Вакцина против бруцеллеза для овец

агропромышленного комитета СССР

ПО ПРИМЕНЕНИЮ ВАКЦИНЫ ЖИВОЙ СУХОЙ ИЗ ШТАММА РЕВ-1

БРУЦЕЛЛА МЕЛИТЕНЗИС ДЛЯ ИММУНИЗАЦИИ ОВЕЦ И КОЗ ПРОТИВ

БРУЦЕЛЛЕЗА И БАРАНОВ ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО ЭПИДИДИМИТА,

ВЫЗЫВАЕМОГО ВОЗБУДИТЕЛЕМ БРУЦЕЛЛА ОВИС

1.1. Вакцину из штамма Рев-1 бруцелла мелитензис применяют для профилактической иммунизации против бруцеллеза маточного поголовья овец и коз в колхозах, совхозах, других сельскохозяйственных предприятиях, занятых разведением мелкого рогатого скота, и в личных подсобных хозяйствах граждан, а также против инфекционного эпидидимита баранов, вызываемого возбудителем бруцелла овис, в комплексе мер, предусмотренных действующей инструкцией по борьбе с бруцеллезом животных.

1.1.1. Перечень автономных республик, краев, областей и районов, в которых допускается применение указанной вакцины для иммунизации животных, устанавливают главные управления (управления) ветеринарии госагропромов союзных республик.

1.1.2. Прививки животных вакциной из штамма Рев-1 разрешается проводить ветеринарным врачам и ветеринарным фельдшерам под контролем ветврача.

Главные ветеринарные врачи районов обязаны проводить обучение ветеринарных специалистов хозяйств и учреждений государственной ветеринарной сети правилам проведения прививок вакциной животных.

1.2. Сухая живая вакцина готовится из слабовирулентного штамма Рев-1 бруцелла мелитензис.

Вакцина представляет собой мелкозернистую массу светло-коричневого или серовато-желтого цвета. Выпускается в ампулах, запаянных под вакуумом и уложенных в коробки.

1.3. На каждой ампуле с вакциной должна быть надпись с указанием наименования вакцины, номера серии, срока годности и количества доз препарата. Ампулы с вакциной, не имеющие указанной надписи, а также разбитые, с трещинами, содержащие посторонние примеси или плесень, утратившие вакуум, с истекшим сроком годности препарата, упакованные в коробки без этикеток, бракуют, вскрывают и обеззараживают кипячением в течение 30 мин.

1.4. На этикетках коробок с вакциной должны быть указаны: наименование вакцины, наименование и товарный знак биопредприятия, изготовившего вакцину, номер серии и номер госконтроля, дата изготовления, срок годности, количество ампул в коробке и количество доз в ампуле, условия хранения вакцины и обозначение ТУ.

В каждую коробку должно быть вложено наставление по применению вакцины.

1.5. Вакцина в ампулах под вакуумом пригодна для применения в течение 12 мес. со дня ее изготовления при условии хранения в холодильных камерах или в темном сухом помещении при температуре 2 — 10 °С. При хранении сухой вакцины при температуре выше 10 °С качество (активность) ее не гарантируется и применение не разрешается. В жаркое время года вакцину доставляют к месту применения в термочемоданах или термосах со льдом.

1.6. Перед применением сухую вакцину разводят специальным растворителем для сухих живых вакцин против бруцеллеза. При отсутствии такого растворителя допускается использование физиологического раствора. Разведение готовят из расчета, чтобы одна прививочная доза для животных составляла 2 мл разведенной вакцины. Для этого шейку ампулы в верхней части протирают смоченной спиртом ватой и обламывают стекло. В ампулу шприцем с иглой вносят 4 мл растворителя, осторожно встряхивают до превращения массы в равномерную взвесь.

Разведенную в ампуле вакцину шприцем с длинной иглой отсасывают и переносят во флакон емкостью 500 — 1000 мл с предварительно налитым в него растворителем. С учетом жидкости, использованной для растворения вакцины, во флаконе должно быть столько растворителя, сколько требуется для приготовления необходимого количества доз вакцины в разведенном виде для прививки животных.

Растворитель (физраствор), флаконы, шприцы, иглы, используемые для приготовления вакцины к применению, должны быть стерильными.

1.7. Приготовленную для применения вакцину защищают от прямого солнечного света и используют через 30 мин. после разведения в течение не более 4 ч. Остатки разведенной вакцины уничтожают путем кипячения в течение 30 мин. Обеззараживанию кипячением подлежат также ампулы и флаконы из-под использованной вакцины, шприцы и иглы.

1.8. Вакцину животным вводят подкожно в бесшерстное место за локтевым суставом. Для прививки каждого животного используют отдельную, предварительно простерилизованную иглу. Шприцы и иглы стерилизуют кипячением. Во время прививок допускается стерилизация игл путем протирания их спиртом. Место введения вакцины протирают 70-процентным этиловым спиртом или 0,5-процентным раствором фенола.

1.9. Иммунитет против бруцеллеза и инфекционного эпидидимита у животных наступает через 3 нед. и сохраняется в течение не менее 2 лет после первичной прививки их вакциной.

1.10. Запрещается проводить прививки вакциной мелкого рогатого скота в период вспышки в хозяйстве (на ферме) острой инфекционной болезни (сибирская язва, ящур, пастереллез и др.), а также племенных животных, отобранных в благополучных по бруцеллезу хозяйствах к продаже на племенные цели хозяйствам других областей, краев и республик.

1.11. При проведении прививок животных вакциной прекращают применение антибиотиков (в лечебных и профилактических целях) в сроки:

непролонгированных препаратов: бензилпенициллина, эритромицина, олеамдомицина — за сутки; хлортетрациклина, окситетрациклина, тетрациклина, левомицетина, полимиксина — за 3 сут.; стрептомицина, канамицина, неомицина, мономицина — за 7 сут. до вакцинации;

пролонгированных антибиотиков: бициллина — за 6 сут.; дитетрациклина — за 25 и дибиомицина — за 30 сут. до вакцинации;

любые антибиотики — в течение 15 сут. после вакцинации животных.

1.12. Каждое вакцинированное животное метят путем выщипа круглого отверстия в основании правого уха. Их берут на учет и за ними устанавливают наблюдение в течение 10 дней, имея в виду, что у привитых животных может повыситься температура тела, иногда отмечается кратковременная хромота.

1.13. Проведение вакцинации животных по каждой отаре оформляют актом, в котором указывают наименование хозяйства, фермы, номер отары, ее эпизоотическое состояние в отношении бруцеллеза или инфекционного эпидидимита, количество, пол и возраст вакцинированных животных, наименование предприятия, изготовившего вакцину, номер серии, дату изготовления и срок годности препарата. Один экземпляр акта направляют главному ветеринарному врачу района, другой хранят в хозяйстве.

1.14. В случае осложнений у животных применение вакцины данной серии прекращают и в соответствии с указанием Главного управления ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР от 3 сентября 1982 г. N 116-6а направляют с нарочным, соблюдая режим хранения, 2 — 3 невскрытых ампулы с вакциной из серии, вызвавшей осложнения, во Всесоюзный государственный научно-контрольный институт ветеринарных препаратов (123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5). В сопроводительном документе указывают количество вакцинированных животных, дату прививки, характер осложнений.

2.1. Вакцину из штамма Рев-1 применяют для прививки овец и коз против бруцеллеза в хозяйствах областей, краев, республик (без областного деления), неблагополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота. В особых случаях с разрешения главных управлений (управлений) ветеринарии госагропромов союзных республик допускается проводить прививку этой вакциной овец и коз в благополучных хозяйствах районов, непосредственно граничащих с неблагополучными территориями.

2.2. Ярок и козочек во всех хозяйствах (неблагополучных или благополучных по бруцеллезу) прививают вакциной первый раз в возрасте 3 — 5 мес. без исследования их на бруцеллез. Животных, не привитых в указанном возрасте по каким-либо причинам, иммунизируют этой же вакциной, но не позднее чем за 2 мес. до осеменения.

2.2.1. Вакцинированный молодняк формируют в отдельные отары и содержат обособленно от взрослого поголовья. Пополнение привитыми ярками (козочками) отар взрослых овец (коз), неблагополучных по бруцеллезу, запрещается.

2.2.2. В дальнейшем животных реиммунизируют вакциной из штамма Рев-1 1 раз в 2 года за 2 мес. (не позднее) до осеменения.

В благополучных по бруцеллезу хозяйствах реиммунизацию овец (коз) проводят без исследования животных на эту болезнь.

2.3. В неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах, где вакцина из штамма Рев-1 применялась только для иммунизации молодняка, всех овцематок (козоматок) отар с острым течением болезни (аборты, массовое выделение реагирующих) сдают на убой. Поголовье овец, коз (если животные не были привиты вакциной из штамма 19) других отар данного хозяйства однократно исследуют на бруцеллез (аллергически или серологически РА и РДСК). Реагирующих удаляют, нереагирующих овец (коз) прививают вакциной из штамма Рев-1 (проводят первую реиммунизацию этой вакциной, но не ранее чем через год после первичной прививки животных).

Через 2 года после реиммунизации овец (коз) исследуют на бруцеллез однократно серологически (РБП или РСК). При отсутствии клинических проявлений бруцеллеза у животных и получении отрицательных результатов исследования отару считают оздоровленной от бруцеллеза. В случае выделения реагирующих их удаляют из отары. Всех животных с отрицательными реакциями вновь реиммунизируют вакциной из штамма Рев-1 и далее с ними поступают, как указано в настоящем абзаце выше.

2.4. Овец (коз), привитых вакциной из штамма Рев-1, можно исследовать на бруцеллез в следующие сроки:

животных, привитых однократно в возрасте 3 — 5 мес., — не ранее чем через год после вакцинации;

животных, привитых однократно переярками, и овец (коз), подвергавшихся реиммунизации (см. подпункты 2.2, 2.2.2 и 2.3), — не ранее чем через 2 года после последней вакцинации.

Для исследования животных на бруцеллез применяют серологические реакции: РБП или РСК.

На инфекционную болезнь, вызываемую возбудителем бруцелла овис, овец можно исследовать (РДСК) в любые сроки после прививки вакциной из штамма Рев-1.

В порядке контроля за состоянием поголовья овец (коз) по бруцеллезу в благополучных и оздоравливаемых хозяйствах ежегодно исследуют на бруцеллез баранов-производителей (аллергическим и серологическим методами) и маток, оставшихся без приплода, а также абортировавших. Абортированные плоды и другой материал от животных направляют в ветеринарную лабораторию для бактериологического и биологического (биопроба) исследований. По результатам этих исследований судят о состоянии по бруцеллезу каждой отары хозяйства.

2.5. В личных подсобных хозяйствах граждан прививкам против бруцеллеза вакциной из штамма Рев-1 подвергают только ярок (козочек). При проведении иммунизации соблюдают требования и условия, указанные в настоящем Наставлении (см. подпункты 1.12 — 1.14, 2.1, 2.2, 2.4).

2.6. Перед снятием ограничений с неблагополучной по бруцеллезу мелкого рогатого скота фермы (отделения, хозяйства) исследуют серологическим методом (РБП или РСК) на бруцеллез всех овец и коз (в том числе подвергавшихся иммунизации вакциной из штамма Рев-1), находящихся на их территории. Ограничения снимают только после получения отрицательных результатов исследований и выполнения мероприятий, предусмотренных инструкцией по борьбе с бруцеллезом животных.

В хозяйствах, в которых проводили иммунизацию и реиммунизацию овец (коз) вакциной из штамма 19, перед снятием ограничений все такое поголовье должно быть сдано на убой.

2.7. При оздоровлении всех хозяйств в районе вакцинацию взрослых овец (коз) прекращают, а иммунизацию ярок (козочек) проводят до устранения угрозы заражения животных бруцеллезом.

2.8. В хозяйствах, где имеются взрослые овцы (козы), ранее привитые вакциной из штамма 19 (до выхода настоящего Наставления ), овцематок (козоматок) на бруцеллез не исследуют, их ежегодно ревакцинируют вакциной из штамма 19, содержат обособленными отарами и по мере хозяйственной выбраковки сдают на убой. Вводить в такие отары животных, привитых или не привитых вакциной из штамма Рев-1, категорически запрещается. Полученный в хозяйствах молодняк прививают вакциной из штамма Рев-1 в порядке, как указано в подпунктах 2.2 — 2.2.3.

С 1 января 1987 г. прививка вакциной из штамма 19 овец (коз), ранее не подвергавшихся иммунизации этой вакциной, категорически запрещается.

3.1. Вакцину из штамма Рев-1 применяют в хозяйствах, неблагополучных по инфекционному эпидидимиту баранов, расположенных в областях (краях) и районах, где применяют эту вакцину для иммунизации овец (коз) против бруцеллеза.

3.2. Вакциной иммунизируют только баранчиков, отобранных в благополучных по ИЭ маточных отарах и оставленных в данном хозяйстве для ремонтных целей. Вакциной прививают животных только 1 раз в возрасте 3 — 8 мес.

Не подлежат прививкам вакциной бараны:

отобранные в благополучных по бруцеллезу и ИЭ маточных отарах для продажи на племенные цели другим хозяйствам или племпредприятиям;

вновь поступившие в данное хозяйство в возрасте старше 8 мес.;

на станциях (пунктах) по искусственному осеменению животных и других племпредприятиях.

3.3. Перед иммунизацией баранчиков исследуют на инфекционный эпидидимит серологически (РДСК) и на бруцеллез серологически (РБП или РА и РДСК) и аллергически. Реагирующих животных и баранчиков с клиническими признаками эпидидимита выбраковывают для откорма. Остальных животных иммунизируют.

3.4. Вакцинированных баранов можно исследовать на инфекционный эпидидимит (РДСК) в любые сроки, а на бруцеллез серологически (РБП или РА и РСК) не ранее чем через 12 мес. после вакцинации, но обязательно проверяют на эти болезни перед использованием животных в случной кампании.

3.4.1. При выделении реагирующих баранов при исследовании их на ИЭ всех животных данной группы проверяют (РДСК) на эту болезнь через каждые 30 дней до получения 2-кратных подряд отрицательных результатов по группе и затем оставляют под контрольным наблюдением на 6 мес., в течение которых их исследуют 2 раза.

При получении отрицательных результатов исследования и отсутствии клинических признаков болезни у животных группу признают оздоровленной, баранов допускают к использованию в воспроизводстве.

3.4.2. Если при исследовании выделены животные с положительными реакциями на бруцеллез, группу продолжают исследовать каждые 30 дней серологическими (РБП или РСК) и аллергическим методами и далее с животными поступают в порядке, как указано в подпункте 3.4.1.

3.4.3. Реагирующих животных при исследовании на бруцеллез или ИЭ выбраковывают для откорма.

3.5. В хозяйствах, где применяют вакцину из штамма Рев-1 для иммунизации баранчиков против инфекционного эпидидимита, проводят весь комплекс ветеринарных, санитарных, организационно-хозяйственных и других мероприятий по борьбе с этой болезнью, предусмотренных действующей «Инструкцией о мероприятиях по профилактике и ликвидации бруцеллеза животных».

С утверждением настоящего Наставления утрачивает силу «Наставление по применению вакцины живой сухой из штамма Рев-1 бруцелла мелитензис против бруцеллеза мелкого рогатого скота», утвержденное Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 29 марта 1983 г.

Ассоциация содействует в оказании услуги в продаже лесоматериалов: доска обрезная по выгодным ценам на постоянной основе. Лесопродукция отличного качества.

источник

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к изготовлению вакцины против бруцеллеза мелкого рогатого скота.

В настоящее время для профилактики бруцеллеза овец и коз широко используют вакцину, изготовленную из штамма Brucella melitensis Rev-1.

Выращивание штамма Rev-1 при изготовлении вакцины проводят на триптиказо-соевом агаре, агаре Альбими, сывороточно-декстрозном агаре (см. Дж. Альтон, Л.М. Джонс «Методы лабораторных исследований по бруцеллезу», ВОЗ, Женева, 1968, стр. 77-79). Ингредиенты, входящие в первые две среды, в нашей стране не выпускают, а применение агара-заменителя Альбими в производстве вакцины нерационально из-за недостаточного выхода бакмассы. На других питательных средах (печеночные, мясные, картофельные среды, эритритагар, агар Д и т.д.), применяемых для культивирования бруцелл (см. кн. “Бруцеллез”, под ред. П.А. Вершиловой, М., 1961, стр. 208-210), штамм Rev-1 растет плохо и диссоциирует.

Известен способ получения живой вакцины из штамма В.melitensis Rev-1, заключающийся в выращивании его на сывороточно-декстрозном агаре на основе мясо-пептонного бульона (см. Производство вакцины Rev-1. G.G. Alton WHO/Bruc. 70.321; Питательная среда для изготовления вакцины из штамма B.melitensis Rev-1. Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротестсистем. Мат. междунар. науч. конф., посвящ. 70-летию НПО «Питательные среды», Махачкала, 1998, с. 116-117). Недостатком данного способа является необходимость добавления в питательную среду перед засевом культуры бруцелл штамма Rev-1 до 10% стерильной сыворотки крови животных, а также то, что основой среды служат мясной бульон и пептон.

Изготовление питательной среды на основе высокоценного пищевого продукта — мяса экономически не оправдано, а добавление дефицитной и дорогостоящей сыворотки крови, помимо экономической нецелесообразности, вызывает дополнительные трудности, связанные со стерильным внесением ее в готовую среду и возможностью загрязнения вакцины посторонней микрофлорой.

Целью настоящего изобретения является разработка способа изготовления живой вакцины против бруцеллеза овец и коз из штамма Rev-1, состоящей из типичных для данного штамма однородных клеток бруцелл в S-форме и не имеющей диссоциированных микроорганизмов с использованием питательной среды, изготовленной из непищевого сырья и без добавления сыворотки крови животных.

Поставленная цель достигается тем, что для изготовления вакцины с целью увеличения выхода микробной массы и во избежание диссоциации бруцелл, культуру штамма В.melitensis Rev-1 выращивают на питательной среде, основой которой является панкреатический гидролизат казеина с добавлением в качестве источника витаминов и других ростовых факторов экстракта кормовых или хлебных дрожжей.

Питательная среда состоит из равных объемов панкреатического гидролизата казеина глубокой степени расщепления и экстракта дрожжей, разведенных после смешивания дистиллированной водой до содержания аминного азота 110-130 мг % с добавлением 0,5% хлористого натрия, 1% глюкозы, 2% глицерина и 2-3,5% агар-агара. При выращивании на такой питательной среде достигается лучший рост бруцелл штамма Rev-1, больший выход бактериальной массы без диссоциированных клеток и обладающий лучшей жизнеспособностью, а также высокими иммуногенными свойствами.

Приготовление гидролизата казеина

Сухой казеин в количестве 1 кг заливают 10 литрами теплой дистиллированной воды, подщелачивают до рН — 8,5-9,0 и оставляют на несколько часов для разбухания. Затем при постоянном перемешивании подогревают до 80-90°C и температуру в этих пределах поддерживают до растворения казеина. В процессе растворения казеина рН смеси снижается, и поэтому периодически добавляют 20% раствор щелочи (NaOH) для поддержания рН на уровне 8,5-9,0 до полного растворения казеина.

Полученный раствор остужают до 45°C и к нему добавляют 50-100 г в зависимости от активности, панкреатина или же фарш поджелудочной железы крупного рогатого скота в количестве 0,5-1 кг.

Гидролиз проводят в течение 3-4 часов при температуре 45°C при постоянном перемешивании, поддерживая рН на уровне 8,5-9,0. Содержание аминного азота в готовом гидролизате должно быть 600-800 мг %.

При медленном гидролизе и содержании аминного азота менее 600 мг % панкреатин добавляют повторно.

По достижении аминного азота до 600-800 мг % гидролиз прекращают добавлением 100-120 мг уксусной кислоты.

Гидролизат кипятят в течение 10 минут, после чего его охлаждают и оставляют до следующего дня для отстаивания.

Отстоявшийся гидролизат декантируют и фильтруют через ватно-марлевой фильтр.

Приготовление экстракта дрожжей

Берут 1 кг светлых сортов кормовых или прессованных пекарских дрожжей и добавляют к ним 10 литров дистиллированной воды. Смесь тщательно перемешивают, кипятят в течение 10-15 минут и в горячем виде фильтруют до прозрачности.

Приготовление питательной среды

Для изготовления среды смешивают панкреатический гидролизат казеина и экстракт дрожжей в равных количествах и разводят дистиллированной водой до содержания аминного азота 110-130 мг %.

Смесь подогревают и после закипания к ней добавляют предварительно вымоченный в воде в течение 12 часов Корсаковский агар-агар высшего или первого сорта из расчета 3-3,5% для четвертей или матровых колб и 2% для пробирок и чашек.

После полного расплавления агар-агара в среду вносят 0,5% хлористого натрия, 1% глюкозы и 2% глицерина, доводят рН до 7,2-7,3 и, периодически перемешивая, ее кипятят еще 10-15 минут. Затем питательную среду фильтруют через ватный или полотняный фильтр, разливают в матровые колбы, четверти или другие необходимые емкости и стерилизуют при температуре 110-112°C в течение 30 минут.

После стерилизации матровые колбы ставятся в горизонтальном положении для застывания агара, а четверти обкатывают для распределения питательной среды по всей их внутренней поверхности.

До засева вакцинной культуры питательную среду в колбах, четвертях, чашках и пробирках выдерживают в течение 48 часов при температуре 37°C для подсушивания поверхности и контроля стерильности.

Выращивание культуры Rev-1 для получения вакцины проводят на вышеуказанной питательной среде в матровых колбах, четвертях, пробирках или других емкостях.

Для засева серии вакцинной культуры проводят предварительную расплодку штамма в пробирках, матровых колбах или четвертях.

Вначале производственный штамм Rev-1 засевают в пробирки на косой агар. Берут одну пробирку 3-4-суточного роста эталонной культуры, разводят стерильным буферным раствором рН 6,6-6,8 так, чтобы получилась концентрация 10 -6 и 10 -7 .

Из каждого разведения 0,1 мл культуры штамма засевают по 3 бактериологические чашки.

Через 5 суток выращивания в термостате при температуре 37°C чашки просматривают на чистоту и типичность роста культуры, проверяют морфологию клеток и на диссоциацию методом окраски колоний по Уайт -Уильсону.

При отсутствии диссоциации из неокрашенных, бактериологических чашек отбирают типичные колонии, которые отсевают на пробирки с косым агаром. После выдерживания посевов в течение 48 часов в термостате при температуре 37°C и проверки на чистоту культуру пересевают на требуемое количество пробирок с той же питательной средой. Пробирки выдерживают в течение 48 часов при температуре 37°C. Из этих пробирок получают рабочие культуры штамма Rev-1, используемые для засева очередных серий вакцины.

Пробирки с рабочей культурой штамма Rev-1 хранят в запаянном виде в холодильнике при температуре +4-8°С и пригодны для использования в течение 30 дней.

Для получения взвеси клеток с целью засева серии вакцины необходимо рабочие культуры размножить в нужном количестве в пробирках, матровых колбах или четвертях, смыть стерильным, забуферным (рН 6,6-6,8) физраствором так, чтобы получилась концентрация 2-3 млрд микробов, тел в 1 мл по оптическому бруцеллезному стандарту мутности. Такой расплодкой в количестве 4-5 мл засевают матровые колбы (матрасы) или четверти данной серии.

Выращивание культуры B. melitensis Rev-1 для получения вакцины на вышеуказанной питательной среде проводят в течение 72 часов при температуре 37°С. Выросшую вакцинную культуру, с поверхности агара, смывают средой высушивания.

Среду высушивания готовят следующим образом: в 1 литре кипящей дистиллированной воды растворяют 15 г желатина, после ее растворения добавляют 100 г сахарозы. Затем кипятят 5-6 минут, доводят рН до 7,2-7,3, фильтруют через полотняный фильтр, стерилизуют при 1 атмосфере 30 минут. После стерилизации среда должна иметь рН 6,8-7,0.

В каждую колбу или четверть вводят такое количество среды высушивания, чтобы концентрация бакмассы была в пределах 80-140 млрд микробных тел в 1 мл.

Суспензию бруцелл, полученную из колб или четвертей сливают в общую бутыль. После проверки на чистоту и диссоциацию расфасовывают в ампулы по 2 или 4 мл и подвергают лиофильной сушке.

Предлагаемый способ изготовления вакцины обеспечивает, по сравнению с существующим, увеличение выхода препарата в 1,2-1,3 раза. Полученная при этом вакцина состоит из однородных клеток в S-форме, типичной для штамма Rev-1 морфологии, и не имеющих признаков диссоциации.

Предлагаемая питательная среда, изготовленная на основе панкреатического гидролизата казеина и экстракта дрожжей, разлитая по 250,0 мл в 10 матровых колб, была испытана для изготовления живой вакцины против бруцеллеза овец и коз из штамма B. melitensis Rev-1.

Для сравнения результатов культуру штамма B. melitensis Rev-1 для изготовления вакцины выращивали и на сывороточно-декстрозном агаре на основе мясо-пептонного бульона с добавлением 10% стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота. Данную питательную среду разливали в матровые колбы также по 250,0 мл в каждую колбу. Засевали культурой B. melitensis Rev-1 10 матровых колб со средой.

Культуру B. melitensis Rev-1 на обеих питательных средах выращивали при температуре 36-37°С в течение 72 часов. Основные данные, характеризующие результаты использования обеих питательных сред для выращивания штамма B. melitensis Rev-1 и изготовления из этого штамма вакцины против бруцеллеза овец и коз, представлены в следующей таблице.

Таблица. Основные результаты выращивания культуры штамма Brucella melitensis Rev-1 для получения бакмассы и изготовления вакцины против бруцеллеза овец и коз при использовании испытуемой питательной среды (новый вариант) и ранее применявшейся питательной среды (старый вариант).

Таким образом, в результате проведенных исследований по испытанию предлагаемой нами питательной среды, изготовленной на основе панкреатического гидролизата казеина и экстракта хлебных дрожжей, установлены пригодность данной среды и целесообразность ее применения для выращивания штамма B. melitensis Rev-1 при изготовлении из этого штамма живой вакцины против бруцеллеза овец и коз. При этом показано, что применение указанной питательной среды позволяет получить бакмассу бруцелл штамма Rev-1 типичной для данного штамма морфологии в S-форме, не содержащую диссоциированных микробных клеток и 1,2 раза больше, чем при применении сывороточно-декстрозного агара, изготовленного на основе мясопептонного бульона с добавлением 10% сыворотки крови крупного рогатого скота.

Способ изготовления вакцины против бруцеллеза мелкого рогатого скота, включающий посев и выращивание бруцелл штамма B. melitensis Rev-1 на питательной среде, состоящей из равных объемов панкреатического гидролизата казеина глубокой степени расщепления и экстракта дрожжей, разведенных после смешивания дистиллированной водой до содержания аминного азота 110-130 мг % с добавлением 0,5% хлористого натрия, 1% глюкозы, 2% глицерина и 2-3,5% агар-агара, их смыв, разбавление средой высушивания до содержания 80-140 млрд микробных клеток в 1 мл, расфасовку в ампулы и лиофильную сушку.

источник

Исследования по изучению эффективности моновакцины из штамма К-24 МВБ-формы Br. melitensis были проведены в г. Волгограде (П. А. Триленко, П. Г. Тивелев, Д. И. Субботин, Т. В. Фоменко, 1965).

Проведенные исследования дали парадоксальный результат. Вакцина из штамма К-24, не вызывающая при подкожном введении появления у овец диагностируемых бруцеллезных S-антител, оказалась более иммуногенной, чем «полноценная» вакцина из штамма № 19. В связи с этим было проведено аналогичное исследование на 180 ярках (П. А. Триленко, Ф. Г. Баландин, Т. Ф. Фоменко, Д. И. Цицулин, 1967).

Ярки, полученные от здоровых овец из благополучного по бруцеллезу хозяйства, были разбиты по принципу аналогов на три группы.

1-я группа состояла из 70 ярок, которых вакцинировали подкожно живой вакциной из штамма К-24 в дозе 30 млрд. микробных тел.

2-я группа состояла также из 70 ярок, которых вакцинировали живой сухой вакциной из штамма № 19 (серия № 825), согласно наставлению по ее применению.

3-я грууппа включала 40 ярок, которых не вакцинировал и (контроль). Через 2 и 4 мес после вакцинации подопытные группы были обследованы на бруцеллез по РА, РСК и аллергии. Ярок 1-й и 2-й групп через 123 дня после вакцинации ревакцинировали соответствующими вакцинами по той же методике и теми же дозами, что и при первой вакцинации. Обследовали ярок после ревакцинации через 42, 76 и 214 дней.

Через 6 мес после ревакцинации ярок случали со здоровыми баранами, а через 8 мес заражали вирулентной культурой Br. melitensis штамма № 2506 (ГНКИ) в дозе 100 тыс. микробных тел. К заражающей дозе культуры добавляли 1 мл изотопического раствора хлорида натрия, после чего ее вводили подкожно в подчелюстное пространство однократно.

После заражения ярок обследовали 3 раза по РА и РСК через 15, 30 и 60 дней.

При изучении иммуногенных свойств вакцины из штамма К-24 было установлено, что она выгодно отличается от других вакцин, применяемых в производстве.

Неагглютиногенная вакцина из штамма К-24 оказалась наиболее иммуногенной по сравнению со слабоагглютиногенными вакцинами из штаммов № 56, Невский 12 и др. Из 7 вакцин только вакцина из штамма К-24 не вызывает в организме привитых овец образования S-антител, диагностируемых по РА и РСК (РДСК) со стандартными биофабричными антигенами. В этом ее преимущество перед всеми остальными указанными выше вакцинами.

Необходимо подчеркнуть, что в острых опытах не могла быть проявлена и учтена главная особенность инагглютиногенной вакцины из штамма К-24 — свойство провоцировать скрытую инфекцию у бруцеллоносителей и таким образом создавать после прививок возможность их выявления по результатам исследования по РА и РСК со стандартными антигенами.

Эффективность применения вакцины из штамма К-24 для оздоровления отар от бруцеллеза изучалась в хозяйстве, неблагополучном по бруцеллезу в предыдущие годы. Здесь планировалась вакцинация ярок в 2—3-месячном возрасте. Для сопоставления данных параллельно одну отару овец вакцинировали вакциной из штамма № 19 по методике, изложенной в наставлении, вторую отару, контрольную, вакциной не прививали.

Через год ярок ревакцинировали теми же вакцинами и в той же дозе.

Данные полевого опыта показали, что применение вакцины из штамма К-24 для двукратной вакцинации ярок, родившихся в неблагополучных по бруцеллезу отарах, позволяет добиться оздоровления ягнят уже в первом поколении.

При этом критерием оздоровления являлись следующие показатели: отсутствие абортов бруцеллезного происхождения и реагирующих на бруцеллез по РА и РСК, т. е. критерий такой, который принят для непривитых отар.

Ввиду получения удовлетворительных результатов в первом производственном опыте по применению вакцины из штамма К-24 было подобрано для оздоровления хозяйство с максимально тяжелой эпизоотической обстановкой по бруцеллезу овец (П. А. Триленко, В. Я. Фишбейн, Ф. Г. Баландин, А. С. Гуков, Т. В. Фоменко, 1971).

Клинический бруцеллез в хозяйстве возник в 1963 г. Во 2-м отделении хозяйства из обследованных 930 овцематок было выделено реагирующих на бруцеллез по РА и РСК 270 овец, по аллергии (внутрикожная проба бруцеллогидролизатом) реагировали 343 овцы. Здесь возникли и приобрели массовый характер аборты бруцеллезного происхождения. Аналогичная картина была в 3, 4 и 6-м отделениях, и только в 1-м отделении инфекция находилась в начальном периоде своего развития.

Оздоровление этого хозяйства с применением вакцины из штамма К-24 начато при эпизоотической обстановке.

Бруцеллезная инфекция была зарегистрирована у овец и коз, принадлежащих рабочим и служащим хозяйства.

Оздоровление отделений и хозяйства в целом проводили по следующей схеме.

1. Всех ярок в 2,5—3,5-месячном возрасте в 3, 4 и 5-м отделениях вакцинировали вакциной из штамма К-24 в дозе 30 млрд. микробных тел подкожно. Исследования овец перед вакцинацией не проводили, ярки в 5—6-месячном возрасте из этих трех отделений были собраны в одну отару, а овцы, как бруцеллезные, сданы на мясо.

2. В 1-м отделении вакцинировали всех овцематок, переярок и ярок.

3. В дальнейшем всех привитых овец и ярок ревакцинировали через год после прививок. Родившихся ягнят из всех отар прививали вакциной из штамма К-24 и ревакцинировали через год.

4. Обследование по РА и РСК на бруцеллез производили после каждой прививки с удалением из отар животных, реагирующих положительно и сомнительно.

5. Начиная с 1965 г. всех овец и коз, имевшихся у населения в зоне проводимых оздоровительных мероприятий, стали прививать вакциной из штамма К-24 и обследовать по изложенной выше схеме. Через 2 года после применения двукратной прививки вакциной из штамма К-24 все хозяйства были оздоровлены от бруцеллеза.

Большой интерес представляют результаты изучения возможностей использования вакцины из штамма К-24 для первичной прививки ягнят, находящихся вместе со своими матерями в отарах, в которых были массовые аборты бруцеллезного происхождения. Перед первой прививкой ярок не обследовали. Через 40 дней после прививки было выделено 83 ярки, реагирующие по РА или РСК. После ревакцинации, проведенной через 9—10 мес с момента первой прививки, ярок обследовали через 82 дня и через 6,5 мес. За 2 исследования было выделено 40 реагирующих ярок. Через год после ревакцинации реагировала только 1 овца по РСК. Всего выделено до оздоровления 123 ярки, или 13,4%.

Необходимо подчеркнуть, что после прививки, т. е. с осени 1964 г., в отарах не было зарегистрировано ни одного аборта бруцеллезного происхождения до конца их хозяйственного использования. Ярки, родившиеся от первично привитых овцематок, не реагировали на бруцеллез.

Наблюдение за привитыми овцами и их обследование продолжалось до 1969 г. К указанному сроку в хозяйстве имелось 4215 овец. В 1969 г. из указанного количества реагировали 2 овцы и только по РСК, обе они из отары, где овец первично прививали после первого окота. Кроме того, в этой отаре имелось в 1969 г. 75 овцематок, реагирующих положительно по аллергии. В других же отарах были лишь единицы реагирующих по аллергии. В 1970 г. всех овец, реагирующих на бруцеллез по аллергии, и двух, реагирующих по РСК, убили и обследовали бактерилогически. Культуры бруцелл выделены не были ни в одном случае.

На основании результатов проведенных исследований можно сделать следующие выводы.

1. Вакцина из штамма К-24 в остром очаге клинического бруцеллеза способствовала выявлению бруцеллоносителей в оздоравливаемых отарах. В этом случае проявилось ее диагностическое значение, так как после прививок возникала специфическая провокация бруцеллеза у скрытых бруцеллоносителей, которых в последующем выявляли методом РА и РСК и удаляли из отары.

2. Иммунитет, создаваемый вакциной из штамма К-24 у ярок, переярок и овец, предохраняет их от заражения бруцеллезом в очаге инфекции. Применение ее одновременно способствует удалению из оздоравливаемых отар больных бруцеллезом овец и ягнят, обнаруженных после вакцинации.

3. Оздоровление отар ярок, прививаемых первично под матками в 2,5—3,5-месячном возрасте, проходило более успешно, чем отар со взрослыми овцами. Так, в отаре неблагополучных ярок, привитых в очаге острой инфекции в отдаленные сроки, через 2—4 года после применения вакцины не обнаруживалось реагирующих по аллергии, РА и РСК.

В отаре же овцематок, хотя бруцеллезная инфекция была ликвидирована в те же сроки (2 года), аллергическая сенсибилизация у 11,5% овец оставалась практически на всю их жизнь.

4. Метод борьбы с бруцеллезом с применением вакцины К-24 позволяет проводить профилактические прививки и оздоровление отар овец и баранов во всех хозяйствах, находящихся в очаге инфекции, в том числе в племовцезаводах и отдельных хозяйствах граждан данной оздоравливаемой зоны.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

источник

Владельцы патента RU 2642316:

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для изготовления вакцины против бруцеллеза мелкого рогатого скота из штамма Brucella melitensis Rev-1. Способ изготовления вакцины против бруцеллеза мелкого рогатого скота предусматривает посев и выращивание штамма Brucella melitensis Rev-1 на питательной среде, содержащей панкреатический гидролизат казеина глубокой степени расщепления, экстракта дрожжей, натрий хлористый, глюкозу, глицерин и агар-агар в заданном соотношении компонентов в течение 72 часов при 37°C. Выросшую вакцинную культуру смывают с поверхности агара средой высушивания и доводят до концентрации 80-140 млрд м.к. в 1 мл. Проверяют на чистоту и диссоциацию, расфасовывают в ампулы и подвергают лиофильной сушке. Изобретение позволяет увеличить выход штамма Brucella melitensis Rev-1 в S-форме. 1 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к изготовлению вакцины против бруцеллеза мелкого рогатого скота.

В настоящее время для профилактики бруцеллеза овец и коз широко используют вакцину, изготовленную из штамма Brucella melitensis Rev-1.

Выращивание штамма Rev-1 при изготовлении вакцины проводят на триптиказо-соевом агаре, агаре Альбими, сывороточно-декстрозном агаре (см. Дж. Альтон, Л.М. Джонс «Методы лабораторных исследований по бруцеллезу», ВОЗ, Женева, 1968, стр. 77-79). Ингредиенты, входящие в первые две среды, в нашей стране не выпускают, а применение агара-заменителя Альбими в производстве вакцины нерационально из-за недостаточного выхода бакмассы. На других питательных средах (печеночные, мясные, картофельные среды, эритритагар, агар Д и т.д.), применяемых для культивирования бруцелл (см. кн. “Бруцеллез”, под ред. П.А. Вершиловой, М., 1961, стр. 208-210), штамм Rev-1 растет плохо и диссоциирует.

Известен способ получения живой вакцины из штамма В.melitensis Rev-1, заключающийся в выращивании его на сывороточно-декстрозном агаре на основе мясо-пептонного бульона (см. Производство вакцины Rev-1. G.G. Alton WHO/Bruc. 70.321; Питательная среда для изготовления вакцины из штамма B.melitensis Rev-1. Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротестсистем. Мат. междунар. науч. конф., посвящ. 70-летию НПО «Питательные среды», Махачкала, 1998, с. 116-117). Недостатком данного способа является необходимость добавления в питательную среду перед засевом культуры бруцелл штамма Rev-1 до 10% стерильной сыворотки крови животных, а также то, что основой среды служат мясной бульон и пептон.

Изготовление питательной среды на основе высокоценного пищевого продукта — мяса экономически не оправдано, а добавление дефицитной и дорогостоящей сыворотки крови, помимо экономической нецелесообразности, вызывает дополнительные трудности, связанные со стерильным внесением ее в готовую среду и возможностью загрязнения вакцины посторонней микрофлорой.

Целью настоящего изобретения является разработка способа изготовления живой вакцины против бруцеллеза овец и коз из штамма Rev-1, состоящей из типичных для данного штамма однородных клеток бруцелл в S-форме и не имеющей диссоциированных микроорганизмов с использованием питательной среды, изготовленной из непищевого сырья и без добавления сыворотки крови животных.

Поставленная цель достигается тем, что для изготовления вакцины с целью увеличения выхода микробной массы и во избежание диссоциации бруцелл, культуру штамма В.melitensis Rev-1 выращивают на питательной среде, основой которой является панкреатический гидролизат казеина с добавлением в качестве источника витаминов и других ростовых факторов экстракта кормовых или хлебных дрожжей.

Питательная среда состоит из равных объемов панкреатического гидролизата казеина глубокой степени расщепления и экстракта дрожжей, разведенных после смешивания дистиллированной водой до содержания аминного азота 110-130 мг % с добавлением 0,5% хлористого натрия, 1% глюкозы, 2% глицерина и 2-3,5% агар-агара. При выращивании на такой питательной среде достигается лучший рост бруцелл штамма Rev-1, больший выход бактериальной массы без диссоциированных клеток и обладающий лучшей жизнеспособностью, а также высокими иммуногенными свойствами.

Приготовление гидролизата казеина

Сухой казеин в количестве 1 кг заливают 10 литрами теплой дистиллированной воды, подщелачивают до рН — 8,5-9,0 и оставляют на несколько часов для разбухания. Затем при постоянном перемешивании подогревают до 80-90°C и температуру в этих пределах поддерживают до растворения казеина. В процессе растворения казеина рН смеси снижается, и поэтому периодически добавляют 20% раствор щелочи (NaOH) для поддержания рН на уровне 8,5-9,0 до полного растворения казеина.

Полученный раствор остужают до 45°C и к нему добавляют 50-100 г в зависимости от активности, панкреатина или же фарш поджелудочной железы крупного рогатого скота в количестве 0,5-1 кг.

Гидролиз проводят в течение 3-4 часов при температуре 45°C при постоянном перемешивании, поддерживая рН на уровне 8,5-9,0. Содержание аминного азота в готовом гидролизате должно быть 600-800 мг %.

При медленном гидролизе и содержании аминного азота менее 600 мг % панкреатин добавляют повторно.

По достижении аминного азота до 600-800 мг % гидролиз прекращают добавлением 100-120 мг уксусной кислоты.

Гидролизат кипятят в течение 10 минут, после чего его охлаждают и оставляют до следующего дня для отстаивания.

Отстоявшийся гидролизат декантируют и фильтруют через ватно-марлевой фильтр.

Приготовление экстракта дрожжей

Берут 1 кг светлых сортов кормовых или прессованных пекарских дрожжей и добавляют к ним 10 литров дистиллированной воды. Смесь тщательно перемешивают, кипятят в течение 10-15 минут и в горячем виде фильтруют до прозрачности.

Приготовление питательной среды

Для изготовления среды смешивают панкреатический гидролизат казеина и экстракт дрожжей в равных количествах и разводят дистиллированной водой до содержания аминного азота 110-130 мг %.

Смесь подогревают и после закипания к ней добавляют предварительно вымоченный в воде в течение 12 часов Корсаковский агар-агар высшего или первого сорта из расчета 3-3,5% для четвертей или матровых колб и 2% для пробирок и чашек.

После полного расплавления агар-агара в среду вносят 0,5% хлористого натрия, 1% глюкозы и 2% глицерина, доводят рН до 7,2-7,3 и, периодически перемешивая, ее кипятят еще 10-15 минут. Затем питательную среду фильтруют через ватный или полотняный фильтр, разливают в матровые колбы, четверти или другие необходимые емкости и стерилизуют при температуре 110-112°C в течение 30 минут.

После стерилизации матровые колбы ставятся в горизонтальном положении для застывания агара, а четверти обкатывают для распределения питательной среды по всей их внутренней поверхности.

До засева вакцинной культуры питательную среду в колбах, четвертях, чашках и пробирках выдерживают в течение 48 часов при температуре 37°C для подсушивания поверхности и контроля стерильности.

Выращивание культуры Rev-1 для получения вакцины проводят на вышеуказанной питательной среде в матровых колбах, четвертях, пробирках или других емкостях.

Для засева серии вакцинной культуры проводят предварительную расплодку штамма в пробирках, матровых колбах или четвертях.

Вначале производственный штамм Rev-1 засевают в пробирки на косой агар. Берут одну пробирку 3-4-суточного роста эталонной культуры, разводят стерильным буферным раствором рН 6,6-6,8 так, чтобы получилась концентрация 10 -6 и 10 -7 .

Из каждого разведения 0,1 мл культуры штамма засевают по 3 бактериологические чашки.

Через 5 суток выращивания в термостате при температуре 37°C чашки просматривают на чистоту и типичность роста культуры, проверяют морфологию клеток и на диссоциацию методом окраски колоний по Уайт -Уильсону.

При отсутствии диссоциации из неокрашенных, бактериологических чашек отбирают типичные колонии, которые отсевают на пробирки с косым агаром. После выдерживания посевов в течение 48 часов в термостате при температуре 37°C и проверки на чистоту культуру пересевают на требуемое количество пробирок с той же питательной средой. Пробирки выдерживают в течение 48 часов при температуре 37°C. Из этих пробирок получают рабочие культуры штамма Rev-1, используемые для засева очередных серий вакцины.

Пробирки с рабочей культурой штамма Rev-1 хранят в запаянном виде в холодильнике при температуре +4-8°С и пригодны для использования в течение 30 дней.

Для получения взвеси клеток с целью засева серии вакцины необходимо рабочие культуры размножить в нужном количестве в пробирках, матровых колбах или четвертях, смыть стерильным, забуферным (рН 6,6-6,8) физраствором так, чтобы получилась концентрация 2-3 млрд микробов, тел в 1 мл по оптическому бруцеллезному стандарту мутности. Такой расплодкой в количестве 4-5 мл засевают матровые колбы (матрасы) или четверти данной серии.

Выращивание культуры B. melitensis Rev-1 для получения вакцины на вышеуказанной питательной среде проводят в течение 72 часов при температуре 37°С. Выросшую вакцинную культуру, с поверхности агара, смывают средой высушивания.

Среду высушивания готовят следующим образом: в 1 литре кипящей дистиллированной воды растворяют 15 г желатина, после ее растворения добавляют 100 г сахарозы. Затем кипятят 5-6 минут, доводят рН до 7,2-7,3, фильтруют через полотняный фильтр, стерилизуют при 1 атмосфере 30 минут. После стерилизации среда должна иметь рН 6,8-7,0.

В каждую колбу или четверть вводят такое количество среды высушивания, чтобы концентрация бакмассы была в пределах 80-140 млрд микробных тел в 1 мл.

Суспензию бруцелл, полученную из колб или четвертей сливают в общую бутыль. После проверки на чистоту и диссоциацию расфасовывают в ампулы по 2 или 4 мл и подвергают лиофильной сушке.

Предлагаемый способ изготовления вакцины обеспечивает, по сравнению с существующим, увеличение выхода препарата в 1,2-1,3 раза. Полученная при этом вакцина состоит из однородных клеток в S-форме, типичной для штамма Rev-1 морфологии, и не имеющих признаков диссоциации.

Предлагаемая питательная среда, изготовленная на основе панкреатического гидролизата казеина и экстракта дрожжей, разлитая по 250,0 мл в 10 матровых колб, была испытана для изготовления живой вакцины против бруцеллеза овец и коз из штамма B. melitensis Rev-1.

Для сравнения результатов культуру штамма B. melitensis Rev-1 для изготовления вакцины выращивали и на сывороточно-декстрозном агаре на основе мясо-пептонного бульона с добавлением 10% стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота. Данную питательную среду разливали в матровые колбы также по 250,0 мл в каждую колбу. Засевали культурой B. melitensis Rev-1 10 матровых колб со средой.

Культуру B. melitensis Rev-1 на обеих питательных средах выращивали при температуре 36-37°С в течение 72 часов. Основные данные, характеризующие результаты использования обеих питательных сред для выращивания штамма B. melitensis Rev-1 и изготовления из этого штамма вакцины против бруцеллеза овец и коз, представлены в следующей таблице.

Таблица. Основные результаты выращивания культуры штамма Brucella melitensis Rev-1 для получения бакмассы и изготовления вакцины против бруцеллеза овец и коз при использовании испытуемой питательной среды (новый вариант) и ранее применявшейся питательной среды (старый вариант).

Таким образом, в результате проведенных исследований по испытанию предлагаемой нами питательной среды, изготовленной на основе панкреатического гидролизата казеина и экстракта хлебных дрожжей, установлены пригодность данной среды и целесообразность ее применения для выращивания штамма B. melitensis Rev-1 при изготовлении из этого штамма живой вакцины против бруцеллеза овец и коз. При этом показано, что применение указанной питательной среды позволяет получить бакмассу бруцелл штамма Rev-1 типичной для данного штамма морфологии в S-форме, не содержащую диссоциированных микробных клеток и 1,2 раза больше, чем при применении сывороточно-декстрозного агара, изготовленного на основе мясопептонного бульона с добавлением 10% сыворотки крови крупного рогатого скота.

Способ изготовления вакцины против бруцеллеза мелкого рогатого скота, включающий посев и выращивание бруцелл штамма B. melitensis Rev-1 на питательной среде, состоящей из равных объемов панкреатического гидролизата казеина глубокой степени расщепления и экстракта дрожжей, разведенных после смешивания дистиллированной водой до содержания аминного азота 110-130 мг % с добавлением 0,5% хлористого натрия, 1% глюкозы, 2% глицерина и 2-3,5% агар-агара, их смыв, разбавление средой высушивания до содержания 80-140 млрд микробных клеток в 1 мл, расфасовку в ампулы и лиофильную сушку.

источник

ВАКЦИНА ПРОТИВ БРУЦЕЛЛЕЗА ОВЕЦ И КОЗ И ИНФЕКЦИОННОГО ЭПИДИДИМИТА БАРАНОВ ИЗ ШТАММА BRUCELLA MELITENSIS REV-1ЖИВАЯ СУХАЯ инструкция по применению