С целью раннего выявления дифтерии и определения носителей дифтерийной палочки необходимы выделение и идентификация возбудителя, а также определение его способности к токсинообразованию. Материалом для исследования служат дифтеритические плёнки, слизь из носоглотки или отделяемое из подозрительных поражений кожных покровов.
Забор материала на дифтерию проводят двумя стерильными тампонами: один используют для посева, с другого делают мазки и окрашивают их по Граму и Найссеру. Взятый материал следует доставлять в лабораторию не позднее чем через 3 ч.
Окраска по Граму не является специфичной, так как дифтерийные палочки сравнительно плохо воспринимают красители, но позволяет косвенно идентифицировать непатогенные коринебактерии, располагающиеся в виде палисада (параллельно) или в виде китайских иероглифов. Окраска по Найссеру позволяет выявить характерные зёрна Бабеша-Эрнста и отличить дифтерийную палочку от ложнодифтерийной палочки С. pseudodiphtheriticum (С. hofmannii), часто обитающей в носоглотке.
Бактерии дифтерии выделяют посевом на элективные среды с теллуритом (например, Клауберга II или Маклёода), ложнодифтерийная палочка (палочка Хофманна) теллур не восстанавливает (см. рис. 8 на вклейке). Для выделения чистой культуры дифтерии часть подозрительной колонии засевают на скошенный агар (или среду Ру), вторую часть — на твёрдую питательную среду для определения токсигенности и (не обжигая петли) проводят определение цистиназной активности (проба Пизу). При положительном результате наблюдают образование коричневого облачка вокруг линии укола. Чистую культуру идентифицируют на средах Хйсса, пользуясь укороченным пёстрым рядом (глюкоза, мальтоза, сахароза, мочевина), что позволяет отличить С. diphtheriae от непатоген пых коринебактерии (рис. 14-3).
Для идентификации биоваров дифтерии используют «длинный» ряд углеводов, включающий крахмал и гликоген. Для полной идентификации можно исследовать способность бактерий расти в анаэробных условиях посевом уколом в столбик 0,5% сахарного агара (растёт только С. diphtheriae).
Определение токсигенности дифтерийной палочки in vivo. Проводят подкожным или внутрикожным заражением 0,5-1,0 мл бактериальной культуры морских свинок массой 250 г. За 24 ч до заражения одно животное иммунизируют дифтерийным антитоксином. При положительном результате неиммунизированные животные погибают в течение 3-5 сут.
Определение токсигенности дифтерийной палочки in vitro. Способность к образованию токсина можно определять заражением куриных эмбрионов или культур клеток с регистрацией последующего цитопатнческого эффекта. Можно использовать твердофазный ИФА с использованием антитоксинов, меченных пероксидазой. Также предложены ПЦР и ДНК-зонды для обнаружения гена tox в бактериальной хромосоме. Однако наибольшее распространение получил тест иммунодиффузии Илека. На среду с пониженным содержанием Fe2+ (для более интенсивного токсинообразования) проводят посев исследуемого изолята и эталонных токсигенного и нетокси-генного штаммов параллельными штрихами. На выросшие колонии накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной дифтерийным антитоксином. Образующийся токсин и антитоксин диффундируют в агар и в месте встречи образуют линии преципитации, так называемые «усы» или стрелы. На практике используют модификацию метода. Полоску бумаги, пропитанную антитоксином (500 ME в 1 мл), наносят на чашку, а исследуемые культуры засевают бляшками по обе стороны бумажной полоски. Контролем служит заведомо токсигенная культура, также посеянная «бляшкой». В результате встречной диффузии токсина и антитоксина в месте их контакта выпадает линия преципитации, сливающаяся с линией преципитации токсигенного штамма.
Для дифференциальной диагностики возбудителей используют набор из 9 кори нефагов. С его помощью можно типировать большинство токсигенных и нетоксигенных штаммов биовара gravis.
источник
В основе метода определения токсигенности коринебактерий дифтерии (тест Элека) лежит процесс встречной иммунодиффузии токсина и антитоксических антител в плотной питательной среде. В местах оптимального количественного соотношения между токсином, продуцируемым коринебактериями, и антитоксином, нанесенным на фильтровальную бумагу, происходит их взаимодействие с образованием преципитата в виде белой линии или «усов».
Токсигенность коринебактерий дифтерии определяют, как правило, в чистой культуре (отдельные колонии или культура со скошенного агара, или с пробы Пизу). Смесь колоний или культуры, загрязненные посторонней микрофлорой, также могут быть испытаны на токсигенность. При отсутствии, в этом случае, преципитатов в агаровом геле, опыт следует повторить с выделенными чистыми культурами.
Культуру засевают в виде «бляшек» диаметром 0,6-0,7 см на расстоянии 0,7-0,8 см друг от друга и 0,5 см от края полоски фильтровальной бумаги. На одну чашку следует засевать не более 10 «бляшек». Из них 6 «бляшек» испытуемой культуры, 4-контрольного штамма. При небольшом количестве испытуемого материала засевают 6 контрольных «бляшек» и 4 — испытуемых. Чашки с посевом помещают в термостат при 37 град. C.
Результат учитывают через 18-24 часа и 48 часов роста. Следует иметь в виду, что препарат антитоксической противодифтерийной сыворотки, помимо антител к дифтерийному антитоксину, содержит антитела к антигенам микробной клетки. Поэтому при постановке пробы на токсигенность с использованием данного препарата преципитаты могут образовываться не только в результате связывания токсина с антитоксином (специфические преципитаты), но и при взаимодействии антибактериальных антител с компонентами клетки коринебактерий дифтерии (неспецифические преципитаты). Последние могут формироваться как у токсигенных, в том числе и у контрольного штамма, так и у нетоксигенных коринебактерий дифтерии. Иногда отмечается появление множественных линий преципитации. Неспецифические преципитаты, как правило, слабо выражены, имеют нечеткие контуры, появляются чаще через 48-72 часа, в редких случаях могут появляться и на первые сутки. Критерием оценки специфичности преципитатов является слияние линий преципитации испытуемого штамма со специфическими линиями контрольного токсигенного штамма. В тех случаях, когда у контрольного штамма формируется несколько линий преципитации, специфическими следует считать более четкие и рано появляющиеся преципитаты. Поэтому просмотр чашек с пробой на токсигенность осуществляют через 18-24 часа от момента ее постановки. Если в течение данного времени у контрольного штамма линии преципитации не обнаруживаются, это свидетельствует о нарушении условий постановки реакции.
Варианты оценки результатов реакции:
- 1. Испытуемые культуры коринебактерий дифтерии являются токсигенными, если образуемые ими линии преципитации сливаются или имеют тенденцию к слиянию с соответствующими специфическими линиями контрольного токсигенного штамма.
- 2. Испытуемые культуры коринебактерий дифтерии являются нетоксигенными, если:
- а) линии преципитации, образуемые испытуемой культурой, отсутствуют, при наличии специфических линий преципитации у контрольного штамма;
- б) линии преципитации не могут слиться со специфическими линиями преципитации контрольного штамма, а скрещиваются или имеют тенденцию к скрещиванию с ними (неидентичные, неспецифические линии);
- в) линии преципитации испытуемой культуры сливаются с неспецифическими линиями контрольного штамма;
- г) линии преципитации испытуемой культуры перекрещиваются со специфическими линиями и сливаются с неспецифическими линиями контрольного штамма.
Очищенный ферментолизом и специфической сорбцией антитоксин не содержит антител к компонентам микробной клетки. При использовании этого препарата неспецифические линии преципитации не образуются.
источник
Реакция Райта
Развернутая РА для определении АТ при бруцеллезе
1. Сыворотка, разведенная в физрастворе двукратно (АТ)
2. Единый бруцеллезный диагностикум (АГ) (голубой, единственный подкрашенный)
Механизм: при наличии АТ образуются хлопья агглютинации, оседающие на дно.
Титр АТ – наибольшее разведение, при котором еще есть агглютинация.
Реакция Манчини
Реакция преципитации в геле для определения уровня Ig – метод радиальной иммунодиффузии
Образцы исследуемых сывороток помещают в лунки агарового геля, который содержит АТ против IgG, IgM или IgA в известной концентрации. Диффундирующие в агар Ig образуют кольца преципитации с антиглобулиновыми антителами, размер которых зависит от содержания в сыворотке Ig соответствующего класса. . По разведениям стандартной сыворотки строится калибровочная кривая, по которой определяется уровень Ig в исслед.сыворотке. Уровень сывороточных Ig отражает функциональное состояние B-системы организма.
Постановка ориентировочной РА для определения неизвестного микроба
Компоненты: 1. Взвесь неизвестной культуры в физ.р-ре (АГ в электролите)
2. Диагностические аггл. сыворотки (АТ): н-р, 1) поливалентная эшерихиозная 2) типовые О-26, О-55, О-111.
Механизм: при соответствии антигена антителу – хлопья агглютинации.
Окраска по Граму (чистая культура)
Позволяет выявить особенности строения КС бактерий
Стекло обезжирить мылом. Капля 0,9% NaCl. Культуру бакпетлей в каплю. Сушим. Фиксируем (3 раза провести над пламенем горелки). Генцианвиолет (бумажки по Синеву) смочить водой 1-2 мин. Р-р Люголя – 1-2 мин. Стряхиваем и краситель, и Люголь. Этиловый спирт – 30-60 с, до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя (опустить 3 раза). Промывание водой. Фуксин Пфейффера – 3-5 мин. промыть водой. Грам(+) не обесцвечиваются спиртом и сохраняют окраску певрого красителя (многослойный пептидогликан КС взаимодействует с краской и задерживает её в комплексе с йодом), грам(-) обеспечиваются спиртом и окрашиваются вторым красителем.
Окраска по Гинса-Бури
Позволяет выявить капсулу бактерий (называется негативным, так как капсула не прокрашивается)
В каплю черной туши внести культуру, смешать и 2 стеклом со шлифованным краем приготовить мазок, как из крови. Высушить. Зафиксировать на воздухе. Фуксин Пфейффера – 1-2 мин. Капсула не воспринимает красители, поэтому окрашиваем бактерии и окружающий фон. Фон окрашивается тушью в черный цвет, а возбудитель фуксином в розовый цвет, при этом капсула видна в виде светлого ободка вокруг бактерий.
Окраска по Ожешко
Позволяет окрасить споры бактерий.
На нефиусированный мазок 0,5% HCl – 3 мин с прогреванием (протрава). промывание водой (осторожно). Фиксация в пламени спиртовки. Окраска по Цилю-Нильсену. Спора, как кислотоустойчивая структура красится в красный цвет, а цитоплазма клетки, как кислотонеустойчивая структура – в синий цвет.
Окраска по Цилю-Нильсену
Позволяет определить кислотоустойчивые бактерии.
Карболвый фуксин Циля 3-5 мин. Промывание водой. 5% H2SO4 1-2 мин (для обесцвечивания). промывание водой. Метиленовая синь 3-5 мин. Промывание водой. Кислотоустойчивые бактерии не обесцвечиваются после первого красителя, так как содержат больше липидов, воска, окислителей, поэтому окрашиваются в красный цвет. Кислотонеустойичвые бактерии и структуры обесцвечиваются после первого красителя, поэтому красятся в голубой цвет.
Тельца Бабеша-Негри
Цитоплазматические включения в нейронах (срезы аммонова рога и мозжечка), клетках слюнных желез при бешенстве – индикация вируса. Красные на голубом фоне.
Среда Эндо (диф.-диагн.) (МПА + 1% лактоза + осн.фуксин, обесцвеч. тиосульфитом натрия), Lac(+) – темно-красные колонии с металлич.блеском; для выявления энтеробактерий (сахаролитические свойства).
Среда Левина(диф.-диагн.) (МПА + 1% лактоза + метилен.синь и эозин), Lac (+) – насыщ. синего цвета; для выявления энтеробактерий (сахаролитические свойства).
Среда Плоскирева (диф.-электив.) (МПА + 1% лактоза + нейтр.красный + соли желч.к-т + бриллиант.зелен.) (для шигелл и сальмонелл); Lac (+) – красные.
Среда Раппопорта (желтая) (электив.-диф. для сальмонелл и шигелл) (МПБ + 1% желчь (электив.ф-р) + глю(диф.ф-р) + инд-р Андреде(кислый фуксин + NaOH): S.typhi –до кислоты (красный), S.paratyphi A,B – до кислоты и газа. Разливается в бутылки и колбы, т.к. в начале болезни сальмонеллы находятся в крови. Берут 5 мл крови и разбавляют в 10 раз (до 50 мл).
ЩПВ — щелочно-пептонная вода (селектив) (1% пептонная вода + 0,5% NaCl + KNO3 + Nа2CO3; pH = 9,0). Щелочь – селективный фактер для холерного вибриона.
Сахарный бульон (универсальная) (триптоза + мясной экстракт + глю + NaCl )
КА (диф-диаг) (агар+эритроцитарная масса). Для определения гемолизирующих свойств бактерий. Гемолиз: α – Hb превращается в гемосидерин (зеленый), β – просветы вокруг колоний, γ – отсутствие гемолиза.
ЖСА (элективн)(МПА + желточная взвесь + 10% NaCl). Для выявления фермента патогенности лецитовиттелазы (лецитиназы). (+) помутнение вокруг колоний.
МПБ (универсальная)(мясная вода + пептон + 0,5% NaCl).
Китта-Тароцци (для анаэробов) (сахарный бульон + кусочки паренхиматозных органов (для адсорбции О2) + высокий столбик + слой вазелинового масла (для изоляции от атмосферного воздуха). Перед посевом среду прогревают на кипящей водяной бане в теч 10-15 мин для удаления воздуха
Вильсона-Блера (железосульфитный агар) (3% МПА + 1% глю + 20% сульфит натрия + 8% FeCl3) Разливают высоким столбиком, сверху – вазелиновое масло (для изоляции от атмосферного воздуха). Позволяет выявить сероводородную активность. Анаэробы образуют колонии черного цвета за счет восстановления сульфита натрия, который, соединяясь с FeCl3 дает осадок сульфата железа черного цвета.
Игла –синтетическая (13 АМК, 7 витаминов, на основе сбалансированного солевого раствора Эрла). Питательный раствор для культур клеток, используемых для культивирования вирусов.
199 – синтетическая(20 АМК, 17 витаминов, глюкоза, минеральные соли, пурины и пиримидины – всего 199 компонентов, на основе сбалансированного солевого р-ра Хенкса). Питательный раствор для культур клеток, используемых для культивирования вирусов.
· хроническая гонорея – кровь / серологическое
· острая гонорея — гной / бактериоскопическое, бактериологическое
· дизентерия – испражнения / бактериологическое
· холера – испражнения / бактериологическое
· брюшной тиф – кровь, испражнения / бактериологическое, серологическое
· коклюш – отделения из носоглотки / бактериологическое
· дифтерия – пленки / бактериологическое
· сибирская язва – содержимое карбункулов / бактериологическое
· корь – кровь / серологическое
· полиомиелит – кровь, ликвор / серологическое
Определение токсигенности дифтерийной палочки реакцией преципитации в геле
В чашку Петри с питат.агаром кладут полоску фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой. Засевают исследуемые культуры, в качестве контроля используют заведомо токсигенную культуру. При размножении токисгенной культуры в месте соединения токсина с антитоксином в плотной питательной среде образуется преципитат в виде белых линий – «усов».
Дата добавления: 2017-02-25 ; просмотров: 1601 | Нарушение авторских прав
источник
Одна из разновидностей РП в геле (реакция Оухтерлони) позволяет определять токсигенность дифтерийной палочки с помощью антитоксической сыворотки. В чашку Петри с питательной средой помещают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной антитоксической противодифтерийной сывороткой и засевают исследуемыми культурами в виде штрихов, перпендикулярных к полоске бумаги. Инкубируют при 37 ПС в течение суток. При наличии токсигенной культуры в месте взаимодействия токсина с антитоксином образуются линии преципитации.
.24. Произвести учет развернутой РА в пробирках с культурой кишечной палочки при
диагностике колиэнтеритов.
Для установления серологической группы выделенных культур: а) ставят реакцию агглютинации на стекле с поливалентными ОК-сыворотками; поливалентной ОК-сывороткой в течение, для постановки реакции на стекле с каждой типовой ОК-сывороткой, входившей в состав поливалентной смеси. Контролем реакции служит взвесь микробов в капле изотонического раствора хлорида натрия. Реакция агглютинации на стекле с живой культурой имеет только ориентировочное значение, указывая на наличие в ней соответствующего К-антигена, и не может служить основанием для отнесения выделенного штамма к той или иной О-группе. 3. Для окончательной идентификации культур по О — и К-антигену ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках с той ОК-сывороткой, которая агглютинировала культуру на предметном стекле. Если положительная агглютинация на стекле имела место с несколькими типовыми сыворотками, развернутую агглютинацию ставят со всеми этими сыворотками. Принадлежность культуры к серологическому типу в таком случае определяют по наивысшему титру с той или иной сывороткой. При постановке развернутой реакции агглютинации готовят два ряда разведений типовой агглютинирующей ОК-сыворотки от 1:50 до титра, указанного на этикетке ампулы. Разведенную сыворотку разливают по 0,5— 1 мл. Для определения К-антигенов в каждую пробирку добавляют трехмиллиардную взвесь живой исследуемой куль- туры кишечной палочки. При определении О-антигена пользуются этой же микробной взвесью, но после предварительного кипячения ее в водяной бане в течение часа для инактивации поверхностнооболочечных антигенов и устранения таким образом феномена О-инагглютинабельности.
Последние две пробирки ряда — контрольные: контроль антигена (КА)—? исследуемая культура в изотоническом растворе хлорида натрия и контроль сыворотки (КС) —сыворотка в разведении 1 :50. Штатив с пробирками встряхивают для лучшего перемешивания сыворотки с антигеном и ставят в термостат на 20 ч. Положительный ответ дают в том случае, если выделенная культура по антигенному строению соответствует той или иной серологической группе энтеропатогенных эшерихий. При этом живая культура образует крупнохлопчатый агглю-тинат с полным просветлением жидкости над осадком не менее чем в 2—3 разведениях сыворотки; прогретая культура выпадает в виде мелкозернистого агглютината до предельного разведения той же сыворотки или до 3Д титра, указанного на этикетке’. Такого рода результат указывает на принадлежность выделенной культуры к соответствующей серологической группе энтеропатогенных кишечных палочек. Образование мелкозернистого агглютината в ряду пробирок с живой и прогретой культурой, в разведениях сыворотки до 3/i ее титра по О-антигену свидетельствует о принадлежности культуры к соответствующей О-группе и отсутствии или низком содержании в ней поверхностных соматических К-антигенов (В или L). Реакция считается положительной. Отсутствие агглютинации в пробирках с гретой культурой указывает на принадлежность выделенной культуры к другой О-группе. Если прогретая культура агглютинируется только в начальных разведениях сыворотки, это свидетельствует о ее принадлежности к другой группе, имеющей антигенное родство с соответствующей О-группой. Реакция считается отрицательной.
25.Реакция ВидаляРеакция агглютинации широко применяется в лабораторной практике для серодиагностики. Реакция агглютинации протекает в две фазы:
1 фаза — соединение антигена с антителом;
2 фаза — адсорбция на комплексе антиген+антитело физиологического раствора и выпадение осадка двух видов:
а) крупнохлопчатого — у жгутиковых бактерий (Н-агглютинация);
б) мелкозернистого — агглютинат образуется в виде компактных зерен (О-агглютинация).
Компоненты реакции Видаля:
1) испытуемая сыворотка в разведениях 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600;
2) диагностикумы — взвесь убитых сальмонелл трех видов: брюшного тифа, паратифа А и В;
3) физиологический раствор.
Цель реакции: определение титра антител в испытуемой сыворотке.
Реакция агглютинации должна сопровождаться контролем антигена и сыворотки. Реакция ставится в трех рядах. Учет результатов проводят через 18-20 часов.
Степень положительной реакции агглютинации обозначается плюсами: + + + + полная агглютинация + + + неполная агглютинация + + слабая агглютинация — осадка нет (отрицательная реакция) Положительным результатом у людей, не привитых против брюшного тифа, считают агглютинацию в разведении 1:100 при наличии клинической картины и не ниже 1:200 при отсутствии таковой. У привитых больных указанные титры О-антител не являются надежным диагностическим признаком. Диагностический титр Н-антител у ранее привитых больных должен быть не менее 1:400.
26. Реакция Видаля (с культурой дизентерийных палочек) считается доказательной в разведении 1 : 100 для дизентерии типа Зонне и 1 : 200 для остальных типов, наибольшую диагностическую ценность имеет нарастание титра при повторных исследованиях,
При положительной реакции осадок равномерным слоем покрывает дно пробирки. Края его обычно неровные (так называемый зонтик). Надосадочная жидкость просветляется. После легкого встряхивания пробирки в прозрачной надосадочной жидкости всплывают отдельные хлопья агглютината. Последнее разведение сыворотки, в котором наблюдают хорошо выраженную агглютинацию, считают ее титром. При отрицательной реакции взвесь сохраняет исходную мутность, так же как в контроле диагностикума. При избытке антигена он может осесть на дно в виде плотного комка.
27.Учет результатов РПГА при гриппе. резул-ты р-ции учитыв. По наличию геммаглютинации-рыхлого осадка из склеившихся эритроцитов на дне и боковых поверхностях лунок(«зонтик»).в контролях геммаглют. Не должно быть(появление плотного осадка эритр. В виде пуговки или колечка)
В ряде лунок А-Н наход. 2-х кратные разведения (от 1/2 до 1/1024) 8-ми испытуемых сывороток(в предпоследней положит сывор.,в последней – отриц.)в ряде В и F –р-ция отриц.,в ряде А и Н-РНГА положит. в титре 1/32, С и G- 1/16, D- 1/128,некоторые сыворотки (С и G)дают эффект прозоны.
28. Учет результатов РПГА с эритр диагностикумами. С целью диагностики дизентерии сыворотки титруют с эритроцитарными диагностикумами Флекснера (из S. flexneri 1 — 5), Зонне (из S. sonnei), Минимальным условно диагностическим титром к диагностикуму Флекснера для взрослых считают положительный результат реакции в разведении 1:400, для детей до 3 лет — 1:100, старше 3 лет — 1:200; для остальных диагностикумов — 1:200. В связи с большим числом неспецифических положительных результатов этой реакции, в особенности в отношении диагностикумов Флекснера и Зонне, достоверным положительным результатом следует считать не менее чем четырехкратное нарастание титра в динамике заболевания, а также наличие титра цистеинустойчивых антител 1:80 и выше.
29. Реакция Райта: ставят в начале 2-й недели болезни. Реакцию ставят не менее чем в пяти разведениях (1:50, 1:100, 1:200, 1:400 и 1:800) в объеме 1 мл каждое. В качестве антигена применяют единый бруцеллезный дианостикум. Перед употреблением диагностикум разводят в 10 раз карболизированным (0,5%) физиологическим раствором. Учет реакции производят через 24 часа путем сравнения степени просветления в опытных пробирках с соответствующим стандартом мутности, который готовят следующим образом. В 4 пробирки последовательно наливают 1, 2, 3 и 4 мл разведенного диагностикума, затем в том же порядке добавляют 3, 2 и 1 мл карболизированного физиологического раствора, в последнюю пробирку ничего не добавляют. После взбалтывания содержимого берут по 0,5 мл антигена каждой концентрации и 0,5 мл карболизированного физиологического раствора. Таким образом получают 4 пробирки стандарта мутности с различной степенью просветления (75% — 3—, 50% — 2 — и 25% — 1 — и отсутствие просветления), которые вместе с опытными пробирками помещают в термостат при t° 37° на 24 часа, после чего производят учет реакции. Диагностическим титром исследуемой сыворотки считается 50% агглютинации (2+).
30. Факторы патогенности стафилококков
1. Выявление плазмокоагулазы: выделенную агаровую культуру в виде густой взвези вносят в пробирку с цитратной плазмой кролика и эмульгируют. Пробирки выдерживают в вертикальном положении при 37 гр. и наблюдают за появлением коагуляции- свертывания крови. (+ результат отмечается через 2-6 ч.)
2. Определение ДНКазной активности: культуры стафилококков засевают бляшками в чашку Петри с ДНК-содержащим агаром. Через сутки в чашку вносят соляную кислоту и через 3-5 мин. Наблюдают появление вокруг бляшек зоны просветления, что свидетельствует о наличии ДНКазы.
3. Лизоцимная активность: при выделении лизоцима вокруг колонии стафилококков образуются зоны лизиса микрококка.
4. Выявление продукции энтеротоксина: культуру стафилококков засевают в специальную питательную среду. Инкубация 37 гр. 3-4 суток. Затем фильтруют через мембранные фильтры. Полученный фильтрат смешивают с молоком скармливают котятам. При наличии энтеротоксина через 1 ч. У котят возникает рвота, а через 2-3 ч. Понос, возможен летальный исход.
ЦПД в культуре тканей
Исследуемый материал: испражнения, носоглоточный смывы. Заражают культуру клеток почек обезьян. В культуре вирус оказывает ЦПД. Идентифицируют вирус, проводя РН с типоспецифическими сыворотками и ИФА.
РН. Компоненты: вируссодержащий. материал и диагностическая сыворотка. Готовят разведения сывороток, добавляют вирусод. материал, заражают смесью культуру клеток. Пол. результат: отсутствие ЦПД вируса, бляшкообразования и изменения цвета.
ИФА: Компоненты: специфические АТ, вируссод. материал, АТ той же специфичности, конъюгат, хромогенный субстрат. Связывают специфические АТ с пластиком лунки планшета, вносят вируссод. материал, вносят АТ той же специфичности, конъюгат и субстрат. Пол. результат: изменение окраски субстрата.
32.Учут результатов ИФА Используют в качестве метки АТ ферментов, способных разлагать субстрат и приводить к образованию окрашенных продуктов( хромогена). Соединенные с ферментом АТ соединяются с гомологичными АГ. Сначала на твердой фазе адсорбируются АГ или АТ , а потом все компонентты реакции. Интенсивность окраски хромогена соответствует количеству образовавшихся комплексов АГ +АТ + фермент. АГ улавливается АТ, присоединенным к твердой фазе( пластиковые планшеты, пленки) . В результате инкубации исследуемый АГ присоединяется к АТ и твердой фазе. Затем привязанный АГ выявляют с помощью меченых ферментом АТ против этого АГ-прямой вариант.При непрямом методе используются меченые ферментом антивидовые сыворотки. Количество присоединенного к твердой фазе фермента соответствует количеству АГ. Активность фермента оценивают по интенсивности окрашивания хромогена визуально или с помощью фотоэлектроколориметра.
33. Произвести учет РГА с целью определения титра вируса.Для постановки РГА готовят двукратные разведения вакцинного вируса от 1:2 до 1:4096. С этой целью во все лунки одного ряда полистероловой микропанели микротитратором разливают физиологи ческий раствор (0,05 или О,25 см3), в первую вносят в равном объеме вакцинный вирус трехкратно пипетируюти и переносят 0,05 или0,025 см3 во вторую лунку и т.д. Из последней лунки 0,05 или0,025 см3 удаляюти обезвреживают в 2%-ном растворе едкого натрия. После разведения вируса во все лунки вносят 0,7%-ную суспензию эритроцитов петуха в объеме, равном исходному объему физиологического раствора. Микропанели аккуратно встряхивают и оставляют при команатной температуре (18-20*С). Учет реакции проводят после оседания эритроцитов в контроле.
Для контроля эритроцитов на спонтанную гемагглютинацию оп ределения времени учета реакции в две лунки с физиологическим растворам (0,05 или 0,025 см3) добавляют равный объем эритроцитов. РГА оценивают положительно при оcедании эритроцитов в виде хорошо выраженного «зонтика», отрицательно — в виде «пуговки». За титр вируса принимают его наибольшее разведение, дающее четко выраженную агглютинацию в виде «зонтика». Получение нечетких ре зультатов может быть связано с изменившимся рН физиологического раствора.
34.Учет РТГА Берем 6 пробирок. последняя — контрольная ( контроль эритроцитов). В каждую добавляем ИХН. Затем в каждую добавляем АГ. ( диагностикум) ( кроме шестой) . Затем в первую добавляем сыворотку от больного и титруем. Потом на 30 мин. в термостат . Затем добавим во все эритроциты ( одинаковое количество) . Потом — 30 мин. термостат. Положительный результат — пуговка. Отрицательный — зонтик.
35учет ИФА. По ходу, так же , как и 32, но неточно.
Общие условия выбора системы дренажа: Система дренажа выбирается в зависимости от характера защищаемого.
источник
Полоска фильтровальной бумаги размером 1,5×8 см, простерилизованная в автоклаве, пропитывается антитоксической противодифтерийной сывороткой «Диаферм-3», разведенной физиологическим раствором до содержания 500 АЕ в I мл.
Смоченную сывороткой бумагу стерильным пинцетом переносят на поверхность питательной среды в чашке Петри. Чашку подсушивают в термостате 20 минут. Испытуемые культуры (колонии) засевают петлей бляшками диаметром в I см на расстоянии 0,5 см от бумаги. На одну чашку засевают несколько штаммов, в том числе один заведомо токсигенный. Рекомендуется каждую культуру засевать не менее чем четырьмя бляшками (по две с каждой стороны от бумаги). Посевы помещают в термостат. Учет производят через 24, 48, 72 часа. Определение токсигенности основано на следующем принципе: образующийся в процессе роста дифтерийных бактерий экзотоксин диффундирует в питательную среду. Одновременно в среду диффундирует специфическая антитоксическая противодифтерийная сыворотка. В тех местах среды, где токсин и антитоксин встречаются в оптимальных соотношениях, выпадает реакция преципитации в виде белой изогнутой линии. Исследуемые бактерии считаются токсигенными, если линии преципитата их сливаются с линиями преципитата контрольного штамма. Демонстрация опыта по определению токсина методом преципитации в агаре.
б)Для определения гемотоксина произвести посев золотистого, стафилококка на пластинки кровяного МПА. Для этого чашка с кровяным МПА делится на два сектора. На одном из них засевается культура золотистого стафилококка, а на другом — для контроля — культура нетоксигенного белого стафилококка.
в)Определение некротоксина производится путем внутрикожного введения лабораторному животному 0,2 мл бульонной культуры (или фильтрата бульонной культуры) испытуемого микроба.
Через сутки или двое суток на месте введения образуется очаг некроза. Демонстрация опыта. Зарисовать дермонекротическую пробу.
§ 5. Демонстрация опыта по выявлению брюшнотифозного эндотоксина внутрикожной пробы на кролике. 0,2 мл эндотоксина, полученного путем обработки культуры трихлоруксусной кислотой, вводят внутрикожно кролику. На месте введения эндотоксина через 24-48 часов отмечается воспалительная реакция. Зарисовать.
§ 6. а) Для выявления гиалуронидазы кролику в один участок депилированнои кожи вводят внутрикожно 0,2 мл туши в физиологическом растворе, а в такой же соседний участок — 0,2 мл туши с прибавлением фильтрата бульонной культуры стафилококка.
Пятно на месте инъекции туши с фильтратом бульонной культуры стафилококка через 24-48 часов в несколько раз превосходит по размерам пятно на месте введения туши без фильтрата за счет повышения проницаемости ткани в присутствии гиалуронидазы. Демонстрация опыта.
б)Для выявления фибринолитического фермента в чашки Петри с агаровой средой, содержащей плазму, засевают испытуемую культуру. После инкубации в течение 24-48 часов при 37 0 образуется зона про светления вокруг колоний бактерий, продуцирующих фибринолизин. Демонстрация опыта.
в)Для выявления фермента плазмокоагулазы испытуемую культуру засевают в 0,2 мл цитратной кроличьей или человеческой плазмы. В случае выработки плазмокоагулазы через 2-4-6-18 часов инкубации при 37 0 происходит свертывание плазмы. В контроле плазма остается жидкой. Демонстрация опыта.
г)Для выявления лецитиназы изучаемую культуру засевают на желточный агар. При наличии лецитиназы вокруг колонии бактерий образу ется зона помутнения и радужного венчика. Демонстрация опыта.
источник
Для диагностики дифтерии разработаны различные методы: бактериологический, биологический, иммунохимический (РПГА, ИФА, РКоА, РЛА), также проводятся молекулярно-биологические исследования (ПЦР, риботипирование, энзимотипирование, секвенирование ДНК).
Крайне важны правильное взятие и своевременная доставка материала, а также четкий учет результатов.
Современная лабораторная диагностика дифтерийной инфекции имеет большое значение для установления диагноза, принятия решения о проведении специфической терапии, оценки и прогнозирования эпидемиологической ситуации.
Бактериологический или культуральный метод является основным и используется с диагностической, профилактической и эпидемиологической целями.
Проведение бактериологического исследования на обнаружение возбудителя дифтерии регламентировано и осуществляется в соответствии с методическими указаниями «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции».
Результаты бактериологического исследования в значительной степени зависят от своевременного и правильного забора материала, качества питательных сред, четкого и профессионального выполнения.
С диагностической целью в стационаре обследуют больных с острыми воспалительными заболеваниями в ротоглотке и дыхательных путях при подозрении на дифтерию ежедневно в течение 3 дней; при амбулаторном обследовании — больных ангинами, имеющих патологические выпоты на миндалинах, больных с подозрением на паратонзиллит, заглоточный абсцесс, стенозирующий ларинготрахеит, инфекционный мононуклеоз. Материал берут однократно.
По эпидемиологическим показаниям обследуются лица, бывшие в контакте с источником инфекции. Забор материала у них проводится однократно.
С профилактической целью обследуют лиц, поступающих в детские дома, специальные учреждения для детей с поражением ЦНС, санатории для детей с туберкулезной интоксикацией, в психоневрологические стационары — однократно.
Бактериологическое обследование бактерионосителей токсигенных штаммов С. diphtheriae проводят двукратно.
В период реконвалесценции после завершения антибактериальной терапии обследование проводят через 3 дня после окончания лечения, дважды с интервалом в одни сутки.
Материалом для исследования служат слизь, отделяемое и пленки из ротоглотки и носа. При наличии налета взятие материал производится с границы пораженной и здоровой ткани.
При подозрении на экстрабуккальные формы дифтерии проводят забор из очагов поражения (глаз, ухо, кожа, влагалище и др.), также следует брать материал из носа и зева. От больных материал должен быть взят в течение 3-4 ч (не позднее 12 ч) с момента поступления в стационар до назначения антибактериальной терапии.
При обследовании здоровых лиц на дифтерийное бактерионосительство исследуют слизь из зева (миндалины, дужки) и носа (нижние носовые ходы).
Для взятия проб используют стерильные ватные сухие тампоны. Исследуемый материал из каждого локуса забирают отдельным тампоном. Фибринозную пленку можно снять пинцетом.
Доставка материал в лабораторию осуществляется в течение 3 часов, в холодное время года, предохраняя от охлаждения.
При проведении обследования контингентов в отдаленных от бактериологических лабораторий районах, когда посев не может быть проведен в течение 3 ч, материал засевают у постели больного на транспортную полужидкую среду с теллуритом калия.
При использовании транспортной среды тампоны с материалом погружают в среду. Допускается инкубация посевов на транспортной среде до 18-20 ч, после чего делают высев на плотные питательные среды.
Культивирование материала на тампоне в транспортной среде, используемой в качестве среды обогащения, позволяет повысить показатель высеваеваемости коринебактерий дифтерии и применять иммунохимические методы для выявления токсина, использование которых сокращает сроки выдачи предварительного ответа.
С другой стороны, культивирование исследуемого материала на транспортной среде свыше 8 ч может способствовать размножению не только коринебактерий, но и сопутствующей микрофлоры, в частности S. aureus и S. epidermidis, соответственно более 90 и 10 % штаммов которых обладают теллуритредуктазой.
Для выделения возбудителя дифтерии проводят прямой посев материала, взятого сухим ватным тампоном или тампоном после культивирования в транспортной среде, на одну из элективноселективных сред для коринебактерий дифтерии.
В настоящее время предпочтение отдается кровяным теллуритовым средам. Все среды, используемые для первичного посева и последующей дифференциации выделенной культуры, подлежат предварительному контролю.
Через 24 часа инкубации на кровяных теллуритовых средах формируются колонии, окрашенные в черный или темно-серый цвет. Замедленное формирование подозрительных колоний (через 48 ч) в основном выявляется при исследовании материала, взятого у бактерионосителей.
Признаки, характерные для колоний биоваров gravis, mitis и intermedius, проявляются через 48 ч. Просмотр колоний осуществляют с помощью микроскопа бинокулярного стереоскопического (МБС).
В случае обнаружения подозрительных на коринебактерии дифтерии колоний их сразу же исследуют на токсигенные свойства. Необходимо изучать токсигенные свойства у нескольких колоний, т. к. из исследуемого материала могут быть выделены одновременно токсигенные и нетоксигенные клоны клеток коринебактерий дифтерии.
Для определения токсигенности используют тест Элека (традиционный или модификационный), основанный на методе встречной иммунодиффузии токсина и антитоксических антител (антитоксина) в специальных питательных средах (среда для определения токсина дифтерийного микроба или коринетоксагар) и являющийся одним из вариантов постановки реакции преципитации в геле.
При постановке теста Элека делают посев по 1\2 каждой из 2 изолированных колоний на среду для определения токсигенности и необожженной петлей — уколом в столбик среды Пизу; другую половину колонии отсевают в пробирку со скошенным 10% сывороточным агаром, из оставшихся нескольких 5-7 колоний формируют бляшки.
В случае множественного роста подозрительных колоний проводят определение уреазной активности в пробе Заксе. При обнаружении только одной колонии ее засевают на среду для определения токсигенности и, не обжигая петлю, в среду Пизу для определения цистиназы.
После учета результатов для дальнейшей идентификации используют культуру со среды Пизу или из бляшки.
У выросшей на сывороточном агаре культуры изучают морфологию, используя метод окраски по Леффлеру, биохимические свойства (глюкоза, сахароза, мальтоза, крахмал, декстрин), определяют уреазную активность.
При необходимости идентифицировать С. ulcerans используют тесты на уреазу и восстановление нитратов в нитриты.
Определение токсина является основным дифференциально-диагностическим тестом при бактериологическом исследовании на дифтерию.
Клиническое и эпидемиологическое значение токсигенных и нетоксигенных штаммов различно, поэтому чрезвычайно важно как можно быстрее получить точные данные о токсигенности штаммов, чтобы подтвердить диагноз дифтерии и воспрепятствовать распространению инфекции путем выявления бактерионосителей среди контактных лиц.
Критерием оценки специфичности преципитатов служит время появления и расположение линий преципитации испытуемого штамма по отношению к линиям преципитации контрольного токсигенного штамма. Специфические линии преципитации появляются через 24-48 ч, сливаются или направлены на слияние с линиями контрольного штамма.
Метод преципитации является высокоспецифичным, но его чувствительность составляет 0,5-1,0 мкг/мл по белку антигена. В связи с этим у штаммов коринебактерий дифтерии с низким уровнем продукции токсина специфические линии преципитации могут формироваться гораздо позже.
В практических лабораториях возможна гиподиагностика при определении токсигенности дифтерийных бактерий, что в основном обусловлено нестандартными питательными средами, повышенным содержанием железа в сыворотке, добавляемой в среду, недостаточными посевными дозами и малым содержанием антитоксина на бумажных носителях, а также другими отклонениями от методики постановки теста.
Одной из причин гиподиагностики при определении токсина методом иммунодиффузии является повышенное содержание железа в сыворотке лошади или крупного рогатого скота, которая является обязательным компонентом, добавляемым в среду для определения токсина дифтерийного микроба или коринетоксагар.
У токсигенных штаммов С. diphtheriae способность экспрессировать ДТ, а также интенсивность роста и размножения наблюдаются при малых концентрациях железа, что объясняется снижением потребности в источнике железа у токсиген-ных штаммов С. diphtheriae.
Экспрессия структурного tox-гена, носителем которого является профаг, находится под контролем хромосомного регуляторного гена dtxR. Ген dtxR является ответственным за синтез железо-зависимого белка-репрессо-ра dtxR.
В операторе гена tox имеется участок ДНК, с которым взаимодействует белок-репрессор, препятствуя транскрипции tox-мРНК и, следовательно, продукции дифтерийного токсина. При дефиците железа белок-репрессор инактивируется и начинается синтез токсина.
Неспецифические линии преципитации при определении токсина могут быть выявлены в основном при использовании лечебной антитоксической сыворотки или препаратов нестандартного антитоксина, содержащих антитела к клеточным антигенам С. diphtheriae.
Выявление цистиназной активности, способности окислять глюкозу и мальтозу, отношение к крахмалу, декстрину и отсутствие фермента уреазы наряду с характерными морфокультуральными признаками (полиморфизм, метахроматичное окрашивание, формирование колоний черного или серого цвета на кровяных теллуритовых средах) позволяют отнести выделенный микроорганизм к С. diphtheriae и одному из биоваров.
Выделенный в результате бактериологического исследования штамм C.diphtheriae является возбудителем дифтерии, если он обладает токсигенными свойствами.
Бактериологический метод диф-диагностики дифтерии позволяет в случае выделения токсигенного штамма, обладающего цистиназной активностью, дать окончательный документированный ответ через 48-72-96 часов, нетоксигенного штамма — через 72-96 часов.
Использование высококачественных питательных сред для первичного посева, определения токсигенности, биохимических свойств и микроскопа бинокулярного стереоскопического (МБС) для отбора колоний позволяет ускорить проведение бактериологического исследования и, соответственно, сократить сроки выдачи ответа до 48 часов.
Определение токсина у возбудителя дифтерии является основным дифференциальным тестом при диагностике дифтерии.
Для определения токсигенных свойств коринебактерий дифтерии разработаны и могут быть использованы разные методы, которые значительно различаются по специфичности, чувствительности и времени проведения исследования.
Основной метод определения токсина — иммунодиффузия в агаре — является высокоспецифичным, но позволяет выявлять ДТ только у 84,0 и 80,4 % штаммов, выделенных от больных и бактерионосителей соответственно.
Это связано с наличием у положительных в ПЦР и отрицательных в тесте Элека штаммов «молчащего» гена токсигенности. Роль таких штаммов в патологии пока неясна.
Биологические методы определения токсигенности, основанные на использовании 9-дневных куриных эмбрионов, перевиваемых культур клеток, пробах на вирулентность на морских свинках или кроликах, являются высокочувствительными, но трудоемкими и дорогостоящими.
Наиболее надежным тестом для определения токсина in vivo является подкожный тест на вирулентность на морских свинках.
При диагностике дифтерии комплексное микробиологическое исследование с использованием иммунохимических (РЛА, РКоА, РПГА, ИФА) методов позволяет значительно повысить эффективность лабораторной диагностики дифтерийной инфекции, ускорить обнаружение токсина.
Методы не являются обязательными при проведении диагностики дифтерии, но, по сравнению с традиционным (метод Элека), имеют преимущества по чувствительности и времени проведения анализа.
Современные варианты иммунохимического анализа, использование моноклональных антител к эпитопам дифтерийного токсина гарантируют и их высокую специфичность. Результаты, полученные этими методами, позволяют дать только предварительный ответ о наличии токсина.
Реакция пассивной гемагглютинации (РИГА) и иммуноферментный анализ (ИФА) могут быть использованы для выявления слаботоксигенных штаммов C.diphtheriae, определения уровня токсинопродукции, а также с целью сокращения сроков выявления ДТ.
Токсин обнаруживается в РИГА через 18 часов после посева культуры в жидкую питательную среду, содержащую сыворотку и теллурит калия, и через 3 ч при использовании бульона на основе сред 199 или «Игла» с 20 % сыворотки крупного рогатого скота.
Для проведения ИФА можно использовать культуру и непосредственно надосадок среды культивирования исходного клинического материала. Реакции являются высокочувствительными, и при их использовании токсин определяется в 98 % случаев.
Постановка РИГА основана на использовании эритроцитарного дифтерийного диагностикума, сенсибилизированного поликлональными антитоксическими антителами (антитоксином), способными взаимодействовать только с дифтерийным токсином.
При наличии в исследуемом образце токсина образуется специфический комплекс (ДТ—АТ), который выявляется в виде агглю-тината эритроцитов. Для постановки РПГА необходимо использовать стабильные стандартные диагностикумы, чувствительность которых не ниже 0,003 Lf/мл.
Метод позволяет определять относительное содержание токсина, умножая значение чувствительности диагностикума, выраженного в единицах Lf/мл, на обратное значение титра исследуемой пробы.
Для определения дифтерийного токсина методом ИФА разработан твердофазный вариант «сэндвич». В микробиологии тест-системы ИФА пдля диагностики дифтерии используют моноклональные антитоксические противодифтерийные антитела (МкАт) к концевому участку В-фрагмента дифтерийного токсина, адсорбированные на поверхности полистироловых планшет.
Адсорбированные на поверхности полистирола МкАт взаимодействуют с эпитопами В-фрагмента ДТ, если он присутствует в исследуемой пробе. К комплексу МкАт—ДТ добавляют конъюгат (К), представляющий собой поликлональные антитоксические антитела, конъюгированные с ферментом (пероксидаза хрена).
Свободные эпитопы ДТ взаимодействуют с поликлональными антитоксическими антителами, входящими в состав конъюгата, образуется комплекс МкАт—ДТ—К, который обнаруживают, добавляя смесь перекиси водорода с индикатором.
Результаты реакции учитывают визуально или с использованием спектрофотометра. Использование Fab-фрагментов МкАт гарантирует высокую чувствительность тест-системы. Метод позволяет определять токсин в концентрации 0,8-1,5 нг/мл или 0,0002 Lf/мл анатоксина и используется как в варианте «скрининг», так и для количественного определения ДТ.
Разработан метод определения ДТ на мембранах эпителиоцитов слизистой оболочки больных с помощью ИФА. С этой целью используют тест-систему «Дифтерия-монозим», в которую входят моноклональные антитела к СООН-концевой части В-фрагмента молекулы ДТ.
Данный метод позволяет выявить в течение 5-6 ч даже незначительное количество токсина, адсорбированного на мембранах клеток слизистой оболочки больных в 100 % случаев, провести раннюю дифференциальную диагностику дифтерии с клинически схожими заболеваниями.
РЛА и РКоА являются экспресс-методами обнаружения ДТ в культуральной жидкости.
Разработана аналитическая система для реализации экспресс-способа диагностики токсигенных штаммов, в которую входит дифтерийный латексный диагностикум и микроридер со сменными чипами.
Дифтерийный антительный диагностикум получен путем химической сорбции на поверхности полиакриламидных латексных частиц высокоавидных антитоксических антител с индексом авидности не менее 90 %.
Постановку РЛА осуществляют на чипах, результаты фиксируют в заданном или произвольном режиме в памяти компьютера в виде фотоизображений. Разработанный способ обладает высокой эффективностью, количественная оценка чувствительности метода составляет 0,001 Lf/мл.
В настоящее время большинство иммунохимических методов определения дифтерийного токсина могут применяться только в лабораториях научно-исследовательских учреждений, в которых они разработаны, т. к. соответствующих тест-систем производственного выпуска не существует.
Основным показателем напряженности противодифтерийного иммунитета является уровень дифтерийного антитоксина в сыворотке крови.
Для определения уровня антитоксина в сыворотке крови вакцинированных и больных используют иммунологические методы (РПГА, ИФА, методы Ремера и Йенсена, реакция нейтрализации токсина в клеточной культуре Vero).
Реакцию нейтрализации in vivo на морских свинках по Ремеру или на кроликах по Йенсену считают универсальными методами, или «золотым стандартом» определения антитоксических антител в сыворотке крови человека. Результаты реакции нейтрализации по Йенсену в 100 % случаев совпадают с результатами теста Элека.
Иммунологические методы могут быть полезными при необходимости дифференциации стертых и атипичных форм дифтерии и неспецифических ангин с сопутствующим носительством токсигенных штаммов.
Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) отличается высокой специфичностью и чувствительностью и является регламентированным методом для изучения напряженности противодифтерийного иммунитета.
Это двухкомпонентная сложная реакция, при которой противодифтерийные антитела, находящиеся в исследуемой сыворотке, взаимодействуют с дифтерийным анатоксином, который адсорбирован на эритроцитах.
В результате специфического взаимодействия антитоксических антител с анатоксином образуется комплекс, выявляемый в виде агглютината эритроцитов. За условно-защитный титр противодифтерийных антитоксических антител принимается титр 1:20. Существует и мнение, что нет четко определенного «защитного титра» антител, определяемого в этой реакции.
Результат РПГА подтверждается в реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА), реакция оценивается специфичной при снижении титра антител в РТПГА в 4-8 раз и более.
Реакцию нейтрализации (PH) на кроликах по Йенсену проводят с целью количественного определения антитоксина в крови больного. Метод основан на способности ДТ вызывать воспалительную реакцию и некроз при внутрикожном его введении кроликам.
In vitro исследуемую сыворотку смешивают с различными дозами стандартного токсина и затем вводят кроликам. Отсутствие или степень выраженности внутрикожной реакции зависит от количества антитоксина, содержащегося в крови больного.
С помощью метода Йенсена можно дифференцировать стертые и атипичные формы дифтерии от ангины другой этиологии с сопутствующим носительством токсигенных штаммов. Исследование крови проводят в первые 3-5 дней от начала заболевания.
Отсутствие антитоксина или его низкий уровень (менее 0,01 МЕ/мл) является доводом в пользу заболевания. Уровень антитоксина 0,5-1,0 МЕ/мл свидетельствует в пользу бактерионосительства.
Резкий подъем антитоксина у больных может быть обусловлен вторичным иммунным ответом в случае, если больной вакцинирован, что необходимо учитывать при оценке реакции. Определение титра антитоксина с диагностической целью проводят только до введения лечебной сыворотки. Метод Йенсена применяют редко, т. к. он остается трудоемким и дорогостоящим.
Соответственно рекомендациям ВОЗ для определения уровня антитоксина в сыворотке используют и реакцию нейтрализации токсина в культуре клеток Vero (перевиваемая культура клеток почек обезьян).
Дифтерийный токсин подавляет метаболическую активность и рост культуры клеток Vero. Тест основан на нейтрализации цитотоксического действия ДТ антитоксином, который содержится в сыворотке крови.
Реакцию нейтрализации проводят в микропланшете, в лунки которого с последовательно разведенной исследуемой сывороткой крови вносят ДТ в рабочей дозе и культуру клеток Vero, инкубируют в течение 5-6 дней при 37 °С.
Определение титра антител к дифтерийному токсину проводят по выявлению живых клеток культуры Vero или спектрофотометрически по снижению степени окрашиваемости субстрата митохондриальной дегидрогеназой.
При иммунном ответе на дифтерийный токсин или анатоксин в крови обнаруживаются лимфоциты (1,00-5,71 %), специфически связывающие эти антигены. Определение лимфоцитов, специфически связывающих дифтерийный токсин или анатоксин, проводят в реакции смешанного розеткообразования.
С этой целью в качестве контроля используют эритроциты, сенсибилизированные столбнячным анатоксином, что позволяет дифференцировать антигенсвязывающие лимфоциты (АСЛ) дифтерийной специфичности, обусловленной дифтерийной инфекцией или вакцинацией.
Обнаружение АСЛ дифтерийной специфичности и отсутствие АСЛ столбнячной специфичности является основным критерием для постановки диагноза дифтерийной инфекции.
Вакцинация дифтерийным анатоксином практически всегда осуществляется в комплексе со столбнячным, а иммуногенная активность последнего в АКДС и АДС больше, чем дифтерийного, поэтому в случаях, когда выявление АСЛ дифтерийной специфичности обусловлено вакцинацией, всегда будут обнаружены АСЛ и столбнячной специфичности.
В случае дифтерийной инфекции (заболевание или носительство), наоборот, выявляются АСЛ только дифтерийной специфичности.
Метод количественного определения токсина в составе циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) разработан для ранней диагностики дифтерии и иммунологического мониторинга в процессе лечения.
Для постановки метода используют сыворотку крови больного, из которой с помощью полиэтиленгликоля осаждают ЦИК и исследуют в иммуноферментной реакции согласно инструкции по применению «Дифтерия-монозим». ДТ в составе ЦИК обнаруживается в широком диапазоне концентраций: 0,45-22,3 Lf/мл.
Сроки обнаружения ДТ в ЦИК и его уровень имеют корреляцию с длительностью симптомов интоксикации и развитием осложнений дифтерийного процесса, что является важным для прогнозирования тяжести течения дифтерии и оценки эффективности терапевтических мероприятий.
источник
Возбудитель дифтерии относится к роду Corynebacterium (от лат. coryna — булава, diphthera — пленка). Бактерии имеют булавовидные утолщения на концах. К этому роду относятся патогенные для человека дифтерийные палочки и непатогенные виды — ложнодифтерийные палочки и дифтероиды, обнаруживаемые на слизистых оболочках и кожных покровах.
Возбудители дифтерии — Corynebacterium diphtheriae — были обнаружены Т. Клебсом (1883) и выделены в чистом виде Ф. Леффлером (1884).
Морфология. Возбудители дифтерии слегка изогнутые, тонкие палочки, размером 3-6 × 0,3-0,5 мкм, на концах которых имеются утолщения. В этих утолщениях имеются зерна волютина (зерна Бабеша — Эрнста). Бактерии дифтерии неподвижны, не имеют спор и капсул. Грамположительны. Они хорошо окрашиваются основными анилиновыми красителями, при этом волютиновые зерна окрашиваются интенсивнее. Для окраски обычно применяют щелочной метиленовый синий или кристаллический фиолетовый. Особенностью коринебактерий дифтерии является их полиморфность; в одной кулатуре встречаются различные по форме и размерам палочки: изогнутые, прямые, длинные, короткие, толстые, иногда коккобактерии. Характерно расположение бактерий в мазках — они обычно располагаются попарно под острым или тупым углом, в виде растопыренных пальцев и т. д. Расположение в мазках и наличие зерен волютина является дифференциально-диагностическим признаком при микроскопическом исследовании. Непатогенные представители рода коринебактерий — ложнодифтерийные палочки и дифтериоды чаще располагаются в виде частокола, зерна волютина у них могут отсутствовать либо быть на одном конце (см. рис. 4).
Культивирование. Коринебактерий дифтерии — факультативные анаэробы. Растут при температуре 35-37° С, рН среды 7,4-7,8. Они не размножаются на обычных питательных средах. Культивируют их на средах, содержащих кровь или сыворотку.
В конце XIX века французский ученый Э. Ру для культивирования бактерий дифтерии предложил использовать свернутую бычью или лошадиную сыворотку, а Ф. Леффлер рекомендовал добавлять к ней бульон (25%) и 1% глюкозу. На этих средах коринебактерий растут быстро, в течение 14-18 ч образуют несливающиеся выпуклые колонии кремового цвета (рост на скошенной среде напоминает шагреневую кожу). Однако отдифференцировать на этих средах дифтерийные палочки от ложнодифтерийных невозможно.
В настоящее время основными средами для выращивания являются среда Клауберга (содержащая сыворотку крови и теллурит калия), хинозольная среда Бунина, среда Тинсдаля и др. На основании культуральных и ферментативных свойств коринебактерий дифтерии делят на три биовара: гравис (gravis), ми тис (mitis), интермедиус (intermedins). Биовар гравис обычно находится в R-форме. На среде Клауберга бактерии этого биовара растут в виде крупных колоний 2-3 мм, серовато-черного цвета (так как восстанавливают теллурит в теллур), имеют изрезанные края, что придает им вид розетки. При прикосновении к колонии петлей она как бы рассыпается. На бульоне бактерии этого биовара образуют крошащуюся пленку и зернистый осадок.
Коринебактерии биовара митис (mitis) на среде Клауберга растут в виде небольших, гладких колоний (S-форма) черного цвета. На бульоне они дают равномерное помутнение.
Коринебактерии биовара интермедиус (intermedins) являются промежуточными. На среде Клауберга бактерии этого биовара чаще растут в виде блестящих, мелких, черных колоний (этот биовар встречается редко).
Ферментативные свойства. Все три биовара дифтерийных бактерий обладают ферментом цистиназой, расщепляющим цистин с образованием сероводорода. Эти свойства используются для дифференциации возбудителей дифтерии от непатогенных представителей этого рода (табл. 49).
Таблица 49. Свойства возбудителей дифтерии и близких к ним коринебактерий
Примечание. + положительная реакция (расщепляет); — отрицательная реакция (не расщепляет).
Возбудители всех трех биоваров расщепляют глюкозу и мальтозу до образования кислоты. С. gravis расщепляют крахмал. Это свойство отличает его от двух других биоваров. Коринебактерий дифтерии восстанавливают нитраты в нитриты, не образуют индол, не разлагают мочевину.
Коринебактерии дифтерии образуют нейраминидазу, гиалуронидазу и другие ферменты патогенности.
Токсинообразование. Вирулентные штаммы возбудителей дифтерии продуцируют экзотоксин. Химически он представляет собой термолабильный белок, состоящий из Двух фракций. Фракция В фиксирует токсин на чувствительных к нему тканях организма. Фракция А ответственна за токсическое действие. Силу токсина дифтерийных культур можно устанавливать «in vivo» на чувствительных к этому токсину морских свинках. Dim дифтерийного экзотоксина — минимальная смертельная доза, это минимальное количество яда, убивающее морскую свинку массой 250 г на 4-й день.
Наличие экзотоксина можно обнаружить также «in vitro» — на плотной питательной среде. Этот метод широко используется в практической работе. Дифтерийный экзотоксин малоустойчив. Он быстро разрушается под влиянием температуры, света и кислорода воздуха. После добавления к токсину формалина (0,3-0,4%) и выдерживания его при температуре 37-38° С в течение нескольких недель он переходит в анатоксин, который теряет ядовитость, но сохраняет антигенные свойства токсина. Токсины, образуемые различными штаммами, не различаются между собой и могут быть нейтрализованы дифтерийным антитоксином * .
* ( В настоящее время установлено, что все биовары коринебактерий могут быть токсигенными и нетоксигенными.)
Антигенная структура. У бактерий дифтерии имеется поверхностный термолабильный белковый антиген и типоспецифический полисахаридный О-антиген. Кроме этого, среди коринебактерий различают 19 фаговаров, которые учитываются при идентификации культур. С помощью фаговаров выявляют источник заболевания.
Устойчивость к факторам окружающей среды. Возбудители дифтериии сравнительно устойчивы. Температура 60° С убивает их через 10-15 мин, 100° С — через минуту. В пленке они выдерживают нагревание до 90° С. На свернутой сыворотке при комнатной температуре сохраняются до 2 мес, на детских игрушках — несколько суток. Низкие температуры коринебактерий переносят хорошо. К высушиванию возбудители дифтерии довольно устойчивы. Дезинфицирующие вещества (3% раствор фенола, 1% раствор сулемы, 10% раствор перекиси водорода) убивают эти бактерии в течение нескольких минут.
Восприимчивость животных. В естественных условиях животные дифтерией не болеют. Из экспериментальных животных наиболее восприимчивы морские свинки и кролики. При внутрикожном или подкожном заражении у них развивается картина токсикоинфекции с образованием на месте введения воспаления, отека, некроза. В надпочечниках наблюдаются кровоизлияния.
Источники заболевания. Больные люди и бактерионосители.
Пути передачи. Воздушно-капельный путь, контактно-бытовой (через посуду, игрушки, книги, полотенца и т. д.).
Заболевание у человека: 1) дифтерия зева; 2) дифтерия носа.
Реже возникает дифтерия трахеи, бронхов, глаз, уха, влагалища и дифтерия поврежденной кожи.
Патогенез. Входными воротами являются слизистые оболочки дыхательных путей и поврежденная кожа. Попав на слизистую оболочку, возбудители дифтерии размножаются в месте внедрения и вызывают некроз ткани. Образуется пленка, тесно связанная с подлежащими тканями. На поверхности слизистой появляются грязно-серые или желтоватые налеты, состоящие из разрушенного эпителия, фибрина, лейкоцитов и коринебактерий дифтерии. При снятии пленки ватным тампоном или шпателем поверхность слизистой может кровоточить.
В процессе размножения коринебактерий дифтерии в некротических участках накапливается экзотоксин, который может привести к отеку слизистой оболочки и клетчатки. Со слизистой оболочки отек может распространяться на гортань, бронхи и вызвать явления асфиксии. Токсин, циркулирующий в крови, избирательно поражает сердечную мышцу, надпочечники и клетки нервной ткани.
Дифтерия — это токсикоинфекция. Тяжесть процесса зависит от степени токсигенности штамма и от защитных сил организма.
Иммунитет. Невосприимчивость обусловливается антитоксическим и антибактериальным иммунитетом. Грудные дети не болеют, так как у них имеется пассивный иммунитет, переданный от матери.
О наличии антитоксического иммунитета судят по реакции Шика. Для постановки реакции 1 /40 Dlm (летальной дозы токсина для морской свинки), содержащегося в 0,2 мл изотонического раствора натрия хлорида, вводят внутрикожно в области предплечья. При отсутствии в крови антитоксина в месте введения через 24-48 ч появляется краснота и припухлость (до 2 см в диаметре). При наличии антитоксина припухлости и красноты нет (имеющийся в крови антитоксин нейтрализовал введенный токсин).
Перенесенное заболевание оставляет иммунитет. Однако в 6-7% случаев наблюдаются повторные заболевания.
Профилактика. Ранняя диагностика. Изоляция. Дезинфекция. Выявление носителей токсигенной дифтерийной палочки.
Специфическая профилактика осуществляется введением анатоксина. В СССР проводят обязательную вакцинацию детей вакциной АКДС — это комплексная вакцина, в которую входят дифтерийный и столбнячный анатоксин и взвесь убитых коклюшных палочек. Вакцинируют детей с 5-6 месяцев с последующей ревакцинацией. Для ревакцинации вводят вакцину без коклюшных палочек.
Специфическое лечение. Применяют противодифтерийную антитоксическую сыворотку. Доза и кратность определяется лечащим врачом, вводят также антимикробные препараты.
1. Какова морфология коринебактерий дифтерии и какие имеются биовары?
2. На каких средах выращивают бактерии дифтерии и каков характер роста?
3. Отношение к какому углеводу позволяет отличить биовар gravis от других биоваров дифтерии?
4. Каков путь передачи и где чаще локализуется возбудитель дифтерии у больного?
5. Каковы специфическая профилактика и специфическое лечение дифтерии?
Цель исследования: выделение возбудителя для постановки диагноза. Выявление бактерионосителей дифтерии по эпидемиологическим показаниям. Выявление экзотоксина у выделенной культуры.
1. Отделяемое слизистой оболочки зева.
2. Отделяемое слизистой оболочки носа.
3. Отделяемое слизистой оболочки глаза.
5. Отделяемое слизистой оболочки влагалища.
Материал для исследования зависит от локализации процесса.
Способы сбора материала
При любой локализации процесса обязательно исследует слизистую зева и носа. Материал собирают ватным тампоном, для чего используют металлическую проволоку, желательно алюминиевую, на один конец которой плотно накручивают вату, затем тампон монтируют в корковую пробку, помещают в пробирку и стерилизуют в печи Пастера при температуре 160° С 1 тампон течение часа или в автоклаве при температуре 112° С.
Примечания. 1. Материал собирают натощак либо не раньше чем через 2 ч после еды и не ранее чем через 4 дня после лечения антибиотиками или другими антибактериальными средствами. 2. Если материал берут из зева и носа, то пробирки с обоими тампонами надписывают и связывают вместе. Посевы делают раздельно и исследование материала из каждого тампона ведут как самостоятельную работу. 3 Материал, собранный сухим тампоном, должен быть посеян не позднее чем через 2-3 ч после забора. При необходимости транспортировки собранного материала тампон предварительно смачивают 5% раствором глицерина в изотоническом растворе натрия хлорида.
Первый день исследования
Чашки вынимают из термостата и просматривают. Рост бактерий на среде Клауберга может быть замедлен из-за наличия ингибиторов в среде. В этом случае чашки ставят в термостат еще на 24 ч.
Чашки вынимают из термостата, просматривают их с помощью лупы или стереоскопического микроскопа. При наличии подозрительных колоний часть их под контролем стереоскопического микроскопа выделяют на агар с 25% сывороткой и на столбик со средой Пизу для определения фермента цистиназы. Из другой части колоний ставят пробу на токсигенность.
При микроскопическом исследовании колоний, снятых со среды Клауберга, коринебактерии дифтерии теряют свою специфичность: отсутствует зернистость, изменяется величина, расположение сохраняется. При посеве их на среды с сывороткой морфологическая специфичность возбудителей дифтерии восстанавливается.
Проба на наличие фермента цистиназы и определение токсигенности являются обязательными при идентификации возбудителей дифтерии. Если результат этих опытов, проведенных с частью колоний со среды Клауберга, недостаточно четкий или отрицательный, то опыт повторяют, используя выделенную чистую культуру.
Проба на цистиназу. Проводят посев исследуемой культуры уколом в центр столбика среды Пизу. При положительной реакции через 18-24 ч по ходу укола наблюдается почернение, а вокруг черного стержня образуется темное облачко; почернение происходит в результате того, что фермент цистиназа расщепляет цистин, входящий в состав среды Пизу, и освободившаяся сера вступает в реакцию с ацетатом свинца — образуется сульфит свинца черного цвета. Дифтероиды и ложнодифтерийные палочки не содержат фермент цистиназу, поэтому при росте их на среде Пизу цвет среды не изменяется.
Определение экзотоксина. Проводят методом диффузной преципитации в геле. Метод основан на взаимодействии токсина с антитоксином. В тех участках агара, где эти компоненты взаимодействуют, образуется преципитат в виде закругленных линий.
Методика определения: в чашки Петри разливают растопленный и охлажденный до 50° С агар Мартена рН 7,8 (на агаре Мартена лучше продуцируется экзотоксин). Количество агара в чашке должно быть не более 12-15 мл, чтобы сохранить прозрачность, — в толстом слое линии преципитации плохо видны. После застывания агара накладывают полоску стерильной фильтровальной бумаги, смоченной противодифтерийной антитоксической сывороткой.
Испытуемую культуру засевают «бляшками». Посев производят петлей. Диаметр бляшек 0,8-1,0 см. Расстояние бляшек от края полосок бумаги 0,5-0,7 см, между двумя бляшками испытуемой культуры засевают бляшки заведомо токсигенного штамма. Испытуемую культуру считают токсигенной, если линии преципитации четки и сливаются с линиями преципитации контрольного (токсигенного) штамма. Если линии преципитации перекрещиваются с линиями контрольного штамма или отсутствуют, выделенную культуру считают нетоксигенной (рис. 50).
Рис. 50. Выявление экзотоксина C.Diphtheriae методом диффузной преципитации в агаре. 1 — бляшки нетоксигенного штамма (линии преципитации перекрещиваются); 2 — бляшки токсигенного штамма (линии преципитации соединяются)
Приготовление полосок бумаги. Из фильтровальной бумаги нарезают полоски размером 1,5×8 см, заворачивают по несколько штук в бумагу и стерилизуют в автоклаве при температуре 120° С в течение 30 мин. Перед постановкой опыта стерильным пинцетом вынимают одну полоску, укладывают ее в стерильную чашку Петри и смачивают противодифтерийной антитоксической сывороткой. Предварительно сыворотку разводят так, чтобы в 1 мл содержалось 500 АЕ (антитоксических единиц). Бумажку смачивают 0,25 мл сыворотки (125 АЕ) и помещают на поверхность среды. Затем делают посевы указанным выше способом. Все посевы ставят в термостат. Учет результатов производят через 18-24 и 48 ч.
Вынимают посевы из термостата, учитывают результат. Делают мазки из культуры, выросшей на среде с сывороткой, и окрашивают их синим Леффлера.
Наличие в мазках характерных по морфологии палочек, черного с облачком стержня в среде Пизу и линий преципитации в агаре позволяет дать предварительный ответ: «Обнаружены коринебактерии дифтерии». Исследование продолжают. При отсутствии линий преципитации в агаре или их недостаточной четкости исследование на токсигенность обязательно повторяют с выделенной чистой культурой.
Для окончательной идентификации выделенной культуры и определения биовара возбудителя производят посев на глюкозу, сахарозу, крахмал и бульон с мочевиной (для выявления фермента уреазы). Посев на среды делают обычным способом.
Проба на уреазу. Выделенную культуру засевают на бульон с мочевиной и индикатором (крезоловый красный) и ставят в термостат. Уже через 30-40 мин можно учитывать результат: при посеве истинных возбудителей дифтерии цвет среды не изменяется, так как они не содержат уреазу. Псевдодифтерийные палочки расщепляют мочевину и изменяют индикатор — среда приобретает малиново-красный цвет.
Производят учет результатов (табл. 50).
Таблица 50. Ферментативные свойства выделенных возбудителей
1. Какой материал исследуют для выявления возбудителя дифтерии?
2. Как собирают материал для исследования на дифтерию из зева и носа?
3. Что нужно сделать с тампоном, если собранный материал необходимо транспортировать?
4. При помощи какого прибора изучают колонии на среде Клауберга?
5. Какие исследования проводят для окончательной идентификации выделенной культуры?
6. Какими методами определяют токсигенность коринебактерий дифтерии?
1. Возьмите у преподавателя проволоку и вату и приготовьте 10 тампонов, вмонтируйте их в корковую пробку, вставьте в пробирку и простерилизуйте.
Внимание! Перед стерилизацией проверьте, достаточно ли плотно накручен тампон.
2. Возьмите у преподавателя стерильные тампоны и произведите забор материала друг у друга из зева и носа (разными тампонами).
3. Изучите по табл. 49 свойства возбудителей дифтерии и близких к ним коринебактерий.
4. Поставьте пробу на токсигенность. Бляшки сделайте петлей без культуры.
5. Зарисуйте ход исследования и положительный и отрицательный результат пробы на токсигенность.
Теллуровая среда Клауберга: первая смесь — предварительно за 1,5 мес готовят смесь из 20 мл бараньей или лошадиной крови и 10 мл глицерина. В день приготовления среды готовят две другие смеси; вторая смесь — 50 мл МПА рН 7,5 растапливают и охлаждают до температуры 50° С, после чего прибавляют 2,5 мл первой смеси; третья смесь — смешивают 17 мл бараньей крови и 33 мл дистиллированной воды (смесь приготавливают стерильно), подогревают на водяной бане до температуры 50° С. Соединяют вторую и третью смеси, прибавляют 4 мл 1% раствора теллурита калия К2ТеО3, быстро все перемешивают и разливают в чашки. Среда прозрачная, имеет цвет красного вина.
Среда Пизу. К 90 мл расплавленного 2% МПА (рН 7,6) добавляют 2 мл раствора цистина (1% раствор цистина в 0,1 н. растворе гидроксида натрия), тщательно перемешивают и добавляют такой же объем 0,1 н. раствора серной кислоты. Среду стерилизуют 30 мин при температуре 112° С. К расплавленной и охлажденной до 50° С среде добавляют 1 мл 10% раствора ацетата свинца, стерилизованного двукратно текучим паром, перемешивают и добавляют 9 мл нормальной лошадиной сыворотки. Среду стерильно разливают в маленькие пробирки по 2 мл. Посев производят уколом.
Среда Бунина. Сухую хинозольную среду добавляют к 100 мл холодной воды (рН 7,6-7,8), размешивают и нагревают на слабом огне до расплавления агара (по прописи на этикетке). Затем среду кипятят 2-3 мин до образования пены, после чего среду остужают до 50° С и добавляют 5-10 мл стерильной дефибринированной крови. Среду перемешивают и разливают в чашки Петри. Готовую среду можно сохранять 3-4 дня при температуре 4-10°.
Среда Тинсдаля. К 100 мл 2% питательного агара, расплавленного и охлажденного до 50° С, добавляют: 1) 12 мл 1% раствора цистина на 0,1 н. растворе серной кислоты; 2) 12 мл 1% раствора гидроксида натрия; 3) 1,8 мл 2% раствора теллурита калия; 4) 1,8 мл 2,5% раствора гипосульфита натрия, 20 мл нормальной лошадиной или бычьей сыворотки. После добавления каждого ингредиента среду тщательно перемешивают. Чашки со средой хранят 3-4 дня при 10° С.
источник