1.1. В методических рекомендациях (далее — МР) представлена рациональная и эффективная тактика использования серологических методов диагностики и мониторинга иммунитета к дифтерийной инфекции.
1.2. В настоящих МР описаны используемые в последние годы международные и отечественные методы определения противодифтерийных антител, а также предложен наиболее надежный и перспективный метод иммуноферментного анализа (далее — ИФА) для определения суммарных и высокоавидных антител, его стандартное применение, в том числе предложены надежные критерии оценки защитных уровней, необходимые для выявления среди детей и взрослых групп повышенного риска и оценки напряженности индивидуального и коллективного иммунитета к дифтерийной инфекции.
1.3. Настоящие МР предназначены для врачей-эпидемиологов и микробиологов и носят рекомендательный характер.
2.1. Несмотря на высокие показатели привитости населения от дифтерии в разных регионах России периодически регистрируются случаи заболевания дифтерией или носительства Corynebacterium diphtheria, особенно среди лиц в закрытых коллективах [3, 4, 8].
2.2. В настоящее время, спустя 15 лет после прошедшей эпидемии дифтерии, повсеместно отмечается снижение внимания клиницистов к этой инфекции. Профилактические и диагностические обследования проводятся, но не в полном объеме [12].
2.3. Как известно, защищенность от дифтерии в нашей стране определяется с помощью реакции прямой гемагглютинации (РПГА) [13]. Однако результат реакции, выражаемый в титрах, не позволяет точно определить количество антитоксических антител (АТ-АТ), а, значит, и оценить состояние иммунитета против дифтерии. Разработка и повсеместное внедрение в практику оценочной шкалы защищенности от дифтерии на основании определения количества АТ-АТ позволили контролировать качество вакцинации 1 [14]. Однако информация о количестве вырабатываемых противодифтерийных антител не всегда дает достоверный ответ на вопрос о степени защищенности от дифтерии. Это было продемонстрировано во время последней эпидемии дифтерии в России и после нее, когда у заболевших (до 40 % случаев) находили в крови АТ-АТ зашитых уровней [9, 10]. Проведенными исследованиями установлена определяющая роль высокоавидных АТ-АТ в защите от дифтерии, которые могут быть определены наряду с количеством суммарных АТ-АТ в иммуноферментном анализе [2, 5, 6, 16]. При этом была показана динамика формирования и утраты АТ-АТ, равно как и показателя их авидности, изучены особенности специфического иммунитета к дифтерии среди различных групп населения [1, 7, 11, 15]. Тем не менее, отсутствие программ и схем исследования при диагностике дифтерии и изучении напряженности иммунитета у населения, содержащих новые аргументированные данные, не позволяют полноценно и качественно проводить бактериологический и иммунологический контроль в отношении защищенности к дифтерии на местах.
0,01 МЕ/мл — минимальная степень защиты,
0,01 — 0,09 МЕ/мл — некоторая степень защиты,
0,1 — 0,9 МЕ/мл — защитный уровень антител,
1,0 и > МЕ/мл — стойкая длительная невосприимчивость к дифтерии.
3.1. Для постановки методов при проведении контроля иммунитета населения к дифтерии необходимо соблюдать требования санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2008 № 4 (зарегистрировано в Минюсте России 21.02.2008 № 11197).
3.2. Список оборудования и материалов, необходимых для проведения исследования, представлен в прилож. 1.
4.1.1. Серологический контроль иммунитета в различных группах позволяет представить иммунологическую структуру населения и выявить группы повышенного риска, определить состояние вакцинального иммунитета как в ранние, так и в отдаленные сроки после вакцинации.
4.1.2. Серологический контроль состояния и длительности сохранения вакцинального иммунитета необходимо осуществлять систематически методом выборочного серологического обследования (мониторинга) различных групп населения в городах и сельских районах каждой области, края.
4.1.3. Обследованию подлежат привитые против дифтерии дети и подростки от 3 до 18 лет каждой возрастной группы (3 года, 4 года, 5 лет и т.д., особое внимание следует обратить на детей 9 — 13 лет).
4.1.4. Серологический контроль следует проводить, начиная с групп детей 3 лет не ранее, чем через 6 месяцев после последней прививки. К этому возрасту должен быть закончен первичный вакцинальный комплекс против дифтерии, включающий вакцинацию и первичную ревакцинацию (V и RV).
4.1.5. В случае отсутствия материально-технических возможностей обследования каждой возрастной группы детей и подростков можно отобрать возрастные группы, подлежащие очередной ревакцинации (4 — 5 лет, 9 — 10 лет, 14 — 15 лет).
4.1.6. При получении неудовлетворительных иммунологических показателей в этих группах контроль за иммунитетом следует провести в каждой возрастной группе.
4.2.1. Наиболее подвержены заболеванию дифтерией следующие группы «риска»: лица старше 50 лет; рабочие промышленных предприятий, особенно занятые на вредном производстве; лица, страдающие туберкулезом, а также гепатитом С, СПИД, наркоманией и алкоголизмом.
4.2.2. Особое внимание должно уделяться лицам в закрытых коллективах.
Для определения уровней сывороточных АТ-АТ в крови здоровых людей в нашей стране используют реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА), которая рекомендована методическими указаниями МУК 4.2.3065-13 «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции», утвержденными Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 14 июля 2013 г. Эта реакция имеет свои преимущества, состоящие в простоте постановки, быстроте получения результатов и экономичности.
Для постановки реакции используется диагностикум дифтерийный эритроцитарный антигенный. Поскольку срок годности эритроцитарных диагностикумов составляет 1 год, необходимо перед каждым проведением серологического исследования сывороток проверять активность препарата. Проверка проводится с контрольным антитоксином, приложенным к комплекту, либо используется национальный препарат дифтерийного антитоксина, очищенного ферментолизом и специфической сорбцией, диагностический сухой. Допускается исследование контрольной сыворотки (лабораторный образец) с известным титром дифтерийных антител. Если диагностикум выявляет в сыворотке антитела в концентрации на 2 — 3 разведения ниже, чем они в ней содержатся, то такой препарат не пригоден для дальнейшего исследования.
РПГА ставят в два этапа согласно инструкции, прилагаемой к препарату: 1-й — подготовка к реакции; 2-й — основной опыт. Ответ может быть получен на 2-е сутки с момента получения исследуемого материала лабораторией.
Однако ряд зарубежных исследователей отмечает возможность получения ложноположительных данных и несовпадение результатов, полученных в реакции нейтрализации in vivo и методах in vitro. По данным ряда авторов коэффициент корреляции между результатами, полученными в РПГА и PH, составляет всего 0,6.
Как известно, «золотым стандартом» при определении антитоксических противодифтерийных антител является кожная проба на кроликах или морских свинках. Однако результат в этом тесте можно получить лишь спустя 4 — 7 дней, что ограничивает его применение при проведении исследований в клинической лаборатории, где результат должен быть получен в минимальные сроки.
Поэтому в качестве второго стандарта была принята реакция нейтрализации (PH) в культуре клеток Vero, поскольку она лишена недостатков биологического теста, более стандартна и наглядна. Коэффициент корреляции результатов, полученных в PH в культуре клеток Vero, с результатами, полученными в классическом методе (на лабораторных животных), составляет 0,98. Этот метод гораздо экономичнее, быстрее и проще в постановке. Однако достоверность результатов PH во многом определяется стандартностью культуры клеток и всех контролей (токсинов и антитоксинов).
В реакции используется цветная проба, основанная на способности токсина изменять метаболическую активность зараженных клеток, что определяют по цвету индикатора, содержащегося в питательной среде. В не пораженных токсином культурах клеток под влиянием выделяющихся продуктов клеточного метаболизма pH питательной среды сдвигается в кислую сторону, вызывая изменение цвета индикатора. В пораженных токсином культурах в результате дегенерации клеток их метаболическая активность подавляется, и цвет фенолового красного не изменяется или изменяется частично.
В реакции используется токсин 0,0002 Lf/мл и антитоксин 0,032 МЕ/мл (National Collection of Type Cultures Diphtheriae Reference Laboratory, Central Health Laboratory (CPHL), London, UK). При постановке реакций применяют культуру клеток Vero, получаемую из лаборатории детских вирусных инфекций НИИЭМ им. Пастера, в концентрации 2,5 ⋅ 10 5 клеток/мл. Содержание антитоксических антител определяют от 0,000125 МЕ/мл и выше,
В последние годы совершенствование иммунотехнологии позволило использовать иммуноферментные методы для определения антител, в том числе противодифтерийных. Эти реакции отличаются стабильностью, быстротой, удобством в постановке. В связи е этим в нашей стране (НПО «Биомед», Пермь) разработана и имеет регистрационное удостоверение № 09/600/22116 тест-система на основе твердофазного ИФА с адсорбированным в лунках планшета очищенным дифтерийным анатоксином. Конъюгатом служат иммуноглобулины (F(аb’)2-фрагменты) диагностические против IgG человека, аффинноочищенные, меченные пероксидазой хрена.
Тест-система для ИФА представляет собой набор, предназначенный для определения суммарных антитоксических антител, и включает следующие реагенты: иммуносорбент 1-96-луночный полистироловый или хлорвиниловый планшет для иммунологических реакций, в лунках которого сорбирован анатоксин дифтерийный очищенный; конъюгат — иммуноглобулины (F(аb’)2-фрагменты) диагностические против IgG человека, аффинноочищенные, меченные пероксидазой; контрольный положительный образец (К+) — сыворотка или плазма крови человека с известным титром дифтерийных антител; контрольный отрицательный образец (К-) — сыворотка или плазма крови человека, не содержащая дифтерийных антител; концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином (ФСБ-Т×25); блокатор — белково-солевой раствор (Б); цитратно-фосфатный буферный раствор с перекисью водорода (ЦФБР); хромоген — тетраметилбензидин (ТМБ); стоп-реагент (СР) — 5 %-ый раствор серной кислоты. Специальная компьютерная программа, прилагаемая к набору, дает возможность производить перерасчет показателей оптической плотности в показатели антитоксических международных единиц.
Для определения индекса авидности противодифтерийных антитоксических антител в сыворотке (плазме) крови человека разработано дополнение к набору, которое включает в себя следующие ингредиенты: контрольный положительный образец высокоавидных антител (КА+) — сыворотка крови человека с известным индексом авидности противодифтерийных антитоксических антител (индекс авидности сыворотки указан на этикетке флакона); контрольный отрицательный образец низ-коавидных антител (КА-) — сыворотка крови человека, содержащая противодифтерийные антитоксические антитела низкой авидности; фосфатно-солевой буфер, содержащий 3М калия роданистого для определения авидности противодифтерийных антитоксических антител (ФСБ-3МКрод). Набор рассчитан на исследование 29 образцов сыворотки (плазмы) крови для определения индекса авидности противодифтерийных антитоксических антител.
Тест-система укомплектована национальным стандартом антитоксина, измеряемым в МЕ/мл. Расчет концентрации АТ проводится с учетом коэффициента по калибровочной кривой, что делает результаты более достоверными. Сравнительный анализ нейтрализующего эффекта испытуемых сывороток людей в клеточной культуре Vero и других линиях показал хорошую корреляцию (r = 0,91) с результатами, полученными в модифицированных вариантах ИФА, что подтверждает адекватность применения ИФА для измерения уровня антитоксического иммунитета к дифтерии у здоровых людей.
5.3.1. Определение уровня противодифтерийных АТ
с помощью тест-системы ИФА
1. Приготовить разведения исследуемых сывороток 1:20, 1:200, 1:2000 на буферном растворе № 1 (содержимое флакона концентрата ФСБ-Т×25 развести в 600 мл дистиллированной вода, содержимое флакона с блокатором растворить в 5,0 мл дистиллированной воды, полученный раствор добавить в емкость с раствором ФСБ-Т и тщательно перемешать) в макропланшете непосредственно перед использованием.
2. Приготовить непосредственно перед использованием рабочие разведения: отрицательной сыворотки — 1:20, добавляя в содержимое флакона (0,2 мл) 3,8 мл буферного раствора; положительной сыворотки — 1:200 (отмерить 0,01 мл растворенного К+ и добавить 2,0 мл раствора № 1), из которого затем приготовить отдельно каждое разведение — 1:2, 1:4, 1:8 и 1:16 (в итоге получить пять разведений К+ — 1:200, 1:400, 1:800, 1:1 600 и 1:3200).
3. Полистироловые планшеты с иммунобилгоированным антитоксином трижды отмыть буферным раствором (в объеме 0,3 мл в каждую лунку), удалить буферный раствор, постукивая по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге, помещенной на поддон.
4. Разведения К+ внести по 0,1 мл в лунки: А1 — 1:200, В1 — 1:400, C1 — 1:800, D1 — 1:1600, E1 — 1:3200. К- внести по 0,1 мл в лунки F1 и G1. В лунку Н1 внести 0,1 мл раствора № 1 («бланк»). Разведения исследуемых образцов сывороток крови внести по 0,1 мл в остальные лунки планшета (А2-Н12). Планшет герметично закрыть и выдержать (60 ± 5) мин при температуре (37 ± 1) °С.
6. В каждую лунку планшета, кроме Н1 («бланк»), внести по 0,1 мл раствора конъюгата (непосредственно перед использованием из флакона отобрать необходимый объем конъюгата и развести его раствором № 1 до указанного на этикетке рабочего разведения, тщательно перемешать). В лунку Н1 внести 0,1 мл раствора № 1. Планшет герметично закрыть и выдержать (60 ± 5) мин при температуре (37 ± 1) °С.
7. Удалить жидкость из лунок, планшеты промыть, как указано в пункте 5.
8. Внести в каждую лунку планшета по 0,2 мл раствора ТМБ (готовят непосредственно перед внесением в лунки планшетов). Для этого содержимое флакона с ТМБ перенести во флакон с ЦФБР и тщательно перемешать. Раствор готовить в защищенном от прямых солнечных лучей месте. Планшет выдержать при температуре (20 ± 2) °С в течение 20 мин в защищенном от света месте.
9. Реакцию остановить добавлением в каждую лунку по 0,1 мл стоп-реагента (СР).
10. Результаты ИФА регистрируют на спектрофотометре при двух длинах волн 450/620 нм. Выведение спектрофотометра на нулевой уровень («бланк») осуществляют по лункам вертикального ряда.
5.3.2. Определение индекса авидности противодифтерийных
антитоксических антител
1. Внести контрольные и исследуемые образцы. После внесения контролем К+, К- и раствора № 1 добавить КА+, КА- и все испытуемые сыворотки в двух повторностях (одну повторность КА+, КА- и рабочие сыворотки промыть раствором № 1, а вторую — 3М раствором калия роданистого). Планшет герметично закрыть и выдержать (60 ± 5) мин при температуре (37 ± 1) °С. следуя инструкции к набору дата ИФА. Затем содержимое лунок собрать в сосуд с дезинфицирующим раствором (5 — 6 % раствор монохлорамина).
2. Первая промывка планшета.
Контроли К+, К- и первую повторность КА+, КА- и рабочих сывороток промыть 5 раз раствором № 1, вторую повторность КА+, КА- и рабочих сывороток промыть 4 раза 3МКрод, а 5-й раз — раствором № 1.
3. Далее все этапы реакции выполнить согласно основной инструкции к набору.
Регистрация и оценка результатов
Результаты ИФА регистрируют на спектрофотометре при двух длинах волн 450/620 нм.
Индекс авидности (ИА) рассчитывают по формуле:
ОП(ФСБ — 3МКрод) — оптическая плотность в лунках, обработанных раствором детергента (ФСБ-3МКрод), ОП(Раствор № 1) — оптическая плотность в лунке, обработанной обычным промывочным раствором, используемым в тест-системе (раствор № 1).
КА+ должен содержать высокоавидные противодифтерийные антитоксические антитела с индексом авидности не менее 90 %. КА- должен содержать низкоавидные противодифтерийные антитоксические антитела с индексом авидности не более 10 %.
Индекс авидности рабочих сывороток более 30 % соответствует вероятности защиты от заболевания дифтерией на 95 %, а индекс авидности 10 % является показателем критического уровня, ниже которого вероятность заболевания возрастает до 99 %.
1. Показатель ОП рабочей сыворотки в лунке, обработанной ФСБ-3МКрод, равен 0,24, а в лунке, обработанной раствором № 1, равен 0,37. Индекс авидности, рассчитанный по приведенной формуле, равен 65 %, что соответствует высокой степени защиты от дифтерии (более 30 %).
2. Показатель ОП рабочей сыворотки в лунке, обработанной ФСБ-3МКрод, равен 0,05, а в лунке, обработанной раствором № 1, равен 0,62. Индекс авидности, рассчитанный по приведенной формуле, равен 8 %, что соответствует низкой степени защиты от дифтерии (менее 10 %).
Этап 1. Отобрать кровь у обследуемого в пробирку с активатором свертывания. Внести в систему баз данных информацию об обследуемом по форме (табл. 1).
Профессия или учебное заведение
Наличие хронического или острого заболевания
Есть или нет подозрение на дифтерию
Этап 2. Определить с помощью ИФА тест-системы и 3М роданистого калия количество противодифтерийных антитоксических антител, выраженное в МЕ/мл, и индекс авидности антител, выраженный в %. Количество антител рассчитать по данным оптической плотности в лунках планшета с помощью компьютерной программы, входящей в качестве приложения к тест-системе. Индекс авидности (ИА) антител рассчитать по формуле;
ОП(Е) — оптическая плотность в лунке, обработанной детергентом, ОП(А) — оптическая плотность в лунке, обработанной обычным промывочным раствором, используемым в тест-системе.
Этап 3. Сделать прогноз защищенности обследуемого на будущее. Поскольку авидность антител, защищающая от заболевания дифтерией, снижается быстрее, чем количественный показатель суммарных антител, то в прогнозе необходимо ориентироваться на индекс авидности антител. Для этого найти на графике (рис. 1) значение, наиболее приближенное к полученному индексу авидности антител (с учетом прошлой вакцинации, если она была проведена в ближайший год), и определить по графику, через сколько месяцев индекс авидности снизится до критической отметки (10 %). Очередную ревакцинацию (или повторное исследование) рекомендуется пройти до этой даты.
Рис. 1. Математическая модель из исходных данных
о динамике индексов авидности после ревакцинации
Этап 4. Если обследуемый относится к группе «риска» по заболеванию дифтерией, то нужно учесть, что у таких лиц можно ожидать снижение индекса авидности антител в гораздо более ранние сроки, чем у лиц, не входящих в группу риска. Поэтому очередное исследование на напряженность иммунитета необходимо перенести на более ранний срок.
Этап 1. Определить контингент для изучения напряженности иммунитета к дифтерии с учетом групп риска. Исследование лучше проводить спустя 3 — 5 лет после очередной ревакцинации. Отобрать кровь для исследования. Заполнить индивидуальную информацию в базе данных для каждого обследуемого
Этап 2. Определить индивидуальные показатели защищенности от дифтерии и рассчитать вероятность заболевания на момент обследования. Затем определить средние показатели для всей группы обследованных.
Этап 3. Определить прогноз для всего коллектива в отношении динамики авидности антитоксических антител. Рассчитать сроки очередного обследования или вакцинации.
Все рекомендуемые мероприятия не идут в разрез с нормативными документами по вакцинопрофилактике и контролю иммунитета, а предполагают индивидуальный подход ко всем обследуемым лицам и повышенное внимание к представителям из групп риска.
1. Стандартное оборудование клинических лабораторий для взятия крови.
2. Стандартное оборудование для проведения серологических реакций.
3. Ламинарный или настольный бокс, ТУ 9452003-215-04087-5.
4. Фотометр микропланшетный (ридер).
5. Тест-система для ИФА — набор, предназначенный для определения суммарных антитоксических антител на основе конъюгата — иммуноглобулины (F(аb’)2-фрагменты) диагностические против IgG человека, аффинноочищенные, меченные пероксидазой (производство НПО «Биомед», г. Пермь). Специальная компьютерная программа, прилагаемая к набору, дает возможность производить перерасчет показателей оптической плотности в показатели антитоксических международных единиц.
1. Алексеева Е.А. Оптимизация мониторинга противодифтерийного иммунитета детей в Вологодской области/Е.А. Алексеева, Д.А. Краева, Г.Я. Ценева, Г.И. Беспалова//Материалы X Съезда ВНПОЭМП, Инфекция и иммунитет. Москва, 2012. № 2. С. 77 — 78.
2. Алексеева Е.А. Эффективность высокоавидных антитоксических антител в оценке невосприимчивости к дифтерийной инфекции/Е.А. Алексеева, Л.А. Краева. Г.Я. Ценева, А.М. Николаева//Профилактическая и клиническая медицина. 2011. № 1. С. 38.
4. Краева Л.А. Качественные показатели антитоксических антител в оценке противодифтерийного иммунитета/Л.А. Краева, Ф.С. Носков, Г.Я. Ценева//Ж. мед. иммунол. С.-Пб., 2005. Т. 7. № 2 — 3. С. 274.
5. Краева Л.А. К вопросу о протективных противодифтерийных антителах и методика их определения/Л.А. Краева//Материалы всеросс. научно-практич. конф. «Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов». Пермь, 2008. С. 58 — 59.
6. Краева Л.А. Новые подходы к оценке защищенности от дифтерийной инфекции/Л.А. Краева, ГЛ. Ценева, А.М. Николаева, Е.А. Алексеева//Материалы 4-ой международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями». С.-Пб., 2008. С. 15.
7. Краева Л.А. Роль высокоавидных антитоксических антител в оценке невосприимчивости к дифтерийной инфекции/Л.А. Краева, Г.Я. Ценева, А.М. Николаева, Е.А. Алексеева//Эпидемиология и инфекционные болезни. 2011. № 4. С. 20 — 24.
8. Краева Д.А. Показатели иммунитета к дифтерии у населения Северо-Западного округа РФ и пути оптимизации мониторинга инфекции/Л.А. Краева, Г.Я. Ценева, Л.А. Липатова, Е.А. Алексеева, М.А. Кузакова//Материалы научно-практической конференции, посвященной 90 лет ГСЭС Ленинградской области «Актуальные вопросы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия Ленинградской области». 2012. С. 197 — 200.
11. Ценева Г.Я. Скрининговые исследования иммунитета к дифтерии и коклюшу в Санкт-Петербурге и проблемы контроля невосприимчивости/Г.Я. Ценева, Л.А. Краева, Н.Н. Курова//Мат-лы междунар. конф. «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями». С.-Пб., 2010. С. 82.
12. Ценева Г.Я. Уровень антитоксического противодифтерийного иммунитета у населения Северо-Западного окрута РФ и пути оптимизации мониторинга инфекции/Г.Я. Ценева, Л.А. Краева, Е.Е. Щедеркина//Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2010. № 5 (54). С. 51 — 54.
14. Efsltatiou A., Maple Р.А.С. Manual for the laboratory diagnosis of diphtheria. Copenhagen//The Expanded Programme on Immunization in the European Region of WHO. 1994 (ICP/EPI038).
источник
МЕТОДИКИ ПОСТАНОВКИ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА И РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДИФТЕРИЙНОГО ТОКСИНА
Для решения задачи эпиднадзора за дифтерийной инфекцией необходим качественно новый подход к лабораторной диагностике дифтерии — сокращение сроков исследования, применение более надежных и специфических методов исследования.
Совершенно очевидно, что для сокращения сроков диагностики дифтерийной инфекции необходимо подходить не с позиции выявления коринебактерий дифтерии (токсигенных и нетоксигенных), а с позиций индикации патогенного агента возбудителя дифтерии — дифтерийного токсина.
При определении дифтерийного токсина методом ИФА применяется твердофазнй вариант. Далее приводится описание метода с использованием моноклональных антитоксических противодифтерийных антител (МкАт), полученных к COOH-концевому участку В-фрагмента дифтерийного токсина, ответственного за биологическое связывание с клетками макроорганизма, и иммобилизированных на полистироле. Используются также поликлональные антитоксические противодифтерийные антитела (ПкАт), меченые ферментом пероксидазой хрена. Сорбированные на поверхности полистироловых планшетов МкАт связывают находящиеся в исследуемых пробах молекулы дифтерийного токсина (анатоксина) и не связывают никаких других продуктов микробного или иного происхождения, обеспечивая тем самым исключительно высокую специфичность метода. Свободные антигенные детерминанты молекулы токсина взаимодействуют с ПкАт, конъюгированными с пероксидазой хрена. При наличии в анализируемых пробах токсина образовавшийся комплекс моноклональные антитела — дифтерийный токсин — поликлональный конъюгат с пероксидазой проявляются индикаторной субстратной смесью перекиси водорода с 5-аминосалициловой кислотой (рисунок 2).
Учет реакции производят визуально или инструментально по изменению цвета субстратной смеси. Высокая чувствительность и специфичность метода позволяет выявить токсин в концентрации 4-8 нг/мл или 0,002 Lf/мл анатоксина. Значительным преимуществом ИФА является возможность индикации токсина непосредственно в жидкой питательной среде, в которую был произведен посев клинического образца, минуя этап выделения чистой культуры. Этот метод можно использовать как для качественного (по принципу «да — нет»), так и количественного определения дифтерийного токсина. Пробы ставят в дубликатах — по 2 лунки для каждой пробы.
Схема проведения иммуноферментного анализа (ИФА) для выявления
Ат Аг Ат Аг Ат Е
Ат Аг Ат Ат Е Е
ИЗМЕРЕНИЕ
ПРОДУКТА СУБСТРАТ Е Ат Аг Ат
РЕАКЦИИ
отмывка Ат
Условные обозначения:АТ — иммобилизированные антитоксические противодифтерийные антитела; АГ — определяемый антиген (дифтерийный токсин); АтЕ — конъюгат (антитоксические антитела — фермент)
РНГА — двухкомпонентная реакция, предполагает использование диагностикума эритроцитарного дифтерийного антительного, действующим началом которого являются связанные с эритроцитами очищенные специфической сорбцией поликлональные антитоксические противодифтерийные антитела, вступающие во взаимодействие лишь с дифтерийным токсином — анатоксином. Учитывая возможность появления неспецифической агглютинации в первых лунках планшетов за счет высокой концентрации белка, при постановке РНГА все исследуемые пробы анализируются в серийных разведениях. При наличии в исследуемой пробе токсина, образуется специфический комплекс дифтерийный токсин — сенсибилизированные эритроциты — антитоксические антитела, формирующий осадок в виде агглютината эритроцитов. Чувствительность практически не уступает ИФА.
Сравнительное испытание методов — реакции преципитации в агаре (метод традиционной бактериологии), РНАт, ИФА, РНГА показало преимущество ИФА и РНГА по чувствительности, специфичности, времени проведения анализа. ИФА и РНГА позволяют выдать ответ о наличии токсина или его отсутствии в исследуемом материале на 1-3 суток раньше традиционных методов. Чувствительность ИФА и РНГА зависит от условий культивирования исследуемого материала. Использование жидкой питательной среды позволяет выявить токсин у слаботоксигенных штаммов, продукцию которого уловить на плотной питательной среде, при постановке менее чувствительной реакции иммуно-преципитации в агаре, не всегда представляется возможным.
ИФА и РНГА могут быть применены для ускоренного выявления токсина в материале от больных дифтерией, носителей токсигенных коринебактерий дифтерии; от лиц, обследуемых с профилактической целью или по эпидемическим показаниям; а также — в культурах, выделенных на разных этапах бактериологического исследования. Кроме того, они позволяют изучить уровень токсинообразования штаммов коринебактерий дифтерии. Эти методы могут быть реализованы в бактериологических , диагностических лабораториях СЭО.
Для проведения исследований необходимы:
n коммерческая тест-система иммуноферментная моноклональная для определения дифтерийного токсина «Дифтерия-Монозим» (изготовитель — фирма «Илья Мечников» при ЦНИИВС им. И.И.Мечникова, 103064, Москва, пер. Мечникова, 5а, тел. 916-03-20);
n пипеточные дозаторы или автоматические пипетки на 100 мкл или 200 мкл (импортные или отечественного производства);
n мерная посуда (химически чистая);
n 0,85% раствор хлорида натрия, pH 7,2;
n 4% раствор гидроксида натрия (NaOH);
n 3% раствор перекиси водорода (H2O2);
n в случае необходимости инструментального учета — вертикальный фотометр для оценки иммуноферментных реакций в 96-луночных планшетах с фильтром 450 нм.
Общий принцип постановки ИФА описан на примере коммерческого набора «Дифтерия-Монозим». При использовании других коммерческих тест-систем вносят коррективы согласно инструкции применения этих систем.
Набор «Дифтерия-Монозим» содержит:
1) моноклональные антитела для адсорбции на планшетах;
2) конъюгат антитоксический поликлональный — меченные пероксидазой хрена ПкАт;
3) положительный контроль — анатоксин дифтерийный, 300 Lf/мл;
4) отрицательный контроль — среда культивирования контрольного нетоксигенного штамма коринебактерии дифтерии;
5) 5-АС — 5-аминосалициловая кислота (индикатор);
6) твин-20 — детергент для приготовления промывающего раствора;
7) планшеты полистироловые (обязательно плоскодонные в случае инструментального учета результата) для иммуноферментных реакций одноразового пользования.
источник
Для диагностики in vitro. Набор RIDASCREEN® Diphtherie IgG это
иммуноферментный тест для количественного определения IgG антител к
дифтерийному анатоксину в сыворотке человека. Тест может быть использован
для уточнения иммунного статуса.
- Общая информация и пояснения к тесту
Благодаря тому, что строго соблюдается вакцинирование детей, дифтерия сейчас
– довольно редкое заболевание. После прививки дифтерийным анатоксином,
начинается выработка специфических антител, как ответная реакция иммунной
системы. Иммунологические методы позволяют определять эти антитела в
сыворотке крови. Анатоксин обладает такими же антигенными свойствами, как и
бактериальный токсин, но без токсического эффекта. Поэтому можно определить
и титры пост-вакцинальных IgG, и иммуноглобулинов, появившихся после
выздоровления. Сопоставимость измерений достигается за счёт корректирования
ИФА методов по международным стандартным сывороткам.
- Принцип теста
Дифтерийный анатоксин наносится на микролунки плашки. Антитела,
присутствующие в образце сыворотки пациента, связываются с антигенами и
выявляются во время второй инкубации, при помощи меченных ферментом анти-
человеческих антител (коньюгата). Фермент превращает бесцветный субстрат
(H2O2/TMB) в конечный продукт голубого цвета. Ферментная реакция
останавливается при добавлении серной кислоты, при этом цвет реакционной
смеси меняется из голубого в жёлтый. Окончательное измерение проводится на
плашечном фотометре при длине волны 450 нм с референсным ≥ 620 нм
- Поставляемые реагенты
Состав набора (Компонентов набора достаточно для выполнения 96
определений):
— Плашка 96 лунок: Микротитровальная плашка; 12 микролуночных стрипов (разборных) в стрип-холдере; сорбированные антигеном дифтерийного анатоксина;
— SeroPP 110 мл: Буфер для образцов, готовый к работе; Фосфатно-буферный раствор
NaCl, жёлтого цвета, содержит 0.01% мертиолята и 0.05% твина 20;
— SeroWP 100 мл: Буфер для промывки, 10-х концентрат; трис-буферный раствор NaCl;
содержит 0.2% бронидокса- Л и 0.05% твина 20;
— Контроль IgG + зелёная крышка 2.5 мл: Стандартный контроль IgG, готовый к работе; разбавленная сыворотка человека; зелёного цвета; содержит 0.01% мертиолята, и 0.05 % твина 20;
— Контроль IgG — бесцветная крышка 1.2 мл: Отрицательный контроль IgG, готовый к работе; разбавленная сыворотка человека; содержит 0.01% мертиолята, и 0.05 % твина 20;
— SeroG HD зелёная крышка 12 мл: Коньюгат анти-человеческих IgG (кроличьих), готов к работе; антитела, коньюгированные пероксидазой в стабилизированном белковом растворе; содержит 10 ppm проклина, 0.01% метилизотиазолинона, 0.01% Бромонитродиоксана;
— SeroSC 12 мл: Субстрат; Н2О2/тетраметилбензидин, готовый к работе;
— SeroStop 12 мл: Стоп-реагент; 0.5 М серная кислота, готовая к работе.
- Инструкции по хранению
Набор должен храниться при 2 – 8 °C и может быть использован после
открывания до истечения срока годности, указанного на этикетке. Растворённый
промывочный буфер должен быть использован в течение 4 недель, при условии,
что хранится при 2 — 8°C или в течение 5 дней, если хранится при комнатной
температуре 20 – 25 °C .Гарантия качества не сохраняется после окончания срока
Упаковка из фольги, в которой находятся микроплашки, должна быть открыта
таким образом, чтобы не повредился закрывающий зажим. Неиспользованные
микролунки надо сразу же вернуть назад в эту упаковку, и они должны храниться
в этой упаковке при 2 — 8 °C .
Не следует допускать контаминации реагентов, а бесцветный хромоген должен
быть защищён от попадания прямого света
- Материалы необходимые, но не поставляемые
− дистиллированная или деионизованная вода.
6.2. Дополнительные материалы
− Влажная камера или инкубатор на 37 °C
− Микропипетки на объёмы 10-100 μл и 100-1000 μл
− Плашечный промыватель или многоканальная пипетка
− Плашечный считыватель (450 нм, референсная длина волны ≥ 600 нм)
− Контейнер для отходов с 0.5 % раствором гипохлорита
- Предупреждения для пользователей
Только для диагностики in vitro.
Это тестирование может выполняться только обученным и подготовленным
персоналом. Следует строго соблюдать рекомендации руководств по работе в
медицинских лабораториях и строго придерживаться инструкции по выполнению
Недопустимо пипетировать ртом образцы и реагенты, нельзя допускать контакта с
повреждёнными кожными покровами и слизистыми. При работе с образцами,
обязательно надевать перчатки и по окончании тестирования тщательно мыть
руки. Нельзя курить, принимать пищу и пить в помещении, где работают с
образцами или реагентами для тестирования.
Контрольные сыворотки, входящие в состав набора, были протестированы на
ВИЧ- и ВГС-Aт, а так же на HbsAg и показали отрицательные результаты. Но, тем
не менее, с ними следует обращаться, как с потенциально инфекционным
материалом, т.е. так же, как с образцами пациентов, и соблюдать все меры
предосторожности, согласно местным правилам по работе с инфекционными
Стандартный контроль и отрицательный контроль, а так же буфер для образцов и
промывочный буфер, содержат в качестве консерванта 0.01% мертиолят. Нельзя
допускать, чтобы это вещество попадало на слизистые и кожу.
В состав промывочного буфера в качестве консерванта входит 0.2% бронидокс Л.
Нельзя допускать, чтобы это вещество попадало на слизистые и кожу.
Н2О2 (субстрат) может вызвать ожоги. Поэтому с ним следует обращаться,
соблюдая все меры предосторожности.
Стоп-реагент содержит 0.5 М серную кислоту. Избегайте контакта с кожей и
одеждой. Если стоп-реагент попал на кожу, его необходимо смыть водой.
Все реагенты и материалы, находившиеся в контакте с потенциально
инфекционными образцами, должны быть обработаны доступными
дезинфектантами или автоклавированы при 121 °C в течение 1 часа. ВНИМАНИЕ:
Чтобы предотвратить образование ядовитых газов, все жидкие отходы,
содержащие стоп-реагент, следует нейтрализовать перед тем, как поместить их в
- Сбор и хранение образцов
Данный тест можно применять для образцов сыворотки крови. После взятия
крови, сыворотку необходимо как можно скорее отделить от сгустка, во избежание
гемолиза. До тестирования образцы можно хранить в холоде или
замороженными. Ни в коем случае не допускаются повторные оттаивания и
замораживания образцов и микробная контаминация. Использование образцов
инактивированных нагреванием, или с признаками липемии, гемолиза,
желтушности или мутности, может привести к ложным результатам.
источник
Для диагностики in vitro. Набор RIDASCREEN® Diphtherie IgG это
иммуноферментный тест для количественного определения IgG антител к
дифтерийному анатоксину в сыворотке человека. Тест может быть использован
для уточнения иммунного статуса.
- Общая информация и пояснения к тесту
Благодаря тому, что строго соблюдается вакцинирование детей, дифтерия сейчас
– довольно редкое заболевание. После прививки дифтерийным анатоксином,
начинается выработка специфических антител, как ответная реакция иммунной
системы. Иммунологические методы позволяют определять эти антитела в
сыворотке крови. Анатоксин обладает такими же антигенными свойствами, как и
бактериальный токсин, но без токсического эффекта. Поэтому можно определить
и титры пост-вакцинальных IgG, и иммуноглобулинов, появившихся после
выздоровления. Сопоставимость измерений достигается за счёт корректирования
ИФА методов по международным стандартным сывороткам.
- Принцип теста
Дифтерийный анатоксин наносится на микролунки плашки. Антитела,
присутствующие в образце сыворотки пациента, связываются с антигенами и
выявляются во время второй инкубации, при помощи меченных ферментом анти-
человеческих антител (коньюгата). Фермент превращает бесцветный субстрат
(H2O2/TMB) в конечный продукт голубого цвета. Ферментная реакция
останавливается при добавлении серной кислоты, при этом цвет реакционной
смеси меняется из голубого в жёлтый. Окончательное измерение проводится на
плашечном фотометре при длине волны 450 нм с референсным ≥ 620 нм
- Поставляемые реагенты
Состав набора (Компонентов набора достаточно для выполнения 96
определений):
— Плашка 96 лунок: Микротитровальная плашка; 12 микролуночных стрипов (разборных) в стрип-холдере; сорбированные антигеном дифтерийного анатоксина;
— SeroPP 110 мл: Буфер для образцов, готовый к работе; Фосфатно-буферный раствор
NaCl, жёлтого цвета, содержит 0.01% мертиолята и 0.05% твина 20;
— SeroWP 100 мл: Буфер для промывки, 10-х концентрат; трис-буферный раствор NaCl;
содержит 0.2% бронидокса- Л и 0.05% твина 20;
— Контроль IgG + зелёная крышка 2.5 мл: Стандартный контроль IgG, готовый к работе; разбавленная сыворотка человека; зелёного цвета; содержит 0.01% мертиолята, и 0.05 % твина 20;
— Контроль IgG — бесцветная крышка 1.2 мл: Отрицательный контроль IgG, готовый к работе; разбавленная сыворотка человека; содержит 0.01% мертиолята, и 0.05 % твина 20;
— SeroG HD зелёная крышка 12 мл: Коньюгат анти-человеческих IgG (кроличьих), готов к работе; антитела, коньюгированные пероксидазой в стабилизированном белковом растворе; содержит 10 ppm проклина, 0.01% метилизотиазолинона, 0.01% Бромонитродиоксана;
— SeroSC 12 мл: Субстрат; Н2О2/тетраметилбензидин, готовый к работе;
— SeroStop 12 мл: Стоп-реагент; 0.5 М серная кислота, готовая к работе.
- Инструкции по хранению
Набор должен храниться при 2 – 8 °C и может быть использован после
открывания до истечения срока годности, указанного на этикетке. Растворённый
промывочный буфер должен быть использован в течение 4 недель, при условии,
что хранится при 2 — 8°C или в течение 5 дней, если хранится при комнатной
температуре 20 – 25 °C .Гарантия качества не сохраняется после окончания срока
Упаковка из фольги, в которой находятся микроплашки, должна быть открыта
таким образом, чтобы не повредился закрывающий зажим. Неиспользованные
микролунки надо сразу же вернуть назад в эту упаковку, и они должны храниться
в этой упаковке при 2 — 8 °C .
Не следует допускать контаминации реагентов, а бесцветный хромоген должен
быть защищён от попадания прямого света
- Материалы необходимые, но не поставляемые
− дистиллированная или деионизованная вода.
6.2. Дополнительные материалы
− Влажная камера или инкубатор на 37 °C
− Микропипетки на объёмы 10-100 μл и 100-1000 μл
− Плашечный промыватель или многоканальная пипетка
− Плашечный считыватель (450 нм, референсная длина волны ≥ 600 нм)
− Фильтровальная бумага (лабораторные полотенца)
− Контейнер для отходов с 0.5 % раствором гипохлорита
- Предупреждения для пользователей
Только для диагностики in vitro.
Это тестирование может выполняться только обученным и подготовленным
персоналом. Следует строго соблюдать рекомендации руководств по работе в
медицинских лабораториях и строго придерживаться инструкции по выполнению
Недопустимо пипетировать ртом образцы и реагенты, нельзя допускать контакта с
повреждёнными кожными покровами и слизистыми. При работе с образцами,
обязательно надевать перчатки и по окончании тестирования тщательно мыть
руки. Нельзя курить, принимать пищу и пить в помещении, где работают с
образцами или реагентами для тестирования.
Контрольные сыворотки, входящие в состав набора, были протестированы на
ВИЧ- и ВГС-Aт, а так же на HbsAg и показали отрицательные результаты. Но, тем
не менее, с ними следует обращаться, как с потенциально инфекционным
материалом, т.е. так же, как с образцами пациентов, и соблюдать все меры
предосторожности, согласно местным правилам по работе с инфекционными
Стандартный контроль и отрицательный контроль, а так же буфер для образцов и
промывочный буфер, содержат в качестве консерванта 0.01% мертиолят. Нельзя
допускать, чтобы это вещество попадало на слизистые и кожу.
В состав промывочного буфера в качестве консерванта входит 0.2% бронидокс Л.
Нельзя допускать, чтобы это вещество попадало на слизистые и кожу.
Н2О2 (субстрат) может вызвать ожоги. Поэтому с ним следует обращаться,
соблюдая все меры предосторожности.
Стоп-реагент содержит 0.5 М серную кислоту. Избегайте контакта с кожей и
одеждой. Если стоп-реагент попал на кожу, его необходимо смыть водой.
Все реагенты и материалы, находившиеся в контакте с потенциально
инфекционными образцами, должны быть обработаны доступными
дезинфектантами или автоклавированы при 121 °C в течение 1 часа. ВНИМАНИЕ:
Чтобы предотвратить образование ядовитых газов, все жидкие отходы,
содержащие стоп-реагент, следует нейтрализовать перед тем, как поместить их в
- Сбор и хранение образцов
Данный тест можно применять для образцов сыворотки крови. После взятия
крови, сыворотку необходимо как можно скорее отделить от сгустка, во избежание
гемолиза. До тестирования образцы можно хранить в холоде или
замороженными. Ни в коем случае не допускаются повторные оттаивания и
замораживания образцов и микробная контаминация. Использование образцов
инактивированных нагреванием, или с признаками липемии, гемолиза,
желтушности или мутности, может привести к ложным результатам.
источник
| Классы МПК: | G01N33/53 иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого |
| Автор(ы): | Мельникова А.В. , Железникова Г.Ф. , Иванова В.В. |
| Патентообладатель(и): | Научно-исследовательский институт детских инфекций |
| Приоритеты: |