дифтерийных бактерий также разработаны ИФА и ПЦР.
Цистиназу у выделенных культур (проба Пизу) определяют путем посева методом укола петли исследуемой культуры на цистиновый МПА с азотнокислым свинцом. Посевы помещают на сутки в термостат при 37 0 С. При наличии цистиназы в среде образуется почернение (образование сульфида свинца) по ходу укола, вокруг которого появляется коричневое облачко.
Выделенную культуру идентифицируют и дифференцируют от сходных с ней непатогенных коринебактерий по биологическим свойствам (табл. 16). Для определения уреазы петлю исследуемой культуры вносят в пробирку, содержащую спиртовый раствор мочевины и индикатор феноловый красный. Пробирку выдерживают 30 минут в термостате при 37 0 С, при наличии уреазы содержимое пробирки окрашивается в красный цвет.
При выделении нетоксигенной культуры ставят реакцию агглютинации с противодифтерийной сывороткой для выявления видового антигена Corynebacterium diphtheriae.
Серологический метод –РА, РНГА с целью определения антител в парных сыворотках крови больных дифтерией.
Таблица 16.Биологические свойства коринебактерий
| Вид | Волютин | Гемолиз | ферментация | токсин | цистиназа | уреаза | РА с ПДС | ||
| сахарозы | глюкозы | крахмала | |||||||
| C. diphtheriae биовар биовар | + + | — + | — | + + | + — | ± ± | + + | — — | + + |
| C.xerosis | ± | — | + | + | — | — | — | — | — |
| C. pseudodiphtheriae | ± | — | — | — | — | — | — | + | — |
Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:
Лучшие изречения: На стипендию можно купить что-нибудь, но не больше. 8740 — 
| 7143 — 
или читать все.
195.133.146.119 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.
Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно
источник
Дифтерийная палочка – возбудители дифтерии.
Дифтерия – острое инфекционное заболевание, характеризующееся токсическим поражением сердечно-сосудистой и нервной систем, а также специфическим фибринозным (дифтеритическим) воспалением в месте входных ворот.
Возбудитель был открыт в 1883 г. Клебсом, в 1884 г. Ф. Леффлер выделил его в чистой культуре. В 1888 г. Ру и Йерсен получили дифтерийный токсин, а в 1895 г. Беринг и Ру независимо друг от друга получили противодифтерийную сыворотку. В 1923 г. Рамон разработали технологию получения дифтерийного анатоксина, а позднее получил противодифтерийную сыворотку. Н.Г. Габричевский применил противодифтерийную сыворотку с лечебной целью и организовал ее производство в России.
В род Corynebacterium входят около 60 видов. Согласно Международной классификации Берджи этот род разделен на 3 секции:
1) патогенные для человека и животных;
2) патогенные для растений;
Прямые или слегка изогнутые палочки размером 0,3 — 0,6 х 4 — 8 мкм, спор не образуют, имеют микрокапсулу, неподвижны.
Особенностями дифтерийной палочки является наличие булавовидных утолщениях на концах; палочки отличаются также полиморфизмом; характерно взаимного расположения бактерий в мазках – в виде цифр V,X, L (не полное расхождение при делении);
В толстых мазках располагаются в виде «пучка булавок». Булавовидные утолщения на концах связаны с наличием зерен волютина (тельца Бабеша-Эрнста) – производные нуклеиновых кислот, метахроматиновые гранулы полиметафосфата. Бактерии могут образовывать фильтрующиеся и L-формы.
Грамположительные микроорганизмы. При окраске по методу Нейссера тело клетки окрашивается в синий цвет, а зерна волютина — в желтый. Метод Леффлера окрашивает цитоплазму в голубой цвет, а зерна волютина – в темно-синий.
Культуральные свойства.
Возбудители дифтерии — факультативные анаэробы, отимальная температура их культивирования 37 о С, рН 7,3-8,0. Требовательны к питательной среде, для роста необходимо наличие цистина, гистидина, фенилаланина, метионина и т.д. Факторами роста являются Са 2+ , Mg 2+ , Fe 2+ , Zn 2+ , Mn 2+ , Cu 2+ . Для культивирования применяют сывороточные (среда Леффлера), среды с добавлением крови, хинозальную среду Бучина. Дифференциально-диагностические среды: теллуритовая среда (Конради, Трох, 1913г.), глицериновокровяная среда с теллуритом (среда Клауберг ΙΙ), сывороточно-теллуритовый агар с цистином (Тиндаль), теллурит-шоколадный агар Маклеода.
На среде Леффлера бактерии растут в виде серовато-кремовых колоний, по типу «шагреневой кожи».
На теллуритовых средах возбудитель образует серовато-черные колонии, что обусловлено восстановлением теллурита до металлического теллура, имеющего черный цвет и аккумулирующегося бактериями.
Биохимическая активность.
Дифтерийные палочки малоактивны, сбраживают с образованием кислоты глюкозу, мальтозу, галактозу, декстрин, не разлагают сахарозу, лактозу, маннит, восстанавливают нитраты в нитриты. Не гидролизуют мочевину (проба Закса отрицательная), не образуют индол. Разлагают цистеин (проба Пизу положительная).
По культуральным, биохимическим, патогенетическим и некоторым другим свойствам дифтерийные палочки разделяются на 3 биовара.
1) биовар митис, характеризуется свойствами:
- ферментирует глюкозу, крахмал, мальтозу, не сбраживает сахарозу, гликоген, декстрин;
- обладает цистиназной активностью;
- восстанавливает нитраты;
- уреазная проба отрицательная;
- на средах с теллуритом образует мелкие гладкие блестящие черные колонии с ровным краем;
- на жидкой среде дает равномерное помутнение и порошкообразный осадок;
- дает зоны гемолиза на кровяных средах;
- малотоксичен;
- возбудители вызывают легкую спорадическую заболеваемость.
2) биовар гравис, характеризуется свойствами:
- ферментирует глюкозу, крахмал,декстрин, мальтозу,
- обладает цистиназной активностью;
- восстанавливает нитраты;
- уреазная проба отрицательная;
- на средах с теллуритом формирует крупные, сухие, матовые, плоские, серо-черные колонии, приподнятые в центре, с радиальной исчерченностью и неровным краем (напоминают маргаритку);
- на жидкой среде образуется пленка, помутнение, крошковидный или крупнозернистый осадок;
- дает гемолиз на кровяных средах;
· обладает выраженными токсигенными свойствами;
· выделяется от больных с тяжелой формой дифтерии, вызывает групповые вспышки.
3) биовар интермедиус, характеризуется свойствами:
· на средах с теллуритом образует мелкие сухие матовые серо-черные колонии с прозрачной периферией и неровным краем;
· на жидкой среде дает помутнение с последующим просветлением и образованием мелкозернистого осадка;
· гемолиз на кровяных средах отсутствует.
Антигенная структура.
Дифтерийная палочка имеет 2 антигена
1. О – антиген (групповой), полисахарид клеточной стенки, термостабильный, дает перекрестные реакции с микобактериями и нокардиями;
2. К – антиген (типовой), капсульный, термолабильный, иммуногенный, видоспецифичный.
На практике серотипирование не применяется, однако выпускаются диагностические сыворотки для РА, РПГА.
Для идентификации используют фаготипирование (22 фага) и бактериоцинотипирование (25 бактериоцинов).
Факторы патогенности.
Токсины. Палочка выделяет токсин – дифтерийный экзотоксин. По силе он занимает 3-е место после ботулинического и столбнячного. Термолабильный, высокотоксичный, иммуногенный, протективный, обладает анестезирующим действием. Гистотоксин обладает дермонекротическими, гемолитическими свойствами. Синтезируется в виде неактивного предшественника — единой полипептидной цепи с молекулярной массой 61 кД. Активируется под действием собственной протеазы, которая разрезает полипептид на 2 связанные между собой дисульфидными связями пептида: А (21 кД) и В (39 кД). Пептид В выполняет акцепторную функцию – распознает рецептор, связывается с ним, формирует внутримембранный канал, через который проникает в клетку пептид А. Пептид А – это фермент, который обеспечивает перенос аденозиндифосфатрибозы из НАД на один из аминокислотных остатков (гистидина) белкового фактора элонгации EF-2. В результате модификации EF-2 утрачивает свою активность, что приводит к подавлению синтеза белка рибосомами на стадии транслокации. Токсин синтезируют только С. diphtheriae, лизогенные умеренным конвертирующим tox-профагом, интегрирующимся с помощью сайт-специфической рекомбинации. Оперон, кодирующий синтез токсина имеет промотор tox Р и 3 участка: tox S, tox А, tox В. Тox S – обеспечивает выход токсина через мембрану в периплазматическое пространство бактериальной клетки. Утрата клеткой профага или мутации в tox-опероне делают клетку малотоксичной.
Ферменты патогенности: гиалуронидаза, нейраминидаза, фибринолизин, каталаза – факторы инвазии, лейкоцидин – обеспечивает устойчивость к фагоцитозу;
Структурные и химические компоненты клетки – пили (способствуют адгезии на чувствительных клетках), микрокапсула (обеспечивает устойчивость к фагоцитозу), корд-фактор (6-6-дифосфоэфир трегалозы, коринемиколовая и коринемиколиновая кислоты, обладающие нарушает фосфорилирование в митохондриях), бактериоцины (корицины) кодирование синтеза которых передается плазмидами.
Резистентность.
При нагревании до 60 о С палочки погибают за 10 мин, при 100 о С наступает мгновенная гибель. 5% раствор карболовой кислоты обеспечивает инактивацию через – 1 мин. Под действием прямого солнечного света палочка выживает несколько часов, в высохших пленках и кале – 3-4 мес., на предметах обихода и одежде сохраняется до 15 дней, на мягких игрушках – 3 мес., в воде и молоке – до 20 дней, в пыли – до 5 мес. Дифтерийные палочки чувствительны к пенициллину, тетрациклину, эритромицину.
Эпидемиология.
Источник инфекции – больной человек, носитель или реконвалесцент.
Механизмы передачи инфекции:
– аэрогенный (пути — воздушно-капельный и воздушно-пылевой);
– контактный (путь — непрямой контактный).
Больной опасен (в смысле заражения) с последних дней инкубационного периода.
Входные ворота – слизистые оболочки носа, зева, гортани, трахеи, бронхов, конъюнктивы глаз, наружных половых органов; раневая поверхность, пупочная рана.
Инкубационный период – 2-14-20 дней.
Возбудители адсорбируются на чувствительных клетках, колонизируют эпителий. Секретируют гистотоксин, который инициирует развитие местного фибринозного воспаления, некроз эпителия, паретическое расширение сосудов с нарушением их проницаемости, отек тканей и выход фибриногена из сосудов. Фибриноген под влиянием тканевого тромбопластина, некротизированных тканей и атмосферным кислородом свертывается. На поверхности образуется фибринозная пленка. На многослойном плоском эпителии — плотная, спаянная с прилежащими тканями; на однослойном – тонкая, легко снимается. Разрастание пленок в воздухоносных путях может привести к асфиксии (истинный круп). Процесс сопровождают регионарные лимфадениты. Системное действие токсина приводит к гемодинамическим нарушениям. Развивается токсический миокардит и ранний паралич сердца. Возможно поражение канальцевого аппарата почек, некроз коркового слоя. В нервной системе – цитолиз нервных клеток с развитием поздних параличей мягкого неба, диафрагмы, сердца, блуждающего нерва. Смерть при дифтерии может наступить от раннего или позднего паралича сердца и диафрагмы, а также в результате истинного крупа (закупорки дыхательных путей оторвавшимися пленками).
У детей грудного возраста чаще развивается дифтерия зева (насмокр, слабая выраженность общих проявлений). Необходимо осматривать пупочную ранку для исключения местного процесса.
После перенесенного заболевания развивается стойкий напряженный антитоксический и мало выраженный антимикробный иммунитет. Возможно развитие носительства (10%) и повторное заражение (6-8%). Уровень иммунитета можно установить в РПГА. Диагностические – титры — 1:200 и выше. С той же целью применяется реакция Шика – внутрикожное введение микродоз дифтерийного токсина (1/40 Dlm 0,2 мл) внутрикожно. Через 48 ч появляется покраснение и инфильтрат, что свидетельствует об отсутствии антитоксических антител; при их наличии реакция не возникает. Из-за опасности сенсибилизации организма эту пробу проводят редко.
Микробиологическая диагностика.
Исследуемый материал – слизь из зева, носа, пленки с миндалин, раневое отделяемое, кровь
1. Бактериоскопический метод – микроскопия мазков из исследуемого материала (окраска по Граму, Нейссеру, Леффлеру).
2. Бактериологический метод – выделение чистой культуры возбудителя и ее идентификация. Необходимо не только выделить из исследуемого материала дифтерийную палочку, но и определить ее токсигенность.
Определение токсигенности С. dphtheriae:
а) биологическая проба на животных – внутрикожное заражение морских свинок фильтратом культуры дифтерийных бактерий – вызывает некроз в месте введения. Минимальная смертельная доза (20-30 нг) убивает морскую свинку на 4-5 день;
б) заражение куриных эмбрионов (наблюдается гибель под действием токсина);
в) внесение в культуру клеток ( выявление ЦПД);
г) метод твердофазного ИФА с меченными пероксидазой антителами;
д) использование ДНК-зонда для обнаружения tox-оперона в геноме;
е) тест Илека и Оухтерлони (1948 г.) – основу составляет способность токсина и антитоксина диффундировать в агар и образовывать преципитаты (усы, стрелы) по ходу диффузии – метод двойной преципитации в геле, предварительный ответ может быть выдан через 48 часов, через 72 часа – заключение о наличии токсигенных коринебактерий, через 96 часов – окончательный ответ.
3. Серодиагностика – РПГА, ИФА, РИА, реакция ко-агглютинации, реакция Шика.
4. Экспресс – диагностика – РИФ, ИФА, РПГА, реакция ко-агглютинации.
5. Биохимический и молекулярно-биологический метод – ПЦР (обнаружение tox-гена).
источник
| Материал | Метод исследования | Результаты |
| Слизь из зева и носа, пленки, налеты с миндалин | Бактериоскопический. Материал берут двумя стерильными ватными тампонами, один используют для приготовления микропрепарата, другой для посева. Мазки окрашивают по Нейсеру и метиленовым синим. Метод имеет ориентировочное зна-чение. Бактериологический. Материал засевают на одну из из элективных сред: сывороточную Клауберга II хинозоловую. На этих средах задерживается рост кокков и др. микрофлоры зева. На второй день из подозрительных колоний делают мазки, окрашивают по Нейссеру и отсевают на скошенный сывороточный агар для выделения чистой культуры. На третий день проводят идентификацию чистой культуры по следующим тестам: 1. Определение токсигенности методом диффузной преципитации в агаре; 2. Определение фермента цистиназы (проба Пизу); 3. Определение уреазной активности – посев в среду с мочевиной и индикатором крезолрот (проба Закса). На этом этапе дают положительный ответ, но исследование продолжают. 4. Посев на углеводы: глюкозу, мальтозу, крахмал, гликоген. Выдача окончательного ответа. | Коринебактерии дифтерии располагаются под углом друг к другу в виде буквы «V» зерна волютина находятся по полюсам палочек. При окраске по Нейссеру тело палочки окрашивается в желтый цвет, а зерна волютина в черный цвет. Дифтероиды не имеют зерен волютина, а сами палочки расположены параллельно. На свернутой сыворотке мелкие круглые колонии кремового цвета с уплотнением в центре. На среде Клауберга тип gravis образует крупные с радиальной исчерченностью серого цвета колонии; тип – mitis круглые, выпуклые колонии черного цвета. Исследуемая культура образует линии преципитации в агаре. Расщепляет цистин – по ходу укола почернение среды. Не образует уреазу – среда не изменяет цвет. Дифтероиды выделяют уреазу, среда с мочевиной окрашивается в розовый цвет. Тип gravis расщепляет глюкозу, мальтозу, крахмал и гликоген до кислоты, тип mitis полисахариды не ферментирует. |
Определение токсикогенности дифтерийных коринебактерий
Токсигенность определяют методом диффузной преципитации в агаре по Оухтерлони. Для этого на чашку с сывороточным агаром накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную дифтерийной антитоксической сывороткой. Рядом с полоской бумаги засевают выделенную культуру в виде «бляшек». Если культура токсигенна, то через 24-48 часов диффундирующий в питательную среду токсин и антитоксическая сыворотка образуют линии преципитации белого цвета.
Ускоренные методы микробиологической диагностики дифтерии
В качестве ускоренного метода диагностики применяется реакция иммунофлюоресценции (РИФ).
Препараты для специфической профилактики и терапии
Плановая профилактика проводится дифтерийным анатоксином, который входит в состав вакцины АКДС.
Для экстренной профилактики и лечения используют противодифтерийную антитоксическую сыворотку.
Антибиотики: эритромицин, олеандомицин, тетрациклин.
Вопросы для обсуждения
1. Общая характеристика и классификация коринебактерий.
2. Источник заражения, пути передачи инфекции, патогенез заболевания.
3. Материал для исследования, методы лабораторной диагностики.
4. Бактериологический метод исследования дифтерии.
5. Характеристика экзотоксина и метод определения токсикогенности дифтерийной палочки.
6. Специфическая профилактика и терапия дифтерии.
Самостоятельная работа студентов
1. Микроскопия демонстрационного препарата дифтерийной палочки в чистой культуре, окрашенного по Нейссеру.
2. Окраска готовых микропрепаратов уксуснокислым метилвиолетом, микроскопия.
3. Изучение бактериологического метода исследования при дифтерии с последующей идентификацией возбудителя:
а) характер роста на сывороточных и теллуритовых средах;
б) определение токсигенности методом диффузной преципитации в агаре по Оухтерлони;
в) реакции на цистиназу (проба Пизу);
г) реакция на уреазу (проба Закса);
д) ферментация моно- и полисахаридов.
4. Изучение препаратов, применяющихся для диагностики, специфической профилактики и лечения дифтерии.
5. Выполненную работу оформить протоколом по следующей схеме, отметить полученные результаты.
Протокол бактериологического исследования материала при дифтерии
| Дата | Ход исследования | Результаты |
| 1 день | 1. Посев пленок из зева на сывороточный агар, среду Клауберга, хинозоловый агар. | |
| 2 день | 2. Изучение подозрительных на дифтерию колоний. 3. Пресев на сывороточный скошенный агар для выделения чистой культуры. | |
| 3 день | 4. Изучение и идентификация чистой культуры: а) мазок, окраска по Нейссеру; б) изучение токсикогенности; в) изучение цистиназы; г) посев в столбики с глюкозой, мальтозой, сахарозой, крахмалом, гликогеном. | |
| Вывод: |
Зарисовать микропрепарат дифтерийной палочки, окрашенной по Нейссеру и уксуснокислым метилвиолетом. Зарисовать на чашке Петри с методом определения токсигенности дифтерийной палочки.
Туберкулез — инфекционное заболевание человека и животных с наклонностью к хроническому течению, характеризующееся образованием специфических воспалительных изменений (бугорков) с преимущественной локализацией в легких.
Цель занятия: овладеть навыком оценки микробиологической диагностики туберкулеза.
— лабораторную диагностику заболевания.
— интерпретировать результаты лабораторных исследований;
— подобрать препараты для специфической профилактики и терапии туберкулеза.
источник
Для диагностики дифтерии разработаны различные методы: бактериологический, биологический, иммунохимический (РПГА, ИФА, РКоА, РЛА), также проводятся молекулярно-биологические исследования (ПЦР, риботипирование, энзимотипирование, секвенирование ДНК).
Крайне важны правильное взятие и своевременная доставка материала, а также четкий учет результатов.
Современная лабораторная диагностика дифтерийной инфекции имеет большое значение для установления диагноза, принятия решения о проведении специфической терапии, оценки и прогнозирования эпидемиологической ситуации.
Бактериологический или культуральный метод является основным и используется с диагностической, профилактической и эпидемиологической целями.
Проведение бактериологического исследования на обнаружение возбудителя дифтерии регламентировано и осуществляется в соответствии с методическими указаниями «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции».
Результаты бактериологического исследования в значительной степени зависят от своевременного и правильного забора материала, качества питательных сред, четкого и профессионального выполнения.
С диагностической целью в стационаре обследуют больных с острыми воспалительными заболеваниями в ротоглотке и дыхательных путях при подозрении на дифтерию ежедневно в течение 3 дней; при амбулаторном обследовании — больных ангинами, имеющих патологические выпоты на миндалинах, больных с подозрением на паратонзиллит, заглоточный абсцесс, стенозирующий ларинготрахеит, инфекционный мононуклеоз. Материал берут однократно.
По эпидемиологическим показаниям обследуются лица, бывшие в контакте с источником инфекции. Забор материала у них проводится однократно.
С профилактической целью обследуют лиц, поступающих в детские дома, специальные учреждения для детей с поражением ЦНС, санатории для детей с туберкулезной интоксикацией, в психоневрологические стационары — однократно.
Бактериологическое обследование бактерионосителей токсигенных штаммов С. diphtheriae проводят двукратно.
В период реконвалесценции после завершения антибактериальной терапии обследование проводят через 3 дня после окончания лечения, дважды с интервалом в одни сутки.
Материалом для исследования служат слизь, отделяемое и пленки из ротоглотки и носа. При наличии налета взятие материал производится с границы пораженной и здоровой ткани.
При подозрении на экстрабуккальные формы дифтерии проводят забор из очагов поражения (глаз, ухо, кожа, влагалище и др.), также следует брать материал из носа и зева. От больных материал должен быть взят в течение 3-4 ч (не позднее 12 ч) с момента поступления в стационар до назначения антибактериальной терапии.
При обследовании здоровых лиц на дифтерийное бактерионосительство исследуют слизь из зева (миндалины, дужки) и носа (нижние носовые ходы).
Для взятия проб используют стерильные ватные сухие тампоны. Исследуемый материал из каждого локуса забирают отдельным тампоном. Фибринозную пленку можно снять пинцетом.
Доставка материал в лабораторию осуществляется в течение 3 часов, в холодное время года, предохраняя от охлаждения.
При проведении обследования контингентов в отдаленных от бактериологических лабораторий районах, когда посев не может быть проведен в течение 3 ч, материал засевают у постели больного на транспортную полужидкую среду с теллуритом калия.
При использовании транспортной среды тампоны с материалом погружают в среду. Допускается инкубация посевов на транспортной среде до 18-20 ч, после чего делают высев на плотные питательные среды.
Культивирование материала на тампоне в транспортной среде, используемой в качестве среды обогащения, позволяет повысить показатель высеваеваемости коринебактерий дифтерии и применять иммунохимические методы для выявления токсина, использование которых сокращает сроки выдачи предварительного ответа.
С другой стороны, культивирование исследуемого материала на транспортной среде свыше 8 ч может способствовать размножению не только коринебактерий, но и сопутствующей микрофлоры, в частности S. aureus и S. epidermidis, соответственно более 90 и 10 % штаммов которых обладают теллуритредуктазой.
Для выделения возбудителя дифтерии проводят прямой посев материала, взятого сухим ватным тампоном или тампоном после культивирования в транспортной среде, на одну из элективноселективных сред для коринебактерий дифтерии.
В настоящее время предпочтение отдается кровяным теллуритовым средам. Все среды, используемые для первичного посева и последующей дифференциации выделенной культуры, подлежат предварительному контролю.
Через 24 часа инкубации на кровяных теллуритовых средах формируются колонии, окрашенные в черный или темно-серый цвет. Замедленное формирование подозрительных колоний (через 48 ч) в основном выявляется при исследовании материала, взятого у бактерионосителей.
Признаки, характерные для колоний биоваров gravis, mitis и intermedius, проявляются через 48 ч. Просмотр колоний осуществляют с помощью микроскопа бинокулярного стереоскопического (МБС).
В случае обнаружения подозрительных на коринебактерии дифтерии колоний их сразу же исследуют на токсигенные свойства. Необходимо изучать токсигенные свойства у нескольких колоний, т. к. из исследуемого материала могут быть выделены одновременно токсигенные и нетоксигенные клоны клеток коринебактерий дифтерии.
Для определения токсигенности используют тест Элека (традиционный или модификационный), основанный на методе встречной иммунодиффузии токсина и антитоксических антител (антитоксина) в специальных питательных средах (среда для определения токсина дифтерийного микроба или коринетоксагар) и являющийся одним из вариантов постановки реакции преципитации в геле.
При постановке теста Элека делают посев по 1\2 каждой из 2 изолированных колоний на среду для определения токсигенности и необожженной петлей — уколом в столбик среды Пизу; другую половину колонии отсевают в пробирку со скошенным 10% сывороточным агаром, из оставшихся нескольких 5-7 колоний формируют бляшки.
В случае множественного роста подозрительных колоний проводят определение уреазной активности в пробе Заксе. При обнаружении только одной колонии ее засевают на среду для определения токсигенности и, не обжигая петлю, в среду Пизу для определения цистиназы.
После учета результатов для дальнейшей идентификации используют культуру со среды Пизу или из бляшки.
У выросшей на сывороточном агаре культуры изучают морфологию, используя метод окраски по Леффлеру, биохимические свойства (глюкоза, сахароза, мальтоза, крахмал, декстрин), определяют уреазную активность.
При необходимости идентифицировать С. ulcerans используют тесты на уреазу и восстановление нитратов в нитриты.
Определение токсина является основным дифференциально-диагностическим тестом при бактериологическом исследовании на дифтерию.
Клиническое и эпидемиологическое значение токсигенных и нетоксигенных штаммов различно, поэтому чрезвычайно важно как можно быстрее получить точные данные о токсигенности штаммов, чтобы подтвердить диагноз дифтерии и воспрепятствовать распространению инфекции путем выявления бактерионосителей среди контактных лиц.
Критерием оценки специфичности преципитатов служит время появления и расположение линий преципитации испытуемого штамма по отношению к линиям преципитации контрольного токсигенного штамма. Специфические линии преципитации появляются через 24-48 ч, сливаются или направлены на слияние с линиями контрольного штамма.
Метод преципитации является высокоспецифичным, но его чувствительность составляет 0,5-1,0 мкг/мл по белку антигена. В связи с этим у штаммов коринебактерий дифтерии с низким уровнем продукции токсина специфические линии преципитации могут формироваться гораздо позже.
В практических лабораториях возможна гиподиагностика при определении токсигенности дифтерийных бактерий, что в основном обусловлено нестандартными питательными средами, повышенным содержанием железа в сыворотке, добавляемой в среду, недостаточными посевными дозами и малым содержанием антитоксина на бумажных носителях, а также другими отклонениями от методики постановки теста.
Одной из причин гиподиагностики при определении токсина методом иммунодиффузии является повышенное содержание железа в сыворотке лошади или крупного рогатого скота, которая является обязательным компонентом, добавляемым в среду для определения токсина дифтерийного микроба или коринетоксагар.
У токсигенных штаммов С. diphtheriae способность экспрессировать ДТ, а также интенсивность роста и размножения наблюдаются при малых концентрациях железа, что объясняется снижением потребности в источнике железа у токсиген-ных штаммов С. diphtheriae.
Экспрессия структурного tox-гена, носителем которого является профаг, находится под контролем хромосомного регуляторного гена dtxR. Ген dtxR является ответственным за синтез железо-зависимого белка-репрессо-ра dtxR.
В операторе гена tox имеется участок ДНК, с которым взаимодействует белок-репрессор, препятствуя транскрипции tox-мРНК и, следовательно, продукции дифтерийного токсина. При дефиците железа белок-репрессор инактивируется и начинается синтез токсина.
Неспецифические линии преципитации при определении токсина могут быть выявлены в основном при использовании лечебной антитоксической сыворотки или препаратов нестандартного антитоксина, содержащих антитела к клеточным антигенам С. diphtheriae.
Выявление цистиназной активности, способности окислять глюкозу и мальтозу, отношение к крахмалу, декстрину и отсутствие фермента уреазы наряду с характерными морфокультуральными признаками (полиморфизм, метахроматичное окрашивание, формирование колоний черного или серого цвета на кровяных теллуритовых средах) позволяют отнести выделенный микроорганизм к С. diphtheriae и одному из биоваров.
Выделенный в результате бактериологического исследования штамм C.diphtheriae является возбудителем дифтерии, если он обладает токсигенными свойствами.
Бактериологический метод диф-диагностики дифтерии позволяет в случае выделения токсигенного штамма, обладающего цистиназной активностью, дать окончательный документированный ответ через 48-72-96 часов, нетоксигенного штамма — через 72-96 часов.
Использование высококачественных питательных сред для первичного посева, определения токсигенности, биохимических свойств и микроскопа бинокулярного стереоскопического (МБС) для отбора колоний позволяет ускорить проведение бактериологического исследования и, соответственно, сократить сроки выдачи ответа до 48 часов.
Определение токсина у возбудителя дифтерии является основным дифференциальным тестом при диагностике дифтерии.
Для определения токсигенных свойств коринебактерий дифтерии разработаны и могут быть использованы разные методы, которые значительно различаются по специфичности, чувствительности и времени проведения исследования.
Основной метод определения токсина — иммунодиффузия в агаре — является высокоспецифичным, но позволяет выявлять ДТ только у 84,0 и 80,4 % штаммов, выделенных от больных и бактерионосителей соответственно.
Это связано с наличием у положительных в ПЦР и отрицательных в тесте Элека штаммов «молчащего» гена токсигенности. Роль таких штаммов в патологии пока неясна.
Биологические методы определения токсигенности, основанные на использовании 9-дневных куриных эмбрионов, перевиваемых культур клеток, пробах на вирулентность на морских свинках или кроликах, являются высокочувствительными, но трудоемкими и дорогостоящими.
Наиболее надежным тестом для определения токсина in vivo является подкожный тест на вирулентность на морских свинках.
При диагностике дифтерии комплексное микробиологическое исследование с использованием иммунохимических (РЛА, РКоА, РПГА, ИФА) методов позволяет значительно повысить эффективность лабораторной диагностики дифтерийной инфекции, ускорить обнаружение токсина.
Методы не являются обязательными при проведении диагностики дифтерии, но, по сравнению с традиционным (метод Элека), имеют преимущества по чувствительности и времени проведения анализа.
Современные варианты иммунохимического анализа, использование моноклональных антител к эпитопам дифтерийного токсина гарантируют и их высокую специфичность. Результаты, полученные этими методами, позволяют дать только предварительный ответ о наличии токсина.
Реакция пассивной гемагглютинации (РИГА) и иммуноферментный анализ (ИФА) могут быть использованы для выявления слаботоксигенных штаммов C.diphtheriae, определения уровня токсинопродукции, а также с целью сокращения сроков выявления ДТ.
Токсин обнаруживается в РИГА через 18 часов после посева культуры в жидкую питательную среду, содержащую сыворотку и теллурит калия, и через 3 ч при использовании бульона на основе сред 199 или «Игла» с 20 % сыворотки крупного рогатого скота.
Для проведения ИФА можно использовать культуру и непосредственно надосадок среды культивирования исходного клинического материала. Реакции являются высокочувствительными, и при их использовании токсин определяется в 98 % случаев.
Постановка РИГА основана на использовании эритроцитарного дифтерийного диагностикума, сенсибилизированного поликлональными антитоксическими антителами (антитоксином), способными взаимодействовать только с дифтерийным токсином.
При наличии в исследуемом образце токсина образуется специфический комплекс (ДТ—АТ), который выявляется в виде агглю-тината эритроцитов. Для постановки РПГА необходимо использовать стабильные стандартные диагностикумы, чувствительность которых не ниже 0,003 Lf/мл.
Метод позволяет определять относительное содержание токсина, умножая значение чувствительности диагностикума, выраженного в единицах Lf/мл, на обратное значение титра исследуемой пробы.
Для определения дифтерийного токсина методом ИФА разработан твердофазный вариант «сэндвич». В микробиологии тест-системы ИФА пдля диагностики дифтерии используют моноклональные антитоксические противодифтерийные антитела (МкАт) к концевому участку В-фрагмента дифтерийного токсина, адсорбированные на поверхности полистироловых планшет.
Адсорбированные на поверхности полистирола МкАт взаимодействуют с эпитопами В-фрагмента ДТ, если он присутствует в исследуемой пробе. К комплексу МкАт—ДТ добавляют конъюгат (К), представляющий собой поликлональные антитоксические антитела, конъюгированные с ферментом (пероксидаза хрена).
Свободные эпитопы ДТ взаимодействуют с поликлональными антитоксическими антителами, входящими в состав конъюгата, образуется комплекс МкАт—ДТ—К, который обнаруживают, добавляя смесь перекиси водорода с индикатором.
Результаты реакции учитывают визуально или с использованием спектрофотометра. Использование Fab-фрагментов МкАт гарантирует высокую чувствительность тест-системы. Метод позволяет определять токсин в концентрации 0,8-1,5 нг/мл или 0,0002 Lf/мл анатоксина и используется как в варианте «скрининг», так и для количественного определения ДТ.
Разработан метод определения ДТ на мембранах эпителиоцитов слизистой оболочки больных с помощью ИФА. С этой целью используют тест-систему «Дифтерия-монозим», в которую входят моноклональные антитела к СООН-концевой части В-фрагмента молекулы ДТ.
Данный метод позволяет выявить в течение 5-6 ч даже незначительное количество токсина, адсорбированного на мембранах клеток слизистой оболочки больных в 100 % случаев, провести раннюю дифференциальную диагностику дифтерии с клинически схожими заболеваниями.
РЛА и РКоА являются экспресс-методами обнаружения ДТ в культуральной жидкости.
Разработана аналитическая система для реализации экспресс-способа диагностики токсигенных штаммов, в которую входит дифтерийный латексный диагностикум и микроридер со сменными чипами.
Дифтерийный антительный диагностикум получен путем химической сорбции на поверхности полиакриламидных латексных частиц высокоавидных антитоксических антител с индексом авидности не менее 90 %.
Постановку РЛА осуществляют на чипах, результаты фиксируют в заданном или произвольном режиме в памяти компьютера в виде фотоизображений. Разработанный способ обладает высокой эффективностью, количественная оценка чувствительности метода составляет 0,001 Lf/мл.
В настоящее время большинство иммунохимических методов определения дифтерийного токсина могут применяться только в лабораториях научно-исследовательских учреждений, в которых они разработаны, т. к. соответствующих тест-систем производственного выпуска не существует.
Основным показателем напряженности противодифтерийного иммунитета является уровень дифтерийного антитоксина в сыворотке крови.
Для определения уровня антитоксина в сыворотке крови вакцинированных и больных используют иммунологические методы (РПГА, ИФА, методы Ремера и Йенсена, реакция нейтрализации токсина в клеточной культуре Vero).
Реакцию нейтрализации in vivo на морских свинках по Ремеру или на кроликах по Йенсену считают универсальными методами, или «золотым стандартом» определения антитоксических антител в сыворотке крови человека. Результаты реакции нейтрализации по Йенсену в 100 % случаев совпадают с результатами теста Элека.
Иммунологические методы могут быть полезными при необходимости дифференциации стертых и атипичных форм дифтерии и неспецифических ангин с сопутствующим носительством токсигенных штаммов.
Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) отличается высокой специфичностью и чувствительностью и является регламентированным методом для изучения напряженности противодифтерийного иммунитета.
Это двухкомпонентная сложная реакция, при которой противодифтерийные антитела, находящиеся в исследуемой сыворотке, взаимодействуют с дифтерийным анатоксином, который адсорбирован на эритроцитах.
В результате специфического взаимодействия антитоксических антител с анатоксином образуется комплекс, выявляемый в виде агглютината эритроцитов. За условно-защитный титр противодифтерийных антитоксических антител принимается титр 1:20. Существует и мнение, что нет четко определенного «защитного титра» антител, определяемого в этой реакции.
Результат РПГА подтверждается в реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА), реакция оценивается специфичной при снижении титра антител в РТПГА в 4-8 раз и более.
Реакцию нейтрализации (PH) на кроликах по Йенсену проводят с целью количественного определения антитоксина в крови больного. Метод основан на способности ДТ вызывать воспалительную реакцию и некроз при внутрикожном его введении кроликам.
In vitro исследуемую сыворотку смешивают с различными дозами стандартного токсина и затем вводят кроликам. Отсутствие или степень выраженности внутрикожной реакции зависит от количества антитоксина, содержащегося в крови больного.
С помощью метода Йенсена можно дифференцировать стертые и атипичные формы дифтерии от ангины другой этиологии с сопутствующим носительством токсигенных штаммов. Исследование крови проводят в первые 3-5 дней от начала заболевания.
Отсутствие антитоксина или его низкий уровень (менее 0,01 МЕ/мл) является доводом в пользу заболевания. Уровень антитоксина 0,5-1,0 МЕ/мл свидетельствует в пользу бактерионосительства.
Резкий подъем антитоксина у больных может быть обусловлен вторичным иммунным ответом в случае, если больной вакцинирован, что необходимо учитывать при оценке реакции. Определение титра антитоксина с диагностической целью проводят только до введения лечебной сыворотки. Метод Йенсена применяют редко, т. к. он остается трудоемким и дорогостоящим.
Соответственно рекомендациям ВОЗ для определения уровня антитоксина в сыворотке используют и реакцию нейтрализации токсина в культуре клеток Vero (перевиваемая культура клеток почек обезьян).
Дифтерийный токсин подавляет метаболическую активность и рост культуры клеток Vero. Тест основан на нейтрализации цитотоксического действия ДТ антитоксином, который содержится в сыворотке крови.
Реакцию нейтрализации проводят в микропланшете, в лунки которого с последовательно разведенной исследуемой сывороткой крови вносят ДТ в рабочей дозе и культуру клеток Vero, инкубируют в течение 5-6 дней при 37 °С.
Определение титра антител к дифтерийному токсину проводят по выявлению живых клеток культуры Vero или спектрофотометрически по снижению степени окрашиваемости субстрата митохондриальной дегидрогеназой.
При иммунном ответе на дифтерийный токсин или анатоксин в крови обнаруживаются лимфоциты (1,00-5,71 %), специфически связывающие эти антигены. Определение лимфоцитов, специфически связывающих дифтерийный токсин или анатоксин, проводят в реакции смешанного розеткообразования.
С этой целью в качестве контроля используют эритроциты, сенсибилизированные столбнячным анатоксином, что позволяет дифференцировать антигенсвязывающие лимфоциты (АСЛ) дифтерийной специфичности, обусловленной дифтерийной инфекцией или вакцинацией.
Обнаружение АСЛ дифтерийной специфичности и отсутствие АСЛ столбнячной специфичности является основным критерием для постановки диагноза дифтерийной инфекции.
Вакцинация дифтерийным анатоксином практически всегда осуществляется в комплексе со столбнячным, а иммуногенная активность последнего в АКДС и АДС больше, чем дифтерийного, поэтому в случаях, когда выявление АСЛ дифтерийной специфичности обусловлено вакцинацией, всегда будут обнаружены АСЛ и столбнячной специфичности.
В случае дифтерийной инфекции (заболевание или носительство), наоборот, выявляются АСЛ только дифтерийной специфичности.
Метод количественного определения токсина в составе циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) разработан для ранней диагностики дифтерии и иммунологического мониторинга в процессе лечения.
Для постановки метода используют сыворотку крови больного, из которой с помощью полиэтиленгликоля осаждают ЦИК и исследуют в иммуноферментной реакции согласно инструкции по применению «Дифтерия-монозим». ДТ в составе ЦИК обнаруживается в широком диапазоне концентраций: 0,45-22,3 Lf/мл.
Сроки обнаружения ДТ в ЦИК и его уровень имеют корреляцию с длительностью симптомов интоксикации и развитием осложнений дифтерийного процесса, что является важным для прогнозирования тяжести течения дифтерии и оценки эффективности терапевтических мероприятий.
источник