Розбенгал проба на бруцеллез постановка реакции

Your browser does not support iframes.

Непрозрачная жидкость малиново-розового цвета.

Препарат для экспресс-диагностики in vitro методом пластинчатой реакции агглютинации.

Применяется в лабораториях ветеринарной медицины для исследования сывороток крови при диагностике бруцеллеза у сельскохозяйственных животных: крупный и мелкий рогатый скот, лошади, свиньи, верблюды, северные олени.

Кровь для исследования на бруцеллез берут из яремной вены животных с соблюдением правил асептики.

Противопоказания
Запрещается применять препарат после окончания срока годности или при
несоблюдение температурного режима хранения.

Сыворотки крови, которые исследуются, должны быть прозрачные, без примесей и эритроцитов; взяты не позднее 4-х суток хранения при температуре от (4 до 8) ° С.

Консервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 14 дней. Не прозрачные, подозрительные сыворотки исследованию не подлежат.

Постановка Роз-Бенгал пробы .

Оборудование, необходимое для постановки Роз-Бенгал пробы .

— белые металлические эмалированные, фарфоровые или глазурованные керамические пластинки с лунками;

— шприц полуавтомат ( дозатор, капельница) для дозирования сыворотки;
— калиброванные пипетки, дозатор ( капельница) для дозирования антигена;
— ручной смеситель для 25 лунок диагностических пластин;
— автоматический прибор для покачивания диагностических пластин;
— сигнальные часы.

Компоненты для Роз-Бенгал пробы.

— бруцеллезный антиген, окрашенный бенгальских розовым ( антиген для Роз-Бенгал пробы);
— исследуемые сыворотки крови животных;

-положительная бруцеллезная и отрицательная сыворотки;
— 0,5% фенолизированый физиологический раствор.

Техника постановки Роз-Бенгал пробы.

Перед использованием антиген выдерживают 30-40 минут при комнатной температуре, а затем тщательно встряхивают.

Перед началом работы ставят контроль антигена с положительной бруцеллезной и отрицательной сыворотками, а также контроль антигена на спонтанную агглютинацию с физраствором. Для этого описанным ниже способом смешивают по 0,03 см 3 антигена отдельно с обеими сыворотками и физиологическим раствором.

Реакцию проводят на чистых, сухих эмалированных, фарфоровых или глазурованных керамических пластинках с лунками при температуре не ниже 18 ° С. На бортиках пластин против каждой лунки записывают номер исследуемой сыворотки.

Исследуемые сыворотки крови в дозе 0,03 см 3 (1 капля) вносят на дно лунки с помощью шприца полуавтомата ( ШПРБ-1), дозатора или микропипетки. После внесения каждой сыворотки шприц-полуавтомат ( ШПРБ-1) или микропипетку трижды промывают фенолизированным физраствором и подсушивают фильтровальной бумагой, наконечник дозатора используют один раз.

При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов, свиней в каждую лунку, рядом с сывороткой с помощью пипетки-капельницы вносят 0,03 см 3 ( две капли) антигена, а при исследовании сывороток крови овец, коз, северных оленей 0,015 см 3 ( одну каплю) антигена. Затем антиген тщательно смешивают с каждой каплей сыворотки крови с помощью ручного смесителя до получения однородной смеси, распределяя ее при этом по всей поверхности лунки. После смешивания сывороток каждого ряда лунок смеситель ополаскивают в фенолизированном физиологическом растворе и просушивают с помощью марлевой салфетки или фильтровальной бумаги.

Пластинку с сыворотками и антигенами покачивают в течение 4 минут осторожными круговыми движениями вручную или с помощью автоматического прибора, который предназначен для этого. При положительной реакции в смеси в течение 4 минут возникают различной величины хлопья аглютината розового цвета.

Учет реакции проводят визуально при достаточном естественном или искусственном освещении, слегка наклоняя пластинки. Учет агглютинации проводят в течение 4-х минут после смешивания сыворотки с антигеном.

Реакцию считают положительной при наличии выраженной агглютинации окрашенных бруцелл антигена в виде мелких или крупных хлопьев розового цвета, четко выделяются на белом фоне лунки.

При отсутствии агглютинации ( смесь гомогенная, равномерно прокрашена) реакцию считают отрицательной.
Реакцию, которая начинается позже, чем через 4 минуты с момента смешивания, не учитывают. При нечетко выраженной агглютинации проводят повторное исследование этой сыворотки. По результатам повторного исследования дают заключительную оценку реакции ( положительная или отрицательная). После учета реакции пластинки дезинфицируют погружением на 5 минут в 2,5-5% раствор хлорамина, затем тщательно моют водопроводной водой, высушивают.

18 месяцев со дня изготовления. Использовать в течение 12 часов после вскрытия флакона.

Условия хранения и транспортировки

В сухом темном месте при температуре от 4 ° С до 12 ° С. Не замораживать. Хранить в недоступном для детей месте. Транспортируют всеми видами транспорта в соответствии с требованиями ГОСТ 17768 и « Правил транспортировки и хранения ветеринарных препаратов, субстанций, готовых кормов, кормовых добавок и средств ветеринарной медицины в ветеринарных аптеках, их структурных подразделениях, на базах, складах и т.д.», утвержденных приказом Государственного департамента ветеринарной медицины Украины № 44 от 13.08.2002 и зарегистрированы в Министерстве юстиции Украины № 719/7007 от 30.08.2002 года.

Упаковка
Флаконы из нейтрального стекла емкостью 10 см 3 , 15 см 3 , 20 см 3 , плотно закрыты резиновыми пробками и обкатаны алюминиевыми колпачками.

Особые меры безопасности при обращении с неиспользованным ВИП, способы его обезвреживания и утилизации

Упаковку и остатки неиспользованного продукта следует утилизировать в соответствии с действующим законодательством.

Название, местонахождение и место осуществления деятельности владельца регистрационного свидетельства и производителя

Херсонское государственное предприятие — биологическая фабрика, Украина, 73011, г. Херсон, ул. Адмирала Макарова, 9.

Если препарат не отвечает требованиям листка-вкладыша или возникли осложнения, применение этой серии прекращают и сообщают Государственный научно-контрольный институт биотехнологии и штаммов микроорганизмов ( ГНКИБШМ) и поставщика ( производителя). Одновременно с нарочным в ГНКИБШМ направляют, согласно « Инструкции о порядке предъявления рекламаций на биологические препараты, предназначенные для применения в ветеринарной медицине» от 03.06.98 № 2 три нераскрытых флакона этой серии препарата по адресу: 03151, г. Киев, ул. Донецкая, 30, ГНКИБШМ.

источник

Основными тестами при массовых диагностических исследованиях явля­ются пробирочная РА, РА на стекле (Роз-бенгал проба), РСК и РДСК, коль­цевая реакция с молоком, реакция диффузионной преципитации.

Пробирочная реакция агглютинации.Используют при диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота, шец, коз, лошадей, буйволов, верблюдов, оленей, собак, пушных зверей И т.д. Реакцию проводят в объеме
1 мл. Сыворотки крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов исследуют в разведениях 1:50-1:400; онец, коз, свиней, буйволов, оленей и собак — 1:25 -1:200; пушных зве­рей и морских свинок — 1:10-1:80. При массовых исследованиях до­пускается постановка РА в двух первых разведениях, но при этом надо иметь в виду возможность феномена «прозоны». Сыворотки крови круп­ного рогатого скота, лошадей, собак, пушных зверей, верблюдов разво­дят 0,85%-ным раствором натрия хлорида с 0,5% фенола; сыворотки кро­ви овец, коз и буйволов разводят 5%-ным, а сыворотки крови оленей — 10%-ным фенолизированным раствором натрия хлорида. Разведения сы­воротки крови делают в объеме 0,5 мл, затем в каждую пробирку вносят 0,5 мл единого бруцеллезного антигена, разведенного 1:10, при этом раз­ведения сыворотки крови удваиваются. Компоненты перемешивают Встряхиванием и штатив с пробирками помещают в термостат при 37-38° С на 18-20 часов, затем выдерживают несколько часов при комнат­ной температуре и учитывают результат общепринятым способом (техни­ку постановки и учета результатов РА см. в разделе «Серологические ре­акции»). В качестве контролей параллельно исследуют заведомо положи­тельную и отрицательную сыворотки. РА при бруцеллезе крупного рога­того скота, лошадей и верблюдов считают положительной при титре 1:100 и более (1:50 — сомнительный результат), у овец, коз, оленей, буйволов и собак — 1:50 (1:25 — сомнительный результат). При получении сомни­тельных результатов сыворотки крови от этих животных исследуют через три-четыре недели повторно.

Помимо титра результаты пробирочной РА выражают в международ­ных единицах (ME). В разных странах готовят антигены, различающиеся по агглютинабилыюсти, что приводит к несопоставимости титров РА. По­этому была предложена международная стандартная бруцеллезная сыво­ротка, по отношению к которой определяют активность национальных ан­тигенов. Активность стандартной сыворотки определена в 1000 МЕ/мл. Например, при исследовании этой сыворотки с определенным нацио­нальным антигеном она показывает в РА титр 1:500. Следовательно, если в РА с этим антигеном исследуют сыворотку крови от животного из хозяй­ства и получают титр РА 1:500, то она также содержит 1000 ME бруцеллез­ных антител, а вторая сыворотка, давшая титр 1:400, содержит 1000 х 400 : 500 = 800 ME и т.д. В настоящее время в странах разработаны национальные стандартные бруцеллезные сыворотки, соответствующие по активности международной сыворотке. В РФ в соответствии с «Наставлением по диаг­ностике бруцеллеза животных» (2000) приняты следующие критери оценки РА в ME. Реакцию считают положительной у невакцинироваппого крупного рогатого скота, верблюдов, лошадей, а также иммунизированных неаг-глютиногенными вакцинами при наличии 200 ME антител (сомнительной — 50-100 ME); у овец и коз — 100 ME; оленей и собак — 50 ME; пушных зверей и морских свинок —10 ME. PA считают сомнительной у овец, коз, оленей, собак этой группы на уровне 25-50 ME. При сомнительных пока­заниях РА животных повторно исследуют через 15-30 суток. В случае повышения уровня антител животных признают больными, при отсутствии динамики — здоровыми. Выявление в стадах крупного рогатого скота, иммунизированного ра­нее агглютиногенными вакцинами, животных с уровнем антител не более 200 ME предполагает через 15-30 суток их повторное исследование. Если при повторном исследовании наблюдают повышение уровня антител, то животных признают больными. При отсутствии повышения дополнитель­ными методами уточняют специфичность результатов РА.

При обнаружении в неблагополучных по бруцеллезу стадах крупного рогатого скота (ранее иммунизированного или не иммунизированного) жи­вотных с уровнем антител 100 ME и более их признают больными,
50 ME — результат РА сомнительный. В случае сомнительной РА животных исследу­ют через 15-30 суток повторно и при вторичном сомнительном результате животных признают больными.

При исследовании в РА невакцинированных баранов-производителей, пробников, ярок, козлов, содержащихся в благополучных отарах, где про­водилась иммунизация, РА оценивают как положительную при уровне ан­тител 100 ME и более, сомнительной — 50 ME. В последнем случае живот­ных через 15-30 суток исследуют повторно, и, если содержание антител не увеличилось, их признают здоровыми.

Роз-бенгал проба (РБП).РА на стекле с корпускулярным антигеном, окрашенным розовым бен­гальским, используют для диагностики бруцеллеза крупного рогатого ско­та, овец, коз, лошадей, свиней, буйволов, верблюдов и северных оленей. Реакцию проводят на чистых, сухих эмалированных пластинках с лунками при температуре не ниже 18°С. Исследуемые сыворотки в дозе 0,03 мл вно­сят на дно лунки, затем в лунку рядом с сывороткой помещают при исследо­вании крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов и свиней 0,03 мл ан­тигена, сывороток овец, коз, буйволов и северных оленей — 0,015 мл анти­гена. Компоненты должны иметь температуру не ниже 18°С.

Затем компоненты перемешивают в течение 4 минут, одновременно учи­тывая результат. В положительных случаях в течение указанного времени появляются розовые хлопья агглютината. В РБП исследуют неразведен-ные сыворотки, влияние нормальных антител нивелируется использовани­ем кислого антигена со значениями рН, при которых нормальные антитела с низкой авидностыо не реагируют с антигеном, что обеспечивает специ­фичность результата реакции. Перед началом исследований антиген проверяют в РБП на активность, специфичность и на спонтанную агглютинацию соответственно с позитивной, негативной сыворотками и в последнем случае — с физиологическим раствором. В соответствии с «Наставлением по диагностике бруцеллеза животных» в РФ результат РБП считают положительным при наличии четко выраженной агглютинации. В благополучных по бруцеллезу хозяйствах в случае позитивной РБП сыворотки крови исследуют в РА и РСК (РДСК) или РА и РИД. Если при этом получают отрицательные результаты, то животных с позитивной РБП повторно исследуют через 15-30 дней в этих же серологических реакциях. В неблагополучном по бруцеллезу хозяйствах овец, коз, северных оленей с позитивной РБП признают больными. Сыворотку крови крупного рогатого скота, вер­блюдов и лошадей дополнительно исследуют в РА, РСК (РДСК) или РА и РИД, животных с положительными результатами этих серологических ре­акций признают больными, сомнительно реагирующих исследуют повторно через 15-30 суток в РА, РСК (РДСК) или РА и РИД. При получении положительных или сомнительных результатов животных признают больными бруцеллезом.

Кольцевая реакция с молоком (КР).Реакцию применяют для проверки благополучных по бруцеллезу стад крупного рогатого скота и молока на рынках.

В РФ, в соответствии с «Наставлением по диагностике бруцеллеза животных», реакцию и оценку результатов проводят следующим образом. В уленгутовские пробирки наливают 0,05 мл антигена (клетки бруцелл, окрашенные гематоксилином) и 1 мл исследуемого молока. Если используют пробирки Флоринского — 2 мл молока и 0,1 мл антигена, компоненты пе­ремешивают, пробирки помещают в водяную баню (37-38° С) на 1 час, затем учитывают результат по нижеследующим критериям:

КР на 2-3 креста считают положительной, 1 крест — сомнительной. При положительной КР от всех животных стада берут кровь для исследо­вания в РА или РСК (РДСК) или РА и РИД. Если получают их отрицатель­ный результат, то независимо от позитивной КР животных признают здоро­выми.

Реакция связывания комплемента (РСК, РДСК). Данную серологическую реакцию применяют для диагностики бруцел­леза практически у всех видов животных. Согласно «Наставлению по ди­агностике бруцеллеза животных» исследуемые сыворотки крови крупного рогатого скота для РСК инактивируют разведенными 1:5 в водяной бане в течение 30 минут при 60-62°С; сыворотки крови ослов, мулов при 64-65°С; буйволов — 62-64° С; свиней — 60-62° С 50 минут; при постанов­ке РДСК 30 минут при 62-64° С. Используют единый бруцеллезный анти­ген в рабочем титре, гемолизин для РСК в удвоеном титре, для РДСК — в утроенном, 2,5%-ную взвесь эритроцитов барана для РСК и 3%-ную для РДСК. Комплемент в количестве 1,2 единицы (титр комплемента принима­ется за 1 единицу). Реакцию проводят в объеме 1 мл с сыворотками, разве­денными 1:5 или 1:10 (технику постановки и учета результатов см. в разде­ле «Серологические реакции»).

При исследовании сывороток в одном разведении (1:5) и задержке гемо­лиза на один крест эти сыворотки повторно исследуют в двух разведениях (1:5, 1:10). В случае сомнительной РСК животных повторно исследуют че­рез 15-30 суток. Если при повторном исследовании животных из благопо­лучного по бруцеллезу хозяйства вновь получена сомнительная РСК — жи­вотных признают здоровыми. Если аналогичный результат получен у жи­вотных неблагополучного хозяйства, их рассматривают как больных. По­лучение только позитивной РСК в разведении 1:10 в благополучных по бруцеллезу стадах ранее вакцинированного крупного рогатого скота пред­полагает повторное исследование через 15-30 суток. При нарастании титров РСК диагноз на бруцеллез считают установленным, в обратном слу­чае результат исследования считают отрицательным («Наставление по ди­агностике бруцеллеза животных», 2000).

Реакция иммунодиффузии (РИД). Согласно «Наставлению по диагностике бруцеллеза животных» (2000) в РФ РИД используют при плановых исследованиях в благополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота хозяйствах, где не применяются вак­цины, одновременно с РА, а также при проверке сомнительно реагирую­щих в РА или РСК (РДСК) животных для дифференциации неспецифичес­ких реакций; в благополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота хозяйствах, где проводится иммунизация крупного рогатого скота аг-глютиногенными вакцинами при контроле эпизоотического состояния (не ранее 1,5 месяца после вакцинации); для дифференциации реакций, полу­ченных в РА (не более
200 ME) или РСК (РДСК) в разведениях не выше 1:10; при плановых исследованиях животных одновременно с РА; в не­благополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота хозяйствах через 1,5 месяца после иммунизации; среди телок и нетелей в течение первых шести месяцев после иммунизации (реиммунизации) 2-4-кратно; через месяцев после иммунизации (реиммунизации) животных для оздоровления стада от бруцеллеза в комплексе предусмотренных реакций; при постановке хозяйства на контроль и снятии ограничений одновременно с РА и РСК (РДСК).

При диагностике бруцеллеза северных оленей для оценки эпизоотического состояния стад, благополучных по бруцеллезу, вакцинированных против бруцеллеза; для исследования на бруцеллез не ранее чем через два месяца после применения вакцин; для дифференциации неспецифических реакций.

Техника проведения РИД. Расплавленный агар разливают по 2,5 мл на предметные стекла, пластинки размером 6×9 см —12 мл, стандартные чашки Петри слоем не менее 2 мм, которые предварительно размещают на строго горизонтальной поверхности. В застывшем агаровом геле штампом делают лунки: центральную диаметром 5 мм и шесть переферических по 3 мм.

В центральную лунку вносят 20 мкл О-полисахаридного антигена, в пе­риферические — 40 мкл исследуемых сывороток крови. Одновременно на каждой пластинке (чашке Петри) ставят контроль с позитивной сывороткой крови. Затем стекла (чашки Петри) выдерживают во влажной камере при температуре не ниже 18° С и учитывают результат в косопроходящем свете через 24 и 48 часов. Как положительный результат оценивают наличие ли­нии преципитации, появившейся через 24 часа. Сыворотки крови, давшие реакцию преципитации через 48 часов, исследуют повторно и при получении линии преципитации через 24 или 48 часов результат реакции признают по­ложительным.

Печеночно-сывороточный или печеночно-аминопептидный агар.Готовят печеночный отвар: 500 г свежего фарша говяжьей печени смешивают с 500 мл воды, кипятят 1 час, фильтруют через ватный фильтр, стерилизуют в автоклаве, смешивают равные объемы печеночного отвара и водопроводной воды, добавляют 1% пептона, 0,5% натрия хлорида, 2% агар-агара. На 1000 мл смеси вносят 17 мл 10%-ной двууглекислой соды, автоклавируют 20-25 минут при 115° С, фильтруют через ватный фильтр, ус­танавливают рН 7,0-7,2, добавляют 1% глюкозы и 2% глицерина, разливают по колбам и стерилизуют 20-25 минут при 110° С. Перед использо­ванием агар расплавляют, остужают до 50° С, добавляют 10-20% сыво­ротки крови лошади или крупного рогатого скота (печеночно-сывороточ-иый агар) или 10-15% аминопептида (печеночно-аминопептидный агар) и разливают по чашкам или пробиркам. Также готовят полужидкие агары, внося 0,15-0,2% агар-агара. Рекомендуют среды данного типа для культивирования В. ovis.

Печеночный агар Хеддльсона.В 500 мл воды вносят 10 г пентона,
5 г натрия хлорида, 20 г агар-агара, автоклавируют 30 минут, добавляют 500 мл печеночного отвара, охлаж­дают до 60° С, устанавливают рН 7,0. К 1 л среды добавляют один яичный белок, автоклавируют 30 минут при 120° С, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают рН 7,0, разливают по емкостям и стерилизуют 30 минут при 115° С.

Плотный печеночно-глюкозо-глицериновый агар (ППГГА). 400 г свежей говяжьей печени освобождают от жира и пленок, измель­чают, добавляют 500 мл водопроводной воды, кипятят 1 час, фильтруют через ватный фильтр. Полученный печеночный отвар разводят водопро­водной водой 1:1, добавляют 1% пептона, 0,5% натрия хлорида, 2,5% ага­ра и
17 мл 10%-ного раствора гидрокарбоната натрия на 1000 мл. Среду автоклавируют 20 минут при 115° С, отстаивают в автоклаве 3-4 часа, фильтруют через ватный фильтр, устанавливают рН 7,2. Затем в среду вно­сят 1% глюкозы и 2-3% глицерина, разливают по пробиркам, колбам, сте­рилизуют 20-25 минут при 110° С. Данную среду рекомендуется приме­нять для культивирования В. abortus, В. melitensis и В. suis, при бактериостатическом методе дифференциации бруцелл. ППГГБ готовят так же, но агар не добавляют.

Сывороточно-декстрозиый агар.К 835 мл дистиллированной воды добавляют 15г агар-агара, 10г пептона, 5 г химически чистого натрия хлорида и 165 мл мягкой воды. Прогре­вают 1 час текучим паром, устанавливают рН 7,8, автоклавируют 30 мин при 127° С, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 7,4. Среду разливают по сосудам и стерилизуют при 116° С 15 минут. Перед использованием среду расплавляют, охлаждают до 50° С, добавляют сте­рилизованные фильтрованием сыворотку крови лошади или крупного ро­гатого скота до концентрации 5% и раствор декстрозы до уровня 1%. Сре­да рекомендуется для первичного выделения бруцелл.

Сывороточно-декстрозный бульон.Готовят так же, как сывороточно-декстрозный агар, но без добавления агар-агара.

Альбими-агар.В 1000 мл дистиллированной воды добавляют 20 г сухого пептона, 20 мл дрожжевой воды, 5 г натрия хлорида, 20 г агар-агара. Устанавливают рН 7,3, все компоненты растворяют в аппарате Коха, фильтруют через ватный фильтр. Вносят 1 г глюкозы, 0,2 г бисульфита натрия, устанавливают рН 7,2 0-7,3, разливают по колбам и стерилизуют 40 минут текучим паром, затем 20 минут в автоклаве при 110° С. Дрожжевую воду получают путем кипячения 1 кг хлебных дрожжей в 1000 мл дистиллированной воды, затем фильтруют через полотно и хранят под флороформом в темноте (не более 15 дней).

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

Реакция Хеддльсона (пластинчатый метод)

Преимущество этого метода заключается в простоте постановки реакции, быстром получении результатов и чувствительности реакции. В качестве антигена для постановки реакции Хеддлсона и Райта применяют единый бруцеллезный диагностикум. Реакцию ставят на обычном оконном, тщательно вымытом, обезжиренном стекле, расчерченном на квадраты величиной 4 x 4 см каждый, по горизонтали должно быть 5 квадратов. На первом квадрате с левой стороны записывается номер испытуемой сыворотки, в последующие квадраты слева направо разливают (микропипеткой или 1 мл градуированной пипеткой) испытуемую сыворотку в следующих дозах: 0,04, 0,02, 0,01 и 0,03 (контроль сыворотки). К первым трем дозам сыворотки добавляют по 0,03 мл антигена. К последней дозе сыворотки (0,03) добавляют 0,03 мл физиологического раствора. Сыворотку осторожно смешивают с антигеном палочкой, начиная с минимальной дозы сыворотки. Контроль антигена ставят, добавляя 0,03 мл физиологического раствора к 0,03 мл антигена. Затем стекло слегка подогревают над пламенем спиртовки так, чтобы происходило равномерное нагревание всей поверхности стекла.

В случае положительной реакции в первые же минуты в каплях сыворотки с антигеном появляются хлопья (агглютинат). Максимальный срок наблюдения 8 минут. Контроль сыворотки ставят с каждой испытуемой сывороткой для исключения спонтанной агглютинации; контроль антигена ставят один (при любом числе испытуемых сывороток) для исключения спонтанной агглютинации применяемого антигена. Учет реакции проводят невооруженным глазом по следующей схеме: а) полное просветление жидкости с крупными и мелкими хлопьями, т.е. 100 % агглютинации (4+); б) почти полное просветление жидкости с ясно заметными хлопьями, т.е. 75 % агглютинации (3+); в) незначительное просветление жидкости с заметными хлопьями, т.е. 50 % агглютинации (2+); г) мутная жидкость с едва заметной зернистостью (+); д) равномерная мутная жидкость (-).

Для оценки результатов рекомендуется следующая схема: а) агглютинация на 4+ во всех дозах сыворотки — результат «резко положительный»; б) агглютинация не менее 2+ во всех дозах сыворотки — результат «положительный»; в) агглютинация только в первой или в первой и второй дозах сыворотки — результат «сомнительный»; г) отсутствие агглютинации во всех дозах сыворотки — реакция «отрицательная».

Для диагностики бруцеллеза имеет значение только положительный результат реакции. При сомнительном или отрицательном результатах реакции и наличии эпидемических и эпизоотических показаний, а также в стационаре и при обследовании доноров, где необходимо определение титра агглютининов и их динамики, следует применять реакции Райта и Кумбса, РПГА и ИФА.

Роз-Бенгал проба (РБП)

Роз-Бенгал проба, по сравнению с другими методами серологической диаг­ностики бруцеллеза, обладает следующими преимуществами: большой чувстви­тельностью, способностью в короткие сроки после заражения выявлять специ­фические бруцеллезные антитела и, благодаря кислой реакции антигена, ингибировать проявления неспецифических антител, а также стабильностью показаний, технической простотой постановки, требующей небольшой затраты труда и времени, четкостью и быстротой получаемых результатов.

Сыворотки крови, подлежащие исследованию, должны быть прозрачные, без примеси эритроцитов. Их исследуют не позднее, чем через 4 дня хранения при температуре плюс 4-8 °С.

Допускается исследовать сыворотки, консервированные сухой борной кис­лотой (2 % борной кислоты к объему сыворотки). Консервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 14 дней.

Антиген представляет собой суспензию инактивированных нагреванием и фенолом бруцелл в буферном растворе, окрашенных бенгальским розовым в розовый цвет. Расфасован во флаконы из темного стекла, подлежит хранению в темном сухом месте при температуре плюс 4-12 °С. Срок годности антигена при соблюдении условий хранения 18 месяцев со дня его изготовления.

Антиген во флаконах без этикетки (надписи) или с трещинами, содержащий постороннюю примесь, неразвивающиеся хлопья, плесень, с истекшим сроком годности или подвергавшиеся замораживанию, для применения не годен.

Перед употреблением антиген выдерживают 30-40 мин. при комнатной температуре и затем тщательно встряхивают.

Техника постановки Роз-Бенгал пробы: реакцию проводят на чистых сухих металлических эмалированных пластинках или изразцовых плитках с лунками при комнатной температуре (плюс 18-30 °С).

Исследуемые сыворотки крови в дозе 0,03 мл вносят на дно лунки шприцем-полуавтоматом или микропипеткой, которые трижды промывают фенолизированным (карболизированным) физиологическим раствором и подсушивают фильтро­вальной бумагой.

В каждую лунку рядом с сывороткой пипеткой-капельницей вносят равное количество (0,03 мл антигена) и тщательно смешивают активным движением ручного полисмесителя на 5 или 25 проб для получения однородной смеси, рас­пределяя ее при этом по всей поверхности лунки.

Пластину с внесенными на нее сыворотками и антигеном покачивают в течение 4 мин осторожными вращательными движениями вручную или при помощи автоматического прибора, предназначенного для этой цели. При положительной реакции появляются хлопья агглютината розового цвета.

В начале работы ставят контроль антигена с нормальной (отрицательной) и положительной агглютинирующей сыворотками в тех же дозах, а также контроль антигена на спонтанную агглютинацию (к 0,03 мл антигена добавляют 0,03 мл физиологического раствора).

Учет реакции проводят невооруженным глазом в течение 4 мин. после смеши­вания сыворотки с антигеном при слегка наклонном положении пластинки.

Агглютинацию, которая наступает позже, чем через 4 мин — не учитывают.

Реакцию считают положительной при наличии выраженной агглютинации в виде мелких или крупных хлопьев розового цвета.

При отсутствии агглютинации (смесь гомогенна, равномерно окрашена) реакцию считают отрицательной.

После учета реакции пластинки дезинфицируют погружением на 5 мин в 3 % раствор фенола или 1 %-ный раствор хлорамина, затем тщательно промывают водопроводной водой, высушивают и используют повторно. Для этих целей можно применять кассеты и штативы сушилки.

При нечетко выраженной агглютинации проводят повторное исследование.

По результатам повторного исследования дают окончательную оценку реакции (положительная или отрицательная).

Сыворотки, с которыми получена положительная РБП, исследуют в РА и РСК (РДСК) для установления титра агглютининов и наличия комплементсвязывающих антител. Сыворотки, с которыми получена отрицательная РБП, дополнительно в РА и РСК (РДСК) не исследуют.

Кольцевая реакция с молоком

Кольцевая реакция применяется с целью ориентировочной проверки благо­получных по бруцеллезу молочных стад и для проверки молока на рынках.

Сущность кольцевой реакции заключается в том, что в молоке бруцеллезных животных при добавлении антигена образуется комплекс антитела с антигеном, который адсорбируется жировыми частицами молока. Жировые частицы вслед­ствие своего малого удельного веса поднимаются наверх, увлекая адсорбиро­ванный агглютинат, который в зависимости от цвета антигена образует на по­верхности жидкости окрашенное кольцо.

Для кольцевой реакции применяют цветной антиген Триленко, представ­ляющий взвесь убитых, окрашенных бруцеллезных микробов.

Для исследования необходимо брать цельное, лучше свежее, молоко или консервированное формалином (из расчета 0,1 мл 10 % раствора формалина на 10 мл молока).

В пробирку берут 2 мл молока и добавляют 0,1 мл (2 капли) концентрирован­ного антигена, тщательно встряхивают и помещают в водяную баню или термостат на 45-50 мин при температуре 37-39 °С.

Учет реакции: а) если в верхней части столбика молока (в слое сливок) четко выражено синее кольцо, а остальная часть молока белая, реакция оценивается положительной — 100 или 75 % агглютинации (+ + + + и + + +); б) при наличии достаточно выраженного синего кольца в слое сливок, а ос­тальная часть молока синеватого цвета, реакция оценивается положительной – 50 % агглютинации (+ +); в) если синее кольцо в слое сливок слабо выражено и весь столбик молока имеет синий цвет, реакция считается сомнительной — 25 % агглютинации (+ и ±); г) если столбик молока равномерно окрашен в синий цвет, а слой сливок ос­тается белым или слегка желтоватым, реакция отрицательная (-).

Молоко от коров с сомнительной реакцией исследуют повторно через 10-15 суток. При получении отрицательного или снова сомнительного результата животных считают благополучными по бруцеллезу.

Пластинчатая реакция агглютинации (исследование молока)

Данная реакция применяется для исследования только свежего молока и молочной сыворотки. Не подлежит исследованию пастеризованное, кипяченое и замороженное молоко (в таком молоке антибруцеллезные агглютинины раз­рушаются), а также молоко, имеющее кислотность выше 30 °С по Тернеру (во избежание получения неспецифических результатов).

Реакцией агглютинации можно исследовать молоко жирное (цельное), обез­жиренное (снятое) и молозиво. Жирное молоко предварительно обезжиривают отстаиванием или центри­фугированием, затем из-под слоя сливок забирают молоко для исследования. Обезжиренное молоко и молозиво исследуют без предварительной подго­товки, но так, чтобы сливок попало минимальное количество.

Обезжиренное молоко наносят на стекло (чашку Петри) в коли­честве 0,1 мл (или двух капель) и 0,05 мл (или одной капли). К каждой дозе испытуемого молока добавляют по одной капле бруцеллезного диагностикума. Реакция сопровождается двумя контролями: к 0,05 мл диагностикума добавляют 0,1 мл физиологического раствора и 0,1 мл испытуемого молока смешивают с 0,05 мл 12 % раствора хлористого натрия. Путем покачивания стекла смеши­вают ингредиенты. Учет реакции производят в первые 3-5 мин.

Положительная реакция агглютинации характеризуется выпадением хлопьев с большим или меньшим обесцвечиванием молока. При отрицательном резуль­тате молоко остается равномерно окрашенным в голубой цвет (цвет антигена).

Исследование молочной сыворотки

Перед получением молочной сыворотки жирное молоко обезжиривают путем центрифугирования или отстаивания. Молочную сыворотку получают при ство­раживании молока сычужным ферментом. Для этого к 5 мл молока добавляют 1-2 капли 10 % сычужного фермента на физиологическом растворе хлористого натрия. Пробирки помещают при температуре 37 °С на 20-30 мин (до свертывания молока). Молочную сыворотку можно получить также путем помещения молока при 37 °С на сутки. Молочную сыворотку сразу отделяют путем фильтрования через бумажный фильтр. Дальнейшие манипуляции: постановка реакции и учет результатов анало­гично постановке и учету реакции агглютинации с цельным молоком.

При оценке результатов исследования молока на бруцеллез при помощи пластинчатой реакции агглютинации необходимо учесть возможность образования мелкохлопчатого агглютината, который из-за мутности молока может быть не отмечен и результаты реакции могут быть приняты за отрицательные. В отри­цательных реакциях рекомендуется молоко исследовать в реакции агглютинации с молочной сывороткой.

Последнее изменение этой страницы: 2016-12-30; Нарушение авторского права страницы

источник

4.1. Серологическая диагностика бруцеллеза заключается в обнаружении специфических

антител в сыворотке крови животных с помощью реакции агглютинации в пробирках (РА), реакции

связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента на холоде (РДСК),

пластинчатой реакции агглютинации с роз бенгал антигеном (роз бенгал проба — РБП) и в молоке

коров — кольцевой реакции (КР).

4.2. Постановка и учет результатов реакции агглютинации в пробирках (РА).

4.2.1. Реакцию агглютинации в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при

диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота, овец, коз, лошадей, буйволов, верблюдов, оленей,

собак, пушных зверей и животных других видов.

4.2.2. Компоненты реакции агглютинации:

испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);

позитивная бруцеллезная сыворотка, изготовленная биопредприятием или полученная от

больного бруцеллезом животного. На этикетке флакона с такими сыворотками указывают титры в РА

и РСК и дату изготовления;

негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных), изготовленная биопредприятием

или полученная в лаборатории;

антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК (см. Приложение N 2, п. 6);

раствор хлорида натрия. При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, лошадей,

верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок для разведения испытуемых сывороток и

антигена используют фенолизированный (0,5-процентный) физиологический раствор хлорида

натрия (0,85-процентный), при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов — 5-процентный

и оленей — 10-процентный фенолизированный раствор хлорида натрия (см. Приложение N 2, п. 1).

4.2.3. Постановка реакции агглютинации.

Реакцию агглютинации проводят в объеме 1 мл в четырех разведениях:

при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов, оленей и собак — 1:25, 1:50, 1:100 и

крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов — 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

пушных зверей и морских свинок — 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

При массовых исследованиях допускается постановка реакции в первых двух разведениях.

Разлив компонентов реакции проводят индивидуальными мерными пипетками или

групповыми дозаторами Флоринского.

Для исследования каждой испытуемой сыворотки крови требуется 5 пробирок. В пробирках

первого ряда делают основное разведение. Для этого сыворотку крови крупного рогатого скота,

лошадей и верблюдов берут в дозе 0,1 мл, вносят в пробирки и добавляют к ней 2,4 мл

соответствующего раствора хлорида натрия, получают разведение сыворотки 1:25. Сыворотку крови

овец, коз, буйволов, оленей и собак берут в дозе 0,2 мл и добавляют 2,3 мл соответствующего

раствора хлорида натрия (разведение 1:12,5), а сыворотку крови пушных зверей и морских свинок

берут в дозе 0,3 мл и добавляют 1,2 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:5).

Таким образом делают основное разведение испытуемых сывороток в пробирках первого ряда

штатива (по 10 проб в ряду).

После приготовления основного разведения сывороток в первом ряду в пробирки третьего,

четвертого и пятого рядов вливают по 0,5 мл соответствующего раствора хлорида натрия. Затем из

пробирок первого ряда при помощи группового дозатора Флоринского переносят в пробирки второго

и третьего рядов по 0,5 мл основного разведения сывороток (1:25, 1:12,5 или 1:5). В пробирках

третьего ряда сыворотки смешивают с раствором хлорида натрия, по 0,5 мл этого разбавления

переносят в пробирки четвертого ряда и так же из пробирок четвертого ряда — в пятый. Из пробирок

пятого ряда по 0,5 мл жидкости удаляют. Таким образом делают последовательные двукратные

разведения одновременно 10 сывороток.

После этого в каждую пробирку второго, третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными

сыворотками вносят при помощи группового дозатора Флоринского или другого дозирующего

устройства по 0,5 мл антигена, предварительно разбавленного в соотношении 1:10 соответствующим

раствором хлорида натрия. После добавления антигена разведение сывороток в каждой пробирке

удваивается и в зависимости от вида исследуемых животных будет составлять соотношения: 1:50,

1:100, 1:200 и 1:400; 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200 или 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

В пробирки первого ряда бруцеллезный антиген не вносят, и они служат контролем качества

сыворотки. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты

реакции агглютинации не учитывают.

При массовых исследованиях сыворотки разливают индивидуальной микропипеткой (с грушей)

или групповыми дозаторами Флоринского в две пробирки в дозах 0,02 и 0,01 мл (сыворотки

крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов) или 0,04 и 0,02 мл (при исследовании сывороток

овец, коз, буйволов, оленей и собак). Затем в каждую пробирку добавляют по 1,0 мл антигена,

разведенного соответствующим раствором хлорида натрия в соотношении 1:20. При этом разведения

сывороток будут соответствовать соотношениям 1:50 и 1:100 или 1:25 и 1:50.

При постановке реакции агглютинации одновременно с испытуемыми сыворотками ставят

с негативной сывороткой в тех же разведениях, как с испытуемыми;

с позитивной бруцеллезной сывороткой в разведениях до ее предельного титра.

После добавления к испытуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками

осторожно встряхивают и помещают в термостат при 37 — 38 °С на 16 — 20 часов, затем выдерживают

при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего проводят учет реакции.

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

4.2.4. Учет реакции агглютинации. Результаты реакции учитывают визуально и определяют в

крестах по следующей схеме:

++++ (4 креста) — полное просветление жидкости, микробные тела

осели на дно пробирки в виде «зонтика», при легком

встряхивании «зонтик» разбивается на хлопья и

а жидкость остается прозрачной (100% агглютинации);

+++ (3 креста) — неполное просветление жидкости и хорошо выраженный

++ (2 креста) — просветление жидкости, «зонтик» умеренно выражен

+ (1 крест) — едва заметное просветление жидкости, «зонтик»

слабо, при встряхивании заметно небольшое

хлопьев или комочков (25% агглютинации);

— (знак минус) — просветления жидкости и образования «зонтика» не

наступило, на дне пробирки виден «пунктик» осевших

микробов антигена, при легком встряхивании

За титр антител принимают последнее разведение сыворотки, в котором произошла

агглютинация не менее чем на 2 креста (++), что соответствует количеству международных единиц

(ME) антител в 1 мл сыворотки (например, сыворотка с конечным титром РА 1:100 содержит 100 ME,

Для более объективной оценки результатов РА в крестах готовят стандарты мутности,

соответствующие 0 (нулю), 25, 50 и 75% просветления жидкости.

В четыре пробирки последовательно наливают 1, 2, 3 и 4 мл антигена, разведенного 1:10. Затем

в том же порядке в три первые пробирки добавляют 3, 2 и 1 мл фенолизированного

физиологического раствора. В четвертую пробирку раствор не добавляют. После встряхивания

пробирок жидкость из каждой из них переносят по 0,5 мл в серологические пробирки и добавляют по

0,5 мл фенолизированного физиологического раствора. Полученные стандарты соответствуют 75, 50

и 25% просветления жидкости. В последней, четвертой пробирке просветление отсутствует.

Стандарты мутности готовят каждый раз при постановке РА и выдерживают в термостате

одновременно с основной реакцией.

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

Степень просветления в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют визуально путем

сравнения со стандартами и результаты реакции выражают в крестах.

При массовых исследованиях сывороток в двух разведениях все сыворотки, давшие

агглютинацию с оценкой не менее чем на 2 креста (++) в каком-либо из указанных разведений,

исследуют повторно в четырех разведениях.

4.2.5. Диагностическая оценка реакции агглютинации.

Реакцию считают положительной при наличии агглютинации с сыворотками крови крупного

рогатого скота, лошадей и верблюдов начиная с разведения 1:100 (100 ME — международных единиц

антител), коз, овец, буйволов, оленей и собак — с разведения 1:50 (50 ME), пушных зверей и морских

свинок — с разведения 1:10 (10 ME) с оценкой не менее чем на 2 креста.

Реакцию считают сомнительной при наличии агглютинации только в разведении 1:50 (50 ME) с

сыворотками крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов и в разведении 1:25 (25 ME) с

сыворотками овец, коз, буйволов, оленей и собак с оценкой не менее чем на 2 креста.

При получении сомнительного результата реакции сыворотку крови данного животного

исследуют повторно через 3 — 4 недели.

На неблагополучных по бруцеллезу фермах животных, при исследовании которых будет

получена дважды сомнительная РА, относят к положительно реагирующим.

В заключении лаборатории о результатах исследования должна быть сообщена диагностическая

оценка каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр)

сыворотки, в котором получен соответствующий результат, выраженное в международных единицах

(например: конечный титр сыворотки крови крупного рогатого скота 1:100 с оценкой 2 креста или

более — «положительная 100 ME»; конечный титр сыворотки 1:50 с оценкой 2 креста или более —

Суммарные результаты исследования испытуемых сывороток, серию антигена, срок его

годности, а также предельный титр позитивной сыворотки записывают в журнал серологических

4.3. Постановка и учет реакции связывания комплемента (РСК) и реакция длительного

связывания комплемента на холоде (РДСК).

4.3.1. Реакцию связывания комплемента применяют при диагностике бруцеллеза у крупного

рогатого скота, овец, коз, свиней, лошадей, оленей, собак, пушных зверей и животных других видов.

Реакцию длительного связывания комплемента, как более чувствительную, применяют вместо

РСК при исследовании на бруцеллез сывороток животных указанных видов, а также при диагностике

инфекционного эпидидимита баранов.

4.3.2. Компоненты реакций и их подготовка к работе:

испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);

позитивная бруцеллезная или овисная сыворотка, изготовленная на биофабрике или полученная

от больного животного. На этикетках флаконов с сыворотками указывают титр в РСК (РДСК) и дату

негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных), изготовленная на биофабрике

или полученная в лаборатории.

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

Испытуемые и контрольные (позитивную и негативную) сыворотки инактивируют в водяной

бане в день постановки реакции: для РСК — при 60 — 62 °С в течение 30 мин. (сыворотки крови ослов

и мулов — при 64 — 65 °С, буйволов — при 62 — 64 °С в течение 30 мин., свиней — при 60 — 62° в течение

50 мин.); для РДСК сыворотки крови животных всех видов — при 63 — 64 °С в течение 30 мин.;

антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК или овисный для РДСК в рабочем титре,

указанном предприятием, его изготовившим (см. Приложение N 2, п. 6);

комплемент — сыворотка крови морской свинки (свежая, консервированная добавлением 4%

борной кислоты или лиофильно высушенная). При использовании в качестве комплемента свежей

или консервированной сыворотки и при получении каждой новой серии сухого комплемента

проводят титрование его в гемолитической системе для определения активности (см. Приложение N

Сухой биофабричный комплемент растворяют в физиологическом растворе, как указано на

этикетке. Берут такое количество ампул (флаконов), в которых содержится необходимое для

проведения всего опыта количество комплемента. Содержимое ампул (флаконов) сливают в одну

пробирку, осторожно смешивают, берут 0,5 мл и разводят физиологическим раствором 1:20 для

титрования. Остальное количество комплемента хранят в холодильнике при плюс 2 — 4 °С;

гемолитическая сыворотка (гемолизин) — для РСК в удвоенном титре, для РДСК — в утроенном.

Титрование гемолизина проводят периодически один раз в 3 месяца и при использовании каждой

новой серии (см. Приложение N 2, п. 5);

эритроциты барана — 2,5-процентная от осадка взвесь эритроцитов в физиологическом растворе

для РСК и 3-процентная для РДСК (см. Приложение N 2, п. 3).

Для приготовления гемолитической системы соответствующую взвесь эритроцитов и

гемолитическую сыворотку в рабочем разведении смешивают в равных объемах и выдерживают в

термостате при 37 °С в течение 15 — 20 мин. При смешивании гемолизин вливают во взвесь

физиологический раствор — 0,85-процентный раствор химически чистого хлорида натрия в

дистиллированной воде рН = 7,3 — 7,4 или физиологический раствор, содержащий ионы магния и

кальция (см. Приложение N 2, п. 2).

Рабочие разведения всех компонентов для РСК или РДСК готовят перед постановкой реакции

и проверяют их на антикомплементарность и гемотоксичность по следующей схеме:

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

¦ Комплемент в разведении ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ — ¦ — ¦ —

¦ Гемолизин в рабочем титре ¦ 0,2 ¦ — ¦ 0,2 ¦ — ¦ —

¦ Антиген в рабочем титре ¦ 0,4 ¦ — ¦ — ¦ 0,4 ¦ —

¦ Эритроциты (2,5% или 3%) ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2

¦ Физиологический раствор ¦ — ¦ 0,6 ¦ 0,6 ¦ 0,2

¦ водяная баня 10 минут при 37 —

¦ Результат: гемолиз полная задержка

В реакциях используют компоненты, не обладающие антикомплементарными и

4.3.3. Постановка реакции связывания комплемента.

Реакцию проводят в водяной бане при 37 — 38 °С в объеме 1 мл (по 0,2 мл каждого компонента —

сыворотки, антигена, комплемента, гемолизина и эритроцитов).

Перед постановкой главного опыта проводят титрование комплемента в бактериолитической

системе на позитивной (бруцеллезной) сыворотке, негативной сыворотке крови того вида животных,

которых исследуют, и одной сыворотке, взятой из исследуемой партии.

Каждую сыворотку разводят 1:5 физиологическим раствором (1 мл сыворотки + 4 мл

физиологического раствора), инактивируют, как указано в подпункте 4.3.2, и разливают по 0,2 мл в

два ряда по 10 пробирок. Затем в пробирки каждого ряда вносят комплемент (разведенный 1:20) в

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

возрастающих дозах от 0,02 мл до 0,2 мл с интервалом 0,02 мл и недостающее до 0,2 мл (в каждой

пробирке) количество физиологического раствора.

После разлива комплемента в первый ряд пробирок с каждой сывороткой вносят по 0,2 мл

антигена в рабочем разведении, а во второй ряд — по 0,2 мл физиологического раствора. Пробирки

ставят в водяную баню при 37 — 38 °С на 20 мин. Затем во все пробирки добавляют по 0,4 мл

гемолитической системы, встряхивают их и вновь ставят в водяную баню на 20 мин., после чего

Схема титрования комплемента в бактериолитической системе (на примере негативной

источник

Применяется КР с целью проверки благополучия стад на бруцеллез крупного рогатого скота и для проверки молока при продаже его на рынках.

Компонентами реакции являются:

— антиген цветной бруцеллезный для кольцевой реакции с молоком, который представляет собой стандартизованную взвесь убитых бруцелл, окрашенных гематоксилином в синий цвет;

— сыворотка позитивная бруцеллезная.

В агглютинационные пробирки берут по два мл молока и добавляют по 0,1 мл антигена, затем пробирки тщательно встряхивают для перемешивания молока с антигеном.

При каждой постановке реакции одновременно с испытуемыми пробами молока ставят контроли: с молоком от заведомо здоровой коровы; со смесью молока здоровой коровы и позитивной бруцеллезной сыворотки (0,05 мл сыворотки на 1 мл молока). Штативы с испытуемыми и контрольными пробами молока помещают в водяную баню или термостат при 37-38°С на 1 час. Если в молоке имеются бруцеллезные антитела, то они образуют с антигеном комплекс, который адсорбируется на капельках жира и при отстаивании всплывают вверх, образуя синее кольцо (остальная часть молока остается белой) – реакция положительная.

При отрицательной реакции столбик молока остается равномерно окрашенным в первоначальный синий цвет, который был получен сразу после добавления к нему антигена, а слой сливок – белого или слегка желтоватого цвета.

Рис. 67. Капельная реакция агглютинации на предметном стекле: а – положительная; б – отрицательная

При получении положительного или сомнительного результата КР от всех животных берут кровь для исследования на бруцеллез в РБП или РА и РСК (РДСК), проводят эпизоотологическое обследование хозяйства, клинический осмотр и исследование животных на заболевание маститами.

К а п е л ь н ы й м е т о д РА применяют в основном для идентификации культур бактерий, а также для установления их принадлежности к определенным серогруппам и серовариантам. Так поступают при диагностике колибактериоза и сальмонеллезов. Техника постановки РА сводится к следующему. На предметное стекло наносят каплю сыворотки и каплю физиологического раствора (контроль). Петлю с бактериальной культурой увлажняют в капле сыворотки, затем культуру тщательно растирают рядом с каплей, смешивают с сывороткой и энергично 6-10 раз покачивают стекло круговыми движениями. Агглютинация наступает сразу или не позднее 1-2 мин. Реакцию агглютинации учитывают при хорошем освещении. Пользование лупой облегчает учет реакции.

Агглютинация проявляется в виде склеивания бактериальной массы и полного или частичного просветления жидкости.

При отрицательной реакции культура после тщательного смешивания с каплей сыворотки образует гомогенную взвесь (рис. 67). То же самое должно быть при проведении контроля (антиген + физиологический раствор).

Р о з-б е н г а л п р о б а (РБП)

Пластинчатую реакцию агглютинации с бруцеллезным роз-бенгал антигеном применяют для исследования сывороток крови при диагностике бруцеллеза у многих видов животных.

Компонентами РБП являются:

— испытуемые сыворотки крови;

— бруцеллезный антиген для РБП, изготовляемый на биопредприятиях, представляет собой стандартизированную суспензию в буферном растворе инактивированных нагреванием и фенолом бруцелл, окрашенных бенгальским розовым в розовый цвет;

— позитивная бруцеллезная и негативная сыворотки;

— 0,5%-ный карболизированный физиологический раствор.

Реакцию проводят на чистых сухих эмалированных пластинках с лунками при температуре 18-30°С.

Исследуемые сыворотки крови в дозе 0,03 мл вносят на дно лунки. При исследовании сывороток крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов, свиней в каждую лунку рядом с сывороткой вносят 0,03 мл антигена, а при исследовании сывороток других животных – 0,015 мл, тщательно смешивают покачиванием и легким вращением в течение 4 мин. Одновременно проводят контроли антигена с позитивной и негативной сыворотками, с физраствором.

Реакцию считают положительной при выраженной агглютинации окрашенных бруцелл в виде мелких или крупных хлопьев розового цвета, выделяющихся на белом фоне лунки. Реакцию считают отрицательной при отсутствии агглютинации (смесь гомогенна, равномерно окрашена).

Р е а к ц и я г е м а г г л ю т и н а ц и и (РГА)

Эта реакция не относится к реакциям иммунитета, так как является результатом действия естественных гемагглютининов некоторых бактерий и вирусов на эритроциты, что влечет за собой их агглютинацию.

Реакцию ставят на плексигласовых панелях с лунками.

Исследуемый материал разводят физраствором и к этим разведениям добавляют равный объем 1-2%-ной взвеси эритроцитов, после чего панели с реакцией помещают в термостат на 30 мин или оставляют при комнатной температуре на 1 ч.

Учет реакции производят по характеру осадка. При положительной реакции осадок из склеившихся эритроцитов имеет форму раскрытого «зонтика» с изрезанными краями, а при отрицательной — компактный диск в виде «кнопки» с ровными краями.

Реакция гемагглютинации позволяет только выявить гемагглю-тинирующую способность бактерий и вирусов.

Для идентификации этих микроорганизмов в дальнейшем используют реакцию торможения гемагглютинации.

Р е а к ц и я т о р м о ж е н и я г е м а г г л ю т и н а ц и и (РТГА)

РТГА – иммунная реакция, в которой специфические антитела, взаимодействуя с антигеном, лишают его способности агглютинировать эритроциты.

Реакция проводится в два этапа. На первом этапе разводят специфическую сыворотку от 1:10 до 1:1280, К каждому разведению сыворотки добавляют равный объем жидкости, содержащий антиген в четырехкратном титре, который определен в РГА. Если титр антигена равен 1:640, агглютинируют эритроциты, делают разведение в 4 раза концентрированнее – 1:160.

После инкубирования при 37°С в течение 30 мин на втором этапе к этой смеси добавляют равный объем 1-2%-ной взвеси эритроцитов. Если сыворотки и антигена взято по 0,25 мл, то эритроцитов добавляют 0,5 мл.

Контролем является проба, где сыворотка заменена физраствором. Реакция читается после выдерживания в течение 30 мин в термостате или 45 мин при комнатной температуре.

При положительной РТГА образуется плотный осадок эритроцитов (задержка реакции) на дне пробирки, имеющих вид «пуговки» диска.

При отрицательной РТГА отмечается выраженная гемагглютинация в виде «зонтика».

Реакция используется для идентификации и типизации выделенного антигена, титрования вируссодержащих жидкостей и материалов и серологическом диагностики вирусных инфекций.

Р е а к ц и я н е п р я м о й (п а с с и в н о й) г е м а г г л ю т и н а ц и и (Р Н Г А)

Сущность этой реакции заключается в том, что на поверхность эритроцитов адсорбируют или антиген, или антитела (иммуноглобулины), которые приобретают способность агглютинироваться в присутствии специфических антител или антигена.

Главными достоинствами РНГА – высокая чувствительность и специфичность, техническая простота, стабильность используемых компонентов.

РНГА применяют при диагностике инфекционных болезней:

1) для обнаружения в титрования антител в исследуемой сыворотке крови с помощью известного эритроцитарного антигенного диагностикума;

2) для идентификации неизвестного антигена с помощью известного иммуноглобулинного эритроцитарного диагностикума.

Учет РНГА проводится так же, как и при постановке РГА.

Задания для самостоятельной работы

1. Провести постановку и учет результатов реакции агглютинации капельным методом с неизвестным антигеном с использованием набора агглютинирующих сальмонеллезных сывороток.

2. Провести постановку реакции агглютинации классическим (пробирочным методом) на бруцеллез с сыворотками крови крупного рогатого скота (учет результатов провести на следующем занятии).

3. Ознакомиться с результатами кольцевой реакции с молоком на бруцеллез, с реакцией гемагглютинации с Роз-бенгаловой пробой на бруцеллез.

Вопросы для самоподготовки и контроля знаний

1. Как называются компоненты в реакции агглютинации?

3. Осадок, продукт соединения антигена с антителом.

2. Для постановки реакции агглютинации необходимо приготовить исходное разведение исследуемой сыворотки 1:25. Какой из приведенных вариантов удовлетворяет это условие?

А. 0,3 мл сыворотки + 4,7 мл физраствора.

Б. 0,2 мл сыворотки + 4,8 мл физраствора.

В. 0,1 мл сыворотки + 4,9 мл физраствора.

3. При чтении реакции агглютинации в одной из пробирок установлены следующие признаки – жидкость мутная (непрозрачная), на дне небольшой осадок. Дать оценку реакции агглютинации на плюсовой системе.

4. При чтении реакции агглютинации на бруцеллез с сывороткой крупного рогатого скота получены результаты:

1:50 +++, 1:100 +++, 1:200 ++, 1:400 ++. Дайте оценку реакции.

5. В лабораторию присланы пробы сыворотки крови крупного рогатого скота. Какие разведения сыворотки нужно приготовить для постановки реакции агглютинации на бруцеллез?

6. Какие изменения претерпевает антиген под действием специфических антител в реакции агглютинации?

А. Выпадает осадок на границе обеих жидкостей.

7. При положительной реакции агглютинации в пробирке наблюдается осадок в виде «зонтика», при встряхивании которого образуются крупные хлопья. К какому виду агглютинации относится данная реакция?

8. Проведена реакция агглютинации методом кольцевой пробы с молоком на бруцеллез, в результате чего проба молока стала белой и на его поверхности образовалось синее кольцо. Дайте оценку реакции.

источник